ES2894680T3 - Derivados de hexahidropirazinotriazinona como inhibidores de quinasas - Google Patents

Derivados de hexahidropirazinotriazinona como inhibidores de quinasas Download PDF

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Richard John Mears
Judi Charlotte Neuss
James Thomas Reuberson
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Abstract

Un compuesto de fórmula (I) o un N-óxido del mismo, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo: **(Ver fórmula)** en donde Q representa un grupo de fórmula (Qb) o (Qf) **(Ver fórmula)** en donde el asterisco (*) representa el punto de unión al resto de la molécula; X representa N o CH; U representa oxígeno, azufre o N-R3b; U2 representa oxígeno, azufre o N-R2b; T2 representa N o C-R4a; R1 representa hidrógeno o amino; R2a representa hidrógeno o alquilo de C1-6; R2b representa hidrógeno o alquilo de C1-6; R3a representa hidrógeno o alquilo de C1-6; R3b representa hidrógeno o alquilo de C1-6 y R4a representa hidrógeno; Z representa arilo que puede estar opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados independientemente de alquilo de C1-6, trifluorometilo, alcoxi de C1-6 y trifluorometoxi; y A1 representa hidrógeno o alquilo de C1-6.

Description

DESCRIPCIÓN
Derivados de hexahidropirazinotriazinona como inhibidores de quinasas
La presente invención se refiere a una clase de compuestos heterocíclicos bicíclicos condensados y a su uso en terapia. Más particularmente, la presente invención proporciona derivados de hexahidropirazino[1,2-d][1,2,4]triazin-4-ona sustituidos. Estos compuestos son inhibidores selectivos de la actividad de la fosfatidilinositol-4-quinasa IIIp (PI4KI11 p) y, por lo tanto, son beneficiosos como agentes farmacéuticos, especialmente en el tratamiento de trastornos inflamatorios, autoinmunes y oncológicos adversos, en el tratamiento de enfermedades víricas y malaria, y en la gestión del rechazo de trasplantes de órganos y células.
Además, los compuestos de acuerdo con la presente invención pueden ser beneficiosos como patrones farmacológicos para su uso en el desarrollo de nuevas pruebas biológicas y en la búsqueda de nuevos agentes farmacológicos. Por tanto, los compuestos de esta invención pueden ser útiles como radioligandos en ensayos para detectar compuestos farmacológicamente activos.
El documento WO 2013/034738 describe que los inhibidores de la actividad de PI4KIIIp son útiles como medicamentos para el tratamiento de trastornos autoinmunitarios e inflamatorios y el rechazo de trasplantes de órganos y células.
El documento WO 2010/103130 describe una familia de derivados de oxazolo[5,4-d]pirimidina, tiazolo[5,4-d]-pirimidina, tieno[2,3-d]pirimidina y de purina que son activos en una variedad de ensayos, incluida la prueba de la Reacción de Linfocitos Mixtos (MLR) y se afirma que es eficaz para el tratamiento de trastornos inmunes y autoinmunes y el rechazo de trasplantes de órganos y células. El documento WO 2011/147753 describe la misma familia de compuestos que tienen una actividad antivírica significativa. Es más, el documento WO 2012/035423 describe la misma familia de compuestos que tienen una actividad anticancerígena significativa.
Los documentos WO 2013/024291, WO 2013/068458, WO 2014/053581 y WO 2014/096423 y las solicitudes de patente en trámite PCT/EP2015/063048, PCT/EP2015/063051 y PCT/EP2015/063052 (publicadas el 23 de diciembre de 2015 como documentos WO 2015/193167, WO 2015/193168 y WO 2015/193169, respectivamente), describen varias series de derivados heteroaromáticos bicíclicos condensados que se declaran beneficiosos como agentes farmacéuticos, especialmente en el tratamiento de trastornos inflamatorios, autoinmunes y oncológicos adversos, en el tratamiento de enfermedades víricas y en la gestión del rechazo de los trasplantes de órganos y células.
Los inhibidores de PI4KIIIp se han identificado como moléculas con un perfil de actividad ideal para la prevención, el tratamiento y la eliminación de la malaria (compárese con C.W. McNamara et al., Nature, 2013, 504, 248-253).
Sin embargo, ninguna de las técnicas anteriores disponibles hasta la fecha describe o sugiere que la clase estructural precisa de derivados sustituidos de hexahidropirazino[1,2-d][1,2,4]triazin-4-ona proporcionados por la presente invención tienen actividad como inhibidores de PI4KIIIp.
Los compuestos de la presente invención son inhibidores potentes y selectivos de la actividad de PI4KIIIp, que inhiben la afinidad de la quinasa de PI4KIIIp de ser humano (IC50) a concentraciones de 50 pM o menos, generalmente de 20 pM o menos, generalmente de 5 pM o menos, típicamente de 1 pM o menos, adecuadamente de 500 nM o menos, idealmente de 100 nM o menos, y preferiblemente de 20 nM o menos (la persona experta apreciará que una cifra más baja de IC50 denota un compuesto más activo). Los compuestos de la invención pueden poseer al menos una afinidad selectiva de 10 veces, típicamente una afinidad selectiva de al menos 20 veces, adecuadamente una afinidad selectiva de al menos 50 veces, e idealmente una afinidad selectiva de al menos 100 veces, por la PI4KIIIp de ser humano en relación con otras quinasas de ser humano.
Ciertos compuestos de acuerdo con la presente invención son activos como inhibidores cuando se someten a la prueba de Reacción de Linfocitos Mixtos (MLR). La prueba MLR es predictiva de inmunosupresión o inmunomodulación. Por lo tanto, cuando se someten a la prueba de MLR, ciertos compuestos de la presente invención muestran un valor de IC50 de 10 pM o menos, generalmente de 5 pM o menos, generalmente de 2 pM o menos, típicamente de 1 pM o menos, adecuadamente de 500 nM o menos, idealmente de 100 nM o menos, y preferiblemente de 20 nM o menos (de nuevo, el experto apreciará que una cifra más baja de IC50 denota un compuesto más activo).
Los compuestos de la invención poseen ventajas notables en términos de su alta potencia, eficacia demostrable a dosis más bajas y valiosas propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas (que incluyen el aclaramiento y la biodisponibilidad).
La presente invención proporciona un compuesto de fórmula (I) o un N-óxido del mismo, o una sal o solvato del mismo farmacéuticamente aceptable:
Figure imgf000003_0001
en donde
Q representa un grupo de fórmula (Qb) o (Qf)
Figure imgf000003_0002
en las cuales el asterisco (*) representa el punto de unión al resto de la molécula;
X representa N o CH;
U representa oxígeno, azufre o N-R3b;
U2 representa oxígeno, azufre o N-R2b;
T2 representa N o C-R4a;
R1 representa hidrógeno o amino;
R2a representa hidrógeno o alquilo de C1-6;
R2b representa hidrógeno o alquilo de C1-6;
R3a representa hidrógeno o alquilo de C1-6;
R3b representa hidrógeno o alquilo de C1-6 y
R4a representa hidrógeno;
Z representa arilo que puede estar opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados independientemente de alquilo de C1-6, trifluorometilo, alcoxi de C1-6 y trifluorometoxi; y
A1 representa hidrógeno o alquilo de C1-6. Cuando se indica que cualquiera de los grupos en los compuestos de fórmula (I) anterior está opcionalmente sustituido, este grupo puede estar sin sustituir o sustituido con uno o más sustituyentes. Normalmente, dichos grupos no estarán sustituidos o estarán sustituidos con uno o dos sustituyentes.
Para uso en medicina, las sales de los compuestos de fórmula (I) serán sales farmacéuticamente aceptables. Sin embargo, otras sales pueden ser útiles en la preparación de los compuestos de la invención o de sus sales farmacéuticamente aceptables. Las sales farmacéuticamente aceptables adecuadas de los compuestos de esta invención incluyen sales de adición de ácidos que pueden, por ejemplo, formarse mezclando una solución del compuesto de la invención con una solución de un ácido farmacéuticamente aceptable tal como ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido metanosulfónico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico, ácido acético, ácido benzoico, ácido cítrico, ácido tartárico o ácido fosfórico. Además, cuando los compuestos de la invención portan un resto ácido, p. ej., carboxi, sus sales farmacéuticamente aceptables adecuadas pueden incluir sales de metales alcalinos, p. ej., sales de sodio o potasio; sales de metales alcalinotérreos, p. ej., sales de calcio o magnesio; y sales formadas con ligandos orgánicos adecuados, p. ej., sales de amonio cuaternario.
La presente invención incluye dentro de su alcance solvatos de los compuestos de fórmula (I) anterior. Dichos solvatos se pueden formar con disolventes orgánicos comunes, p. ej., disolventes tipo hidrocarburos tales como benceno o tolueno; disolventes clorados tales como cloroformo o diclorometano; disolventes alcohólicos tales como metanol, etanol o isopropanol; disolventes tipo éter tales como éter dietílico o tetrahidrofurano; o disolventes tipo éster tales como acetato de etilo. Alternativamente, los solvatos de los compuestos de fórmula (I) pueden formarse con agua, en cuyo caso serán hidratos.
Los grupos alquilo adecuados que pueden estar presentes en los compuestos de la invención incluyen grupos alquilo de C1-6 de cadena lineal y ramificada, por ejemplo grupos alquilo de C1-4. Los ejemplos típicos incluyen grupos metilo y etilo, y grupos propilo, butilo, pentilo y hexilo de cadena lineal o ramificada. Los grupos alquilo particulares incluyen metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, isobutilo, terc-butilo, 2,2-dimetilpropilo y 3-metilbutilo. Expresiones derivadas, tales como "alcoxi de C1-6", "alquilo de C1 -6-tio", "alquilo de C1-6-sulfonilo" y "alquilo de C1-6-amino” deben interpretarse en consecuencia.
Los grupos arilo adecuados incluyen fenilo y naftilo, preferiblemente fenilo.
El término "halógeno" como se usa en este documento pretende incluir átomos de flúor, cloro, bromo y yodo, típicamente flúor, cloro o bromo.
Cuando los compuestos de fórmula (I) tienen uno o más centros asimétricos, pueden por consiguiente existir como enantiómeros. Cuando los compuestos de la invención poseen dos o más centros asimétricos, pueden existir adicionalmente como diastereómeros. Debe entenderse que la invención se extiende a todos estos enantiómeros y diastereómeros, y a sus mezclas en cualquier proporción, incluidos los racematos. La fórmula (I) y las fórmulas que se describen a continuación pretenden representar todos los estereoisómeros individuales y todas las posibles mezclas de los mismos, a menos que se indique o se muestre de otra manera. Además, los compuestos de fórmula (I) pueden existir como tautómeros, por ejemplo tautómeros ceto (CH2C=O) ^ enol (CH=CHOH) o tautómeros de amida (NHC=O) ^ hidroxiimina (N=COH). La fórmula (I) y las fórmulas que se describen a continuación están destinadas a representar todos los tautómeros individuales y todas las posibles mezclas de los mismos, a menos que se indique o se muestre de otra manera.
Debe entenderse que cada átomo individual presente en la fórmula (I), o en las fórmulas que se describen a continuación, puede de hecho estar presente en forma de cualquiera de sus isótopos naturales, prefiriéndose el isótopo o los isótopos más abundantes. Así, a modo de ejemplo, cada átomo de hidrógeno individual presente en la fórmula (I), o en las fórmulas que se describen a continuación, puede estar presente como un átomo 1H, 2H (deuterio) o 3H (tritio), preferiblemente 1H. De manera similar, a modo de ejemplo, cada átomo de carbono individual presente en la fórmula (I), o en las fórmulas representadas a continuación, puede estar presente como un átomo 12C, 13C o 14C, preferiblemente 12C.
Los valores adecuados de Q incluyen pirazolo[3,4-b]piridinilo, pirazolo[3,4-d]pirimidinilo e isoxazolo[4,5-d]pirimidinilo, cualquiera de dichos grupos puede estar opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes.
Los valores típicos de sustituyentes opcionales en Q incluyen uno, dos o tres sustituyentes seleccionados independientemente entre halógeno, ciano, nitro, alquilo de C1-6, trifluorometilo, hidroxi, hidroxi-alquilo de(C1-6), alcoxi de C1-6, difluorometoxi, trifluorometoxi, alquilo de C1-6-tio, alquilo de C1-6-sulfinilo, alquilo de C1-6-sulfonilo, amino, alquilo de C1-6-amino, dialquilo de (C1-6)-amino, alquilo de C2-6-carbonilamino, alcoxi de C2-6-carbonilamino, alquilo de C1-6-sulfonilamino, formilo, alquilo de C2-6-carbonilo, carboxi, alcoxi de C2-6-carbonilo, aminocarbonilo, alquilo de C1-6-aminocarbonilo, dialquilo de (C1-6)-aminocarbonilo, aminosulfonilo, alquilo de C1-6-aminosulfonilo y dialquilo de (C1-6)-aminosulfonilo.
Los valores adecuados de sustituyentes opcionales en Q incluyen uno, dos o tres sustituyentes seleccionados independientemente de alquilo de C1-6 y amino.
Los valores típicos de sustituyentes particulares en Q incluyen uno, dos o tres sustituyentes seleccionados independientemente entre flúor, cloro, bromo, ciano, nitro, metilo, etilo, isopropilo, trifluorometilo, hidroxi, hidroximetilo, metoxi, difluorometoxi, trifluorometoxi, metiltio, metilsulfinilo, metilsulfonilo, amino, metilamino, dimetilamino, acetilamino, metoxicarbonilamino, metilsulfonilamino, formilo, acetilo, carboxi, metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, aminocarbonilo, metilaminocarbonilo, dimetilaminocarbonilo, aminosulfonilo, metilaminosulfonilo y dimetilaminosulfonilo.
Los valores adecuados de sustituyentes particulares en Q incluyen uno, dos o tres sustituyentes seleccionados independientemente entre metilo y amino.
En una primera realización, Q representa un grupo de fórmula (Qb) como se definió anteriormente. En una segunda realización, Q representa un grupo de fórmula (Qf) como se definió anteriormente
En una primera realización, X representa N. En una segunda realización, X representa CH.
En una primera forma de realización, U representa oxígeno. En una segunda forma de realización, U representa azufre. En una tercera forma de realización, U representa N-R3b.
En una primera realización, U2 representa oxígeno. En una segunda forma de realización, U2 representa azufre. En una tercera forma de realización, U2 representa N-R2b.
En una primera realización, T2 representa N. En una segunda realización, T2 representa C-R4a.
Normalmente, R1 representa hidrógeno o amino.
En una primera realización, R1 representa hidrógeno. En una segunda realización, R1 representa amino.
Ejemplos adecuados de valores opcionales de R2a incluyen hidrógeno y alquilo de C1-6.
Ejemplos adecuados de valores particulares de R2a incluyen hidrógeno y metilo.
En una primera realización, R2a representa hidrógeno. En una segunda realización, R2a representa alquilo de C1-6 , especialmente metilo.
Ejemplos adecuados de valores opcionales de R2b incluyen hidrógeno y alquilo de C1-6.
Ejemplos adecuados de valores particulares de R2b incluyen hidrógeno y metilo.
En una primera realización, R2b representa hidrógeno. En una segunda realización, R2b representa alquilo de C1-6 , especialmente metilo.
Normalmente, R3a representa hidrógeno o alquilo de C1-6.
Valores típicos de R3a incluyen hidrógeno, flúor, cloro, ciano, metilo, etilo y trifluorometilo.
Valores adecuados de R3a incluyen hidrógeno y metilo.
En una primera realización, R3a representa hidrógeno. En una segunda realización, R3a representa alquilo de C1-6 , especialmente metilo o etilo. En un primer aspecto de esa realización, R3a representa metilo. En un segundo aspecto de esa realización, R3a representa etilo.
Valores adecuados de R3b incluyen hidrógeno y metilo.
En una primera realización, R3b representa hidrógeno. En una segunda realización, R3b representa alquilo de C1-6 , especialmente metilo.
Normalmente, R4a representa hidrógeno.
En una realización seleccionada, Q representa un grupo de fórmula (Qb) como se definió anteriormente en la que U representa N-R3b. En otra realización seleccionada, Q representa un grupo de fórmula (Qf) como se definió anteriormente en la que U2 representa oxígeno y T2 representa N.
Normalmente, Z representa arilo, grupo el cual puede estar opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes. En una realización, Z no está sustituido. En otra realización, Z está sustituido con uno o más sustituyentes, típicamente con uno, dos o tres sustituyentes, adecuadamente con uno o dos sustituyentes. En un aspecto de esa realización, Z está monosustituido. En otro aspecto de esa realización, Z está disustituido. En un aspecto adicional de esa realización, Z está trisustituido.
Los ejemplos adecuados de sustituyentes opcionales en Z incluyen uno, dos o tres sustituyentes seleccionados independientemente de alquilo de C1-6, trifluorometilo, C1-6 alcoxi y trifluorometoxi.
Los ejemplos adecuados de sustituyentes específicos en Z incluyen uno, dos o tres sustituyentes seleccionados independientemente entre metilo, trifluorometilo, metoxi y trifluorometoxi.
Los valores típicos de Z incluyen metoxifenilo, trifluorometoxifenilo y (metoxi)(metil)fenilo.
En una primera realización, Z representa metoxifenilo, especialmente 4-metoxifenilo.
En una segunda realización, Z representa trifluorometoxifenilo, especialmente 4-(trifluorometoxi)fenilo.
En una tercera realización, Z representa (metoxi)(metil)fenilo, especialmente 4-metoxi-2-metilfenilo o 4-metoxi-3-metilfenilo. En un primer aspecto de esa realización, Z representa 4-metoxi-2-metilfenilo. En un segundo aspecto de esa realización, Z representa 4-metoxi-3-metilfenilo.
Adecuadamente, A1 representa hidrógeno o alquilo de C1-6.
En una primera realización, A1 representa hidrógeno. En una segunda realización, A1 representa alquilo de C1-6 , opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente entre flúor, hidroxi, alcoxi de C1-6 , trifluorometoxi, amino, alquilo de C1-6 -amino, dialquilo de (C1-6)-amino, carboxi, alcoxi de C2-6-carbonilo, aminocarbonilo, alquilo de C1-6-aminocarbonilo y dialquilo de (C1-6)-aminocarbonilo. En un primer aspecto de esa realización, A1 representa alquilo de C1-6 no sustituido, típicamente metilo, etilo, isopropilo o isobutilo, especialmente metilo. Valores adecuados de A1 incluyen hidrógeno y metilo.
Una subclase de compuestos según la invención está representada por los compuestos de fórmula (IIA) y sus sales y solvatos farmacéuticamente aceptables:
Figure imgf000006_0001
en donde Z, A1, X, R1, R2a y R3b son como se definieron anteriormente.
Otra subclase de compuestos según la invención está representada por los compuestos de fórmula (IIB) y sus sales y solvatos farmacéuticamente aceptables:
Figure imgf000006_0002
en donde Z, A1, X, R1 y R3a son como se definieron anteriormente.
Los nuevos compuestos específicos de acuerdo con la presente invención incluyen cada uno de los compuestos cuya preparación se describe en los Ejemplos adjuntos, y sus sales y solvatos farmacéuticamente aceptables.
Los compuestos de acuerdo con la presente invención son beneficiosos en el tratamiento y/o prevención de diversas dolencias humanas. Estas incluyen trastornos inflamatorios, autoinmunes y oncológicos; enfermedades víricas y malaria; y rechazo de trasplantes de órganos y células.
Los trastornos inflamatorios y autoinmunitarios incluyen trastornos autoinmunitarios sistémicos, trastornos endocrinos autoinmunitarios y trastornos autoinmunitarios específicos de órganos. Los trastornos autoinmunitarios sistémicos incluyen lupus eritematoso sistémico (LES), psoriasis, vasculitis, polimiositis, esclerodermia, esclerosis múltiple, espondilitis anquilosante, artritis reumatoide y síndrome de Sjogren. Los trastornos endocrinos autoinmunitarios incluyen tiroiditis. Los trastornos autoinmunitarios específicos de órganos incluyen enfermedad de Addison, anemia hemolítica o perniciosa, glomerulonefritis (incluido el síndrome de Goodpasture), enfermedad de Graves, púrpura trombocitopénica idiopática, diabetes mellitus insulinodependiente, diabetes juvenil, uveítis, enfermedad inflamatoria intestinal (incluidas la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa), pénfigo, dermatitis atópica, hepatitis autoinmune, cirrosis biliar primaria, neumonitis autoinmune, carditis autoinmune, miastenia gravis e infertilidad espontánea.
Los trastornos oncológicos, que pueden ser agudos o crónicos, incluyen trastornos proliferativos, especialmente cáncer, en animales, incluidos mamíferos, especialmente seres humanos. Las categorías particulares de cáncer incluyen malignidad hematológica (incluyendo leucemia y linfoma) y malignidad no hematológica (incluyendo cáncer de tumor sólido, sarcoma, meningioma, glioblastoma multiforme, neuroblastoma, melanoma, carcinoma gástrico y carcinoma de células renales). La leucemia crónica puede ser mieloide o linfoide. Las variedades de leucemia incluyen leucemia linfoblástica de células T, leucemia mielógena crónica (LMC), leucemia linfocítica/linfoide crónica (LLC), leucemia de células pilosas, leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mielógena aguda (LMA), síndrome mielodisplásico, leucemia neutrofílica crónica, leucemia aguda linfoblástica de células T, plasmocitoma, leucemia inmunoblástica de células grandes, leucemia de células del manto, mieloma múltiple, leucemia megacarioblástica aguda, leucemia megacariocítica aguda, leucemia promielocítica y eritroleucemia. Las variedades de linfoma incluyen linfoma maligno, linfoma de Hodgkin, linfoma de no Hodgkin, linfoma linfoblástico de células T, linfoma de Burkitt, linfoma folicular, linfoma MALT1 y linfoma de zona marginal. Las variedades de malignidad no hematológica incluyen cáncer de próstata, pulmón, mama, recto, colon, ganglio linfático, vejiga, riñón, páncreas, hígado, ovario, útero, cuello uterino, cerebro, piel, hueso, estómago y músculo.
Las enfermedades víricas incluyen infecciones causadas por varias familias de virus, incluidas las de Retroviridae, Flaviviridae y Picornaviridae. Varios géneros dentro de la familia de Retroviridae incluyen Alfaretrovirus, Betaretrovirus, Gammaretrovirus, Deltaretrovirus, Epsilonretrovirus, Lentivirus y Espumavirus. Los miembros del género Lentivirus incluyen el virus de la inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1) y el virus de la inmunodeficiencia humana 2 (VIH-2). Varios géneros dentro de la familia de Flaviviridae incluyen Flavivirus, Pestivirus, Hepacivirus y Virus de la hepatitis G. Los miembros del género Flavivirus incluyen el virus de la fiebre del dengue, el virus de la fiebre amarilla, el virus de la encefalitis del Nilo Occidental y el virus de la encefalitis japonesa. Los miembros del género Pestivirus incluyen el virus de la diarrea vírica bovina (VDVB), el virus de la peste porcina clásica y el virus de la enfermedad fronteriza 2 (BDV-2). Los miembros del género Hepacivirus incluyen el virus de la hepatitis C (VHC). Los miembros del género Virus de la hepatitis G incluyen el virus de la hepatitis G. Varios géneros dentro de la familia de Picornaviridae incluyen Aftovirus, Avihepatovirus, Cardiovirus, Enterovirus, Erbovirus, Hepatovirus, Kobuvirus, Parechovirus, Sapelovirus, Senecavirus, Teschovirus y Tremovirus. Los miembros del género Enterovirus incluyen poliovirus, virus coxsackie A, virus coxsackie B y rinovirus.
El rechazo de órganos trasplantados incluye el rechazo de órganos o células trasplantados o injertados (tanto aloinjertos como xenoinjertos), incluida la reacción de injerto contra huésped. El término "órgano" como se usa en este documento significa todos los órganos o partes de órganos en mamíferos, particularmente seres humanos, que incluyen riñón, pulmón, médula ósea, cabello, córnea, ojo (vítreo), corazón, válvula cardíaca, hígado, páncreas, vaso sanguíneo, piel, músculos, huesos, intestino y estómago. El término "rechazo" como se usa en este documento significa todas las reacciones del cuerpo receptor o del órgano trasplantado que finalmente conducen a la muerte celular o tisular en el órgano trasplantado, o afectan adversamente la capacidad funcional y la viabilidad del órgano trasplantado o del receptor. En particular, esto significa reacciones de rechazo agudas y crónicas.
El rechazo de trasplantes de células incluye el rechazo de trasplantes de células y xenotrasplantes. El principal obstáculo para los xenotrasplantes es que incluso antes de que se activen los linfocitos T (responsables del rechazo de los aloinjertos), se activa el sistema inmunológico innato (especialmente los linfocitos B independientes de T y los macrófagos). Esto provoca dos tipos de rechazo agudo severo y temprano, denominado rechazo hiperagudo y rechazo vascular, respectivamente. Los fármacos inmunosupresores convencionales, incluida la ciclosporina A, son ineficaces en el xenotrasplante. Los compuestos de acuerdo con la presente invención no son responsables de este inconveniente. La capacidad de los compuestos de esta invención para suprimir la producción de xenoanticuerpos independientes de T así como la activación de macrófagos puede demostrarse por su capacidad para prevenir el rechazo de xenoinjertos en ratones atímicos deficientes en T que reciben injertos xenógenos de corazón de hámster.
La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con la invención como se describe anteriormente, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, en asociación con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables.
Las composiciones farmacéuticas según la invención pueden adoptar una forma adecuada para la administración oral, bucal, parenteral, nasal, tópica, oftálmica o rectal, o una forma adecuada para la administración por inhalación o insuflación.
Para la administración oral, las composiciones farmacéuticas pueden tomar la forma de, por ejemplo, comprimidos, grageas o cápsulas preparadas por medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables tales como agentes aglutinantes (por ej., almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa); cargas (por ej., lactosa, celulosa microcristalina o hidrógeno-fosfato de calcio); lubricantes (por ej., estearato de magnesio, talco o sílice); desintegrantes (por ej., almidón de patata o glicolato de sodio); o agentes humectantes (por ejemplo, laurilsulfato de sodio). Los comprimidos pueden recubrirse mediante métodos bien conocidos en la técnica. Las preparaciones líquidas para administración oral pueden tomar la forma de, por ejemplo, soluciones, jarabes o suspensiones, o pueden presentarse como un producto seco para reconstituir con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso. Tales preparaciones líquidas pueden prepararse por medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión, agentes emulsionantes, vehículos no acuosos o conservantes. Las preparaciones también pueden contener sales tampón, agentes aromatizantes, agentes colorantes o agentes edulcorantes, según sea apropiado.
Las preparaciones para la administración oral se pueden formular de forma adecuada para dar una liberación controlada del compuesto activo.
Para la administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de comprimidos o grageas formuladas de manera convencional.
Los compuestos de fórmula (I) pueden formularse para la administración parenteral mediante inyección, p. ej., mediante inyección en bolo o infusión. Las formulaciones para inyección se pueden presentar en forma de dosificación unitaria, p. ej., en ampollas de vidrio o envases multidosis, p. ej., viales de vidrio. Las composiciones para inyección pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes, conservantes y/o dispersantes. Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para reconstituir con un vehículo adecuado, p. ej., agua estéril sin pirógenos, antes de su uso.
Además de las formulaciones descritas anteriormente, los compuestos de fórmula (I) también se pueden formular como preparaciones de depósito. Tales formulaciones de acción prolongada pueden administrarse mediante implantación o mediante inyección intramuscular.
Para la administración nasal o la administración por inhalación, los compuestos de acuerdo con la presente invención pueden administrarse convenientemente en forma de una presentación en aerosol para envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado, p. ej., diclorodifluorometano, fluorotriclorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas o mezcla de gases adecuada.
Las composiciones pueden, si se desea, presentarse en un paquete o dispositivo dispensador que puede contener una o más formas de dosificación unitarias que contienen el ingrediente activo. El envase o dispositivo dispensador puede ir acompañado de instrucciones de administración.
Para la administración tópica, los compuestos de uso en la presente invención se pueden formular convenientemente en una pomada adecuada que contenga el componente activo suspendido o disuelto en uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables. Los vehículos particulares incluyen, por ejemplo, aceite mineral, petróleo líquido, propilenglicol, polioxietileno, polioxipropileno, cera emulsionante y agua. Alternativamente, los compuestos de uso en la presente invención pueden formularse en una loción adecuada que contenga el componente activo suspendido o disuelto en uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables. Los vehículos particulares incluyen, por ejemplo, aceite mineral, monoestearato de sorbitán, polisorbato 60, cera de ésteres cetílicos, alcohol cetearílico, alcohol bencílico, 2-octildodecanol y agua.
Para la administración oftálmica, los compuestos de uso en la presente invención se pueden formular convenientemente como suspensiones micronizadas en solución salina estéril isotónica con pH ajustado, con o sin un conservante tal como un agente bactericida o fungicida, por ejemplo, nitrato fenilmercúrico, cloruro de benzalconio o acetato de clorhexidina. Alternativamente, para la administración oftálmica, los compuestos se pueden formular en un ungüento tal como vaselina.
Para la administración rectal, los compuestos de uso en la presente invención pueden formularse convenientemente como supositorios. Estos se pueden preparar mezclando el componente activo con un excipiente no irritante adecuado que sea sólido a temperatura ambiente pero líquido a la temperatura rectal y, por lo tanto, se fundirá en el recto para liberar el componente activo. Dichos materiales incluyen, por ejemplo, manteca de cacao, cera de abejas y polietilenglicoles.
La cantidad de un compuesto de uso en la invención requerida para la profilaxis o el tratamiento de una afección particular variará dependiendo del compuesto elegido y la afección del paciente a tratar. En general, sin embargo, las dosis diarias pueden variar de alrededor de 10 ng/kg a 1000 mg/kg, típicamente de 100 ng/kg a 100 mg/kg, p. ej., alrededor de 0,01 mg/kg a 40 mg/kg de peso corporal, para la administración oral o bucal, de alrededor de 10 ng/kg a 50 mg/kg de peso corporal para la administración parenteral, y de alrededor de 0,05 mg a alrededor de 1000 mg, p. ej., desde alrededor de 0,5 mg hasta alrededor de 1000 mg, para la administración nasal o la administración por inhalación o insuflación.
Los compuestos de la fórmula (I) anterior se pueden preparar mediante un procedimiento que comprende hacer reaccionar un compuesto de fórmula (III) con un compuesto de fórmula (IV):
Q-L1 (III)
Figure imgf000008_0001
en donde Q, Z y A1 son como se definieron anteriormente, y L1 representa un grupo saliente adecuado.
El grupo saliente L1 es típicamente un átomo de halógeno, p. ej., cloro.
La reacción generalmente se llevará a cabo en presencia de una base, típicamente una amina orgánica tal como N, N-diisopropiletilamina. La reacción se efectúa convenientemente a temperatura ambiente o elevada en un disolvente adecuado, p. ej., un disolvente tipo éter cíclico tal como tetrahidrofurano o 1,4-dioxano, o un disolvente aprótico dipolar tal como N, N-dimetilformamida o un alcanol de Ci-6 tal como n-butanol, 2-propanol o etanol.
En otro procedimiento, los compuestos de la fórmula (I) anterior, en la que Q representa un grupo de fórmula (Qb) en donde U representa N-R3b, pueden prepararse mediante un procedimiento que comprende hacer reaccionar un compuesto de fórmula (V) con un compuesto de fórmula (VI):
R3b-NHNH2 (V)
Figure imgf000009_0001
en donde Z, A1, X, R1, R2a y R3b son como se definieron anteriormente, y L2 representa un grupo saliente adecuado. El grupo saliente L2 es típicamente un átomo de halógeno, p. ej., cloro.
La reacción se efectúa convenientemente a una temperatura elevada en un disolvente adecuado, p. ej., un sulfóxido orgánico tal como dimetilsulfóxido.
Los compuestos intermedios de la fórmula (VI) anterior se pueden preparar haciendo reaccionar un compuesto de fórmula (IV) como se definió anteriormente con un compuesto de fórmula (VII):
Figure imgf000009_0002
en donde X, R1, R2a, L1 y L2 son como se definieron anteriormente; en condiciones análogas a las descritas anteriormente para la reacción entre los compuestos (III) y (IV).
Los compuestos intermedios de la fórmula (IV) anterior se pueden preparar ciclando un compuesto de fórmula (VIII):
Figure imgf000009_0003
en donde Z y A1 son como se definieron anteriormente, y Rp representa un grupo N-protector; seguido de la eliminación de los grupos Rp N-protectores.
El grupo Rp N-protector es típicamente terc-butoxicarbonilo (BOC).
La ciclación del compuesto (VIII) se lleva a cabo adecuadamente mediante tratamiento con trifenilfosfina y azodicarboxilato de dietilo. La reacción se efectúa convenientemente a temperatura ambiente en un disolvente adecuado, p. ej., un disolvente tipo éter cíclico tal como tetrahidrofurano.
Cuando el grupo Rp N-protector es BOC, la eliminación posterior del grupo BOC se puede lograr típicamente mediante tratamiento con un ácido, p. ej., un ácido mineral, tal como el ácido clorhídrico, o un ácido orgánico, tal como el ácido trifluoroacético. Alternativamente, el grupo BOC puede eliminarse mediante tratamiento con trifluorometanosulfonato de trimetilsililo y 2,6-lutidina, típicamente a temperatura ambiente en un disolvente adecuado, p. ej., un disolvente clorado, tal como diclorometano.
Los compuestos intermedios de la fórmula (VIII) anterior se pueden preparar mediante un procedimiento de dos etapas que comprende: (i) hacer reaccionar un compuesto de fórmula (IX):
Figure imgf000010_0001
en donde Z y Rp son como se definieron anteriormente; con fosgeno; y (ii) hacer reaccionar el material así obtenido con un compuesto de fórmula (X):
Figure imgf000010_0002
en donde A1 y Rp son como se definieron anteriormente.
Las etapas (i) y (ii) del procedimiento anterior generalmente se llevarán a cabo en presencia de una base, típicamente una amina orgánica tal como N,N-diisopropiletilamina. La reacción se efectúa convenientemente a temperatura ambiente en un disolvente adecuado, p. ej., un disolvente tipo éter cíclico tal como tetrahidrofurano.
Cuando no estén disponibles comercialmente, los materiales de partida de fórmula (III), (V), (VII), (IX) y (X) pueden prepararse mediante métodos análogos a los descritos en los Ejemplos adjuntos, o bien mediante métodos estándar bien conocidos en la técnica.
Se entenderá que cualquier compuesto de fórmula (I) obtenido inicialmente a partir de cualquiera de los procedimientos anteriores puede, cuando sea apropiado, ser elaborado posteriormente en un compuesto adicional de fórmula (I) mediante técnicas conocidas en la técnica. A modo de ejemplo, un compuesto de fórmula (I) que comprende un resto N-BOC puede convertirse en el compuesto correspondiente que comprende un resto N-H mediante tratamiento con un ácido, p. ej., un ácido mineral, tal como el ácido clorhídrico, o un ácido orgánico, tal como el ácido trifluoroacético.
Un compuesto en el que R1 representa alquilo de C1-6-tio, p. ej., metiltio, se puede convertir en el compuesto correspondiente en el que R1 representa alquilo de C1-6-sulfonilo, p. ej., metilsulfonilo, por tratamiento con un agente oxidante, típicamente ácido 3-cloroperoxibenzoico (MCPBA).
Un compuesto en el que R1 representa alquilo de C1-6-sulfonilo, p. ej., metilsulfonilo, se puede convertir en el compuesto correspondiente en el que R1 representa alcoxi de C1-6 por tratamiento con la sal de alcóxido de sodio apropiada. De manera similar, un compuesto en el que R1 representa alquilo de C1-6-sulfonilo, p. ej., metilsulfonilo, se puede convertir en el compuesto correspondiente en el que R1 representa ciano por tratamiento con una sal de cianuro, p. ej., una sal de cianuro de metal alcalino tal como cianuro de sodio. Asimismo, un compuesto en el que R1 representa alquilo de C1-6-sulfonilo, p. ej., metilsulfonilo, se puede convertir en el compuesto correspondiente en el que R1 representa alquilo de C1-6-amino o dialquilo de (C1-6)-amino por tratamiento con la alquilo de C1-6-amina o dialquilo de (C1-6)-amina apropiada.
Un compuesto en el que R2a representa alcoxi de C2-6-carbonilo se puede convertir en el compuesto correspondiente en el que R2a representa carboxi (-CO2 H) por tratamiento con una base, típicamente un hidróxido de metal alcalino tal como hidróxido de sodio. Un compuesto en el que R2a representa carboxi (-CO2 H) se puede convertir en el compuesto correspondiente en el que R2a representa alquilo de C1-6-aminocarbonilo o dialquilo de (C1-6)-aminocarbonilo por tratamiento con la alquilo de C1-6-amina o dialquilo de (C1-6)-amina apropiada, respectivamente, típicamente en presencia de un agente de acoplamiento tal como clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (EDCI) y un aditivo tal como 1-hidroxibenzotriazol hidrato (HOBT), opcionalmente en presencia de una base, p. ej., una base orgánica tal como N, N-diisopropiletilamina.
Un compuesto en el que R2a representa carboxi (-CO2 H) se puede convertir en el compuesto correspondiente en el que R2a representa aminocarbonilo (-CONH2) por tratamiento con cloruro de amonio, típicamente en presencia de un agente de acoplamiento, tal como EDCI, y un aditivo, tal como HOBT, adecuadamente en presencia de una base, p.
ej., una base orgánica tal como diisopropilamina o N, N-diisopropiletilamina.
Un compuesto en el que U representa N-R3b y R3b representa hidrógeno se puede convertir en el compuesto correspondiente en el que R3b representa alquilo de C1-6, p. ej., metilo, por tratamiento con un haluro de alquilo de C1-6, p. ej., yodometano, normalmente en presencia de una base, adecuadamente una base inorgánica fuerte, p. ej., hidruro de sodio.
Cuando se obtiene una mezcla de productos a partir de cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente para la preparación de compuestos de acuerdo con la invención, el producto deseado se puede separar de la misma en una etapa apropiada mediante métodos convencionales tales como HPLC preparativa; o cromatografía en columna utilizando, por ejemplo, sílice y/o alúmina junto con un sistema disolvente apropiado.
Cuando los procedimientos descritos anteriormente para la preparación de los compuestos según la invención dan lugar a mezclas de estereoisómeros, estos isómeros pueden separarse mediante técnicas convencionales. En particular, cuando se desee obtener un enantiómero particular de un compuesto de fórmula (I), éste se puede producir a partir de una mezcla correspondiente de enantiómeros usando cualquier procedimiento convencional adecuado para resolver enantiómeros. Así, por ejemplo, se pueden producir derivados diastereómeros, p. ej., sales, por reacción de una mezcla de enantiómeros de fórmula (I), p. ej., un racemato y un compuesto quiral apropiado, p. ej., una base quiral. Los diastereómeros pueden separarse luego por cualquier medio conveniente, por ejemplo, mediante cristalización, y recuperarse el enantiómero deseado, p. ej., por tratamiento con un ácido en el caso de que el diastereoisómero sea una sal. En otro procedimiento de resolución, se puede separar un racemato de fórmula (I) usando HPLC quiral. Además, si se desea, se puede obtener un enantiómero particular usando un intermedio quiral apropiado en uno de los procedimientos descritos anteriormente. Alternativamente, se puede obtener un enantiómero particular realizando una biotransformación enzimática específica de enantiómero, p. ej., una hidrólisis de éster usando una esterasa, y luego purificando sólo el ácido hidrolizado enantioméricamente puro del antípoda de éster sin reaccionar. También se pueden usar cromatografía, recristalización y otros procedimientos de separación convencionales con productos intermedios o finales cuando se desee obtener un isómero geométrico particular de la invención.
Durante cualquiera de las secuencias sintéticas anteriores, puede ser necesario y/o deseable proteger los grupos sensibles o reactivos en cualquiera de las moléculas en cuestión. Esto se puede lograr por medio de grupos protectores convencionales, tales como los descritos en Protective Groups in Organic Chemistry, ed. J.F.W. McOmie, Plenum Press, 1973; y T.W. Greene y P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, 3a edición, 1999. Los grupos protectores pueden eliminarse en cualquier etapa posterior conveniente utilizando métodos conocidos en la técnica.
Los siguientes Ejemplos ilustran la preparación de compuestos según la invención.
Los compuestos de acuerdo con esta invención inhiben de forma potente la actividad de PI4KIIIp de ser humano.
Ensayo de inhibición de la enzima PI4KIIIp
Procedimiento A
Los compuestos se ensayaron utilizando reactivos de Invitrogen y Promega. Los compuestos se cribaron en DMSO al 1% (final) como diluciones en serie de 3 veces a partir de una concentración inicial de 20 pM. El reactivo 2.5X PI4Kp, la mezcla de sustrato de quinasa lipídica PI 2.5X/ATP y los compuestos 5X se prepararon en Tris 20 mM pH 7,5, EGTA 0,5 mM, DTT 2 mM, MgCl2 5 mM, Triton al 0,4%. La reacción final de 25 pL de quinasa consistió en: PI4Kp 4 nM, sustrato de quinasa lipídica PI 100 pM (ambos de Invitrogen) y compuesto. La concentración final de ATP en el ensayo fue de 10 pM. Los reactivos de detección consistieron en el reactivo ADP-Glo™ y el reactivo de detección ADP-Glo™ (Promega).
Brevemente, el compuesto se añadió a PI4Kp seguido de la adición de la mezcla de sustrato de quinasa lipídica PI/ATP. La mezcla de reacción se incubó durante 60 minutos a temperatura ambiente. Se añadió el reactivo ADP-Glo™ y la placa se incubó durante 40 minutos a temperatura ambiente, seguido de la adición de reactivo de detección ADP-Glo™. La placa se incubó durante 120 minutos más y se leyó en un lector de placas de luminiscencia. Los datos se ajustaron con XLfit de IDBS usando el número de modelo 205.
Procedimiento B
Los compuestos se ensayaron usando un ensayo PI4Kbeta Adapta. Los compuestos se cribaron en DMSO al 1% (final) como diluciones en serie de 3 veces a partir de una concentración inicial de 10 pM. La mezcla de 2X PI4KB (PI4K beta)/sustrato de quinasa lipídica PI se preparó en HEPES 50 mM pH 7,5, CHAPS al 0,1%, EGTA 1 mM, MgCl2 4 mM. La reacción final de quinasa 10 pL consistió en 7,5-60 ng de PI4Kp y sustrato de quinasa lipídica PI 100 pM en HEPES 32,5 mM pH 7,5, c Ha PS al 0,05%, EGTA 0,5 mM, MgCl22 mM. La concentración final de ATP en el ensayo fue de 10 pM. La mezcla de detección consistió en EDTA (30 mM), anticuerpo Eu-anti-ADP (6 nM) y trazador de ADP. La mezcla de detección contenía la concentración EC60 de trazador para ATP 5-150 pM.
Brevemente, se añadió ATP al compuesto, seguido de la adición de una mezcla de sustrato de quinasa lipídica PI/PI4Kp. La placa se agitó durante 30 segundos para mezclar y luego se centrifugó brevemente. La mezcla de reacción se incubó durante 60 minutos a temperatura ambiente. Se añadió la mezcla de detección, luego se agitó la placa y se centrifugó. La placa se incubó durante 60 minutos a temperatura ambiente y se leyó en un lector de placas de fluorescencia. Los datos se ajustaron con XLfit de IDBS usando el número de modelo 205.
Cuando se ensayaron en el ensayo anterior (Procedimiento A o B), se encontró que todos los compuestos de los Ejemplos adjuntos poseían valores de IC50 para la inhibición de la actividad de PI4KIIIp de ser humano de 50 pM o mejor.
Ciertos compuestos de acuerdo con esta invención son potentes inhibidores cuando se miden en la prueba MLR descrita a continuación.
Prueba de reacción de linfocitos mixtos (MLR)
Se aislaron células mononucleares de sangre periférica de ser humano (PBMC) de capas leucocíticas, obtenidas de donantes de sangre sanos mediante centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll (Lymphoprep, Axis-Shield PoC AS, Oslo, Noruega). Las células en la interfase Ficoll-plasma se lavaron tres veces y se usaron como células "de respuesta". Se trataron células RPMI 1788 (ATCC, N° CCL-156) con mitomicina C (Kyowa, Nycomed, Bruselas, Bélgica) y se usaron como células "estimulantes". Se cocultivaron células de respuesta (0,12 x 106), células estimulantes (0,045 x 106) y compuestos (en diferentes concentraciones) durante 6 días en medio RPMI 1640 (BioWhittaker, Lonza, Bélgica) suplementado con suero de ternero fetal al 10%, Geneticina 100 U/mL (Gibco, LifeTechnologies, Reino Unido). Las células se cultivaron por triplicado en placas de cultivo de tejidos de microtitulación de 96 pocillos de fondo plano (TTP, Suiza). Después de 5 días, las células se pulsaron con 1 pCi de metil-3Timidina H (MP Biomedicals, EE. UU.), se cosecharon 18 h después en papel de filtro de vidrio y se contaron. Los valores de proliferación se expresaron como cuentas por minuto (cpm) y se convirtieron en % de inhibición con respecto a una prueba de MLR blanco (idéntica pero sin compuesto añadido). El IC50 se determinó a partir de un gráfico con al menos cuatro puntos, cada uno derivado de la media de 2 experimentos. El valor de IC50 representa la concentración más baja de compuesto de ensayo (expresada en pM) que dio como resultado una inhibición del 50% de la MLR.
Se encontró que ciertos compuestos de los Ejemplos adjuntos generan valores de IC50 en la prueba de MLR de 10 pM o mejores.
Ejemplos
Abreviaturas
THF: tetrahidrofurano MeOH: metanol
DMF: N,N-dimetilformamida DMSO: dimetilsulfóxido
DCM: diclorometano DIPEA: N N-diisopropiletilamina
EtOH: etanol EtOAc: acetato de etilo
DEAD: azodicarboxilato de dietilo DMAP: 4-(dimetilamino)piridina
IPA: alcohol isopropílico HOBT: 1-hidroxibenzotriazol
EDCI: hidrocloruro de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida
H: hora ee: exceso enantiómero
MS: espectrometría de masas M: masa
RT: tiempo de retención t .a.: temperatura ambiente
LCMS: espectrometría de masas por cromatografía líquida
HPLC: cromatografía de líquidos de alta resolución
ES : ionización positiva por electropulverización
Métodos analíticos y de purificación
Método 1
PH bajo
Columna: Phenomenex Kinetex-XB C18 (columna de 2,1 x 100 mm, 1,7 pm)
Caudal: 0,6 mL/minuto
Disolvente A: ácido fórmico al 0,1%/agua
Disolvente B: ácido fórmico al 0,1%/acetonitrilo
Volumen de 3 pL
inyección:
Temperatura de la 40°C
columna:
Longitud de onda 215 nm
de detección UV:
Eluyente: 0 a 5,3 minutos: gradiente constante desde disolvente A al 95% disolvente B al 5% hasta disolvente B al 100%; 5,3 a 5,8 minutos: disolvente B al 100%; Gradiente constante de 5,80 a 5,82 minutos desde disolvente al 100% B hasta disolvente A al 95% disolvente B al 5%. Detección por MS mediante Waters LCT o LCT Premier, o ZQ o ZMD
Detección por UV utilizando la matriz de fotodiodos Waters 2996 o Waters 2787 UV o Waters 2788 UV
Método 2
pH alto (aproximadamente pH 10)
Columna: Phenomenex Gemini®-NX C18, 2,0 x 50 mm, 3 mm
Caudal: 1 mL/minuto
Disolvente A: bicarbonato de amonio 2 nM, tamponado a pH 10
Disolvente B: acetonitrilo
Volumen de 3 pL
inyección:
Temperatura de la 40° C
columna:
Longitud de onda 215 nm
de detección UV:
Eluyente: 0 a 1,8 minutos: gradiente constante desde disolvente A al 99% disolvente B al 1% hasta disolvente B al 100%; 1,8 a 2,1 minutos: disolvente B al 100%; 2,1 a 5,3 minutos: gradiente constante desde disolvente B al 100% hasta disolvente A al 99% disolvente B al 1%; 2,3 a 3,5 minutos: disolvente A al 99% disolvente B al 1%.
Método 3
pH bajo
Columna: Supelco Ascentis® Express C18, 2,1 x 30 mm, 2,7 mm
Caudal: 1 mL/minuto
Disolvente A: ácido fórmico al 0,1%/agua
Disolvente B: ácido fórmico al 0,1%/acetonitrilo
Volumen de 3 pL
inyección:
Temperatura de la 40°C
columna:
Longitud de onda 215 nm
de detección UV:
Eluyente: 0 a 1,5 minutos: gradiente constante desde disolvente A al 95% disolvente B al 5% hasta disolvente B al 100%; 1,5 a 1,6 minutos: disolvente B al 100%; 1,6 a 1,61 minutos: gradiente constante desde disolvente B al 100% hasta disolvente A al 95% disolvente B al 5%.
Método 4
pH alto (aproximadamente pH 9,5)
Columna: Waters XBridge, C18, 2,1 x 20 mm, 2,5 pm
Disolvente A: formiato de amonio 10 mM en agua solución de amoniaco al 0,1% Disolvente B: acetonitrilo disolvente A al 5% solución de amoniaco al 0,1% Programa de gradiente:
Figure imgf000014_0002
Método 5
pH alto (aproximadamente pH 9,5)
Columna: Waters XBridge, C18, 2,1 x 20 mm, 2,5 pm
Disolvente A: formiato de amonio 10 mM en agua solución de amoniaco al 0,1% Disolvente B: acetonitrilo disolvente A al 5% solución de amoniaco al 0,1% Programa de gradiente:
Figure imgf000014_0003
Método 6
pH bajo
Columna: Sunfire C18, 3,5 pm, 4,6 x 100 mm
Temperatura: 45°C
Caudal: 1,9 mL/minuto
Disolvente A: agua
Disolvente B: acetonitrilo
Disolvente C: agua ácido fórmico al 0,5%
Programa de gradiente:
Figure imgf000014_0001
Método 7
pH alto
Columna: Acquity uPLCr HSS T3, C18, 1,8 pm, 2,1 x 100 mm
Temperatura: 45°C
Caudal: 0,4 mL/minuto
Disolvente A: agua/acetonitrilo / formiato de amonio (95/5/63 mg/L)
Disolvente B: acetonitrilo
Programa de gradiente:
Figure imgf000015_0002
Método 8
pH bajo
Columna: Sunfire C18, 3,5 pm, 4,6 x 100 mm
Temperatura: 45°C
Caudal: 1,9 mL/minuto
Disolvente A: agua
Disolvente B: acetonitrilo
Disolvente C: agua ácido fórmico al 0,5%
Programa de gradiente:
Figure imgf000015_0001
HPLC preparativa
Método básico 1
Columna: Waters Sunfire, C18, 30 mm x 100 mm
Caudal: 40 mL/minuto
Fase móvil A: Agua hidróxido de amonio al 0,2%
Fase móvil B: Acetonitrilo hidróxido de amonio al 0,2%
Tamaño de partícula: 5 pm
Tiempo de ejecución: 15,5 minutos
Método (isocrático): T = 0 minutos: 95% A; 5% B T = 2,0 minutos: 85% A; 15% B T = 12,0 minutos: 70% A; 30% B T = 12,5 minutos: 5% A; 95% B
T = 15,0 minutos: 5% A; 95% B
T = 15,5 minutos: 95% A; 5% B
Longitud de onda primaria (recolección): 215 nm
Longitud de onda secundaria: 254 nm
Equipo: Manipulador de líquidos Gilson 215, 2 bombas Gilson 306,
Módulo manométrico Gilson 805, detector dual UV/Vis Gilson 119
Software: Gilson Unipoint V5.11
Método básico 2
Columna: Waters XBridge, C18, 19 mm x 100 mm
Caudal: 20 mL/minuto (19 mL/min de fase móvil, más 1 mL/min de acetonitrilo ACD)
Fase móvil A: Bicarbonato de amonio 10 mM hidróxido de amonio al 0,1%
Fase móvil B: Acetonitrilo hidróxido de amonio al 0,1%
Tamaño de partícula: 5 pm
Tiempo de ejecución: 15 minutos
Método (isocrático): T = 0 minutos: 75% A; 25% B
T = 2 minutos: 75% A; 25% B
T = 11 minutos: 60% A; 40% B
T = 11,3 minutos: 5% A; 95% B
T = 13 minutos: 5% A; 95% B
T = 13,2 minutos: 75% A, 25% B
Gama de recogida UV: 230-400 nm
Equipo: Sistema Waters Fractionlynx, 2545 BGM, módulo de recolección 2767
Software: Mass Lynx V4.1 SCN737
Método orgánico polar
Columna: HILIC 250 x 30 mm
Caudal: 25 mL/minuto
Fase móvil A: terc-Butil metil éter
Fase móvil B: Etanol:metanol (50:50)
Tamaño de partícula: 5 pm
Tiempo de ejecución: 50 minutos
Método (isocrático): Fase móvil B 30%; Fase móvil A 70%
Longitud de onda primaria (recolección): Gráfico máximo (210-240 nm)
Longitud de onda secundaria: 254 nm
Equipo: Instrumento Shimadzu LC-8A
Software: Soluciones LC
Compuesto intermedio 1
4- Cloro-1,3-dimetilpirazolo[3,4-c/]pirimidin-6-amina
Se añadió gota a gota metilhidrazina (~ 40%, 12,9 g, ~ 0,11 mmoles) a una suspensión de 1 -(2-amino-4,6-dicloropirimidin-5- il)etanona (documento WO 2014/096423; 25 g, 0,12 mmoles) y trietilamina (36,8 g) en THF (350 mL) a -10°C. La mezcla se dejó calentar a t.a. y se agitó durante la noche. Se añadió agua (200 mL) a la suspensión. La mezcla se agitó durante 10 minutos y luego se filtró. El sólido se lavó con THF (50 mL) y agua (300 mL), luego se secó en un horno a 50°C bajo nitrógeno durante 16 h para proporcionar un primer lote de material (8,5 g). Las aguas madres se concentraron hasta un pequeño volumen y luego se filtraron. El sólido resultante se lavó con agua (2 x 100 mL) y se secó al vacío para dar un segundo lote de material (12,5 g). Los dos lotes se combinaron y luego se trituraron con terc-butil metil éter (x 2) a 50°C. El sólido se recogió y luego se secó a 50°C durante 1 h a vacío, para dar el compuesto del título (15 g, 60%) como un sólido blanco. 5h (400 MHz, DMSO-d6) 7,20 (s, 2 H), 3,69 (s, 3 H), 2,43 (s, 3 H).
Compuesto intermedio 2
5-Amino-3-metil-4H-isoxazolo[4,5-a(|pirimidin-7-ona
Se calentaron 4-amino-3-metilisoxazol-5-carboxilato de metilo (195 g, 1,25 moles) y clorhidrato de cloroformamidina (150 g, 1,31 moles) en sulfolano (781 mL) a 80°C durante 45 h. La solución viscosa de color marrón oscuro resultante se termorreguló a 20°C. Se añadió una solución acuosa de NaOH (2 M, 1876 mL, 3,75 moles) a la mezcla de reacción, que se calentó a 50°C para completar la ciclación. La suspensión resultante (pH 13,2) se calentó a 60°C y se convirtió en una solución. Después de la adición de salmuera (820 mL), la solución se ajustó a pH 5,5 con HCl 2 M (795 mL). El precipitado resultante se enfrió a 10°C durante 3 h y se mantuvo a esta temperatura durante 1 h. La suspensión se eliminó por filtración, luego se lavó con agua desionizada (3 x 390 mL), seguido de secado a 50°C en un horno de vacío, para dar el compuesto del título (150 g, 66%) como un sólido de color marrón claro. 5h (400 MHz, DMSO-d6) 11,40 (s ancho, 1 H), 6,55 (s, 2 H), 2,33 (s, 3 H). LCMS (ES+) 167 [M H]+, RT 2,39 minutos (método 6).
Compuesto intermedio 3
N-(3-Metil-7-oxo-4H-isoxazolo[4,5-a(|pirimidin-5-il)acetamida
Una mezcla de compuesto intermedio 2 (150 g, 0,82 moles), 4-metilmorfolina (267 g, 2,63 moles) y DMAP (11 g, 0,09 moles) se suspendió en acetonitrilo (680 mL) a 70°C. A la mezcla de reacción se añadió gota a gota anhídrido acético (184 g, 1,81 moles). Una vez que se completó la reacción, se añadió la suspensión fina a agua desionizada (1110 mL) durante 15 minutos. La suspensión se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 h. Después de la filtración, el sólido se lavó con agua desionizada (2 x 450 mL), luego se secó a 50°C en un horno de vacío, para dar el compuesto del título (147 g, 86%) como un sólido beige. 5h (400 MHz, DMSO-d6) 12,40 (s ancho, 1 H), 12,00 (s ancho, 1 H), 2,43 (s, 3 H), 2,18 (s, 3 H). LCMS (ES+) 209 [M H]+, RT 2,68 minutos (método 7).
Compuesto intermedio 4
N-(7-Cloro-3-metilisoxazolo[4,5-a(]pirimidin-5-il)acetamida
Se calentó a 70°C una suspensión de compuesto intermedio 3 (145 g, 0,70 moles) en tolueno (870 mL) y N,N-dietilanilina (166 g, 1,11 moles) a 70°C. Se añadió cloruro de fosforilo (320,40 g, 2,09 moles) y se dejó reaccionar la mezcla durante 8 h. Se añadió tolueno adicional (580 mL) a la mezcla de reacción, antes de enfriar a 5°C durante 7 h. Se filtró la suspensión resultante. El sólido recogido se lavó en primer lugar con tolueno (435 mL) a 5°C y en segundo lugar con tolueno (435 mL) a 20°C, seguido de secado a 50°C en un horno de vacío, para producir el compuesto del título (131 g, 80%) como un sólido blanquecino. 5h (400 MHz, DMSO-d6) 11,10 (s, 1 H), 2,57 (s, 3 H), 2,18 (s, 3 H). LCMS (ES+) 227/229 [M H]+, RT 3,57 minutos (método 8).
Compuesto intermedio 5
(4-Metoxi-3-metilfenil)hidrazina
4-Metoxi-3-metilanilina (9,88 g, 68,4 mmoles) se disolvió en HCl 2 M (150 mL) y se enfrió a 0°C (baño de hielo). Se añadió lentamente gota a gota una solución de nitrito de sodio (4,98 g, 71,8 mmoles) en agua (40 mL), asegurando que la temperatura de la mezcla de reacción no subiera por encima de 5°C. La mezcla de reacción se agitó durante 30 minutos. En un matraz separado se añadieron hidrosulfito de sodio (42 g, 205 mmoles), NaOH (1,4 g, 35 mmoles) y agua (120 mL). La mezcla se enfrió a 0°C (baño de hielo). La mezcla de sal de diazonio se transfirió a un embudo de adición, luego se añadió lentamente gota a gota al segundo matraz, manteniendo la temperatura por debajo de 5°C. Después de la adición, se dejó que el matraz se calentara a temperatura ambiente, luego se ajustó el pH a pH 8 con una solución acuosa de NaOH al 50%. La solución naranja resultante se extrajo con EtOAc (3 x 100 mL). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con agua (100 mL) y salmuera (100 mL), luego se secaron (Na2SO4) y se evaporó, para dar el compuesto del título (10,15 g, 97,5%) como un sólido marrón. 5h (400 MHz, DMSO-d6) 6,71 (d, 1 H, J 8,5 Hz), 6,61 (d, 1 H, J 2,8 Hz), 6,58 (dd, 1H, J 8,5, 2,8 Hz), 6,15 (s ancho, 1 H), 3,81 (s ancho, 2 H), 3,66 (s, 3 H), 2,07 (s, 3 H).
Compuesto intermedio 6
[5-Metoxi-6-(trifluorometil)piridin-2-il]hidrazina
A una solución de 6-bromo-3-metoxi-2-(trifluorometil)piridina (4,0 g, 15,7 mmoles) en EtOH (7 mL) se le añadió hidrato de hidrazina (30 mL). La mezcla de reacción se calentó a 100°C durante 12 h, luego se concentró a vacío. El residuo se diluyó con agua (50 mL) y se extrajo con EtOAc (2 x 100 mL). La capa orgánica se separó, se secó sobre Na2SO4 y se concentró a vacío. El material bruto resultante se purificó mediante cromatografía en columna (MeOH al 5% en DCM) para proporcionar el compuesto del título (1.00 g, 31%) como un sólido amarillo. 5h (400 MHz, DMSO-d6) 7,62 (d, 1 H, J 9.2 Hz), 7,44 (s, 1 H), 7,03 (d, 1 H, J 9,2 Hz), 4,30 (s ancho, 2 H), 3,73 (s, 3 H).
Compuesto intermedio 7
N-(4-Metoxianilino)carbamato de terc-butilo
A una solución de hidrocloruro de 4-metoxifenilhidrazina (4,00 g, 22,9 mmoles) en MeOH (44 mL) a 0°C se le añadió trietilamina (6,95 g, 69,0 mmoles). Después de 5 minutos a 0°C, se añadió dicarbonato de terc-butilo (5,50 g, 25,2 mmoles). La mezcla de reacción se calentó a t.a. durante 10 minutos, luego se calentó a reflujo durante 5 h bajo una atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se concentró a vacío, luego, el residuo se disolvió en EtOAc (100 mL). La capa orgánica se lavó con agua (2 x 20 mL) y salmuera (20 mL), luego se secó sobre Na2SO4 y se filtró a través de tierra de diatomeas. El filtrado se concentró a vacío para amueblar el compuesto del título (5,42 g, 88%) como un jarabe marrón. 5h (500 MHz, DMSO-d6) 8,67 (s ancho, 1H), 7,17 (s ancho, 1H), 6,72-6,77 (m, 2H), 6,58-6,65 (m, 2H), 3,65 (s, 3H), 1,39 (s ancho, 9H). LCMS (ES+) 261 [M Na]+, RT 1,17 minutos (método 3).
Compuesto intermedio 8
N-(4-Metoxi-3-metilanilino)carbamato de terc-butilo
Se preparó a partir de compuesto intermedio 5 según el método descrito para el compuesto intermedio 7, excepto que la reacción se realizó a t.a. durante la noche. El material bruto se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida (elución en gradiente con EtOAc al 5-20%/isohexano) para proporcionar el compuesto del título (10,4 g, 62%) como un sólido rojo/marrón. 5h (300 MHz, DMSO-ds) 8,63 (s, 1 H), 7,05-7,09 (s, 1 H), 6,73 (d, 1 H, J 8,6 Hz), 6,43-6,50 (m, 2 H), 3,67 (s, 3 H), 2,07 (s, 3 H), 1,39 (s, 9 H). LCMS (ES+) 253 [M H]+, RT 1,41 minutos (método 4).
Compuesto intermedio 9
N-{[5-Metoxi-6-(trifluorometil)piridin-2-il]amino}carbamato de terc-butilo
Se preparó a partir del compuesto intermedio 6 según el método descrito para el compuesto intermedio 8. El material bruto se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida (MeOH al 10% en DCM) para proporcionar el compuesto del título (1,00 g, 67%) como un sólido blanco. 5h (400 MHz, DMSO-d6) 8,81 (s, 1 H), 8,61 (s, 1 H), 7,67 (d, 1 H, J 9,1 Hz), 6,82 (d, 1 H, J 9,0 Hz), 3,81 (s, 3 H), 1,40 (s, 9 H). MS (ESI) m/z [M H-íBu]+ 251,9.
Compuesto intermedio 10
N-[4-(Trifluorometoxi)anilino]carbamato de terc-butilo
Se preparó a partir de hidrocloruro de 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazina (10,6 g, 45,4 mmoles) según el método descrito para el compuesto intermedio 8. El compuesto del título (11,98 g, 90%) se obtuvo como un sólido amarillo. 5h (300 MHz, DMSO-ds) 8,83 (s, 1 H), 7,81 (s, 1 H), 7,10-7,15 (m, 2 H), 6,67-6,71 (m, 2 H), 1,41 (s, 9 H). LCMS (ES+) 315 [M Na]+, RT 1,54 minutos (método 4).
Compuesto intermedio 11
2 (N-Metoxi-N-metilcarbamoil)piperazina-1,4-dicarboxilato de O1-bencilo y O4-terc-butilo
A una solución de ácido 1-(benciloxicarbonil)-4-(terc-butoxicarbonil)piperazina-2-carboxílico (18,0 g, 49,3 mmoles) en DMF (200 mL) se añadió hidrocloruro de N,O-dimetilhidroxilamina (10,8 g, 111 mmoles), trietilamina (20,6 mL, 148 mmoles), EDCI (21,2 g, 111 mmoles) y HOBT (15,0 g, 111 mmoles). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 5 h, luego se diluyó con agua (100 mL) y se extrajo con EtOAc (2 x 100 mL). La capa orgánica se separó, se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró a vacío. El residuo bruto se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida (EtOAc al 10% en hexanos) para proporcionar el compuesto del título (18,0 g, 90%) como un semisólido incoloro. 5h (400 MHz, DMSO-d6) 7,28-7,39 (m, 5 H), 5,00-5,14 (m, 3 H), 3,75 (s, 3 H), 3,47 (s, 3 H), 2,80­ 3,20 (m, 6 H), 1,35 (s, 9 H). MS (ESI) m/z [M H]+ 408,00.
Compuesto intermedio 12
2-Acetilpiperazina-1,4-dicarboxilato de O1-bencilo y O4-terc-butilo
A una solución del compuesto intermedio 11 (6,00 g, 14,7 mmoles) en éter dietílico (120 mL), mantenida a 0°C, se añadió bromuro de metilmagnesio (solución 1,6 M en THF, 31,6 mL, 44,2 mmoles). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 h, luego se enfrió a 0°C y se inactivó con una solución acuosa saturada de cloruro de amonio (20 mL). La capa acuosa se extrajo con EtOAc (2 x 100 mL), luego la capa orgánica se separó, se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró a vacío. El residuo bruto se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida (MeOH al 2% en DCM) para proporcionar el compuesto del título (8,00 g, 75%) como un semisólido incoloro. 5h (400 MHz, DMSO-de) 7,17-7,40 (m, 5H), 5,06-5,19 (m, 3H), 4,67-4,75 (m, 1H), 4,41-4,57 (m, 1H), 3,72-3.82 (m, 2H), 2,95­ 3,05 ( m, 2 H), 2,18 (s, 3 H), 1,37 (s, 9 H). MS (ESI) m/z [M H]+ 363,00.
Compuesto intermedio 13
2- (1-Hidroxietil)piperazina-1,4-dicarboxilato de O1-bencilo y O4-terc-butilo
A una solución del compuesto intermedio 12 (6,00 g, 16,5 mmoles) en THF (60 mL) y EtOH (60 mL), mantenida a 0°C, se añadió borohidruro de sodio (1,87 g, 49,6 mmoles). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 h, luego se inactivó con una solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio (10 mL) y se extrajo con EtOAc (2 x 100 mL). La capa orgánica se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró a vacío. El residuo bruto se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida (MeOH al 2% en DCM) para proporcionar el compuesto del título (5,00 g, 83%) como un semisólido incoloro. 5h (400 MHz, DMSO-d6) 7,28-7,40 (m, 5H), 5,05-5,19 (m, 2H), 4,79 (s ancho, 1H), 4,49 (m, 1H), 4,19-4,31 (m, 1H), 3,70-3,92 (m, 4H), 2,70-2,90 (m, 2H), 1,40 (s, 9H), 1,20 (d, 3H, J 5,7 Hz). MS (ESI) m/z [M H]+ 365,00.
Compuesto intermedio 14
3- (1-Hidroxietil)piperazina-1-carboxilato de terc-butilo
Se añadió Pd al 10%/C (1,50 g) a una solución del compuesto intermedio 13 (5,00 g, 13,7 mmoles) en EtOH (50 mL). La mezcla de reacción se agitó a 0,69 MPa (100 psi) bajo hidrógeno durante 4 h, luego se diluyó con EtOAc (2 x 100 mL) y se filtró a través de celite. El filtrado se concentró a vacío. El residuo bruto se purificó mediante cromatografía en columna (MeOH al 15% en DCM) para proporcionar el compuesto del título (2,50 g, 81%) como un semisólido incoloro. MS (ESI) m/z [M H]+ 231,00.
Compuesto intermedio 15
4- [N-(terc-Butoxicarbonilamino)-N-(4-metoxifenil)carbamoil]-3-(hidroximetil)piperazina-1-carboxilato de terc-butilo
Se enfrió THF anhidro (16 mL) a 0°C en una atmósfera de nitrógeno y se añadió fosgeno (solución al 20% en tolueno, 2,0 mL, 4,03 mmoles). Una solución premezclada de compuesto intermedio 7 (800 mg, 2,99 mmoles) y DIPEA (521 mg, 4,03 mmoles) en THF anhidro (8 mL) se añadió gota a gota a la solución de fosgeno a 0°C. La mezcla de reacción se calentó a t.a. durante 10 minutos, luego se enfrió a 0°C. Se añadió gota a gota una solución premezclada de 3-(hidroximetil)piperazina-1 -carboxilato de terc-butilo racémico (870 mg) y DIPEA (521 mg, 4,03 mmoles) en THF anhidro (8 mL) a 0°C. Una vez que se completó la adición, la mezcla de reacción se calentó a t.a. durante 14 h, luego se concentró a vacío. El residuo se volvió a disolver en EtOAc (60 mL). La fase orgánica se lavó con ácido cítrico acuoso 1 M (2 x 20 mL), solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio (20 mL) y salmuera (20 mL), luego se secó sobre Na2SO4 y se filtró. El filtrado se adsorbió sobre sílice (~ 10 mL) a vacío. El material cargado en seco se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida (gradiente de heptano/EtOAc) para proporcionar el compuesto del título (1,02 g, 66%) como una espuma blanquecina. 5h (353K, 250 MHz, DMSO-d6) 9,07 (s, 1H), 7,06-7,14 (m, 2H), 6,85-6,92 (m, 2H), 4,41 (t, 1H, J 5,1 Hz), 3,98 (m, 1 H), 3,90 (dt, 1 H, J 13,2, 1,8 Hz), 3,75 (s, 3 H), 3,71 (d, 1 H, J 12,0 Hz), 3,49 (m, 3 H), 2,86-2,96 (m, 2 H), 2,70-2,84 (m, 1 H), 1,42 (s, 9 H), 1,40 (s, 9 H). LCMS (ES+) 481 [M H]+, RT 1,30 minutos (método 3).
Compuesto intermedio 16
4-[N-(terc-Butoxicarbonilamino)-N-(4-metoxi-3-metilfenil)carbamoil]-3-(hidroximetil)piperazina-1-carboxilato de terc-butilo
Se preparó a partir del compuesto intermedio 8 según el método descrito para el compuesto intermedio 15. El compuesto del título (318 mg, 53%) se obtuvo como un aceite incoloro. 5h (400 MHz, DMSO-d6) 9,48 (s, 1 H), 6,92-6,95 (m, 2 H), 6,83-6,88 (m, 1 H), 4,74 (s, 1 H), 3,89-4,00 (m, 1 H), 3,76 (s, 3 H), 3,73 (s ancho, 1H), 3,39-3,44 (m, 3H), 2,67-3,00 (m, 4H), 2,11 (s, 3H), 1,37-1,43 (m, 18H). Picos anchos (rotámeros). lCm S (ES+) 495 [M H]+, RT 1,48 minutos (método 4).
Compuesto intermedio 17
(3S)-4-[N-(terc-Butoxicarbonilamino)-N-(4-metoxi-3-metilfenil)-carbamoil]-3-(hidroximetil)piperazina-1-carboxilato de terc-butilo
Se preparó a partir del compuesto intermedio 8 con (3S)-3-(hidroximetil)piperazina-1-carboxilato de terc-butilo quiralmente puro (> 95% ee) de acuerdo con el método descrito para el compuesto intermedio 15. El compuesto del título (3,12 g, 80%) se aisló como un aceite incoloro. Los datos analíticos coincidieron con los obtenidos para el compuesto intermedio 16.
Compuesto intermedio 18
4-{N-(terc-Butoxicarbonilamino)-N-[5-metoxi-6-(trifluorometil)piridin-2-il]carbamoil}-3-(hidroximetil)piperazina-1-carboxilato de terc-butilo
Se preparó a partir del compuesto intermedio 9 según el método descrito para el compuesto intermedio 15. El compuesto del título (0,66 g, 46%) se aisló como un sólido blanco. 5h (400 MHz, DMSO-d6) 9,58 (s, 1 H), 7,81 (d, 1 H, J 9,2 Hz), 7,36 (d, 1 H, J 8,7 Hz), 4,36 (t, 1H, J 8;5 Hz), 3,87-4,08 (m, 2 H), 3,81 (s, 3 H), 3,40-3,70 (m, 3 H), 2,60-2,92 (m, 4 H), 1,40 (s, 18 H). MS (ESI) m/z [M H]+ 550,00.
Compuesto intermedio 19
(3S)-4-{N-(terc-Butoxicarbonilamino)-N-[4-(trifluorometoxi)fenil]-carbamoil}-3-(hidroximetil)piperazina-1-carboxilato de terc-butilo
Se preparó a partir del compuesto intermedio 10 y de (3S)-3-(hidroximetil)piperazina-1-carboxilato de terc-butilo quiralmente puro (> 95% ee) de acuerdo con el método descrito para el compuesto intermedio 15. El compuesto del título (0,40 g, 40%) se aisló como un sólido blanquecino. MS (ESI) m/z [M H-BOC]+ 435,15.
Compuesto intermedio 20
4-[N-(terc-butoxicarbonilamino)-N-(4-metoxi-3-metilfenil)carbamoil]-3-(1-hidroxietil)piperazina-1-carboxilato de terc-butilo Se preparó a partir del compuesto intermedio 8 y el compuesto intermedio 14 según el método descrito para el compuesto intermedio 15. El compuesto del título (1,30 g, 64%) se aisló como un sólido blanco. 5h (400 MHz, DMSO-d6) 9,54 (s, 1 H), 6,97 (d, J 8.5 Hz, 1 H), 6,90 (s, 1 H), 6,83 (d, J 8,5 Hz, 1 H), 4,64 (ancho s, 1 H), 4,05-4,13 (m, 1 H), 3,75 (día, J 4,8 Hz, 1 H), 3,68 (s, 3 H), 3,40-3,54 (m, 2 H), 2,60-2,88 (m, 4 H), 2,10 (s, 3 H), 1,39 (s, 18 H), 1,20 (d, J 6,0 Hz, 3 H). MS (ESI) m/z [M H]+ 509,00.
Compuesto intermedio 21
3-(4-Metoxifenil)-4-oxo-6,7,9,9a-tetrahidro-1 H-pirazino[1,2-d][1,2,4]-triazina-2,8-dicarboxilato de di-terc-butilo Se añadió trifenilfosfina (2,22 g, 8,46 mmoles) a una solución del compuesto intermedio 15 (1,01 g, 1,97 mmoles) en THF anhidro (25 mL) en una atmósfera de nitrógeno. Se añadió gota a gota una solución de DEAD (1,10 g, 6,35 mmoles) en THF anhidro (5 mL) durante 4 minutos. La mezcla de reacción se agitó durante 2 h, luego se adsorbió sobre sílice (~ 15 mL) a vacío y se purificó parcialmente mediante cromatografía en columna ultrarrápida (gradiente de heptano/acetato de etilo). El material aislado se disolvió en éter dietílico (60 mL), luego se lavó con una solución acuosa de hidróxido de sodio 4 M (4 x 10 mL) y salmuera (10 mL). El extracto orgánico se secó sobre Na2SO4, luego se filtró. La concentración del filtrado a vacío dio el compuesto del título (796 mg, 87%) como un sólido incoloro.
5h (353K, 250 MHz, DMSO-ds) 7,33-7,42 (m, 2H), 6,85-6,93 (m, 2H), 4,11-4,20 (m, 2H), 3,89-4,02 (m, 2H), 3,75 (s, 3H), 3,47-3,62 (m, 2H), 2,78 (ddd, 2H, J 9,3, 4,5, 1,7 Hz), 2,61-2,74 (m, 1 H), 1,44 (s, 9 H), 1,39 (s, 9 H). LCMS (ES+) 463 [M H]+, RT 1,75 minutos (método 3).
Compuesto intermedio 22
3-(4-Metoxi-3-metilfenil)-4-oxo-6,7,9,9a-tetrahidro-1 H-pirazino[1,2-d][1,2,4]triazina-2,8-dicarboxilato de di-terc-butilo Se preparó a partir del compuesto intermedio 16 según el método descrito para el compuesto intermedio 21 para dar el compuesto del título (298 mg, 97%) como un aceite incoloro. 5h (353 K, 400 MHz, DMSO-d6) 7,15-7,24 (m, 2H), 6,86-6,91 (m, 1H), 4,11-4,18 (m, 2H), 3,92-4,02 (m, 2H), 3,79 (s, 3H), 3,50-3,71 (m, 2H), 2,73-2,85 (m, 2H), 2,65-2,72 (m, 1H), 2,15 (s, 3H), 1,45 (s, 9H), 1,41 (s, 9H). LCMS (ES+) 477 [M H]+, RT 1,56 minutos (método 4).
Compuesto intermedio 23
(9aS)-3-(4-Metoxi-3-metilfenil)-4-oxo-6,7,9,9a-tetrahidro-1 H-pirazino[1,2-d][1,2,4]triazina-2,8-dicarboxilato de di-terc-butilo Se preparó a partir del compuesto intermedio 17 según el método descrito para el compuesto intermedio 21 para dar el compuesto del título (3,3 g, cuant.) como un aceite incoloro. Los datos analíticos coincidieron con los obtenidos para el compuesto intermedio 22.
Compuesto intermedio 24
3-[5-Metoxi-6-(trifluorometil)piridin-2-il]-4-oxo-6,7,9,9a-tetrahidro-1 H-pirazino[1,2-d][1,2,4]triazina-2,8-dicarboxilato de di-terc-butilo
Se preparó a partir del compuesto intermedio 18 según el método descrito para el compuesto intermedio 21 para dar el compuesto del título (0,35 g, 56%) como un semisólido marrón. 5h (400 MHz, DMSO-d6) 7,51-7,66 (m, 2H), 4,34 (t, 2H, J 8,6 Hz), 4,02-4,20 (m, 4 H), 3,91 (s, 3 H), 3,50-3,70 (m, 3 H), 1,40 (s, 18 H). MS (ESI) m/z [M H]+ 532,00. Compuesto intermedio 25
(9aS)-4-Oxo-3- [4-(trifluorometoxi) fenil]-6,7,9,9a-tetrahidro-1H-pirazino[1,2-d][1,2,4]triazina-2,8-dicarboxilato de diterc-butilo
Se preparó a partir del compuesto intermedio 19 según el método descrito para el compuesto intermedio 21 para dar el compuesto del título (0,25 g, 65%) como un sólido blanquecino. 5h (400 MHz, DMSO-d6) 7,58 (d, 2H, J 9,3 Hz), 7,33 (d, 2H, J 8,8 Hz), 4,45 (m, 2 H), 3,89-4,10 (m, 3 H), 3,64 (s ancho, 1 H), 2,77 (m, 3 H), 1,42 (s, 18 H). MS (ESI) m/z [M H-(f-Bu)]+ 461,00.
Compuesto intermedio 26
3-(4-Metoxi-3-metilfenil)-1 -metil-4-oxo-6,7,9,9a-tetrahidro-1 H-pirazino[1,2-d][1,2,4]triazina-2,8-dicarboxilato de di-tercbutilo
Se preparó a partir del compuesto intermedio 20 según el método descrito para el compuesto intermedio 21 para dar el compuesto del título (0,20 g, 42%) como un semisólido incoloro. 5h (400 MHz, DMSO-d6) 6,90-6,98 (m, 2 H), 6,80­ 6,86 (m, 1H), 5,18-5,20 (m, 1H), 3,98-4,28 (m, 3H), 3,75 (s, 3H), 3,30-3,60 (m, 4H), 2,10 (s, 3H), 1,40 (s, 18H), 1,20 (d, 3H, J 6,0 Hz). MS (ESI) m/z [M H]+ 491,00.
Compuesto intermedio 27
Hidrocloruro de 3-(4-metoxifenil)-2,6,7,8,9,9a-hexahidro-1 H-pirazino[1,2-d][1,2,4]triazin-4-ona
A una solución del compuesto intermedio 21 (796 mg, 1,72 mmoles) en 1,4-dioxano (50 mL) se añadió cloruro de hidrógeno (solución 4 M en 1,4-dioxano, 8,6 mL, 34,2 mmoles). Después de 20 h, la mezcla de reacción se concentró a vacío. El residuo se suspendió en 1,4-dioxano (5 mL) y luego se volvió a concentrar a vacío, para dar el compuesto del título (552 mg, 89%) como un sólido incoloro. 5h (500 MHz, D2O) 7,26-7,30 (m, 2H), 7,03-7,07 (m, 2H), 4,51-4,57 (m, 1H), 4,00-4,07 (m, 1H), 3,88 (s, 3H), 3,52-3,63 (m, 3H), 3,15-3,30 (m, 3H), 3,12 (t, 1H, J 12,3 Hz). LCMS (ES+) 263 [M H]+, RT 1,27 minutos (método 2).
Compuesto intermedio 28
Hidrocloruro de 3-(4-metoxi-3-metilfenil)-2,6,7,8,9,9a-hexahidro-1 H-pirazino [1,2-d][1,2,4]triazin-4-ona
Se preparó a partir del compuesto intermedio 22 según el método descrito para el compuesto intermedio 27 para dar el compuesto del título (304 mg, cuant.) como un sólido naranja. 5h (400 MHz, DMSO-d6) 9,40 (s, 2H), 7,21-7,24 (m, 2H), 6,80-6,83 (m, 1H), 4,37-4,43 (m, 1H), 3,78-3,87 (m, 1H), 3,74 (s, 3H) , 3,28-3,40 (m, 2 H), 3,19-3,24 (m, 1 H), 2,99-3,08 (m, 1 H), 2,76-2,98 (m, 3 H), 2,11 (s, 3 H). LCMS (ES+) 277 [M H]+, RT 0,99 minutos (método 4).
Compuesto intermedio 29
Hidrocloruro de (9aS)-3-(4-metoxi-3-metilfenil)-2,6,7,8,9,9a-hexahidro-1 H-pirazino[1,2-d][1,2,4]-triazin-4-ona Se preparó a partir del compuesto intermedio 23 según el método descrito para el compuesto intermedio 27 para dar el compuesto del título (3.6 g, cuant.) como un sólido naranja. Los datos analíticos coincidieron con los obtenidos para el compuesto intermedio 28.
Compuesto intermedio 30
Hidrocloruro de 3-[5-metoxi-6-(trifluorometil)piridin-2-il]-2,6,7,8,9,9a-hexahidro-1 H-pirazino[1,2-d][1,2,4]triazin-4-ona Se preparó a partir del compuesto intermedio 24 según el método descrito para el compuesto intermedio 27, excepto que el material crudo se trituró con éter dietílico (3 x 10 mL) y se secó a vacío, para dar el compuesto del título (0,18 g, 69%) como un sólido blanquecino. 5h (400 MHz, DMSO-d6) 9,40 (s ancho, 2 H), 7,80 (d, 1 H, J 9.1 Hz), 7,64 (d, 1H, J 9,0 Hz), 4,40-4,46 (m, 1H), 3,90-4,20 (m, 4H), 3,88 (s, 3H), 3,20-3,40 (m, 2H), 2,84 -3,10 (m, 2 H). MS (ESI) m/z [M H]+ 332,00.
Compuesto intermedio 31
Hidrocloruro de (9aS)-3-[4-(trifluorometoxi)fenil]-2,6,7,8,9,9a-hexahidro-1 H-pirazino[1,2-d][1,2,4]-triazin-4-ona Se preparó a partir del compuesto intermedio 25 según el método descrito para el compuesto intermedio 27. El compuesto del título (0,13 g, 85%) se obtuvo como un sólido blanquecino, 5h (400 MHz, DMSO-d6) 9,60 (s ancho, 2H), 7,66 (d, 2H, J 9,2 Hz), 7,26 (d, 2H, J 8,8 Hz), 4,43 (d, 1 H, J 13,9 Hz), 3,84-3,92 (m, 1 H), 3,30-3,40 (m, 2 H), 3,22-3,28 (m, 2 H), 2,78-3,15 (m, 3 H). MS (ESI) m/z [M H]+ 317,00.
Compuesto intermedio 32
Hidrocloruro de 3-(4-metoxi-3-metilfenil)-1 -metil-2,6,7,8,9,9a-hexahidro-1 H-pirazino[1,2-d]-[1,2,4]triazin-4-ona Se preparó a partir del compuesto intermedio 26 según el método descrito para el compuesto intermedio 30. El compuesto del título (0,10 g, 85%) se obtuvo como un sólido blanquecino, 5h (400 MHz, DMSO-d6) 8,98 (s, 1 H), 8,80 (s ancho, 1 H), 7,40-7,45 (m, 2 H), 7,30 (d, 1 H, J 6,6 Hz), 6,90 (s, 1 H), 4,11-4,19 (m, 2 H), 3,86 (s, 3 H), 3,76 (d, 2 H, J 13,5 Hz), 3,32-3,40 (m, 2H), 2,90-2,98 (m, 2H), 2,16 (s, 3H), 1,22 (d, 3H, J 6,0 Hz). MS (ESI) m/z [M H]+ 291,00.
Compuesto intermedio 33
4-[(9aS)-3-(4-Metoxi-3-metilfenil)-4-oxo-1,2,6,7,9,9a-hexahidropirazino[1,2-d]-[1,2,4]triazin-8-il]-2-cloropiridin-3-carbaldehído
Una mezcla de compuesto intermedio 29 (500 mg, 1,43 mmoles), 2,4-dicloropiridin-3-carbaldehído (252 mg, 1,43 mmoles) y DIPEA (1,5 ml, 8,6 mmoles) en THF (10 mL) se calentó a 70°C y se agitó durante 3 h, luego se enfrió a temperatura ambiente y se concentró a vacío. El residuo se disolvió en EtOAc (20 mL) y se lavó con una solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio (2 x 20 mL), luego se secó (Na2SO4 ) y se evaporó sobre sílice. El residuo bruto se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida (gradiente de EtOAc al 80-100% en isohexano) para proporcionar el compuesto del título (306 mg, 51%) como una goma amarilla. 5h (400 MHz, DMSO-d6) 10,23 (s, 1 H), 8,16 (d, 1 H, J 6,1 Hz), 7,23-7,26 (m, 2H), 7,15 (d, 1H, J 6,1 Hz), 6,80-6,83 (m, 1 H), 5,87 (dd, 1 H, J 9,2, 4,9 Hz), 4,21 -4,26 (m, 1 H), 3,75-3,69 (m, 1 H), 3,74 (s, 3 H), 3,57-3,62 (m, 1 H), 3,46-3,51 (m, 1 H), 3,32-3,35 ( m, 1 H), 3,07-3,14 (m, 1 H), 2,99-3,08 (m, 2 H), 2,81 -2,89 (m, 1 H), 2,11 (s, 3 H). LCMS (ES+) 416 [M H]+, RT 1,28 minutos (método 4).
Compuesto intermedio 34
N-{7-[(9aS)-3-(4-Metoxi-3-metilfenil)-4-oxo-1,2,6,7,9,9a-hexahidropirazino[1,2-d][1,2,4]triazin-8-il]-3-metilisoxazolo[4,5-d]pirimidin-5-il}acetamida
Una mezcla de compuesto intermedio 29 (1,3 g, 4,2 mmoles), compuesto intermedio 4 (951 mg, 4,2 mmoles) y DIPEA (2,2 mL, 13 mmoles) en IPA (30 mL) se agitó y se calentó a 80°C bajo nitrógeno durante 2,5 h, luego se enfrió a t.a. durante la noche. La mezcla de reacción se concentró a vacío. El residuo se disolvió en DCM (20 mL) y se lavó con una solución acuosa saturada de cloruro de amonio (20 mL) y salmuera (20 mL), luego se pasó a través de un cartucho separador de fases y se evaporó. El residuo bruto se adsorbió sobre sílice y se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida (gradiente de EtOAc al 40-100% en isohexano, luego MeOH al 0-10% en EtOAc). El residuo sólido se trituró en éter dietílico, luego se evaporó a sequedad, para dar el compuesto del título (1,33 g, 67,9%) como un sólido de color crema. 5h (300 MHz, DMSO-ds) 10,29 (s, 1 H), 7,20-7,31 (m, 2 H), 6,77-6,90 (m, 1 H), 5,90 (dd, 1 H, J 8,8, 5,3 Hz), 4,58-4,89 (m, 2H), 4,43 (d, 1H, J 13,1 Hz), 3,75 (s, 3 H), 3,56-3,71 (m, 1 H), 3,35-3,48 (m, 1 H), 3,06­ 3,48 (m, 2 H), 2,84-3,07 (m, 2 H), 2,46 (s, 3 H), 2,17 (s, 3 H), 2,12 (s, 3 H). LCMS (ES+) 467 [m H]+, RT 1,60 minutos (método 5).
Ejemplo 1
8-(6-Amino-1-metilpirazolo[3,4-d]pirimidin-4-il)-3-(4-metoxifenil)-1,2,6,7,9,9a-hexahidropirazino[1,2-d][1,2,4]triazin-4-ona
A una solución de compuesto intermedio 27 (300 mg, 0,83 mmoles) en 1-butanol (8 mL) se añadieron 4-cloro-1-metil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-6-amina (documento WO 2014/096423; 164 mg, 0,89 mmoles) y DIPEA (694 mg, 5,37 mmoles). La mezcla de reacción agitada se calentó a 110°C durante 2,5 h. Después de enfriar, la mezcla de reacción se concentró a sequedad y el residuo se suspendió en EtOAc (40 mL). La suspensión se lavó con una solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio (2 x 10 mL). Se separó un precipitado, que se formó en la unión de las fases, por filtración (después del segundo lavado con bicarbonato de sodio), luego se lavó con agua (0,5 mL) y EtOAc (2 mL). El sólido aislado se purificó mediante HPLC preparativa (método básico 1) para proporcionar el compuesto del título (62 mg, 17%) como un sólido incoloro. 5h (500 MHz, DMSO-ds) 8,03 (s, 1H), 7,37-7,43 (m, 2H), 6,80-6,86 (m, 2H), 6,22 (s, 2H), 5,90 (dd, 1H, J 8,9, 5,4 Hz), 4,57 (ancho s, 1H), 4,51 (ancho s, 1H), 4,33 (td, 1H, J 13,1,2,7 Hz), 3,72 (s, 3 H), 3,71 (s, 3 H), 3,61 (ddd, 1 H, J 10,4, 7,1, 3,4 Hz), 3,43 (dt, 1 H, J 13,7, 5,6 Hz), 3,18 (t, 1H, J 10,9 Hz), 3,06 (s, 1 H), 3,00 (dt, 1 H, J 14,7, 8,2 Hz), 2,86-2,95 (m, 1 H). LCMS (ES+) 410 [M H]+, RT 1,43 minutos (método 1).
La mezcla racémica del Ejemplo 1 (68 mg) se resolvió mediante HPLC preparativa quiral (columna: LUX A2, 20 mm x 250 mm, 5 pm; eluyente: modificador de dietilamina que contiene etanol; caudal: 21 mL/minuto; longitud de onda: 220 nm) para proporcionar (9aR)-8-(6-amino-1 -metil-1 H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-il)-3-(4-metoxifenil)-1,2,6,7,9,9ahexahidropirazino-[1,2-d][1,2,4]triazin-4-ona y (9aS)-8-(6-amino-1 -metil-1 H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-il)-3-(4-metoxifenil)-1,2,6,7,9,9a-hexahidropirazino[1,2-d][1,2,4]triazin-4-ona. Enantiómero que eluye en primer lugar (Isómero 1; 31 mg, ee 99%): LCMS (método 1) pureza 99% [UV215]. Enantiómero que eluye en segundo lugar (Isómero 2; 36 mg, ee 96%): Lc Ms (método 1) pureza 100% [UV215]. Los datos de 1H-RMN y LCMS de ambos isómeros fueron idénticos a los de la muestra racémica.
Ejemplo 2
8-(6-Amino-1-metilpirazolo[3,4-a(|pirimidin-4-il)-3-(4-metoxi-3-metilfenil)-1,2,6,7,9,9a-hexahidropirazino[1,2-d][1,2,4]triazin-4-ona
Se preparó a partir del compuesto intermedio 28 según el método descrito para el Ejemplo 1, excepto que la solución de EtOAc del tratamiento se evaporó sobre sílice y se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida (gradiente de MeOH al 1-10% en EtOAc). Las fracciones que contenían el producto se evaporaron y se liofilizaron en acetonitrilo/agua para producir el compuesto del título (502 mg, 21%) como un sólido blanco. 5h (400 MHz, DMSO-d6) 8,03 (s, 1H), 7,24-7,27 (m, 2H), 6,80-6,83 (m, 1H), 6,22 (s, 2H), 5,87 (dd, 1H, J 8,8, 5,3 Hz), 4,46-4,62 (m, 2H), 4,30­ 4,35 (m, 1H), 3,74 (s, 3H), 3,71 (s, 3H), 3,56-3,64 (m, 1H), 3,38-3,45 (m, 1H), 3,14-3,21 (m, 1H), 2,95-3,09 (m, 2H), 2,86-2,93 (m, 1H), 2,12 (s, 3H). LCMS (ES+) 424 [M H]+, RT 1,39 minutos (método 5).
Ejemplo 3
(9aS)-8-(6-Amino-1-metil-1 H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-il)-3-(4-metoxi-3-metilfenil)-1,2,6,7,9,9a-hexahidropirazino [1,2-d][1,2,4]triazin-4-ona
Se añadió DIPEA (3,8 mL, 22 mmoles) a una suspensión del compuesto intermedio 29 (1,25 g, 3,58 mmoles) y 4-cloro-1-metil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-6-amina (documento WO 2014/ 096423; 657 mg, 3,58 mmoles) en 1-butanol (40 mL). La mezcla de reacción se calentó a 110°C durante 3,5 h, luego se enfrió a t.a. y se concentró a vacío. El residuo se disolvió en EtOAc (20 mL) y se filtró a través de celite (para separar algo de material insoluble), luego se lavó con una solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio (2 x 20 mL) y se secó sobre Na2SO4. La fracción orgánica se evaporó sobre sílice y se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida (gradiente de MeOH al 3-10% en EtOAc). El segundo material de elución se trituró en EtOAc y se filtró, luego se lavó con EtOAc e isohexano. El residuo se evaporó hasta sequedad. El sólido de color crema resultante (410 mg) se purificó adicionalmente mediante HPLC preparativa (método básico 2), luego se liofilizó en acetonitrilo/agua, para producir el compuesto del título (44 mg, 2,9%) como un sólido blanco. Los datos analíticos coincidieron con los obtenidos para el Ejemplo 2.
Ejemplo 4
(9aS)-8-(6-Amino-1-metil-1 H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-il)-3-(4-metoxi-3-metilfenil)-6,7,9,9a-tetrahidropirazino[1,2-d][1,2,4]triazin-4-ona
El primer material de elución obtenido de la reacción descrita en el Ejemplo 3 se liofilizó en acetonitrilo/agua para producir el compuesto del título (63,2 mg, 4%) como un sólido blanco. 5h (400 MHz, DMSO-d6) 8,11 (s, 1 H), 7,13-7,17 (m, 3 H), 6,91 (d, 1 H, J 8.7 Hz), 6,28 (s, 2H), 4,76-4,81 (m, 1H), 4,63-4,68 (m, 1H), 4,37 (ddd, 1H, J 11,4, 3,2, 1,8 Hz), 4,18-4,23 (m, 1 H), 3,80 (s, 3 H), 3,73 (s, 3 H), 3,14-3,33 (m, 2 H), 2,88-2,95 (m, 1 H), 2,15 (s, 3 H). LCMS (ES+) 422 [M H]+, RT 1,64 minutos (método 5).
Ejemplo 5
8-(6-Amino-1,3-dimetilpirazolo[3,4-d]pirimidin-4-il)-3-(4-metoxi-3-metilfenil)-1,2,6,7,9,9a-hexahidropirazino[1,2-d][1,2,4]triazin-4-ona
Se preparó a partir del compuesto intermedio 28 y el compuesto intermedio 1 según el método descrito para el Ejemplo 2. El compuesto del título (105 mg, 27%) se aisló como un sólido blanco. 5h (400 MHz, DMSO-d6) 7,23-7,26 (m, 2H), 6,80-6,83 (m, 1H), 6,31 (s, 2H), 5,86 (dd, 1H, J 9,1,5,0 Hz), 4,33-4,38 (m, 1 H), 4,13-4,17 (m, 1 H), 4,06-4,11 (m, 1 H), 3,74 (s, 3 H), 3,60-3,68 (m, 1 H), 3,64 (s, 3H), 3,34-3,41 (m, 1H), 2,99-3,07 (m, 1H), 2,88-2,97 (m, 3H), 2,42 (s, 3H), 2,11 (s, 3H). LCMS (ES+) 438 [M H]+, Rt 1,16 minutos (método 5).
Ejemplo 6
(9a,S)-8-(6-Amino-1,3-dimetilpirazolo[3,4-d]pirimidin-4-il)-3-(4-metoxi-3-metilfenil)-1,2,6,7,9,9a-hexahidropirazino [1,2-d][1,2,4]triazin-4-ona
Se preparó a partir del compuesto intermedio 29 y el compuesto intermedio 1 según el método descrito para Ejemplo 2. El compuesto del título (76 mg, 26%, ee 94,2%) se aisló como un sólido blanco. Los datos analíticos coincidieron con los obtenidos para el Ejemplo 5.
Ejemplo 7
8-(6-Amino-1-metil-1 H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-il)-3-[5-metoxi-6-(trifluorometil)piridin-2-il]-1,2,6,7,9,9ahexahidropirazino [1,2-d][1,2,4]triazin-4-ona
A una solución del compuesto intermedio 30 (0,18 g, 0,77 mmoles) en EtOH (20 mL) se añadieron DIPEA (0,38 mL, 2,33 mmoles) y 4-cloro-1-metil-1H-pirazolo[3,4-d]-pirimidin-6-amina (documento Wo 2014/096423; 0,21 g, 1,16 mmoles). La mezcla de reacción se calentó a 80°C durante 4 h, luego se diluyó con agua (20 mL) y se extrajo con EtOAc (3 x 20 mL). La capa orgánica se separó, se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró a vacío. El residuo bruto se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida (DCM al 5% en MeOH) para proporcionar el compuesto del título (0,06 g, 18%) como un sólido blanquecino. 5h (400 MHz, DMSO-d6) 8,05 (s, 1 H), 7,78 (d, 1 H, J 9,0 Hz), 7,68 (d, 1 H, J 9,0 Hz), 6,24 (s, 2H), 6,02-6,10 (m, 1H), 4,44-4,62 (m, 2H), 4,33 (d, 1H, J 12,9 Hz), 3,92 (s, 3 H), 3,71 (s, 3 H), 3,60-3,68 (m, 1 H), 3,40-3,50 (m, 1 H), 2,95-3,24 (m, 4 H). MS (ESI) m/z [M H]+ 479,00.
Ejemplo 8
(9aS)-8-(6-Amino-1-metil-1 H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-il)-3-[4-(trifluorometoxi)-fenil]-1,2,6,7,9,9ahexahidropirazino[1,2-d][1,2,4]triazin-4-ona
Se preparó a partir del compuesto intermedio 31 según el método descrito para el Ejemplo 2. El compuesto del título (0,06 g, 34%) se obtuvo como un sólido blanquecino. 5h (400 MHz, DMSO-d6) 8,04 (s, 1 H), 7,70 (d, 2 H, J 9,19 Hz), 7,26 (d, 2H, J 8,73 Hz), 6,24 (s, 2H), 6,00 (m, 1H), 4,58 (s ancho, 2H), 4,36 (d, 1H, J 13,33 Hz), 3,71 (s, 3 H), 3,65 (m, 1 H), 3,40-3,53 (m, 1 H), 3,18 (m, 1 H), 2,89-3,12 (m, 3 H). MS (ESI) m/z [M H]+ 464,00.
Ejemplo 9
cis- y trans-8-(6-Amino-1 -metil-1 H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-il)-3-(4-metoxi-3-metilfenil)-1 -metil-1,2,6,7,9,9ahexahidropirazino[1,2-d][1,2,4]triazin-4-ona
A una solución del compuesto intermedio 32 (0,10 g, 0,34 mmoles) en EtOH (10 mL) se añadió DIPEA (0,17 mL, 1,03 mmoles), seguido de 4-cloro-1-metil-1H-pirazolo[3,4-d]-pirimidin-6-amina (documento WO 2014/096423; 0,09 g, 0,51 mmoles). La mezcla de reacción se calentó a 100°C durante 12 h, luego se enfrió a t.a. y se concentró a vacío. El residuo se diluyó con DCM (20 mL) y se filtró, luego el filtrado se concentró al vacío. El residuo bruto se purificó mediante cromatografía en columna (gradiente de MeOH al 0-4% en DCM) para proporcionar el compuesto del título como una mezcla de isómeros trans:cis 3:1. Los dos isómeros se separaron por HPLC (método orgánico polar).
El isómero cis, el primer pico de elución (34 mg, 22%), se obtuvo como un sólido blanquecino. LCMS (método 5) pureza 97,6%. 5h (400 MHz, DMSO-ds) 7,98 (s, 1 H), 7,26 (m, 2 H), 6,82 (d, 1 H, J 8.4 Hz), 6,24 (s, 2H), 5,72 (d, 1H, J 10,5 Hz), 4,50-4,70 (m, 2H), 4,35 (d, 1H, J 12,9 Hz), 3,74 (s, 3 H), 3,70 (s, 3 H), 3,20-3,30 (m, 2 H), 3,05 (dd, J 17,2, 7,9 Hz, 1 H), 2,92-2,81 (m, 2 H), 2,12 (s, 3 H), 1,25 (d, 3 H, J 6,4 Hz). MS (ESI) m/z [M h ]+ 438,00.
El isómero trans, el segundo pico de elución (95 mg, 64%), se obtuvo como un sólido blanquecino. LCMS (método 5) pureza 96,6%. 5h (400 MHz, DMSO-ds) 7,98 (s, 1 H), 7,26 (m, 2 H), 6,82 (d, J 8.4 Hz, 1 H), 6,24 (s, 2 H), 5,93 (d, 1 H, J 7,6 Hz), 4,50-4,60 (m, 2H), 4,35 (d, 1H, J 12,9 Hz), 3,74 (s, 3 H), 3,70 (s, 3 H), 3,44-3,54 (m, 2 H), 3,20-3,30 (m, 2 H), 2,92-3,00 (m, 1 H), 2,12 (s, 3 H) , 1,16 (d, 3 H, J 6,4 Hz). MS (ESI) m/z [M H]+ 438,00.
El isómero cis (23,8 mg) se resolvió mediante HPLC preparativa quiral (columna: Chiralpak AS-V, 50 mm x 490 mm, 20 gm; eluyente: 50% de heptano y 50% de etanol que contiene 0,1% de modificador dietilamina; caudal: 80 mL/minuto; temperatura: 30°C; longitud de onda: 220 nm) para proporcionar (1R, 9aR)-8-(6-amino-1-metil-1H-pirazolo[3,4-d]-pirimidin-4-il)-3-(4-metoxi-3-metilfenil)-1 -metil-1,2,6,7,9,9a-hexahidropirazino [1,2-d][1,2,4]triazin-4-ona y (1 S, 9aS)-8-(6-amino-1 -metil-1 H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-il)-3-(4-metoxi-3-metilfenil)-1 -metil-1,2,6,7,9,9a-hexahidro-pirazino[1,2-d][1,2,4]triazin-4-ona. Enantiómero que eluye en primer lugar (Isómero 1; 10,3 mg, ee 100%): LCMS (método 5) pureza 93,8%. Enantiómero que eluye en segundo lugar (Isómero 2; 10,3 mg, ee 99,2%): LCMS (método 5) pureza 96,3%. Los datos de 1H-RMN y LCMS de ambos isómeros fueron idénticos a los de la muestra racémica.
El isómero trans (84 mg) se resolvió mediante HPLC preparativa quiral (columna: Chiralpak AS-V, 50 mm x 490 mm, 20 gm; eluyente: heptano al 50% y etanol al 50% que contiene 0,1% de modificador dietilamina; caudal: 80 mL/minuto; temperatura: 30°C; longitud de onda: 220 nm) para proporcionar (1S, 9aR)-8-(6-amino-1-metil-1H-pirazolo [3,4-d]-pirimidin-4-il)-3-(4-metoxi-3-metilfenil)-1 -metil-1,2,6,7,9,9a-hexahidropirazino[1,2-d][1,2,4]triazin-4-ona y (1R, 9aS)-8-(6-amino-1 -metil-1 H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-il)-3-(4-metoxi-3-metilfenil)-1 -metil-1,2,6,7,9,9a-hexahidro-pirazino[1,2-d][1,2,4]triazin-4-ona. Enantiómero que eluye en primer lugar (Isómero 1; 36,7 mg, ee 100%): LCMS (método 5) pureza 97,5%. Enantiómero que eluye en segundo lugar (Isómero 2; 41,9 mg, ee 96,1%): LCMS (método 5) pureza 99,4%. Los datos de 1H-RMN y LCMS de ambos isómeros fueron idénticos a los de la muestra racémica.
Ejemplo 10
(9aS)-3-(4-Metoxi-3-metilfenil)-8-(1 -metil-1 H-pirazolo[3,4-b]piridin-4-il)-1,2,6,7,9,9a-hexahidropirazino[1,2-d][1,2,4]triazin-4-ona
Una solución del Compuesto intermedio 33 (306 mg, 0,74 mmoles) en DMSO (3 mL) se trató con metilhidrazina (0,3 mL) y se calentó a 150°C con irradiación de microondas durante 2 h. La mezcla de reacción se añadió a agua (50 mL). La solución turbia resultante se extrajo con EtOAc (3 x 20 mL). Las capas de EtOAc combinadas se lavaron con salmuera (20 mL), se secaron (Na2SO4) y se evaporó sobre sílice. El residuo bruto se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida (gradiente de MeOH al 1-10% en EtOAc). Después de liofilizar en acetonitrilo/agua, el compuesto del título (59 mg, 20%) se obtuvo como un sólido blanco. 5h (400 MHz, DMSO-d6) 8,30 (s, 1 H), 8,15 (d, 1 H, J 5,6 Hz), 7,25-7,28 (m, 2H), 6,81-6,84 (m, 1H), 6,49 (d, 1H, J 5,7 Hz), 5,89 (dd, 1 H, J 9,0, 5,2 Hz), 4,33 (dt, 1H, J 13,0, 3,0 Hz), 4,14-4,19 (m, 1H), 4,07-4,12 (m, 1H), 3,96 (s, 3H), 3,70-3,81 (m, 1H), 3,75 (s, 3H), 3,45 (ddd, 1H, J 13,9, 5,6, 5,6 Hz), 3,16-3,24 (m, 1 H), 2,95-3,13 (m, 3 H), 2,13 (s, 3 H). LCMS (ES+) 408 [M H]+, RT 1,52 minutos (método 5).
Ejemplo 11
(9aS)-8-(5-Amino-3-metilisoxazolo[4,5-d]pirimidin-7-il)-3-(4-metoxi-3-metilfenil)-1,2,6,7,9,9a-hexahidropirazino[1,2-d][1,2,4]triazin-4-ona
Una solución del compuesto intermedio 34 (1,33 g, 2,85 mmoles) en MeOH (50 mL) se trató con NaOH al 10% (5 mL), luego se calentó a 65°C y se agitó durante 2,5 h. Se formó un sólido de color crema. La mezcla de reacción se neutralizó a pH 7 con HCl al 10% y luego se filtró. El residuo se lavó sucesivamente con MeOH, éter dietílico e isohexano, luego se evaporó a sequedad. El sólido de color crema resultante se suspendió en acetonitrilo/agua y se liofilizó para producir un primer lote de material (915 mg) como un sólido de color crema. El filtrado se concentró al vacío, y la mezcla acuosa restante se extrajo con DCM (2 x 20 mL). Las fases orgánicas se combinaron y lavaron con salmuera (20 mL), luego se pasaron a través de un cartucho separador de fases y se evaporaron. El sólido de color crema resultante se trituró en EtOAc y se filtró, luego se lavó con isohexano y se evaporó hasta sequedad, para producir un segundo lote de material (140 mg) como un sólido de color crema. Ambos lotes se combinaron para producir el compuesto del título (1,06 g, 87%), 5h (300 MHz, DMSO-ds) 7,20-7,31 (m, 2H), 6,75-6,86 (m, 1H), 6,25 (s, 2H), 5,88 (dd, 1H, J 8,9, 5,2 Hz), 4,65 (dd, 2H, J 26,3, 13,0 Hz), 4,41 (d, 1 H, J 13,0 Hz), 3,75 (s, 3 H), 3,61 (d, 1 H, J 9,5 Hz), 3,40 (dt, 1H, J 14,0, 5,7 Hz), 3,03-3,25 (m, 2 H), 2,81-3,03 (m, 2 H), 2,36 (s, 3 H), 2,12 (s, 3 H). LCMS (ES+) 425 [M H]+, Rt 1,61 minutos (método 5).

Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto de fórmula (I) o un N-óxido del mismo, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo:
Figure imgf000026_0001
en donde
Q representa un grupo de fórmula (Qb) o (Qf)
Figure imgf000026_0002
en donde el asterisco (*) representa el punto de unión al resto de la molécula;
X representa N o CH;
U representa oxígeno, azufre o N-R3b;
U2 representa oxígeno, azufre o N-R2b;
T2 representa N o C-R4a;
R1 representa hidrógeno o amino;
R2a representa hidrógeno o alquilo de C1-6 ;
R2b representa hidrógeno o alquilo de C1-6 ;
R3a representa hidrógeno o alquilo de C1-6 ;
R3b representa hidrógeno o alquilo de C1-6 y
R4a representa hidrógeno;
Z representa arilo que puede estar opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados independientemente de alquilo de C1-6, trifluorometilo, alcoxi de C1-6 y trifluorometoxi; y
A1 representa hidrógeno o alquilo de C1-6.
2. Un compuesto según la reivindicación 1 representado por la fórmula (IIA), o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo:
Figure imgf000026_0003
en donde
Z, A1 X, R1, R2a y R3b son como se definen en la reivindicación 1
3. Un compuesto según la reivindicación 1 representado por la fórmula (IIB), o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo:
Figure imgf000027_0001
en donde
Z, A1, X, R1 y R3a son como se definen en la reivindicación 1.
4. Un compuesto de fórmula (I) como se define en la reivindicación 1, seleccionado del grupo que consiste en 8-(6-Amino-1 -metilpirazolo[3,4-d]pirimidin-4-il)-3-(4-metoxifenil)-1,2,6,7,9,9a-hexahidropirazino[1,2-d][1,2,4]triazin-4-ona;
8-(6-Amino-1-metilpirazolo[3,4-d]pirimidin-4-il)-3-(4-metoxi-3-metilfenil)-1,2,6,7,9,9a-hexahidropirazino[1,2-d][1,2,4]triazin-4-ona;
(9aS)-8-(6-Amino-1-metil-1 H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-il)-3-(4-metoxi-3-metil-fenil)-1,2,6,7,9,9ahexahidropirazino[1,2-d][1,2,4]triazin-4-ona;
(9aS)-8-(6-Amino-1-metil-1 H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-il)-3-(4-metoxi-3-metil-fenil)-6,7,9,9a-tetrahidropirazino[1,2-d][1,2,4]triazin-4-ona;
8-(6-Amino-1,3-dimetilpirazolo[3,4-d]pirimidin-4-il)-3-(4-metoxi-3-metilfenil)-1,2,6,7,9,9a-hexahidropirazino[1,2-d][1,2,4]triazin-4-ona;
(9aS)-8-(6-Amino-1,3-dimetilpirazolo[3,4-d]pirimidin-4-il)-3-(4-metoxi-3-metil-fenil)-1,2,6,7,9,9ahexahidropirazino[1,2-d][1,2,4]triazin-4-ona;
8-(6-Amino-1-metil-1 H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-il)-3-[5-metoxi-6-(trifluorometil)piridin-2-il]-1,2,6,7,9,9ahexahidropirazino[1,2-d][1,2,4]triazin-4-ona;
(9aS)-8-(6-Amino-1-metil-1 H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-il)-3-[4-(trifluorometoxi)-fenil]-1,2,6,7,9,9ahexahidropirazino [1,2-d][1,2,4]triazin-4-ona;
cis-8-(6-Amino-1 -metil-1 H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-il)-3-(4-metoxi-3-metilfenil)-1 -metil-1,2,6,7,9,9ahexahidropirazino[1,2-d][1,2,4]triazin-4-ona;
trans-8-(6-Amino-1 -metil-1 H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-il)-3-(4-metoxi-3-metilfenil)-1 -metil-1,2,6,7,9,9ahexahidropirazino[1,2-d][1,2,4]triazin-4-ona;
(9aS)-3-(4-Metoxi-3-metilfenil)-8-(1 -metil-1 H-pirazolo[3,4-b]piridin-4-il)-1,2,6,7,9,9a-hexahidropirazino[1,2-d][1,2,4]triazin-4-ona; y
(9aS)-8-(5-Amino-3-metilisoxazolo[4,5-d]pirimidin-7-il)-3-(4-metoxi-3-metil-fenil)-1,2,6,7,9,9ahexahidropirazino[1,2-d][1,2,4]triazin-4-ona.
5. Un compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 1 o un N-óxido del mismo, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso en terapia.
6. Un compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 1 o un N-óxido del mismo, o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento y/o prevención de un trastorno inflamatorio, autoinmune u oncológico; una enfermedad vírica o malaria; o del rechazo de los trasplantes de órganos o células.
7. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 1 o un N-óxido del mismo, o una sal o solvato del mismo farmacéuticamente aceptable, en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
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