ES2882430T3 - Composición de células madre - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende células madre, un medio de cultivo celular y un hidrogel de poliacrilamida (GPAA), donde el GPAA contiene menos de 0,02 % pmonómero/pGPAA total] de una cadena lateral de N-hidroxietilacrilamida (HEA), y donde las células madre son células madre mesenquimales y donde el módulo de elasticidad del GPAA vale de 1 a 200 Pa.

Description

DESCRIPCIÓN

Composición de células madre

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere a una composición que comprende células madre, un medio de cultivo celular y un hidrogel de poliacrilamida (GPAA), donde el GPAA contiene menos de 0,02 % pmonómero/pGPAA total] de una cadena lateral de N-hidroxietilacrilamida (HEA), y donde las células madre son células madre mesenquimales y donde el módulo de elasticidad del GPAA vale de 1 a 200 Pa.

En particular, la presente invención se refiere a la composición, donde la composición es para uso en medicina, en particular para uso en la prevención y/o tratamiento de lesión tendinosa en un mamífero, artritis en un mamífero o artropatía en un mamífero. La composición para uso en medicina se administra por inyección.

Antecedentes de la invención

En un mamífero, un tendón es una banda resistente de tejido conjuntivo fibroso firme que habitualmente conecta músculo con hueso, soportando con ello tensión. Un ligamento es similar a un tendón, pero conecta hueso con hueso. Los ligamentos se encuentran, por ejemplo, en articulaciones. Los ligamentos estabilizan principalmente movimientos, mientras que los tendones controlan movimientos.

Tanto los ligamentos como los tendones son filamentos de tejido conjuntivo firmemente conectados, orientados longitudinalmente, que están alineados con orientación paralela a lo largo de su eje longitudinal. Sin embargo, con el desgaste estos filamentos pueden romperse, ya sea parcialmente o por completo, y tras una intervención quirúrgica la curación se retrasa debido a la escasa capacidad inherente de curación del tejido. Además, dentro de este tipo de tejido no existen muchos vasos sanguíneos.

Con la edad, el uso excesivo y/o la falta de uso, los ligamentos y tendones pueden degenerar, provocando que los filamentos longitudinales se desorienten y después se calcifiquen, aumentando el riesgo de rotura.

En la actualidad, el único método disponible para reparar ligamentos o tendones desgarrados es la intervención quirúrgica, típicamente un injerto tisular utilizando tejido del propio paciente, procedente de otra parte del cuerpo. Este procedimiento requiere tiempo, es invasivo y puede ocurrir que no restaure el uso completo de los ligamentos o tendones desgarrados o dañados. Los tiempos de recuperación típicos antes de que el tendón o ligamento en cuestión sea estable se sitúan entre 0,5 años y 1 año.

En consecuencia, existe en la técnica la necesidad de un método alternativo o mejorado para reparar ligamentos o tendones desgarrados o dañados, que sea menos invasivo que los métodos existentes, que mejore el uso o restaure el uso completo del tendón o ligamento, y que redunde en una recuperación más rápida.

En un mamífero, artropatía es un término general para dolor y/o inestabilidad articular, y entre las artropatías la más común es la artritis causada por inflamación de la membrana sinovial y destrucción del cartílago. Esta enfermedad está muy extendida y carece de tratamiento no quirúrgico eficaz que sea duradero.

Existe en la técnica, por lo tanto, la necesidad de un método alternativo o mejorado para tratar y/o prevenir la artropatía, que redunde en menos dolor articular y/o menos inestabilidad de la articulación.

La artritis constituye un grupo de afecciones que implican daños en las articulaciones del cuerpo, es decir, dolor causado por la inflamación y destrucción del cartílago. Hay más de 100 formas de artritis distintas.

Existe en la técnica la necesidad de un método alternativo o mejorado para tratar y/o prevenir la artritis, que redunde en menos inflamación y destrucción del cartílago.

La mayoría de los tejidos humanos no se regeneran espontáneamente; por esta razón las terapias celulares y la ingeniería tisular representan alternativas prometedoras. El principio es simple: se obtienen células de un paciente y se introducen directamente en el tejido dañado o por mediación de un soporte poroso tridimensional, y posteriormente se cultivan en un biorreactor en donde los parámetros fisicoquímicos y mecánicos están controlados. Cuando los tejidos (o las células) están maduros, se pueden implantar.

El trabajo reciente en este campo ha demostrado que las células madre mesenquimales (CMM) derivadas de la médula ósea mejoran la curación de lesiones tendinosas en caballos.

Se inyectan CMM en grandes cantidades (10 - 20 millones de células), pero transcurridas 24 horas solo <25 % permanecen en la zona lesionada.

Por lo tanto, existe en la técnica la necesidad de un sistema de administración adecuado para administrar células madre, y este sistema de administración debe ser seguro y no tóxico para el paciente. En la técnica se encuentran disponibles varios hidrogeles, por ejemplo "Notrex", "Amazingel", Aqualift, etc. Sin embargo, entre estos hidrogeles existen diferencias importantes en cuanto a composición química, propiedades físicas, fabricación y técnicas de inyección, lo que los hace bastante diferentes. Se considera que todos los hidrogeles de poliacrilamida son el mismo producto, pero no es así. Esto se discute en un artículo de Narins R.S. y Schmidt R., "Polyacrylamide Hydrogel Differences: Getting rid of the confusion" (Diferencias entre los hidrogeles de poliacrilamida: deshacer la confusión), Journal of Drugs in Dermatology, vol. 10, núm. 12, diciembre de 2011, pág. 1370.

La seguridad de los hidrogeles de poliacrilamida se determina basándose en una combinación de las propiedades químicas y físicas, la estabilidad y fiabilidad del producto, así como en la técnica de implante.

Otro trabajo en este campo (documento WO 2013/086523) ha investigado la idoneidad de un hidrogel, que puede ser adecuado para la regeneración ósea, en el cultivo celular estudiado que comprendía fibroblastos de rata, en cuanto a la citocompatibilidad de lixiviables de hidrogel formados por la polimerización del hidrogel. El gel se ha formado a partir de un macrómero basado en poli(N-isopropilacrilamida) y un macrómero basado en poliamidoamina. Por lo tanto, el gel es un gel de poli-NiPAAm termorrespondiente, y no un gel de poliacrilamida reticulado como el descrito en la presente invención. El gel de poli-NiPAAm se solidifica al ser inyectado en el organismo, formando un gel multirreticulado, y con ello libera in situ productos lixiviables potencialmente tóxicos. Además, el gel se degrada en el plazo de 12 semanas, lo que libera más productos tóxicos dentro del organismo.

El documento WO 2015/186906 describe una composición para tratar una lesión tendinosa, por ejemplo tendinopatía o tendinitis, comprendiendo dicha composición células madre mesenquimales en un medio de cultivo celular. La composición se administra por inyección en la parte afectada. Las células se pueden aplicar solas con un medio de cultivo, o bien en combinación con un medio de cultivo y un hidrogel biodegradable.

Por lo tanto, sería ventajoso un sistema mejorado de administración de células madre que resuelva los antedichos problemas de estabilidad del gel y que no libere in situ componentes tóxicos, y en particular sería ventajoso un sistema más eficiente y/o fiable de administración de células madre con andamio que asegure un crecimiento estable de células madre.

También sería ventajoso un sistema mejorado de administración de células madre que resuelva los antedichos problemas de degradabilidad del gel, y en particular sería ventajoso un sistema más estable de administración de células madre con andamio.

Por lo tanto, sería ventajoso un sistema mejorado de administración de células madre, y en particular sería ventajoso un sistema más eficaz y/o fiable de administración de células madre con andamio.

También sería ventajoso un sistema alternativo o mejorado de administración de células madre para uso en medicina, en particular para uso en la prevención y/o tratamiento de lesión tendinosa en un mamífero, artritis en un mamífero o artropatía en un mamífero.

Sorprendentemente, los inventores han hallado que una composición que comprende células madre, un medio de cultivo celular y GPAA, donde el GPAA contiene menos de 0,02 % pmonómero/pGPAA total] de una cadena lateral de N-hidroxietilacrilamida (HEA) o ninguna cadena lateral de HEA, es útil como sistema de administración con andamio. De hecho se ha hallado, sorprendentemente, que células madre tales como células madre mesenquimales equinas integradas en este andamio, permanecen viables, proliferan y migran cuando se utiliza GPAA como andamio en tejido tendinoso equino, y la composición no induce respuesta proinflamatoria. En consecuencia, la presente invención ha demostrado, sorprendentemente, que la composición que comprende células madre, un medio de cultivo celular y GPAA se puede utilizar como andamio en la reparación de tendinopatías.

Sin quedar ligado por ninguna teoría, se plantea la hipótesis de que la retención física de las células alentará a estas células a injertarse en el tejido, lo que redunda en que un mayor número de las mismas contribuyan a la curación del tejido y mejora adicionalmente sus efectos beneficiosos.

Sorprendentemente, los autores de la presente invención han hallado que una composición que comprende células madre, un medio de cultivo celular y GPAA ofrece una solución al problema de la administración de células madre dentro de un gel flexible, inyectable y biocompatible que se tolera clínicamente y es compatible con la supervivencia y crecimiento de células madre.

Compendio de la invención

El alcance de esta invención está definido por las reivindicaciones. Cualquier "realización" o "ejemplo" que se dé a conocer en la descripción pero que no esté amparado por las reivindicaciones debe considerarse como presentado con fines exclusivamente ilustrativos. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a la composición de la presente invención para uso en un método para tratar el organismo humano (o animal) mediante terapia.

Así, un objeto de la presente invención se refiere a proporcionar una composición que comprende células madre, un medio de cultivo celular y un hidrogel de poliacrilamida (GPAA), donde el GPAA contiene menos de 0,02 % pmonómero/pGPAA total] de una cadena lateral de N-hidroxietilacrilamida (HEA), donde las células madre son células madre mesenquimales y donde el módulo de elasticidad del GPAA vale de 1 a 200 Pa.

En particular, es un objeto de la presente invención proporcionar una composición que resuelva los problemas de la técnica anterior mencionados más arriba, de sistemas de administración de células madre que no son eficientes y/o sistemas de administración de células madre con andamio que no son fiables.

Así, un aspecto de la invención se refiere a una composición que comprende células madre, un medio de cultivo celular y un hidrogel de poliacrilamida (GPAA), donde el GPAA contiene menos de 0,02 % pmonómero/pGPAA total] de una cadena lateral de N-hidroxietilacrilamida (HEA), donde las células madre son células madre mesenquimales y donde el módulo de elasticidad del GPAA vale de 1 a 200 Pa.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a la composición según la invención, donde la composición es para uso en medicina, donde la composición se administra por inyección.

Es otro aspecto más de la presente invención proporcionar un procedimiento para preparar la composición según la invención, que comprende los pasos de: i) proporcionar células madre, un medio de cultivo celular y un hidrogel de poliacrilamida (GPAA), donde el GPAA contiene menos de 0,02 % pmonómero/pGPAA total] de una cadena lateral de N-hidroxietilacrilamida (HEA), ii) mezclar los componentes de i) consiguiendo así la composición. En este caso, las células madre son células madre mesenquimales y el módulo de elasticidad del GPAA vale de 1 a 200 Pa.

Es aún otro aspecto de la presente invención proporcionar una composición que se puede obtener mediante el procedimiento de la invención.

Es aún un aspecto adicional de la presente invención proporcionar una composición según la invención, para uso en medicina.

Es aún un aspecto adicional más de la presente invención proporcionar una composición según la invención, para uso en la prevención y/o tratamiento de lesión tendinosa en un mamífero.

También se describe en la presente memoria un método para prevenir y/o tratar lesión tendinosa en un mamífero, comprendiendo el método administrar a dicho mamífero una composición según la invención.

También se describe en la presente memoria el uso de una composición de la invención para preparar un medicamento para prevenir y/o tratar lesión tendinosa en un mamífero.

Es aún otro aspecto de la presente invención proporcionar una composición según la invención, para uso en la prevención y/o tratamiento de artritis en un mamífero.

También se describe en la presente memoria un método para prevenir y/o tratar artritis en un mamífero, comprendiendo el método administrar a dicho mamífero una composición según la invención.

También se describe en la presente memoria el uso de una composición de la invención para preparar un medicamento para prevenir y/o tratar artritis en un mamífero.

Es otro aspecto más de la presente invención proporcionar una composición según la invención, para uso en la prevención y/o tratamiento de artropatía en un mamífero.

También se describe en la presente memoria un método para prevenir y/o tratar artropatía en un mamífero, comprendiendo el método administrar a dicho mamífero una composición según la invención.

También se describe en la presente memoria el uso de una composición de la invención para preparar un medicamento para prevenir y/o tratar artropatía en un mamífero.

Es aún un aspecto adicional más de la presente invención proporcionar una composición según la invención, para uso en la prevención y/o tratamiento de incontinencia urinaria en un mamífero.

También se describe en la presente memoria un método para prevenir y/o tratar incontinencia urinaria en un mamífero, comprendiendo el método administrar a dicho mamífero una composición según la invención.

También se describe en la presente memoria el uso de una composición de la invención para preparar un medicamento para prevenir y/o tratar incontinencia urinaria en un mamífero.

Es aún un aspecto adicional más de la presente invención proporcionar una composición según la invención, para uso en la prevención y/o tratamiento de incontinencia anal en un mamífero.

También se describe en la presente memoria un método para prevenir y/o tratar incontinencia anal en un mamífero, comprendiendo el método administrar a dicho mamífero una composición según la invención.

También se describe en la presente memoria el uso de una composición de la invención para preparar un medicamento para prevenir y/o tratar incontinencia anal en un mamífero.

Es aún un aspecto adicional más de la presente invención proporcionar una composición según la invención, para uso en la prevención y/o tratamiento de defectos funcionales o cosméticos de la cara o el cuerpo en un mamífero. También se describe en la presente memoria un método para prevenir y/o tratar defectos funcionales o cosméticos de la cara o el cuerpo en un mamífero, comprendiendo el método administrar a dicho mamífero una composición según la invención.

También se describe en la presente memoria el uso de una composición de la invención para preparar un medicamento para prevenir y/o tratar defectos funcionales o cosméticos de la cara o el cuerpo en un mamífero. Breve descripción de las figuras

La Figura 1a muestra el aspecto a simple vista de perlas de GPAA en el momento de su formación (A), al cabo de 5 días (B) y al cabo de 10 días. Son visibles la integridad y la descomposición del polímero.

La Figura 1b muestra una imagen con microscopio de campo claro a baja potencia (x200) de una perla de GPAA con CMM encapsuladas (flechas) tras 24 h de cultivo. Las CMM aparecen como puntos oscuros dentro del GPAA (flechas negras).

La Figura 2a muestra la viabilidad a 12 h de CMM en GPAA (curva inferior) en comparación con el testigo (curva superior). El 90 % de las células siguen siendo viables.

La Figura 2b muestra la proliferación de CMM en GPAA evaluada utilizando el ensayo con alamarBlue®. La proliferación de las CMM evidencia un aumento exponencial en el número de células a lo largo de 5 días.

La Figura 3a muestra lecturas de los datos de ensayos de proliferación de CMM encapsuladas en GPAA. El porcentaje de células vivas se cuantificó utilizando un colorante de vitalidad celular (ensayo vivo/muerto) en los puntos temporales indicados. Tal como se ha indicado, se muestra en la columna correspondiente el número de células vivas y de células muertas contadas bajo el microscopio, dentro de un campo de visión normalizado.

La Figura 3b muestra la capacidad de migración de CMM encapsuladas en GPAA hacia la matriz tendinosa. A) Se prepararon matrices de tendón nativo no viable (TNN) seccionando pequeños cortes que estaban desprovistos de cualquier célula endógena. Se colocaron estos dentro de un pocillo de una placa para cultivo de tejidos, con dos perlas de GPAA (geles transparentes) que contenían CMM marcadas con colorante de fluorescencia verde encima de cada corte y se cultivaron conjuntamente durante 5 días.

B) A los 5 días se han adherido células viables marcadas fluorescentemente (las flechas marcan la señal verde) a la matriz tendinosa (x200).

C) Se observan células viables junto con células muertas débilmente teñidas (flechas), la mayoría de ellas tenocitos residentes que se sitúan en filas alineadas (x200).

La Figura 4a muestra el aspecto externo de una extremidad con el tendón flexor digital profundo 14 días después de la inyección. A: vista de toda la extremidad distal. B: detalle de los lugares de inyección. Se aprecia la hinchazón tanto en el aspecto palmar como en los aspectos laterales (flechas blancas).

La Figura 4b muestra una imagen ecográfica del caso 4a.

A) imagen tomada inmediatamente después de la inyección intratendinosa. Es visible el aire de la inyección (flecha). B: la zona 24 h después de la inyección. El aire ha desaparecido pero la hinchazón permanece.

La Figura 5 muestra la distribución de CMM después del implante en la articulación de un caballo. Las CMM han sido vehiculadas en plasma (figura izquierda) o en GPAA (figura derecha).

Se describirá ahora con mayor detalle la presente invención en lo que sigue.

Descripción de la invención

Definiciones

Antes de tratar la presente invención con mayor detalle, se definirán primeramente los siguientes términos, expresiones y convenciones:

Se prepara el GPAA tal como se describe en el documento WO 02/16453 y además en el documento WO 2012/123385. El GPAA puede comprender cualquier realización del hidrogel según se describe en los documentos WO 02/16453 y WO 2012/123385. El GPAA se describe con mayor detalle más adelante en la sección "Preparación del hidrogel de poliacrilamida (GPAA)".

La expresión "célula madre" utilizada en la presente memoria se refiere a células biológicas indiferenciadas o inmaduras que pueden diferenciarse para dar células especializadas y que pueden dividirse por mitosis. En los mamíferos existen dos grandes tipos de células madre: células madre embrionarias (o genuinas) y células madre adultas (células madre de tipo progenitor o células madre pluripotentes inducidas (células MPi), que se encuentran en diversos tejidos. En los organismos adultos, los tres tipos de células madre pueden actuar como agentes reparadores del organismo, reponiendo tejidos especializados.

Una célula madre de tipo progenitor es una célula biológica que tiende a diferenciarse para dar un tipo específico de célula. Ya es más especializada que una célula madre embrionaria, y se la puede forzar un poco más para diferenciarse dando su célula "objetivo". Las células madre pluripotentes inducidas (células MPi) son células adultas que han sido devueltas al estado embrionario mediante el uso de 4 factores de transcripción embrionarios. La diferencia más importante entre las células madre embrionarias (o embrionarias inducidas) y las células progenitoras reside en el hecho de que las células del primer tipo no presentan especificidad para tejido y pueden replicarse indefinidamente, mientras que las células de tipo progenitor presentan especificidad para tejido y solo pueden dividirse un número limitado de veces.

Los tipos de células madre que se describen en la presente memoria incluyen células madre de tipo progenitor, células madre embrionarias y células MPi. De acuerdo con la invención se prefieren las células madre, y son más preferidas las células madre de tipo progenitor. Las células madre de tipo progenitor incluyen células madre de todo tipo de tejidos de mamífero, por ejemplo de músculo, hueso, sangre, sistema nervioso o piel.

Un tipo particular de células madre de tipo progenitor son las células madre mesenquimales (CMM) -o células estromales-, que son células estromales multipotentes que pueden diferenciarse para dar una diversidad de linajes, entre ellos osteocitos, adipocitos y condrocitos. Según la invención reivindicada, se utilizan CMM.

Arthramid® gel es un producto comercial de GPAA definido, que tiene las siguientes características físicas y químicas: el contenido de materia seca es 2,5 % de poliacrilamida, el módulo de elasticidad vale 33-55 Pa, el pH es 7,3-8,2 y el nivel de los monómeros residuales acrilamida y agente reticulante está por debajo de 1,5 ppm).

Las características fisicoquímicas de producto del GPAA son muy importantes para la capacidad de las células madre de sobrevivir y dividirse con éxito en el gel, es decir, el contenido de materia seca, el módulo de elasticidad, el pH, etc., determinan la estabilidad del gel y, por lo tanto, afectan a la capacidad de las células madre para sobrevivir y dividirse. Además, las características fisicoquímicas de producto del GPAA son importantes para la interacción tisular y para la ausencia de degradabilidad del GPAA tras ser inyectado en un tejido, incluso cuando el GPAA esté cargado con células madre.

Descripción detallada de la invención

En un aspecto, la invención se refiere a una composición que comprende células madre, un medio de cultivo celular y un hidrogel de poliacrilamida (GPAA), donde el GPAA contiene menos de 0,02 % pmonómero/pGPAA total] de una cadena lateral de N-hidroxietilacrilamida (HEA), donde las células madre son células madre mesenquimales y donde el módulo de elasticidad del GPAA vale de 1 a 200 Pa.

En una realización, la invención se refiere a una composición que consiste esencialmente en células madre, un medio de cultivo celular y un hidrogel de poliacrilamida (GPAA), donde el GPAA contiene menos de 0,02 % pmonómero/pGPAA total] de una cadena lateral de N-hidroxietilacrilamida (HEA), donde las células madre son células madre mesenquimales, y donde el módulo de elasticidad del GPAA vale de 1 a 200 Pa.

En una realización, la invención se refiere a una composición que consiste en células madre, un medio de cultivo celular y un hidrogel de poliacrilamida (GPAA), donde el GPAA contiene menos de 0,02 % pmonómero/pGPAA total] de una cadena lateral de N-hidroxietilacrilamida (HEA), donde las células madre son células madre mesenquimales, y donde el módulo de elasticidad del GPAA vale de 1 a 200 Pa.

Los inventores han descubierto, sorprendentemente, que una composición de la invención es muy adecuada como andamio para la administración de células madre, preferiblemente células madre mesenquimales (CMM), por ejemplo, en caballos. El GPAA conserva la viabilidad, la proliferación durante días y la migración de las células madre, preferiblemente CMM, por ejemplo, y el prendimiento de injerto de las células en la matriz tendinosa. Además, no se produce respuesta inflamatoria modulada por interleucina 1 beta (IL-1 p). De hecho, los datos demostraron sorprendentemente una capacidad no inhibida de las células para dividirse en el seno de GPAA durante al menos 5 días. La IL-1 p es una citocina conocida por los expertos en la técnica como marcador de respuestas inflamatorias, es decir, esta citocina es un mediador importante de la respuesta inflamatoria y está involucrada en diversas actividades celulares, entre ellas la proliferación celular, la diferenciación y la apoptosis. Además, el uso de GPAA es seguro cuando se administra en tendones equinos normales, ya que no se asocian con el tratamiento infecciones, reacciones adversas ni cojera. Asimismo, el uso de GPAA como andamio para células madre, preferiblemente CMM, por ejemplo, en articulaciones de caballos, permite una distribución más uniforme de las células dentro de la articulación.

Este hallazgo es sorprendente, ya que otros no han podido demostrar viabilidad, proliferación y migración de una composición que comprendiese células madre, un medio de cultivo celular y un GPAA, donde el GPAA contuviese menos de 0,02 % pmonómero/pGPAA total] de un cadena lateral de N-hidroxietilacrilamida (HEA). Por ejemplo, en el documento WO 2013/174982, por ejemplo, se indica que un gel de poliacrilamida no adsorbió ni retuvo péptidos extracelulares (MEC).

Sorprendentemente, se ha demostrado que la combinación de bajo contenido de materia seca junto con el módulo de elasticidad específico y la baja concentración de monómero residual del GPAA de la presente invención proporciona los efectos únicos de supervivencia de células madre en el gel.

En una realización, la invención se refiere a una composición donde el GPAA contiene menos de 0,02 % pmonómero/pGPAA total] de una cadena lateral de N-hidroxietilacrilamida (HEA), por ejemplo menos de 0,015 %, por ejemplo menos de 0,010 %, por ejemplo menos de 0,005 %. Mediante la aplicación de un proceso de lavado, se pueden eliminar y/o reducir en cantidad los monómeros residuales. Típicamente, el proceso de lavado debe realizarse de una manera y con una duración tales que reduzcan el contenido monomérico residual a no más de 50 ppm, preferiblemente no más de 40 ppm, por ejemplo no más de 30 ppm, más preferiblemente no más de 20 ppm, aún más preferiblemente no más de 10 ppm, lo más preferiblemente no más de 5 ppm, por ejemplo no más de 4 o 3 o aún más preferiblemente no más de 1,5 ppm. Los estándares regulatorios para niveles aceptables de contenido monomérico residual a fin de que el gel sea considerado biocompatible pueden variar, pero a menudo están fijados en no más de 10 ppm, más frecuentemente no más de 5 ppm.

La cadena lateral de HEA tiene la fórmula química que se muestra a continuación:

En una realización, la invención se refiere a una composición en la cual el GPAA no contiene una cadena lateral de HEA. Dicho de otro modo, ni los monómeros ni los polímeros del GPAA contienen cadenas laterales de HEA. Esto significa que el GPAA contiene 0,00 % de cadena lateral de HEA, o solamente cantidades trazas de HEA, tales como no más de 1,5 o no más de 1 ppm.

En una realización, la invención se refiere a una composición que consiste esencialmente en células madre, un medio de cultivo celular y un hidrogel de poliacrilamida (GPAA), donde el GPAA no contiene una cadena lateral de HEA.

En una realización adicional, la invención se refiere a una composición que consiste en células madre, un medio de cultivo celular y un hidrogel de poliacrilamida (GPAA), donde el GPAA no contiene una cadena lateral de HEA. En una realización adicional, de acuerdo con la invención, la cadena lateral también puede ser

O

: , donde X es un alquilo C¹-C⁶ que comprende además una función seleccionada del grupo consistente en hidroxilo, carboxi, amina y aldehido. De acuerdo con la invención, preferiblemente el GPAA no contiene tal cadena

O

lateral, es decir, el GPAA no contiene la cadena lateral

, donde X es un alquilo C¹-C⁶ que comprende además una función seleccionada del grupo consistente en hidroxilo, carboxi, amina y aldehído. Cuando X = -C ²H⁴OH, entonces la cadena lateral es HEA.

De acuerdo con la invención, el GPAA contiene menos de 0,02 % pmonómero/pGPAA total] de una cadena lateral de N-hidroxietilacrilamida (HEA).

De acuerdo con la invención, esto significa que el porcentaje en peso de los monómeros que tienen cadenas laterales de HEA es menos de 0,02 % del peso total del GPAA resultante. El GPAA resultante consiste en una mezcla de monómeros y polímeros. Por lo tanto, solo los monómeros presentes en el GPAA final pueden tener cantidades muy pequeñas de cadenas laterales de HEA (menos de 0,02 % del peso total del GPAA). En una realización preferida, los monómeros no contienen cadenas laterales de HEA. En otra realización aún más preferida, el GPAA final no contiene cadenas laterales de HEA. Todos los porcentajes son proporciones en peso; es decir, peso de monómero:peso de GPAA total.

El un medio de cultivo celular según la invención puede ser cualquier medio de cultivo celular convencional y adecuado para las células en cuestión, tal como, por ejemplo, BME, MEM, DMEM, RPMI, McCoy's 5A, Ham's F-12. Las condiciones del cultivo celular pueden variar para cada tipo de célula, pero los ambientes artificiales consisten en un recipiente adecuado con sustrato o medio que proporciona los nutrientes esenciales (aminoácidos, hidratos de carbono, vitaminas, minerales), factores de crecimiento, hormonas y gases (CO², O²), y regula el entorno fisicoquímico (tampón de pH, presión osmótica, temperatura). La mayoría de las células requieren una superficie o un sustrato artificial (cultivo adherente o monocapa) mientras que otras se pueden cultivar flotando libremente en medio de cultivo (cultivo en suspensión). El medio de cultivo celular preferido es adecuado para el crecimiento y la proliferación de células madre. El medio de cultivo celular más preferido de acuerdo con la invención es el medio D10 (medio de Eagle modificado por Dulbecco, DMEM, suplementado con suero fetal bovino (10 % v/v), penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 U/ml).

La invención se refiere a una composición donde las células madre son células madre mesenquimales. Se prefieren particularmente células madre mesenquimales, e incluso son más preferidas células madre mesenquimales de la médula ósea. En una realización, la invención se refiere a una composición donde la composición se administra por inyección.

La inyección de la composición de la invención se puede realizar bajo anestesia local, pero no se requiere necesariamente anestesia local. En cualquier caso, el procedimiento se realiza preferiblemente en condiciones estériles. Se rasura todo el pelo que cubra la zona de inyección y se lava a fondo la piel, por ejemplo con clorhexidina y etanol (por ejemplo, 3 veces indistintamente). Después se inserta la cánula en la cavidad articular y se comprueba por aspiración que esté colocada intraarticularmente de manera correcta. Generalmente se vacía la articulación en al menos la cantidad de líquido que se ha decidido inyectar, y después se inyecta la cantidad deseada del GPAA. Se puede incluir en el GPAA un antibiótico para prevenir una infección iatrogénica de la articulación. Según una realización de la invención, la composición se administra mediante inyección intraarticular y/o mediante inyección en el tendón y/o mediante inyección en el ligamento. Según la invención, la inyección se realiza preferentemente en un mamífero.

En un mamífero, un tendón es una banda resistente de tejido conjuntivo fibroso firme que habitualmente conecta músculo con hueso, soportando con ello tensión. Un ligamento es similar a un tendón, pero conecta hueso con hueso.

El proceso de curación de un tendón o ligamento roto puede ser largo y doloroso, pero la curación y la recuperación se dan en un proceso que está controlado por las células y su matriz extracelular circundante, un proceso que sorprendentemente se ve acortado y fortalecido por la aplicación de células madre en GPAA.

Se ha hallado, sorprendentemente, que se puede emplear la composición de la invención para mejorar la inestabilidad articular y/o para proporcionar un efecto de alivio del dolor.

En un mamífero, artropatía es un término general para dolor y/o inestabilidad articular, siendo la más común de las artropatías la artritis causada por la inflamación de la membrana sinovial y la destrucción del cartílago. La enfermedad está muy extendida, y falta un tratamiento no quirúrgico eficaz que sea duradero. Se ha demostrado que la inyección de GPAA en la cavidad articular alivia el dolor asociado con la artritis, posiblemente a través de un efecto de almohadillado.

En una realización, la invención se refiere a la composición en donde se administran por inyección 0,1-50 ml de composición una vez, por ejemplo dos veces, por ejemplo tres veces, por ejemplo cuatro veces, por ejemplo 5 veces, por ejemplo 6 veces, por ejemplo 7 veces, por ejemplo 8 veces, por ejemplo 9 veces, por ejemplo 10 veces. En una realización, la invención se refiere a una composición en donde reciben inyección la cavidad intraarticular y/o el núcleo central del tendón flexor y/o el ligamento suspensorio.

En una realización, la invención se refiere a una composición en donde se administran por inyección 0,1-50 ml de composición una vez cada 2 semanas, por ejemplo cada 4 semanas, por ejemplo cada 6 semanas, por ejemplo cada 8 semanas, por ejemplo cada 10 semanas, por ejemplo cada 12 semanas, por ejemplo cada 14 semanas, por ejemplo cada 16 semanas o incluso más.

En una realización, la invención se refiere a una composición en donde reciben inyección la cavidad intraarticular y/o el núcleo central del tendón flexor y/o el ligamento suspensorio.

En un aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para preparar la composición, que comprende los pasos de: i) proporcionar células madre, un medio de cultivo celular y un hidrogel de poliacrilamida (GPAA), donde el GPAA contiene menos de 0,02 % pmonómero/pGPAA total] de una cadena lateral de N-hidroxietilacrilamida (HEA), ii) mezclar los componentes de i) consiguiendo así la composición. En este caso, las células madre son células madre mesenquimales y el módulo de elasticidad del GPAA vale de 1 a 200 Pa.

En una realización, la invención se refiere a un procedimiento para preparar la composición, que consta esencialmente de los pasos de: i) proporcionar células madre, un medio de cultivo celular y un hidrogel de poliacrilamida (GPAA), donde el GPAA contiene menos de 0,02 % pmonómero/pGPAA total] de una cadena lateral de N-hidroxietilacrilamida (HEA), ii) mezclar los componentes de i) consiguiendo así la composición. En este caso las células madre son células madre mesenquimales y el módulo de elasticidad del GPAA vale de 1 a 200 Pa.

En otra realización, la invención se refiere a un procedimiento para preparar la composición, que consta de los pasos de: i) proporcionar células madre, un medio de cultivo celular y un hidrogel de poliacrilamida (GPAA), donde el GPAA contiene menos de 0,02 % pmonómero/pGPAA total] de una cadena lateral de N-hidroxietilacrilamida (HEA), ii) mezclar los componentes de i) consiguiendo así la composición. En este caso las células madre son células madre mesenquimales y el módulo de elasticidad del GPAA vale de 1 a 200 Pa.

En una realización, la invención se refiere a un procedimiento donde el GPAA no contiene una cadena lateral de HEA.

La invención se refiere a un procedimiento donde las células madre son células madre mesenquimales.

En un aspecto, la invención se refiere a una composición que se puede obtener mediante el procedimiento de la invención.

En una realización, la invención se refiere a una composición obtenida mediante el procedimiento de la invención. En un aspecto adicional, la invención se refiere a una composición según la invención, para uso en medicina.

En una realización, la invención se refiere a una composición, para uso en medicina en un mamífero.

En una realización adicional, la invención se refiere a una composición para uso en medicina en un mamífero, donde el mamífero se selecciona entre un ser humano, un mamífero de carreras o un mamífero de compañía.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a una composición según la invención, para uso en la prevención y/o tratamiento de lesión tendinosa en un mamífero.

En una realización adicional, la invención se refiere a una composición según la invención, para uso en la prevención y/o tratamiento de lesión tendinosa en un mamífero, donde el mamífero se selecciona entre un ser humano, un mamífero de carreras o un mamífero de compañía.

En una realización, la invención se refiere a una composición según la invención, para uso en la prevención y/o tratamiento de lesión tendinosa en un mamífero, donde la lesión tendinosa se selecciona entre una o más de traumatismo (lesión), rotura (estallido), desgarro (por presión) o inflamación ulcerosa que origina debilidad de los tejidos. La inflamación ulcerosa está presente cuando se ha desarrollado una úlcera sobre una zona de inflamación, originando así debilidad del tejido. El traumatismo, también denominado lesión, es una herida fisiológica causada por una fuente externa.

En una realización adicional, la invención se refiere a una composición según la invención, para uso en la prevención y/o tratamiento de lesión tendinosa en un mamífero, donde la lesión tendinosa se selecciona entre una o más de tendinitis, tendinosis o tendinopatía. Tendinitis significa inflamación de un tendón. La tendinitis (a veces escrita también "tendonitis") es un tipo de tendinopatía que a menudo se confunde con la tendinosis, más común, que presenta síntomas similares pero requiere un tratamiento diferente. La tendinosis, denominada a veces tendinitis crónica, tendinopatía crónica o lesión de tendón crónica, es la afección de un tendón a nivel celular (el sufijo "osis" implica una patología de degeneración crónica sin inflamación). Se cree que está causada por microdesgarros en el tejido conjuntivo dentro del tendón y alrededor del mismo, lo que lleva a un aumento de las células reparadoras del tendón.

Tendinopatía es un término general para una afección en el tendón a consecuencia de ejercicio excesivo, microdesgarros y degeneración del colágeno, que se manifiesta con inflamación, dolor y debilidad.

En una realización adicional, la invención se refiere a una composición según la invención, para uso en la prevención y/o tratamiento de lesión tendinosa en un mamífero, donde las células madre son células madre mesenquimales. En una realización adicional, la invención se refiere a una composición según la invención, para uso en la prevención y/o tratamiento de lesión tendinosa en un mamífero, donde el mamífero de carreras a tratar es un caballo.

En una realización adicional, la invención se refiere a una composición según la invención, para uso en la prevención y/o tratamiento de lesión tendinosa en un mamífero, siendo el tendón o tendones donde inyectar el tendón flexor digital profundo, el tendón flexor digital superficial o tejidos peritendinosos.

En una realización adicional, la invención se refiere a una composición según la invención, para uso en la prevención y/o tratamiento de lesión tendinosa en un mamífero, seleccionándose el ligamento o ligamentos donde inyectar entre uno o más del ligamento suspensorio, rama extensora del ligamento suspensorio, ligamento sesamoideo distal superficial, ligamento colateral lateral tarsocrural o tejidos periligamentosos.

En una realización adicional, la invención se refiere a una composición según la invención, para uso en la prevención y/o tratamiento de lesión tendinosa en un mamífero, donde el mamífero a tratar es un ser humano.

En una realización adicional, la invención se refiere a una composición según la invención, para uso en la prevención y/o tratamiento de lesión tendinosa en un mamífero, seleccionándose el tendón o tendones donde inyectar entre uno o más del tendón de Aquiles, tendón del bíceps, tendón patelar, tendón del cuádriceps o el tendón o tendones de la planta del pie o manguito rotador.

En una realización adicional, la invención se refiere a una composición según la invención, para uso en la prevención y/o tratamiento de lesión tendinosa en un mamífero, seleccionándose el ligamento o ligamentos donde inyectar entre uno o más del ligamento cruzado anterior, ligamento cruzado posterior, ligamento colateral o el ligamento o ligamentos de la planta del pie o manguito rotador.

En una realización adicional, la invención se refiere a una composición según la invención, para uso en la prevención y/o tratamiento de lesión tendinosa en un mamífero, donde el mamífero de compañía a tratar es un perro.

En una realización adicional, la invención se refiere a una composición según la invención, para uso en la prevención y/o tratamiento de lesión tendinosa en un mamífero, seleccionándose el tendón o tendones donde inyectar entre uno o más del tendón de la articulación del hombro, tendón de Aquiles o tendón del calcáneo común.

En una realización adicional, la invención se refiere a una composición según la invención, para uso en la prevención y/o tratamiento de lesión tendinosa en un mamífero, seleccionándose el ligamento o ligamentos donde inyectar entre uno o más del ligamento de la articulación del hombro, ligamento cruzado anterior o ligamento cruzado posterior. En otro aspecto, la invención se refiere a una composición según la invención, para uso en la prevención y/o tratamiento de artritis en un mamífero.

La artritis es un grupo de situaciones que implican daños en las articulaciones del organismo, es decir, dolor causado por inflamación y destrucción del cartílago. Hay más de 100 formas distintas de artritis. La forma más común, la osteoartritis (enfermedad articular degenerativa) es el resultado de traumatismos en la articulación, infección en la articulación o la edad. Otras formas de artritis son la artritis reumatoide, artritis psoriásica y enfermedades autoinmunitarias relacionadas. La artritis séptica está provocada por infección en la articulación. La osteoartritis (OA) es una enfermedad articular dolorosa y debilitante, sin cura conocida. Se caracteriza por calor, dolor, hinchazón, crepitación (una sensación o sonido de crujido, crepitación o fricción bajo de la piel) y una disminución del margen de movimiento en las articulaciones afectadas. En las personas afecta a las manos, las rodillas, las caderas, la columna dorsal y otras articulaciones. Los caballos padecen osteoartritis articular principalmente en las articulaciones del ataúd, cuartilla, menudillo, carpal y babilla, y su incidencia depende de la edad, el peso, la frecuencia y la naturaleza de la actividad física, así como de la raza.

La artritis reumatoide (AR) es un trastorno autoinmunitario crónico que afecta principalmente a las articulaciones. Lupus o lupus eritematoso es el nombre que se da a un conjunto de enfermedades autoinmunitarias en las cuales el sistema inmunológico humano se vuelve hiperactivo y ataca a tejidos, por ejemplo articulaciones, normales y sanos. La gota (también denominada podagra cuando afecta a la articulación de la base del dedo pulgar del pie) se caracteriza generalmente por ataques recurrentes de artritis inflamatoria: una articulación enrojecida, sensible, caliente e inflamada.

Con independencia del tipo de artritis, los síntomas comunes de todos los trastornos artríticos incluyen niveles variados de dolor, hinchazón, rigidez articular y, a veces, un dolor constante en torno a la o las articulaciones. La principal queja de las personas que padecen artritis es el dolor articular. El dolor suele ser constante y puede estar localizado en la articulación afectada. El dolor se produce en la artritis debido a la inflamación que se origina en torno a la articulación, daños en la articulación debidos a enfermedades, el desgaste diario de la articulación, distensiones musculares causadas por movimientos enérgicos contra articulaciones rígidas y dolorosas, y fatiga.

En otra realización, la invención se refiere a una composición según la invención, donde el mamífero se selecciona entre un ser humano, un mamífero de carreras o un mamífero de compañía.

En otra realización, la invención se refiere a una composición según la invención, donde la artritis se selecciona entre osteoartritis (OA), artritis reumatoide (enfermedad autoinmunitaria localizada con inflamación grave y destrucción del cartílago, así como articulaciones calientes, hinchadas y dolorosas), lupus (enfermedad autoinmunitaria generalizada con dolor articular e hinchazón) o gota (ataques con una articulación enrojecida, sensible, caliente e inflamada a causa de cristales de ácido úrico).

En otra realización, la invención se refiere a una composición según la invención, donde las células madre son células madre mesenquimales.

En otra realización, la invención se refiere a una composición según la invención, donde el mamífero de carreras a tratar es un caballo.

En otra realización, la invención se refiere a una composición según la invención, siendo la articulación o articulaciones donde inyectar una o más de la articulación del menudillo, ataúd, cuartilla, babilla y/o rodilla de las patas traseras.

En otra realización, la invención se refiere a una composición según la invención, donde el mamífero de compañía a tratar es un perro.

En otra realización, la invención se refiere a una composición según la invención, siendo la articulación o articulaciones donde inyectar una o más del codo de la pata delantera o la articulación de la rodilla o la cadera de las patas traseras.

En otra realización, la invención se refiere a una composición según la invención, donde el mamífero a tratar es un ser humano.

En otra realización, la invención se refiere a una composición según la invención, siendo la articulación o articulaciones donde inyectar una o más de las articulaciones de rodilla, cadera, codo, metacarpofalángicas e interfalángicas de manos y pies, la articulación sesamoidea y/o la articulación temporomandibular.

En un aspecto, la invención se refiere a una composición según la invención, para uso en la prevención y/o tratamiento de artropatía o enfermedad articular en un mamífero.

En un mamífero, artropatía es un término general para dolor y/o inestabilidad articular, siendo la más común de las artropatías la artritis causada por la inflamación de la membrana sinovial y la destrucción del cartílago.

En una realización, la invención se refiere a una composición según la invención, para uso en la prevención y/o tratamiento de artropatía en un mamífero, donde el mamífero se selecciona entre un ser humano, un mamífero de carreras o un mamífero de compañía.

En una realización, la invención se refiere a una composición según la invención, para uso en la prevención y/o tratamiento de artropatía en un mamífero, donde la artropatía se selecciona entre artropatía reactiva, artropatía enteropática, artropatía por cristales, artropatía diabética y/o artropatía neuropática.

En una realización, la invención se refiere a una composición según la invención, para uso en la prevención y/o tratamiento de artropatía en un mamífero, donde el mamífero de carreras a tratar es un caballo.

En una realización, la invención se refiere a una composición según la invención, para uso en la prevención y/o tratamiento de artropatía en un mamífero, siendo la articulación o articulaciones donde inyectar una o más del menudillo, ataúd, cuartilla, babilla y/o la articulación de la rodilla de las patas traseras.

En una realización, la invención se refiere a una composición según la invención, para uso en la prevención y/o tratamiento de artropatía en un mamífero, donde el mamífero a tratar es un ser humano.

En una realización, la invención se refiere a una composición según la invención, para uso en la prevención y/o tratamiento de artropatía en un mamífero, siendo la articulación o articulaciones donde inyectar una o más de la rodilla, cadera, codo, las articulaciones metacarpofalángicas e interfalángicas de manos y pies, la articulación sesamoidea y/o la articulación temporomandibular.

En una realización, la invención se refiere a una composición según la invención, para uso en la prevención y/o tratamiento de artropatía en un mamífero, donde el mamífero de compañía a tratar es un perro.

En una realización, la invención se refiere a una composición según la invención, para uso en la prevención y/o tratamiento de artropatía en un mamífero, siendo la articulación o articulaciones donde inyectar una o más del codo de la pata delantera o la articulación de la rodilla o cadera de las patas traseras.

En una realización de la invención, la composición de la invención se proporciona en una jeringa estéril preenvasada.

Preparación del hidrogel de poliacrilamida (GPAA)

El hidrogel se puede preparar de la manera que se describe en el documento WO 02/16453. En lo que sigue, se puede abreviar hidrogel de poliacrilamida a GPAA.

El hidrogel puede comprender cualquier realización del hidrogel descrito en los documentos WO 02/16453 y WO 2012/123385. Preferiblemente, el hidrogel comprende de 0,5 a 25 % en peso de poliacrilamida, basado en el peso total del hidrogel. El hidrogel comprende típicamente además al menos 75 % en peso de agua exenta de pirógenos o solución salina, preferiblemente agua exenta de pirógenos.

El hidrogel se puede obtener combinando acrilamida y monómeros reticulantes, iniciando la polimerización mediante iniciación radicálica; y lavando con agua libre de pirógenos o solución salina, siendo la combinación en cantidades y el lavado tales que proporcionan aproximadamente de 0,5 a 25 % en peso de poliacrilamida, basado en el peso total del hidrogel. El hidrogel así obtenido es bioestable y a la vez biocompatible, y no es reabsorbido por el organismo.

Típicamente, el hidrogel se obtiene combinando acrilamida y agente reticulante, por ejemplo N,N'-metilenbisacrilamida, en una relación molar de 150:1 a 1000:1. El agente reticulante, por ejemplo N,N'-metilenbisacrilamida, sirve para proporcionar reticulación entre cadenas poliméricas, y se puede variar su relación molar para proporcionar diversas densidades de reticulación del hidrogel. Las condiciones para obtener el hidrogel se pueden modificar en función de, por ejemplo, la naturaleza de la articulación, el tendón, el ligamento o el tejido en el cual se va a inyectar el hidrogel, por ejemplo. Las propiedades reológicas deseadas, tales como la elasticidad, pueden controlarse al menos en parte a través del contenido en peso de sólidos del hidrogel. El hidrogel de la invención comprende aproximadamente de 0,5 a 25 % en peso de poliacrilamida, basado en el peso total del hidrogel. En realizaciones adecuadas de la invención, el hidrogel comprende menos de 15 % en peso de poliacrilamida, basado en el peso total del hidrogel, preferiblemente menos de 10 % en peso, más preferiblemente menos de 7,5 % en peso, incluso más preferiblemente menos de 5 %, lo más preferiblemente menos de 3,5 % en peso de poliacrilamida, basado en el peso total del hidrogel. En una realización preferida, el hidrogel de la invención tiene un contenido en peso de sólidos de aproximadamente 0,5 a 20 % en peso de poliacrilamida, basado en el peso total del hidrogel, por ejemplo de aproximadamente 0,5 a 15 % en peso, por ejemplo de aproximadamente 0,5 a 10 % en peso, por ejemplo de aproximadamente 0,5 a 5 % en peso, por ejemplo de aproximadamente 1,0 a 5 % en peso, por ejemplo de aproximadamente 1,5 a 5 % en peso, por ejemplo de aproximadamente 2,0 a 5 % en peso, por ejemplo de aproximadamente 2,5 a 5 % en peso, por ejemplo de aproximadamente 3,0 a 5 % en peso, por ejemplo de aproximadamente 3,5 a 5 % en peso, por ejemplo de aproximadamente 4,0 a 5 % en peso, por ejemplo de aproximadamente 1,0 a 4,5 % en peso, por ejemplo de aproximadamente 1,5 a 4,5 % en peso, por ejemplo de aproximadamente 1,5 a 4 % en peso, por ejemplo de aproximadamente 1,5 a 3,5 %, por ejemplo de aproximadamente 2,0 a 3,5 % en peso, por ejemplo de aproximadamente 2,0 a 3,0 % en peso, por ejemplo de aproximadamente 2,2 a 2,8 % en peso. En una realización más preferida, el hidrogel de la invención tiene un contenido en peso de sólidos de aproximadamente 2,0 a 3,0 % en peso de poliacrilamida, basado en el peso total del hidrogel. En una realización aún más preferida, el hidrogel de la invención tiene un contenido en peso de sólidos de aproximadamente 2,2 a 2,8 % en peso de poliacrilamida, basado en el peso total del hidrogel. En el presente contexto se emplean indistintamente las expresiones "contenido en peso de sólidos" y "contenido de materia seca".

La combinación implica combinar los componentes reactivos acrilamida y agente reticulante, por ejemplo N,N'-metilenbisacrilamida, típicamente desgasificados y típicamente de una manera que minimice el contacto con el operario. Opcionalmente se pueden combinar previamente los componentes reactivos para formar una mezcla inerte. Una mezcla inerte es aquella en la que no se produce ninguna reacción química entre los reactivos componentes. La combinación implica combinar acrilamida, agente reticulante, por ejemplo N,N'-metilenbisacrilamida, y un componente iniciador radicálico para iniciar la polimerización. En una realización adecuada se combina una premezcla inerte de acrilamida, agente reticulante, por ejemplo N,N'-metilenbisacrilamida, y N,N,N',N'-tetrametilenetilendiamina (TEMED) con una solución de iniciador de persulfato de amonio (AMPS). No obstante, se pueden combinar los componentes de manera individual o como premezclas plurales alternativas.

Convenientemente, la acrilamida y el agente reticulante, por ejemplo N,N'-metilenbisacrilamida, se combinan en una relación molar de aproximadamente 150:1 a 1000:1, de manera típica de aproximadamente 150:1 a 900:1, con preferencia de aproximadamente 175:1 a 800:1, con mayor preferencia de aproximadamente 200:1 a 600:1, lo más preferiblemente de 250:1 a 600:1. Según se muestra en las Tablas 2 y 3, se pueden preparar de manera controlable hidrogeles con distinto contenido en peso de sólidos y propiedades reológicas. El hidrogel que tiene las características reológicas deseadas se ha obtenido combinando acrilamida y N,N'-metilenbisacrilamida en una proporción de aproximadamente 250:1, aproximadamente 260:1, aproximadamente 270:1, aproximadamente 280:1, aproximadamente 290:1, aproximadamente 300:1, aproximadamente 310:1, aproximadamente 320:1, aproximadamente 330:1, aproximadamente 340:1, aproximadamente 350:1, aproximadamente 360:1, aproximadamente 370:1, aproximadamente 380:1, aproximadamente 390:1, aproximadamente 400:1, aproximadamente 410:1, aproximadamente 420:1, aproximadamente 430:1, aproximadamente 440:1, aproximadamente 450:1, aproximadamente 460:1, aproximadamente 470:1, aproximadamente 480:1, aproximadamente 490:1 y aproximadamente 500:1.

En particular, en la realización donde se inyecta el hidrogel en una articulación, tendón o ligamento, la elasticidad del hidrogel presenta gran relevancia. El hidrogel de la invención tiene un módulo de elasticidad de 1 a 200 Pa, por ejemplo de aproximadamente 2 a 175 Pa, de manera típica de aproximadamente 5 a 150 Pa, por ejemplo de aproximadamente 10 a 100 Pa, por ejemplo de aproximadamente 20 a 100 Pa, por ejemplo de aproximadamente 30 a 100 Pa, por ejemplo de aproximadamente 40 a 100 Pa, por ejemplo de aproximadamente 50 a 100 Pa, por ejemplo de aproximadamente 50 a 95 Pa, por ejemplo de aproximadamente 55 a 95 Pa, por ejemplo de aproximadamente 55 a 90 Pa, por ejemplo de aproximadamente 15 a 95 Pa, por ejemplo de aproximadamente 20 a 85 Pa, por ejemplo de aproximadamente 25 a 80 Pa, por ejemplo de aproximadamente 30 a 75 Pa, por ejemplo de 30 a 65 Pa, por ejemplo de 30 a 55 Pa, por ejemplo de 30 a 58 Pa, por ejemplo de 33 a 55 Pa, por ejemplo de aproximadamente 35 a 70 Pa, por ejemplo de aproximadamente 40 a 65 Pa, por ejemplo de aproximadamente 45 a 60 Pa, por ejemplo de aproximadamente 50 a 55 Pa. En una realización aún más preferida, el hidrogel de la invención tiene un módulo de elasticidad de aproximadamente 33 a 55 Pa o de aproximadamente 55 a 90 Pa. Los expertos en la técnica sabrán cómo obtener un hidrogel con una elasticidad adecuada para el uso pretendido. Véanse también los ejemplos siguientes, que describen la preparación de hidrogeles con elasticidad baja, media y alta.

El módulo de elasticidad del GPAA tiene gran importancia en lo que respecta a la capacidad de las células madre para sobrevivir y dividirse. Es importante que el GPAA sea estable, física y químicamente, después de su formación. De hecho, los productos de degradación procedentes del proceso de polimerización (sulfato) se sitúan por debajo de 4 ppm y, una vez que el proceso de polimerización ha finalizado, el GPAA permanece física y químicamente estable, también después de haber sido inyectado en el tejido.

En el tejido, el gel también permanece química y físicamente estable, y no libera productos lixiviables, ya que no se degrada en absoluto en el tejido -es permanente. Por lo tanto, la degradabilidad del GPAA tras la inyección en un tejido es también un factor importante del hidrogel de la invención, a fin de asegurar el crecimiento estable de células madre. El hidrogel de GPAA no se degrada con el tiempo (es decir, es permanente) y permite el crecimiento de fibras y vasos hacia el interior del mismo. Es decir, el hidrogel de GPAA de la presente invención no se degrada, es de uso seguro y no es tóxico, es decir, no libera componentes tóxicos con el tiempo.

El hidrogel comprende al menos 75 % en peso de agua exenta de pirógenos o solución salina, preferiblemente agua exenta de pirógenos. En una realización adecuada de la invención, el hidrogel comprende al menos 80 % en peso de agua exenta de pirógenos o solución salina, preferiblemente al menos 85 %, más preferiblemente al menos 90 %, incluso más preferiblemente al menos 95 % en peso de agua exenta de pirógenos o solución salina.

Una solución salina adecuada tiene una osmolaridad similar a la del fluido intersticial. Las soluciones salinas adecuadas incluyen, pero sin limitación, el grupo que comprende cloruro de sodio acuoso al 0,25-1 %, una solución de Ringer-Lockart, una solución de Earle, una solución de Hanks, un medio de Eagle, una solución de glucosa al 0,25-1 %, una solución de cloruro de potasio y una solución de cloruro de calcio. En una realización preferida, la solución salina es una solución acuosa de cloruro de sodio al 0,8-1 %, por ejemplo una solución acuosa de cloruro de sodio al 0,8, 0,9 o 1 %, lo más preferiblemente cloruro de sodio acuoso aproximadamente al 0,9 %.

Como resultará obvio para el experto en la técnica, en la realización en la que se emplea solución salina para la preparación del GPAA y/o para el lavado del GPAA, el contenido en peso de sólidos del GPAA será mayor que la contribución realizada por la poliacrilamida, pero típicamente no más de un 1 % adicional.

En una realización particularmente adecuada de la invención, el hidrogel comprende aproximadamente 2,5 % en peso de poliacrilamida, basado en el peso total del hidrogel, y aproximadamente 97,5 % de agua exenta de pirógenos.

Se utiliza agua exenta de pirógenos o solución salina para lavar el hidrogel en un proceso de lavado. El proceso de lavado sirve, en parte, para eliminar por completo, salvo cantidades traza, los monómeros acrilamida y agente reticulante, por ejemplo N,N'-metilenbisacrilamida. Estos monómeros son tóxicos para el paciente y perjudiciales para la estabilidad del hidrogel. Preferiblemente, el proceso de lavado es tal que las concentraciones de los monómeros residuales acrilamida y agente reticulante, por ejemplo N,N'-metilenbisacrilamida, quedan por debajo de 50 ppm, más preferiblemente por debajo de 40 ppm, por ejemplo por debajo de 30 ppm, lo más preferiblemente por debajo de 20 ppm, típicamente por debajo de 10 ppm, de manera particularmente preferible por debajo de 5 ppm o incluso más preferiblemente por debajo de 1,5 ppm.

Agentes reticulantes

El hidrogel según la presente invención puede contener un agente reticulante seleccionado del grupo consistente en N,N'-metilenbisacrilamida, N,N'-etilenbisacrilamida, óxido etilenbis(oxietilen-nitril)tetraacético, ácido etilenbis(oxietilen-nitril)tetracético y mezclas de los mismos. En una realización, dicho agente reticulante se selecciona del grupo consistente en N,N'-metilenbisacrilamida, N,N'-etilenbisacrilamida y mezclas de las mismas. En una realización adicional, dicho agente reticulante es N,N'-metilenbisacrilamida.

Debe señalarse que las realizaciones y características que se describen en el contexto de uno de los aspectos de la presente invención también se aplican a los otros aspectos de la invención.

Se describirá ahora con más detalle la invención en los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos

Ejemplo 1: Preparación de hidrogel

Preparación de hidrogel:

El GPAA es un gel de poliacrilamida producido por polimerización de los monómeros acrilamida (AM) y N,N'-metilenbisacrilamida (bisAM). También se puede añadir a la mezcla N-hidroxietilacrilamida (HEA). El producto acabado puede tener diversos módulos de elasticidad.

El hidrogel contiene típicamente aproximadamente 95 % de agua. Se ha demostrado que la concentración de los monómeros residuales acrilamida y N,N'-metilenbisacrilamida tras el paso de proceso de lavado es inferior a 10 ppm y es adecuada para la estabilidad deseada del producto final, a menudo inferior a 5 ppm.

El producto acabado debe cumplir en lo que respecta al pH, ausencia de metales pesados, índice de refracción, estabilidad y ausencia de pirógenos, y debe ser estéril, prácticamente inerte y sustancialmente exento de monómeros. El pH del producto acabado es aproximadamente 7-9, por ejemplo preferiblemente 7,3-8,5, por ejemplo aproximadamente 8,2.

Preparación 1.1

La preparación sintética implica convenientemente las siguientes operaciones:

1. Se preparan dos mezclas, A1 y A2. A1 comprende agua, acrilamida, N,N'-metilenbisacrilamida, N,N,N',N'-tetrametilenetilendiamina (TEMED). A2 comprende agua y persulfato de amonio;

2. Se combinan las dos mezclas en la siguiente proporción: 1990 mL de A1 y 10 mL de A2, y se mantienen a 45 °C y se desgasifican con nitrógeno durante 20 segundos;

3. Se vierte la mezcla de reacción en varios vasos de precipitados de 100 mL;

4. Se deja que se produzca polimerización durante un período de 0,5 a 1,5 horas;

5. Se desmoldea el gel;

6. Se extraen los monómeros residuales y se equilibra en agua para inyección durante 92 horas, cambiando el agua varias veces, típicamente 8 veces en el transcurso de las 92 horas;

7. Se homogeneizan los geles purificados triturando con una rejilla de oscilación vertical;

8. Se llena una jeringa con el material de gel homogeneizado;

9. Se trata en autoclave la jeringa.

Un método típico para preparar el hidrogel se puede resumir de la manera siguiente:

Preparación 1.2

Resumen del procedimiento

Se prepara el gel mezclando una solución acuosa de monómeros de acrilamida (AM) y N,N'-metilenbisacrilamida (bisAM) en calidad de reticulante, con N,N,N',N'-tetrametilenetilendiamina (TEMED) como coiniciador y persulfato de amonio (AMPS) como iniciador por radicales libres (sistema redox). Al desgasificar una solución a granel con nitrógeno, comienza la polimerización. Después de la polimerización final, se transfiere el gel a un tanque de lavado con bandejas de malla sobre las que se coloca el gel. Durante el lavado con agua, el gel se hincha y los residuos de monómero resultan extraídos. Se vierte el gel hinchado en una unidad de llenado que introduce el gel en una jeringa, la cual se trata en autoclave. Se han preparado dos formulaciones alternativas, una en el extremo inferior de elasticidad y otra en el extremo superior de elasticidad.

Tabla 1

Lo anterior son preparaciones típicas del hidrogel y pueden ajustarse dentro de ciertos márgenes.

Como alternativa, se puede emplear la misma composición de materias primas tanto para el módulo de elasticidad del extremo inferior como para el del extremo superior, ya que también se pueden emplear las condiciones de reacción, en lugar de ajustar el contenido de materia seca, para conseguir diferencias en el módulo de elasticidad. Ambos métodos son adecuados en la presente invención.

Preparación 1.3

Formulaciones de poliacrilamida mediante un proceso de reticulación en línea

Un método particularmente interesante para preparar los hidrogeles de la invención implica un proceso de reticulación en línea. Se bombean a un mezclador estático dos flujos individuales y eventualmente desgasificados, siendo uno una premezcla de acrilamida, N,N'-metilenbisacrilamida (el reticulante) y TEMED, y el otro la solución de iniciador AMPS, para efectuar la mezcla, la iniciación química y la posterior extrusión aguas abajo hacia un reactor en tubería, hecho de teflón o de acero, en el cual se produce la polimerización. El lavado del gel se simplifica debido a la gran superficie específica del gel procedente del reactor.

Seleccionando las concentraciones de monómero, reticulante e iniciador, así como sus relaciones molares relativas, y regulando los dos caudales y las temperaturas de polimerización, es posible producir geles que varían en el grado de reticulación y en el contenido de sólidos.

Preparación 1.4

Se combinaron los reactivos en las proporciones descritas en las Tablas 2, 3 y 4, y se lavaron tal como se describe en las tablas (con agua exenta de pirógenos salvo que se indique otra cosa) para proporcionar formulaciones de baja, media y alta elasticidad. Se prepararon hidrogeles con contenidos en peso de sólidos entre 0,5 y 25 % de poliacrilamida.

Tabla 2: Parámetros de proceso y características del gel resultante: formulaciones de baja elasticidad

Tabla 2 (cont.)

a) el material era líquido, por lo que el lavado fue una dilución

b) infinita

c) dado que el lavado no fue una extracción sino una dilución, el monómero residual simplemente se redujo en el factor de dilución (de 508 ppm a 254 ppm)

d) el vaciado y el lavado se efectuaron utilizando solución acuosa de NaCl al 0,9 %

e) vaciado con agua; el lavado se efectuó utilizando solución acuosa de NaCl al 0,9 %

f) valores antes del lavado - el lavado reduce típicamente el valor en 30-55 %

g) valores antes del lavado - el lavado reduce típicamente el valor en 20-40 %

h) elevada sensibilidad a muesca

i) las variaciones en los valores pueden deberse a las técnicas con las que se efectúa la medición o a la ubicación dentro el lote del cual se toma la muestra

Tabla 3: Parámetros de proceso y características del gel resultante: formulaciones de elasticidad media

Tabla 4: Parámetros de proceso y características del gel resultante: formulaciones de alta elasticidad

Ejemplo 2: Experimentos in vitro

El Ejemplo 2 presenta datos de estudios in vitro acerca de la viabilidad, proliferación y migración de células madre mesenquimales a tejido tendinoso y si ello induce un cambio proinflamatorio en el fenotipo de las células madre. Ejemplo 2.1 - Preparación de células madre mesenquimales (CMM)

Fuente de CMM:

Se obtuvieron CMM derivadas de médula ósea equina (n = 3) a partir de médula ósea aspirada de caballos sometidos a tratamiento con células madre por lesiones tendinosas de las extremidades delanteras. De manera resumida, se sembró en matraces de plástico para cultivo celular la población de células mononucleares procedentes de la capa leucocitaria de 10 ml de aspirado de médula ósea, en medio D10 (medio de Eagle modificado por Dulbecco, DMEM, suplementado con suero fetal bovino (10 % v/v), penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 U/ml). Se expandió en cultivo la población de células madre adherentes a plástico, se separaron de la superficie de plástico y, entre los pases 0 y 2 (de P0 a P2), se resuspendieron las células en medio de crioalmacenamiento celular Bambanker™, y a continuación se las almacenó en nitrógeno líquido o bien a -80 °C hasta que se utilizaron para los experimentos. Para los experimentos descritos, con el fin de obtener las cantidades necesarias se expandieron en matraces de plástico, en medio D10, células de estas reservas congeladas. Para los experimentos se utilizaron células expandidas a entre P2 - 4. La multipotencia de las células preparadas mediante este método ha sido descrita con anterioridad por su capacidad de trilinaje, su morfología fibroblástica y el ensayo de unidades formadoras de colonias - fibroblastos (UFC-F) por Smith RK, Korda M, Blunn GW, Goodship Ae.

Ejemplo 2.2 - Preparación de CMM encapsuladas en GPAA, integridad y degradación

Fuente de GPAA:

Los GPAA fueron proporcionados por Contura International A/S, Dinamarca, suministrados en forma de jeringas estériles preenvasadas, de 1 ml (gel Arthramid®). Se preparó el GPAA tal como se describe en el Ejemplo 2. Se extruyó el gel en placas de cultivo estériles y se añadió al gel un volumen específico de suspensión celular (40 pL que comprendían aproximadamente 500 células). Ello origina la expansión del polímero a medida que el líquido es absorbido y se distribuye por el polímero. Esto fue necesario para aumentar el volumen del gel Arthramid® con el fin de resuspender eficazmente las células en el seno de una gota. Se pipetearon aproximadamente 50 gl de polímero Arthramid® directamente sobre la superficie de cultivo de tejido deseada (es decir, la placa de cultivo) seguido de la adición de 40 gl, que comprendían aproximadamente 500 células, de suspensión de células CMM para los experimentos de viabilidad. Se obtuvieron así como resultado CMM encapsuladas en GPAA.

Integridad y degradación de GPAA:

Se investigaron mediante inspección visual la integridad y la degradación del GPAA, y los resultados se muestran en la Figura 1a. Desde las jeringas estériles (gel Arthramid®) se extruyó GPAA para formar perlas, con las cuales se investigó. Las perlas tienen aproximadamente 5 mm de diámetro: A) se muestran las perlas de GPAA 5 minutos después de haber extruido el GPAA desde la jeringa, para demostrar su resistencia física y su claridad; B) se muestran, transcurridos 5 días en una incubadora de cultivo de tejidos, perlas de GPAA que habían sido dispuestas en medio D10; C) se muestran, después de 10 días en una incubadora de cultivo de tejidos (es decir, una incubadora de cultivo celular con una atmósfera humidificada de 5 % de CO² en aire, a 37 °C) perlas de GPAA que habían sido dispuestas en medio D10. Se observó que las perlas de GPAA permanecieron físicamente intactas durante los primeros 5 días y después se desintegraron lentamente, como se puede apreciar en la diferencia de su aspecto físico entre los días 5 y 10, donde pasan de una superficie definida de manera lisa a una que estaba más rizada en los bordes. A los 10 días, las perlas de polímero GPAA tenían filamentos de polímero que aparecían como finas extensiones en forma de hebras, detectables alrededor de la perla, y como filamentos libres en el medio de cultivo durante toda la duración del experimento. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que se observó un pequeño grado de formación de filamentos (signo de desintegración) bajo microscopía óptica de baja potencia transcurridas tan solo 24 h de cultivo. Esto está demostrado en la Figura 1b, que muestra una imagen mediante microscopio de campo claro de baja potencia, de una perla de GPAA con CMM encapsuladas, al cabo de 24 h de cultivo. El microscopio de campo claro era un Olympus CX41. Se han marcado con flechas ejemplos de finos filamentos del polímero que se alejan del borde de la perla, situada a la izquierda de la imagen. Estos aumentaron con el tiempo de cultivo. Las CMM aparecen como manchas oscuras dentro del GPAA.

Ejemplo 2.3 - Viabilidad, proliferación y respuesta proinflamatoria de CMM en GPAA

Viabilidad de CMM encapsuladas en GPAA:

Se investigó la viabilidad de CMM encapsuladas en GPAA en comparación con testigo, y en la Figura 2a se muestran los resultados. La figura muestra CMM resuspendidas en D10 solamente (DMEM, curva superior, experimento testigo) o encapsuladas en perlas de GPAA dispuestas en medio D10 (Arthramid, curva inferior) analizadas en cuanto a viabilidad (ensayo vivo/muerto) a lo largo de 12 horas en cultivo, es decir, tiempo frente a % de viabilidad celular (datos no mostrados). Se cuantificó el tanto por ciento de células vivas utilizando un colorante de vitalidad celular (ensayo vivo/muerto) en los puntos temporales indicados. El ensayo vivo/muerto con tinte de vitalidad celular implica agregar un volumen igual de suspensión celular a tinte azul tripán (al 0,4 %) y contar las células bajo el microscopio empleando un hematocitómetro. Los volúmenes habituales son 50 gL de suspensión celular y 50 gL de azul tripán. No se pudieron realizar ensayos de viabilidad utilizando este método en perlas de más de 12 h, ya que los cambios en el polímero en desintegración inhibían la fluorescencia del tinte de vitalidad celular durante la microscopía. Hubo una disminución pequeña (aproximadamente de 5 %) pero significativa en la viabilidad de las células en GPAA en comparación con las células suspendidas en D10 (p <0,001) inmediatamente después de que se suspendieran las células en el GPAA (tiempo 0 minutos). Sin embargo, no se produjo disminución adicional en la viabilidad a lo largo del período de 12 h, permaneciendo viables en el GPAA aproximadamente 90 % de las células.

Proliferación de CMM en GPAA:

La Figura 2b muestra los resultados de la proliferación de CMM en GPAA evaluada utilizando el ensayo con alamarBlue®. Se cultivaron en medio D10 perlas de GPAA que contenían 5000 CMM, y se llevó a cabo el ensayo de proliferación en los días 1 a 5 con el fin de cuantificar el incremento en el número de células dentro de las perlas. La proliferación de las CMM mostró un incremento exponencial en el número de células a lo largo de los 5 días, lo que sugería una capacidad no inhibida de las células para dividirse en el GPAA. Esta tasa de proliferación es comparable a la observada en plástico para cultivo de tejidos.

La Figura 3a muestra lecturas de un ensayo de proliferación de CMM encapsuladas en GPAA. Estos ensayos se realizaron utilizando células procedentes de distintos caballos (dos caballos de este ejemplo son Kiraca y Curacao). Los datos son lecturas de un lector de placas por fluorescencia (fluorímetro Infinite M200 PRO, Tecan, Reino Unido) a partir de las cuales se construyó la curva de proliferación. La proliferación aumentó hasta el día 3, pasado el cual el número de células se hizo demasiado grande (confluente) en la placa de cultivo y la concentración de tinte de proliferación alcanzó la saturación y no podía leerse con precisión (día 4 y día 7; no se muestran los datos del día 7). Sorprendentemente, los resultados demostraron que las CMM proliferan de manera no inhibida en GPAA.

Inducción de IL-1@ en CMM

Transcurridos 7 días no se pudo detectar IL-1 p en el medio de cultivo de perlas con contenido de CMM (10 perlas cargadas con 35.000 células cada una, en 1 ml de D10), lo que indica sorprendentemente que el GPAA no estimula respuesta proinflamatoria en las CMM suspendidas.

Ejemplo 2.4 - Capacidad de migración de CMM encapsuladas en GPAA a la matriz tendinosa

La Figura 3b muestra la capacidad de migración de CMM encapsuladas en GPAA a la matriz tendinosa.

A) Se prepararon matrices de tendón nativo no viable (MTNN) a partir de un tendón flexor digital profundo de un caballo, seccionando pequeños cortes (2 cm de largo por 1 cm de ancho por 2 mm de espesor). Después se sometieron repetidamente estos cortes a ciclos de congelación-descongelación para matar todas las células endógenas. Se pueden ver los cortes de MTNN dispuestos dentro de un pocillo de una placa de pocillos múltiples para cultivo de tejidos, con dos perlas de GPAA (geles) encima de cada corte. Hay dos placas de pocillos múltiples para cultivo de tejidos; una a la izquierda en A y otra a la derecha, y cada una contiene 2 cortes con perlas de GPAA encima de cada uno. Estas perlas contenían CMM marcadas con el tinte celular de fluorescencia verde SPDiOC18. Después se cubrieron con medio D10 los cortes de tejido con las perlas, y se cultivaron conjuntamente durante 5 días al objeto de evaluar la capacidad de las células encapsuladas en GPAA para migrar a la matriz tendinosa, antes de visualizarlo con un microscopio fluorescente.

B) Imágenes de microscopía fluorescente de los cortes de tendón después de haber eliminado de la superficie de los cortes de tendón los restos de perlas de GPAA. Se observó que las células viables con marca fluorescente (flechas que marcan la señal fluorescente (aparece aquí como una señal blanca, ya que las figuras están en blanco y negro)) se habían adherido a la matriz tendinosa a los 5 días. Debido a la desintegración de las perlas a los 5 días, no se puede concluir si la presencia de células en las MTNN se debe a que han migrado fuera de las perlas de GPAA o a que han sido liberadas cuando la perla se ha desintegrado. En cualquier caso, el resultado demuestra que no se ha inhibido la adherencia de las células a la matriz extracelular del tendón después de haber sido encapsuladas dentro del hidrogel de GPAA. La matriz tendinosa presenta una fluorescencia de base que se aprecia como un fondo blanco más claro.

C) Este corte de tendón es similar a B, con el fin de mostrar glóbulos blancos viables (CMM marcadas), pero además se ha teñido con tinte de yoduro de propidio el corte de tendón para mostrar células muertas. La mayoría de las células muertas eran los tenocitos residentes no viables, que pueden reconocerse alineados en filas dentro de la matriz tendinosa.

Resumen y conclusiones de los resultados in vitro

Los resultados de los experimentos discutidos más arriba en el Ejemplo 2 demuestran sorprendentemente que las células madre mesenquimales equinas permanecen viables, proliferan y migran cuando se utiliza GPAA como andamio en tejido tendinoso equino. A la vista de los niveles indetectables de IL-1 p, el gel no induce respuesta proinflamatoria. Por consiguiente, se puede emplear GPAA como andamio en la reparación de tendinopatías.

Ejemplo 3: experimentos in vivo

El Ejemplo 3 presenta datos de un ensayo clínico sobre la seguridad de la administración de GPAA en las estructuras anatómicas frecuentemente afectadas por tendinopatías naturales en los caballos. Se efectuó además una inyección en la articulación metacarpofalángica con CMM vehiculadas respectivamente en plasma o en GPAA. Ejemplo 3.1: Seguridad de la inyección de GPAA demostrada en un ensayo clínico

El gel de GPAA fue proporcionado en forma de jeringa preenvasada de manera estéril con 1 ml de GPAA, provista de un conector Luer para agujas hipodérmicas. En el ensayo clínico se emplearon caballos normales sin anomalías ortopédicas ni cojera. Antes de la administración se examinó ecográficamente la zona que iba a recibir el implante. Se administró una dosis de GPAA, tal como había sido proporcionado por el fabricante, en el núcleo central de las siguientes estructuras anatómicas:

1. Tercio medio del tendón flexor digital superficial (TFDS)

2. Tercio medio del tendón flexor digital profundo (TFDP)

3. Ligamento accesorio del tendón flexor digital profundo (LATFDP)

4. Origen del ligamento suspensorio (OLS)

5. Rama lateral del ligamento suspensorio (RL), 1 cm proximal a la articulación metacarpofalángica.

Se incluyeron en total n = 3 de cada estructura, realizándose en conjunto 18 inyecciones. Se emplearon como máximo 2 estructuras en cada caballo experimental, utilizando en cada estructura una extremidad diferente de cada caballo.

Se preparó de manera aséptica la ubicación anatómica sobre el lugar de la inyección. Se sedó ligeramente al caballo y se le sujetó. Antes de la administración se realizó anestesia local del nervio palmar lateral o de un anillo lateral proximal al lugar de inyección. La inyección se llevó a cabo con una aguja hipodérmica 20 G de 1,5 cm, guiándose por ecografía. En cada inyección se administraron 0,5 ml del GPAA. Se colocó un vendaje acolchado en la extremidad distal, que se retiraba en el momento de cada examen. Se mantuvieron los vendajes hasta el día 3 después del implante.

La monitorización de cada paciente incluyó la temperatura rectal, contorno de la extremidad, palpación de la zona de inyección y presencia de cojera al caminar. Se midieron la hematología y el fibrinógeno antes de la inyección y los días 3 y 7 después de la inyección. Los exámenes se completaron a las 3 horas y a las 12 horas, y después diariamente hasta 7 días tras la administración. Cada día después de la administración, hasta el día 7, se realizó un examen ecográfico del lugar de la inyección. En caso de obtener una imagen de lesión o una imagen hipoecoica o anecoica, se repitió el examen ecográfico cada 7 días hasta recuperar la normalidad.

Una fase final incluirá el seguimiento de una combinación de GPAA-CMM. Esta preparación final empleará pertecnetato de tecnecio99m y oxima de hexametilpropilenamina (Tc99m-OHMPA) para marcar las CMM, y realizará un seguimiento de la posición de las células después de utilizar GPAA como andamio en inyección intratendinosa en 3 caballos normales. Esta parte final del protocolo no ha sido completada.

En todas las estructuras tendinosas o ligamentosas la inyección fue difícil debido a la dureza del tejido normal. Durante la monitorización ecográfica, el gel comenzó a ser visible como una imagen hipoecoica, mezclada con aire introducido por la aguja. Cuando se habían inyectado en torno a 0,2-0,3 ml, comenzó a poderse ver gel fuera del núcleo del tendón. En las estructuras de menor sección, por ejemplo el TFDS o la RL, no se pudieron retener en el núcleo más de 0,2 ml.

Aunque no se produjo cojera después de la inyección ni se encontró inflamación acusada ni infección, en todos los casos se podía ver, transcurridas 3 h, una pequeña hinchazón sobre el lugar de inyección (Figura 4a). Esta hinchazón permaneció visible durante todo el tiempo durante el cual se examinaron las extremidades, en algunos casos hasta 21 días. Existió dolor profundo en el lugar de la inyección durante un período de 2 a 5 días.

La Figura 4 muestra el aspecto externo, 14 días después de la inyección, de una extremidad en la cual el tendón flexor digital profundo había recibido la inyección. A: vista de toda la extremidad distal. B: detalle del lugar de inyección. Se podía apreciar la hinchazón (flechas blancas) tanto en el aspecto palmar como en los aspectos laterales.

Ecográficamente, el GPAA no era visible al cabo de 3 horas, ni en el interior del tendón ni en el tejido blando que rodea al tendón (Figura 4b). La Figura 4b muestra una imagen ecográfica del caso correspondiente a la Figura 4a. Estructuras tendinosas flexoras de la región metacarpiana media. A: imagen correspondiente al momento inmediatamente posterior a la inyección intratendinosa. Es visible el aire después de la introducción del GPAA. B: la zona de inyección 24 h después de la inyección. No se aprecia imagen hipoecoica del GPAA, a pesar de la hinchazón presente.

Conclusiones del ensayo clínico

El uso de GPAA es seguro cuando se administra en tendones equinos normales, puesto que en 18 casos no se ha asociado con el tratamiento infección, reacción adversa ni cojera. No ha sido posible evaluar la cantidad de gel que permanecía dentro del tendón. Durante la inyección, el aspecto ecográfico hipoecoico del gel desapareció de la imagen, posiblemente debido, al menos en parte, a la presión que había que ejercer con la sonda ultrasónica sobre el lugar de inyección.

Solo se puede retener un pequeño volumen de gel en el núcleo del tendón. A partir de 0,1 ml de gel, comienzan a verse imágenes del aire y del gel fuera del tendón. No se sabe si la presión de la sonda ecográfica puede haber reducido el volumen de GPAA que pudiera contener un tendón normal. Se imitó el protocolo aceptado que se utiliza en casos clínicos para el tratamiento intralesional de tendinopatías.

Debe señalarse que un tendón normal proporciona un tejido homogéneo y muy fibroso, en el cual es bastante difícil realizar una inyección. Además, el GPAA tiene una viscosidad y densidad elevadas. No obstante, debe señalarse que las lesiones tendinosas presentan menor resistencia a la inyección.

La pequeña hinchazón que permaneció en la zona de la inyección durante 3 semanas constituye un resultado no cosmético para la mayoría de los pacientes equinos. El examen ecográfico no reveló ninguna imagen hipoecoica y la hinchazón desaparecía bajo la presión de la sonda ecográfica. Puede ser causado por el gel que permanece en el área peritendinosa y que resulta desplazado transitoriamente durante el examen ecográfico. El engrosamiento bajo la piel también podría ser causado por inflamación y reacción fibrosa provocadas por el GPAA.

Ejemplo 3.2 - Distribución de CMM después del implante en la articulación de un caballo

CMM vehiculadas en plasma y en GPAA:

La Figura 5a muestra una comparación de la distribución de CMM vehiculadas en plasma y en GPAA dentro de la articulación de un caballo.

Proyección lateral de gammaescintigrafía plana de una articulación metacarpofalángica 1 hora después del implante de CMM marcadas con Tc99-OHMPA. Las células se implantaron vehiculadas en plasma (CMM) (lado izquierdo de la figura) y en GPAA en calidad de andamio (CMM-GPAA) (lado derecho de la figura). Las CMM permanecen concentradas en el lugar de inyección; sin embargo, el uso de GPAA en calidad de andamio permite una distribución más uniforme de las células dentro de la articulación.

Resumen de resultados del estudio in vitro y el estudio in vivo - Ejemplos 2 y 3

El estudio in vitro realizado ha demostrado el uso de GPAA como andamio para CMM en caballos. El GPAA conserva sorprendentemente la viabilidad y la migración de las CMM, y se produce su injerto en la matriz tendinosa. También de manera sorprendente, y asimismo importante, no se produce respuesta inflamatoria modulada por IL-1 p ya que esta era indetectable en investigaciones preliminares.

Además, el uso de GPAA es seguro cuando se administra en tendones equinos normales, ya que en 18 casos no se asociaron con el tratamiento infecciones, reacciones adversas ni cojera. Asimismo, el uso de GPAA como andamio para las CMM en caballos permite una distribución más uniforme de las células dentro de la articulación.

Ejemplo 3.3 - Ensayo clínico - CMM después del implante en la articulación de caballos con lesión tendinosa De acuerdo con la presente invención, 3 casos de caballos con tendinopatía bilateral de origen natural (total de articulaciones tratadas n = 6) recibirán el implante de 10 millones de CMM alogénicas en ambas articulaciones. CMM en una extremidad y CMM-GPAA contralateralmente. El implante está constituido por CMM marcadas con Tc99-OHMPA, con y sin GPAA. Se realizará escintigrafía nuclear a las 0 h, 1 h, 3 h, 6 h, 12 h, 24 h y 36 h para comparar la distribución y retención en cada tratamiento. Se evaluará a los caballos en cuanto los mismos cambios en las características físicas que se han tratado en el Ejemplo 3.1 - Seguridad de la inyección de GPAA demostrada en un ensayo clínico. Además, el objetivo será evaluar si mejora la cojera y/o la renguera y si el tratamiento con CMM con o sin GPAA es físicamente tolerable para las articulaciones de los caballos. El seguimiento se realizará después de 1 semana, 2 semanas, 1 mes, 3 meses, 6 meses, 24 meses, 36 meses y 48 meses.

Tabla 5

Resultados del ensayo clínico en caballos con tendinopatía bilateral

Al puntuar el parámetro "físicamente tolerable" en la Tabla 5, el veterinario observará los mismos parámetros que se han medido y presentado en el Ejemplo 3.1. Esto significa que el veterinario controlará la temperatura rectal, el contorno de la extremidad, la palpación del área de inyección y la presencia de cojera de los caballos al caminar. Se medirán la hematología y el fibrinógeno antes de la inyección y los días 3 y 7 después de la inyección. Si todos los parámetros son aceptables, se obtiene una puntuación de "sí". El veterinario evaluará mediante inspección visual la mejora en las articulaciones (menos renguera/nada de cojera).

Referencias

Smith RK, Korda M, Blunn GW, Goodship AE. Isolation and implantation of autologous equine mesenchymal stem cells from bone marrow into the superficial digital flexor tendon as a potential novel treatment (Aislamiento e implante de células madre mesenquimales equinas autólogas de médula ósea en el tendón flexor digital superficial como posible nuevo tratamiento). Equine Vet J 2003; 35:99-102.

Narins R.S. y Schmidt R., "Polyacrylamide Hydrogel Differences: Getting rid of the confusion" (Diferencias entre los hidrogeles de poliacrilamida: deshacer la confusión), Journal of Drugs in Dermatology, vol. 10, núm. 12, diciembre de 2011, pág. 1370.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende células madre, un medio de cultivo celular y un hidrogel de poliacrilamida (GPAA), donde el GPAA contiene menos de 0,02 % pmonómero/pGPAA total] de una cadena lateral de N-hidroxietilacrilamida (HEA), y donde las células madre son células madre mesenquimales y donde el módulo de elasticidad del GPAA vale de 1 a 200 Pa.

2. La composición según la reivindicación 1, donde el GPAA no contiene una cadena lateral de HEA.

3. La composición según la reivindicación 1 o 2, donde el GPAA tiene un módulo de elasticidad de 5 a 150 Pa.

4. La composición según las reivindicaciones 1 -3, donde el GPAA tiene un contenido de materia seca de 0,5 a 25 %.

5. Un procedimiento para preparar la composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende los pasos de:

i. proporcionar células madre, un medio de cultivo celular y un hidrogel de poliacrilamida (GPAA), donde el GPAA contiene menos de 0,02 % pmonómero/pGPAA total] de una cadena lateral de N-hidroxietilacrilamida (HEA),

donde las células madre son células madre mesenquimales

ii. mezclar los componentes de i) consiguiendo así la composición.

6. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, para uso en medicina.

7. La composición para uso según la reivindicación 6, donde la composición se administra por inyección.

8. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para uso en la prevención y/o tratamiento de lesión tendinosa en un mamífero.

9. La composición para uso según la reivindicación 8, donde el mamífero se selecciona entre un ser humano, un mamífero de carreras o un mamífero de compañía.

10. La composición para uso según la reivindicación 8 o 9, donde la lesión tendinosa se selecciona entre una o más de traumatismo, rotura, desgarro o inflamación ulcerosa.

11. La composición para uso según la reivindicación 8 o 9, donde la lesión tendinosa se selecciona entre una o más de tendinitis, tendinosis o tendinopatía.

12. La composición para uso según la reivindicación 9-11, donde el mamífero de carreras a tratar es un caballo o el mamífero a tratar es un ser humano o el mamífero de compañía a tratar es un perro.

13. La composición para uso según cualquiera de las reivindicaciones 8-12, donde la composición se administra por inyección.