ES2886228T3

ES2886228T3 - Métodos para la producción de biopolímeros con distribución de peso molecular específico

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Publication number: ES2886228T3
Application number: ES16701828T
Authority: ES
Inventors: Michael Kunz; Fabian Kuhlmann; Karin Wiesweg; Claudia Elsinghorst
Original assignee: Medskin Solutions Dr Suwelack AG
Current assignee: Medskin Solutions Dr Suwelack AG
Priority date: 2015-02-06
Filing date: 2016-01-29
Publication date: 2021-12-16
Anticipated expiration: 2036-01-29
Also published as: US20180243179A1; WO2016124501A1; CN107223049A; EP3253456B1; EP3253456A1; KR20170115083A; CN107223049B; JP2018510927A

Abstract

Un método para la producción de una composición de biopolímero(s) que comprende al menos un biopolímero, donde el/los biopolímero(s) tiene(n) un peso molecular promedio definido, comprendiendo dicho método: (i) proporcionar una primera composición congelada que comprende un biopolímero con un valor definido de pH; (ii) proporcionar una segunda composición congelada que comprende un biopolímero con un valor definido de pH; (iii) combinar las composiciones en un recipiente de reacción sin mezclarlas sustancialmente entre sí; (iv) opcionalmente, congelar las composiciones; (v) liofilizar las composiciones que comprenden los biopolímeros; (vi) opcionalmente, purificar y/o aislar los biopolímeros; donde la temperatura máxima durante el proceso de liofilización se selecciona de manera de facilitar una degradación controlada y definida de dicho biopolímero y donde los valores de pH de la primera composición y de la segunda composición difieren, al menos, en 0,1, y/o donde la primera composición y la segunda composición comprenden diferentes biopolímeros.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para la producción de biopolímeros con distribución de peso molecular específico

Sector de la técnica

La presente invención se inscribe en el campo de la dermatología, la farmacia y la cosmética. En particular, la invención se inscribe en el campo de la producción de sustancias con aplicación farmacéutica, dermatológica o cosmética, así como del uso y la aplicación de las mismas.

Estado de la técnica

Los biopolímeros, como el colágeno, los polisacáridos o el ácido hialurónico, se utilizan habitualmente en composiciones cosméticas o dermatológicas. En muchos casos, estos biopolímeros se utilizan como humectantes o antioxidantes. Por lo general, se administran en forma de cremas, sueros, parches, máscaras, bálsamos, líquidos o ungüentos.

El ácido hialurónico o hialuronano, por ejemplo, es un biopolímero que se distribuye ampliamente por el tejido humano. Es un glicosaminoglicano aniónico y no sulfatado que comprende la siguiente estructura:

El ácido hialurónico tiene diversos usos médicos, particularmente en dermatología, y se utiliza habitualmente en productos cosméticos, en particular los llamados rejuvenecedores o anti-aging.

En general, la bioactividad de los biopolímeros, como el ácido hialurónico, depende directamente del peso molecular promedio de tales biopolímeros. Si se toma como ejemplo el ácido hialurónico y su uso en dermatología, el peso molecular promedio determina la profundidad de la penetración de la piel y los efectos dermatológicos potenciales del ácido hialurónico (véase la Figura 1).

Es un hecho conocido que la función biológica de los biopolímeros depende de su peso molecular promedio, y se han desarrollado varios métodos para generar biopolímeros con un peso molecular promedio definido.

El documento EP 2479 194 A2 describe la hidrólisis de ácido hialurónico en carbón activado. Los documentos EP 2463309 B1 y EP 1992645 A1 describen varios métodos para la hidrólisis ácida del ácido hialurónico. Otros métodos involucran el uso de hidrólisis enzimática y filtración (EP 0138572 B1) o bien el uso de temperaturas elevadas y fuerzas de cizallamiento intensas (EP 1987 153 B1).

El problema de todos estos métodos es que el ácido hialurónico en particular requiere extensos pasos de purificación para eliminar los ácidos hialurónicos de bajo peso molecular, que pueden ser proinflamatorios.

Por lo tanto, existe la necesidad de contar con un método para la producción eficiente de biopolímeros puros con una distribución definida de pesos moleculares, en particular de ácido hialurónico, que permita el control del peso molecular promedio del biopolímero y no requiera pasos de purificación adicionales.

Objeto de la invención

La presente invención refiere a un método para la producción de una composición de biopolímero(s) que comprende al menos un biopolímero, donde el/los biopolímero(s) en cuestión tiene(n) un peso molecular promedio definido, comprendiendo dicho método:

(i) proporcionar una primera composición congelada que comprende un biopolímero con un valor definido de pH;

(ii) proporcionar una segunda composición congelada que comprende un biopolímero con un valor definido de pH;

(iii) combinar las composiciones en un recipiente de reacción sin mezclarlas sustancialmente entre sí; (iv) opcionalmente, congelar las composiciones;

(v) liofilizar las composiciones que comprenden los biopolímeros;

(vi) opcionalmente, purificar y/o aislar los biopolímeros;

donde la temperatura máxima durante el proceso de liofilización se selecciona de manera de facilitar una degradación controlada y definida de tal biopolímero y donde los valores de pH de la primera composición y de la segunda composición difieren, al menos, en 0,1, y/o donde la primera composición y la segunda composición comprenden diferentes biopolímeros.

Preferentemente, los biopolímeros son biopolímeros con un peso molecular alto.

Más preferentemente, los biopolímeros son biopolímeros con un peso molecular nativamente alto.

La invención refiere a un método para la producción de una composición de biopolímero(s) que comprende al menos un biopolímero, donde el/los biopolímero(s) en cuestión tiene(n) un peso molecular promedio definido, comprendiendo dicho método:

(i) proporcionar una primera composición que comprende un biopolímero de alto peso molecular con un valor definido de pH entre 1,5 y 8,5;

(ii) proporcionar una segunda composición que comprende un biopolímero de alto peso molecular con un valor definido de pH entre 1,5 y 8,5;

(v) liofilizar las composiciones que comprenden los biopolímeros;

(vi) opcionalmente, purificar y/o aislar los biopolímeros;

donde la temperatura durante el proceso de liofilización se selecciona de manera de facilitar una degradación controlada y definida de tal biopolímero y donde los valores de pH de la primera composición y la segunda composición difieren, al menos, en 0,1, o donde la primera composición y la segunda composición comprenden diferentes biopolímeros.

Además, la invención refiere al uso de tal método para la producción de composiciones de biopolímeros y a las composiciones de biopolímeros producidas por dicho método.

DEFINICIONES

En el contexto de la presente invención, los biopolímeros son aquellos polímeros producidos por organismos vivos.

En particular, se hace referencia a los biopolímeros con un peso molecular nativamente alto, preferentemente aquellos que no están técnica ni químicamente modificados, excepto por las modificaciones comunes y nativas que ocurren dentro del organismo vivo. Como polímeros, se caracterizan por la presencia de motivos monoméricos repetitivos.

En general, los biopolímeros se dividen en tres clases principales: los polinucleótidos, los polipéptidos y los polisacáridos. En el contexto de esta invención, el término “biopolímero” se refiere únicamente a los polipéptidos y a los polisacáridos. En la presente invención, el término “biopolímero” abarca todas las modificaciones naturales de los biopolímeros, como la glicosilación, la hidrólisis parcial o la unión de lípidos a los polipéptidos.

Los polímeros que consisten de unidades biológicas, pero no se producen en un organismo vivo, como el ácido poliláctico, no se consideran biopolímeros a los fines de esta invención. Los biopolímeros que cumplen con la definición anterior, procesados de acuerdo con la presente invención, son biopolímeros en el contexto de la presente invención. Algunos ejemplos de biopolímeros de acuerdo con la presente invención son, sin carácter taxativo, los colágenos, el almidón, los derivados de la celulosa, los glicosaminoglicanos, los polisacáridos y los fucoidanos.

En el contexto de la presente invención, una composición congelada se refiere a una composición que está en estado sólido, independientemente de su estado a 25 °C. En la mayoría de las realizaciones, una composición congelada es una composición que es líquida a 25 °C, pero se ha enfriado hasta pasar al estado sólido. En una realización, el enfriamiento se realiza mediante congelación rápida (shock freezing) en nitrógeno líquido. Otras formas de enfriar una composición son por enfriamiento o por congelación en un congelador. En una realización preferente, la congelación se realiza a una temperatura entre -50 °C y -4 °C.

En el contexto de la presente invención, el término liofilización hace referencia a un proceso de deshidratación en el que el agua se elimina por sublimación. La liofilización también se conoce como criodesecación. En general, la liofilización comprende las siguientes tres etapas:

(i) Congelar la composición a deshidratar, donde es importante enfriar la composición por debajo del punto triple. El método de congelación adecuado depende de los componentes de la composición. (ii) Una fase de secado primaria en la que se elimina la mayor parte del agua al disminuir la presión a unos pocos pbar, o incluso menos. En esta etapa, la temperatura generalmente se ajusta de manera que el agua se sublime. Preferentemente —aunque no necesariamente—, la temperatura permanece por debajo de 0 °C a lo largo de esta etapa.

(iii) Una fase de secado secundaria, en la que la presión se reduce opcionalmente al rango de los pbar y la temperatura se eleva preferentemente por encima de 0 °C para eliminar el agua unida más fuertemente.

En una realización de la invención, la temperatura se controla durante la segunda fase de secado. En otra realización, la temperatura se controla durante la fase primaria de secado. En una realización particular, la composición se seca mediante el uso de un único paso de secado, en el que las condiciones corresponden al segundo paso de secado. En una realización alternativa, la composición se seca mediante el uso de un único paso de secado, en el que las condiciones corresponden al primer paso de secado.

En el contexto de la presente invención, “temperatura durante el proceso de sublimación” se refiere a la temperatura de la placa de almacenamiento sobre la que se coloca la composición.

En el contexto de la presente invención, el término solución acuosa se refiere a una solución en la que el solvente es agua. En el contexto de la presente invención, el término se refiere, asimismo, a suspensiones gruesas o coloidales de componentes, como los biopolímeros no solubles en agua o los aditivos cosméticos no solubles en agua.

En el contexto de la presente invención, el término emulsión se refiere a una mezcla de líquidos normalmente inmiscibles. En el contexto de la presente invención, el término emulsión se refiere a una emulsión de agua en aceite o de aceite en agua. Preferentemente, en el contexto de la presente invención, la emulsión se estabiliza mediante el uso de un agente emulsionante o simplemente emulsionante. Algunos ejemplos de agentes emulsionantes son, sin carácter taxativo, la lecitina, el estearoil lactilato de sodio, los polímeros con funciones emulsionantes o los detergentes.

En el contexto de la presente invención, un recipiente de reacción es todo recipiente adecuado para contener y procesar las composiciones. Preferentemente, tal recipiente debe ser adecuado para los procesos de congelación y liofilización.

Descripción detallada de la invención

Los inventores descubrieron, sorprendentemente, que los biopolímeros se pueden someter a degradación controlada durante los procesos de liofilización, lo que da lugar a biopolímeros con un peso molecular promedio definido. Además, los inventores descubrieron que la distribución de pesos moleculares del biopolímero degradado se puede alterar mediante la combinación de composiciones congeladas durante el proceso de liofilización.

Un primer aspecto de la presente invención refiere a un método para la producción de una composición de biopolímero(s) que comprende al menos un biopolímero, donde el/los biopolímero(s) en cuestión tiene(n) un peso molecular promedio definido, comprendiendo dicho método:

(v) liofilizar las composiciones que comprenden los biopolímeros;

(vi) opcionalmente, purificar y/o aislar los biopolímeros;

donde la temperatura máxima durante el proceso de liofilización se selecciona de manera de facilitar una degradación controlada y definida de tal biopolímero y donde los valores de pH de la primera composición y la segunda composición difieren, al menos, en 0,1, y/o donde la primera composición y la segunda composición comprenden diferentes biopolímeros.

Combinar las composiciones sin mezclarlas sustancialmente entre sí se refiere a un proceso en el cual las composiciones se combinan en un recipiente de reacción, pero mantienen las concentraciones de compuestos individuales y otras propiedades, como el valor de pH. Para lograrlo, se pueden proporcionar y combinar dos composiciones congeladas o se pueden combinar dos composiciones con alta viscosidad superponiendo las composiciones y congelándolas antes de la liofilización.

En una realización preferente, las composiciones se congelan y se combinan en un recipiente de reacción.

En una realización preferente, los biopolímeros son biopolímeros con un peso molecular alto. En una realización más preferente, los biopolímeros son biopolímeros con un peso molecular nativamente alto.

Las composiciones que comprenden un biopolímero pueden ser de cualquier tipo, siempre y cuando dichas composiciones comprendan al menos pequeñas cantidades de agua además de dicho biopolímero. Dicha composición podría comprender otros biopolímeros (es decir, mezclas).

La primera composición y la segunda composición podrían comprender diferentes biopolímeros. En una realización preferente, ambas composiciones comprenden el mismo biopolímero. En otra realización preferente, la primera composición y la segunda composición comprenden únicamente un biopolímero cada una.

El método es adecuado, en particular, para los biopolímeros seleccionados de entre el grupo que comprende el ácido hialurónico, el colágeno, los glicosaminoglicanos, los polisacáridos y los fucoidanos. En una realización preferente, el biopolímero es un glicosaminoglicano o un polisacárido. En una realización más preferente, el biopolímero se selecciona de entre el grupo que consiste de los alginatos, la goma rizobiana, la carboximetilcelulosa de sodio, el pululano, la goma-1 de biosacárido, el glucomanano, el beta-glucano, la pectina, el polisacárido de semilla de Tamarindus indica y el ácido hialurónico. En una realización incluso más preferente, el biopolímero es alginato de sodio o ácido hialurónico. En la realización más preferente, el biopolímero es ácido hialurónico.

De acuerdo con la invención, ambas composiciones que comprenden un biopolímero son emulsiones o soluciones acuosas congeladas.

Los inventores descubrieron, en particular, que las condiciones controladas durante el proceso de sublimación y un control de los parámetros de las composiciones (p. ej., el contenido de sales, el valor de pH, la presión de vacío y los agentes emulsionantes utilizados) permiten el control del peso molecular promedio del biopolímero degradado. En particular, los inventores descubrieron que combinar composiciones que comprenden el mismo biopolímero con distintos valores de pH da lugar a una distribución diferente del peso molecular promedio del biopolímero, lo que permite obtener diferentes distribuciones de peso definidas en función del valor de pH y/o el volumen de las composiciones.

En una realización de la invención, la primera composición congelada y/o la segunda composición congelada que comprenden un biopolímero tienen un valor de pH seleccionado dentro del intervalo entre 1,5 y 8,5. En una realización preferente, el valor de pH se selecciona dentro del intervalo entre 2,5 y 6.

Si la primera composición y la segunda composición comprenden el mismo biopolímero, se prefiere que el valor de pH de las composiciones difiera, al menos, en 0,1. En una realización preferente, el valor de pH de la primera composición y el valor de pH de la segunda composición difieren, al menos, en 0,5. En una realización más preferente, el valor de pH de la primera composición y el valor de pH de la segunda composición difieren, al menos, en 1. En la realización más preferente, el valor de pH de la primera composición congelada y el valor de pH de la segunda composición congelada difieren, al menos, en 2.

Los inventores descubrieron una correlación directa entre el valor de pH, la temperatura durante el proceso de sublimación y el peso molecular promedio del biopolímero. La Figura 2 muestra la correlación observada en el caso de un ácido hialurónico analizado.

Es evidente que el peso molecular promedio del producto final del biopolímero procesado depende directamente de la combinación seleccionada de temperatura y valor de pH. Los inventores descubrieron, además, que es posible apilar o mezclar múltiples composiciones congeladas para variar la distribución de pesos moleculares del producto final.

En una realización de la invención, la temperatura máxima durante el proceso de sublimación se selecciona dentro del intervalo entre -40 °C y 150 °C. En una realización preferente, la temperatura se selecciona dentro del intervalo entre 0 °C y 140 °C. En una realización más preferente, la temperatura se selecciona dentro del intervalo entre 60 y 130 °C. En la realización más preferente, la temperatura es 120 °C.

En una realización alternativa, la temperatura durante el proceso de sublimación se varía a lo largo del proceso de liofilización. En una primera realización preferente, la sublimación se realiza a dos temperaturas. En la Figura 3 se muestra un resumen sinóptico del perfil de temperaturas preferido.

En una realización de la invención, el proceso de sublimación se realiza a dos temperaturas diferentes. Preferentemente, la primera temperatura se selecciona dentro del rango entre -30 °C y 40 °C y la segunda temperatura se selecciona dentro del rango entre 60 °C y 130 °C. En una realización preferente, la primera temperatura se selecciona dentro del rango entre -20 °C y 20 °C y la segunda temperatura se selecciona dentro del rango entre 80 °C y 120 °C. En la realización más preferente, la primera temperatura es 10 °C y la segunda es 120 °C.

En una realización alternativa, el perfil de temperatura comprende más de dos temperaturas diferentes. En una realización alternativa, el perfil de temperatura comprende un gradiente continuo de temperatura.

En una realización de la invención, la presión durante el paso de sublimación está entre 50 pbar y 800 pbar. En una realización preferente de la invención, la presión está entre 75 pbar y 600 pbar, más preferentemente entre 100 pbar y 400 pbar e incluso más preferentemente entre 150 pbar y 300 pbar. En la realización más preferente, la presión durante el paso de sublimación es 300 pbar.

Las composiciones de biopolímeros producidas mediante el proceso se pueden purificar o aislar a partir de la composición. Sin embargo, se prefiere no realizar ningún paso de purificación o aislamiento posterior. En la realización más preferente, el biopolímero es adecuado directamente para el procesamiento y/o uso posterior.

La presente invención no refiere únicamente a un método para la producción de composiciones de biopolímeros con un peso molecular promedio definido, sino también al uso de dicho método para la producción de composiciones de biopolímeros con un peso molecular promedio definido y a las composiciones de biopolímeros con pesos moleculares promedio definidos producidas con dicho método.

En una realización preferente, el método se utiliza para la producción de biopolímeros con un peso molecular promedio definido seleccionados de entre el grupo que comprende el ácido hialurónico, el colágeno, los glicosaminoglicanos, los polisacáridos y los fucoidanos. En una realización más preferente, el biopolímero es un glicosaminoglicano. En una realización más preferente, el método se utiliza para la producción de biopolímeros con un peso molecular promedio definido seleccionados de entre el grupo de los alginatos, la goma rizobiana, la carboximetilcelulosa de sodio, el pululano, la goma-1 de biosacárido, el glucomanano, el beta-glucano, la pectina, el polisacárido de semilla de Tamarindus indica y el ácido hialurónico. En una realización incluso más preferente, el método se utiliza para la producción de biopolímeros con un peso molecular promedio definido seleccionados entre el alginato de sodio y el ácido hialurónico. En la realización más preferente, el método se utiliza para la producción de ácido hialurónico con un peso molecular promedio definido.

Los inventores descubrieron que la presente invención es adecuada para la producción de composiciones complejas que comprenden biopolímeros. Estas composiciones comprenden al menos un biopolímero con un peso molecular promedio definido y otros componentes opcionales, como ingredientes dermatológicos, farmacéuticos o cosméticos, y solo se deben emulsionar o disolver para usar.

Las composiciones complejas pueden comprender otros biopolímeros u otros polímeros. Cualquier composición es adecuada siempre que comprenda, además, agua.

En una realización preferente, la primera composición y/o la segunda composición es/son emulsiones que comprenden:

(i) un biopolímero,

(ii) agua,

(iii) opcionalmente, compuestos y/o aceites farmacéutica, dermatológica y/o cosméticamente admisibles;

(iv) opcionalmente, un agente emulsionante;

(v) opcionalmente, emolientes.

En realizaciones alternativas, la primera composición congelada y/o la segunda composición congelada es/son un gel o un líquido con viscosidad baja a alta.

La primera composición y/o la segunda composición también contiene(n), preferentemente, otros ingredientes o aditivos cosméticos, dermatológicos o farmacéuticos. Algunos ejemplos de estos ingredientes son, sin carácter taxativo, los emolientes, los ingredientes y las tinturas cosméticamente aceptables, los perfumes y las sustancias farmacéuticamente activas, como el pantenol.

En una realización preferente, la primera composición congelada y la segunda composición congelada comprenden los mismos compuestos, a excepción del biopolímero o el valor de pH. En la realización más preferente, la primera composición congelada y la segunda composición congelada comprenden los mismos compuestos y el mismo biopolímero y difieren únicamente en el valor de pH.

Algunos ejemplos de dichos ingredientes o aditivos son, sin carácter taxativo, los agentes de acondicionamiento de la piel, los agentes suavizantes de la piel, los agentes hidratantes de la piel, como el pantenol o el pantotenol, y los factores humectantes naturales, como la glicerina, el ácido láctico o la urea. Alternativamente, las composiciones pueden comprender bloqueadores solares físicos o químicos y agentes queratolíticos, como los ácidos a-hidroxi o phidroxi, o los a-cetoácidos o p-cetoácidos. Otros ingredientes posibles incluyen los captadores de radicales, los agentes rejuvenecedores (anti-aging), las vitaminas o los derivados de las mismas, p. ej. la vitamina C (ácido ascórbico) o sus ésteres o glucósidos y los antioxidantes, como las catequinas o los flavonoides.

Otros ingredientes potenciales comprenden el resveratrol, el glutatión, el ácido ferúlico, la coenzima Q10, los polifenoles, las ceramidas y los ácidos grasos saturados e insaturados y sus acilglicéridos. Asimismo, son posibles ingredientes los ésteres, por ejemplo, los ésteres cerosos, como el aceite de jojoba, los triglicéridos en general (aceite neutro, aceite de argán, manteca de karité) o los componentes insaponificables de aceites vegetales.

Otros ingredientes comprenden los polisacáridos de origen vegetal, biotecnológico o marino, así como sus hidrolisatos. Otros ingredientes podrían incluir enzimas (p. ej., bromelina), coenzimas, inhibidores enzimáticos, aminoácidos, oligopéptidos naturales y sintéticos, péptidos como el colágeno y la elastina, así como sus hidrolisatos, neuropéptidos, factores de crecimiento y alcaloides. En algunas realizaciones, los ingredientes incluyen opcionalmente fitofármacos como aescina, ginsenósidos, ruscogenina o aloína. Otros polímeros son los alginatos, los derivados de la celulosa, el almidón, el quitosano, el sulfato de condroitina y otros biopolímeros sintéticos con función o compatibilidad biológica. Algunos ejemplos de aditivos cosméticos son, sin carácter taxativo, los agentes aclaradores de la piel, las sustancias decorativas o los filtros inorgánicos o sintéticos, como las tinturas, las partículas o los pigmentos colorantes. Algunas realizaciones de la invención comprenden sustancias para el embellecimiento cosmético de los ojos, los labios o la cara.

En algunas realizaciones, la primera composición congelada y/o la segunda comprende(n), adicionalmente, agentes terapéuticamente activos, como agentes contra el acné o la rosácea, agentes antimicrobianos, como la plata y sus derivados, el iodo o la iodopovidona, antitranspirantes, sustancias analgésicas, como la lidocaína o el ibuprofeno, sustancias astringentes, compuestos desodorantes, sustancias antiseborreicas o antisépticos. Asimismo, puede tratarse de células o componentes de células, como células autólogas, células alogénicas, células madre o plasma rico en plaquetas (PRP).

La primera composición y/o la segunda composición contiene(n) preferentemente otros ingredientes (p. ej., estabilizadores o agentes conservantes) para controlar los parámetros finales del producto, como la solubilidad o emulsionabilidad, la estabilidad mecánica, la viscosidad o las características al tacto.

En una realización particular de la presente invención, la primera composición y la segunda composición se combinan en un recipiente adecuado, que es apto para el proceso de congelación y liofilización, y, opcionalmente, puede servir como empaque de la composición liofilizada que comprende al menos un biopolímero con un peso molecular promedio definido y una distribución de pesos definida.

La invención también refiere al uso de dicho método para la producción de composiciones que comprenden un biopolímero con un peso molecular promedio definido y a composiciones que comprenden los biopolímeros producidos de acuerdo con un método de la presente invención.

En una realización de la presente invención, la composición final puede servir como base para líquidos acuosos, emulsiones con baja viscosidad, líquidos serosos, máscaras, cremas, máscaras de crema, parches o segmentos para aplicaciones tópicas.

Descripción de las figuras

Figura 1: correlación entre el peso molecular promedio, la penetración de la piel y la actividad biológica del ácido hialurónico.

Figura 2: correlación entre el pH, la temperatura y el peso molecular promedio obtenido al procesar una composición que comprende ácido hialurónico de acuerdo con la presente invención.

Figura 3: descripción general de los perfiles de temperatura en función del tiempo sugeridos durante el proceso de liofilización.

Figura 4: curva de calibración para determinar el peso molecular promedio del ácido hialurónico procesado de acuerdo con la presente invención.

Figura 5: perfiles de elución y masa molecular del aceite neutro (a) y el Sepinov EMT-10 (b) procesados de acuerdo con la presente invención.

Figura 6: comparación de los perfiles de elución (A) y los perfiles de masa molecular (B) del ácido hialurónico nativo y del ácido hialurónico liofilizado a 120 °C.

Figura 7: comparación del perfil de elución (A) y los perfiles de masa molecular (B) de una mezcla de ácido hialurónico, Sepinov EMT-10 y aceite neutro liofilizada a diferentes temperaturas.

Figura 8: peso molecular de muestras liofilizadas de muestras de AH de alto peso molecular al 1 %p/p con un pH ajustado en el intervalo entre 6,21 y 2,9.

Figura 9: distribuciones de peso molecular de muestras liofilizadas de muestras de AH de alto peso molecular al 1 %p/p con un pH ajustado a 6,21 y 2,9.

Figura 10: peso molecular de emulsiones que contienen ácido hialurónico liofilizadas a diferentes temperaturas.

Figura 11: distribuciones de peso molecular de muestras liofilizadas de muestras de AH de alto peso molecular al 1 %p/p con un pH ajustado entre 6,21 y 2,9 apiladas en distintas proporciones de volumen.

Figura 12: distribuciones de peso molecular de muestras liofilizadas de muestras de pululano al 1 %p/p con un pH ajustado entre 4,9 y 3,5 apiladas en distintas proporciones de volumen.

Figura 13: distribuciones de peso molecular de muestras liofilizadas de muestras de alginato de sodio al 1 %p/p con un pH ajustado entre 3,5 y 7,15 apiladas en distintas proporciones de volumen.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: degradación controlada de ácido hialurónico

Se transfirió agua desionizada a un reactor de laboratorio de 1 l y se la agitó a 75 °C. Se agregó polvo de ácido hialurónico y se agitó a 75 °C y a 700 rpm durante 15 min hasta que el material se disolvió. Entonces, se agregó el componente emulsionante y se agitó durante 15 min a 50 °C, a 1400 rpm y a una presión reducida (200 pbar). Se agregó el componente de aceite y se lo agitó a 1400 rpm/45 °C/200 pbar durante 10 minutos y, posteriormente, a 2100 rpm/45 °C/200 pbar durante 5 minutos. La emulsión recibida se enfrió a temperatura ambiente, se trasvasó a viales de vidrio de 10 ml y se almacenó hasta el día siguiente en condiciones ambiente. Las muestras se congelaron en un ultracongelador durante un mínimo de 16 h y, posteriormente, se liofilizaron hasta la temperatura máxima objetivo.

Como prueba de principio, se procesó ácido hialurónico de acuerdo con el método inventado. Aquí, se liofilizó ácido hialurónico puro, así como composiciones de ácido hialurónico con aceite neutro de triglicéridos de cadena media (MCT) y Sepinov EMT-10, a diferentes temperaturas.

Se analizaron las muestras siguientes:

1. Aceite neutro no procesado

2. Sepinov EMT-10 no procesado

3. Ácido hialurónico no procesado

4. Sepinov EMT-10 liofilizado a 120 °C

5. Ácido hialurónico liofilizado a 120 °C

6. Mezcla (ácido hialurónico, aceite neutro y Sepinov EMT-10) liofilizada a 40 °C

7. Mezcla liofilizada a 60 °C

8. Mezcla liofilizada a 80 °C

9. Mezcla liofilizada a 100 °C

10. Mezcla liofilizada a 120 °C

Las muestras se analizaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño en 3 columnas analíticas de un sistema HPLC. Las muestras se disolvieron en un tampón fosfato salino (PBS) con un pH de 7,4. Las partes no solubles se eliminaron por filtración.

Las columnas se calibraron con patrones de dextrano/pululano. Las masas moleculares de las muestras se determinaron sobre la base de dicha calibración (para conocer la curva de calibración, véase la Figura 4).

Únicamente las muestras de ácido hialurónico puro se disolvieron por completo. Los componentes solubles del Sepinov EMT-10 o del aceite neutro no producen señales problemáticas durante el análisis (véanse las Figuras 5 a y b).

Los resultados muestran claramente que la composición y la temperatura de liofilización afectan el peso molecular promedio del ácido hialurónico. Aunque la liofilización tiene un efecto sobre el ácido hialurónico puro a altas temperaturas y da lugar a un menor peso molecular promedio (véanse las Figuras 6 a y b), el efecto es mayor en las mezclas (véanse las Figuras 7 a y b).

En general, se observa claramente que la elección de los parámetros durante el proceso de liofilización es un mecanismo adecuado para controlar el peso molecular promedio del ácido hialurónico tras la liofilización.

Ejemplo 2: efecto del valor de pH sobre la degradación

Se disolvió ácido hialurónico con un peso molecular de 1,478 MDa (Contipro, PM según cromatografía de penetración en gel) en una solución al 1 %p/p en agua destilada a 80 °C durante cinco minutos. El pH se ajustó con ácido clorhídrico en el intervalo entre 2,9 y 6,21.

Se colocaron 7,5 ml de solución de AH en viales de vidrio de 10 ml, las muestras se congelaron a -20 °C de un día para otro, se colocaron en un dispositivo Christ Epsilon 2-10D LSC plus HT y se procesaron durante aproximadamente 20 horas de acuerdo con el perfil de temperatura de 10/120 °C que se muestra en la Figura 3.

Las muestras liofilizadas se diluyeron en un tampón para cromatografía de penetración en gel (pH 7,4) a una concentración de 0,3 %p/p y se analizaron mediante cromatografía de penetración en gel contra patrones de peso de pululano y dextrano.

Independientemente del pH ajustado, todas las muestras se escindieron mostrando un máximo de 766 kDa a un pH de 6,21 y un mínimo de 84,75 kDa a un pH de 2,9 (Figura 7). A mayor función de ácido libre en el polímero, mayor la tendencia del polímero a la escisión. En la Figura 8, se muestra un elugrama de las muestras de alto y bajo peso molecular.

Ejemplo 3: degradación de ácidos hialurónicos con distintos pesos moleculares

Cuatro tipos diferentes de ácido hialurónico (Contipro/GfN 3010 (PM: 1478 kDa), Principium Cube3 (PM: 733 kDa), Principium Signal-10 (PM: 25 kDa) y Freda mini-HA (PM: 27 kDa)) se disolvieron en solución al 1 %p/p en agua destilada a 80 °C durante cinco minutos. La solución se usó tal cual o bien su pH se ajustó a aproximadamente 3,5.

Se colocaron 7,5 ml de solución de AH en viales de vidrio de 10 ml, las muestras se congelaron a -20 °C de un día para otro, se colocaron en un dispositivo Christ Epsilon 2-10D LSC plus HT y se procesaron durante aproximadamente 20 horas de acuerdo con el perfil de temperatura de 10/120 °C que se muestra en la Figura 3 o, alternativamente, con el perfil de temperatura de 120 °C que se muestra en tal Figura.

El ácido hialurónico de peso molecular alto o medio mostró una disminución moderada del peso molecular disuelto en agua destilada al valor de pH original, mientras que el peso molecular de las sustancias disminuyó drásticamente a valores bajos de pH, como se muestra en la siguiente tabla.

Ejemplo 4: emulsiones que contienen ácido hialurónico

5 g de ácido hialurónico de alto peso molecular (GfN/Contipro 3010, 1,5 MDa) se disolvieron en 465 g de agua destilada, se calentaron a 80 °C y se agitaron mediante un dispositivo mezclador Somakon MP-LB (1 l) a 1400 rpm y a presión atmosférica durante 15 minutos.

Se agregaron 7,5 g de Sepinov EMT-10 (nombre s/ la Nomenclatura Internacional de Ingredientes Cosméticos (INCI): acrilato de hidroxietilo (y) copolímero de acriloildimetiltaurato de sodio), el pH se ajustó a 3,05 y la mezcla se agitó a 1400 rpm/200 pbar durante otros 15 minutos a 80 °C.

Se agregaron 25 g de triglicéridos de cadena media (MCT) como compuesto de aceite modelo y se los homogeneizó a 2100 rpm/200 pbar durante 5 minutos.

Se colocaron 7,5 ml de la emulsión resultante en viales de vidrio de 10 ml, las muestras se congelaron a -20 °C de un día para otro, se colocaron en un dispositivo Christ Epsilon 2-10D LSC plus HT y se procesaron durante aproximadamente 20 horas a una temperatura máxima de 40, 60, 80, 100 y 120 °C.

Las muestras liofilizadas se diluyeron en un tampón para cromatografía de penetración en gel (pH 7,4) a una concentración de 0,3 %p/p y se analizaron mediante cromatografía de penetración en gel. La Figura 9 muestra cómo el peso molecular (PM) del ácido hialurónico depende de la temperatura y, en particular disminuye al aumentar la temperatura máxima de proceso.

Ejemplo 5: liofilización de distintos biopolímeros

Se disolvieron polímeros en solución al 1 %p/p en agua destilada a 80 °C durante cinco minutos. El pH de las soluciones se midió, y la distribución de pesos moleculares de las soluciones de polímeros no procesadas se determinó mediante cromatografía de exclusión por tamaño contra patrones de peso molecular de pululano y dextrano diluyendo las muestras al 0,3 %p/p en tampón fosfato salino (pH 7,4).

Se colocaron 7,5 ml de solución de polímero en viales de vidrio de 10 ml, las muestras se congelaron a -20 °C de un día para otro, se colocaron en un dispositivo Christ Epsilon 2-10D LSC plus HT y se procesaron durante aproximadamente 20 horas de acuerdo con el perfil de temperatura de 10/120 °C que se muestra en la Figura 3.

Las muestras liofilizadas se diluyeron en un tampón para cromatografía de penetración en gel (pH 7,4) a una concentración de 0,3 %p/p y se analizaron mediante cromatografía de penetración en gel. Los resultados se muestran en las tablas siguientes.

Alginatos de sodio:

Polisacáridos:

Ejemplo 6: variación del pH y el volumen con soluciones de ácido hialurónico apiladas

Se disolvió ácido hialurónico con un peso molecular de 1,478 MDa (Contipro, PM según cromatografía de penetración en gel) en una solución al 1 %p/p en agua destilada a 80 °C durante cinco minutos. Una fracción de la solución se usó al pH normal, mientras que la segunda fracción se ajustó con ácido clorhídrico a un pH de 2,9.

La solución de AH con un pH de 6,21 se colocó en viales de vidrio de 10 ml en distintos volúmenes entre 0,75 ml y 6.75 ml. Las muestras se congelaron a -20 °C, se apilaron con la solución de AH con un pH de 2,9 en volúmenes entre 6.75 ml y 0,75 ml y se congelaron y almacenaron nuevamente a -20 °C hasta el día siguiente. Las proporciones en volumen correspondientes se muestran en la tabla siguiente:

Las muestras se colocaron en un dispositivo Christ 2-10D LSC plus HT y se procesaron durante aproximadamente 20 horas con el perfil de temperatura de 10/120 °C que se muestra en la Figura 3.

En función de la proporción de volúmenes, se pueden obtener distribuciones de pesos moleculares con distintas formas (véase la Figura 10), lo cual indica que se puede obtener una distribución de peso molecular de cualquier forma en función de las fracciones de volumen y el valor de pH ajustado en dichas fracciones de volumen. De acuerdo con la función biológica buscada, se puede diseñar una distribución óptima de pesos moleculares.

Ejemplo 7: variación del pH y el volumen con soluciones de pululano apiladas

Se disolvió pululano con un peso molecular de 371 kDa (Hayashibara, PM según cromatografía de penetración en gel) en una solución al 1 %p/p en agua destilada a 80 °C durante cinco minutos. Una fracción de la solución se usó al pH normal (4,9), mientras que la segunda fracción se ajustó con ácido clorhídrico a un pH de 3,5.

La solución de pululano con un pH de 4,9 se colocó en viales de vidrio de 10 ml en distintos volúmenes entre 0,75 ml y 6,75 ml. Las muestras se congelaron a -20 °C, se apilaron con la solución de pululano con un pH de 2,9 en volúmenes entre 6,75 ml y 0,75 ml y se congelaron y almacenaron nuevamente a -20 °C hasta el día siguiente. Las proporciones en volumen correspondientes se muestran en la tabla siguiente:

En función de la proporción de volúmenes, se pueden obtener distribuciones de pesos moleculares con distintas formas (véase la Figura 11). El peso molecular (PM) se ve afectado principalmente por la cantidad de la solución de menor pH.

Ejemplo 8: variación del pH y el volumen con soluciones de alginato de sodio apiladas

Se disolvió alginato de sodio con un peso molecular de 881 kDa (Cargill, PM según cromatografía de penetración en gel) en una solución al 1 %p/p en agua destilada a 80 °C durante cinco minutos. Una fracción de la solución se usó al pH normal (7,15), mientras que la segunda fracción se ajustó con ácido clorhídrico a un pH de 3,5.

La solución de alginato de sodio con un pH de 7,15 se colocó en viales de vidrio de 10 ml en distintos volúmenes entre 0,75 ml y 6,75 ml. Las muestras se congelaron a -20 °C, se apilaron con la solución de alginato de sodio con un pH de 3,5 en volúmenes entre 6,75 ml y 0,75 ml y se congelaron y almacenaron nuevamente a -20 °C hasta el día siguiente. Las proporciones en volumen correspondientes se muestran en la tabla siguiente:

Las muestras liofilizadas se diluyeron en un tampón para cromatografía de penetración en gel (pH 7,4) a una concentración de 0,3 %p/p y se analizaron mediante cromatografía de penetración en gel contra patrones de peso de pululano y dextrano. En función de la proporción de volúmenes, se pueden obtener distribuciones de pesos moleculares con distintas formas (véase la Figura 12). El desplazamiento del peso molecular se ve afectado principalmente por las condiciones de liofilización y, en menor medida, por la cantidad de la solución de menor pH.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para la producción de una composición de biopolímero(s) que comprende al menos un biopolímero, donde el/los biopolímero(s) tiene(n) un peso molecular promedio definido, comprendiendo dicho método:

(v) liofilizar las composiciones que comprenden los biopolímeros;

(vi) opcionalmente, purificar y/o aislar los biopolímeros;

donde la temperatura máxima durante el proceso de liofilización se selecciona de manera de facilitar una degradación controlada y definida de dicho biopolímero y donde los valores de pH de la primera composición y de la segunda composición difieren, al menos, en 0,1, y/o donde la primera composición y la segunda composición comprenden diferentes biopolímeros.

2. El método de la reivindicación 1, donde la primera composición y la segunda composición comprenden el mismo biopolímero.

3. El método de la reivindicación 1, donde la primera composición y la segunda composición comprenden biopolímeros diferentes.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la primera y/o la segunda de las composiciones que comprenden un biopolímero son emulsiones o soluciones acuosas congeladas.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el valor de pH de la primera y/o la segunda de las composiciones se selecciona dentro del intervalo entre 1,5 y 8,5, preferentemente entre 2,5 y 6.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la temperatura durante el proceso de sublimación se selecciona dentro del intervalo entre -40 °C y 150 °C.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la presión durante el proceso de sublimación se selecciona dentro del intervalo entre 50 pbar y 800 pbar.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el biopolímero de la primera y/o de la segunda de las composiciones se selecciona de entre el grupo que comprende el ácido hialurónico, el colágeno, los glicosoaminglicanos, los polisacáridos y los fucoidanos; preferentemente, el biopolímero es ácido hialurónico.

9. El método de las reivindicaciones 1 a 8, donde la primera y/o la segunda de las composiciones es/son una emulsión que comprende:

(i) un biopolímero,

(ii) agua,

(iii) opcionalmente, un compuesto o aceite farmacéutica, dermatológica y/o cosméticamente admisible; (iv) opcionalmente, un agente emulsionante; y

(v) opcionalmente, emolientes.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde la primera y/o la segunda de las composiciones comprende(n), adicionalmente, aditivos dermatológicos, farmacéuticos o cosméticos.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde la primera y/o la segunda de las composiciones comprende(n) componentes adicionales, de manera que el producto liofilizado resultante sea fácilmente soluble o forme fácilmente una emulsión.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde la primera y/o la segunda de las composiciones comprende(n) el mismo contenido y difiere(n) únicamente en el valor de pH y/o en el biopolímero.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde la primera composición y la segunda composición se combinan en un contenedor adecuado, que es apto para el proceso de liofilización y que puede servir como empaque primario.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde el biopolímero de la primera y/o de la segunda de las composiciones se selecciona de entre el grupo que comprende el ácido hialurónico, el colágeno, los glicosoaminglicanos, los polisacáridos y los fucoidanos; preferentemente, el biopolímero es ácido hialurónico.

15. El uso de un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 para la producción de una composición de biopolímero(s) farmacéutica, dermatológica o cosméticamente admisible.