ES2883417T3

ES2883417T3 - Composiciones para su uso en el tratamiento o mejora de neuroinflamación, neurodegeneración, dolor neuropático y migraña

Info

Publication number: ES2883417T3
Application number: ES16873645T
Authority: ES
Inventors: Yury Miller; Tony L Yaksh
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 2015-12-10
Filing date: 2016-12-05
Publication date: 2021-12-07
Anticipated expiration: 2036-12-05
Also published as: US11478556B2; HUE055326T2; DK3386527T3; EP3386527A1; PT3386527T; US20200390906A1; WO2017100125A1; PL3386527T3; US20180360993A1; EP3386527A4; US10729788B2; EP3386527B1

Abstract

Una formulación, una composición farmacéutica o una combinación terapéutica que comprende uno, todos o varios de un compuesto polipeptídico o una composición polipeptídica de proteínas de unión a ApoA-I (APOA1BP, AIBP o AIBP), o un compuesto que aumenta la expresión o la actividad de, o codifica, un polipéptido o ácido nucleico de APOA1BP, o un polipéptido o péptido que tiene una actividad de APOA1BP, para su uso en el tratamiento, mejora, prevención, reversión o disminución de la gravedad o la duración de: dolor neuropático, - dolor neuropático inducido por inflamación, - inflamación del nervio o del SNC, - alodinia, - un dolor posterior a una lesión nerviosa o tisular o un dolor neuropático, - dolor postquirúrgico o dolor neuropático, - neuropatía periférica inducida por quimioterapia (NPIQ), en particular una NPIQ o alodinia inducida por cisplatino, - una enfermedad o afección neurodegenerativa, en particular una enfermedad o afección neurodegenerativa crónica o progresiva, opcionalmente la enfermedad de Alzheimer o una encefalopatía traumática crónica (ETC) o una tauopatía relacionada, una lesión cerebral traumática (LCT), un trastorno de estrés postraumático, una neurosis de guerra traumática o un síndrome de estrés postraumático (SSPT), - una cefalea primaria, opcionalmente una migraña o una cefalea en racimos, y/o - hiperalgesia, en la que el compuesto que aumenta la expresión o la actividad de un polipéptido APOA1BP, o lo codifica, es un ácido nucleico que expresa o codifica un polipéptido de APOA1BP o un polipéptido que tiene una actividad de polipéptido APOA1BP.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones para su uso en el tratamiento o mejora de neuroinflamación, neurodegeneración, dolor neuropático y migraña

Derechos gubernamentales

La presente invención se realizó con el apoyo del gobierno bajo las subvenciones HL124174, HL055798, HL088093 y T32AR064194, otorgadas por los Institutos Nacionales de Salud (NIH). El gobierno tiene ciertos derechos sobre la invención.

Campo técnico

La presente invención se refiere, en general, a la medicina, el control del dolor y la biología celular. En particular, en realizaciones alternativas, se divulgan métodos para aumentar los niveles y/o regular la expresión de la proteína de unión a ApoA-I (APOA1BP, AIBP o AI-BP) para tratar, mejorar, prevenir, revertir, disminuir la gravedad y/o la duración de: un dolor neuropático, una inflamación del SNC, una alodinia, un dolor posterior a una lesión nerviosa, un dolor posquirúrgico, una neuropatía periférica inducida por quimioterapia (NPIQ) (por ejemplo, alodinia inducida por cisplatino) una neurodegeneración, incluyendo, por ejemplo, una enfermedad o condición neurodegenerativa como la enfermedad de Alzheimer, una hiperalgesia, y/o dolores de cabeza primarios como migrañas y cefaleas en racimo. En realizaciones alternativas, se divulgan métodos que comprenden la administración de formulaciones y composiciones farmacéuticas que comprenden un polipéptido o proteína APOA1BP que es una APOA1BP humana o de mamífero, o una APOA1BP recombinante, peptidomimética o sintética, o un bioisóstero de una proteína de unión a la ApoA-I para tratar, mejorar, prevenir, revertir o disminuir la gravedad de un dolor neuropático, una alodinia, una hiperalgesia, una enfermedad o condición neurodegenerativa como la enfermedad de Alzheimer, y/o un dolor de cabeza primario como una migraña.

Antecedentes

La proteína de unión a la apolipoproteína A-I, o proteína de unión (AIBP), también llamada NAXE, NAD(P)HX epimerasa, es una proteína secretada descubierta en un cribado de proteínas que se asocian físicamente con la apoA-I (8). El gen humano AIBP (APOA1BP) está localizado en 1q22. La AIBP es una proteína secretada. Tiene un supuesto péptido señal N-terminal, que probablemente se escinde de la proteína durante la secreción de la proteína de la célula.

Los estados de dolor persistente (de más de 3 meses), derivados de enfermedades inflamatorias (por ejemplo, artritis, 41 millones de personas en Estados Unidos; cáncer, 8,5 millones; y dolor de espalda, 6 millones1) tienen un impacto negativo extraordinario en la calidad de vida. Aunque los opiáceos, los AINE y los anticonvulsivos pueden aliviar el dolor durante intervalos cortos, son menos eficaces para el tratamiento crónico, especialmente cuando los componentes del estado de dolor implican una inflamación persistente y/o una lesión del nervio periférico2'4. Aparte de la eficacia, muchos de los potentes agentes se ven acosados por efectos secundarios limitantes y problemas relacionados con la dependencia y la adicción5. Esta relativa falta de eficacia a largo plazo, incluso de los agentes aprobados, es evidente a partir de los resultados de los ensayos clínicos, que a menudo indican que la mayoría de los sujetos completan incluso los ensayos con éxito con un dolor lo suficientemente intenso como para permitir el reingreso en el mismo ensayo6.

Los estados de dolor derivados de una lesión tisular local o de una inflamación suelen mostrar un curso temporal paralelo al inicio y la resolución del estado de la lesión7 , mientras que la lesión nerviosa conduce a un estado de dolor persistente. Sin embargo, como se ha informado en humanos, cada vez se aprecia más que el dolor originado por una inflamación prolongada puede persistir incluso cuando el estado inflamatorio se resuelve, es decir, cuando ya no se detectan neutrófilos, macrófagos o citoquinas. Así, tras cirugías como herniorrafias, artroscopias y toracotomías, hasta un 30% de la población puede presentar dolores que duran más de 3 meses89. En el ejemplo clínico clásico de la inflamación persistente, la artritis reumatoide se caracteriza por la inflamación de las articulaciones, la remodelación de las mismas y el dolor. Aunque la asociación del dolor con la inflamación no es inesperada, los pacientes siguen refiriendo un dolor de moderado a intenso a pesar de la remisión o de mostrar signos inflamatorios mínimos1011, lo que sugiere el desarrollo de un estado de dolor crónico.

Bettoni et al. (I, Comelli F, Rossini C, Granucci F, Giagnoni G, Peri F, Costa B.; Glia. 2008 Sep;56(12): 1312-9. El receptor glial TLR4 como nueva diana para tratar el dolor neuropático: eficacia de un nuevo antagonista del receptor en un modelo de lesión del nervio periférico en ratones) divulga un antagonista de TRL-4 para su uso en el tratamiento del dolor neuropático.

Sumario

En realizaciones alternativas, se divulgan métodos y usos para tratar, mejorar, prevenir, revertir o disminuir la severidad o duración de:

• un dolor neuropático,

un dolor neuropático inducido por la inflamación, en el que opcionalmente el dolor neuropático inducido por la inflamación comprende un dolor neuropático inducido por el receptor tipo Toll 4 (TLR4),

inflamación del nervio o del sistema nervioso central (SNC), donde opcionalmente la inflamación del nervio o del SNC comprende una inflamación del nervio o del SNC mediada por TLR4,

una alodinia, en la que opcionalmente la alodinia comprende una alodinia mediada por TLR4, - un dolor posterior a una lesión nerviosa o tisular o un dolor neuropático, en el que opcionalmente el dolor posterior a una lesión nerviosa o tisular o el dolor neuropático es generado o causado por, o es una secuela de, un traumatismo, quimioterapia, artritis, diabetes o una infección viral,

un dolor postquirúrgico o un dolor neuropático,

una neuropatía periférica inducida por quimioterapia (NPIQ) (por ejemplo, una NPIQ o alodinia inducida por cisplatino), en la que opcionalmente la alodinia comprende una alodinia mediada por TLR4,

una enfermedad o afección neurodegenerativa, opcionalmente una enfermedad o afección neurodegenerativa crónica o progresiva, opcionalmente la enfermedad de Alzheimer o una encefalopatía traumática crónica (ETC) o una tauopatía relacionada, una lesión cerebral traumática (LCT), un trastorno de estrés postraumático, una neurosis de guerra traumática o un síndrome de estrés postraumático (SSPT),

una cefalea primaria, opcionalmente una migraña o una cefalea en racimos, y/o

una hiperalgesia, en un sujeto mediante la adición, el aumento de los niveles y/o la regulación al alza de la expresión de una proteína de unión (APOA1BP, AIBP o AI-BP), donde el método comprende:

(a) proporcionar una formulación o una composición farmacéutica que comprenda:

(i) un compuesto o composición polipeptídica de la proteína de unión (APOA1BP, AIBP o AI-BP), o un compuesto que aumenta la expresión o la actividad de, o codifica, un polipéptido o ácido nucleico de APOA1BP, o un polipéptido o péptido que tiene una actividad de APOA1BP; donde el compuesto que aumenta la expresión o la actividad de, o codifica, un polipéptido APOA1BP es un ácido nucleico que expresa o codifica un polipéptido APOA1BP o un polipéptido que tiene una actividad de polipéptido APOA1BP, y opcionalmente el ácido nucleico que expresa o codifica un polipéptido APOA1BP o un polipéptido que tiene una actividad de polipéptido APOA1BP está contenido en un vehículo de expresión, vector, virus recombinante, o equivalente, y opcionalmente el vector o virus es o comprende un vector de adenovirus o un vector de virus adeno-asociado (AAV), un retrovirus, un vector lentiviral, un virus del herpes simple, un virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), o un vector sintético, y opcionalmente el vector AAV comprende o es:

un virus adeno-asociado (AAV), o un vector de adenovirus,

un serotipo o variante AAV5, AAV6, AAV8 o AAV9, AAV-DJ o AAV-DJ/8™ (Cell Biolabs, Inc., San Diego, CA),

un AAV derivado de rhesus, o el AAVrh derivado de rhesus. 10hCLN2,

un mutante de la cápside del AAV o un serotipo híbrido del AAV,

un AAV organotrópico, o un AAV cardiotrópico, o un AAVM41 mutante cardiotrópico,

en el que, opcionalmente, el AAV está diseñado para aumentar la eficiencia en el direccionamiento a un tipo de célula específico que no es permisivo con un AAV de tipo salvaje (wt) y/o para mejorar la eficacia en la infección de un tipo de célula de interés,

y, opcionalmente, el AAV híbrido está reorientado o diseñado como serotipo híbrido mediante una o más modificaciones que comprenden: 1) una transcapsidación, 2) una adsorción de un anticuerpo biespecífico a una superficie de la cápside, 3) el diseño de una cápside en mosaico, y/o 4) el diseño de una cápside quimérica;

(ii) la formulación o composición farmacéutica de (i), en la que el polipéptido o proteína de unión (APOA1BP, AIBP o AI-BP) es una APOA1BP humana o de mamífero, o una AIBP1, o una APOA1BP recombinante, peptidomimética o sintética, o un bioisóstero de una proteína de unión (APOA1BP, AIBP o AI-BP);

(iii) la formulación o composición farmacéutica de cualquiera de los incisos i) a ii), formulada para su administración in vivo o formulada para la administración enteral o parenteral, o para la administración oral, subcutánea (SC), intramuscular (IM), intravenosa (IV) o intratecal (IT), en la que opcionalmente la formulación o composición farmacéutica, o la APOA1BP recombinante, peptidomimética o sintética, o el bioisóstero de la APOA1BP, o el ácido nucleico que codifica la APOA1BP o el vector que contiene un ácido nucleico que codifica la APOA1BP, se transporta en una nanopartícula, una partícula, una micela o un liposoma o lipoplex, un polimersoma, un polyplex o un dendrímero, que opcionalmente puede comprender o expresar además una fracción o péptido penetrante en la célula o en el SNC o una fracción o péptido dirigido al SNC; o

(iv) la formulación o composición farmacéutica de cualquiera de los puntos i) a iii), formulada como nanopartícula, liposoma, comprimido, píldora, cápsula, gel, gelatina, líquido, polvo, emulsión, loción, aerosol, spray, pastilla, solución acuosa o estéril o inyectable, o implante (por ejemplo, un implante intratecal); y

(b) administrar la formulación o la composición farmacéutica de (a) a un sujeto que la necesite, en el que opcionalmente el sujeto es un humano o un animal, tratando así, mejorando, previniendo, revirtiendo o disminuyendo la gravedad o la duración de la:

■ dolor neuropático,

■ dolor neuropático inducido por la inflamación, en el que opcionalmente el dolor neuropático inducido por la inflamación comprende un dolor neuropático inducido por el receptor tipo Toll 4 (TLR4),

■ dolor neuropático inducido por la inflamación,

■ inflamación del nervio o del SNC, donde opcionalmente la inflamación del nervio o del SNC comprende una inflamación del nervio o del SNC mediada por TLR4,

■ alodinia, donde opcionalmente la alodinia comprende una alodinia mediada por TLR4, ■ un dolor posterior a una lesión nerviosa o tisular o un dolor neuropático, en el que, opcionalmente, el dolor posterior a una lesión nerviosa o tisular o el dolor neuropático es generado o causado por, o es una secuela de, un traumatismo, quimioterapia, artritis, diabetes o una infección viral,

■ dolor postquirúrgico o dolor neuropático,

■ neuropatía periférica inducida por quimioterapia (NPIQ) (por ejemplo, una NPIQ o alodinia inducida por cisplatino),

■ una enfermedad o afección neurodegenerativa, opcionalmente una enfermedad o afección neurodegenerativa crónica o progresiva, opcionalmente la enfermedad de Alzheimer o una encefalopatía traumática crónica (ETC) o una tauopatía relacionada, una lesión cerebral traumática (LCT), un trastorno de estrés postraumático, una neurosis de guerra traumática o un síndrome de estrés postraumático (SSPT),

■ una cefalea primaria, opcionalmente una migraña o una cefalea en racimos, y/o

■ hiperalgesia.

En realizaciones alternativas, se proporcionan kits que comprenden una formulación o una composición farmacéutica utilizada en un método o uso tal como se proporciona en el presente documento, y que opcionalmente comprenden instrucciones sobre la práctica de un método o uso tal como se proporciona en el presente documento.

En realizaciones alternativas, se proporcionan Usos de una formulación o una composición farmacéutica como se utiliza en un método proporcionado en el presente documento, en la fabricación de un medicamento.

En realizaciones alternativas, se proporcionan Usos de una formulación o una composición farmacéutica como se utiliza en un método proporcionado en el presente documento, en la fabricación de un medicamento para tratar, mejorar, prevenir, revertir y/o disminuir la gravedad o la duración de: - dolor neuropático,

• dolor neuropático inducido por la inflamación, en el que opcionalmente el dolor neuropático inducido por la inflamación comprende un dolor neuropático inducido por el receptor tipo Toll 4 (TLR4),

• dolor neuropático inducido por la inflamación,

• inflamación del nervio o del SNC, donde opcionalmente la inflamación del nervio o del SNC comprende una inflamación del nervio o del SNC mediada por TLR4,

• alodinia, donde opcionalmente la alodinia comprende una alodinia mediada por TLR4,

• un dolor posterior a una lesión nerviosa o tisular o un dolor neuropático, en el que, opcionalmente, el dolor posterior a una lesión nerviosa o tisular o el dolor neuropático es generado o causado por, o es una secuela de, un traumatismo, quimioterapia, artritis, diabetes o una infección viral,

• dolor postquirúrgico o dolor neuropático,

• neuropatía periférica inducida por quimioterapia (NPIQ) (por ejemplo, una NPIQ o alodinia inducida por cisplatino),

• una enfermedad o afección neurodegenerativa, opcionalmente una enfermedad o afección neurodegenerativa crónica o progresiva, opcionalmente la enfermedad de Alzheimer o una encefalopatía traumática crónica (ETC) o una tauopatía relacionada, una lesión cerebral traumática (LCT), un trastorno de estrés postraumático, una neurosis de guerra traumática o un síndrome de estrés postraumático (SSPT), • una cefalea primaria, opcionalmente una migraña o una cefalea en racimos, y/o

• hiperalgesia

En realizaciones alternativas, se proporcionan formulaciones, composiciones farmacéuticas o combinaciones terapéuticas para su uso en un método para tratar, mejorar, prevenir, revertir o disminuir la gravedad y/o duración de:

• dolor neuropático,

• dolor neuropático inducido por la inflamación,

• dolor postquirúrgico o dolor neuropático,

• neuropatía periférica inducida por quimioterapia (NPIQ) (por ejemplo, una NPIQ o alodinia inducida por cisplatino), •

• hiperalgesia. en el que la formulación o una combinación terapéutica comprende uno de, todos o varios de:

(i) un compuesto o composición polipeptídica de la proteína de unión (APOA1BP, AIBP o AI-BP), o un compuesto que aumenta la expresión o la actividad de un polipéptido o ácido nucleico de APOA1BP, o lo codifica, o un polipéptido o péptido que tiene una actividad de APOA1BP, donde el compuesto que aumenta la expresión o la actividad de un polipéptido APOA1BP, o lo codifica, es un ácido nucleico que expresa o codifica un polipéptido APOA1BP o un polipéptido que tiene una actividad de polipéptido APOA1BP y opcionalmente el ácido nucleico que expresa o codifica un polipéptido APOA1BP o un polipéptido que tiene una actividad de polipéptido APOAlBP está contenido en un vehículo de expresión, vector, virus recombinante o equivalente y opcionalmente el vector o virus es o comprende un vector de adenovirus o un vector de virus adeno-asociado (AAV), un retrovirus, un vector lentiviral, un virus del herpes simple, un virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), o un vector sintético, y opcionalmente el vector AAV comprende o es:

un virus adeno-asociado (AAV), o un vector de adenovirus,

un AAV derivado de rhesus, o el AAVrh derivado de rhesus. 10hCLN2,

un mutante de la cápside del AAV o un serotipo híbrido del AAV,

en el que, opcionalmente, el AAV está diseñado para aumentar la eficiencia en la orientación de un tipo de célula específico que no es permisivo con un AAV de tipo salvaje (wt) y/o para mejorar la eficacia en la infección de un tipo de célula de interés, y opcionalmente el AAV híbrido está reorientado o diseñado como un serotipo híbrido por una o más modificaciones que comprenden: 1) una transcapsidación, 2) la adsorción de un anticuerpo biespecífico a una superficie de la cápside, 3) el diseño de una cápside en mosaico, y/o 4) el diseño de una cápside quimérica;

(ii) la formulación o composición farmacéutica de (i), en la que el polipéptido o proteína de unión a la ApoA1BP (APOA1BP, AIBP o AI-BP) es una APOA1BP humana o de mamífero, o una AIBP1, o una APOA1BP recombinante, peptidomimética o sintética, o un bioisóstero de una proteína de unión a la ApoA-I (APOA1BP, AIBP o AI-BP);

(iv) la formulación o la composición farmacéutica de cualquiera de los incisos i) a iii), formulada como una nanopartícula, un liposoma, un comprimido, una píldora, una cápsula, un gel, una gelatina, un líquido, un polvo, una emulsión, una loción, un aerosol, un spray, una pastilla, una solución acuosa o estéril o inyectable, o un implante (por ejemplo un implante intratecal), y en el que la formulación o una combinación terapéutica se administra a un individuo o paciente que la necesita.

Los detalles de una o más realizaciones de la invención se exponen en los dibujos que se acompañan y en la descripción que sigue. Otras características, objetos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción y los dibujos, y de las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

Los dibujos expuestos en este documento son ilustrativos de las realizaciones proporcionadas en el mismo y no pretenden limitar el alcance de la invención tal y como se engloba en las reivindicaciones.

La FIG. 1 ilustra de forma esquemática cómo el AIBP se dirige a las balsas lipídicas ocupadas por el receptor tipo Toll 4 (TLR4), facilita el eflujo de colesterol e inhibe los mecanismos neuroinflamatorios del dolor neuropático mediados por el TLR4, como se expone en detalle en el Ejemplo 1, más adelante.

La FIG. 2 ilustra gráficamente los datos que muestran el papel de TLR4 en el procesamiento nociceptivo. Los ratones WT (n=7) y Tlr4-/-(n=4) fueron tratados con seis inyecciones i.p. de cisplatino (2,3 mg/kg) durante un período de 11 días (recuadro sombreado) y se les realizó la prueba de von Frey para detectar alodinia. Media±SEM (error estándar en la media); *,p < 0,05, como se discute en detalle en el Ejemplo 1, más adelante.

La FIG. 3 ilustra gráficamente los datos que demuestran que el AIBP aumenta el flujo de colesterol desde las células endoteliales (CE) y los macrófagos. Media±SEM; n=4-7; *, p<0,05, como se discute en detalle en el Ejemplo 1, a continuación

Las FIG. 4A, FIG. 4B y FIG. 4C ilustran imágenes de geles, y la FIG. 4D ilustra gráficamente los datos, mostrando que: AIBP/HDL3 inhiben la dimerización de TLR4 inducida por LPS Fig. 4(A); la señalización inflamatoria en macrófagos en respuesta a LPS Fig. 4 (B); la localización de TLR4 y NOX4 en balsas lipídicas Fig. 4(C); y, la generación de ROS La Fig. 4(D); en células endoteliales, como se discute en detalle en el Ejemplo 1, más adelante.

La FIG. 5 ilustra gráficamente los datos que muestran que la administración intratecal (i.t.) de AIBP recombinante previene la alodinia táctil inducida por LPS. Tras la prueba de umbral de von Frey de referencia, se administró a los ratones una inyección i.t. de AIBP (0,5 jg /5 jl), hi-AIBP inactivado por calor (0,5 jg /5 j l) o solución salina (5 jl). Dos horas después, todos los ratones recibieron una inyección i.t. de LPS (0,1 jg / 5 jl). Media±SEM; n=4; *, p<0,05, como se discute en detalle en el Ejemplo 1, más adelante.

La FIG. 6 ilustra gráficamente los datos que muestran que la administración intratecal de AIBP recombinante alivia la alodinia preexistente. Tras la prueba de umbral de von Frey de referencia, los animales recibieron un LPS i.t. (0,1 jg / 5 jl). Veinticuatro horas después, los ratones recibieron AIBP i.t. (0,5 jg / 5 jl) o solución salina (5jl). Media±SEM; n=4 por grupo; *, p <0,05, como se discute en detalle en el Ejemplo 1, más adelante.

La FIG. 7 ilustra gráficamente los datos que demuestran que la administración intratecal de AIBP recombinante previene la alodinia táctil retardada evocada por la formalina intraplantar. Tras la prueba de umbral de von Frey de referencia, se administró a los ratones una inyección i.t. de AIBP (0,5 jg / 5 j l ) o solución salina (5 jl). Dos horas más tarde, todos los ratones recibieron una inyección de formol en una pata, como se explica detalladamente en el Ejemplo 1, más adelante.

La FIG. 8 ilustra gráficamente los datos que muestran que la administración intratecal de AIBP recombinante reduce la alodinia táctil inducida por el cisplatino. Los ratones (n=18) recibieron 6 inyecciones i.p. de cisplatino (2,3 mg/kg) durante un periodo de 11 días (recuadro gris). Este tratamiento provoca una disminución progresiva y persistente del umbral táctil. El día 25, doce ratones recibieron AIBP i.t. (0,5 jg / 5 jl; círculos rojos en el gráfico) y 6 ratones solución salina i.t. (cuadrados grises). El día 30, los ratones recibieron la segunda inyección i.t: 1) los ratones que recibieron solución salina fueron inyectados de nuevo con solución salina (cuadrados grises); 2) seis ratones que recibieron AIBP fueron inyectados de nuevo con AIBP (círculos rojos); y 3) seis ratones que recibieron AIBP fueron inyectados con solución salina (círculos negros).y recibieron una segunda inyección i.t. de AIBP (n=6) o solución salina (n=6). Media±SEM. *p <0,05, como se discute en detalle en el Ejemplo 1, a continuación.

La FIG. 9 ilustra gráficamente los datos que muestran que la inyección i.t. de AIBP y la deficiencia de TLR4 protegen contra la alodinia inducida por NMDA (ácido W-metil-D-aspárticoo A/-metil-D-aspartato). Dos horas después de que los ratones WT recibieran AIBP i.t. (0,5 jg / 5 jl; n=8) o ninguna inyección (n=8), recibieron NMDA i.t. (0,25nM). Media±SEM; *, p<0,05; **, p<0,005, como se discute en detalle en el Ejemplo 1, más adelante.

La FIG. 10 ilustra los datos que demuestran que AIBP se une a TLR4 pero no a TLR1, TLR7 o TLR9; se realizó un híbrido doble de levadura con pLexA-AIBP y ectodominios de TLR clonados en pB42AD, como se discute en detalle en el Ejemplo 2, a continuación.

Las FIG. 11A, FIG. 11B, FIG. 11C, FIG. 11D, ilustran que el AIBP se une a TLR4 e inhibe la dimerización de TLR4, como se discute en detalle en el Ejemplo 2, a continuación.

Las FIG. 12A, FIG. 12B, FIG. 12C, FIG. 12D ilustran que el AIBP reduce las respuestas inflamatorias en la microglía, como se discute en detalle en el Ejemplo 2, más adelante.

Las FIG. 13A, FIG. 13B, FIG. 13C, FIG. 13D, FIG. 13E, FIG. 13F ilustran los datos que muestran que la AIBP intratecal previene y revierte la alodinia, como se discute en detalle en el Ejemplo 2, más adelante.

La FIG. 14 ilustra gráficamente los datos de los estudios de las inyecciones intratecales de AIBP y LPS en ratones hembra, como se discute en detalle en el Ejemplo 2, a continuación.

La FIG. 15 ilustra gráficamente los datos de los estudios que demuestran que la AIBP intratecal no afecta al estremecimiento agudo de la pata después de la formalina, como se discute en detalle en el Ejemplo 2, a continuación.

Las FIG. 16A-B ilustran esquemática y gráficamente que el AIBP reduce la ocupación de TLR4 en las balsas lipídicas de la microglía, como se discute en detalle en el Ejemplo 3, más adelante.

Las FIG. 17A-B ilustran gráficamente los datos que muestran que el AIBP reduce las balsas lipídicas in vivo en la microglía de la médula espinal, como se discute en detalle en el Ejemplo 3, más adelante.

Las FIG. 18A-D ilustran esquemática y gráficamente que el AIBP reduce las respuestas inflamatorias en la microglía, como se discute en detalle en el Ejemplo 3, más adelante.

Las FIG. 19A-C ilustran gráficamente los datos que muestran que el AIBP reduce la neuroinflamación en el SNC, como se discute en detalle en el Ejemplo 3, a continuación.

La FIG. 20 ilustra esquemáticamente un vector AAV utilizado para demostrar la entrega de AIBP al SNC, donde la región del sitio de clonación múltiple pAAV-MCS es la SEQ ID NO:1; como se discute en detalle en el Ejemplo 4, a continuación.

La FIG. 21 ilustra una imagen de una inmunotransferencia que muestra la expresión de mAIBP en células HEK293 infectadas con FIB-mAIBP-His-AAV-DJ/8; la inmunotransferencia se sondeó con un anticuerpo anti-His, como se discute en detalle en el Ejemplo 4, más adelante.

La FIG. 22 ilustra gráficamente que la AIBP intravenosa reduce la aversión a la luz (medida de la migraña) en ratones machos inyectados con el Compuesto 48/80, como se discute en detalle en el Ejemplo 5, más adelante.

La FIG. 23 ilustra gráficamente que la AIBP intravenosa reduce la aversión a la luz (medida de la migraña) en ratones hembra inyectados con el Compuesto 48/80, como se discute en detalle en el Ejemplo 5, más adelante.

Los símbolos de referencia similares en los distintos dibujos indican elementos similares.

Ahora se hará referencia en detalle a varias realizaciones ejemplares proporcionadas en el presente documento, cuyos ejemplos se ilustran en los dibujos adjuntos. La siguiente descripción detallada se proporciona para dar al lector una mejor comprensión de ciertos detalles de aspectos y realizaciones de la invención, y no debe interpretarse como una limitación del alcance de la invención.

Descripción detallada

En realizaciones alternativas, se proporcionan composiciones y métodos que utilizan compuestos farmacéuticos y formulaciones que comprenden ácidos nucleicos, polipéptidos y vehículos de entrega de genes y polipéptidos para regular o manipular, incluyendo la adición, el mantenimiento, la mejora o la regulación al alza, la expresión de la proteína de unión (APOA1BP, AIBP o AI-BP), y kits que comprenden todos o algunos de los componentes para practicar estas composiciones y métodos. En realizaciones alternativas, se proporcionan composiciones y métodos para suministrar niveles terapéuticos de AIBP al cuerpo, incluyendo el cerebro y el SNC, incluyendo el uso de vehículos de suministro dirigidos y/o capaces de penetrar la barrera hematoencefálica, y vehículos de suministro de ácido nucleico (gen), como vectores y virus, como un vehículo de suministro de virus adeno-asociado (AAV) que contiene un ácido nucleico que expresa AIBP; y para la administración directa del polipéptido AIBP o del ácido nucleico que expresa AIBP directamente por vía intratecal (i.t.).

En el curso de los estudios sobre el papel de las balsas lipídicas en el tráfico de proteínas receptoras celulares, descubrimos inesperadamente que la proteína de unión a apoA-I (AIBP) es un componente regulador importante, y que la elevación de los niveles neuraxiales de AIBP regula la manifestación de los estados de dolor posteriores a la lesión nerviosa.

En nuestro estudio del modelo de transferencia pasiva de suero K/BxN de artritis, utilizamos inadvertidamente ratones C3H/HeJ, que son constitutivamente deficientes en el receptor funcional tipo Toll 4 (TLR4)12. Inesperadamente, encontramos una profunda atenuación de la alodinia de la fase tardía, pero no de la temprana (la alodinia es la experiencia de dolor de una estimulación no dolorosa de la piel, como el tacto ligero). Del mismo modo, la eliminación de TLR4 no tuvo ningún efecto sobre las medidas de referencia o la alodinia observada en la fase inflamatoria temprana (hasta el día 6), pero sorprendentemente evitó la alodinia persistente en la fase tardía. Este efecto se imitó mediante inyecciones intratecales (i.t.) de LPS-RS, un antagonista de TLR4, durante el intervalo del día 6-913. Es importante destacar que el knockout de TLR4 impidió los aumentos en la fase tardía de las citoquinas espinales y la activación de la glía espinal y del ATF3 de los ganglios de la raíz dorsal (DRG). Observando que esta invención no está limitada por ningún mecanismo de acción en particular, se demostró que el TLR4 es crítico en la mediación de la transición del dolor agudo al persistente. Se han generado datos similares después de la lesión del nervio y el tratamiento con quimioterapia en nuestro laboratorio y por otros14'18.

TLR4 y otros receptores implicados en la señalización inflamatoria se localizan, de forma constitutiva o tras la unión del ligando, en las balsas lipídicas, que son microdominios de membrana caracterizados por un alto contenido en colesterol y esfingomielina19'22. Los receptores que carecen de dominios de señalización, como el CD14 que entrega ligandos al TLR4, también residen en balsas lipídicas, y las menores tasas de difusión presentes en las balsas lipídicas favorecen la dimerización del TLR4, que es un paso obligatorio en su cascada de señalización2324.

En realizaciones alternativas, se proporcionan composiciones y métodos para suministrar cantidades terapéuticamente eficaces de AIBP (ya sea en forma de polipéptido de AIBP o de ácido nucleico que expresa AIBP) para dirigirse específicamente y facilitar el eflujo de colesterol en las balsas lipídicas ocupadas por TLR4 para la regulación selectiva de las respuestas inflamatorias, incluida la neuroinflamación y el dolor y la alodinia asociados. El colesterol es un componente estructural de cualquier membrana celular y su contenido es especialmente elevado en las balsas lipídicas. La eliminación del colesterol de las balsas lipídicas interrumpe la señalización de TLR425 El tratamiento con metil-p-ciclodextrina (MpCD) es un método habitual para eliminar el colesterol de la membrana plasmática en experimentos de cultivo celular, lo que produce una inhibición de las respuestas inflamatorias mediadas por TLR42627. Los derivados de la ciclodextrina se están desarrollando como una terapia prometedora para la enfermedad de Niemann-Pick tipo C, un grave trastorno neurodegenerativo de almacenamiento de colesterol lisosomal28'31. Sin embargo, el mecanismo fisiológico de eliminación del colesterol de la célula implica a los transportadores de colesterol de casete de unión a ATP (ABC) de membrana y endosómicos ABCA1 y ABCG1 y a los aceptores de colesterol extracelular apoA-I pobre en lípidos y a las HDL, cuya proteína principal es la apoA-I32-34. Hay un aumento sustancial en la expresión de genes inflamatorios en respuesta a los ligandos TLR4 en las células A b c a l /- Abcg1-/-, con cambios menos dramáticos en las células que carecen de ABCA1 o ABCG13536. Los aceptores de colesterol HDL y apoA-I pobre en lípidos y una serie de péptidos miméticos de apoA-I reducen también las respuestas inflamatorias37'42. Sin embargo, los mecanismos conocidos de eflujo de colesterol no implican ninguna selectividad espacial o tisular, y el carácter indiscriminado de la depleción del colesterol celular por las ciclodextrinas o por la apoA-I puede limitar sus aplicaciones clínicas. Nuestros estudios demostraron que la AIBP es una proteína que dirige el eflujo de colesterol específicamente a las balsas lipídicas ocupadas por TLR4 para la regulación selectiva de las respuestas inflamatorias.

Productos de fabricación, Kits

También se proporcionan productos de fabricación tales como implantes o bombas, kits y productos farmacéuticos para la práctica de los métodos previstos en el presente documento. En realizaciones alternativas, se proporcionan productos de fabricación, kits y/o productos farmacéuticos que comprenden todos los componentes necesarios para practicar un método como el proporcionado en el presente documento. En realizaciones alternativas, los kits también comprenden instrucciones para practicar un método como el que se proporciona aquí,

Formulaciones y composiciones farmacéuticas

En realizaciones alternativas, se proporcionan formulaciones o composiciones farmacéuticas que comprenden ácidos nucleicos y polipéptidos para practicar métodos y usos como los proporcionados en el presente documento para regular el dolor neuropático, los métodos que comprenden la regulación de la expresión de la proteína de unión (APOA1BP, AIBP o AI-BP). En realizaciones alternativas, se proporcionan formulaciones o composiciones farmacéuticas para su uso en métodos in vivo, in vitro o ex vivo para tratar, prevenir, revertir y/o mejorar el dolor neuropático. En realizaciones alternativas, las composiciones y formulaciones farmacéuticas utilizadas para poner en práctica los métodos y usos previstos en el presente documento comprenden ácidos nucleicos y polipéptidos de APOA1BP o dan lugar a un aumento de la expresión o actividad de los ácidos nucleicos y polipéptidos de APOA1BP se administran a un individuo que los necesita en una cantidad suficiente para tratar, prevenir, revertir y/o mejorar, por ejemplo un dolor neuropático, una enfermedad o afección neurodegenerativa, opcionalmente una enfermedad neurodegenerativa crónica o progresiva, opcionalmente la enfermedad de Alzheimer o una encefalopatía traumática crónica (ETC) o una tauopatía relacionada, una lesión cerebral traumática (LTC), un trastorno de estrés postraumático, una neurosis de guerra traumática o un síndrome de estrés postraumático (SSPT). En realizaciones alternativas, las composiciones y formulaciones farmacéuticas utilizadas para poner en práctica los métodos y usos previstos en el presente documento comprenden ácidos nucleicos y polipéptidos APOA1BP o dan lugar a un aumento de la expresión o la actividad de los ácidos nucleicos y polipéptidos A p Oa I b P se administran a un individuo que los necesita en una cantidad suficiente para prevenir o disminuir la intensidad y/o la frecuencia de, por ejemplo, el dolor neuropático o la enfermedad o afección neurodegenerativa.

En realizaciones alternativas, las composiciones farmacéuticas utilizadas para poner en práctica los métodos y usos que se proporcionan en el presente documento pueden administrarse por vía parenteral, tópica, oral o por administración local, como por aerosol o transdérmica. Las composiciones farmacéuticas pueden formularse de cualquier manera y pueden administrarse en una variedad de formas de dosificación unitarias dependiendo de la condición o enfermedad y el grado de la misma, la condición médica general de cada paciente, el método de administración preferido resultante y similares. Los detalles sobre las técnicas de formulación y administración están bien descritos en la literatura científica y de patentes, véase, por ejemplo, la última edición de Remington's Pharmaceutical Sciences, Maack Publishing Co., Easton PA ("Remington's").

Por ejemplo, en realizaciones alternativas, estas composiciones utilizadas para practicar los métodos y usos aquí previstos se formulan en un tampón, en una solución salina, en un polvo, en una emulsión, en una vesícula, en un liposoma, en una nanopartícula, en una nanolipopartícula y similares. En realizaciones alternativas, las composiciones pueden formularse de cualquier manera y pueden aplicarse en una variedad de concentraciones y formas dependiendo de las condiciones in v ivo , in vitro o ex vivo deseadas, un método de administración in vivo, in vitro o ex vivo deseado y similares. Los detalles sobre las técnicas de formulación y administración in vivo, in vitro o ex vivo están bien descritos en la literatura científica y de patentes. Las formulaciones y/o portadores utilizados para poner en práctica los métodos o usos previstos en el presente documento pueden presentarse en formas tales como comprimidos, píldoras, polvos, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, lechadas, suspensiones, etc., adecuados para aplicaciones in vivo, in vitro o ex vivo .

En realizaciones alternativas, las formulaciones y las composiciones farmacéuticas utilizadas para practicar los métodos y los usos que se proporcionan en el presente documento pueden comprender una solución de las composiciones (que incluyen peptidomiméticos, mezclas racémicas o racematos, isómeros, estereoisómeros, derivados y/o análogos de los compuestos) dispuestas en o disueltas en un portador farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse incluyen agua y solución de Ringer, un cloruro de sodio isotónico. Además, se pueden emplear aceites fijos estériles como disolvente o medio de suspensión. Para ello puede emplearse cualquier aceite fijo, incluidos los monoglicéridos o diglicéridos sintéticos, o ácidos grasos como el ácido oleico. En una realización, las soluciones y las formulaciones utilizadas para practicar los métodos y los usos previstos en el presente documento son estériles y pueden fabricarse para que estén generalmente libres de materia indeseable. En una realización, estas soluciones y formulaciones se esterilizan mediante técnicas de esterilización convencionales y bien conocidas.

Las soluciones y formulaciones utilizadas para poner en práctica los métodos y usos previstos en el presente documento pueden comprender sustancias auxiliares, según sea necesario, para aproximar las condiciones fisiológicas, como agentes de ajuste del pH y de amortiguación, agentes de ajuste de la toxicidad, por ejemplo, acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio y similares. La concentración de agente activo en estas formulaciones puede variar ampliamente, y puede seleccionarse principalmente en función de los volúmenes de fluidos, viscosidades y similares, de acuerdo con el modo particular de administración in vivo, in vitro o ex vivo seleccionado y los resultados deseados.

Las composiciones y formulaciones utilizadas para poner en práctica los métodos y usos previstos en el presente documento pueden administrarse mediante el uso de liposomas. Mediante el uso de liposomas, en particular cuando la superficie del liposoma lleva ligandos específicos para las células diana (por ejemplo, una célula neuronal lesionada o enferma o un tejido del SNC), o se dirigen preferentemente a un tipo de tejido u órgano específico, se puede centrar la entrega del agente activo en una célula diana en una aplicación in vivo, in vitro o ex vivo.

Nanopartículas, nanolipopartículas y liposomas

También se proporcionan nanopartículas, nanolipopartículas, vesículas y membranas liposomales que comprenden compuestos utilizados para poner en práctica los métodos y usos previstos en el presente documento, por ejemplo, para suministrar composiciones que comprenden ácidos nucleicos y polipéptidos APOA1BP in vivo, por ejemplo, al SNC y al cerebro. En realizaciones alternativas, estas composiciones están diseñadas para dirigirse a moléculas específicas, incluyendo moléculas biológicas, como polipéptidos, incluyendo polipéptidos de superficie celular, por ejemplo, para dirigirse a un tipo de célula u órgano deseado, por ejemplo, una célula nerviosa o el SNC, y similares.

Se proporcionan liposomas multicapa que comprenden compuestos utilizados para practicar métodos y usos como los proporcionados en el presente documento, por ejemplo, como se describe en Park, et al., la publicación de patente de EE.UU. N° 20070082042. Los liposomas multicapa pueden prepararse utilizando una mezcla de componentes de la fase oleosa que comprenden escualeno, esteroles, ceramidas, lípidos o aceites neutros, ácidos grasos y lecitinas, con un tamaño de partícula de aproximadamente 200 a 5000 nm, para atrapar una composición utilizada para practicar los métodos y usos previstos en el presente documento.

Los liposomas pueden fabricarse utilizando cualquier método, por ejemplo, como se describe en Park, et al., la publicación de patente de EE.UU. N° 20070042031El método de producción de un liposoma encapsulando un agente activo (por ejemplo, ácidos nucleicos y polipéptidos de APOA1BP) comprende una solución acuosa en un primer depósito, APOA1BP ácidos nucleicos y polipéptidos), el método comprende proporcionar una solución acuosa en un primer depósito; proporcionar una solución de lípidos orgánicos en un segundo depósito, y luego mezclar la solución acuosa con la solución de lípidos orgánicos en una primera región de mezcla para producir una solución de liposomas, donde la solución de lípidos orgánicos se mezcla con la solución acuosa para producir sustancialmente instantáneamente un liposoma que encapsula el agente activo; e inmediatamente después mezclar la solución de liposomas con una solución tampón para producir una solución de liposomas diluida.

En una realización, las composiciones de liposomas utilizadas para practicar los métodos y usos como se proporcionan en el presente documento comprenden un amonio sustituido y/o polianiones, por ejemplo, para la entrega dirigida de un compuesto (por ejemplo, un ácido nucleico y polipéptido ApoA lB P ) a un tipo de célula deseada (por ejemplo, una célula endotelial, una célula nerviosa, o cualquier tejido o área, por ejemplo, un SNC, que lo necesite), como se describe por ejemplo, en la publicación de patente de EE.UU. N° 20070110798.

Se proporcionan nanopartículas que comprenden compuestos (por ejemplo, ácidos nucleicos APOA1BP y polipéptidos utilizados para practicar los métodos proporcionados en el presente documento) en forma de nanopartículas que contienen agentes activos (por ejemplo, una nanopartícula secundaria), como se describe, por ejemplo, en la publicación de patente de Ee .u U. N° 20070077286. En una realización, se proporcionan nanopartículas que comprenden un agente activo soluble en grasa o un agente activo soluble en agua solubilizado en grasa para actuar con una sal metálica bivalente o trivalente.

En una realización, las suspensiones lipídicas sólidas pueden utilizarse para formular y entregar composiciones utilizadas para practicar métodos y usos como los proporcionados en el presente documento a células de mamíferos in vivo, por ejemplo, al SNC, como se describe, por ejemplo, en la publicación de patente de EE.UU. N° 20050136121.

Modificación de los vehículos de entrega y modificación del AIBP

En realizaciones alternativas, los péptidos o polipéptidos de AIBP, o las nanopartículas que contienen AIBP, los liposomas y similares (por ejemplo, que comprenden o contienen ácidos nucleicos o polipéptidos de APOA1BP utilizados para practicar los métodos proporcionados en el presente documento) se modifican para facilitar la inyección intratecal, por ejemplo, la entrega en el líquido cefalorraquídeo o el cerebro. Por ejemplo, en realizaciones alternativas, los péptidos o polipéptidos AIBP, o las nanopartículas que contienen AIBP, los liposomas y similares, están diseñados para comprender una fracción que permite que los péptidos o polipéptidos AIBP, o las nanopartículas que contienen AIBP, los liposomas y similares, se unan a un receptor o a una estructura de la membrana celular que facilite el suministro al SNC o al cerebro, por ejemplo, donde la fracción puede comprender un receptor de manosa-6-fosfato, un receptor de melanotransferrina, un receptor LRP o cualquier otro receptor que se exprese de forma ubicua en la superficie de cualquier célula del SNC o del cerebro. Por ejemplo, la conjugación de las moléculas de manosa-6-fosfato permite que los péptidos o polipéptidos de AIBP, o las nanopartículas que contienen AIBP, los liposomas y similares, sean captados por una célula del SNC que exprese un receptor de manosa-6-fosfato. En realizaciones alternativas, se puede utilizar cualquier protocolo o modificación de los péptidos o polipéptidos de AIBP, o de las nanopartículas que contienen AIBP, liposomas y similares, que facilitan la entrada o el suministro en el SNC o el cerebro in vivo, por ejemplo, como se describe en la USPN 9.089.566.

En realizaciones alternativas, los péptidos o polipéptidos de AIBP, o las nanopartículas, liposomas y similares que contienen AIBP (p. ej, que comprenden o tienen contenidos en ellos ácidos nucleicos o polipéptidos de APOA1BP utilizados para practicar los métodos proporcionados en el presente documento) están directa o indirectamente unidos o conjugados a cualquier agente dirigido a la barrera hematoencefálica (BBB), por ejemplo, una transferrina, una insulina una leptina, un factor de crecimiento similar a la insulina, un péptido catiónico, una lectina, una proteína asociada a receptores (RAP) (una chaperona de 39 kD localizada en el retículo endoplásmico y el Golgi, un ligando de la familia de receptores de lipoproteínas (LRP)), un anticuerpo (p.ej., un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal peptidomimético) contra un receptor de transferrina, un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal peptidomimético) contra el receptor de insulina, un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal peptidomimético) contra el receptor del factor de crecimiento similar a la insulina, un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal peptidomimético) contra el receptor de leptina y similares. En realizaciones alternativas, se puede utilizar cualquier protocolo o modificación de los péptidos o polipéptidos de AIBP, o de las nanopartículas que contienen AIBP, liposomas y similares, que facilitan el cruce de la BBB, por ejemplo, como se describe en las publicaciones de patente de EE.UU. nos. 20050142141; 20050042227. Por ejemplo, para mejorar la administración en el SNC o en el cerebro de una composición utilizada para practicar los métodos aquí previstos, se puede utilizar cualquier protocolo, por ejemplo: inyección intracraneal directa, permeabilización transitoria de la BBB, y/o modificación de péptidos o polipéptidos de AIBP, o de nanopartículas que contengan AIBP, liposomas y similares para alterar la distribución en los tejidos

Células de entrega y vehículos de entrega

En realizaciones alternativas, se puede utilizar cualquier vehículo de entrega para practicar los métodos o usos que se proporcionan en el presente documento, por ejemplo, para entregar composiciones (por ejemplo, ácidos nucleicos y polipéptidos APOA1BP) a un SNC o un cerebro in vivo. Por ejemplo, los vehículos de entrega que comprenden policationes, polímeros catiónicos y/o péptidos catiónicos, como los derivados de polietilenoimina, pueden utilizarse, por ejemplo, como se describe, por ejemplo, en la publicación de patente de EE.UU. N° 20060083737. En una realización, un vehículo de entrega es una célula transducida diseñada para expresar o sobreexpresar y luego secretar un AIBP endógeno o exógeno.

En una realización, se utiliza un complejo polipéptido-surfactante se

practicar métodos como los proporcionados en el presente documento, por ejemplo, como se describe, por ejemplo, en la publicación de patente de EE.UU. N° 20040151766.

En una realización, una composición utilizada para poner en práctica los métodos y usos previstos en el presente documento puede aplicarse a las células utilizando vehículos con conjugados de péptidos permeantes de la membrana celular, por ejemplo, como se describe en la Patente de EE.UU. n° 7.306.7836,589,503. En un aspecto, la composición a entregar se conjuga con un péptido permeante de la membrana celular. En una realización, la composición a entregar y/o el vehículo de entrega se conjugan con un péptido mediador del transporte, por ejemplo, como se describe en la Patente de EE.UU. n° 5.846.743 en la que se describen péptidos mediadores del transporte que son altamente básicos y se unen a los polifosfoyesitos.

En una realización, las células que se entregarán posteriormente a un SNC o un cerebro se transfectan o transducen con un ácido nucleico que expresa AIBP, por ejemplo, un vector, por ejemplo, mediante electropermeabilización, que puede utilizarse como medio primario o adjunto para entregar la composición a una célula, por ejemplo, utilizando cualquier sistema de electroporación como se describe, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU. n° 7.109.034; 6.261.815; 5.874.268.

Entrega in vivo de núcleos que codifican AIBP

En realizaciones alternativas, se proporcionan composiciones y métodos para suministrar ácidos nucleicos que codifican péptidos o polipéptidos AIBP, o ácidos nucleicos que codifican péptidos o polipéptidos que tienen actividad AIBP, o vectores o virus recombinantes que contienen estos ácidos nucleicos. En realizaciones alternativas, los ácidos nucleicos, los vectores o los virus recombinantes están diseñados para su administración y expresión in vivo o en el SNC.

En realizaciones alternativas, se proporcionan composiciones y métodos para el suministro y la expresión controlada de un ácido nucleico o un gen que codifica la AIBP, o un vehículo de expresión (por ejemplo, un vector, un virus recombinante y similares) que comprende (que contiene) un ácido nucleico o un gen que codifica la AIBP, lo que da lugar a la liberación de una proteína AIBP en el torrente sanguíneo o en la circulación general, donde puede tener un efecto beneficioso en el cuerpo, por ejemplo, en el SNC, el cerebro u otros objetivos.

En realizaciones alternativas, se proporcionan métodos para poder activar y desactivar la expresión de ácidos nucleicos o genes que expresan AIBP de forma fácil y eficiente para tratamientos a medida y para asegurar una seguridad óptima.

En realizaciones alternativas, la proteína o las proteínas de AIBP expresadas por el ácido(s) nucleico(s) o el gen(s) que expresan AIBP tienen efectos beneficiosos o favorables (por ejemplo, terapéuticos o profilácticos) en un tejido u órgano, por ejemplo, el cerebro, el SNC u otras dianas, aunque se secreten en la sangre o la circulación general a una distancia (por ejemplo, anatómicamente remota) de su sitio o sitios de acción.

En realizaciones alternativas, se proporcionan vehículos de expresión, vectores, virus recombinantes y similares para la expresión in vivo de un ácido nucleico o gen que codifica AIBP para practicar los métodos que se proporcionan aquí. En realizaciones alternativas, los vehículos de expresión, vectores, virus recombinantes y similares que expresan el ácido nucleico o el gen de la AIBP pueden administrarse por inyección intramuscular (IM), por inyección intravenosa (IV), por inyección subcutánea, por inhalación, por un sistema de administración de partículas biológicas (por ejemplo, la llamada "pistola de genes"), y similares, por ejemplo, como paciente externo, por ejemplo, durante una visita al consultorio.

En realizaciones alternativas, este modo "periférico" de entrega, por ejemplo, vehículos de expresión, vectores, virus recombinantes y similares inyectados por vía IM o IV, puede eludir los problemas encontrados cuando los genes o los ácidos nucleicos se expresan directamente en un órgano (por ejemplo, el cerebro o el SNC). La secreción sostenida de un AIBP en el torrente sanguíneo o en la circulación general también evita las dificultades y los gastos de la administración de proteínas por infusión.

En realizaciones alternativas, un virus recombinante (por ejemplo, un virus de larga duración o un vector viral), o un vector, o un vector de expresión, y similares, puede inyectarse, por ejemplo, en una vena sistémica (por ejemplo, IV), o por inyección intramuscular (IM), por inhalación, o por un sistema de entrega de partículas biológicas (por ejemplo, una llamada "pistola de genes"), por ejemplo, de forma ambulatoria, por ejemplo, en la consulta de un médico. En realizaciones alternativas, días o semanas más tarde (por ejemplo, cuatro semanas más tarde), se administra al individuo, paciente o sujeto (por ejemplo, se inhala, se inyecta o se traga), un producto químico o farmacéutico que induce la expresión de los ácidos nucleicos o genes que expresan AIBP; por ejemplo, se administra un antibiótico oral (por ejemplo, doxiciclina o rapamicina) una vez al día (o más o menos a menudo), que activará la expresión del gen. En realizaciones alternativas, tras la "activación", o la inducción de la expresión (por ejemplo, mediante un promotor inducible) del ácido nucleico o del gen, se sintetiza una proteína AIBP y se libera en la circulación del sujeto (por ejemplo, en la sangre), y posteriormente tiene efectos fisiológicos favorables, por ejemplo, terapéuticos o profilácticos, que benefician al individuo o al paciente (por ejemplo, benefician la función cardíaca, renal o pulmonar). Cuando el médico o el sujeto desean interrumpir el tratamiento AIBP, el sujeto simplemente deja de tomar el producto químico o farmacéutico activador, por ejemplo, un antibiótico. Las realizaciones alternativas comprenden el uso de "casetes de expresión" que comprenden o contienen una secuencia de nucleótidos utilizada para practicar los métodos proporcionados en el presente documento, por ejemplo, un ácido nucleico que expresa AIBP, que puede ser capaz de afectar a la expresión del ácido nucleico, por ejemplo, como un gen estructural o una transcripción (por ejemplo, que codifica una proteína AIBP) en un huésped compatible con tales secuencias. Los casetes de expresión pueden incluir al menos un promotor vinculado operativamente con la secuencia codificadora del polipéptido o la secuencia inhibidora; y, en un aspecto, con otras secuencias, por ejemplo, señales de terminación de la transcripción. También pueden utilizarse factores adicionales necesarios o útiles para efectuar la expresión, por ejemplo, potenciadores.

En aspectos alternativos, los casetes de expresión también incluyen plásmidos, vectores de expresión, virus recombinantes, cualquier forma de vector de "ADN desnudo" recombinante y similares. En aspectos alternativos, un "vector" puede comprender un ácido nucleico que puede infectar, transfectar, transducir transitoria o permanentemente una célula. En aspectos alternativos, un vector puede ser un ácido nucleico desnudo, o un ácido nucleico complejado con proteínas o lípidos. En aspectos alternativos, los vectores pueden comprender ácidos nucleicos virales o bacterianos y/o proteínas, y/o membranas (por ejemplo, una membrana celular, una envoltura lipídica viral, etc.). En aspectos alternativos, los vectores pueden incluir, pero no están limitados a replicones (por ejemplo, replicones de a Rn , bacteriófagos) a los que se pueden unir fragmentos de ADN y replicarse. Los vectores incluyen, pero no se limitan a ARN, ADN o ARN circular o lineal autorreplicante autónomo (por ejemplo, plásmidos, virus y similares, véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. n° 5.217.879), y puede incluir tanto los plásmidos de expresión como los de no expresión. En aspectos alternativos, un vector puede ser replicado de forma estable por las células durante la mitosis como una estructura autónoma, o puede ser incorporado dentro del genoma del huésped.

En aspectos alternativos, los "promotores" incluyen todas las secuencias capaces de impulsar la transcripción de una secuencia codificante en una célula, por ejemplo, una célula de mamífero como una célula muscular, nerviosa o cerebral. Los promotores utilizados en las construcciones proporcionadas en el presente documento incluyen elementos de control transcripcional de acción cis y secuencias reguladoras que participan en la regulación o la modulación del momento y/o la tasa de transcripción de un ácido nucleico, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica AIBP. Por ejemplo, un promotor puede ser un elemento de control transcripcional de acción cis, incluyendo un potenciador, un promotor, un terminador de la transcripción, un origen de replicación, una secuencia de integración cromosómica, regiones no traducidas 5' y 3', o una secuencia intrónica, que están implicados en la regulación transcripcional. Estas secuencias de acción cis suelen interactuar con proteínas u otras biomoléculas para llevar a cabo (activar/desactivar, regular, modular, etc.) la transcripción.

En realizaciones alternativas, los promotores "constitutivos" pueden ser aquellos que impulsan la expresión de forma continua en la mayoría de las condiciones ambientales y estados de desarrollo o diferenciación celular. En realizaciones alternativas, los promotores "inducibles" o "regulables" pueden dirigir la expresión de un ácido nucleico, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica AIBP, bajo la influencia de condiciones ambientales, agentes químicos administrados o condiciones de desarrollo.

Terapia génica y vehículos de entrega de genes

En realizaciones alternativas, los métodos de la invención comprenden el uso de sistemas de entrega de ácido nucleico (por ejemplo, gen o polipéptido que codifica un ácido nucleico que codifica AIBP) para entregar una carga útil del ácido nucleico o gen, o ácido nucleico que expresa AIBP, transcripción o mensaje, a una célula o células in vitro, ex vivo o in vivo, por ejemplo, como vehículos de entrega de terapia génica.

En realizaciones alternativas, el vehículo de expresión, el vector, el virus recombinante o los equivalentes utilizados para practicar los métodos proporcionados en el presente documento son o comprenden: un virus adeno-asociado (AAV), un vector lentiviral o un vector adenovirus; un serotipo AAV5, AAV6, AAV8 o AAV9; un AAV derivado de rhesus, o el AAVrh derivado de rhesus. 10hCLN2; un AAV organotrópico, o un AAV neurotrópico; y/o un serotipo híbrido o mutante de la cápside del AAV. En otras realizaciones, el AAV está diseñado para aumentar la eficiencia en la orientación de un tipo de célula específico que no es permisivo con un AAV de tipo salvaje (wt) y/o para mejorar la eficacia en la infección de un tipo de célula de interés. En realizaciones alternativas, el AAV híbrido es reorientado o diseñado como un serotipo híbrido mediante una o más modificaciones que comprenden: 1) una transcapsidación, 2) la adsorción de un anticuerpo biespecífico a una superficie de la cápside, 3) el diseño de una cápside en mosaico, y/o 4) el diseño de una cápside quimérica. Es bien conocido en el arte cómo diseñar la cápside de un virus adeno-asociado (AAV) para aumentar la eficiencia en el direccionamiento a tipos de célula específicos que no son permisivos a los virus de tipo salvaje (wt) y para mejorar la eficacia en la infección de sólo el tipo de célula de interés; véase por ejemplo, los documentos Wu et al., Mol. Ther. 2006 Sep;14(3):316-27. Epub 2006 Jul 7 Choi, et al., Curr. Gene Ther.

2005 Jun;5(3):299-310.

Por ejemplo, en realizaciones alternativas, los serotipos AAV-8, AAV-9, AAV-DJ o AAV-DJ/8™ (Cell Biolabs, Inc., San Diego, CA), que tienen una mayor captación en el tejido cerebral in vivo, se utilizan para entregar una carga útil de ácido nucleico que codifica AIBP para su expresión en el SNC. En otras realizaciones, se utilizan los siguientes serotipos, o sus variantes, para dirigirse a un tejido específico:

Tejido Serotipo óptimo

Páncreas AAV8

Tejido Serotipo óptimo

Células fotorreceptoras AAV2, AAV5, AAV8

EPR (epitelio pigmentario de la retina) AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV8

Músculo esquelético AAV1, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9

En realizaciones alternativas, se puede utilizar el AAVrh.10hCLN2 derivado de rhesus o sus equivalentes, en los que el AAV derivado de rhesus puede no ser inhibido por ninguna inmunidad preexistente en un humano; véase, por ejemplo los documentos Sondhi, et al., Hum Gene Ther. Métodos. 2012 Oct;23(5):324-35, Epub 2012 Nov 6 Sondhi, et al., Hum Gene Ther. Métodos. 2012 Oct 17; que enseñan que la administración directa de AAVrh.10hCLN2 al SNC de ratas y primates no humanos en dosis escalables a los seres humanos tiene un perfil de seguridad aceptable y media una expresión significativa de la carga útil en el SNC.

Debido a que los virus adeno-asociados (AAVs) son agentes infecciosos comunes de los primates, y como tal, los primates sanos llevan un gran grupo de anticuerpos neutralizantes específicos de AAV (NAbs) que inhiben las estrategias terapéuticas de transferencia de genes mediadas por AAV, los métodos proporcionados en el presente documento pueden comprender el cribado de los pacientes candidatos para los NAbs específicos de AAV antes del tratamiento, especialmente con el componente de la cápside de AAV8 frecuentemente utilizado, para facilitar el diseño del tratamiento individualizado y mejorar la eficacia terapéutica; véase, por ejemplo, los documentos Sun, et al., J. Immunol. Métodos. 2013 Ene 31;387(1-2):114-20, Epub 2012 Oct 11.

Dosificación

Las composiciones y formulaciones farmacéuticas utilizadas para poner en práctica los métodos y usos previstos en el presente documento pueden administrarse para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. En las aplicaciones terapéuticas, las composiciones se administran a un sujeto que ya padece una enfermedad, afección, infección o defecto en una cantidad suficiente para curar, aliviar o detener parcialmente las manifestaciones clínicas de la enfermedad, afección, infección o dolencia y sus complicaciones (una "cantidad terapéuticamente eficaz"), incluyendo, por ejemplo, un dolor neuropático. Por ejemplo, en realizaciones alternativas, las composiciones y formulaciones farmacéuticas que comprenden el ácido nucleico o el polipéptido APOA1BP, tal como se proporciona en el presente documento, se administran a un individuo que las necesita en una cantidad suficiente para tratar, prevenir, revertir y/o mejorar un dolor neuropático, un dolor neuropático inducido por la inflamación, un dolor neuropático inducido por la inflamación, una inflamación del nervio o del SNC, una alodinia, un dolor posterior a una lesión nerviosa o un dolor neuropático, un dolor posquirúrgico o un dolor neuropático, una neuropatía periférica inducida por quimioterapia (NPIQ) (por ejemplo, alodinia inducida por cisplatino), una enfermedad o afección neurodegenerativa, opcionalmente una enfermedad o afección neurodegenerativa crónica o progresiva, opcionalmente la enfermedad de Alzheimer o una encefalopatía traumática crónica (ETC) o una tauopatía relacionada, una lesión cerebral traumática (LCT), un trastorno de estrés postraumático, una neurosis de guerra traumática o un síndrome de estrés postraumático (SSPT), una migraña y/o una hiperalgesia.

La cantidad de composición farmacéutica adecuada para lograr esto se define como "dosis terapéuticamente eficaz" El esquema de dosificación y las cantidades efectivas para este uso, es decir, el "régimen de dosificación", dependerá de una variedad de factores, incluyendo la etapa de la enfermedad o condición, la gravedad de la enfermedad o condición, el estado general de la salud del paciente, el estado físico del paciente, la edad y similares. Al calcular el régimen de dosificación para un paciente, también se tiene en cuenta el modo de administración.

En realizaciones alternativas, se administran vectores virales como adenovirus o vectores AAV a un individuo que los necesita, y en una realización alternativa la dosis administrada a un humano comprende una dosis de aproximadamente 2 ><1012genomas vectoriales por kg de peso corporal (vg/kg), o entre aproximadamente1010 y 1014 genomas vectoriales por kg de peso corporal (vg/kg), o aproximadamente 109,101°,1011,1012,1011,1014,1015, o más vg/kg, que puede administrarse como una dosis única o en dosis múltiples, según sea necesario. En otras realizaciones, estas dosis se administran por vía oral, IM, IV o intratecal. En realizaciones alternativas, los vectores se entregan como formulaciones o preparaciones farmacéuticas, por ejemplo, cuando los vectores están contenidos en una nanopartícula, una partícula, una micela o un liposoma o lipoplex, un polimersoma, un polyplex o un dendrímero. En realizaciones alternativas, estas dosis se administran una vez al día, una vez a la semana, o cualquier variación de las mismas, según sea necesario para mantener los niveles de expresión in vivo de la AIBP, que pueden controlarse midiendo realmente la expresión de la AIBP o mediante el control del efecto terapéutico, por ejemplo, la disminución del dolor. El régimen de dosificación también toma en consideración los parámetros farmacocinéticos bien conocidos en el arte, es decir, la tasa de absorción de los agentes activos, la biodisponibilidad, el metabolismo, el aclaramiento y similares (véase, por ejemplo, los documentos Hidalgo-Aragones (1996) J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 58:611-617 Groning (1996) Pharmazie 51:337-341 Fotherby (1996) Contraception 54:59-69 Johnson (1995) J. Pharm. Sci.

84:1144-1146 Rohatagi (1995) Pharmazie 50:610-613 Brophy (1983) Eur. J. Clin. Pharmacol. 24:103-108; el último de Remington, supra). El estado de la técnica permite al médico determinar el régimen de dosificación para cada paciente individual, agente activo y enfermedad o condición tratada. Las directrices proporcionadas para composiciones similares utilizadas como productos farmacéuticos pueden utilizarse como guía para determinar el régimen de dosificación, es decir, el esquema de dosis y los niveles de dosificación, administrados practicando los métodos tal y como se proporcionan aquí son correctos y apropiados.

Las administraciones únicas o múltiples de las formulaciones pueden administrarse dependiendo de la dosis y la frecuencia según lo requiera y tolere el paciente. Las formulaciones deben proporcionar una cantidad suficiente de agente activo para tratar, prevenir o mejorar eficazmente las afecciones, enfermedades o síntomas descritos en el presente documento. Por ejemplo, las formulaciones farmacéuticas alternativas ejemplares para la administración oral de las composiciones utilizadas para practicar los métodos que se proporcionan en el presente documento están en una cantidad diaria de entre aproximadamente 0,1 a 0,5 a aproximadamente 20, 50, 100 o 1000 o más ug por kilogramo de peso corporal por día. En una realización alternativa, se utilizan dosis de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 4 mg por kg de peso corporal por paciente y por día. A diferencia de la administración por vía oral, pueden utilizarse dosis más bajas en el torrente sanguíneo, en una cavidad corporal o en el lumen de un órgano. Se pueden utilizar dosis sustancialmente más altas en la administración tópica u oral o administrando por polvos, spray o inhalación. Los métodos reales para preparar formulaciones administrables por vía parenteral o no parenteral serán conocidos o evidentes para los expertos en la materia y se describen con más detalle en publicaciones como la de Remington, supra.

Los métodos tal como se proporcionan en el presente documento pueden comprender además la coadministración con otros medicamentos o productos farmacéuticos, por ejemplo, composiciones para el tratamiento de cualquier enfermedad, condición, infección o lesión neurológica o neuromuscular, incluidas las enfermedades y condiciones inflamatorias y autoinmunes relacionadas, y similares. Por ejemplo, los métodos y/o las composiciones y formulaciones que se proporcionan en el presente documento pueden coformularse con y/o coadministrarse con, fluidos, antibióticos, citocinas, agentes inmunorreguladores, agentes antiinflamatorios, compuestos que alivian el dolor, agentes activadores del complemento, como péptidos o proteínas que comprenden dominios similares al colágeno o dominios similares al fibrinógeno (por ejemplo, una ficolina), dominios de unión a carbohidratos, y similares y combinaciones de los mismos.

Bioisósteros de compuestos

En una realización alternativa, también se proporcionan bioisósteros de compuestos utilizados para practicar los métodos proporcionados aquí, por ejemplo, polipéptidos que tienen una actividad APOA1BP. Los bioisósteros utilizados para practicar métodos como los previstos en el presente documento incluyen bioisósteros de, por ejemplo, ácidos nucleicos y polipéptidos APOA1BP, que en realizaciones alternativas pueden comprender uno o más sustituyentes y/o grupos de sustitución con un sustituyente y/o grupo que tenga propiedades físicas o químicas sustancialmente similares que produzcan propiedades biológicas sustancialmente similares a los compuestos utilizados para practicar métodos o usos como los previstos en el presente documento. En una realización, el propósito de cambiar un bioisóstero por otro es mejorar las propiedades biológicas o físicas deseadas de un compuesto sin hacer cambios significativos en las estructuras químicas.

Por ejemplo, en una realización, uno o más átomos de hidrógeno se sustituyen por uno o más átomos de flúor, por ejemplo, en un sitio de oxidación metabólica; esto puede impedir que se produzca el metabolismo (catabolismo). Dado que el átomo de flúor tiene un tamaño similar al del átomo de hidrógeno, la topología general de la molécula no se ve afectada significativamente, por lo que la actividad biológica deseada no se ve afectada. Sin embargo, con una vía bloqueada para el metabolismo, la molécula puede tener una vida media más larga o ser menos tóxica, y similares.

Dispositivos para la administración de agentes terapéuticos directamente en el SNC o el cerebro

En realizaciones alternativas, las composiciones y formulaciones farmacéuticas, incluidas las nanopartículas y los liposomas, utilizadas para practicar los métodos que se proporcionan en el presente documento, se administran directamente en el s Nc o en el cerebro, por ejemplo, por inyección intravenosa o intratecal, o mediante diversos dispositivos conocidos en la técnica. Por ejemplo, La publicación de la solicitud de patente de EE.UU. N° 20080140056describe un catéter de avance rostral en el espacio intratecal para la administración cerebral directa de productos farmacéuticos y formulaciones. También se pueden utilizar dispositivos de infusión implantables; por ejemplo, un catéter para suministrar fluido desde el dispositivo de infusión al cerebro puede introducirse por vía subcutánea desde el abdomen hasta el cráneo del paciente, donde el catéter puede acceder al cerebro del individuo a través de un agujero perforado. Alternativamente, se puede implantar un catéter de manera que suministre el agente por vía intratecal dentro del canal espinal del paciente. También se pueden utilizar catéteres guía flexibles que tienen un extremo distal para su introducción por debajo del cráneo de un paciente y un extremo proximal que permanece fuera del paciente, por ejemplo, véase la publicación de la solicitud de patente de EE.UU. N° 20060129126.

En realizaciones alternativas, las composiciones y formulaciones farmacéuticas utilizadas para poner en práctica los métodos previstos en el presente documento se suministran mediante la entrega directa de composiciones y formulaciones farmacéuticas, incluyendo nanopartículas y liposomas, o la implantación directa de células que expresan AIBP en un cerebro, por ejemplo, utilizando cualquier cánula de implantación celular, jeringa y similares, como se describe, por ejemplo, en la publicación de la solicitud de patente de EE.UU. N° 20080132878dispositivos médicos de inserción, o alargados, como los descritos, por ejemplo, en la Patente de EE.UU. N° 7.343.205; o una cánula quirúrgica como la descrita, por ejemplo, en la patente de EE.UU. N° 4.899.729. Las cánulas de implantación, jeringas y similares también pueden utilizarse para la inyección directa de líquidos, por ejemplo, como suspensiones fluidas.

En realizaciones alternativas, las composiciones y formulaciones farmacéuticas utilizadas para practicar los métodos aquí previstos se suministran con trazadores que son detectables, por ejemplo, por resonancia magnética (MRI) y/o por tomografía computarizada (CT) de rayos X; los trazadores pueden ser co-infundidos con el agente terapéutico y utilizados para monitorear la distribución del agente terapéutico a medida que se mueve a través del tejido objetivo, como se describe, por ejemplo, en la patente de EE.UU. N° 7.371.225.

Kits e instrucciones

Se proporcionan kits que comprenden composiciones (incluyendo los dispositivos descritos en el presente documento) y/o instrucciones para practicar los métodos proporcionados en el presente documento para su uso, por ejemplo, para tratar, mejorar o prevenir un dolor neuropático. Por ello, también se pueden proporcionar kits, células, vectores y similares. En realizaciones alternativas, se proporcionan kits que comprenden: una composición utilizada para practicar un método como el proporcionado en el presente documento, o una composición, una composición farmacéutica o una formulación como la proporcionada en el presente documento, y que opcionalmente comprenden instrucciones para su uso.

La invención se describirá más adelante con referencia a los ejemplos descritos en el presente documento; sin embargo, debe entenderse que la invención no se limita a dichos ejemplos.

Ejemplos

Ejemplo 1: Eficacia demostrada en métodos ejemplares

Este ejemplo describe y demuestra realizaciones ejemplares, y la eficacia de los métodos aquí proporcionados para, por ejemplo, tratar o mejorar un dolor neuropático, incluyendo, por ejemplo, la alodinia y el dolor neuropático inducido por la inflamación mediada por TLR4.

Papel de TLR4 en el procesamiento nociceptivo. El TLR4 es un mediador omnipresente de los estados de dolor persistente. La Fig. 2 muestra que la deficiencia de TLR4 provoca una atenuación completa de la alodinia táctil tras el tratamiento con el quimioterapéutico cisplatino20. Tanto el desarrollo inicial de la alodinia, durante el tratamiento con cisplatino, como el estado de dolor persistente están atenuados. Hemos demostrado que la liberación de TNFa mediada por TLR4 se considera un factor importante en el desarrollo de la alodinia165960.

TLR4 se localiza en las balsas lipídicas, y se ha demostrado que los factores que facilitan el agotamiento del colesterol de las balsas lipídicas disminuyen la respuesta inflamatoria mediada por TLR4s 2061-64. A continuación describimos un nuevo actor en la regulación de las balsas lipídicas, el AIBP, que demostramos que puede modular (atenuar) la alodinia y la hiperalgesia mediadas por TLR4.

El AIBP aumenta el eflujo de colesterol, reduce las balsas lipídicas e interfiere en la señalización del receptor. Dado que la AIBP se une a la apoA-I53, primero validamos que la AIBP recombinante se unía a la HDL3, una fracción importante de las HDL implicada en el eflujo de colesterol58. A continuación, demostramos que, en presencia de AIBP, el eflujo de colesterol de las células endoteliales (CE) y de los macrófagos a las HDL3 aumentaba entre 2 y 4 veces (Fig. 3). Por sí mismo, el AIBP no promovió el eflujo de colesterol en ausencia de HDL3. Más bien, la unión del AIBP a las células aumentó la capacidad general de la célula para unir el HDL3 y aumentó la tasa de disociación de1HDL3 de las células58, creando así condiciones que facilitarían el eflujo de colesterol.

Las HDL eliminan el colesterol y reducen las balsas lipídicas, un proceso que interfiere con la dimerización de TLR4 inducida por el ligando. Esta hipótesis fue validada inicialmente en los experimentos que se muestran en la Fig. 4: El tratamiento con AIBP/HDL3 inhibió la dimerización de TLR4 inducida por LPS en las células BaF3 que expresan TLR4-flag y TLR4-gfp (A), la fosforilación de p65 y ERK1/2 inducida por LPS en los macrófagos RAW (B), y la localización de TLR4 y NOX4 en las balsas lipídicas de la CE (C), con la consiguiente reducción de las ROS inducidas por LPS (D).

Para probar la hipótesis de que el AIBP inhibe los mecanismos inflamatorios del dolor neuropático mediados por el TLR4, inyectamos solución salina o AIBP recombinante por vía intratecal (i.t.) 2 horas antes de la inyección i.t. de LPS, el agonista específico de TLR4 (Fig. 5). Como se esperaba de nuestros estudios anteriores, en el grupo inyectado con solución salina, el LPS indujo una grave alodinia táctil. Sorprendentemente, la inyección de AIBP impidió por completo la alodinia inducida por el LPS, mientras que las inyecciones de AIBP desnaturalizada e inactivada por el calor no tuvieron ningún efecto. No observamos ninguna toxicidad aparente del AIBP i.t. (o i.v. en otros experimentos). Estos primeros resultados apoyan firmemente nuestra hipótesis. Es importante destacar que AIBP i.t. inyectada hasta 24 horas después de LPS i.t. también redujo la alodinia (Fig. 6).

Alodinia táctil retardada evocada por la formalina intraplantar. La inyección intraplantar de formalina produce un comportamiento agudo de estremecimiento y, después de 7 días, una alodinia táctil persistente y una activación microglial espinal asociada65. En un trabajo reciente, descubrimos que la eliminación o el antagonismo de TLR4 no tenían ningún efecto sobre el estremecimiento, pero prevenía la alodinia táctil retardada. Del mismo modo, las inyecciones i.t. de AIBP impidieron la alodinia táctil retardada de la pata ipsilateral pero no la contralateral en respuesta a la formalina (Fig. 7).

Polineuropatía inducida por cisplatino. En los roedores, al igual que en las personas, el cisplatino induce una alodinia táctil de larga duración. Este modelo altamente traslativo demostró que la alodinia táctil inducida por el cisplatino se atenúa en los ratones2021 Tlr4-/-. Descubrimos que una sola inyección i.t. de AIBP revirtió significativamente, aunque de forma transitoria (días), la alodinia establecida inducida por el cisplatino (Fig. 8), mientras que una segunda inyección produjo una eficacia más prolongada.

Clínicamente, la neuropatía periférica inducida por quimioterapia (NPIQ) es uno de los únicos estados de dolor neuropático en los que el inicio del estímulo doloroso se controla de forma predecible. Por lo tanto, examinamos si AIBP i.t. puede prevenir, así como revertir, la alodinia táctil inducida por el cisplatino en ratones. Según los datos ilustrados gráficamente en la Fig. 8, una sola dosis de AIBP puede no ser adecuada; pero como se muestra en el modelo K/BxN, fueron necesarias 3 inyecciones i.t. de un antagonista de TLR4 para promover la reversión de la alodinia retardada y persistente16. Observamos que se puede realizar una dosificación i.t. múltiple en ratones.

Aunque la invención no está limitada por ningún mecanismo de acción en particular, el AIBP puede afectar no sólo al TLR4 sino también a la función de otros receptores localizados en balsas lipídicas. Inyectamos a los ratones con AIBP i.t., seguido de NMDA i.t.. Sorprendentemente, la inyección de AIBP evitó en gran parte la alodinia inducida por el NMDA (Fig. 9).

Ejemplo 2: Eficacia demostrada en métodos ejemplares - La AIBP trata y previene el dolor neuropático

En realizaciones alternativas, se proporcionan métodos para tratar, mejorar, prevenir, revertir o disminuir la gravedad o la duración de las lesiones nerviosas y tisulares y los estados de dolor neuropático relacionados generados, por ejemplo, por un traumatismo, quimioterapia, artritis, diabetes o infección viral, todos los cuales pueden dar lugar a estados de dolor neuropático.

Una característica común de estos eventos iniciadores es la liberación de moléculas de patrones moleculares asociados al daño, que pueden activar los receptores tipo Toll (TLR) (1-4). El TLR4 neuraxial y sus adaptadores de señalización descendentes se han implicado en el desarrollo de estados de dolor facilitado, como ocurre tras una lesión nerviosa (5-11) y, en particular, en la evolución de un estado de dolor crónico tras una lesión aguda o una inflamación (6). Al igual que otros receptores inflamatorios y neurotransmisores clave, el TLR4 activado se localiza en balsas lipídicas (12-15). Hemos descubierto que el AIBP, en combinación con las lipoproteínas de alta densidad (HDL), reduce las balsas lipídicas en las células endoteliales y, por tanto, controla la activación del receptor-2 del factor de crecimiento endotelial vascular localizado en las balsas lipídicas y restringe la angiogénesis (17).

Aunque la invención no está limitada por ningún mecanismo de acción en particular, se proporcionan métodos para usar o administrar AIBP para regular los receptores inflamatorios que residen en las balsas lipídicas, incluyendo los TLR en los macrófagos y la microglía.

Materiales y métodos

Animales: Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California, San Diego. Se alojaron hasta 4 ratones por jaula estándar a temperatura ambiente y se mantuvieron en un ciclo de luz y oscuridad de 12:12 horas, con las luces encendidas a las 07:00. Todas las pruebas de comportamiento se realizaron durante el ciclo de luz. Tanto la comida como el agua estaban disponibles ad libitum. Los ratones machos C57B1/6 de tipo salvaje se adquirieron en Harlan (Indianápolis, IN) o en el Laboratorio Jackson (Bar Harbor, ME).

Células: Se cosecharon macrófagos peritoneales primarios de ratones C57B1/6 3 días después de una inyección intraperitoneal de tioglicolato, se seleccionaron por adsorción a una placa y se mantuvieron en DMEM suplementado con 10% de FBS inactivado por calor (Omega Scientific) y 50 pg/ml de gentamicina (Omega Scientific). Se aislaron microglías primarias de ratones C57BI/6 de 2 a 3 semanas de edad como se describió anteriormente (1). En resumen, los cerebros aislados de 5 a 6 ratones se juntaron y se homogeneizaron en HBSS (Gibco) suplementado con 0,5% de BSA y EDTA 1 mM en hielo. Se obtuvo una suspensión de células individuales con un colador de células de 70 pm (Biologix Group) separadas en un gradiente discontinuo de Percoll (GE Healthcare) al 37-70%. Tras eliminar la capa de mielina/residuos, se recogieron las células de la interfase, se lavaron y se colocaron en DMEM/F12 (Cellgro) suplementado con 5% de FBS y 50 pg/ml de gentamicina. Las células se complementaron diariamente durante 7 días con 20 ng/ml de IL-34 de ratón recombinante (R&D Systems). Las células microgliales inmortalizadas de la línea BV-2 (2) se mantuvieron en DMEM suplementado con 5% de FBS (Omega Scientific) y 50 pg/ml de gentamicina. Las células Ba/F3 que expresan de forma estable TLR4-gfp, TLR4-flag y MD2 (3, 4) se cultivaron en RPMI1640 (Invitrogen) con 70 unidades/ml de interleucina murina recombinante, 10% de FBS inactivado por calor y 50 |jg/ml de gentamicina. Las células HEK293 se cultivaron en DMEM suplementado con 10% de FBS y 50 jg/m l de gentamicina.

Sistema de hibridación doble de levadura: Las interacciones de los ectodominios de los TLR con el AIBP se evaluaron mediante un ensayo de dos híbridos de levadura (BD Clontech, Palo Alto, CA). En un experimento (Fig. 1), las levaduras EGY48 transformadas con p80p-LacZ fueron co-transformadas con pB42AD-AIBP y pLexA-TLR4 (AA 1 629). En un experimento diferente (Figura 10), se cambiaron los vectores y se transfornaron levaduras pLexA-AIBP y pB42AD-TLR1 (AA 22-524), pB42AD-TLR4 (AA 1-629), pB42AD-TLR7 (AA 1-795) o pB42AD-TLR9 (AA 1-772). Tras la selección para un fenotipo Trp+ e His+, se probó el crecimiento dependiente de Leu y la actividad p-gal (LacZ) en medio de inducción (SD/galactosa/rafinosa). El control positivo fue la línea celular de levadura EGY48/p80p-LacZ cotransfectada con pLexA53 y pB42ADT; el control negativo fue la línea celular de levadura co-transfectada con pLexA y pB42AD (5).

Ensayo de pull-down de AIBP-TLR4: Las células HEK293 se transfectaron con el dominio extracelular de flag-TLR4 humano y flag-AIBP humano utilizando el reactivo de transfección de ADN GenJet™ In Vitro (SignaGen Laboratories). A los 2 días de la transfección, las células se lisaron con un tampón de lisis frío (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, 1% NP-40, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, Na3VO45 mM, NaF 1 mM y un cóctel de inhibidores de proteasas de Sigma). Los lisados celulares se preincubaron con perlas de sefarosa de proteína A/G (GE Healthcare) durante 30 minutos a 4°C y se inmunoprecipitaron con un anticuerpo de conejo anti-AIBP (Abcam) durante la noche a 4°C. Al día siguiente, los lisados se incubaron de nuevo con perlas de sefarosa de proteína A/G durante 1 hora más a 4°C. Los complejos inmunes se lavaron cinco veces con tampón de lisis, se corrieron en un gel NuPAGE™ (Invitrogen), y el TLR4 unido a AIBP se detectó por inmunotransferencia con un anticuerpo anti-flag (Sigma).

Ensayo de unión por citometría de flujo: Los macrófagos peritoneales primarios aislados de ratones de tipo salvaje y Tlr4-/- se colocaron en placas durante la noche, luego se lavaron con PBS, se bloquearon con TBS que contenía 1% de BSA durante 30 minutos en hielo y se incubaron con 2 jg/m l de BSA o 2 jg/m l de AIBP durante 2 horas en hielo. Las células se lavaron tres veces con PBS y se incubaron con un anticuerpo anti-His conjugado con FITC (Abcam) de 1 jg/m l durante 1 hora a 4 °C. Tras cinco lavados con PBS, las células se analizaron con un citómetro de flujo FACSCanto II™ (BD Biosciences, San José, CA). Se midieron las medias geométricas de los histogramas FACS y se presentaron como gráficos de barras.

Ensayo de dimerización de TLR4: Las células Ba/F3 fueron pretratadas con 50 jg/m l de HDL solo o con 50 jg/m l de HDL+ 0,2 jg/m l de AIBP. Dos horas después del pretratamiento, las células se estimularon con DMSO (vehículo) o con 10 ng/ml de LPS durante 10 minutos a 37°C y se lisaron con un tampón de lisis frío (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, 1% NP-40, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, Na3VO45 mM, NaF 1 mM y un cóctel de inhibidores de proteasas de Sigma). Los lisados celulares se preincubaron con perlas de sefarosa de proteína A/G durante 30 minutos a 4°C y se inmunoprecipitaron con un anticuerpo de conejo anti-GFP (Abcam) durante toda la noche a 4°C. Al día siguiente, los lisados se incubaron con perlas de sefarosa de proteína A/G durante 1 hora a 4°C. Los complejos inmunes se lavaron cinco veces con tampón de lisis, se corrieron en un gel NuPAGE™ (Invitrogen), y el TLR4 dimerizado se detectó por inmunotransferencia con anticuerpos antiflag (Sigma) y anti-GFP.

Aislamiento de balsas lipídicas: Las balsas lipídicas se aislaron utilizando un método de ultracentrifugación de gradiente discontinuo sin detergente, como en nuestro trabajo anterior (6). En resumen, las células BV-2 se pretrataron con BSA o AIBP durante 2 horas y luego se estimularon con 10 ng/ml de LPS durante 10 minutos. Las células se lavaron dos veces con PBS frío y se cosecharon en 1 ml de tampón de bicarbonato de sodio 0,5 M (pH 11,0) que contenía un cóctel de inhibidores de la proteasa, se homogeneizaron y se sonicaron. Se mezcló un ml de la suspensión celular disgregada con 1 ml de sacarosa al 90% en MBS (ácido 2-(N-morfolino) etanosulfónico 25 mM, pH 6,5, NaCl 150 mM) para ajustarlo al 45% de sacarosa y se colocó en tubos de ultracentrifugación. Por encima de la muestra se formaron 4 ml de gradiente discontinuo de sacarosa del 5 al 35% en MBS con bicarbonato sódico 250 mM. Tras la ultracentrifugación a 35.000 rpm en un rotor SW-41 (Beckman) durante 20 horas a 4°C, se recogieron diez fracciones de 1 ml de arriba abajo. Las fracciones de balsa lipídica 4 y 5 se combinaron, se complementaron con 3 * volumen de tampón MBS y se sometieron a una ronda adicional de ultracentrifugación a 35.000 rpm durante 2 horas a 4°C. El pellet se resuspendió en tampón de muestras LDS (Invitrogen), y las muestras se pasaron por un gel NuPAGE™, se transfirieron a una membrana de PVDF y se sometieron a inmunotransferencia con los anticuerpos indicados.

Citometría de flujo ex vivo para balsas lipídicas: Los ratones C57B1/6 fueron inyectados intratecalmente (i.t.) con solución salina o AIBP. Dos horas más tarde, los ratones fueron inyectados intratecalmente con LPS. Quince minutos después de la inyección de LPS, se cosecharon las médulas espinales y se obtuvieron suspensiones de células individuales de las médulas espinales utilizando un kit Neural Tissue Dissociation™ (Miltenyi Biotec) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para eliminar la mielina, se añadieron Myelin Removal Beads II™ (Miltenyi Biotec) a las muestras y se incubaron durante 15 minutos a 4°C, seguidos de lavados y separación con una columna LS y un separador MACS™ (Miltenyi Biotec). Tras el aislamiento, las células se lavaron dos veces con un tampón FACS (BD Bioscience), y se incubaron con un anticuerpo anti-CD 16/CD3 2 (bloqueador de FcRy, BD Bioscience) durante 10 minutos a temperatura ambiente, seguido de la tinción con un anticuerpo CD11b conjugado con APC (BD Bioscience) y toxina del cólera B conjugada con FITC (Sigma) durante 1 hora en hielo. Las células se lavaron dos veces con un tampón FACS, se fijaron con formaldehído al 3,7% durante 15 minutos en hielo, se lavaron tres veces con un tampón FACS y se analizaron con un citómetro de flujo FACSCanto II™ (BD Biosciences).

Inmunotransferencia. Anticuerpos específicos para FLOT1, fosfo-p65, p65, fosfo-ERK1/2, ERK1/2 y GAPDH (Cell Signaling Technology) y un anticuerpo TLR4 (GenWay Biotech). Los anticuerpos específicos para FLAG y GFP se adquirieron en Sigma-Aldrich y Abcam, respectivamente. Los lisados celulares se sometieron a electroforesis en gel y a inmunotransferencia como se describe (7).

PCR cuantitativa. El ARN total se aisló utilizando columnas de ARN Nucleospin™ (Clontech). El ARN aislado se transcribió de forma inversa utilizando RNA to cDNA EcoDry (Clontech) siguiendo el protocolo del fabricante. La PCR cuantitativa se realizó utilizando el kit KAPA SYBR FAST™ Universal qPCR (KApA Biosystems, KK4602), con los cebadores pedidos a Integrated DNA Technologies (IDT), y un termociclador Rotor Gene Q™ (Qiagen).

AIBP recombinante: La AIBP se produjo en un sistema de baculovirus/células de insectos para permitir la modificación postraduccional y garantizar una preparación sin endotoxinas. La AIBP humana se clonó en un vector pAcHLT-C detrás del promotor de la poliedrina. El vector contiene una etiqueta His N-terminal para permitir la purificación y la detección. Se transfectaron células Sf9 de insectos con ADN de baculovirus BD BaculoGold™ y el vector AIBP. Tras 4-5 días, se recogió el sobrenadante para obtener un stock de baculovirus. Se infectaron células Sf9 frescas con el baculovirus productor de AIBP, se recogieron los gránulos celulares al cabo de 3 días, se lisaron, se sonicaron, se limpiaron por centrifugación y se cargaron los sobrenadantes en una columna de agarosa Ni-NTA eluida con imidazol. La proteína se dializó con solución salina y se midió su concentración. Las alícuotas se almacenaron a -80°C.

LPS y ciclodextrina: Los experimentos in vitro se realizaron con Kdo2-LipidA (KLA; Avanti Polar Lipids), un componente activo bien caracterizado del LPS y un agonista altamente específico de TLR4 (8). Nuestros estudios anteriores han demostrado que las inyecciones i.t. de KLA o de LPS ultrapuro de Escherichia coli 0111:B4 (Invivogen) producían respuestas de alodinia idénticas en ratones (9). En este estudio utilizamos para las inyecciones i.t. LPS de Invivogen a 0,1 |jg/5 |jl en solución salina al 0,9%. La beta-ciclodextrina de grado farmacéutico CAVAMAX W7 PHARMA™ era de Wacker Chemie AG.

Tratamiento con cisplatino: Los ratones recibieron inyecciones intraperitoneales (i.p.) de cisplatino (2,3 mg/kg/inyección; Spectrum Chemical MFG) cada dos días durante 6 inyecciones totales para inducir la alodinia táctil. Entre los días de inyección de cisplatino, se inyectó solución de Ringer lactato (0,25 ml) para mantener la hidratación y proteger el riñón y el hígado. Durante el periodo de administración de cisplatino, se realizaron observaciones del comportamiento bruto y se evaluó la salud general de los animales, incluyendo los cambios en el peso corporal. En caso de deshidratación, se administró solución de Ringer lactato adicional. En el estudio, el criterio para la eutanasia fue la pérdida de peso superior al 20%, sin embargo, ningún animal requirió la eutanasia.

Inyección intratecal (i.t.) en ratones: Los ratones fueron anestesiados utilizando isoflurano al 4% para la inducción y al 2,5% para el mantenimiento de la anestesia con una mezcla de 50% de oxígeno y 50% de aire ambiente. Se afeitó la parte inferior de la espalda y se colocó al animal en posición prona para poder sujetar la pelvis entre el pulgar y el índice. Las vértebras L5 y l6 se identificaron por palpación y se introdujo una aguja de 30G por vía percutánea en la línea media entre las vértebras L5 y L6. La entrada exitosa se evaluó mediante la observación de un movimiento rápido de la cola. Se administraron inyecciones de 5 j l en un intervalo de aproximadamente 30 segundos. Tras la recuperación de la anestesia, se evaluó la coordinación motora y el tono muscular de los ratones.

[0095] Alodinia mecánica: Para las pruebas, los animales se colocaron en jaulas de plástico transparente con fondo de malla metálica durante 45 minutos antes del inicio de las pruebas. Los umbrales táctiles se midieron con una serie de filamentos de von Frey (anestesiómetro Semmes Weinstein von Frey; Stoelting Co.) que oscilaban entre 2,44 y 4,31 (0,04-2,00 g). Se registró el umbral del 50% de probabilidad de retirada. A la luz de los informes sobre la posible contribución del sexo del experimentador (10), observamos que una hembra realizó las pruebas de comportamiento de los ratones. En los presentes experimentos, se evaluaron los umbrales de retirada mecánica antes del tratamiento y en los momentos posteriores al mismo, utilizando el método up-down (11).

Flagelación de la formalina: Se colocó una banda metálica alrededor de la pata trasera izquierda del ratón. Después de 1 hora de aclimatación con la banda metálica, el ratón recibió una única inyección de formalina intraplantar (2,5%) para inducir el estremecimiento. El movimiento de la banda metálica (aleteo del ratón) fue detectado por un dispositivo automatizado (12) durante un período de 1 hora después de la administración del formol.

Análisis estadísticos: Los resultados se analizaron mediante la prueba t de Student (para las diferencias entre 2 grupos) o ANOVA de dos vías con la prueba post hoc de Bonferroni (para los experimentos de curso temporal), utilizando GraphPad Prism™. Las diferencias entre grupos con p<0,05 se consideraron estadísticamente significativas. No se utilizaron métodos estadísticos para predeterminar el tamaño de la muestra, no se diseñó una aleatorización en los experimentos y los estudios no estaban cegados. El tamaño de las muestras se estimó sobre la base de estudios experimentales anteriores. En estos estudios no se utilizaron criterios de exclusión.

Resultados y discusión

Utilizando el sistema de dos híbridos de levadura, demostramos la unión constitutiva de AIBP al ectodominio de TLR4, pero no a los ectodominios de TLR1, TLR7 o TLR9 (Figura 11A y Figura 10). La unión AIBP-TLR4 se confirmó en un experimento de pull-down con AIBP y el ectodominio TLR4 expresado en células HEK 293 (Figura 11B). Además, la AIBP recombinante se unió a los macrófagos peritoneales de ratones de tipo salvaje (WT) pero no a los de Tlr4-/-(Figura 11C). Estos resultados nos llevaron a plantear la hipótesis de que la AIBP se dirige a las balsas lipídicas ocupadas por TLR4 y que, a su vez, la alteración de las balsas mediada por la AIBP interfiere en la dimerización de TLR4 inducida por el ligando. De hecho, el tratamiento con AIBP inhibió la dimerización de TLR4 inducida por LPS en las células Ba/F3 que expresaban TLR4-flag, TLR4-gfp y MD2 (Figura 11D).

LA FIG. 11A, FIG. 11B, FIG. 11C, FIG. 11D, ilustran que AIBP se une a TLR4 e inhibe la dimerización de TLR4: FIG.

11A muestra un estudio de doble híbrido de levadura realizado con pB42AD-AIBP y pLexA-TLR4 ectodominio; FIG.

11B ilustra gráficamente los datos en los que las células HEK293 fueron co-transfectadas con el ectodominio TLR4 marcado con una bandera y AIBP marcado con una bandera; AIBP de los lisados celulares se extrajo con un anticuerpo anti-AIBP o una IgG de control de isotipo, y las inmunotransferencias de los lisados celulares extraídos o totales se probaron con un anticuerpo anti-flag; FIG. 11C ilustra gráficamente los datos en los que los macrófagos peritoneales elicitados de ratones WT y Tlr4-/-se incubaron durante 2 horas en hielo con 2 pg/ml de BSA o 2 pg/ml de AIBP (con una etiqueta His) y luego se sometieron a un análisis de citometría de flujo con un anticuerpo anti-His conjugado con FITC; FIG. 11D ilustra gráficamente los datos en los que las células Ba/F3 que expresan de forma estable TLR4-gfp, TLR4-flag y MD2 se incubaron con medios sin suero que contenían 50 pg/ml de HDL, en presencia o ausencia de 02 pg/ml de AIBP, y luego se estimularon con 10 ng/ml de LPS durante 20 minutos; los lisados celulares se inmunoprecipitaron con un anticuerpo anti-GFP y las inmunotransferencias se probaron con anticuerpos anti-flag y anti-GFP; Media±SEM; n=4-6; **, p<0,01; prueba t de Student.

Estudios anteriores han demostrado que el TLR4 es un mediador omnipresente de los estados de dolor persistente. La deficiencia de TLR4 da lugar a una atenuación completa de la alodinia táctil durante el tratamiento con el quimioterapéutico cisplatino y durante el estado de dolor persistente tras la finalización del tratamiento con cisplatino (10, 11). Los experimentos con modelos de lesiones nerviosas y artritis también apoyan el papel de TLR4 en la mediación de la transición de un estado de dolor agudo a uno persistente (7-11, 18, 19). De manera reveladora, las inyecciones intratecales (i.t.) de LPS, un ligando específico de TLR4, pero no de LPS-RS, que no activa TLR4, producen una alodinia táctil inmediata (19). El mecanismo implica la liberación de citoquinas inflamatorias mediada por TLR4 desde la microglía y/o los astrocitos, lo que a su vez conduce a la sensibilización central y la alodinia (2, 19, 20).

Por lo tanto, probamos si el AIBP afecta al TLR4 en la microglía. La exposición al LPS provoca un mayor reclutamiento de TLR4 a las balsas lipídicas, donde los receptores dimerizan e inician la señalización inflamatoria (21). El tratamiento con AIBP redujo la ocupación de TLR4 inducida por LPS en las balsas lipídicas de las células BV-2 tipo microglía (Figura 12A). En estas células, el tratamiento con AIBP también dio lugar a la inhibición de la fosforilación de p65 y ERK1/2 (Figura 12B) y de la expresión de ARNm de citoquinas inflamatorias (Figura 12C) en respuesta al LPS. Estos resultados se reprodujeron en microglías primarias de ratón, en las que el AIBP inhibió completamente la expresión de la mayoría de las citoquinas inflamatorias inducida por el LPS (Figura 12D).

Las FIG. 12A, FIG. 12B, FIG. 12C y FIG. 12D ilustran que el AIBP reduce las respuestas inflamatorias en la microglía: FIG. 12A-C ilustran los datos de estudios en los que se incubaron células BV-2 durante 2 horas con vehículo (0,1% BSA) o 0,2 pg/ml de AIBP (en 0,1% BSA) en medio que contenía suero y se estimularon con 10 ng/ml de LPS. La ocupación de TLR4 en las balsas lipídicas se comprobó 15 minutos después de añadir el LPS (FIG. 12A), la fosforilación de p65 y ERK1/2 después de 30 minutos (FIG. 12B), y la expresión de ARNm de citoquinas tras 2 h de incubación (FIG. 12C); y la FIG. 12D ilustra gráficamente los datos de estudios en los que se incubaron microglías primarias de ratón (agrupadas de 5-6 ratones por muestra) durante 2 horas con vehículo (0,1% BSA) o 0,2 pg/ml de AIBP (en 0.1% de BSA) en un medio que contenía suero y se estimuló con 10 ng/ml de LPS durante 1 hora; media±SEM; n=4-6 para BV-2; n=3 para experimentos con microglía primaria; *, p<0,05; **, p<0,01; ****, p<0,0005 (prueba t de Student).

Para examinar si el AIBP reduce las balsas lipídicas en la microglía de la médula espinal in vivo, inyectamos i.t. a los ratones con solución salina o AIBP recombinante dos horas antes de la inyección i.t. de LPS. El AIBP redujo significativamente la abundancia de balsas lipídicas en la microglía espinal en comparación con la solución salina, como se midió ex vivo mediante la unión de la toxina del cólera B (Figura 13A). Las reducciones de las balsas de lípidos impuestas por el AIBP en la microglía espinal en los animales tratados con LPS fueron de una media del 14%. Nuestra hipótesis es que este cambio moderado en la organización de los microdominios de membrana es suficiente para inhibir fisiológicamente la neuroinflamación mediada por TLR4 y el dolor neuropático, pero no interferiría con la función neuronal normal.

Para probar esta hipótesis, se inyectaron ratones con solución salina o AIBP i.t.recombinante, seguidos de la inyección i.t. de LPS, y se probó la alodinia. Anteriormente hemos demostrado que la respuesta de alodinia a la LPS i.t. en ratones hembra es menos robusto que en los machos (22). En efecto, LPS i.t. indujo sólo una reducción parcial del nivel del umbral táctil en los ratones hembra, y el AIBP fue ineficaz en las primeras fases de la alodinia, aunque la fase de recuperación fue más rápida en el AIBP i.t. en comparación con la solución salina i.t. (Figura 14).

En contraste con las hembras, el LPS indujo una severa alodinia táctil en los ratones machos, lo que se esperaba de nuestros experimentos anteriores (19, 22). Sorprendentemente, la inyección i.t. inicial de AIBP previno significativamente la alodinia inducida por LPS, mientras que las inyecciones de AIBP desnaturalizada e inactivada por calor no tuvieron ningún efecto antagónico (Figuras 13A, 13B).

A continuación, comparamos el efecto terapéutico del AIBP con el de una beta-ciclodextrina (pCD). Los pCD son oligosacáridos cíclicos heptámero, comúnmente utilizados para solubilizar moléculas hidrofóbicas en formulaciones farmacéuticas, así como para eliminar el colesterol de la membrana en experimentos de cultivo celular y, por lo tanto, sirven como método para interrumpir las balsas lipídicas. Los pCDs inhiben las respuestas inflamatorias mediadas por TLR4 in vitro (23, 24). pCD i.t.previno la alodinia inducida por LPS hasta 4 horas, pero a diferencia del AIBP, el pCD no fue eficaz en los puntos temporales de 24 y 48 horas (Figura 13B). Debido a las diferencias en la respuesta a AlBP i.t. entre ratones machos y hembras, en los estudios posteriores nos centramos en los ratones machos.

No observamos ningún déficit motor en los animales inyectados con AIBP i.t.. Los animales se caracterizaron sistemáticamente en cuanto a la marcha simétrica, la sustentación de las extremidades traseras, los reflejos del pabellón auricular y del parpadeo y la colocación de las patas traseras y la pisada (P/S). P/S evalúa la integridad del tacto ligero (aferentes Ap del dorso de la pata) y el reflejo intacto mediado espinalmente que implica la colocación plantar y la extensión de los dedos, lo que refleja el control motor fino del tobillo y la pata. Todas estas medidas (excepto el pabellón auricular y el parpadeo) se deprimen o se pierden de forma dependiente de la dosis después de los anestésicos locales i.t. y la toxina botulínica (25, 26), pero no se vieron afectadas enanimales inyectados con AIBP i.t., lo que demuestra una función motora intacta.

Nuestros estudios demostraron un mecanismo y un papel novedosos para la AIBP en la prevención del dolor neuropático. Sin embargo, desde el punto de vista médico, la reversión del dolor crónico tendría un beneficio sanitario mucho mayor para las poblaciones afectadas. Para probar el potencial terapéutico del AIBP en la reversión del dolor neuropático, primero inyectamos i.t. a ratones machos con l Ps , seguido después de 24 horas por solución salina o AIBP i.t.. Después de LPS i.t., los ratones desarrollaron una alodinia severa. Sin embargo, la alodinia se atenuó notablemente con una única inyección de AIBP, pero no con solución salina (Figura 13C).

En un modelo diferente de dolor crónico, la inyección intraplantar de formalina produce un estremecimiento agudo, una extensión y flexión coordinada y de alta frecuencia de la pata trasera inyectada y, tras un retraso de 7 días, se desarrolla progresivamente una alodinia táctil persistente junto con una activación asociada de la microglía espinal (27). En este modelo, sometimos a ratones machos a inyecciones i.t. de solución salina o AIBP, seguidas de una inyección intraplantar de formol. El AIBP no tuvo ningún efecto sobre la fase 1 o 2 de las sacudidas de la pata trasera provocadas por la formalina (Figura 15). Un comportamiento agudo no afectado después de la PAI i.t. vuelve a atestiguar una función motora normal. Sin embargo, el AIBP redujo la alodinia que se observó en el 7° día después de la administración de formalina (Figura 13D). En otro experimento, los ratones recibieron primero formalina intraplantar y 7 días después AIBP o solución salina i.t.. El AIBP, pero no la solución salina, revirtió significativamente la alodinia (Figura 13E). Estos resultados demuestran que la AIBP controla el desarrollo del dolor crónico tras una lesión aguda.

En los roedores, al igual que en las personas, el quimioterapéutico cisplatino induce una alodinia táctil de larga duración. Una sola inyección i.t. de AIBP revirtió de forma significativa la alodinia establecida inducida por el cisplatino, y una segunda inyección produjo una eficacia más prolongada (Figura 13F).

Hasta donde sabemos, no hay ninguna terapia actual que revierta la neuropatía periférica inducida por la quimioterapia (NPIQ) establecida (28-30). El efecto terapéutico y la ausencia de efectos secundarios observados en los ratones tratados con AIBP validan y demuestran el novedoso enfoque para el tratamiento de la NPIQ en pacientes, tal como se proporciona en el presente documento.

La necesidad de administración neuraxial en humanos no constituye una barrera para el desarrollo de la terapia AIBP. La terapia intratecal tiene importantes precedentes, especialmente para grupos específicos de pacientes, entre ellos los que padecen NPIQ (31). Se ha argumentado que la vía intratecal es una vía de administración útil y eficaz para determinadas proteínas terapéuticas, péptidos y oligonucleótidos, en contraposición a las moléculas pequeñas (32 34). Además, en realizaciones alternativas, para la terapia de AIBP como se proporciona en el presente documento, el AIPB se suministra al SNC utilizando elementos que se dirigen y/o permiten la entrada en el SNC, por ejemplo, permiten que cantidades terapéuticas de AIBP pasen a través de la BBB y entren en el SNC.

Observando que esta invención no está limitada por ningún mecanismo de acción en particular, este trabajo se centró en la inhibición mediada por AIBP de la localización de TLR4 a las balsas lipídicas, la dimerización de TLR4, la señalización y la expresión de citoquinas inflamatorias. De forma similar a la administración i.t. de pCD, una sustancia química que interrumpe las balsas lipídicas, el AIBP i.t. impidió la alodinia mediada por TLR4 en los ratones (Figura 13B). Sin embargo, a diferencia de la pCD, la inhibición de la alodinia por parte de la AIBP se mantuvo, lo que podría deberse a que, a diferencia de la alteración indiscriminada de las balsas lipídicas por parte de la pCD, el aumento de los niveles de AIBP en la columna vertebral amplifica un mecanismo natural que controla la ocupación de TLR4 en las balsas lipídicas. La AIBP está presente en el líquido cefalorraquídeo (16).

Las FIG. 13A, FIG. 13B, FIG. 13C, FIG. 13D, FIG. 13E, FIG. 13F ilustran los datos que muestran que la AIBP intratecal previene y revierte la alodinia. A, Los ratones machos recibieron una inyección i.t. de AIBP (0,5 |jg/ 5 j l) o de solución salina (5 jl); dos horas después, todos los ratones recibieron una inyección i.t. de LPS (0,1 jg / 5 j l ) y fueron dados de baja 15 min después. Se aislaron las médulas espinales, se desmielinizaron, se tiñeron para CD11b y toxina de cólera B (CTB) y se sometieron a un análisis de citometría de flujo. Media±SEM; n=11; *, p<0,05 (prueba t de Student). FIG. 13A-13B, tras la prueba de umbral de von Frey de referencia, se administró a los ratones macho una inyección i.t. de AIBP (0,5 |jg/ 5 jl), hi-AIBP inactivada por calor (0,5 |jg/ 5 jl), beta-ciclodextrina (5 j l de solución al 10% en solución salina) o solución salina (5 jil). Dos horas más tarde, se administró a todos los ratones una inyección i.t. de LPS (0,1 jig/ 5 jil) y se comprobó la alodinia táctil a lo largo del tiempo; Media±SEM; n=4-6; *, p<0,01; ***, p<0,0001 (ANOVA de dos vías con postest de Bonferroni). FIG. 13C, Tras la prueba de umbral de von Frey de referencia, se administró a los ratones machos LPS i.t. (0,1 jg / 5 jl). Veinticuatro horas después, los ratones recibieron AIBP i.t. (0,5 jg / 5 j l) o solución salina (5 jl). Media±SEM; n=4 por grupo; *, p<0,05 (prueba t de Student sólo para el punto temporal de 48 horas). FIG. 13D, Tras la prueba de umbral de von Frey de referencia, se administró a los ratones macho una inyección intraplantar de formol en una pata trasera. El gráfico muestra los cambios normalizados por la línea de base en el umbral de retirada en la pata ipsilateral. Media±SEM; n=4-12 por grupo; *, p<0,05 (prueba t de Student sólo para el punto temporal de 7 días). FIG. 13E, En otro grupo de ratones machos, las lecturas de von Frey se #normalizaron al 7° día post-formalina y los ratones recibieron AIBp i.t. (0,5 jg / 5 j l ) o solución salina (5 jl). Media±SEM; n=4 por grupo; *, p<0,05 entre 0 y 24 horas (medidas repetidas ANOVA de una vía con post-test de Bonferroni). FIG. 13F, Ratones machos (n=18) recibieron 6 inyecciones i.p. de cisplatino (2,3 mg/kg) durante un periodo de 11 días (recuadro gris sombreado) para establecer la alodinia. El día 25, doce ratones fueron tratados con 1er AIBP i.t. (0,5 jg / 5 jl; círculos rojos) y seis ratones con solución salina i.t. (cuadrados blancos). El día 30, los ratones recibieron la segunda inyección i.t: 1) seis ratones que recibieron AIBP fueron inyectados con AIBP (círculos rojos); 2) seis ratones que recibieron AIBP fueron inyectados con solución salina (cuadrados grises oscuros); y 3) ratones que recibieron solución salina fueron inyectados con solución salina (cuadrados blancos). Media±SEM. *p<0,05; ***, p<0,001; ****, p<0,0001 (ANOVA de dos vías con postest de Bonferroni).

La FIG. 14 ilustra gráficamente los datos de estudios de inyecciones intratecales de AIBP y LPS en ratones hembra. Tras la prueba de umbral de von Frey de referencia, se administró a los ratones hembra una inyección i.t. de AIBP (0,5 jg / 5 j l) o solución salina (5 jl). Dos horas más tarde, se administró a todos los ratones una inyección i.t. de LPS (0,1 jg / 5 j l ) y se comprobó la alodinia táctil a lo largo del tiempo. Media±SEM; n=4; sin diferencias estadísticamente significativas (ANOVA de dos vías con post-test de Bonferroni).

FIG. 15 ilustra gráficamente los datos de los estudios que demuestran que la AIBP intratecal no afecta al estremecimiento agudo de la pata después de la formalina. Los animales recibieron una inyección intraplantar de formol en una pata trasera. El gráfico muestra el número total de aleteos de la pata trasera en la fase I (1-9 min) y en la fase II (10-50 min). Media±SD; n=4-12 por grupo; #, no significativo, p>0,05 (prueba t de Student).

Ejemplo 3: Eficacia demostrada en métodos ejemplares - AIBP trata y previene la neurodegeneración y las enfermedades o afecciones neurodegenerativas

Este ejemplo describe y demuestra realizaciones ejemplares y la eficacia de los métodos aquí proporcionados para, por ejemplo, tratar, prevenir, disminuir la gravedad o mejorar la neurodegeneración y/o la neuroinflamación, incluyendo, por ejemplo, una enfermedad neurodegenerativa como la enfermedad de Alzheimer, la encefalopatía traumática crónica (ETC) o el daño al SNC o a los nervios debido a un traumatismo, como la lesión cerebral traumática (LTC).

Nuestros estudios, utilizando tanto sistemas in vitro como modelos animales, han demostrado que el AIBP reduce las balsas lipídicas patológicas y la ocupación de receptores inflamatorios (TLR4) en las balsas lipídicas; véase, por ejemplo, la ref. [1] y las Figs. 1 y 11 a 14, y discusiones, arriba. Véase también la Figura 16, que ilustra esquemática y gráficamente que el AIBP reduce la ocupación de TLR4 en las balsas lipídicas de la microglía. Las células de microglía BV-2 se incubaron durante 2 horas con vehículo (0,1% de BSA) o con 0,2 jg/m l de AIBP (en 0,1% de BSA) en medio que contenía suero y se estimularon con 10 ng/ml de LPS. La ocupación de TLR4 en las balsas lipídicas se comprobó 15 minutos después de añadir el LPS. Media±SEM; n=6; *, p<0,05; **, p<0,01 (prueba t de Student).

La Figura 17 ilustra gráficamente los datos que muestran que el AIBP reduce las balsas lipídicas in vivo en la microglía de la médula espinal. Los ratones machos recibieron una inyección i.t. de AIBP (0,5 jg / 5 j l ) o solución salina (5 jl); dos horas después, todos los ratones recibieron una inyección i.t. de LPS (0,1 jg / 5 j l ) y fueron dados de baja 15 min después. Se aislaron las médulas espinales, se desmielinizaron, se tiñeron para CD11b y toxina de cólera B (CTB) y se sometieron a un análisis de citometría de flujo, FIG. 17A, los resultados se muestran gráficamente en la FIG. 17B. Media±SEM; n=11; *, p<0,05 (prueba t de Student).

La figura 18 ilustra de forma esquemática y gráfica que el AIBP reduce las respuestas inflamatorias en la microglía. FIG. 18B-C ilustran gráficamente los datos en los que las células de microglía BV-2 se incubaron durante 2 horas con vehículo (0,1% de BSA) o 0,2 jg/m l de AIBP (en 0,1% de BSA) en un medio que contenía suero y se estimularon con 10 ng/ml de LPS. Se comprobó la fosforilación de p65 y ERK1/2 después de 30 min (inmunotransferencia ilustrado en la FIG. 18A, y los resultados ilustrados gráficamente en la FIG. 18B), y la expresión de ARNm de citoquinas tras 2 h de incubación con LPS (FIG. 18C). FIG. 18D ilustra gráficamente los datos en los que se incubaron microglías primarias de ratón (agrupadas de 5-6 ratones por muestra) durante 2 horas con vehículo (0,1% de BSA) o 0,2 jg/m l de AIBP (en 0,1% de BSA) en medio que contenía suero y se estimularon con 10 ng/ml de LPS durante 1 hora.

Media±SEM; n=4-6 para BV-2; n=3 para experimentos con microglía primaria; *, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,005 (prueba t de Student).

La figura 19 ilustra gráficamente los datos que muestran que el AIBP reduce la neuroinflamación en el SNC. Los ratones macho recibieron una inyección i.t. de AIBP (0,5 |jg/ 5 j l ) o solución salina (5 jl); y dos horas después, los ratones recibieron una inyección i.t. de LPS (0,1 jg / 5 jl). Cuatro horas después, los ratones fueron sacrificados, se recogió líquido cefalorraquídeo (LCR) y se analizó en ELISA para determinar los niveles de citoquinas inflamatorias IL-1 (FIG. 19A), TNF-alfa (TNF-a) (FIG. 19B) y la IL-1beta (IL-ip) (FIG. 19C). Muestras de LCR agrupadas de 4 ratones de cada grupo.

Por lo tanto, estos datos demuestran que las composiciones y los métodos proporcionados en el presente documento pueden utilizarse para tratar, prevenir, disminuir la gravedad o mejorar numerosos procesos patológicos asociados con las balsas lipídicas patológicas y la ocupación de receptores inflamatorios (TLR4) en las balsas lipídicas, incluyendo la neuroinflamación, las enfermedades de Alzheimer (EA) y otras enfermedades o condiciones neurodegenerativas. Estos incluyen, pero no se limitan a la escisión de la Y-secretasa de la APP, la lipidación de la apoE y la neuroinflamación [2-4]. Nuestros estudios sobre el dolor neuropático han demostrado que la AIBP reduce eficazmente las respuestas inflamatorias en la microglía (véase, por ejemplo, la Figura 12 y la discusión anterior) y que la administración espinal de AIBP reduce la neuroinflamación en el SNC en el modelo de ratón (Fig. 19).

Por lo tanto, proponemos que el aumento de los niveles de AIBP en el SNC prevendrá, retrasará y/o revertirá el desarrollo de enfermedades o condiciones neurodegenerativas. La AIBP puede administrarse en el s Nc a través de un virus adeno-asociado (AAV; véase el documento adjunto) u otros métodos de administración en el SNC, por ejemplo, un vehículo dirigido al SNC capaz de penetrar la barrera hematoencefálica (BBB) como se ha comentado anteriormente, como por ejemplo, con portadores derivados de neurotoxinas Clostridiales para la administración retroaxonal de proteínas y genes de carga en el cerebro [5].

Ejemplo 4: Eficacia demostrada en métodos ejemplares - Entrega de AIBP al SNC con AAV para tratar la neurodegeneración y las enfermedades neurodegenerativas

Este ejemplo describe y demuestra la realización ejemplar de la administración de AIBP al SNC para, por ejemplo, tratar, prevenir, disminuir la gravedad o mejorar la neurodegeneración y/o la neuroinflamación, incluyendo, por ejemplo, una enfermedad o afección neurodegenerativa como la enfermedad de Alzheimer, la encefalopatía traumática crónica (ETC) o el daño al SNC o a los nervios debido a un traumatismo, como la lesión cerebral traumática (LCT).

El método de administración de AIBP utilizado en los estudios preclínicos (en ratones) fue: inyecciones intratecales de la proteína AIBP recombinante (29 kDa). En una realización alternativa, este AIBP se modifica, por ejemplo, introduciendo péptidos miméticos u otros derivados.

En realizaciones alternativas, el AIPB se administra al SNC mediante inyecciones intravenosas (IV) de una gran dosis de AIBP o sus derivados diseñados para atravesar la barrera hematoencefálica. Por ejemplo, en realizaciones alternativas, el polipéptido AIBP, o el ácido nucleico que codifica el AIBP, por ejemplo, el ácido nucleico contenido en un vector, se transporta en una nanopartícula, una partícula, una micela o un liposoma o lipoplex, un polimersoma, un polyplex o un dendrímero, que opcionalmente puede comprender o expresar además una fracción o péptido penetrante en la célula, y/o una fracción o péptido dirigido al SNC.

En una realización alternativa, la AIBP se suministra al SNC utilizando un virus adeno-asociado (AAV); opcionalmente, como una dosis única (opcionalmente una dosis única de aproximadamente 1010-1014gc/kg) de AAV, o dosis múltiples de AAV, según sea necesario, que asegurarán la secreción sostenida de AIBP en el cerebro. En realizaciones alternativas, se administran niveles suficientes de dosis individuales, o administraciones múltiples, a un paciente que las necesita para lograr niveles sostenidos de AIBP en el SNC, lo que puede ser ventajoso en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa u otra condición crónica del SNC.

Para los estudios preclínicos, primero hicimos AIBP-AAV de ratón. En concreto, utilizamos el AAV-DJ/8 disponible en el mercado, del que se ha informado que infecta preferentemente las células del SNC [1-3]. Se puede utilizar una estrategia similar para producir AIBP-AAv humanos para aplicaciones clínicas, utilizando otras construcciones AAV disponibles o propias.

Producción y pruebas de virus

La AIBP de ratón (24-863 aa) se fusionó con la secuencia de secreción de fibronectina (FIB) en el N-terminal y 6X-His en el C-terminal (FIB-mAIBP-His). FIB-mAIBP-His o FIB-GFP-His se clonó en el vector pAAV-MCS, como se ilustra en la FIG. 20. Todos los clones fueron secuenciados para confirmar la presencia del inserto.

Las células AAV-293™ (Agilent Technologies) se transfectaron con 20 jg de cada pAAV-FIB-mAIBP-His, pAAV-DJ/8 (Cell Biolabs) y ADN pHelper™ (Cell Biolabs) siguiendo el protocolo rutinario basado en fosfato de calcio (Agilent Technologies). Los pasos subsiguientes de recolección, purificación y almacenamiento del virus se realizaron de acuerdo con el protocolo del fabricante (Agilent Technologies).

Se extrajo el ADN viral del virus purificado y se determinó el número de copias del gen (gc) mediante qPCR con cebadores para las repeticiones terminales invertidas (ITR).

Para probar el FIB-mAIBP-His-AAV-DJ/8, infectamos células HEK 293. Tres días después se cosecharon las células y se confirmó la expresión de mAIBP-His en la inmunotransferencia de western con un anticuerpo anti-His, como se ilustra en la FIG. 21: Expresión de mAIBP en células HEK293 infectadas con FIB-mAIBP-His-AAV-DJ/8. La inmunotransferencia fue sondeada con un anticuerpo anti-His. Las dos bandas representan el mAIBP con la secuencia de secreción de la fibronectina todavía unida (banda superior) y el mAIBP procesado para su secreción del que se ha escindido la señal de secreción de la fibronectina (banda inferior). Las células se infectaron con 3,3*1011 gc (muestra 1), 6,6*1011 gc (muestra 1), 9,9*1011 gc (muestra 1), 2,2*1011 gc (muestra 1), 4,4*1011 gc (muestra 1) y 6,6*1011 gc (muestra 1), y se analizaron 3 días después. Las células no infectadas se utilizaron como control negativo.

SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:3 son las secuencias de nucleótidos y proteínas, respectivamente, de AIBP murina complementada con la señal de secreción de fibronectina (en cursiva) en el N-terminal, y con la etiqueta His (subrayada) en el C-terminal; el producto se abrevia como FIB-mAIBP-His

SEQ ID NO:2:

A TG CTC AGG GGTCCG GGA CCC GGG CGG CTG CTG CTG CTA GCA GTC CTG

TGC CTG GGG ACA TCG GTG CGC TGCACC GAA ACC GGG AAG AGC AAG AGG

CAG CAGAGTGTG TG TCGTG CAAGG CCCATCTGGTGGG GAACACAGCGCCGGG

G CTCG GAG ACCATGGCGG GCGCTG CG GTGAAGTACTTAAG TCAGGAG GAG GC

TC AG G C C G TG G AC CAAG AG C TTTTTAAC G AG TATCAG TTCAG C G TG G ATCAA

CTCATGGAG CTG GCCG GGTTGAG CTGTGCCACGG CTATTG CCAAGGCTTATCC

CCCCACGTCTATGTCCAAGAGTCCCCCGACTG TCTTGGTCATCTGTGGCCCCG

G AAATAACG G AG G G G ATG G G CTG G TCTG TG CG CG ACACCTCAAACTTTTTG G

TTAC C AG C C AAC TATC TATTAC C C C AAAAG AC C TAAC AAG C C C C TC TTC AC TG

G G C TAG TG AC TC AG TG TC AG AAAATG G ACATTCC TTTCC TTG G TG AAATG CC C

CCAG AG CCCATG ATGGTGG ACGAG CTGTATG AGCTGGTGG TGGACGCCATCT

TCG G CTTCAG TTTCAAG G G TG ACG TTCG G G AG CCATTCCACAG CATCCTG AG T

G TCTTG AG TG G ACTCACTG TG CCCATTG CTAG CATCG ACATTCCCTCAG G ATG

G G A TG TAG AG AAG G G AAAC C C TAG C G G AATC C AAC C AG AC TTAC TC ATC TC A

CTG ACG G C ACC C AAG AAG TC TG CAAC TC AC TTTACTG G CC G ATATC ATTAC C T

TG G G G G TCG CTTTG TACCACCTG CTCTAG AG AAG AAG TACCAG CTG AACCTG

CC ATC TT AC CC TGAC AC AG AG TG TG TCTACCG TCT AC A G C ATC ATC ATC ATC A

TC ATTA A SEQ ID NO: 3:

MLRGPGPGRLLLLAVLCLGTSVRCTETGKSKRQQSVCRAKPWWGTQKRGS

ETM AG A AV KYLSQ EEA Q A V D Q E LFN E Y Q FS V D Q LM E LA G LS C A TA IA K A Y P P TS

M SKSPPTVLVIC G PG NN G G DG LVCARH LKLFG YQ PTIYYPKR PNKPLFTG LVTQ C

Q KM DLPFLG EM PPEPM M VDELYELVVDAIFG FSFKG DVREPFHSILSVLSG LTVPI

A SIDIP SGWD VEKG NP S G IQ PD LLISLT AP KK S ATHFTGR YH YLG G RF VPP A LE K K

YQ LN LPSYPD TEC VYRLQ H H HH H H

En una realización alternativa, el polipéptido AIBP humano, o un ácido nucleico que codifica un AIBP se administra a un individuo que lo necesita, o se utiliza para fabricar una formulación o un producto farmacéutico, o se utiliza para hacer un vector o un vehículo de expresión para su administración:

Ácido nucleico humano que codifica AIBP (ADNc) (SEQ ID NO:4)

GGGCCGGGCCGGGCCGGGGGCGCGCGCTCTGCGAGCTGGATGTCCAGGCTGC

GGGCGCTGCTGGGCCTCGGGCTGCTGGTTGCGGGCTCGCGCGTGCCGCGGAT

CAAAAG CCAG ACCATCGCCTGTCGCTCGGGACCCACCTGGTGG GGACCGCAG

CGGCTGAACTCGGGTGGCCGCTGGGACTCAGAGGTCATGGCGAGCACGGTGG

TG AAG TACCTG AG CCAG G AG G AG G CCCAG G CCG TG G ACCAG G AG CTATTTAA

C G AATACCAG TTCAG CG TG G ACCAACTTATG G AACTG G CCG G G CTG AG CTG T

GCTACAG CCATCGCCAAGGCATATCCCCCCACGTCCATGTCCAGGAGCCCCCC

TACTGTCCTG G TCATCTG TG G CCCG G G G AATAATG G AG G AG ATG G TCTG G TCT

G TG C TC G AC AC C TC AAAC TC TTTG G C TAC G AG C CAAC C ATC TATTAC CC C AAA

AG G C CTAAC AAG C CC C TCTTC AC TG C ATTG G TG AC CC AG TG TC AG AAAATG G

AC ATCCCTTTCCTTG G G G AAATG CCCG CAG AG CCCATG ACG ATTG ATG AACTG

TATGAGCTG G TG G TG G ATG CCATCTTTG G CTTCAG CTTCAAG G G CG ATG TTCG

G G AACCG TTCCACAG CATCCTG AG TG TCCTG AAG G G ACTCACTG TG CCCATTG

CCAG CATCG ACATTCCCTCAG G ATG G G ACG TG G AG AAG G G AAATG CTG G AG G

G ATCCAG CCAG AC TTG C TC ATATCC C TC AC AG C C C CC AAAAAATC TG C AAC CC

AGTTTACCGG TCGCTACCATTACCTGGGG GGTCGTTTTG TG CCACCTGCTCTG

G AG AAG AAG TACCAG CTG AACCTG CCACCCTACCCTG ACACCG AG TG TG TCT

ATC G TC TG C AG TG AG G G AAG G TG G G TG G G TATTCTTC C CAATAAAG AC TTAG

AG CCCCTCTCTTCCAG AACTG TG G ATTCCTG G G AG CTCCTCTG G CAATAAAAG

TCAG TG AATG G TG G AAG TCAG AG ACCAACCCTG G G G ATTG G G TG CCATCTCT

C TAG G G G TAACACAAAG G G C AA G AG G TTG C TA TG G TATTTG G A AA C A ATG A A

AA TG G AC TG TT A G AT GCC A A

Polipéptido humano AIBP (SEQ ID NO:5)

M SRLRALLG LG LLVAG SRVPRIKSQ TIACRSG PTW W G PQ RLNSG G RW DSEVM AS

TVVKYLSQ EEAQ AVDQ ELFNEYQ FSVDQ LM ELAG LSCATA1AKAYPPTSM SRSPP

TVLV IC G P G N N G G D G LVC AR H LK LFG Y EPTIY YP KR PN KP LFTALVTQ C Q K M D IP

FLGEMP AEPM TID EL YE L V VDA1F GF SF KGDVREPF H SIL S V L K G LT VPIASID IP SG

W DVEKG NAG G TQ PDLLTSLTAPKKSATQ FTG RYHYLG G RFVPPALEKKYQ LNLPP

YPDTECVYRLQ

En una realización, se añade una señal de secreción para asegurar una secreción robusta de AIBP, por ejemplo, se añade una señal de secreción de fibronectina al extremo N de AIBP (véase las secuencias en cursiva en SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:3); o se añade un ácido nucleico que codifica una señal de secreción a la secuencia de codificación de AIBP. En realizaciones alternativas, una señal de secreción es una señal de secreción de fibronectina, una señal de secreción de cadena pesada de inmunoglobulina o un péptido secretor de cadena ligera de inmunoglobulina kappa (véase, por ejemplo, PLoS One. 2015; 10(2): e0116878), o un péptido señal de interleucina-2 (véase, por ejemplo, J. Gene Med. 2005 Mar;7(3):354-65).

En realizaciones alternativas, las secuencias codificadoras del polipéptido están vinculadas operativamente a un promotor, por ejemplo, un promotor constitutivo, inducible, específico del tejido (por ejemplo, específico del tejido nervioso o cerebral) o ubicuo u otro agente activador de la transcripción.

Ejemplo 5: Eficacia demostrada en métodos ejemplares - La administración intravenosa (IV) de AIBP mejora las migrañas

Este ejemplo describe y demuestra, utilizando un modelo animal (murino) aceptado por el arte para las migrañas, la realización ejemplar de la entrega de AIBP para el tratamiento o la mejora de las migrañas.

El compuesto 48/80, un producto de condensación de la N-metil-p-metoxifentilamina con formaldehído, promueve la degranulación de los mastocitos, la liberación de histamina e induce una aversión a la luz similar a la migraña en ratones (Dolor. 2007 Jul; 130(1-2): 166-76). Esto se prueba en una unidad de alojamiento con cámaras de luz y oscuridad conectadas, y se registra el tiempo de permanencia en cada cámara. Los ratones no tratados pasan aproximadamente el 50% del tiempo en cada cámara, pero los ratones tratados con el compuesto 48/80 prefieren la cámara oscura durante al menos 2 horas, y luego se recuperan lentamente.

Los ratones machos y hembras fueron inyectados i.v. con AIBP (0,5 jg/100 j l) o solución salina (100 j l) 2 horas antes de la inyección i.p. del compuesto 48/80 (2 mg/kg). Los ratones inyectados con AIBP no desarrollaron aversión a la luz (Figs. 22 y 23), demostrando así la eficacia de la administración de AIBP para el tratamiento o la mejora de las migrañas.

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Referencias - Ejemplo 2 - Materiales y métodos

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Referencias - Ejemplo 2 - Resultados y discusión

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22. Woller SA, et al. El TAK-242 sistémico previene la hiperalgesia evocada por el LPS intratecal en los ratones machos, pero no en las hembras, y previene la alodinia retardada después de la formalina intraplantar tanto en los ratones machos como en las hembras: El papel de TLR4 en la evolución de un estado de dolor persistente. Brain Behav Immun. 2016;56:271-80.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Una formulación, una composición farmacéutica o una combinación terapéutica que comprende uno, todos o varios de un compuesto polipeptídico o una composición polipeptídica de proteínas de unión a ApoA-I (APOA1BP, AIBP o AI-BP), o un compuesto que aumenta la expresión o la actividad de, o codifica, un polipéptido o ácido nucleico de APOA1BP, o un polipéptido o péptido que tiene una actividad de APOA1BP, para su uso en el tratamiento, mejora, prevención, reversión o disminución de la gravedad o la duración de: dolor neuropático,

- dolor neuropático inducido por inflamación,

- inflamación del nervio o del SNC,

- alodinia,

- un dolor posterior a una lesión nerviosa o tisular o un dolor neuropático,

- dolor postquirúrgico o dolor neuropático,

- neuropatía periférica inducida por quimioterapia (NPIQ), en particular una NPIQ o alodinia inducida por cisplatino,

- una enfermedad o afección neurodegenerativa, en particular una enfermedad o afección neurodegenerativa crónica o progresiva, opcionalmente la enfermedad de Alzheimer o una encefalopatía traumática crónica (ETC) o una tauopatía relacionada, una lesión cerebral traumática (LCT), un trastorno de estrés postraumático, una neurosis de guerra traumática o un síndrome de estrés postraumático (SSPT), - una cefalea primaria, opcionalmente una migraña o una cefalea en racimos, y/o

- hiperalgesia,

en la que el compuesto que aumenta la expresión o la actividad de un polipéptido APOA1BP, o lo codifica, es un ácido nucleico que expresa o codifica un polipéptido de APOA1BP o un polipéptido que tiene una actividad de polipéptido APOA1BP.

2. La formulación, composición farmacéutica o combinación terapéutica para su uso según la reivindicación 1, en el que dicho dolor neuropático inducido por la inflamación comprende un dolor neuropático inducido por la inflamación mediada por el receptor tipo Toll 4 (TLR4), o dicha inflamación del nervio o del SNC comprende una inflamación del nervio o del SNC mediada por TLR4, o dicha alodinia comprende una alodinia mediada por TLR4.

3. La formulación, composición farmacéutica o combinación terapéutica para su uso según la reivindicación 1, en el que dicho dolor posterior a una lesión nerviosa o tisular o dolor neuropático es generado o causado por, o es una secuela de, un traumatismo, quimioterapia, artritis, diabetes o infección viral.

4. La formulación o composición farmacéutica o combinación terapéutica para su uso según la reivindicación 1, en la que el ácido nucleico que expresa o codifica un polipéptido de APOA1BP o un polipéptido que tiene una actividad de polipéptido APOA1BP está contenido en un vehículo de expresión, vector, virus recombinante o equivalente.

5. La formulación o composición farmacéutica o combinación terapéutica para su uso según la reivindicación 4, en la que el vector o virus es o comprende un vector de adenovirus o un vector de virus adeno-asociado (AAV), un retrovirus, un vector lentiviral, un virus del herpes simple, un virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) o un vector sintético.

6. La formulación o composición farmacéutica o combinación terapéutica para su uso según la reivindicación 5, en la que el vector AAV comprende o es:

- un virus adeno-asociado (AAV), o un vector de adenovirus,

- un serotipo AAV o una variante AAV5, AAV6, AAV8 o AAV9, AAV-DJ,

- un AAV derivado de rhesus, o el AAVrh derivado de rhesus. 10hCLN2,

- un mutante de la cápside del AAV o un serotipo híbrido del AAV,

- un AAV organotrópico, o un AAV cardiotrópico, o un AAVM41 mutante cardiotrópico.

7. La formulación o composición farmacéutica o combinación terapéutica para su uso según la reivindicación 6, en la que el AAV está diseñado para aumentar la eficiencia en el direccionamiento a un tipo de célula específico que no es permisivo a un AAV de tipo salvaje (wt) y/o para mejorar la eficacia en la infección de sólo un tipo de célula de interés.

8. La formulación o composición farmacéutica o combinación terapéutica para su uso según la reivindicación 6, en la que el AAV híbrido está reorientado o diseñado como un serotipo híbrido mediante una o más modificaciones que comprenden: 1) una transcapsidación, 2) la adsorción de un anticuerpo biespecífico a una superficie de la cápside, 3) el diseño de una cápside en mosaico, y/o 4) el diseño de una cápside quimérica.

9. La formulación o composición farmacéutica o combinación terapéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que el polipéptido o proteína de la proteína de unión a ApoA-I (APOA1BP, AIBP, o AI-BP) es APOA1BP humana o de mamífero, o una AIBP1 o una AIBP2, o una APOA1BP recombinante, peptidomimética o sintética, o un bioisóstero de una Proteína de Unión a ApoA-I (APOA1BP, AIBP, o AI-BP).

10. La formulación o composición farmacéutica o combinación terapéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, formulada para administración enteral o parenteral, o para administración oral, intravenosa (IV) o intratecal (IT), y en la que opcionalmente la APOA1BP recombinante, peptidomimética o sintética, o bioisóstero de APOA1BP o el ácido nucleico que codifica la APOA1BP, o el vector que contiene en él un ácido nucleico que codifica la APOA1BP, se transporta en una nanopartícula, una partícula, una micela o un liposoma o lipoplex, un polimersoma, un polyplex o un dendrímero, que opcionalmente puede comprender o expresar además una fracción o péptido penetrante en las células o en el SNC o una fracción o péptido dirigido al SNC.

11. La formulación o composición farmacéutica o combinación terapéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que está formulada para como una nanopartícula, un liposoma, un comprimido, una píldora, una cápsula, un gel, una gelatina, un líquido, un polvo, una emulsión, una loción, un aerosol, un spray, una pastilla, una solución acuosa o estéril o inyectable, o un implante, en particular un implante intratecal.

12. Un kit que comprende la combinación terapéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11.