ES2876410T3

ES2876410T3 - Métodos para diferenciar accidente cerebrovascular isquémico de accidente cerebrovascular hemorrágico

Info

Publication number: ES2876410T3
Application number: ES15804521T
Authority: ES
Inventors: Villalonga Joan Montaner; Sebastià Víctor Llombart
Original assignee: Fundacio Hospital Universitari Vall dHebron Institut de Recerca FIR VHIR
Current assignee: Fundacio Hospital Universitari Vall dHebron Institut de Recerca FIR VHIR
Priority date: 2014-12-03
Filing date: 2015-12-03
Publication date: 2021-11-12
Anticipated expiration: 2035-12-03
Also published as: EP3227688A1; WO2016087611A1; CA2969568A1; EP3227688B1; US10520513B2; US20170269104A1; EP3029466A1; CA2969568C

Abstract

Método in vitro para diferenciar accidente cerebrovascular isquémico de accidente cerebrovascular hemorrágico en un paciente, que comprende a) determinar el nivel de proteína ácida fibrilar glial (GFAP) en una muestra de dicho paciente, en el que dicha muestra es una muestra de suero, plasma o sangre, en combinación con el nivel de uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en polipéptido medio de neurofilamentos (NEF3), b-sinucleína, proteína 1 que contiene dominio de ATP-Grasp (CARNS1) y proteína 4 de unión a retinol (RBP4) y b) comparar dichos niveles con un valor de referencia correspondiente en el que un nivel de GFAP en dicha muestra inferior al valor de referencia correspondiente y un nivel de NEF3, b-sinucleína, CARNS1 y/o RBP4 superior al valor de referencia correspondiente es indicativo de que el paciente padece accidente cerebrovascular isquémico o en el que un nivel de GFAP en dicha muestra superior al valor de referencia y un nivel de NEF3, b-sinucleína, CARNS1 y/o RBP4 inferior al valor de referencia correspondiente es indicativo de que el paciente padece accidente cerebrovascular hemorrágico.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para diferenciar accidente cerebrovascular isquémico de accidente cerebrovascular hemorrágico

Campo técnico de la invención

La invención está relacionada con el campo del diagnóstico, en particular con un método para diferenciar accidente cerebrovascular isquémico de accidente cerebrovascular hemorrágico.

Antecedentes de la invención

El accidente cerebrovascular sigue siendo una de las afecciones neurológicas más importantes. Representa la segunda causa principal de muerte prevenible en todo el mundo y una causa principal de deterioro de la productividad. Los dos subtipos principales de accidente cerebrovascular son accidente cerebrovascular isquémico (IS) y hemorragia intracerebral (ICH), también denominado accidente cerebrovascular hemorrágico. Más del 80-85 % de todos los accidentes cerebrovasculares son IS provocados por una oclusión de la arteria cerebral, mientras que el 15-20% restante son ICH que aparecen debido a una rotura arterial. Los pacientes que padecen ICH presentan un peor desenlace con una mortalidad después de 30 días desde el inicio de los síntomas del 37-38 %, en contraste con los pacientes con IS que tienen una mortalidad a los 30 días de solo el 8-12 %.

Una diferenciación precisa de ambos subtipos es crítica durante la fase aguda para prescribir el protocolo de tratamiento más adecuado, que es específico y ampliamente diferente entre IS e ICH. La terapia primaria recomendada para IS aguda es trombólisis con activador de plasminógeno tisular recombinante (r-tPA), una serina proteasa que lisa el coágulo que ocluye la arteria cerebral. La trombólisis tiene una ventana de tiempo terapéutico estrecha de solo 4,5 h desde el inicio de los síntomas, por lo tanto, una identificación rápida de IS podría permitir una recanalización temprana que conduzca a una recuperación del tejido de la penumbra y, por lo tanto, mejore el desenlace clínico. Por el contrario, los pacientes con ICH aguda pueden controlarse reduciendo la tensión arterial para retrasar el crecimiento del hematoma o para evitar la aparición de edema y hemorragias recurrentes. Algunos pacientes con ICH presentan anomalías hemostáticas subyacentes que pueden deberse a la ingesta de anticoagulante oral (OAC), a una deficiencia de factores de coagulación adquirida o congénita o a un número o funcionalidad de plaquetas anómalo. En todos estos casos, es necesario restablecer la homeostasis corrigiendo la dosis de OAC o reemplazando el factor de coagulación o plaquetas ausentes.

Hoy en día, el diagnóstico del subtipo de accidente cerebrovascular se basa principalmente en datos de obtención de imágenes del cerebro mediante tomografía computarizada (TC) u obtención de imágenes por resonancia magnética (IRM). Desafortunadamente, a pesar de ser altamente sensibles, las exploraciones por IRM y TC rara vez están disponibles, no pueden usarse repetidamente en el hospital primario debido a la falta de recursos y pueden estar sujetas a errores o incertidumbre si el personal médico que realiza y/o interpreta la exploración no tiene experiencia o está inadecuadamente formado.

Varios documentos describen el uso de biomarcadores para llevar a cabo una diferenciación rápida de subtipos de accidente cerebrovascular, tales como el documento WO2012036892 que da a conocer la determinación de proteínas tales como la preproteína apolipoproteína A-I, preproteína apolipoproteína A-II, preproteína apolipoproteína A-IV, precursor de apolipoproteína B, precursor de apolipoproteína C-I, precursor de apolipoproteína C-II, precursor de apolipoproteína C-III, precursor de apolipoproteína D, precursor de apolipoproteína E y precursor de apolipoproteína H.

Kavalci C. et al (Bratisl. Lek.Listy 3011; 112) dan a conocer el uso de la combinación de biomarcadores plasmáticos tales como BNP, dímero D, MMP9 y S100b para el diagnóstico diferencial de accidente cerebrovascular isquémico o hemorrágico.

El documento WO2005/029087 A1 da a conocer un método para diferenciar accidente cerebrovascular hemorrágico intracerebral de otras formas de accidente cerebrovascular. Para este propósito, se determina el nivel de GFAP y se considera que altos niveles de GFAP son indicativos de accidente cerebrovascular hemorrágico. El documento WO2003/016910 A1 o Foerch C. et al., 2011, Clinical Chemistry, 58(1): 237-245 también dan a conocer que GFAP es un marcador usado para diferenciar accidente cerebrovascular isquémico de accidente cerebrovascular hemorrágico. En particular, el documento WO2003/016910 A1 da a conocer un método para diferenciar accidente cerebrovascular isquémico de accidente cerebrovascular hemorrágico en un sujeto, basándose en la cantidad de uno o más marcadores tales como GFAP, IL-6, IL-8 o neurotrofina-3, en una muestra de prueba.

El documento US 2005/181386 A1 describe kits para medir GFAP y su uso en la diferenciación de accidente cerebrovascular isquémico de accidente cerebrovascular hemorrágico. El documento WO2005/106038A2 da a conocer además un kit que comprende anticuerpos para beta-sinucleína y GFAP. Ingelsson E. et al., 2009, Atherosclerosis, 206(1): 239-244 describen la detección de RBP4 en suero usando un kit de ELISA.

Sasaki M. Am. et al., 2010, Metabolism, clinical and experimental, 59(4): 527-532, dan a conocer que niveles elevados de RBP4 son un marcador de arteriosclerosis en pacientes con infarto cerebral.

El dr. K. E. Jie ha descrito un resumen de pruebas de diagnóstico diferencial para subtipos de accidente cerebrovascular, que resalta las debilidades de los estudios (www.bestbets.org/bets/bet.php?id=2251).

Por lo tanto, existe la necesidad en la técnica de una prueba alternativa rápida basada en biomarcadores para superar las limitaciones de los métodos divulgados en la técnica y de que pueda acelerarse el proceso de diagnóstico del subtipo de accidente cerebrovascular y acortar el inicio del tratamiento agudo.

Sumario de la invención

En un aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para diferenciar accidente cerebrovascular isquémico de accidente cerebrovascular hemorrágico en un paciente, que comprende

a) determinar el nivel de proteína ácida fibrilar glial (GFAP) en una muestra de dicho paciente, en el que dicha muestra es una muestra de suero, plasma o sangre, en combinación con el nivel de uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en polipéptido medio de neurofilamentos (NEF3), p-sinucleína, proteína 1 que contiene dominio de ATP-Grasp (CARNS1) y proteína 4 de unión a retinol (RBP4) y

b) comparar dichos niveles con un valor de referencia correspondiente

en el que un nivel de GFAP en dicha muestra inferior al valor de referencia correspondiente y un nivel de NEF3, psinucleína, CARNS1 y/o RBP4 superior al valor de referencia correspondiente es indicativo de que el paciente padece accidente cerebrovascular isquémico o en el que un nivel de GFAP en dicha muestra superior al valor de referencia y un nivel de NEF3, p-sinucleína, CARNS1 y/o RBP4 inferior al valor de referencia correspondiente es indicativo de que el paciente padece accidente cerebrovascular hemorrágico.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para seleccionar un paciente que padece accidente cerebrovascular para una terapia con un agente antitrombótico o con un agente capaz de reducir la tensión arterial que comprende

a) determinar el nivel de GFAP en una muestra de dicho paciente, en el que dicha muestra es una muestra de suero, plasma o sangre, en combinación con el nivel de uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en NEF3, p-sinucleína, CARNS1 y RBP4 y

b) comparar dichos niveles con un valor de referencia correspondiente en el que un nivel de GFAP en dicha muestra inferior al valor de referencia correspondiente y un nivel de NEF3, p-sinucleína, CARNS1 y/o RBP4 superior al valor de referencia correspondiente es indicativo de que el paciente es un candidato para una terapia con un agente trombolítico o

en el que un nivel de GFAP en dicha muestra superior al valor de referencia y un nivel de NEF3, p-sinucleína, CARNS1 y/o RBP4 inferior al valor de referencia correspondiente es indicativo de que el paciente es un candidato para una terapia con un agente capaz de reducir la tensión arterial.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un kit para diferenciar accidente cerebrovascular isquémico de accidente cerebrovascular hemorrágico o para seleccionar un paciente que padece accidente cerebrovascular para una terapia con un agente antitrombótico o con un agente capaz de reducir la tensión arterial, en el que el kit comprende un primer reactivo para detectar el nivel de GFAP y al menos un segundo reactivo para detectar el nivel de al menos un segundo marcador seleccionado del grupo que consiste en NEF3, p-sinucleína, CARNS1, RBP4, o una combinación de los mismos.

Breve descripción de las figuras

Las siguientes figuras se incluyen para mostrar adicionalmente determinados aspectos de la presente invención. Figura 1: Posibles candidatos a biomarcador para diferenciar IS de ICH a partir de la fase de descubrimiento. * p<0,01; **p<0,005.

Figura 2: Resultados de la primera fase de replicación. * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,005.

Figura 3: Niveles plasmáticos de RBP4, APOB100, RAGE y GFAP en pacientes con IS e ICH en la segunda fase de replicación. * p<0,05, **p<0,0001.

Figura 4: A) Curvas ROC de RBP4 y GFAP. B) Especificidad y sensibilidad para diferenciar el accidente cerebrovascular IS de ICH para puntos de corte de RBP4>49,53 |ig/ml y GFAP<0,07 ng/ml. C) Los puntos de corte para ambos biomarcadores que buscan una especificidad del 100 % para tanto accidente cerebrovascular isquémico como hemorrágico son RPB4 = 57,8 |ig/ml y/o RBP4=61 |ig/ml y GFAP=0,07 ng/ml.

Figura 5: Curvas ROC de todos los modelos de regresión logística. A) Modelo clínico frente al modelo de RBP4; B) modelo clínico frente al modelo de GFAP; C) modelo clínico frente al modelo de RBP4 y GFAP; D) modelo clínico frente al modelo combinado de RBP4 y GFAP.

Figura 6: Curvas ROC de todos los modelos de regresión logística. A) Modelo clínico ajustado frente al modelo clínico y punto de corte de RBP4; B) modelo clínico ajustado frente al punto de corte de GFAP; C) modelo clínico ajustado frente al punto de corte de GFAP y RBP4; D) modelo clínico ajustado frente a los puntos de corte de GFAP y RBP4 combinados en una sola variable.

Figura 7: Niveles circulantes de Syn, Per, NEF3, NFL e Ina. Solo NEF3 mostró diferencias significativas entre pacientes que padecían una ICH (n = 16) en comparación con IS (n = 15). Se representan la media y la desviación estándar. * indica p<0,05.

Figura 8: Niveles de proteínas OMG, NRGN, ADRB1, p-sinucleína, C1orf96, NEF3, CARNS1, CAC1A, JN y GFAP analizados en la cohorte de 40 pacientes con IS y 34 pacientes con ICH. El diagrama de cajas representa la mediana y el intervalo intercuartílico. Los gráficos de barras representan la media y la DE. *p<0,05 ** p<0,001.

Figura 9: Curvas ROC de GFAP (A), NEF3 (B) y p-sinucleína (C).

Figura 10: Diagrama de puntos que muestra la distribución de pacientes con IS (círculo negro) e ICH (círculo blanco) con respecto a sus niveles de A) GFAP y NEF3 o B) GFAP y beta sinucleína. C) muestra el % de detección de IS e ICH cuando GFAP<0,07 se combina con NEF3>17,796 y GFAP<0,07 se combina con p-sinucleína>270,312.

Figura 11: Gráficos de barras apiladas en los que se muestra el % de detección de IS e ICH, cuando se consideraron GFAP<0,07 combinado con CARNS1>123,255.

Figura 12: Gráficos de puntos que muestran la distribución de pacientes con IS (círculo negro) e ICH (círculo blanco) con respecto a sus niveles de GFAP y CARNS1. Los valores de puntos de corte de GFAP = 0,07 y CARNS1=123,255 están resaltados.

Descripción detallada de la invención

Los autores de la presente divulgación han identificado a RBP4 como un nuevo biomarcador plasmático para diferenciar IS e ICH agudas (véase el ejemplo 1). Adicionalmente, GFAP en combinación con uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en NEF3, p-sinucleína, CARNS1 y RBP4 son útiles para diferenciar IS e ICH (ejemplos 2 y 3)

Métodos de la invención

En un primer aspecto, la divulgación se refiere a un método in vitro para diferenciar accidente cerebrovascular isquémico de accidente cerebrovascular hemorrágico en un paciente (primer método de la divulgación), que comprende

a) determinar el nivel de RBP4 en una muestra de dicho paciente y

b) comparar dicho nivel con un valor de referencia

en el que un nivel de RBP4 en dicha muestra superior al valor de referencia es indicativo de que el paciente padece accidente cerebrovascular isquémico o en el que un nivel de RBP4 en dicha muestra inferior al valor de referencia es indicativo de que el paciente padece accidente cerebrovascular hemorrágico.

El término “paciente”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier sujeto que muestre uno o más signos o síntomas normalmente asociados con un accidente cerebrovascular, tales como debilidad facial de inicio repentino, deriva del brazo, habla anómala, así como combinaciones de los mismos tales como el FAST (cara, brazo, habla y tiempo), hemiplejia y debilidad muscular de la cara, entumecimiento, reducción de la sensación sensorial o vibratoria, flacidez inicial (hipotonicidad), reemplazado por espasticidad (hipertonicidad), hiperreflexia, sinergias obligatorias y, en particular, cuando aparecen en un lado del cuerpo (unilateral), olfato, sabor, audición o visión alterados (total o parcial), caída del párpado (ptosis) y debilidad de los músculos oculares, disminución de los reflejos (por ejemplo, faríngeo, deglución, reactividad de la pupila a la luz), sensación disminuida y debilidad muscular de la cara, problemas de equilibrio y nistagmo, respiración y frecuencia cardíaca alteradas, debilidad en el músculo esternocleidomastoideo con incapacidad para girar la cabeza a un lado, debilidad en la lengua (incapacidad para sacarla y/o moverla de lado a lado), afasia, disartria, apraxia, defecto del campo visual, déficits de memoria, heminatención, pensamiento desorganizado, confusión, gestos hipersexuales, falta de conocimiento de sí mismo, habitualmente relacionados con el accidente cerebrovascular, discapacidad, marcha alterada al caminar, coordinación de movimientos alterada, vértigo, cefalea y/o desequilibrio.

El término “diferenciación”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la determinación de una condición diferente. Tal como entenderán los expertos en la técnica, la diferenciación, aunque se prefiere, no es necesario que sea correcta para el 100 % de los sujetos que van a diagnosticarse o evaluarse. El término, sin embargo, requiere que pueda identificarse que una parte estadísticamente significativa de los sujetos tiene una mayor probabilidad de tener uno de los dos tipos de accidente cerebrovascular. Si un sujeto es estadísticamente significativo puede determinarse sin más por el experto en la técnica usando diversas herramientas de evaluación estadística bien conocidas, por ejemplo, determinación de intervalos de confianza, determinación del valor de p, prueba de la t de Student, prueba de Mann-Whitney, etc. Se encuentran detalles en Dowdy y Wearden, Statistics for Research, John Wiley & amp; Sons, Nueva York 1983. Los intervalos de confianza preferidos son del al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 % o al menos el 95 %. Los valores de p son, preferiblemente, 0,05, 0,01,0,005 o inferior.

El término “accidente cerebrovascular isquémico” se refiere al bloqueo físico del flujo sanguíneo a un área del cerebro, que provoca que las células cerebrales en el área mueran. Los accidentes cerebrovasculares isquémicos pueden dividirse además en accidentes cerebrovasculares trombóticos y embólicos. Los accidentes cerebrovasculares trombóticos se producen cuando una arteria cerebral se bloquea por un coágulo sanguíneo formado en el cerebro. Los accidentes cerebrovasculares embólicos están provocados por un trombo, que se forma en una arteria periférica o en el corazón, que se desplaza al cerebro donde produce isquemia.

El término “accidente cerebrovascular hemorrágico”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una hemorragia en el tejido cerebral debido a un estallido de vasos sanguíneos.

Además, dado que el biomarcador identificado en la presente divulgación permite diferenciar accidente cerebrovascular isquémico de accidente cerebrovascular hemorrágico en un paciente y considerando que se aplican diferentes terapias a estos dos tipos de pacientes (agentes antitrombóticos en pacientes que padecen accidente cerebrovascular isquémico y un agente capaz de reducir la tensión arterial en pacientes que padecen accidente cerebrovascular hemorrágico) (véase Tsivgoulis G. et al., Neurology. 19 de septiembre de 2014), la divulgación también proporciona un método para la selección de una terapia para un paciente que ha padecido un accidente cerebrovascular. En consecuencia, en un segundo aspecto, la divulgación se refiere a un método in vitro para seleccionar un paciente que padece accidente cerebrovascular para una terapia con un agente antitrombótico o para una terapia con un agente capaz de reducir la tensión arterial (segundo método de la divulgación) que comprende

a) determinar el nivel de RBP4 en una muestra de dicho paciente y

b) comparar dicho nivel con un valor de referencia

en el que un nivel de RBP4 en dicha muestra superior al valor de referencia es indicativo de que el paciente es un candidato para una terapia con un agente antitrombótico o en el que un nivel de RBP4 en dicha muestra inferior al valor de referencia es indicativo de que el paciente es un candidato para una terapia con un agente capaz de reducir la tensión arterial.

El término “seleccionar un paciente para una terapia”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la identificación de un paciente para una terapia diseñada para curar una enfermedad o atenuar los síntomas asociados con una o más enfermedades o afecciones. En el caso particular de una terapia para el accidente cerebrovascular, se entiende cualquier terapia que elimine, retarde o reduzca los síntomas asociados con el accidente cerebrovascular y, más en particular, con accidente cerebrovascular isquémico o alternativamente con accidente cerebrovascular hemorrágico.

Tal como entenderán los expertos en la técnica, la selección de un paciente, aunque se prefiere, no es necesario que sea adecuada para el 100 % de los sujetos seleccionados según el segundo método de la divulgación. El término, sin embargo, requiere que una porción estadísticamente significativa de los sujetos se seleccione correctamente. Si la selección de un paciente en una población de sujetos es estadísticamente significativa puede determinarse sin más por el experto en la técnica usando diversas herramientas de evaluación estadística muy conocidas, por ejemplo, determinación de intervalos de confianza, determinación del valor de p, prueba de la t de Student, prueba de Mann-Whitney, etc. Se encuentran detalles en Dowdy y Wearden, Statistics for Research, John Wiley & amp; Sons, Nueva York 1983. Los intervalos de confianza preferidos son de al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 % o al menos el 95 %. Los valores de p son, preferiblemente, 0,01, 0,05, 0,005, 0,001 o inferior.

El término “agente antitrombótico”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un fármaco que es capaz de reducir la formación de coágulos. Los agentes antitrombóticos adecuados para su uso en la presente invención incluyen, sin limitación, agentes trombolíticos, agentes antiplaquetarios y compuestos anticoagulantes.

El término “agente trombolítico”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un fármaco que es capaz de disolver un coágulo. Todos los agentes trombolíticos son serina proteasas y convierten el plasminógeno en plasmina, lo que descompone el fibrinógeno y la fibrina y disuelve el coágulo. Los agentes trombolíticos disponibles actualmente incluyen reteplasa (r-PA o Retavase), alteplasa (t-PA o Activase), urocinasa (Abbokinase), prourocinasa, complejo activador de estreptocinasa purificada anisoilada (APSAC), estafilocinasa (Sak), atenecteplasa (TNKase), anistreplasa (Eminasa), estreptocinasa (Kabikinase, Streptase) o urocinasa (Abokinase).

El término compuestos anticoagulantes, tal como se usa en el presente documento, se refiere a compuestos que evitan la coagulación e incluyen, sin limitación, antagonistas de la vitamina K (warfarina, acenocumarol, fenprocumón y fenidiona), heparina y derivados de heparina tales como heparinas de bajo peso molecular, inhibidores del factor Xa tales como pentasacáridos sintéticos, inhibidores directos de la trombina (argatrobán, lepirudina, bivalirudina y ximelagatrán) y compuestos antiplaquetarios que actúan mediante la inhibición de la agregación plaquetaria y, por lo tanto, la formación de trombos e incluyen, sin limitación, inhibidores de la ciclooxigenasa (aspirina), inhibidores del receptor de difosfato de adenosina (clopidrel y ticlopidina), inhibidores de fosfodiesterasa (cilostazol), inhibidores de glucoproteína IIB/IIIA (Abciximab, Eptifibatide, Tirofiban y Defibrotide) e inhibidores de la captación de adenosina (dipiridamol).

En una realización preferida, el agente antitrombótico es un agente trombolítico. En una realización más preferida, el agente trombolítico es un activador de plaminógeno. En una realización aún más preferida, el activador de plasminógeno es tPA (activador de plasminógeno tisular).

El término “activador de plasminógeno tisular (t-PA)”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una serina proteasa que se encuentra en células endoteliales que cataliza la conversión de plasminógeno en plasmina. La secuencia proteica completa para t-PA humano tiene el número de registro de UniProt P00750 (11 de julio de 2012). Puede fabricarse tPA usando técnicas de biotecnología recombinante, el tPA creado de esta manera puede denominarse activador de plasminógeno tisular recombinante (rtPA). Los activadores de plasminógeno tisular recombinantes (r-tPA) incluyen alteplasa, reteplasa y tenecteplasa (TNKase).

Las dosis de t-PA deben administrarse en el plazo de las primeras 3 horas desde el inicio de los síntomas o hasta 4,5 horas desde el inicio de los síntomas. Dosis total recomendada: 0,9 mg/kg (la dosis máxima no debe exceder los 90 mg) infundidos a lo largo de 60 minutos. Cargar con 0,09 mg/kg (10 % de la dosis de 0,9 mg/kg) como un bolo intravenoso a lo largo de 1 minuto, seguido de 0,81 mg/kg (90 % de la dosis de 0,9 mg/kg) como una infusión continua a lo largo de 60 minutos. La heparina no debe iniciarse durante 24 horas o más después de comenzar la alteplasa para el accidente cerebrovascular. Dicho t-PA se administra por vía intravenosa y, en algunos casos, puede administrarse directamente en una arteria y debe administrarse de inmediato después de los primeros síntomas del inicio de accidente cerebrovascular.

“Tensión arterial” debe entenderse en el presente documento que se refiere a la tensión arterial en el sitio de las arterias centrales, tales como la arteria aorta y carótida. La tensión arterial central puede medirse adecuadamente de manera no invasiva (tal como se expone a continuación) en las carótidas o radiales por tonometría de aplanación. “Tensión arterial” tal como se usa en el presente documento abarca así la tensión arterial aórtica.

“Agente capaz de reducir la tensión arterial”, tal como se usa en la presente invención, se refiere a cualquier fármaco que reduzca la tensión arterial por diferentes medios. Entre los agentes más ampliamente usados se encuentran los diuréticos de tiazida [tales como furosemida, nitroprusiato, hidralazina]; los inhibidores de la ECA, los bloqueantes de los canales de calcio [tales como nicardipina o nimodipina]; el antagonista del receptor adrenérgico [tal como antagonista alfa-adrenérgico, urapidil], o bloqueantes alfa y beta combinados [labetalol y nitroglicerina]; y los antagonistas del receptor de angiotensina II (ARB). Ejemplos ilustrativos, no limitativos de agentes capaces de reducir o disminuir la tensión arterial son a-metildopa (Aldomet), éster metílico del ácido 11,17a-dimetoxi-18p-[(3,4,5-trimetoxi-benzoil)oxil)]-3p,2a-yohimban-16p-carboxílico (reserpina) o clorhidrato de 2-(2,6-diclorofenilamino)2-imidazolina (clorhidrato de clonidina), lergotrilo o, a saber, 2-cloro-6-metilergolina-8p-acetonitrilo tal como se da a conocer en el documento EP0005074A1. Las modalidades de tratamiento para la disminución de la tensión arterial están destinadas a lograr una tensión arterial sistólica por debajo de 180 mm Hg. En una realización preferida, la tensión arterial puede reducirse mediante la administración intravenosa de un agente capaz de reducir la tensión arterial y la administración conjunta de agente(s) antihipertensivo(s) oral(es).

Puede usarse cualquier método adecuado para medir la tensión arterial para determinar si un agente es capaz de reducir la tensión arterial, en el que se detecta una reducción en la tensión arterial después de la administración del agente. Ejemplos ilustrativos, no limitativos de métodos para medir la tensión arterial son técnicas no invasivas, tales como, a modo de ejemplo ilustrativo no limitativo, palpitación, auscultación, tensión arterial no invasiva (CNAP) oscilométrica y continua.

El término “paciente”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a todos los animales clasificados como mamíferos e incluye, pero no está restringido a, animales domésticos y de granja, primates y humanos, por ejemplo, seres humanos, primates no humanos, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, perros, gatos o roedores.

Preferiblemente, el paciente es un ser humano hombre o mujer de cualquier edad o raza. Preferiblemente, el paciente padece accidente cerebrovascular.

La primera etapa de los métodos de la divulgación comprende determinar el nivel de RBP4 en una muestra de dicho paciente.

El término “muestra”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier muestra que pueda obtenerse del paciente. El presente método puede aplicarse a cualquier tipo de muestra biológica de un paciente, tal como una muestra de biopsia, tejido, células o fluidos biológicos (plasma, suero, saliva, semen, esputo, líquido cefalorraquídeo (LCR), lágrimas, moco, sudor, leche, extractos cerebrales y similares).

En una divulgación preferida, la muestra es un fluido biológico. Fluidos biológicos ilustrativos, no limitativos son sangre, plasma, suero, saliva, orina o líquido cefalorraquídeo. En una realización preferida, el fluido biológico es plasma o suero.

En una realización preferida de los métodos de la divulgación y de la invención, la muestra se obtiene en el momento basal.

Podrían usarse diferentes muestras para determinar el nivel de diferentes marcadores. Por lo tanto, no es necesario que los niveles de todos los marcadores según los métodos de la divulgación y de la invención se midan en el mismo tipo de muestra. Por lo tanto, en otra realización preferida, los niveles de GFAP, CARNS1, p-sinucleína y/o NEF3 se miden en suero. En otra preferida, el nivel de GFAP o RBP4 se miden en plasma.

“Momento basal”, tal como se usa en el presente documento, se considera cualquier momento desde el inicio de los síntomas hasta que el paciente se explora por primera vez. Esto habitualmente es en el plazo de las primeras horas después del accidente cerebrovascular y habitualmente es la primera atención en la ambulancia o en el hospital. En una realización preferida, el momento basal está dentro de las primeras 4,5 horas desde el inicio de los síntomas, o menos de 6 horas después de accidente cerebrovascular o, en otra realización preferida, menos de 24 horas del inicio de los síntomas.

El término “RBP4”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la proteína 4 de unión a retinol, plasmática que pertenece a la familia de la lipocalina y es el portador específico para el retinol en la sangre. La secuencia completa para la proteína 4 de unión a retinol humano tiene el número de registro de UniProt P02753 (8 de agosto de 2013).

En una realización preferida, los métodos de la divulgación comprenden además determinar el nivel de GFAP en el que el nivel reducido de GFAP en dicha muestra con respecto a un valor de referencia para GFAP es indicativo de que el paciente padece accidente cerebrovascular isquémico o que el paciente es un candidato para una terapia con un agente trombolítico y el nivel aumentado de GFAp en dicha muestra con respecto a un valor de referencia es indicativo de que el paciente padece accidente cerebrovascular hemorrágico o que el paciente es un candidato para una terapia con un agente capaz de reducir la tensión arterial.

El término “GFAP”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la proteína ácida fibrilar glial, una proteína de filamentos intermedios que se expresa por numerosos tipos celulares del sistema nervioso central. La secuencia completa para la proteína ácida fibrilar glial tiene el número de registro de UniProt P14136 (8 de agosto de 2013).

Tal como entiende el experto en la técnica, los niveles de expresión de RBP4 y/o GFAP pueden determinarse midiendo los niveles de ARNm codificado por los genes correspondientes o midiendo los niveles de proteínas codificadas por dichos genes y los niveles de variantes de los mismos.

A modo de ilustración no limitativa, los niveles de expresión se determinan mediante la cuantificación de los niveles de ARNm codificado por dichos genes. Esto último puede cuantificarse mediante el uso de métodos convencionales, por ejemplo, métodos que comprenden la amplificación de ARNm y la cuantificación del producto de amplificación de dicho ARNm, tales como electroforesis y tinción, o, alternativamente, por medio de transferencia de tipo Northern y el uso de sondas adecuadas, transferencia de tipo Northern y el uso de sondas específicas del ARNm de los genes de interés o de su ADNc/ARNc correspondiente, mapeo con la nucleasa S1, RT-p Cr , hibridación, microalineamientos, etc. De manera similar, los niveles de ADNc/ARNc correspondientes a dicho ARNm codificado por los genes marcadores también pueden cuantificarse mediante el uso de técnicas convencionales; en este caso, el método de la divulgación o de la invención incluye una etapa de síntesis del ADNc correspondiente por medio de transcripción inversa (RT) del ARNm correspondiente seguido de la síntesis (ARN polimerasa) y amplificación del ARNc complementario a dicho ADNc. Pueden encontrarse métodos convencionales de cuantificación de los niveles de expresión, por ejemplo, en Sambrook et al., 2001 “Molecular cloning: to Laboratory Manual”, 3a ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., Vol. 1-3.

Para normalizar los valores de expresión de ARNm entre las diferentes muestras, es posible comparar los niveles de expresión del ARNm de interés en las muestras de prueba con la expresión de un ARN de control. Un “ARN de control”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a ARN cuyos niveles de expresión no cambian o cambian solo en cantidades limitadas. Preferiblemente, el ARN de control es ARNm derivado de genes de mantenimiento y que codifican proteínas que se expresan constitutivamente y llevan a cabo funciones celulares esenciales. Los genes de mantenimiento preferidos para su uso en la presente invención incluyen la proteína ribosómica 18-S, p-2-microglobulina, ubiquitina, ciclofilina, GAPDH, PSMB4, tubulina y p-actina.

Alternativamente, también es posible determinar los niveles de expresión de los genes marcadores mediante la determinación de los niveles de expresión de las proteínas codificadas por dichos genes, ya que si la expresión de los genes aumenta, debe producirse un aumento de la cantidad de proteína correspondiente y si la expresión de genes disminuye, debe producirse una disminución de la cantidad de proteína correspondiente.

La determinación de los niveles de expresión de las proteínas puede llevarse a cabo mediante técnicas inmunológicas tales como ELISA, inmunotransferencia de tipo Western o inmunofluorescencia. La inmunotransferencia de tipo Western se basa en la detección de proteínas previamente resueltas por electroforesis en gel en condiciones desnaturalizantes e inmovilizadas sobre una membrana, generalmente nitrocelulosa mediante la incubación con un anticuerpo específico y un sistema de revelado (por ejemplo, quimioluminiscente). El análisis por inmunofluorescencia requiere el uso de un anticuerpo específico para la proteína diana para el análisis de la expresión. El ELISA se basa en el uso de antígenos o anticuerpos marcados con enzimas, de modo que los conjugados formados entre el antígeno diana y el anticuerpo marcado dan como resultado la formación de complejos enzimáticamente activos. Dado que uno de los componentes (el antígeno o el anticuerpo marcado) está inmovilizado sobre un soporte, los complejos de anticuerpo-antígeno se inmovilizan sobre el soporte y, por lo tanto, pueden detectarse mediante la adición de un sustrato que se convierte por la enzima en un producto que es detectable, por ejemplo, mediante espectrofotometría, fluorometría, espectrometría de masas o etiquetas de masas en tándem (TMT).

Por otro lado, la determinación de los niveles de expresión de proteínas puede llevarse a cabo construyendo un microalineamiento de tejido (TMA) que contiene las muestras del sujeto ensambladas y determinando los niveles de expresión de las proteínas mediante técnicas bien conocidas en el estado de la técnica.

En una realización preferida, la determinación de los niveles de los marcadores se determina mediante una técnica inmunológica. En una realización más preferida, la técnica inmunológica es ELISA.

Cuando se usa un método inmunológico, puede usarse cualquier anticuerpo o reactivo que se sabe que se une con alta afinidad a las proteínas diana para detectar la cantidad de proteínas diana. No obstante, se prefiere el uso de anticuerpos, por ejemplo, sueros policlonales, sobrenadantes de hibridoma o anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpos, Fv, Fab, Fab' y F(ab')2, ScFv, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y anticuerpos humanizados.

Tal como se mencionó anteriormente, los niveles de expresión de RBP4 y/o GFAP se pueden determinar midiendo tanto los niveles de proteína como los niveles de variantes de las mismas, tales como fragmentos, isoformas, análogos y/o derivados.

Se entiende que el término “variante funcionalmente equivalente” significa todas las proteínas derivadas de la secuencia de RBP4 y/o GFAP por modificación, inserción y/o deleción o uno o más aminoácidos, siempre que la función de dichas variantes se mantenga sustancialmente. Preferiblemente, variantes de RBP4 y/o GFAP son (i) polipéptidos en los que uno o más residuos de aminoácidos se sustituyen por un residuo de aminoácido conservado o no conservado (preferiblemente un residuo de aminoácido conservado) y tal aminoácido sustituido puede estar codificado o no por el código genético, (ii) polipéptidos en los que hay uno o más residuos de aminoácidos modificados, por ejemplo, residuos modificados por unión de sustituyentes, (iii) polipéptidos que resultan del procesamiento alternativo de un ARNm similar, (iv) fragmentos de polipéptidos y/o (v) polipéptidos que resultan de la fusión de RBP4 o GFAP o el polipéptido definido en (i) a (iii) con otro polipéptido, tal como una secuencia líder secretora o una secuencia que se usa para la purificación (por ejemplo, etiqueta His) o para la detección (por ejemplo, etiqueta de epítopo Sv5). Los fragmentos incluyen polipéptidos generados a través de corte proteolítico (incluyendo proteólisis multisitio) de una secuencia original. Las variantes pueden modificarse postraduccionalmente o químicamente. Se supone que tales variantes son evidentes para los expertos en la técnica.

Tal como se conoce en la técnica, la “similitud” entre dos proteínas se determina comparando la secuencia de aminoácidos y sus sustitutos de aminoácidos conservados de una proteína con una secuencia de una segunda proteína. Se define que las variantes incluyen secuencias polipeptídicas diferentes de la secuencia original, preferiblemente diferentes de la secuencia original en menos del 40 % de los residuos por segmento en cuestión, más preferiblemente diferentes de la secuencia original en menos del 25 % de los residuos por segmento en cuestión, más preferiblemente diferentes de la secuencia original en menos del 10 % de los residuos por segmento en cuestión, más preferiblemente diferentes de la secuencia original en solo unos pocos residuos por segmento en cuestión y, al mismo tiempo, suficientemente homólogas a la secuencia original para conservar la funcionalidad de la secuencia original. Las variantes según la presente invención incluyen secuencias de aminoácidos que son al menos el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 72 %, el 74 %, el 76 %, el 78 %, el 80 %, el 90 % o el 95 % similares o idénticas a la secuencia de aminoácidos original. El grado de identidad entre dos proteínas se determina usando algoritmos informáticos y métodos que son ampliamente conocidos por los expertos en la técnica. La identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina preferiblemente usando el algoritmo BLASTP [BLAST Manual, Altschul, S., etal., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)].

Las proteínas pueden modificarse postraduccionalmente. Por ejemplo, las modificaciones postraduccionales que se encuentran dentro del alcance de la presente invención incluyen escisión de péptido señal, glicosilación, acetilación, isoprenilación, proteólisis, miristoilación, plegamiento de proteínas y procesamiento proteolítico, etc. Adicionalmente, las proteínas pueden incluir aminoácidos no naturales formados por modificación postraduccional o por introducción de aminoácidos no naturales durante la traducción.

La segunda etapa de los métodos de la divulgación comprende comparar el nivel de RBP4 con un valor de referencia o, en el caso de que se determine adicionalmente GFAP, el método también comprende comparar el nivel de GFAP con un valor de referencia.

El término “valor de referencia”, como se usa en el presente documento, se refiere a un criterio predeterminado usado como referencia para evaluar los valores o datos obtenidos de las muestras recogidas de un sujeto. El valor de referencia o nivel de referencia puede ser un valor absoluto; un valor relativo; un valor que tiene un límite superior o inferior; un intervalo de valores; un valor promedio; un valor mediana, un valor medio o un valor en comparación con un control particular o valor basal. Un valor de referencia puede basarse en un valor de una muestra individual, tal como, por ejemplo, un valor obtenido de una muestra del sujeto que se está sometiendo a prueba, pero en un punto anterior en el tiempo. El valor de referencia puede basarse en un gran número de muestras, tal como de la población de sujetos del grupo de edad coincidente cronológicamente, o basarse en un conjunto de muestras que incluyen o excluyen la muestra que se va a analizar.

Según el primer método de la divulgación, un nivel de RBP4 en la muestra del paciente superior al valor de referencia es indicativo de que el paciente padece accidente cerebrovascular isquémico.

Según el segundo método de la divulgación, un nivel de RBP4 en dicha muestra superior al valor de referencia es indicativo de que el paciente es un candidato para una terapia con un agente antitrombótico

Según el segundo método de la divulgación, un nivel de RBP4 en dicha muestra inferior al valor de referencia es indicativo de que el paciente es un candidato para una terapia con un agente capaz de reducir la tensión arterial.

Según el primer método de la divulgación, un nivel reducido de GFAP en dicha muestra con respecto a un valor de referencia es indicativo de que el paciente padece accidente cerebrovascular isquémico.

Según el segundo método de la divulgación, el nivel reducido de GFAP en dicha muestra con respecto a un valor de referencia para GFAP es indicativo de que el paciente es un candidato para una terapia con un agente trombolítico.

Según el segundo método de la divulgación, el nivel aumentado de GFAP en dicha muestra con respecto a un valor de referencia para GFAP es indicativo de que el paciente es un candidato para una terapia con un agente capaz de reducir la tensión arterial.

Se considera que los niveles de un biomarcador son superiores a su valor de referencia cuando son al menos el 1,5 %, al menos el 2 %, al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 15 %, al menos el 20 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 35 %, al menos el 40 %, al menos el 45 %, al menos el 50 %, al menos el 55 %, al menos el 60 %, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %: al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 100 %, al menos el 110 %, al menos el 120 %, al menos el 130 %, al menos el 140 %, al menos el 150 % o más superiores al valor de referencia.

Del mismo modo, en el contexto de la presente invención, el nivel de un biomarcador está reducido cuando el nivel de dicho biomarcador en una muestra es inferior a un valor de referencia. Se considera que los niveles de un biomarcador son inferiores a su valor de referencia cuando son al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 15 %, al menos el 20 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 35 %, al menos el 40 %, al menos el 45 %, al menos el 50 %, al menos el 55 %, al menos el 60 %, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %: al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 100 %, al menos el 110 %, al menos el 120 %, al menos el 130 %, al menos el 140 %, al menos el 150 % o más inferiores al valor de referencia.

En una realización preferida, el valor de referencia para RBP4 es 49,53 |ig de proteína/ml.

En otra realización preferida, el valor de referencia para GFAP es 0,07 ng de proteína/ml.

En otra realización, los métodos de la divulgación y de la invención comprenden además determinar uno o más parámetros clínicos. Por lo tanto, los métodos según la divulgación pueden comprender determinar el nivel de RBP4 y uno o más parámetros clínicos o determinar los niveles de RBP4 y de GFAP y uno o más parámetros clínicos.

El término “parámetros clínicos” o datos clínicos, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la demografía de personas (edad o fecha de nacimiento, raza y/o etnicidad), síntomas o signos clínicos del paciente relacionados con enfermedades/afecciones relacionadas con accidente cerebrovascular.

En una realización preferida, los datos clínicos son hipertensión.

El término “hipertensión” a veces denominada hipertensión arterial, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una afección médica crónica en la que la tensión arterial en las arterias está elevada. La tensión arterial normal en reposo está dentro del intervalo de 100-140 mmHg sistólica (lectura superior) y 60-90 mmHg diastólica (lectura inferior). Se dice que está presente tensión arterial alta si está persistentemente a o es superior a 140/90 mmHg.

En otra realización preferida, el parámetro clínico se selecciona de la edad, puntuación de NIHSS, sexo, tensión arterial sistólica y combinaciones de las mismas.

El término “puntuación de NIHSS”, tal como se usa en la presente invención, se refiere a la puntuación de la escala de accidente cerebrovascular de los Institutos Nacionales de Salud (NIHSS), una herramienta de evaluación sistemática que proporciona una medida cuantitativa del déficit neurológico relacionado con el accidente cerebrovascular (Adams HP Jr Neurology. 13 de julio de 1999; 53(1):126-31). El NIHSS se diseñó originalmente como una herramienta de investigación para medir los datos basales en pacientes en ensayos clínicos de accidente cerebrovascular agudo. Ahora, la escala también se usa ampliamente como herramienta de evaluación clínica para evaluar la agudeza de los pacientes con accidente cerebrovascular, determinar el tratamiento apropiado y predecir el desenlace del paciente. La NIHSS es una escala de accidente cerebrovascular de examen neurológico de 15 artículos utilizada para evaluar el efecto del infarto cerebral agudo sobre los niveles de consciencia, lenguaje, desatención, pérdida del campo visual, movimiento extraocular, fuerza motora, ataxia, disartria y pérdida sensorial. Un observador capacitado clasifica la capacidad del paciente para responder preguntas y realizar actividades. Las clasificaciones para cada artículo se puntúan con de 3 a 5 grados con 0 como normal y hay una asignación para artículos no controlables. El nivel de gravedad del accidente cerebrovascular medido por el sistema de puntuación de la escala de accidente cerebrovascular de los NIH: 0 = sin accidente cerebrovascular, 1-4 = accidente cerebrovascular menor, 5 15 = accidente cerebrovascular moderado, 15-20 = accidente cerebrovascular moderado/grave, 21-42 = accidente cerebrovascular grave. En la presente invención, el término “puntuación más alta” se refiere a una puntuación de 5 a 42 en el sistema de puntuación de la escala de accidente cerebrovascular de los NIH.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para diferenciar accidente cerebrovascular isquémico de accidente cerebrovascular hemorrágico en un paciente (tercer método de la invención), que comprende

b) comparar dichos niveles con un valor de referencia correspondiente en el que un nivel de GFAP en dicha muestra inferior al valor de referencia correspondiente y un nivel de NEF3, p-sinucleína, CARNS1 y/o RBP4 superior al valor de referencia correspondiente es indicativo de que el paciente padece accidente cerebrovascular isquémico o en el que un nivel de GFAP en dicha muestra superior al valor de referencia y un nivel de NEF3, p-sinucleína, CARNS1 y/o RBP4 inferior al valor de referencia correspondiente es indicativo de que el paciente padece accidente cerebrovascular hemorrágico.

“NEF3”, NFM o NEFM, tal como se usa en el presente documento, se refiere al polipéptido medio de neurofilamentos implicado en el mantenimiento del calibre neuronal. La secuencia completa para NEF3 humano tiene el número de registro de UniProt P07197 (11 de noviembre de 2015).

“P-sinucleína”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una proteína que protege las neuronas de la activación de caspasa estimulada por estaurosporina y 6-hidroxidopamina (6OHDA) de una manera dependiente de p53/TP53. La secuencia completa para la p-sinucleína humana tiene el número de registro de Uniprot Q16143 ((11 de noviembre de 2015).

“CARNS1”, también conocida como proteína 1 que contiene dominio de ATP-grasp y tal como se usa en el presente documento, se refiere a la carnosina sintasa 1, una enzima que cataliza la síntesis de carnosina y homocarnosina. La secuencia completa para CARNS1 humana tiene el número de registro de Uniprot A5YM72 (11 de noviembre de 2015).

En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para seleccionar un paciente que padece accidente cerebrovascular para una terapia con un agente antitrombótico o con un agente capaz de reducir la tensión arterial (cuarto método de la invención) que comprende

b) comparar dichos niveles con un valor de referencia correspondiente

en el que un nivel de GFAP en dicha muestra inferior al valor de referencia correspondiente y un nivel de NEF3, psinucleína, CARNS1 y/o RBP4 superior al valor de referencia correspondiente es indicativo de que el paciente es un candidato para una terapia con un agente trombolítico o en el que un nivel de GFAP en dicha muestra superior al valor de referencia y un nivel de NEF3, p-sinucleína, CARNS1 y/o RBP4 inferior al valor de referencia correspondiente es indicativo de que el paciente es un candidato para una terapia con un agente capaz de reducir la tensión arterial.

En una realización preferida, el tercer o el cuarto método de la invención, el método comprende determinar el nivel de GFAP y un marcador seleccionado del grupo que consiste en NEF3, p-sinucleína, CARNS1 y RBP4. Por lo tanto, en una realización preferida, el tercer o cuarto método de la invención comprende determinar GFAP y NEF3; GFAP y psinucleína; GFAP y CARNS1; o GFAP y RBP4.

En otra realización preferida, el tercer o el cuarto método de la invención comprende determinar el nivel de GFAP y dos marcadores seleccionados del grupo que consiste en NEF3, p-sinucleína, CARNS1 y RBP4. Por lo tanto, en una realización preferida, el tercer o cuarto método de la invención comprende determinar GFAP, NEF3 y p-sinucleína; GFAP, NEF3 y CARNS1; GFAP, NEF3 y RBP4; GFAP, p-sinucleína y CARNS1; GFAP, p-sinucleína y RBP4; o GFAP, CARNS1 y RBP4.

En otra realización preferida, el tercer o el cuarto método de la invención comprende determinar el nivel de GFAP y tres marcadores seleccionados del grupo que consiste en NEF3, p-sinucleína, CARNS1 y RBP4. Por lo tanto, en una realización preferida, el tercer o cuarto método de la invención comprende determinar GFAP, NEF3, p-sinucleína y CARNS1; GFAP, NEF3, p-sinucleína y RBP4; GFAP, NEF3, CARNS1 y RBP4; o GFAP, p-sinucleína, CARNS1 y RBP4.

En otra realización preferida, el tercer o el cuarto método de la invención comprende determinar el nivel de GFAP y cuatro marcadores NEF3, p-sinucleína, CARNS1 y RBP4. Por lo tanto, en una realización preferida, el tercer y cuarto método de la invención comprende determinar GFAP, NEF3, p-sinucleína, CARNS1 y RBP4.

En una realización más preferida, el tercer y cuarto método de la invención comprende determinar el nivel de nivel de GFAP y NEF3; GFAP y p-sinucleína; GFAP, NEF3 y p-sinucleína; GFAP y CARNS1; GFAP, CARNS1 y NEF3; GFAP, CARNS1 y RBP4; GFAP, p-sinucleína y RBP4, GFAP, NEF y RBP4 o GFAP y RBP4.

Todos los términos, las realizaciones y divulgaciones descritas previamente en relación con los métodos primero y segundo de la divulgación son igualmente aplicables a los métodos tercero y cuarto de la invención.

Uso de un kit

Se da a conocer un kit que comprende un reactivo para detectar el nivel de un marcador seleccionado de GFAP, NEF3, p-sinucleína, CARNS1, RBP4, o una combinación de los mismos.

El término “kit”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un producto que contiene los diferentes reactivos necesarios para llevar a cabo los métodos de la invención envasados para permitir su transporte y almacenamiento. Los materiales adecuados para envasar los componentes del kit incluyen cristal, plástico (por ejemplo, polietileno, polipropileno, policarbonato), botellas, viales, papel o envolturas.

Adicionalmente, los kits para su uso según la invención pueden contener instrucciones para el uso simultáneo, secuencial o separado de los diferentes componentes que están en el kit. Dichas instrucciones pueden estar en forma de material impreso o en forma de un soporte electrónico capaz de almacenar instrucciones susceptibles de leerse o entenderse, tal como, por ejemplo, medios de almacenamiento electrónico (por ejemplo, discos magnéticos, cintas), o medios ópticos (por ejemplo, CD-ROM, DVD), o materiales de audio. Adicional o alternativamente, los medios pueden contener direcciones de internet que proporcionan dichas instrucciones.

Los reactivos del kit incluyen compuestos que se unen específicamente a las proteínas marcadoras. Preferiblemente, dichos compuestos son anticuerpos, aptámeros o fragmentos de los mismos.

En una realización preferida, el reactivo es un anticuerpo o fragmentos del mismo.

Los anticuerpos del kit para su uso según la invención pueden usarse según técnicas conocidas en la técnica para determinar los niveles de expresión de proteínas, tales como, por ejemplo, citometría de flujo, inmunotransferencia de tipo Western, ELISA, RIA, EIA competitivo, DAS-ELISA, técnicas basadas en el uso de biochips, microalineamientos de proteínas o ensayos de precipitación coloidal en tiras reactivas.

Los anticuerpos pueden fijarse a un soporte sólido tal como una membrana, un plástico o un vidrio, opcionalmente tratado para facilitar la fijación de dichos anticuerpos al soporte. Dicho soporte sólido comprende, al menos, un conjunto de anticuerpos que reconocen específicamente el marcador y que puede usarse para detectar los niveles de expresión de dicho marcador.

Adicionalmente, los kits para su uso según la invención comprenden reactivos para detectar una proteína codificada por un gen constitutivo. La disponibilidad de dichos reactivos adicionales permite normalizar las mediciones realizadas en diferentes muestras (por ejemplo, la muestra a analizar y la muestra de control) para descartar que las diferencias en la expresión de los biomarcadores se deban a una cantidad diferente de la cantidad de proteína total en la muestra más que a las diferencias reales en los niveles relativos de expresión. Los genes constitutivos en la presente invención son genes que siempre están activos o se transcriben constantemente y que codifican proteínas que se expresan constitutivamente y llevan a cabo funciones celulares esenciales. Las proteínas que se expresan constitutivamente y pueden usarse en la presente invención incluyen, sin limitación, p-2-microglobulina (B2M), ubiquitina, proteína ribosómica 18-S, ciclofilina, GAPDH, PSMB4, tubulina y actina.

En una realización preferida, los reactivos para someter a ensayo los niveles de los diferentes biomarcadores comprenden al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 % o al menos el 100 % de la cantidad total de reactivos para someter a ensayo biomarcadores que forman el kit. Por lo tanto, se da a conocer que, en el caso particular de kits que comprenden reactivos para someter a ensayo los niveles de RBP4 y/o GFPA, los reactivos específicos para dichos biomarcadores (es decir, anticuerpos que se unen específicamente a RBP4 y/o GFPA) comprenden al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 % o al menos el 100 % de los anticuerpos presentes en el kit.

En una realización preferida, la invención se refiere al uso del kit en el tercer o cuarto método de la invención. También se da a conocer el uso del kit en el primer o segundo método de la divulgación.

En otra realización preferida, el kit para su uso según la invención comprende un reactivo para determinar el nivel de GFAP y un reactivo para determinar el nivel de un marcador seleccionado del grupo que consiste en NEF3, psinucleína, CARNS1 y RBP4. Por lo tanto, en una realización preferida, el kit para su uso según la invención comprende reactivos para determinar el nivel de GFAP y NEF3; GFAP y p-sinucleína; GFAP y CARNS1; o GFAP y RBP4.

En otra realización preferida, el kit para su uso según la invención comprende un reactivo para determinar el nivel de GFAP y reactivos para determinar el nivel de dos marcadores seleccionados del grupo que consiste en NEF3, psinucleína, CARNS1 y RBP4. Por lo tanto, en una realización preferida, el kit para su uso según la invención comprende reactivos para determinar los niveles de GFAP, NEF3 y p-sinucleína; GFAP, NEF3 y CARNS1; GFAP, NEF3 y RBP4; GFAP, p-sinucleína y CARNS1; GFAP, p-sinucleína y RBP4; o GFAP, CARNS1 y RBP4.

En otra realización preferida, el kit para su uso según la invención comprende un reactivo para determinar el nivel de GFAP y reactivos para determinar el nivel de tres marcadores seleccionados del grupo que consiste en NEF3, psinucleína, CARNS1 y RBP4. Por lo tanto, en una realización preferida, el kit para su uso según la invención comprende reactivos para determinar el nivel de GFAP, NEF3, p-sinucleína y CARNS1; GFAP, NEF3, p-sinucleína y RBP4; GFAP, NEF3, CARNS1 y RBP4; o GFAP, p-sinucleína, CARNS1 y RBP4.

En otra realización preferida, el kit para su uso según la invención comprende un reactivo para determinar el nivel de GFAP y reactivos para determinar los niveles de cuatro marcadores NEF3, p-sinucleína, CARNS1 y RBP4. Por lo tanto, en una realización preferida, el kit para su uso según la invención comprende reactivos para determinar el nivel de GFAP, NEF3, p-sinucleína, CARNS1 y RBP4.

En una realización más preferida, el kit para su uso según la invención comprende reactivos para determinar el nivel de GFAP y NEF3; GFAP y p-sinucleína; GFAP, NEF3 y p-sinucleína; GFAP y CARNS1; GFAP, CARNS1 y NEF3; GFAP, CARNS1 y RBP4; GFAP, p-sinucleína y RBP4, GFAP, NEF y RBP4 o GFAP y RBP4. Todos los términos, las realizaciones y divulgaciones descritas previamente en relación con los métodos de la divulgación y de la invención son igualmente aplicables al kit para su uso según la invención.

La invención se describirá por medio de los siguientes ejemplos que deben considerarse como meramente ilustrativos y no limitativos del alcance de la invención.

Ejemplos

Materiales y métodos

Población de estudio

Un número total de 170 pacientes con accidente cerebrovascular agudo ingresaron en el departamento de urgencias del Hospital Universitario Vall d'Hebrón (Barcelona, España) desde 2004 hasta 2010 (ejemplo 1). Se incluyeron un número total de 74 pacientes con accidente cerebrovascular ingresados en el departamento de urgencias de1Hospital Universitario Vall d'Hebrón (Barcelona, España) desde 2012 hasta 2015 (ejemplos 2 y 3). El diagnóstico de accidente cerebrovascular se basó en un protocolo estandarizado y previamente descrito de evaluación clínica y neurorradiológica (Mendioroz, M. et al. Osteopontin predicts long-term functional outcome among ischemic stroke patients. J. Neurol. 258, 486-493 (2011). La gravedad del accidente cerebrovascular se evaluó utilizando la escala de accidente cerebrovascular de los Institutos Nacionales de Salud (NIHSS) (Brott, T. & Bogousslavsky, J. J. Treatment of acute ischemic stroke. N. Engl. J. Med. 343, 710722 (2000)). El plasma se separó inmediatamente en tubos de EDTA por centrifugación a 1500 g durante 15 min a 4°C y se almacenó a -80°C hasta su uso y se recogieron datos clínicos con enmascaramiento de los resultados de biomarcadores plasmáticos (Montaner, J. et al. Differentiating ischemic from hemorrhagic stroke using plasma biomarkers: the S100B/RAGE pathway. J. Proteomics 75, 4758-4765 (2012)). Se obtuvo el consentimiento por escrito de todos los pacientes según la declaración de Helsinki.

Fase de descubrimiento

Ejemplo 1: Se obtuvo un número total de 9 grupos de plasma de muestras individuales de 36 pacientes con accidente cerebrovascular isquémico (IS) coincidentes en edad, sexo, NIHSS y etiología del accidente cerebrovascular. Cada grupo estaba formado por 4 muestras individuales de pacientes con características clínicas similares que se mezclaron por agitación durante 2 horas a 4°C. Estos 9 grupos se compararon con muestras de plasma individuales obtenidas de 10 pacientes con hemorragias intracerebrales (ICH).

Se cribó una biblioteca de 177 proteínas humanas con ELISA de tipo sándwich multiplexados de la plataforma SearchLight® (AushonBioSystems, Billerica, MA, EE. UU.), basándose en la detección quimioluminiscente de moléculas cuyos respectivos anticuerpos de captura se combinaron en placas de 96 pocillos.

Ejemplos 2 y 3: Una primera selección de biomarcadores proteicos candidatos se basó en el Atlas de Proteínas Humanas (HPA) versión 13 (Uhlen, M. et al. Towards a knowledge-based Human Protein Atlas. Nat. Biotechnol. 2010, 28 (12), 1248-50.). HPA proporciona los perfiles de expresión para proteínas en 48 tejidos humanos diferentes y en más de 40 tipos de células. Los datos de expresión de proteínas se basan en resultados de inmunohistoquímica obtenidos en microalineamientos de tejido. La lista completa de todas las proteínas incluidas en el Atlas de Proteínas Humanas se descargó de http://www.proteinatlas.org/about/download y se seleccionaron aquellas proteínas con información de apoyo (“apoyo” significa que más de un anticuerpo notificó patrones similares de expresión de la proteína). Las proteínas con datos de apoyo se clasificaron usando los criterios: i) proteínas con una expresión alta/media en tejidos cerebrales (corteza cerebral, ventrículos laterales, hipocampo y cerebelo) y baja o no detectada en otros tejidos; ii) proteínas con una alta expresión en células gliales y no detectada en otros tipos de células. Los primeros criterios se usaron para obtener una lista de proteínas enriquecidas en el cerebro, mientras que los segundos criterios se usaron para obtener una lista de proteínas específicas de las células gliales, similar al perfil de expresión de la proteína GFAP.

Una segunda lista de candidatos proteicos estaba compuesta por las proteínas de la familia de los neurofilamentos. Esta familia de proteínas son las principales proteínas estructurales de las neuronas y muestran una alta abundancia en neuronas más grandes, axones y axones de proyección larga (Melissa M. et al Neurofilament Proteins as Body Fluid Biomarkers of Neurodegeneration in Multiple Sclerosis). Los miembros de esta familia son polipéptido medio de neurofilamentos (NEF3), polipéptido ligero de neurofilamentos (NEFL), polipéptido pesado de neurofilamentos (NEFH), alfa internexina (Ina), periferina (Per) y sinemina (Syn).

Primera fase de replicación

Ejemplo 1: Las proteínas candidatas se seleccionaron del análisis previo con respecto a sus diferencias estadísticas entre accidente cerebrovascular isquémico y hemorrágico: la globulina de unión a hormona sexual (SHBG) y el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) se analizaron mediante ELISA (R&D systems, EE. UU.); y la apolipoproteína B-100 (Apo B-100), el factor neurotrófico derivado de pigmento (PEDF) y la proteína 4 de unión a retinol (RBP4) se analizaron mediante ELISA de tipo sándwich multiplexados de la plataforma SearchLight® (AushonBioSystems, Billerica, MA, EE. UU.)

Estas proteínas se sometieron a prueba en muestras de plasma individuales obtenidas durante las primeras 6 horas desde el inicio de los síntomas de 20 pacientes con IS y 20 con ICH coincidentes en edad y sexo y con NIHSS similar. En ambas fases (descubrimiento y replicación) los resultados de los biomarcadores se enmascararon a los datos clínicos. Cada muestra se analizó dos veces con un CV inferior al 20 % y se usó el valor medio para el análisis.

Ejemplos 2 y 3: Los niveles de los candidatos seleccionados se analizaron usando el enfoque de HPA de glicoproteína de mielina de oligodendrocitos (OMG) (Cusabio, PR China), neurogranina (NRGN) (Cusabio), proteína asociada al huso, cilios y centriolo (C1orf96) (MyBiosource, EE. UU.), p-sinucleína (Antobodies on-line, Alemania), carnosina sintasa 1 (CARNS1) (Mybiosource), receptor beta-1 adrenérgico (ADRB1) (Cusabio), subunidad alfa-1A de canal de calcio de tipo P/Q dependiente de voltaje (CAC1A) (Elabscience, PR China) y juxtanodina (Mybiosource) mediante inmunoensayo de ELISA. Se incluyeron un total de 74 pacientes con accidente cerebrovascular (40 IS y 34 ICH) en este análisis.

Se analizaron los niveles de polipéptido medio de neurofilamentos (NEF3) (Elabsicence, PR China), polipéptido pesado de neurofilamentos (n Fh ) (Cusabio), polipéptido ligero de neurofilamentos (NFL) (Cusabio), alfa internexina (Ina) (LS bio, EE. UU.), periferina (Per) (Antobodies on-line) y sinemina (Syn) (Mybiosource) mediante inmunoensayo de ELISA en un subgrupo de 31 pacientes (15 IS y 16 ICH). Las proteínas de la familia de los neurofilamentos que mostraron diferencias significativas entre los grupos se analizaron en toda la cohorte de 74 pacientes.

Los niveles de GFAP, juxtanodina, CARNS1, OMG, NRGN, beta sinucleína, NEF3, NFL, sinemina, periferina y alfa internexina se midieron en suero. Los niveles de RBP4, ADRB1, CAC1A y C1orf96 se midieron en plasma.

Segunda fase de replicación

Ejemplo 1: Las proteínas que permanecieron significativamente diferentes entre los subtipos de accidente cerebrovascular se analizaron en muestras de plasma individuales obtenidas durante las primeras 4,5 horas desde el inicio de los síntomas de una segunda cohorte independiente de 38 pacientes con IS y 28 con ICH. Estas proteínas se analizaron junto con proteína ácida fibrilar glial (GFAP) (AbNova, Taiwán).

Análisis estadístico

Se usó el paquete estadístico SPSS 15.0 para el análisis estadístico (ejemplo 1) y se usó el paquete estadístico SPSS 22 para el análisis estadístico (ejemplos 2 y 3). Las diferencias entre grupos se evaluaron mediante la prueba de chicuadrado de Pearson para variables categóricas. La normalidad se evaluó mediante la prueba de Shapiro-Wilk para la fase de descubrimiento y la prueba de Kolmogorov-Smirnov para la fase de replicación. Para variables continuas, los distribuidas de manera normal (p>0,05) se analizaron mediante la prueba de la t de Student o ANOVA y se facilitan los valores de media y desviación estándar (DE), mientras que para las variables con distribución no normal se usaron la prueba de la U de Mann-Whitney o Kruskal-Wallis y se notificaron la mediana y el intervalo intercuartílico (IQR). Se usaron curvas de características operativas del receptor (ROC) para cada biomarcador para obtener los puntos de corte con una precisión óptima (tanto sensibilidad como especificidad) para predecir el subtipo de accidente cerebrovascular. En todos los casos, un p <0,05 se consideró significativo a un nivel de confianza del 95 %. Para construir modelos predictivos, las variables clínicas consideradas se incluyeron en un análisis de regresión logística multivariante gradual hacia adelante. Después de eso, los biomarcadores solos o en combinación se añadieron mediante el método de Enter a modelos predictivos clínicos. Se proporcionaron razones de posibilidades (ORadj) e intervalos de confianza (IC) del 95 %. El AUC de los modelos de regresión logística se comparó mediante el método de Long usando Medcalc v12.3.

Mejora de discriminación integrada (IDI)

Es una contribución estadística comparativa adicional a la proporcionada por las áreas bajo la curva de la información de las curvas ROC (AUC). Una forma de cuantificar la diferencia entre las probabilidades determinadas por el modelo predictivo entre biomarcadores isquémicos y hemorrágicos que se añaden al modelo de accidente cerebrovascular es calculando la IDI.

El cálculo de la IDI se realiza calculando las probabilidades predichas promedio de sujetos que desarrollaron el evento de interés y la capacidad predicha de sujetos que no alcanzaron el evento en modelos con y sin el/los biomarcador(es) añadido(s) y restando los valores de los casos y controles entre sí. El aumento en la diferencia entre los casos y los controles después de la adición del/de los biomarcador(es) es la mejora de la discriminación integrada. Por lo tanto, la IDI es equivalente a la mejora en la diferencia entre el riesgo promedio predicho de individuos que desarrollaron un evento y el riesgo promedio predicho de individuos que no desarrollaron un evento.

Por lo tanto, el cálculo de IDI proporciona un valor numérico a la diferencia entre el modelo con y sin biomarcadores, mientras que el AUC solo indica qué modelo tiene mayor discriminación. Además, la IDI revela si el modelo es mejor en la predicción de eventos (alta sensibilidad) o ausencia de eventos (alta especificidad), proporcionando una idea más completa del modelo de discriminación (Pencina MJ et al., Stat Med 2008;27(2):157-172).

Usando software R (paquetes Hmisc y PredictABEL), se calcularon los índices NRI e IDI para evaluar los FMPP de valor añadido a los modelos predictivos clínicos. En la prueba de NRI, se usaron umbrales clínicamente relevantes previamente especificados de riesgo predicho (<10 % y >90 %) para calcular la reclasificación de los pacientes en grupos de desenlace de riesgo.

En todos los casos, un valor de p <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Mejora de reclasificación neta (NRI)

La mejora de reclasificación neta (NRI) es una medida cada vez más popular para evaluar mejoras en las predicciones de riesgo. La NRI permite conocer el cambio en la probabilidad predicha por el modelo con biomarcadores con respecto al modelo clínico. La NRI evalúa el número neto de individuos clasificados correctamente añadiendo biomarcadores al modelo; por ejemplo, en un modelo que predice la discapacidad a largo plazo, el número de pacientes que realmente padecen una discapacidad se clasifica como eventos por el modelo predictivo que incluye biomarcadores y no estaban en el modelo clínico. De la misma manera que la IDI, el cálculo contempla para la NRI vigente el número de pacientes para ambos eventos y para la ausencia de eventos (Pencina MJ et al., Stat Med 2008; 27(2): 157-172).

La NRI se puede calcular con las probabilidades consideradas como una variable continua, donde el aumento en la probabilidad en un punto indica un cambio de categoría o categorías de riesgo por defecto y la observación de individuos que cambian de un grupo de riesgo a otro. Se recomienda el uso de NRI categórica, habitualmente con un máximo de tres grupos de riesgo (bajo, medio, alto) y que incluyen porcentajes clínicamente relevantes según lo indicado por el modelo predictivo; el uso de NRI continua o con categorías adicionales dará como resultado una sobreestimación de la tasa de reclasificación (Pickering JW et al., Clin J Am Soc Nephrol CJASN. Agosto de 2012; 7(8): 1355-64).

Ejemplo 1-Resultados

Se cribaron nueve muestras de plasma agrupado de pacientes con accidente cerebrovascular con IS aguda y 10 muestras de plasma individuales de pacientes con ICH en una biblioteca de 177 proteínas en la fase de descubrimiento. Entre las 177 proteínas analizadas, solo se encontró que 18 tuvieran diferentes niveles con respecto a los subtipos de accidente cerebrovascular. A partir de estas 18 proteínas, 14 fueron más altas en IS y 4 fueron más altas en iCh (p<0,1) (tabla 1).

Tabla 1: Nivel de biomarcadores con respecto al subtipo de accidente cerebrovascular. Lista de 18 proteínas que se encontraron a diferentes concentraciones entre el grupo de plasma de pacientes con IS y muestras de plasma individuales de pacientes con ICH. Esos biomarcadores distribuidos de manera normal se expresan como media ± DE y los distribuidos de manera no normal se describieron como mediana (IQR). Las proteínas que se seleccionaron para replicaciones adicionales se resaltan en negrita. (p<0,05, significativamente diferente; p<0,1, tendencia). ACRP30: Adiponectina APO B-100: apolipoproteína B-100; BMP-9: proteína morfogenética ósea 9; CC16: proteína de células claras; CD 14: clúster de diferenciación 14; EGF: factor de crecimiento epidérmico; IGFBP 3: proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina 3; MIP 1a: proteína inflamatoria de macrófagos 1 alfa; PEDF: factor derivado del epitelio pigmentario; RBP4: proteína 4 de unión a retinol; SCF: factor de células madre; SHBG: globulina de unión a hormonas sexuales; TARC: quimiocina regulada por timo y activación; VCAM1: molécula de adhesión a células vasculares 1; VEGF: factor de crecimiento endotelial vascular.

Cinco proteínas mostraron la diferencia más significativa (p<0,01). Cuatro de ellas fueron más altas en IS que en ICH: Factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF) (p = 0,006), apolipoproteína 100 (APO B-100) (p=0,005), proteína 4 de unión a retinol (RBP4) (p = 0,002) y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (p = 0,007). Solo se encontró que la globulina de unión a hormonas sexuales (SHBG) era mayor en ICH en comparación con IS (p = 0,009) (figura 1) (tabla 2).

Se realizó una primera fase de replicación en una cohorte independiente de 20 pacientes con accidente cerebrovascular de IS y 20 con ICH (<6 h desde el inicio de los síntomas) coincidentes en edad, sexo y NIHSS. Los pacientes con accidente cerebrovascular de IS tenían concentraciones plasmáticas más altas de RBP4, APO B-100 y PEDF que los pacientes con ICH (p = 0,009; p=0,003 y p=0,028, respectivamente), mientras que no se encontraron diferencias en los niveles de SHb G (p = 0,839) ni VEg F (p = 0,756) (figura 2) (tabla 2).

Tabla 2: Niveles de biomarcadores candidatos en cada fase experimental con respecto al subtipo de accidente cerebrovascular. Se muestra la lista de biomarcadores candidatos que se analizaron durante cada etapa experimental. Los biomarcadores distribuidos de manera normal se expresan como media ± DE y los distribuidos de manera no normal se describieron como mediana (IQR). Los biomarcadores candidatos finales seleccionados para el análisis de regresión logística se resaltan en negrita. (p<0,05, significativamente diferente; p<0,1, tendencia)

RBP4, APOB100 y PEDF se sometieron a prueba en una tercera cohorte de pacientes con accidente cerebrovascular hiperagudo (<4,5 h de evolución desde el inicio de los síntomas) con 38 IS y 28 ICH. Estos tres candidatos se analizaron junto con GFAP y RAGE, que se ha informado ampliamente que están asociados con accidente cerebrovascular hemorrágico e isquémico, respectivamente. En esta cohorte, más pacientes con IS padecían hipertensión (p = 0,005) y cardiopatía isquémica (p = 0,004) que pacientes con ICH. La fibrilación auricular y la dislipidemia estaban levemente asociadas con IS (p=0,111 y p=0,101, respectivamente) y el sexo masculino estaba relacionado con ICH (p = 0,107) pero solo cerca de una tendencia (tabla 3).

Tabla 3: Características demográficos basales y perfil de factores de riesgo en la cohorte de la segunda fase de replicación. Los factores resaltados en negrita mostraron diferencias estadísticamente significativas entre IS e ICH (p<0,05) y se incluyeron en el análisis de regresión logística. Sin embargo, la hipertensión permaneció como la única variable clínica asociada independientemente con IS y considerada en el modelo clínico.

Los niveles plasmáticos de RBP4 fueron más elevados en IS en comparación con ICH (p = 0,011) mientras que GFAP fue significativamente mayor en ICH (p<0,0001) (figura 3). No se encontraron diferencias en las concentraciones plasmáticas de APO B-100 y RAGE entre ambos subtipos de accidente cerebrovascular (tabla 2). Los resultados de PEDF se excluyeron para un análisis adicional debido al CV alto entre los controles entre placas.

Teniendo en cuenta RBP4 como el único biomarcador que diferenció IS de ICH en todas las etapas de replicación y GFAP, los inventores determinaron mediante análisis de curvas ROC RBP4>49,53 |ig/ml y GFAP<0,07 ng/ml como los mejores puntos de corte de biomarcador para diferenciar IS de ICH (sensibilidad = 63,2 %; especificidad = 32 %; PPV (valor predictivo positivo) = 85,7 % y NPV (valor predictivo negativo) = 100 %) (figura 4).

El análisis de regresión logística mostró la hipertensión como la única variable clínica asociada independientemente con IS (ORadj 4,571 [IC del 95 % 1,516-13,781] p=0,007). Ambos, RBP4 y GFAP dicotomizados por cada punto de corte, se añadieron por separado (RBP4: ORadj 3,99 [IC del 95 % 1,03-15,450] p=0,045; GFAP: ORadj 0,029 [IC del 95 % 0,003-0,272] p=0,029) o en combinación (ORadj 7,591 [IC del 95 % 2,422-23,79] p=0,001) (tabla 4). El AUC (área bajo la curva) del modelo clínico excluyendo los biomarcadores fue de 0,658 (IC del 95 % [0,521-0,795]). Esta área aumentó cuando se incluyeron RBP4 (AUC = 0,743 (IC del 95 % [0,620-0,867]), p=0,0368) o GFAP (AUC=0,788 (IC del 95% [0,665-0,911]), p=0,0046) en el modelo clínico. Sin embargo, el modelo con la mejor capacidad de discriminación fue el de las variables clínicas y tanto RBP4 como GFAP (AUC = 0,847 (IC del 95 % [0,740-0,953]), p=0,0028) en comparación con la variable clínica sola (figura 5).

Los autores analizaron los índices de mejora de discriminación integrada (IDI) y mejora de reclasificación neta (NRI) para evaluar adicionalmente el valor añadido de RBP4 y GFAP a la base clínica. Al determinar la concentración plasmática de ambos biomarcadores, pudieron aumentar significativamente la discriminación entre los sujetos que padecían IS y los que padecían ICH (índice de IDI 29,3 %, p=6,6*10'6). Además, la combinación de RBP4 y GFAP se reclasificó significativamente en categorías de mayor riesgo (índice de NRI 60,63 %, p=0,0002) (tabla 4).

Tabla 4: Comparación entre modelos predictivos. Se facilitan ORadj (IC del 95 %) y el valor de p para todos los modelos de regresión logística. Se añadieron biomarcadores al modelo de regresión logística clínica usando el punto de corte: RBP4>49,53 pg/ml y GFAP<0,07 ng/ml. AUC: Área bajo la curva ROC; área con IC del 95 % facilitado para cada modelo. Modelo clínico siempre.

Tabla 4: Comparación entre modelos predictivos. Se facilitan ORadj (IC del 95 %) y el valor de p para todos los modelos de regresión logística. Se añadieron biomarcadores al modelo de regresión logística clínica usando el punto de corte: RBP4>49,53 pg/ml y GFAP<0,07 ng/ml. AUC: Área bajo la curva ROC; área con IC del 95 % facilitado para cada modelo. El modelo clínico siempre se usó como modelo de referencia para comparar. La significación estadística se resalta en negrita.

Se realizó el mismo análisis con un modelo clínico de edad ajustado por edad, sexo y NIHSS tal como se describió anteriormente (Montaner, 2012 citado anteriormente), junto con HTA.

En el análisis de regresión logística, tanto RBP4 como GFAP dicotomizados por cada punto de corte se añadieron por separado (RBP4: ORadj 4,673 [IC del 95 % 1,331-16,404] p=0,016; GFAP: 0,034 [IC del 95 % 0,003-0,332] p=0,004) o en combinación (ORadj 9,423 [IC del 95% 2,450-36,249] p=0,001) (tabla 5). El AUC del modelo clínico ajustado excluyendo biomarcadores fue de 0,731 (IC del 95 % [0,605-0,858]). Esta área aumentó cuando se incluyeron RBP4 (AUC = 0,775 (IC del 95 % [0,648-0,903])) o GFAP (AUC=0,823 (IC del 95 % [0,712-0,935]) en el modelo clínico. Sin embargo, el modelo con la mejor capacidad de discriminación fue el de las variables clínicas y tanto RBP4 como GFAP (AUC = 0,867 (IC del 95 % [0,763-0,972]), p=0,04) en comparación con la variable clínica sola (figura 6) (tabla 5).

Los inventores también analizaron los índices de mejora de discriminación integrada (IDI) y mejora de reclasificación neta (NRI) para evaluar adicionalmente el valor añadido de RBP4 y GFAP a la base clínica. Al determinar la concentración plasmática de ambos biomarcadores, los inventores pudieron aumentar significativamente la discriminación entre los sujetos que padecían IS y los que padecían ICH (índice de IDI 27,6 %, p=1,98*10-5). Además, la combinación de RBP4 y GFAp se reclasificó significativamente en categorías de mayor riesgo (índice de NRI 60,63 %, p = 1*10-5) (tabla 5).

Tabla 5: regresión logística multivariante con un modelo clínico ajustado por edad, sexo y NIHSS.

Observando los puntos de corte con la máxima especificidad para el accidente cerebrovascular isquémico y/o hemorrágico, los inventores encontraron (figura 4) que un punto de corte de RPB4 = 57,8 pg/ml y GFAP=0,07 ng/ml para un accidente cerebrovascular isquémico conducen a una sensibilidad = 36,8 %, especificidad = 100 %, PPV = 100 % y NPV = 51 % y para accidente cerebrovascular hemorrágico: sensibilidad = 36 %, especificidad = 100 %, PPV = 100% y NPV = 70%.

Adicionalmente, un punto de corte de RPB4 = 61 pg/ml y GFAP = 0,07 ng/ml para un accidente cerebrovascular isquémico conducen a una sensibilidad = 34,2 %, especificidad = 100 %, PPV = 100 % y NPV = 50 % y para accidente cerebrovascular hemorrágico: sensibilidad = 44 %, especificidad = 100 %, PPV = 100 % y NPV = 73 %.

Ejemplo 2

Selección de biomarcadores candidatos proteicos de HPA

En la tabla 6 se muestran proteínas que mostraron una alta expresión en el cerebro (corteza cerebral, ventrículos laterales, hipocampo y cerebelo) y estaban bajas o no detectadas en otros tejidos. Tabla 7, la lista de proteínas que parecían ser específicas de células gliales, mostrando un perfil de expresión similar a GFAP (específico de células gliales). Las proteínas C1orf96, OMG, NRGN, CAC1A, p-sinucleína, CARNS1, ADRB1 y juxtanodina se seleccionaron para analizarse mediante inmunoensayo de ELISA en muestras de suero/plasma de pacientes con accidente cerebrovascular, basado en su PUNTUACIÓN, su función, la bibliografía actual o disponibilidad de inmunoensayo comercial.

Tabla 6: Las 10 proteínas superiores que mostraron una alta expresión en el tejido cerebral y baja o no determinada en otros tejidos. La puntuación se calculó añadiendo 1 para cada tejido en el que la proteína correspondiente estaba baja o no detectada. Cuanto mayor sea la puntuación, más específica del cerebro es la proteína.

Tabla 7: Las 10 proteínas superiores que mostraron un alto nivel de expresión en células gliales y no se detectaron en otros tipos de células. La PUNTUACIÓN se calculó añadiendo 1 para cada tipo de célula en la que no se detectó la proteína correspondiente. Cuanto mayor sea la puntuación, más específica de la glía es la proteína.

Análisis de neurofilamentos

Entre las proteínas de la familia de los neurofilamentos, solo NEF3 mostró diferencias significativas entre los pacientes con IS e ICH (p = 0,024) (figura 7) y se seleccionó para analizarse en toda la cohorte de 74 pacientes con accidente cerebrovascular junto con los biomarcadores proteicos seleccionados usando datos de h Pa . Los niveles de NFH fueron indetectables en todos los pacientes analizados.

Niveles de biomarcadores seleccionados en diferentes subtipos de accidente cerebrovascular

Se analizaron las proteínas C1orf96, OMG, NRGN, p-sinucleína, CARNS1, CAC1A, ADRB1 seleccionadas del enfoque basado en HPA, junto con NEF3 de la familia de neurofilamentos, mediante inmunoensayo de ELISA en muestras de suero/plasma de 74 pacientes con accidente cerebrovascular. Las proteínas GFAP y RBP4 también se analizaron en esta nueva cohorte. Esta cohorte de 74 pacientes presentó NIHSS>4 y tuvo menos de 4,5 horas de evolución desde el inicio de los síntomas. Además, los pacientes con IS e ICH se equilibraron por edad, sexo y etiología. La tabla 8 muestra las principales características gráficas de los pacientes que se incluyeron en esta cohorte.

Frecuenci

Sexo (fem e 34 (45,9 %

Hipertensió 57 (77 %)

D islip idem i 36 (48,6 %

Diabetes m 21 (28,4 %

Tabaquism 10 (13 ,5 %

Alcohol 5 (6,8 %)

A ccidente

cerebrovas

isquém ico 40 (54,1 %

Edad (años) 73,47 ±11 ,

N IH SS (bas

13,2 ±6 ,06

Tabla 8: Datos demográficos principales de los 74 pacientes con accidente cerebrovascular que se incluyeron en la nueva cohorte. La media y la De se indican para variables continuas.

Los inventores encontraron diferencias significativas con respecto a los niveles de GFAP (p<0,001) y NEF3 (p = 0,024) entre pacientes con IS e ICH. Los pacientes con IS también tenían una tendencia a tener niveles más altos en psinucleína (0,136) (figura 8). La tabla 9 muestra los niveles de cada proteína analizada.

Tabla 9: Niveles de biomarcadores proteicos analizados en plasma/suero de pacientes con IS e ICH. Las variables distribuidas de manera normal se indican como media desviación estándar (DE), mientras que las distribuidas de manera no normal muestran la mediana y el intervalo intercuartílico (IQR).

Después de un análisis univariante, los inventores encontraron diferencias significativas con respecto al consumo de alcohol y se encontró un aumento de la tensión arterial sistólica y diastólica en pacientes con ICH en comparación con IS (p<0,05) (tabla 10)

Tabla 10: Análisis univariante entre pacientes con IS e ICH. Las variables distribuidas de manera normal muestran la media DE, mientras que las distribuidas de manera no normal muestran la mediana y el intervalo intercuartílico.

Sensibilidad y especificidad

Los inventores identificaron los puntos de corte que proporcionaron la mejor sensibilidad y especificidad por medio de la curva ROC. Niveles de p-sinucleína>270,312 ng/ml mostraron una sensibilidad = 97,2%, especificidad=36,4 %, valor predictivo positivo = 62,5 % (48,55 %-75,08 %) y valor predictivo negativo = 92,31 % (63,97 %-99,81 %). NEF3>17,796 ng/ml mostró una sensibilidad = 76,7%, especificidad=72,7 %, valor predictivo positivo = 79,31 % (60,28 %-92,01 %) y valor predictivo negativo = 69,57 % (47,08 %, 86,79 %). Finalmente, GFAP<0,07 recuperó una sensibilidad = 97,3%, especificidad=72,73 %, valor predictivo positivo=80 % (65,4 %-90,42 %), valor predictivo negativo = 96% (79,65 %-99,9 %) (figura 9). Las figuras 10A y 10B muestran la selección de pacientes cuando NEF3>17,796 ng/ml y p-sinucleína>270,312 ng/ml se consideraron juntos en combinación con GFAP. Cuando los inventores combinaron los biomarcadores dicotomizados por su punto de corte correspondiente, la combinación de GFAP<0,07 y NEF3>17,796 ng/ml detectó el subtipo IS con una sensibilidad = 76,67 %, especificidad = 86,36 %, valor predictivo positivo = 88,46 % (69,85 %-97,55 %), valor predictivo negativo = 73,08 % (52,21 %-88,43 %). Por otro lado, la combinación de GFAP<0,07 y p-sinucleína>270,312 detectó IS con una sensibilidad = 94,44 %, especificidad=78,79 %, valor predictivo positivo = 82,93 % (67,94 %-82,85 %), valor predictivo negativo = 92,86 % (76,5 %-99,12 %) (figura 10 C)

Modelos predictivos

Los biomarcadores NEF3 y p-sinucleína (dicotomizados por su punto de corte correspondiente) se añadieron al modelo predictivo compuesto por GFAP y ajustado por edad, sexo y NIHSS en el nivel basal y mostraron un ORadj = 5,652 (IC del 95% 0,746-42,803); p=0,094 y ORadj = 22,487 (0,999-506,38); p=0,05, respectivamente (tabla 11). Cuando se combinó GFAP con NEF3 y p-sinucleína por separado, la combinación parecía ser un factor de pronóstico independiente de accidente cerebrovascular isquémico (16,773 (4,06-69,28); p<0,001, para GFAP/NEF3; y 104,08 (9,82-1103,11); p<0,001 para GFAP/p-sinucleína). Ni NEF3 ni p-sinucleína aumentaron significativamente la precisión del modelo predictivo cuando se añadieron a GFAP (basándose en los valores de AUC), sin embargo, NEF3 aumentó significativamente la discriminación entre sujetos que padecían una IS y aquellos con ICH (índice de IDI 9,72 % (3,67, 15,76); p=0,002). Además, NEF3 se reclasificó significativamente en categorías de mayor riesgo cuando se añadió a GFAP o en combinación con GFAP (NRI 45,76 %) (24,374-66,77), p<0,001; y NRI 30 % (5,54, 54,46), p=0,016). Para analizar el rendimiento de los biomarcadores NEF3 y p-sinucleína junto con GFAP en un modelo clínico simple, se realizó el mismo análisis considerando la edad como la única variable clínica (tabla 12). La combinación de NEF3 con GFAP así como p-sinucleína con GFAP fueron factores de pronóstico independientes de IS (16,71 (4,03-69,24); p<0,001 y 48,75 (8,53-278,72); p<0,001). La bondad de ajuste de todos los modelos analizados fue buena (p>0,05). Considerando las probabilidades que recuperaron cada modelo predictivo, la predicción del subtipo de accidente cerebrovascular se calculó basándose en una especificidad del 80 % (tabla 13). Cuando se añadió NEF3 al modelo que contenía la edad, sexo, NIHSS y GFAP, el 100 % de los pacientes que se predijo que tenían ICH tenían realmente ICH y un 94,9 % de la IS predicha dio como resultado una IS clínicamente diagnosticada.

Tabla 11: Comparación entre modelos predictivos. Se facilitan ORadj (IC del 95%) y el valor de p para todos los modelos de regresión logística. Se añadieron biomarcadores al modelo de regresión logística clínica usando puntos de corte: NEF3>17,796 ng/ml, p-sinucleína>270,312 ng/ml y GFAP<0,07 ng/ml. AUC: Área bajo la curva ROC; área con IC del 95 % facilitado para cada modelo. El modelo clínico con GFAP se usó siempre como modelo de referencia para comparar. La significación estadística está resaltada en negrita.

Tabla 12: Comparación entre modelos predictivos. Se facilitan ORadj (IC del 95% ) y el valor de p para todos los modelos de regresión logística. Se añadieron biomarcadores al modelo de regresión logística clínico usando puntos de corte: NEF3>17,796 ng/ml, p-sinucleína>270,312 ng/ml y GFAP<0,07 ng/ml. AUC: Área bajo la curva ROC; área con IC del 95 % facilitado para cada modelo. El modelo clínico con GFAP se usó siempre como modelo de referencia para comparar. La significación estadística está resaltada en negrita.

Tabla 13: Predicción del subtipo de accidente cerebrovascular basándose en las probabilidades recuperadas por el modelo predictivo correspondiente. Una especificidad en el 80 % se consideró como umbral.

Las variables clínicas incluyeron edad, sexo y NIHSS en el nivel basal. Los porcentajes indican la proporción de subtipo predicho que se clasificó correctamente como ICH o IS.

Ejemplo 3

Sensibilidad y especificidad de CARNS1

Adicionalmente para GFAP, NEF3 y beta-sinucleína, los inventores identificaron por medio de la curva ROC el mejor punto de corte para CARNS1. CARNS1>123,255 ng/ml notificó una sensibilidad del 92 %, una especificidad del 48 %, valor predictivo positivo = 65,79% (48,65 %-80,37%) y valor predictivo negativo = 85,71 % (57,19%-98,22 %). Cuando se combinó con GFa P<0,07, CARNS1>123,255 notificó una sensibilidad del 89,89 % y una especificidad del 84 % para IS con un PPV = 85,71 % (67,33 %-95,97 %) y un NPV de 87,5 % (67,64 %-97,34 %) (figura 11).

Modelos predictivos

Los inventores realizaron una regresión logística que incluía todas las variables clínicas que notificaron diferencias significativas entre IS e ICH en el análisis univariante. Solo la SBP (tensión arterial sistémica) permaneció como un factor de pronóstico independiente del subtipo de accidente cerebrovascular (datos no mostrados). Los inventores desarrollaron nuevos modelos predictivos para el accidente cerebrovascular de IS incluyendo SBP, junto con la edad, sexo y NIHSS en el nivel basal como variables clínicas, y añadieron consecutivamente GFAP<0,07, NEF3>17,796 y CARNS1>123,255. Cuando se añadió al modelo clínico junto con GFAP, NEF3 dio como resultado un factor de pronóstico de IS con una tendencia ORadj=7,511 (IC del 95 % 0,698-80,868); p=0,096) y CARNS1 mostró resultados muy similares ORadj=7,565 (IC del 95 % 0,691-82,84); p=0,097). Adicionalmente, NEF3 aumentó significativamente la discriminación entre sujetos que padecían una IS y aquellos con ICH (índice de IDH 10,37 % (2-18,7); p=0,015). Tanto NEF3 como CARNS1 se reclasificaron en categorías de mayor riesgo cuando se añadieron a GFAP (NRI 32,2 % (11,8 52,7), p=0,002 y NRI 30,95 % (6,04-55,86), p=0,01, respectivamente)) (tabla 14).

Tabla 14: Comparación entre modelos predictivos. Se facilitan ORadj (IC del 95% ) y el valor de p para todos los modelos de regresión logística. Se añadieron biomarcadores al modelo de regresión logística clínico usando puntos de corte: NEF3>17,796 ng/ml, CARNS1>123,255 ng/ml y GFAP<0,07 ng/ml. AUC: Área bajo la curva ROC; área con IC del 95 % facilitado para cada modelo. El modelo clínico con GFAP se usó siempre como modelo de referencia para comparar. La significación estadística está resaltada en negrita.

De manera similar a lo notificado anteriormente, considerando las probabilidades que recuperaban cada modelo predictivo, se calculó la predicción del subtipo de accidente cerebrovascular basándose en una especificidad del 80 % (tabla 15). Cuando se añadieron tanto CARNS1 como NEF3 al modelo que contenía la edad, sexo, NIHSS, SBP y GFAP, el 100 % de los pacientes que se predijo que tenían ICH tenían ICH realmente. El porcentaje de IS predicho correctamente aumentó ligeramente cuando se añadió NEF3 al modelo.

Tabla 15: Predicción del subtipo de accidente cerebrovascular basándose en las probabilidades recuperadas por el modelo predictivo correspondiente. Una especificidad del 80 % se consideró como umbral.

Las variables clínicas incluyeron edad, sexo y NIHSS en el nivel inicial y SBP. Los porcentajes indican la proporción de subtipo predicho que se clasificó correctamente como ICH o IS.

Los datos de sensibilidad y especificidad de marcadores individuales y combinaciones para accidente cerebrovascular isquémico se resumen en la tabla 16.

Tabla 16. Especificidad y sensibilidad para diferenciar accidente cerebrovascular de IS de ICH usando diferentes biomarcadores.

Los datos de sensibilidad y especificidad de marcadores individuales y combinaciones para accidente cerebrovascular hemorrágico se resumen en la tabla 17.

Tabla 17. Especificad y sensibilidad para diferenciar accidente cerebrovascular ICH de IS usando diferentes biomarcadores.

Claims

REIVINDICACIONES

i . Método in vitro para diferenciar accidente cerebrovascular isquémico de accidente cerebrovascular hemorrágico en un paciente, que comprende

a) determinar el nivel de proteína ácida fibrilar glial (GFAP) en una muestra de dicho paciente, en el que dicha muestra es una muestra de suero, plasma o sangre, en combinación con el nivel de uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en polipéptido medio de neurofilamentos (NEF3), p-sinucleína, proteína 1 que contiene dominio de ATP-Grasp (CARNS1) y proteína 4 de unión a retinol (RBP4) y

b) comparar dichos niveles con un valor de referencia correspondiente

en el que un nivel de GFAP en dicha muestra inferior al valor de referencia correspondiente y un nivel de NEF3, p-sinucleína, CARNS1 y/o RBP4 superior al valor de referencia correspondiente es indicativo de que el paciente padece accidente cerebrovascular isquémico o en el que un nivel de GFAP en dicha muestra superior al valor de referencia y un nivel de NEF3, p-sinucleína, CARNS1 y/o RBP4 inferior al valor de referencia correspondiente es indicativo de que el paciente padece accidente cerebrovascular hemorrágico.
2. Método in vitro para seleccionar un paciente que padece accidente cerebrovascular para una terapia con un agente antitrombótico o con un agente capaz de reducir la tensión arterial que comprende

a) determinar el nivel de GFAP en una muestra de dicho paciente, en el que dicha muestra es una muestra de suero, plasma o sangre, en combinación con el nivel de uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en NEF3, p-sinucleína, CARNS1 y RBP4 y

b) comparar dichos niveles con un valor de referencia correspondiente

en el que un nivel de GFAP en dicha muestra inferior al valor de referencia correspondiente y un nivel de NEF3, p-sinucleína, CARNS1 y/o RBP4 superior al valor de referencia correspondiente s indicativo de que el paciente es un candidato para una terapia con un agente trombolítico o

en el que un nivel de GFAP en dicha muestra superior al valor de referencia y un nivel de NEF3, p-sinucleína, CARNS1 y/o RBP4 inferior al valor de referencia correspondiente es indicativo de que el paciente es un candidato para una terapia con un agente capaz de reducir la tensión arterial.
3. Método in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, que comprende determinar el nivel de GFAP y NEF3; GFAP y p-sinucleína; GFAP, NEF3 y p-sinucleína; GFAP y CARNS1; GFAP, CARNS1 y NEF3; GFAP, CARNS1 y RBP4; GFAP, p-sinucleína y RBP4; GFAP, NEF y RBP4 o GFAP y RBP4.
4. Método según las reivindicaciones 2 o 3, en el que el agente antitrombótico es un agente trombolítico.
5. Método según la reivindicación 4, en el que el agente trombolítico es un activador de plasminógeno.
6. Método según la reivindicación 5, en el que el activador de plasminógeno es activador de plasminógeno tisular.
7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el valor de referencia para GFAP es 0,07 ng/ml, el valor de referencia para NEF3 es 17,796 ng/ml, el valor de referencia para p-sinucleína es 270,312 ng/ml, el valor de referencia para CARNS1 es 123,255 ng/ml y/o el valor de referencia para RBP4 es 49,53 pg/ml.
8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende además determinar uno o más parámetros clínicos, en el que el uno o más parámetros clínicos se seleccionan del grupo que consiste en hipertensión, edad, puntuación de NIHSS, sexo y tensión arterial sistólica.
9. Método según la reivindicación 8, en el que el uno o más parámetros clínicos son hipertensión y en el que si el paciente tiene hipertensión es indicativo de que el paciente padece accidente cerebrovascular isquémico o que el paciente es un candidato para una terapia con un agente trombolítico.
10. Uso in vitro de un kit para diferenciar accidente cerebrovascular isquémico de accidente cerebrovascular hemorrágico o para seleccionar un paciente que padece accidente cerebrovascular para una terapia con un agente antitrombótico o con un agente capaz de reducir la tensión arterial, en el que el kit comprende un primer reactivo para detectar el nivel de GFAP y al menos un segundo reactivo para detectar el nivel de al menos un segundo marcador seleccionado del grupo que consiste en NEF3, p-sinucleína, CARNS1, RBP4, o una combinación de los mismos.

Ċ
11. Uso según la reivindicación 10, en el que el reactivo es un anticuerpo.