ES2883218T3 - Método para la proliferación de células progenitoras neurales y composición para tratar trastornos nerviosos que contiene células progenitoras neurales proliferadas - Google Patents

Método para la proliferación de células progenitoras neurales y composición para tratar trastornos nerviosos que contiene células progenitoras neurales proliferadas Download PDF

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Abstract

Método para la proliferación de una célula madre neural, comprendiendo el método: cultivar la célula madre neural en un medio que comprende tocoferol, acetato de tocoferol o una mezcla de los mismos a una concentración en un intervalo de 0,1 mg/ml a 10 mg/ml, en el que el cultivo de la célula madre neural se realiza en una condición de hipoxia.

Description

DESCRIPCIÓN
Método para la proliferación de células progenitoras neurales y composición para tratar trastornos nerviosos que contiene células progenitoras neurales proliferadas
Campo técnico
La presente invención se refiere a un método de proliferación de células progenitoras neurales.
Antecedentes de la técnica
Las enfermedades neurológicas son una amplia gama de enfermedades en las que células nerviosas o bien en el sistema nervioso central o bien en el sistema nervioso periférico mueren o funcionan mal. En particular, se sabe que las enfermedades neurológicas degenerativas están provocadas por, con la edad, apoptosis de neuronas, problemas en la formación de sinapsis entre neuronas o disfunciones de sinapsis.
Las células madre neurales son células capaces de proliferar continuamente en un estado indiferenciado y, al mismo tiempo, de diferenciarse en diversos tipos de neuronas. Tales células madre neurales existen en diversas regiones anatómicas y forman el sistema nervioso en el período fetal y se sabe que las células madre neurales no se regeneran una vez dañadas. También existen células madre neurales en el sistema nervioso central de mamíferos adultos, y proliferan y se diferencian a lo largo de toda la vida para producir nuevas neuronas. Las células madre neurales pueden cultivarse in vitro a largo plazo, y pueden integrarse en el sistema nervioso de un huésped mediante injerto, migración y diferenciación durante el trasplante in vivo. Por consiguiente, existe un creciente interés en la posibilidad de terapia regenerativa de nervios usando células madre neurales en enfermedades neurológicas.
Teniendo en cuenta la aplicación clínica de células madre neurales, existe la necesidad de establecer una técnica para inducir la diferenciación de las células madre neurales en neuronas apropiadas mientras que las células madre neurales se cultivan de manera segura y proliferan en una cantidad suficiente identificando los mecanismos de proliferación, crecimiento y diferenciación de las células madre neurales. Dado que las células madre neurales tienen la capacidad de diferenciarse en un tipo de célula deseado, las células madre neurales pueden ser útiles para la terapia celular mejorando la capacidad de proliferación de las células madre neurales.
Descripción detallada de la invención
Problema técnico
Un aspecto de la presente divulgación proporciona un método para la proliferación de células madre neurales, incluyendo el método cultivar una célula madre neural en un medio que contiene tocoferol, acetato de tocoferol, o una mezcla de los mismos a una concentración en un intervalo de 0,1 |ig/ml a 10 |ig/ml, en el que el cultivo de la célula madre neural se realiza en una condición de hipoxia.
También se describe en el presente documento una composición para tratar una enfermedad neurológica. La composición incluye las células progenitoras neurales que se producen según el método anterior.
En el presente documento también se describe una composición de cultivo que contiene tocoferol, acetato de tocoferol, o una mezcla de los mismos para la proliferación de células progenitoras neurales en un estado indiferenciado.
Solución técnica
Un aspecto de la presente divulgación proporciona un método para la proliferación de células madre neurales, incluyendo el método cultivar células madre neurales en un medio que contiene tocoferol, acetato de tocoferol, o una mezcla de los mismos a una concentración en un intervalo de 0,1 |ig/ml a 10 |ig/ml, en el que el cultivo de la célula madre neural se realiza en una condición de hipoxia.
La célula madre se cultiva en una condición de hipoxia. La condición de hipoxia puede incluir, por ejemplo, oxígeno atmosférico a una concentración en un intervalo de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 10 %, de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 10 %, de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 8 %, de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 5 %, de aproximadamente el 2 % a aproximadamente el 5 % o de aproximadamente el 2 % a aproximadamente el 3 %.
La célula madre proliferada según el método anterior puede usarse para tratar o prevenir diversas enfermedades. Las enfermedades pueden incluir, por ejemplo, enfermedad cardiovascular o de los vasos sanguíneos, arteriosclerosis, diabetes, anemia aplásica, isquemia, mielodisplasia, infarto de miocardio, desvanecimiento, esclerosis múltiple, convulsiones, accidente cerebrovascular, hipotensión, paro cardíaco, isquemia, inflamación, pérdida cognitiva relacionada con la edad, peligro de radiación, apoplejía cerebral, enfermedad neurodegenerativa, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, demencia por enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, enfermedad de Leigh, demencia por SIDA, pérdida de memoria, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), atrofia sistémica múltiple, cardiopatía isquémica, lesión cerebral o de la médula espinal, enfermedad neurológica provocada por lesión de la médula espinal, derivación cardiopulmonar, glaucoma, isquemia retiniana, enfermedad de almacenamiento lisosómico, tal como enfermedad de Niemarm-Pick, enfermedad de Fabry, enfermedad de Gaucher, enfermedad de Hunter, síndrome de Hurler, mucopolisacaridosis, glucogénesis tal como enfermedad de almacenamiento de glucógeno, trastorno metabólico congénito, adrenoleucodistrofia, fibrosis quística, hipotiroidismo, anemia de células falciformes, síndrome de Pearson, enfermedad de Pompe, fenilcetonuria (PKU), porfirias, enfermedad de la orina de jarabe de arce, homocistinuria, enfermedad granulomatosa crónica, tirosinemia, enfermedad de Tay-Sachs, cáncer, tumor y otras afecciones patológicas u oncológicas, pero los ejemplos de las enfermedades no se limitan a los mismos.
El término “una célula progenitora neural (o una célula precursora neuronal)” tal como se usa en el presente documento se refiere a una célula que puede diferenciarse en diversos tipos de neuronas. La célula progenitora neural puede usarse indistintamente con una célula madre neural. Además, la célula progenitora neural puede referirse a una célula derivada de una célula madre neural. La célula progenitora neural puede derivarse, por ejemplo, de un feto o adulto mamífero. La célula progenitora neural puede derivarse, por ejemplo, de un tejido cerebral del feto mamífero. La célula progenitora neural puede derivarse, por ejemplo, de un tejido de mesencéfalo ventral del feto mamífero. Además, la célula progenitora neural puede obtenerse por diferenciación de las células derivadas de células madre embrionarias humanas (hESC), células madre pluripotentes inducidas (iPSC), células madre adultas humanas, células madre hematopoyéticas humanas, células madre mesenquimatosas humanas (hMSC) o líneas celulares inmortalizadas derivadas de tejido neural fetal humano según un método conocido dado a conocer en el documento de Yiping Yana, et al., Directed Differentiation of Dopaminergic Neuronal Subtypes from Human Embryonic Stem Cells, Stem Cells.
2005; 23(6): 781-790; el documento de Yan Li, et al., Neural differentiation from pluripotent stem cells: The role of natural and synthetic extracelular matrix, World J Stem Cells. 26 de enero de 2014; 6(1): 11-23; el documento de Lorena Arranz, et al., Neuropathy of haematopoietic stem cell niche is essential for myeloproliferative neoplasms, Nature. 7 de agosto de 2014;512(7512):78-81; y el documento de Liang Xu, et al., The iPS Technique Provides Hope for Parkinson’s Disease Treatment, Stem Cell Rev and Rep (2010) 6:398-404.
Las células madre pueden, por ejemplo, proliferar en un estado indiferenciado. El término “proliferación”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un aumento en el número de células. La proliferación en un estado indiferenciado significa la proliferación de una célula en células que tienen las mismas propiedades que la célula original sin diferenciarse en células específicas.
El tocoferol o el acetato de tocoferol en el medio puede ser, por ejemplo, alfa-tocoferol o acetato de alfa-tocoferol. En el método según la invención, los medios contienen tocoferol, acetato de tocoferol o una mezcla a una concentración en un intervalo de 0,1 |ig/ml a 10 |ig/ml. La mezcla de tocoferol y acetato de tocoferol puede añadirse en el medio a una razón en un intervalo de 1:10 a 10:1, 1:5 a 5:1, 1:4 a 4:1, 1:3 a 3:1, o 1:2 a 2:1, o a una razón de 1:1.
El medio puede, por ejemplo, prepararse conteniendo tocoferol y/o acetato de tocoferol en un medio de cultivo celular normalmente usado en la técnica. El medio de cultivo celular puede ser, por ejemplo, medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, fabricado por GIBCO, EE.UU.), medio esencial mínimo (MEM, fabricado por GIBCO, EE.u U.), medio basal de Eagle (BME, fabricado por GIBCO, EE.UU.), RPMI 1640 (fabricado por GIBCO, EE.UU.), DMEM/mezcla de nutrientes F-10 (DMEM/F10, fabricado por GIBCO, EE.UU.), DMEM/mezcla de nutrientes F-12 (DMEM/F12, fabricado por GIBCO, EE.UU.), medio esencial mínimo a (a-MEM, fabricado por GIBCO, EE.UU.), medio esencial mínimo de Glasgow (G-MEM, fabricado por GIBCO, EE.UU.) o medio de Dulbecco modificado por Isocove (IMDM, fabricado por GIBCO, EE.UU.). El medio puede incluir además un antibiótico, un suplemento de B27 y/o un factor de crecimiento. El antibiótico puede ser, por ejemplo, penicilina, estreptomicina, gentamicina o primocin™. El factor de crecimiento puede ser, por ejemplo, factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF) y/o factor de crecimiento de fibroblastos 4 (FGF4). En el presente documento, puede incluirse bFGF, EGF o FGF4 en el medio a una concentración en un intervalo de, por ejemplo, aproximadamente 2 ng/ml a aproximadamente 100 ng/ml, de aproximadamente 4 ng/ml a aproximadamente 80 ng/ml, de aproximadamente 5 ng/ml a aproximadamente 50 ng/ml o de aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 30 ng/ml.
El método se realiza en una condición de hipoxia. La condición de hipoxia puede incluir, por ejemplo, oxígeno atmosférico a una concentración en un intervalo del 0,1 % al 10 %, de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 10 %, de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 8 %, de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 5 %, de aproximadamente el 2 % a aproximadamente el 4 % o de aproximadamente el 2 % a aproximadamente el 3 %. Las células madre neurales pueden proliferar en un estado indiferenciado. El tocoferol o el acetato de tocoferol contenido en el medio puede ser, por ejemplo, alfa-tocoferol o acetato de alfa-tocoferol. Una concentración de tocoferol, acetato de tocoferol o una mezcla de los mismos contenida en el medio y una razón de mezclado de tocoferol y acetato de tocoferol son las mismas que se describieron anteriormente. El medio puede prepararse conteniendo tocoferol y/o acetato de tocoferol en un medio de cultivo celular normalmente usado en la técnica. El medio de cultivo celular puede ser el mismo que el descrito anteriormente. El medio puede incluir además, por ejemplo, un antibiótico, un suplemento de B27 y/o un factor de crecimiento. El antibiótico y el factor de crecimiento son respectivamente los mismos que los descritos anteriormente.
También se describe en el presente documento una composición para tratar una enfermedad neurológica, incluyendo la composición células progenitoras neurales que se producen en un medio que contiene tocoferol, acetato de tocoferol, o una mezcla de los mismos.
Las células progenitoras neurales pueden cultivarse, por ejemplo, en una condición de hipoxia. La condición de hipoxia puede incluir, por ejemplo, oxígeno atmosférico a una concentración en un intervalo de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 10 %, de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 10 %, de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 8 %, de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 5 %, de aproximadamente el 2 % aproximadamente el 4 % o de aproximadamente el 2 % a aproximadamente el 3 %. El tocoferol o el acetato de tocoferol en el medio puede ser, por ejemplo, alfa-tocoferol o acetato de alfa-tocoferol. Una concentración de tocoferol, acetato de tocoferol o una mezcla de los mismos en el medio puede estar en un intervalo de, por ejemplo, aproximadamente
0,01 |ig/ml a aproximadamente 50 |ig/ml, de aproximadamente 0,01 |ig/ml a aproximadamente 40 |ig/ml, de aproximadamente 0,01 |ig/ml a aproximadamente 30 |ig/ml, de aproximadamente 0,01 |ig/ml a aproximadamente
20 |ig/ml, de aproximadamente 0,01 |ig/ml a aproximadamente 10 |ig/ml o de aproximadamente 1 |ig/ml a aproximadamente 10 |ig/ml. El tocoferol y el acetato de tocoferol en el medio pueden añadirse como mezcla a una razón en un intervalo de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 10:1, de aproximadamente 1:5 a aproximadamente 5:1, de aproximadamente 1:4 a aproximadamente 4:1, de aproximadamente 1:3 a aproximadamente de 3:1 o de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 2:1, o a una razón de aproximadamente 1:1.
El medio puede prepararse mediante adición de tocoferol y/o acetato de tocoferol en un medio de cultivo celular normalmente usado en la técnica. El medio de cultivo celular es el mismo que el descrito anteriormente. El medio puede incluir además, por ejemplo, un antibiótico, un suplemento de B27 y/o un factor de crecimiento. El antibiótico y el factor de crecimiento son respectivamente los mismos que los descritos anteriormente.
La enfermedad neurológica puede ser, por ejemplo, una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, atrofia sistémica múltiple, demencia por enfermedad de Parkinson, accidente cerebrovascular, isquemia y enfermedad neurológica provocada por lesión de la médula espinal.
En el presente documento también se describe una composición de cultivo que contiene tocoferol, acetato de tocoferol o una mezcla de los mismos para la proliferación de una célula progenitora neural en un estado indiferenciado.
El tocoferol o el acetato de tocoferol contenido en la composición de cultivo puede ser alfa-tocoferol o acetato de alfatocoferol. El tocoferol, el acetato de tocoferol o una mezcla de los mismos en la composición de cultivo puede estar a una concentración en un intervalo de, por ejemplo, aproximadamente 0,01 |ig/ml a aproximadamente 50 |ig/ml, de aproximadamente 0,01 |ig/ml a aproximadamente 40 |ig/ml, de aproximadamente 0,01 |ig/ml a aproximadamente
30 |ig/ml, de aproximadamente 0,01 |ig/ml a aproximadamente 20 |ig/ml, de aproximadamente 0,01 |ig/ml a aproximadamente 10 |ig/ml o de aproximadamente 1 |ig/ml a aproximadamente 10 |ig/ml. El tocoferol y el acetato de tocoferol en la composición de cultivo pueden mezclarse a una razón en un intervalo de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 10:1, de aproximadamente 1:5 a aproximadamente 5:1, de aproximadamente 1:4 a aproximadamente 4:1, de aproximadamente 1:3 a aproximadamente 3:1 o de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 2:1, o a una razón de aproximadamente 1:1. La composición de cultivo puede prepararse conteniendo tocoferol y/o acetato de tocoferol en un medio de cultivo celular normalmente usado en la técnica. El medio de cultivo celular puede ser el mismo que el descrito anteriormente. El medio de cultivo celular puede incluir además, por ejemplo, un antibiótico, un suplemento de B27 y/o un factor de crecimiento. El antibiótico y el factor de crecimiento son respectivamente los mismos que los descritos anteriormente.
Efectos ventajosos de la invención
Un método de proliferación de una célula madre neural según un aspecto de la presente divulgación puede contribuir a la producción en masa de las células madre. Por consiguiente, se espera que las células madre proliferadas sean útiles en el tratamiento de diversas enfermedades.
Descripción de los dibujos
La figura 1 muestra los resultados obtenidos por la viabilidad celular a través de un ensayo de MTT después de cultivar células progenitoras neurales fetales en cada medio durante 7 días.
La figura 2 muestra los resultados del examen microscópico (véase la figura 2A) y la citometría (véase la figura 2B), sobre células progenitoras neurales fetales que se cultivaron en cada medio durante 7 días.
Las figuras 3A a 3D muestran cada una la comparación de las tasas de expresión de Ki67, Ki67+nestina tras los marcadores Dapi en un medio después de que las células progenitoras neurales fetales se cultivaran en cada medio durante 7 días y luego se sometieran a inmunotinción.
Las figuras 4A a 4E muestran cada una los resultados de comparar las tasas de expresión de GFAP, Tuj1, GFAP+Tuj1 tras los marcadores Dapi en un medio después de que las células progenitoras neurales de feto se cultivaran en cada medio durante 7 días y luego se sometieran a inmunotinción.
Mejor modo
A continuación en el presente documento, la presente invención se describirá de manera más completa con referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos son solo para fines ilustrativos y, por lo tanto, no deben interpretarse como que estén limitados a los ejemplos expuestos en el presente documento.
Ejemplo 1. Medición de viabilidad celular por ensayo de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-M)-2,5-difeniltetrazolio (MTT)
Se aislaron células progenitoras neurales humanas de fetos humanos de 14 semanas de edad. Antes de obtener las muestras de feto, se recibieron los consentimientos informados que se habían descrito suficientemente a los padres de antemano. Además, la recogida de muestras y el uso de las mismas para investigación fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional del Hospital CHA. Se aislaron tejidos de mesencéfalo ventral en el cerebro de un feto humano de 14 semanas de edad según el método dado a conocer en los documento de Storch et al. 2001; y Milosevic et al. 2006, 2007, y luego, se disociaron para dar una suspensión de células individuales tratando los tejidos de mesencéfalo ventral en una disolución que contenía 0,1 mg/ml de papaína y 100 |ig/ml de ADNasa a una temperatura de 37°C durante aproximadamente 30 minutos. La suspensión de células individuales se lavó con disolución salina tamponada con fosfato (PBS), y luego se incubo en 50 |ig/ml de antipapaína a una temperatura de 37°C durante 30 minutos. Las células progenitoras neurales resultantes se sembraron en placa, en una monocapa, a una densidad de 30.000 células/cm2, sobre una placa de cultivo que se recubrió previamente con 15 |ig/ml de poli-L-ornitina y 4 |ig/ml de fibronectina, y luego se cultivaron. Las células progenitoras neurales de feto cultivadas se sembraron en una placa de 96 pocillos a una densidad de 1 X 104 células/pocillo, se cultivaron durante 7 días y se trataron con un reactivo de MTT. Entonces, midiendo la densidad óptica de las mismas (a una longitud de onda de 570 nm), se analizó la viabilidad celular.
La figura 1 muestra los resultados obtenidos por la viabilidad celular a través de un ensayo de MTT después de que se cultivasen células progenitoras neurales fetales en cada medio durante 7 días. Se añadieron 20 ng/ml de cada uno de bFGF y EGF (disponibles de Peprotech, R&D system) y 10 ml de un suplemento de B27 (disponible de GIBCO) a 500 ml de un medio mixto de DMEM/F12 (1:1) que contenía 0,5 ml de Primocin, que es una formulación de antibióticos, y luego, las células progenitoras neurales fetales se cultivaron en una condición en la que se añadieron 1 |ig/ml de acetato de DL-alfa-tocoferol (M3), 1 |ig/ml de (+)-alfa-tocoferol (M4) o una combinación de los mismos (M5). Las células progenitoras neurales fetales resultantes se compararon con las cultivadas en una condición de cultivo general. Con respecto a la condición de cultivo general, se añadieron 20 ng/ml de cada uno de bFGF y EGF y un suplemento a (2,5 mg de insulina, 25 mg de transferrina, selenito de sodio 0,03 |iM, 36,5 mg de L-glutamina y 0,75 g de L-glucosa) a 500 ml de un medio mixto de DMEM/F12 (1:1) que contenía 0,5 ml de Primocin, que es una formulación de antibióticos, y luego, las células progenitoras neurales fetales se cultivaron en la misma (M1), o en una condición en la que se añadió además el suplemento de B27 (M2).
Como resultado, en comparación con las células progenitoras neurales fetales cultivadas en la condición de cultivo general, el medio que contenía alfa-tocoferol y/o acetato de DL-alfa-tocoferol mostró una mayor viabilidad celular que es estadísticamente significativa (Ps < 0,02). Además, en comparación con las células progenitoras neurales fetales cultivadas en una condición de normoxia, el medio en una condición de hipoxia que contiene oxígeno atmosférico en un intervalo de aproximadamente el 0,1 % a aproximadamente el 10 % mostró una mayor viabilidad celular que es estadísticamente significativa (M3: P <0,009, M4: P < 0,01, M5: P < 0,001).
Por lo tanto, se confirmó que la viabilidad celular de las células progenitoras neurales de feto aumentó tras el tratamiento de acetato de DL-alfa-tocoferol y/o alfa-tocoferol, y más particularmente, un efecto sinérgico de este tipo se mostró en una condición de hipoxia.
Ejemplo 2. Citometría
Las células progenitoras neurales fetales se sembraron en una placa de 6 pocillos a una densidad de 2 X 105 células/pocillo, se cultivaron durante 7 días y después se sometieron a citometría.
La figura 2 muestra un examen microscópico (véase la figura 2A) y una citometría (véase la figura 2B), sobre las células progenitoras neurales fetales que se cultivaron en cada medio durante 7 días. En este caso, cada condición de cultivo de M1 a M5 fue la misma que se describió en el ejemplo 1. En comparación con las células progenitoras neurales fetales cultivadas en una condición general, el número significativamente aumentado de células progenitoras neurales fetales se detectó cuando las células progenitoras neurales fetales se cultivaron en un medio que contenía 1 |ig/ml de alfa-tocoferol y/o 1 |ig/ml de acetato de DL-alfa-tocoferol (Ps < 0,0001). En hipoxia, en comparación con un tratamiento único de o bien acetato de DL-alfa-tocoferol o bien alfa-tocoferol, el tratamiento combinatorio tanto con acetato de DL-alfa-tocoferol como alfa-tocoferol aumentó el número de células progenitoras neurales fetales de significación (M3 frente a M4: P < 0,003, M3 frente a M5: P < 0,0006). En una condición de normoxia, en comparación con la adición de solo acetato de DL-alfa-tocoferol, el tratamiento tanto de acetato de DL-alfa-tocoferol como alfatocoferol mostró un aumento estadísticamente significativo en el número de células progenitoras neurales fetales (M3 frente a M5: P < 0,009).
Por consiguiente, el mayor número de células progenitoras neurales fetales se confirmó en los grupos experimentales tratados con tanto acetato de DL-alfa-tocoferol como alfa-tocoferol.
Ejemplo 3: Análisis inmunocitoquímico 1
Las células progenitoras neurales fetales se sembraron en una placa de 24 pocillos a una densidad de 1 X 105 células/pocillo, se cultivaron durante 7 días y luego se sometieron a análisis inmunocitoquímico usando Ki67, nestina y marcadores DAPI.
Las figuras 3A a 3D muestran cada una la comparación de las tasas de expresión de Ki67, Ki67+nestina tras los marcadores Dapi en un medio después de que las células progenitoras neurales fetales se cultivaran en cada medio durante 7 días y luego se sometieran a inmunotinción.
En la figura 3B, en comparación con las células progenitoras neurales fetales que se cultivaron en M1 y M2 que representan una condición de cultivo general, las células progenitoras neurales fetales que estaban en M3 con acetato de DL-alfa-tocoferol solo, M4 con alfa-tocoferol solo o M5 con tanto acetato de DL-alfa-tocoferol como alfa-tocoferol, mostraron una expresión aumentada de Ki67 de significación (Ps < 0,0001). En una condición de hipoxia, en comparación con la adición de alfa-tocoferol solo, el suplemento tanto de acetato de DL-alfa-tocoferol como alfatocoferol indujo marginalmente más expresión de Ki67 (M4 frente a M5: P = 0,05). Entre las condiciones de cultivo generales, la adición de suplemento de B27 (M2) mostró una expresión aumentada de Ki67 de una manera estadísticamente significativa, en comparación con la ausencia del suplemento de B27 (M1) (Ps < 0,03).
En la figura 3C, en comparación con las células progenitoras neurales fetales cultivadas en la condición de cultivo general, las células progenitoras neurales cultivadas con acetato de DL-alfatocoferol, alfa-tocoferol o tanto acetato de DL-alfa-tocoferol como alfa-tocoferol, mostraron una mayor frecuencia de expresión tanto de Ki67 como nestina juntos de una manera estadísticamente significativa (Ps < 0,0001). Entre las condiciones de hipoxia, en comparación con la adición de alfa-tocoferol solo, el suplemento de tanto acetato de DL-alfa-tocoferol como alfa-tocoferol condujo a una mayor frecuencia de expresión de tanto Ki67 como nestina, ambas de significación (M4 frente a M5, P < 0,02).
En la figura 3D, en comparación con las células progenitoras neurales fetales cultivadas en normoxia, las células progenitoras neurales fetales cultivadas en hipoxia mostraron una expresión aumentada de Dapi (F4,48 = 57,91, P < 0,0001). Además, en comparación con las células progenitoras neurales fetales que se cultivaron en normoxia, las células progenitoras neurales fetales cultivadas con acetato de DL-alfa-tocoferol, alfa-tocoferol o tanto acetato de DL-alfa-tocoferol como alfa-tocoferol, mostraron un aumento estadísticamente significativo en la expresión de Dapi (Ps < 0,0001). Entre las condiciones de hipoxia, en comparación con las células progenitoras neurales fetales cultivadas o bien con acetato de DL-alfa-tocoferol o bien alfa-tocoferol solo, las células progenitoras neurales fetales cultivadas tanto con acetato de DL-alfa-tocoferol como alfa-tocoferol mostraron un aumento estadísticamente significativo en la expresión de Dapi (M3 frente a M5, P < 0,0001, M4 frente a M5, P < 0,0002). En las condiciones en las que solo se añadió alfa-tocoferol y se añadieron tanto acetato de DL-alfa-tocoferol como alfa-tocoferol, las células progenitoras neurales fetales mostraron un aumento estadísticamente significativo en la expresión de Dapi en tales condiciones de hipoxia en comparación con las cultivadas en una condición de normoxia (en comparación con la condición de normoxia, M4 y M5 de las condiciones de hipoxia tenían P< 0,006 y P < 0,0001, respectivamente).
Por lo tanto, se confirmó que los grupos experimentales tratados con tanto acetato de DL-alfa-tocoferol como alfatocoferol, mostraron una mayor expresión de Dapi, alto porcentaje de células que mostraron Ki67 positivo, un marcador de proliferación, o alto porcentaje de células que mostraron Ki67 positivo y nestina positiva, un marcador de células progenitoras neurales (véanse las figuras 3B a 3D).
Ejemplo 4: Análisis inmunocitoquímico 2
Las células progenitoras neurales se sembraron en una placa de 24 pocillos a una densidad de 1 X 105 células/pocillo, se cultivaron durante 7 días y luego se sometieron a análisis inmunocitoquímico usando GFAP, Tuj1 y marcadores DAPI.
Las figuras 4A a 4E muestran cada una la comparación de las tasas de expresión de GFAP, Tuj1, GFAP+Tuj1 y marcadores Dapi en un medio después de que las células progenitoras neurales fetales se cultivaran en cada medio durante 7 días y luego se sometieran a inmunotinción.
En la figura 4B, en comparación con las células progenitoras neurales fetales cultivadas en M1 y M2, que representan cada una una condición de cultivo general, las células progenitoras neurales fetales que estaban en M3 que incluía acetato de DL-alfa-tocoferol solo, M4 que incluía alfa-tocoferol solo o M5 que incluía tanto acetato de DL-alfa-tocoferol como alfa-tocoferol, mostraron una expresión reducida de GFAP de una manera estadísticamente significativa (Ps < 0,04). Además, entre las condiciones de cultivo generales, la adición del suplemento de B27 (M2) redujo la expresión de GFAP de significación en comparación con la ausencia del suplemento de B27 (M1) (condición de hipoxia: P < 0,006, condición general de normoxia: P < 0,007).
En la figura 4C, en comparación con las células progenitoras neurales fetales cultivadas en M1 y M2, que representan cada una una condición de cultivo general, las células progenitoras neurales fetales que estaban en M3 que incluía acetato de DL-alfa-tocoferol solo, M4 que incluía alfa-tocoferol solo o M5 que incluía tanto acetato de DL-alfa-tocoferol como alfa-tocoferol, mostraron una expresión reducida de Tuj1 de una manera estadísticamente significativa (Ps < 0,02). Además, entre las condiciones de cultivo generales, la adición del suplemento de B27 (M2) redujo significativamente la expresión de Tuj1, en comparación con un caso sin el suplemento de B27 (M1) (condición de hipoxia: P < 0,008).
En la figura 4D, en comparación con las células progenitoras neurales fetales cultivadas en la condición de cultivo general, las células progenitoras neurales fetales cultivadas con acetato de DL-alfa-tocoferol, alfa-tocoferol o tanto acetato de DL-alfa-tocoferol como alfa-tocoferol, mostraron una frecuencia de expresión menor de tanto GFAP como Tuj1 juntos (Ps < 0,0001). Además, entre las condiciones de cultivo generales, la adición del suplemento de B27 (M2) redujo la frecuencia de expresión de tanto GFAP como Tuj1 juntos, en comparación con un caso sin el suplemento de B27 (M1) (condición de hipoxia: P < 0,003, condición general de normoxia: P < 0,001).
En la figura 4E, en comparación con las células progenitoras neurales fetales cultivadas en la condición de cultivo general, las células progenitoras neurales fetales cultivadas con acetato de DL-alfa-tocoferol, alfa-tocoferol o tanto acetato de DL-alfa-tocoferol como alfa-tocoferol, mostraron un aumento estadísticamente significativo en la expresión de Dapi (Ps < 0,0001). Además, entre las condiciones de cultivo generales, la adición del suplemento de b27 (M2) aumentó la expresión de Dapi, en comparación con la ausencia de suplemento de B27 (M1) (condición de normoxia: Ps < 0,008). En comparación con las células progenitoras neurales fetales cultivadas con alfa-tocoferol en normoxia, las células progenitoras neurales fetales cultivadas con alfa-tocoferol en hipoxia mostraron un aumento estadísticamente significativo en la expresión de Dapi (M4: P < 0,006).
Por lo tanto, se confirmó que la adición de acetato de DL-alfa-tocoferol, alfa-tocoferol o tanto acetato de DL-alfatocoferol como alfa-tocoferol redujo las células positivas para GFAP, un marcador de células de neuroglía, y para Tuj1, un marcador de neuronas, y condujo a una mayor expresión de Dapi, en comparación con las encontradas en los casos en la condición de cultivo general.

Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Método para la proliferación de una célula madre neural, comprendiendo el método:
cultivar la célula madre neural en un medio que comprende tocoferol, acetato de tocoferol o una mezcla de los mismos a una concentración en un intervalo de 0,1 |ig/ml a 10 |ig/ml, en el que el cultivo de la célula madre neural se realiza en una condición de hipoxia.
2. Método según la reivindicación 1, en el que la célula madre neural prolifera en un estado indiferenciado.
3. Método según la reivindicación 1, en el que el tocoferol y el acetato de tocoferol se mezclan a una razón en un intervalo de 1:5 a 5:1.
4. Método según la reivindicación 1, en el que el medio comprende además factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) y factor de crecimiento epidérmico (EGF).
5. Método según la reivindicación 4, en el que el medio comprende además factor de crecimiento de fibroblastos 4 (FGF4).
6. Método según la reivindicación 1, en el que la condición de hipoxia comprende oxígeno atmosférico a una concentración en un intervalo del 0,1 % al 10 %
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