ES2875248B2

ES2875248B2 - Use of Spanolepis selloanae as biological control agent of the invasive plant Cortaderia selloana

Info

Publication number: ES2875248B2
Application number: ES202030389A
Authority: ES
Inventors: Díaz Jaime Fagúndez; García María José Servia
Original assignee: Universidade da Coruna
Current assignee: Universidade da Coruna
Priority date: 2020-05-04
Filing date: 2020-05-04
Publication date: 2022-04-01
Anticipated expiration: 2040-05-04
Also published as: WO2021224524A1; ES2875248A1

Description

DESCRIPCIÓNDESCRIPTION

Uso de Spanolepis selloanae como agente de control biológico de la planta invasora Cortadera selloana Use of Spanolepis selloanae as biological control agent of the invasive plant Cortadera selloana

CAMPO TÉCNICOTECHNICAL FIELD

La presente invención se refiere al uso de una nueva especie de díptero identificada y nombrada como Spanolepis selloanae como agente de control biológico para el control de la planta exótica invasora Cortadera selloana. Adicionalmente, la presente invención describe composiciones que comprenden dicho díptero, así como sus usos en métodos de control y erradicación de la planta invasora. La presente invención también se refiere a los métodos de conservación del agente de control. Por lo tanto, la presente invención se engloba dentro del campo técnico del sector medioambiental, y más concretamente del sector destinado al control del crecimiento de especies vegetales invasoras mediante el uso de agentes de control biológico.The present invention refers to the use of a new species of Diptera identified and named as Spanolepis selloanae as a biological control agent for the control of the invasive exotic plant Cortadera selloana. Additionally, the present invention describes compositions comprising said dipteran, as well as their uses in methods of control and eradication of the invasive plant. The present invention also relates to control agent preservation methods. Therefore, the present invention falls within the technical field of the environmental sector, and more specifically in the sector aimed at controlling the growth of invasive plant species through the use of biological control agents.

ESTADO DE LA TÉCNICASTATE OF THE ART

Las especies exóticas invasoras representan uno de los principales problemas ambientales a nivel global. Estas especies se encuentran naturalizadas en áreas geográficas diferentes a su distribución nativa. Se caracterizan por presentar un comportamiento agresivo y afectar negativamente a las comunidades y especies nativas, o bien tienen un impacto negativo de tipo ambiental, económico, social o de salud púbica.Invasive alien species represent one of the main environmental problems globally. These species are naturalized in geographical areas different from their native distribution. They are characterized by aggressive behavior and negatively affect native communities and species, or have a negative environmental, economic, social or public health impact.

La especie Cortadera selloana es una de las principales plantas invasoras en el sur de Europa, ampliamente extendida y con una fuerte presión sobre los hábitats en los que se instala. C. selloana coloniza áreas alteradas por el uso humano como márgenes de carreteras y solares. A partir de estas áreas, la especie invade hábitats naturales sensibles como las marismas costeras. Esta especie está incluida en el "Catálogo español de especies exóticas invasoras” (Real Decreto 630/2013, de 2 de agosto).The Cortadera selloana species is one of the main invasive plants in southern Europe, widely distributed and with strong pressure on the habitats in which it settles. C. selloana colonizes areas altered by human use such as roadsides and lots. From these areas, the species invades sensitive natural habitats such as coastal marshes. This species is included in the "Spanish Catalog of Invasive Alien Species" (Royal Decree 630/2013, of August 2).

La invasión de la especie C. selloana es creciente y genera una gran alarma social, por su alto impacto socio-económico, sanitario y ambiental. Los métodos actuales para el control del crecimiento y expansión de dicha especie se basan principalmente en métodos mecánicos y/o químicos, dirigidos sobre las plantas adultas, pero no se conocen métodos de control que limiten la reproducción sexual que culmina con la producción de semillas, la estrategia principal que utiliza dicha especie para su propagación.The invasion of the species C. selloana is growing and generates great social alarm, due to its high socio-economic, health and environmental impact. Current methods to control the growth and expansion of this species are mainly based on methods mechanical and/or chemical, directed at adult plants, but there are no known control methods that limit sexual reproduction that culminates in the production of seeds, the main strategy used by this species for its propagation.

El control mecánico consiste en el desbroce o la corta total o parcial (inflorescencias) de las plantas de forma individual. Requiere uso de maquinaria pesada, y para que sea efectivo es necesario retirar también la base del tallo, por lo que implica la movilización de una gran cantidad de suelo. Además, dicho método de control debe ser repetido durante un periodo de varios años hasta conseguir la desaparición de los cepellones de la planta. En el caso del corte de las inflorescencias, es importante que sean cortadas antes de la polinización y la maduración de las semillas (generalmente a partir de septiembre), colocándolas en una bolsa bien cerrada para evitar la dispersión. El control químico consiste en la aplicación de herbicidas sistémicos, tales como, por ejemplo, el glifosato, de forma individualizada y requiriendo además varias aplicaciones para que surta efecto. Este método está limitado por diferentes normativas medioambientales al ser el glifosato un compuesto tóxico, y de hecho no se permite su uso en áreas sensibles, sumado todo esto al elevado coste del producto. En los últimos años también se ha utilizado el agente de control selectivo para monocotiledóneas quizalofop, pero sus resultados han sido muy pobres y no impidieron el rebrote de la planta después de su aplicación. En resumen, los métodos actuales utilizados para el control de la especie invasora C. selloana son poco efectivos y altamente costosos.The mechanical control consists of the clearing or the total or partial cutting (inflorescences) of the plants individually. It requires the use of heavy machinery, and for it to be effective it is also necessary to remove the base of the stem, which implies the mobilization of a large amount of soil. In addition, said control method must be repeated over a period of several years until the root balls of the plant disappear. In the case of cutting the inflorescences, it is important that they are cut before pollination and the maturation of the seeds (generally from September), placing them in a well-closed bag to avoid dispersion. Chemical control consists of the application of systemic herbicides, such as, for example, glyphosate, individually and also requiring several applications for it to take effect. This method is limited by different environmental regulations as glyphosate is a toxic compound, and in fact its use is not allowed in sensitive areas, adding all this to the high cost of the product. In recent years, the selective control agent for monocotyledons, quizalofop, has also been used, but its results have been very poor and it did not prevent the regrowth of the plant after its application. In summary, the current methods used to control the invasive species C. selloana are ineffective and highly expensive.

El control biológico se presenta como una alternativa eficaz y libre de riesgo frente a los numerosos y crecientes problemas derivados del uso de los productos químicos biocidas. El control biológico se lleva a cabo mediante enemigos naturales de las especies invasoras, tales como, por ejemplo, predadores, herbívoros o parásitos. En el control de plantas invasoras, los insectos son con frecuencia los agentes más efectivos. Así, los insectos que reducen la producción de semillas son especialmente efectivos en plantas en las que la reproducción sexual es la forma principal de reproducción.Biological control is presented as an effective and risk-free alternative to the numerous and growing problems derived from the use of biocidal chemical products. Biological control is carried out by natural enemies of invasive species, such as, for example, predators, herbivores or parasites. In the control of invasive plants, insects are often the most effective agents. Thus, insects that reduce seed production are especially effective on plants in which sexual reproduction is the main form of reproduction.

Debido a la compleja biología de los agentes de control biológico, el éxito de su utilización no está asegurado si no va precedido de estudios detallados y rigurosos sobre las interrelaciones que se establecen entre ellos, sobre su especificidad y sobre las características ambientales y biológicas que rigen sus ciclos de vida. Es conocido que algunos insectos, como por ejemplo la mayoría de las moscas formadoras de agallas (dípteros pertenecientes a la familia Cecidomyiidae), son altamente específicos y selectivos (atacan a una sola especie de planta hospedadora), siendo por tanto candidatos adecuados para el control biológico al no afectar su uso a especies vegetales nativas. Dasineura dielsi Rübsaamen y Dasineura rubiformis Kolesik son dos ejemplos de dípteros cecidómidos que atacan las semillas de dos especies invasoras de Acacias (Mimosiidae) (Adair, R.J. Australian Journal of Entomology. 2005; 44:446-456; Impson FA, et al. De Wild, in South Africa. South African J Bot. 2013; 87:118-121, Post JA, et al. Biol Control. 2010; 53:68-75). Ambas especies tienen un ciclo vital sincronizado con la fenología de la planta hospedadora, y depositan la puesta en las flores de la planta inmediatamente antes de la antesis. Estos insectos han demostrado que el uso de agentes de control biológico en el manejo de las especies invasoras es el método más efectivo, selectivo y con menor coste económico y ambiental.Due to the complex biology of biological control agents, the success of their use is not assured if it is not preceded by detailed and rigorous studies on the interrelationships established between them, on their specificity and on the environmental and biological characteristics that govern their life cycles. It is known that some insects, such as most gall-forming flies (Diptera belonging to the Cecidomyiidae family), are highly specific and selective (they attack a single species of host plant), thus being suitable candidates for biological control as their use does not affect native plant species. Dasineura dielsi Rübsaamen and Dasineura rubiformis Kolesik are two examples of gall midges that attack the seeds of two invasive species of Acacias ( Mimosiidae) (Adair, RJ Australian Journal of Entomology. 2005; 44:446-456; Impson FA, et al. De Wild, in South Africa. South African J Bot. 2013;87:118-121, Post JA, et al. Biol Control. 2010;53:68-75). Both species have a life cycle synchronized with the phenology of the host plant, and deposit spawn on plant flowers immediately before anthesis. These insects have shown that the use of biological control agents in the management of invasive species is the most effective, selective method with the lowest economic and environmental cost.

En este sentido, para el caso concreto de la especie invasora C. selloana no se conocen depredadores naturales ni parásitos que puedan ser utilizados para su control biológico. Por tanto, existe en el estado de la técnica la necesidad de buscar métodos alternativos a los conocidos para el control de la especie invasora C. selloana, mucho más efectivos, selectivos y económicos que los actuales, capaces de controlar el crecimiento y la expansión de dicha especie invasora.In this sense, for the specific case of the invasive species C. selloana , there are no known natural predators or parasites that can be used for its biological control. Therefore, there is a need in the state of the art to seek alternative methods to those known for the control of the invasive species C. selloana, much more effective, selective and economical than the current ones, capable of controlling the growth and expansion of this invasive species.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓNDESCRIPTION OF THE INVENTION

La presente invención describe el uso de una nueva especie de díptero (moscas y mosquitos) no conocida hasta ahora, que se ha incluido dentro de la familia Cecidomyiidae, y se le ha dado el nombre de Spanolepis selloanae, como agente de control biológico frente a la especie invasora C. selloana. The present invention describes the use of a new species of Diptera (flies and mosquitoes) not known until now, which has been included within the Cecidomyiidae family, and has been given the name of Spanolepis selloanae, as a biological control agent against the invasive species C. selloana.

Así, en un primer aspecto, la presente invención se refiere al uso del díptero S. selloanae, así como a las larvas del mismo, como agente de control biológico frente a la especie exótica invasora C. selloana. Thus, in a first aspect, the present invention relates to the use of the dipteran S. selloanae, as well as its larvae, as a biological control agent against the invasive exotic species C. selloana.

La familia de los cecidómidos pertenece al orden de los dípteros (Insecta: Diptera: Cecidomyiidae). En su fase adulta estas moscas presentan cuerpos pequeños y delicados y también largas antenas con ornamentación y estructura muy diversas. Las larvas, en la mayor parte de las especies, son parásitas de plantas vasculares, y es frecuente que la relación entre planta y parásito sea exclusiva o altamente específica, ya que la estructura atacada en la planta, el modo de alimentación de la larva o la forma de dispersión de esta fase obligan a dicha especificidad en la relación.The family of the cecidomida belongs to the order of the Diptera (Insecta: Diptera: Cecidomyiidae). In their adult phase, these flies have small and delicate bodies and also long antennae with very diverse ornamentation and structure. The larvae, in most of the species, are parasites of vascular plants, and it is frequent that the relationship between plant and parasite is exclusive or highly specific, since the structure attacked in the plant, the mode of feeding of the larva or the form of dispersion of this phase force such specificity in the relationship.

En la actualidad se conocen algunos cecidómidos parásitos de especies de gramíneas cuyas inflorescencias son similares a las de C. selloana (Ahee JE, et al. Can Entomologist.At present, some parasitic gall midges of grass species whose inflorescences are similar to those of C. selloana are known (Ahee JE, et al. Can Entomologist.

2013; 145:235-246). Sin embargo, las características del parásito objeto de la presente invención, S. selloanae, son distintas a las de las especies hasta ahora conocidas, y no se ha descrito hasta ahora la existencia de ningún parásito cecidómido de C. selloana. 2013; 145:235-246). However, the characteristics of the parasite object of the present invention, S. selloanae, are different from those of the species known up to now, and the existence of no cecidomide parasite of C. selloana has not been described until now.

Spanolepis selloanaeSpanolepis selloanae

El agente de control S. selloanae de la presente invención se caracteriza por consumir las estructuras reproductivas de las inflorescencias de C. selloana. Las hembras del agente de control depositan los huevos dentro de las glumas que rodean las estructuras reproductivas y, tras la eclosión, las larvas se alimentan del ovario, impidiendo así la formación de semillas viables. Mediante el estudio en detalle del parásito los inventores han concluido que se trata de un nuevo género y especie, no descrito con anterioridad. Así, se ha propuesto el nombre de Spanolepis selloanae Gagné para la nueva especie (Fagúndez J., Gagné R.J., & Vila M., Phytoparasitica, 2020).The control agent S. selloanae of the present invention is characterized by consuming the reproductive structures of the inflorescences of C. selloana. The females of the control agent lay eggs within the glumes surrounding the reproductive structures and, after hatching, the larvae feed on the ovary, thus preventing the formation of viable seeds. By studying the parasite in detail, the inventors have concluded that it is a new genus and species, not previously described. Thus, the name Spanolepis selloanae Gagné has been proposed for the new species (Fagúndez J., Gagné RJ, & Vila M., Phytoparasitica, 2020).

Al tratarse, S. selloanae de una nueva especie identificada por primera vez por los inventores, se ha procedido a su caracterización morfológica y genética. Esta especie se caracteriza, por un lado, por la asociación específica a la planta hospedadora C. selloana, y, por otro lado, por los caracteres de diagnósticos que se detallan a continuación.As S. selloanae is a new species identified for the first time by the inventors, its morphological and genetic characterization has been carried out. This species is characterized, on the one hand, by the specific association with the host plant C. selloana, and, on the other hand, by the diagnostic characters detailed below.

Spanolepis selloanae presenta un ciclo vital ligado a la fenología de la especie hospedadora, en este caso ligado a la fenología de C. selloana. Los adultos emergen a partir de las larvas, más concretamente, a partir de las larvas de tercer estadio hibernantes coincidiendo con la floración de C. selloana, visitan las inflorescencias de la planta y ovopositan en las flores en desarrollo. Las larvas eclosionan y, durante su crecimiento y consiguiente paso sucesivo de primer a tercer estadio, destruyen el ovario, ocupando el espacio en las flores femeninas. Las larvas pupan al menos una vez durante la floración, formando la segunda y, potencialmente, sucesivas generaciones de adultos que copulan y generan nuevas puestas. En el momento de la dispersión de C. selloana, se liberan flores completas con el fruto en el interior. Cuando estas flores están infectadas con el agente de control de la invención, se dispersan, las larvas del agente de control presentes en las mismas hibernan en el suelo y su ciclo vital vuelve a activarse al verano siguiente. Spanolepis selloanae presents a life cycle linked to the phenology of the host species, in this case linked to the phenology of C. selloana . The adults emerge from the larvae, more specifically, from the hibernating third-stage larvae coinciding with the flowering of C. selloana, they visit the inflorescences of the plant and oviposit in the developing flowers. The larvae hatch and, during their growth and consequent successive passage from the first to the third stage, destroy the ovary, occupying the space in the female flowers. Larvae pupate at least once during flowering, forming second and potentially successive generations of adults that mate and spawn new clutches. At the time of dispersal of C. selloana, flowers are released complete with the fruit inside. When these flowers are infected with the control agent of the invention, they disperse, the larvae of the control agent present in them hibernate in the soil and their life cycle is activated again the following summer.

Los individuos adultos de S. selloanae miden entre 2-3 mm y presentan un aspecto delicado y un color anaranjado (Fig. 1a), con unas alas de un tamaño aproximado de entre 1,4-1,5 mm. Las antenas de los adultos presentan en su segmento basal (escapo) con 3-4 sedas en su parte ventral, y en el segundo segmento (pedicelo) presentan 7-9 sedas, más cortas que las del escapo. Los restantes segmentos de la antena (flagelómeros) alcanzan un número total de 12 en el caso de los machos, mientras que en las hembras ese número puede ser de 10-11 segmentos. Además, estos flagelómeros son distintos en machos y hembras, ya que en los machos los segmentos presentan una parte basal redondeada y una distal más alargada, mientras que en las hembras carecen de esta parte alargada. En cuanto a otros caracteres distintivos de los adultos, esta especie presenta en la frente 10 12 sedas, y tanto los escleritos torácicos como los abdominales carecen de las escamas distintivas de géneros próximos.Adult individuals of S. selloanae measure between 2-3 mm and have a delicate appearance and an orange color (Fig. 1a), with wings approximately 1.4-1.5 mm in size. The antennae of adults present in their basal segment (scape) with 3-4 setae in their ventral part, and in the second segment (pedicel) they present 7-9 setae, shorter than those of the scape. The remaining segments of the antenna (flagellomeres) reach a total number of 12 in the case of males, while in females that number can be 10-11 segments. In addition, these flagellomeres are different in males and females, since in males the segments have a rounded basal part and a more elongated distal part, while in females they lack this elongated part. As for other distinctive characters of adults, this species has 10 to 12 setae on the forehead, and both the thoracic and abdominal sclerites lack the distinctive scales of related genera.

Respecto a los diferentes estadíos larvarios de S. selloanae, todos ellos son inmóviles, presentando un tamaño de entre 0,8-1,2 mm con aspecto cilíndrico-elipsoidal, color anaranjado y cápsula cefálica semiesférica (Fig. 1b). En el tercer estadio larvario, que precede a los individuos adultos, las antenas son el doble de largas que anchas, y todo el tegumento es blanco a excepción del último segmento, que es oscuro. El tegumento está recubierto por protuberancias verrucosas a excepción de una larga banda estrecha que recorre el cuerpo de la larva desde las 4 papilas ventrales del primer segmento abdominal hasta el séptimo segmento abdominal. Otro carácter diagnóstico importante es la ausencia de espátula, que es una estructura esclerotizada presente en especies que pupan en el suelo, donde la usan para excavar, o que se alimentan de tejidos duros de plantas. Además, a diferencia de otros géneros próximos, las larvas de S. selloanae presentan un único triplete de setas laterales en lugar de dos en cada lado de los segmentos torácicos y cuatro en lugar de ocho papilas en el segmento terminal.Regarding the different larval stages of S. selloanae, all of them are immobile, presenting a size between 0.8-1.2 mm with a cylindrical-ellipsoidal appearance, orange color and hemispherical head capsule (Fig. 1b). In the third larval stage, which precedes the adult individuals, the antennae are twice as long as they are wide, and the entire integument is white except for the last segment, which is dark. The integument is covered by verrucous protuberances except for a long narrow band that runs along the body of the larva from the 4 ventral papillae of the first abdominal segment to the seventh abdominal segment. Another important diagnostic character is the absence of a spatula, which is a sclerotized structure present in species that pupate in the soil, where they use it to burrow, or that feed on hard plant tissues. Furthermore, unlike other related genera, S. selloanae larvae have a single triplet of lateral setae instead of two on each side of the thoracic segments and four instead of eight papillae on the terminal segment.

En cuanto a la identificación genética de S. selloanae se ha tomado como referencia la secuencia del gen citocromo mitocondrial c oxidasa subunidad I (COI), del genoma mitocondrial de la especie de cecidómido Mayetiola destructor, identificado con el número de acceso en GenBank: GQ387648.1:1145-2680, y concretamente se han utilizado las posiciones 1176 a 1874 de dicho gen. Los resultados obtenidos para la identificación genética del agente de control de la presente invención se muestran en el Ejemplo 1. Brevemente, el agente de control de la presente invención, S. selloanae presenta dos haplotipos. Ambos haplotipos difieren entre ellos en la sustitución de la posición 327 de la secuencia obtenida del gen COI de Mayetiola destructor (número de acceso en GenBank: GQ387648.1: posiciones 1176-1874; Beckenbach y Joy, 2009, Genome Biol Evol 2009: 278-287), y se trata de una transición guanina-adenina en el comienzo de un codón (G/A)AC. El haplotipo 1 (SEQ ID NO: 1) presenta el codón (GAC) que codifica para glicina y el haplotipo 2 (SEQ ID NO: 2) presenta el codón (AAC) que codifica para ácido glutámico.Regarding the genetic identification of S. selloanae, the sequence of the mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I (COI) gene has been taken as a reference, from the mitochondrial genome of the gall midge species Mayetiola destructor, identified with the access number in GenBank: GQ387648 .1:1145-2680, and specifically the positions 1176 to 1874 of said gene. The results obtained for the genetic identification of the control agent of the present invention are shown in Example 1. Briefly, the control agent of the present invention, S. selloanae , has two haplotypes. Both haplotypes differ from each other in the substitution of position 327 of the sequence obtained from the Mayetiola destructor COI gene (GenBank access number: GQ387648.1: positions 1176-1874; Beckenbach and Joy, 2009, Genome Biol Evol 2009: 278 -287), and it is a guanine-adenine transition at the beginning of a (G/A)AC codon. Haplotype 1 (SEQ ID NO: 1) has the codon (GAC) that codes for glycine and haplotype 2 (SEQ ID NO: 2) has the codon (AAC) that codes for glutamic acid.

Los haplotipos 1 y 2 (SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente) identificados para el agente de control de la invención se diferencian de las especies más próximas identificadas, Macrolabis fagicola (número de acceso en GenBank: JQ684878.1) y Janetiella glechomae (número de acceso en GenBank: KR742308.1 utilizado para el haplotipo 1 y los números de acceso: KR740388, KR743364 y KR956680 utilizados para el haplotipo 2) en los siguientes valores:Haplotypes 1 and 2 (SEQ ID NO: 1 and 2, respectively) identified for the control agent of the invention differ from the closest identified species, Macrolabis fagicola (GenBank accession number: JQ684878.1) and Janetiella glechomae (GenBank accession number: KR742308.1 used for haplotype 1 and accession numbers: KR740388, KR743364 and KR956680 used for haplotype 2) in the following values:

- Macrolabis fagicola (número de acceso en GenBank: JQ684878.1): muestra un 90,29% de identidad frente al haplotipo 1 (SEQ ID NO: 1) de S. selloanae, y un 90,27% de identidad frente al haplotipo 2 (SEQ ID NO: 2), y- Macrolabis fagicola (GenBank access number: JQ684878.1): shows 90.29% identity against haplotype 1 (SEQ ID NO: 1) of S. selloanae, and 90.27% identity against haplotype 2 (SEQ ID NO: 2), and

- Janetiella glechomae (número de acceso en GenBank: KR742308.1 utilizado para el haplotipo 1 y los números de acceso: KR740388, KR743364 y KR956680 utilizados para el haplotipo 2): muestra un 90,43% de identidad frete al haplotipo 1 (SEQ ID NO: 1) de S. selloanae, y un 90,6% de identidad frente al haplotipo 2 (SEQ ID NO: 2) de S. selloanae. - Janetiella glechomae (GenBank accession number: KR742308.1 used for haplotype 1 and accession numbers: KR740388, KR743364 and KR956680 used for haplotype 2): shows 90.43% identity against haplotype 1 (SEQ ID NO: 1) of S. selloanae, and 90.6% identity against haplotype 2 (SEQ ID NO: 2) of S. selloanae.

Una vez caracterizados, morfológica y genéticamente los agentes de control descritos en la presente invención, se incluye también una descripción de cómo S. selloanae infecta a la planta huésped C. selloana, pudiendo por tanto ser utilizado como agente de control biológico frente a la misma. En este sentido, los adultos copulan y depositan los huevos en las inflorescencias femeninas de C. selloana a finales de agosto o principios de septiembre. Una vez las larvas eclosionan, éstas comienzan a alimentarse de los tejidos del ovario durante 1-2 semanas hasta que pupan y se transforman en una nueva generación de adultos, que nuevamente vuelven a depositar huevos de nuevo sobre las inflorescencias a finales de septiembre. Así, las larvas durante su ciclo vital consumen los ovarios de las flores impidiendo la formación de frutos viables y llegado el mes de noviembre, que es la época en la que se produce la dispersión de las semillas, el lugar que debían ocupar dichas semillas lo ocupan las larvas que hibernarán en esa fase.Once the control agents described in the present invention have been morphologically and genetically characterized, a description of how S. selloanae infects the host plant C. selloana is also included, and can therefore be used as a biological control agent against it. . In this sense, adults copulate and lay eggs in the female inflorescences of C. selloana at the end of August or beginning of September. Once the larvae hatch, they begin to feed on the ovary tissues for 1-2 weeks until they pupate and transform into a new generation of adults, which lay eggs again on the inflorescences at the end of September. Thus, the larvae during their life cycle consume the ovaries of the flowers, preventing the formation of viable fruits and when November comes, which is the time in which the dispersion of the seeds occurs, the place that these seeds should occupy is occupied by the larvae that will hibernate in that phase.

Los ensayos llevados a cabo por los inventores y que se muestran en los ejemplos incluidos en la presente invención, han puesto de manifiesto una tasa de infección cercana al 75% (una semilla viable por cada 3 consumidas por las larvas).The tests carried out by the inventors and shown in the examples included in the present invention, have shown an infection rate close to 75% (one viable seed for every 3 consumed by the larvae).

Así, tal y como hemos mencionado anteriormente, en un primer aspecto, la presente invención se refiere al uso del agente de control de la invención, en este caso particular al uso del díptero perteneciente a la especie S. selloanae y/o de sus larvas, como agente de control biológico frente a la especie vegetal C. selloana. Thus, as we have mentioned previously, in a first aspect, the present invention refers to the use of the control agent of the invention, in this particular case to the use of the diptera belonging to the species S. selloanae and/or its larvae , as a biological control agent against the plant species C. selloana.

A efectos de la presente invención, el término "agente de control biológico” se refiere a individuos adultos y/o larvas de la especie S. selloanae, solos o formulados en forma de composición capaces de producir un daño directo en plantas de la especie C. selloana, impidiendo su reproducción y limitando su expansión.For the purposes of the present invention, the term "biological control agent" refers to adult individuals and/or larvae of the species S. selloanae, alone or formulated in the form of a composition capable of causing direct damage to plants of the species C selloana, preventing its reproduction and limiting its expansion.

A efectos de la presente invención el término "larva” se refiere a individuos juveniles y carentes de estructuras alares de la especie S. selloanae, lo que excluye a las fases de pupa y adulto.For the purposes of the present invention, the term "larva" refers to juvenile individuals lacking wing structures of the species S. selloanae , which excludes the pupal and adult phases.

A efectos de la presente invención, el término "Cortaderia selloana", se refiere a una especie vegetal que se caracteriza por pertenecer a la familia de las Poaceas o gramíneas siendo ésta una familia de plantas herbáceas, o muy raramente leñosas, perteneciente al orden Poales de las monocotiledóneas. La especie C. selloana, también conocida como hierba de la Pampa, es una especie nativa de Sudamérica, de la región pampeana y la Patagonia. Posee más denominaciones comunes, entre ellas plumero, plumacho, plumerillo, cola de zorro, carrizo de la Pampa, paja penacho, paina, cortaderia, ginerio, gimnerio o paja brava. Crece en densas macollas, pudiendo alcanzar 3 m de altura; hojas perennes, largas y finas, 1-2 m de largo y 1 cm ancho, con bordes muy afilados (debiéndosela manipular con cuidado), color verde azulinas, pero pueden llegar a gris plateadas. Flores en densa panícula blanca, o en ocasiones rosada, de 3-9 dm de largo y 2-3 m de altura sus varas florales; sus espiguillas de 15-25 mm, c/una con 4-6 flores. Flores masculinas con 3-estambres, ovario rudimentario; femeninas con un ovario desarrollado y dos estilos plumosos. Florece a fines del verano, el pico de floración se produce en septiembre. Es de hábito hemicriptófito.For the purposes of the present invention, the term "Cortaderia selloana" refers to a plant species that is characterized by belonging to the Poaceas or gramineae family, this being a family of herbaceous plants, or very rarely woody, belonging to the Poales order. of the monocots. The species C. selloana, also known as Pampas grass, is a species native to South America, from the Pampas region and Patagonia. It has more common denominations, among them duster, plumacho, plumerillo, fox tail, Pampas reed, plume straw, paina, Cortaderia, ginerio, gymnerio or paja brava. It grows in dense clumps, being able to reach 3 m in height; Evergreen leaves, long and thin, 1-2 m long and 1 cm wide, with very sharp edges (it must be handled with care), bluish-green, but can reach silver-grey. Flowers in dense white panicle, or sometimes pink, 3-9 dm long and 2-3 m tall, its floral rods; its spikelets 15-25 mm, each with 4-6 flowers. Male flowers with 3-stamens, ovary rudimentary; female with a developed ovary and two feathery styles. Blooms in late summer, peak blooming in September. It is hemicryptophytic in habit.

El agente de control biológico de la presente invención tiene su origen en España, particularmente en la Comunidad autónoma de Galicia. Dado que el agente de control de la invención se trata de un recurso genético, tal y como se entiende y se encuentra cubierto por el Reglamento (UE) n.° 511/2014 del Parlamento Europeo y del Consejo, de 16 de abril de 2014, relativo a las medidas de cumplimiento de los usuarios del Protocolo de Nagoya sobre el acceso a los recursos genéticos y participación justa y equitativa en los beneficios que se deriven de su utilización en la Unión, los inventores han llevado a cabo la declaración de diligencia debida de conformidad con el Art. 14.3 del Real Decreto 124/2017 de 24 de febrero relativo al acceso a los recursos genéticos procedentes de taxones silvestres y al control de la utilización, así como de conformidad con el Art. 23 de la Ley 24/2015, de 24 de julio, de Patentes y con el Art. 2 de su Reglamento de ejecución. Para que conste en el presente documento, el número de registro de la presentación de la declaración de diligencia debida asociada al agente de control de la presente invención es: 000002023e2000006746.The biological control agent of the present invention has its origin in Spain, particularly in the Autonomous Community of Galicia. Given that the control agent of the invention is a genetic resource, as understood and covered by Regulation (EU) No. 511/2014 of the European Parliament and of the Council, of April 16, 2014 , regarding user compliance measures of the Nagoya Protocol on access to genetic resources and fair and equitable sharing of benefits arising from their use in the Union, the inventors have carried out the declaration of due diligence in accordance with Art. 14.3 of Royal Decree 124/2017 of February 24 regarding access to genetic resources from wild taxa and control of use, as well as in accordance with Art. 23 of Law 24/2015 , of July 24, of Patents and with Art. 2 of its Execution Regulations. For the record in this document, the registration number of the presentation of the due diligence declaration associated with the control agent of the present invention is: 000002023e2000006746.

Método de conservación del agente de control de la invenciónPreservation method of the control agent of the invention

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método de conservación del agente de control de la invención, de aquí en adelante, método de conservación de la invención.In another aspect, the present invention relates to a preservation method of the control agent of the invention, hereinafter, preservation method of the invention.

Hasta la fecha de la presente invención no se conocía nada sobre la biología ni sobre el ciclo de vida de S. selloanae. Es bien conocido en el ámbito de la entomología que los requerimientos tróficos, estímulos de oviposición, condiciones climáticas de supervivencia, condiciones óptimas de fertilidad y fecundidad, y otras características biológicas, son distintos en cada especie de insecto y, por lo tanto, es necesario determinar todas estas características para que el agente de control de la invención pueda ser aplicado con éxito frente a la especie invasora C. selloana. Until the date of the present invention, nothing was known about the biology or the life cycle of S. selloanae. It is well known in the field of entomology that the trophic requirements, oviposition stimuli, climatic conditions for survival, optimal conditions of fertility and fecundity, and other biological characteristics, are different in each species of insect and, therefore, it is necessary determine all these characteristics so that the control agent of the invention can be successfully applied against the invasive species C. selloana.

Los inventores describen en la presente invención un método de conservación del agente de control de la invención para que pueda ser utilizado a escala industrial y que permita la obtención de gran cantidad de individuos para utilizarlos como agentes de control biológico frente a C. selloana. The inventors describe in the present invention a conservation method for the control agent of the invention so that it can be used on an industrial scale and that allows obtaining a large number of individuals to use them as biological control agents against C. selloana .

Así, en otro aspecto, la presente invención se refiere a un método de conservación del agente de control de la presente invención, preferiblemente larvas del agente de control, que comprende las etapas de:Thus, in another aspect, the present invention relates to a method of preserving the control agent of the present invention, preferably larvae of the control agent, comprising the steps of:

a. recolectar las larvas de S. selloanae de las inflorescencias de las plantas femeninas de C. selloana, a. collect the larvae of S. selloanae from the inflorescences of the female plants of C. selloana,

b. introducir las larvas recolectadas en la etapa a) en un sustrato que comprende tierra vegetal, un ingrediente adicional que facilite la aireación, preferiblemente, arena fina, y un ingrediente adicional que permita la retención de agua, preferiblemente seleccionado de entre perlita y vermiculita, donde dicho sustrato ha sido previamente esterilizado,b. Introduce the larvae collected in stage a) in a substrate that includes topsoil, an additional ingredient that facilitates aeration, preferably fine sand, and an additional ingredient that allows water retention, preferably selected from perlite and vermiculite, where said substrate has been previously sterilized,

c. almacenar las larvas junto con el sustrato, en condiciones de oscuridad y a una temperatura de entre 2 °C a 7°C, preferiblemente de 4°C a 5°C.c. store the larvae together with the substrate, in dark conditions and at a temperature between 2 °C and 7 °C, preferably between 4 °C and 5 °C.

En una realización preferida, el método de conservación de la invención se caracteriza por que la recolección se lleva a cabo en el periodo de tiempo que se produce la dispersión de las plantas y en ese momento se recogen las larvas vivas de las inflorescencias, preferiblemente larvas vivas que se encuentran en el tercer estadio de su ciclo vital. En una realización más preferida, el periodo de recogida de las larvas se lleva a cabo preferiblemente entre los meses de octubre a noviembre.In a preferred embodiment, the preservation method of the invention is characterized in that the collection is carried out in the period of time that the dispersion of the plants occurs and at that moment the live larvae of the inflorescences are collected, preferably larvae alive that are in the third stage of their vital cycle. In a more preferred embodiment, the larvae collection period is preferably carried out between the months of October to November.

En una realización preferida del método de recolección de la invención, dicha recolección se lleva a cabo sin alterar el propágulo infectado de la planta y manteniendo la cubierta protectora, es decir el lema o glumela inferior, permitiendo así utilizar la cubierta del propágulo como elemento protector frente a posibles agentes externos, ya sean físicos y/o biológicos, que puedan afectar a la(s) larva(s) que tiene(n) en su interior. En una realización más preferida aún, dicha recolección se lleva a cabo cortando las partes de la inflorescencia infectadas e introduciéndola en un recipiente que garantice la transpiración, por ejemplo, un recipiente tal como un sobre de papel.In a preferred embodiment of the collection method of the invention, said collection is carried out without altering the infected plant propagule and maintaining the protective cover, that is, the lower lemma or glumella, thus allowing the use of the propagule cover as a protective element. against possible external agents, whether physical and/or biological, that may affect the larva(s) they have inside. In an even more preferred embodiment, said harvesting is carried out by cutting off the parts of the infected inflorescence and inserting it into a container that guarantees perspiration, for example, a container such as a paper envelope.

A efectos de la presente invención, el término "propágulo” se refiere al conjunto formado por el fruto y la cubierta protectora. El fruto es una cariópside, esto se refiere a que es un fruto formado por una única semilla con una pared delgada. La cubierta está formada por dos brácteas: la glumela inferior o lema, y la glumela superior o pálea. El lema es de gran tamaño y envuelve todo el conjunto, la pálea es muy reducida y no tiene un papel relevante. El lema además tiene largos cilios que favorecen la dispersión por el viento.For the purposes of the present invention, the term "propagule" refers to the whole formed by the fruit and the protective cover. The fruit is a caryopsis, this means that it is a fruit formed by a single seed with a thin wall. cover is formed by two bracts: the lower glumella or lemma, and the upper glumella or palea.The lemma is large size and surrounds the whole, the palea is very small and does not play a relevant role. The lemma also has long cilia that favor dispersion by the wind.

A efectos de la presente invención, el término "propágulo infectado” se refiere al propágulo de la planta invasora, concretamente al propágulo de C. selloana que contiene una larva del cecidómido que ocupa el lugar y sustituye a la cariópside.For purposes of the present invention, the term "infected propagule" refers to the invasive plant propagule, specifically the C. selloana propagule that contains a gall midge larva that takes the place of and replaces the caryopsis.

En otra realización preferida del método de conservación de la invención, éste se caracteriza porque en la etapa b) el sustrato utilizado comprende tierra vegetal, un ingrediente adicional que facilite la aireación, donde dicho ingrediente es preferiblemente un ingrediente no poroso, inerte químicamente y con dimensiones de sus partículas inferiores a 5 mm, y otro ingrediente adicional que permita la retención de agua, donde dicho ingrediente es preferiblemente un ingrediente poroso. En otra realización más preferida, el sustrato se caracteriza porque el ingrediente no poroso, inerte químicamente y con dimensiones de sus partículas inferiores a 5 mm es preferiblemente, arena fina. En otra realización más preferida, el sustrato se caracteriza porque el ingrediente poroso, se selecciona de entre perlita y/o vermiculita.In another preferred embodiment of the preservation method of the invention, it is characterized in that in step b) the substrate used comprises topsoil, an additional ingredient that facilitates aeration, where said ingredient is preferably a non-porous ingredient, chemically inert and with dimensions of its particles less than 5 mm, and another additional ingredient that allows water retention, where said ingredient is preferably a porous ingredient. In another more preferred embodiment, the substrate is characterized in that the non-porous, chemically inert ingredient with particle size of less than 5 mm is preferably fine sand. In another more preferred embodiment, the substrate is characterized in that the porous ingredient is selected from perlite and/or vermiculite.

A efectos de la presente invención el término "sustrato” se refiere a la mezcla artificial de elementos o ingredientes, libres de patógenos, que imitan las condiciones del suelo y que permite la hibernación de las larvas de S. selloanae. For the purposes of the present invention, the term "substrate" refers to the artificial mixture of elements or ingredients, free of pathogens, that mimic soil conditions and that allows the hibernation of S. selloanae larvae.

A efectos de la presente invención el término "arena fina” se refiere a un conjunto de partículas que es resultado de la desintegración natural de las rocas o de la trituración de las mismas, los granos obtenidos tienen dimensiones inferiores a los 5 milímetros. A efectos de la presente invención, se entiende también que la arena fina es un ingrediente no poroso e inerte químicamente.For the purposes of the present invention, the term "fine sand" refers to a set of particles that is the result of the natural disintegration of rocks or their crushing, the grains obtained have dimensions of less than 5 millimeters. of the present invention, it is also understood that the fine sand is a non-porous and chemically inert ingredient.

A efectos de la presente invención el término "tierra vegetal” se refiere a un sustrato natural formado por restos vegetales en diferentes grados de descomposición y tamaño heterogéneo, procedente del suelo turboso o altamente orgánico generado en condiciones naturales con cubierta vegetal, que contiene alrededor de un 60%-80% de materia orgánica y un 20-40% de compuestos minerales. For the purposes of the present invention, the term "vegetable soil" refers to a natural substrate formed by plant remains in different degrees of decomposition and heterogeneous in size, coming from peat or highly organic soil generated under natural conditions with plant cover, containing around 60%-80% organic matter and 20-40% mineral compounds.

A efectos de la presente invención el término “perlita” se refiere a partículas granulares resultantes de la fusión de rocas volcánicas silíceas a temperaturas cercanas a los 1000°C, con dimensiones inferiores a los 6 milímetros. A efectos de la presente invención, la perlita se define también como un ingrediente poroso.For the purposes of the present invention, the term "perlite" refers to granular particles resulting from the fusion of siliceous volcanic rocks at temperatures close to 1000°C, with dimensions less than 6 millimeters. For purposes of the present invention, perlite is also defined as a porous ingredient.

A efectos de la presente invención el término “vermiculita” se refiere a partículas granulares resultantes del calentamiento a temperaturas superiores a 870°C de un mineral de la familia de la mica compuesto por silicatos de hierro o magnesio, con dimensiones inferiores a los 5 milímetros. A efectos de la presente invención, la vermiculita se define también como un ingrediente poroso.For the purposes of the present invention, the term "vermiculite" refers to granular particles resulting from heating at temperatures above 870°C of a mineral of the mica family composed of iron or magnesium silicates, with dimensions less than 5 millimeters. . For purposes of the present invention, vermiculite is also defined as a porous ingredient.

En otra realización preferida del método de conservación de la invención, este se caracteriza por que el sustrato comprende al menos un 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49% o 50% de arena fina, preferiblemente al menos un 35%, más preferiblemente al menos un 40% y más preferible aún un 40% de arena final, respecto al porcentaje total del sustrato. En otra realización preferida del método de conservación de la invención, este se caracteriza por que el sustrato comprende al menos un 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49% o 50% de tierra vegetal, preferiblemente al menos un 35%, más preferiblemente al menos un 40% y más preferible aún un 40% de tierra vegetal, respecto al porcentaje total del sustrato. En otra realización preferida del método de conservación de la invención, este se caracteriza por que el sustrato comprende al menos un 10%, 11%, 12%, 13%, 14%,15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29% o 30% de perlita, preferiblemente al menos un 15%, más preferiblemente aún al menos un 20% y más preferible aún un 20% de perlita y/o vermiculita, respecto al porcentaje total del sustrato.In another preferred embodiment of the preservation method of the invention, it is characterized in that the substrate comprises at least 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49% or 50% fine sand, preferably at least 35%, more preferably at least 40% and even more preferably 40% of final sand, with respect to the total percentage of the substrate. In another preferred embodiment of the preservation method of the invention, it is characterized in that the substrate comprises at least 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49% or 50% topsoil, preferably at least 35%, more preferably at least 40% and even more preferably 40% of topsoil, with respect to the total percentage of the substrate. In another preferred embodiment of the preservation method of the invention, it is characterized in that the substrate comprises at least 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29% or 30% perlite, preferably at least 15%, more preferably still at least 20% and even more preferably 20% of perlite and/or vermiculite, with respect to the total percentage of the substrate.

En otra realización preferida del método de conservación de la invención, este se caracteriza por que el sustrato comprende un 40% de arena fina, un 40% de tierra vegetal y un 20% de perlita y/o vermiculita.In another preferred embodiment of the preservation method of the invention, this is characterized in that the substrate comprises 40% fine sand, 40% topsoil and 20% perlite and/or vermiculite.

En otra realización preferida del método de conservación de la invención, este se caracteriza por que el sustrato presenta un grado de humedad de al menos un 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49% o 50%, preferiblemente un grado de humedad de al menos un 35%, más preferiblemente un grado de humedad de al menos un 40% y más preferible aún un grado de humedad de un 40%. En otra realización preferida, el método de conservación de la invención se caracteriza por que el sustrato presenta un grado de humedad del 40%.In another preferred embodiment of the preservation method of the invention, it is characterized in that the substrate has a humidity level of at least 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37 %, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49% or 50%, preferably a degree of humidity of at least one 35%, more preferably a degree of humidity of at least 40% and even more preferably a degree of humidity of 40%. In another preferred embodiment, the preservation method of the invention is characterized in that the substrate has a humidity level of 40%.

Tal y como se ha mencionado anteriormente, el sustrato previamente a ponerlo en contacto con las larvas vivas recolectadas ha sido sometido a un proceso de esterilización. De manera general, el proceso de esterilización comprende el autoclavado de cada uno de los componentes de dicho sustrato a una temperatura de al menos 121°C durante al menos un tiempo de 20 minutos, a una presión de al menos 1 atmósfera. La esterilización de los componentes del sustrato hace que se inactiven las posibles semillas que puedan estar en la mezcla de los componentes que forman dicho sustrato y se limita el crecimiento de microorganismos que puedan afectar a la conservación de las larvas.As mentioned above, the substrate, prior to putting it in contact with the collected live larvae, has been subjected to a sterilization process. In general, the sterilization process comprises autoclaving each of the components of said substrate at a temperature of at least 121°C for at least 20 minutes, at a pressure of at least 1 atmosphere. The sterilization of the components of the substrate inactivates the possible seeds that may be in the mixture of the components that make up said substrate and limits the growth of microorganisms that may affect the conservation of the larvae.

En otra realización preferida del método de conservación de la invención, este se caracteriza por que la etapa b) se lleva a cabo en condiciones controladas que mantienen el aire libre de partículas en suspensión, preferentemente en una campana de flujo laminar, para reducir cualquier tipo de contaminación que pudiese darse por agentes externos tales como hongos u otros organismos.In another preferred embodiment of the preservation method of the invention, this is characterized in that step b) is carried out under controlled conditions that keep the air free of suspended particles, preferably in a laminar flow hood, to reduce any type contamination that could be caused by external agents such as fungi or other organisms.

En otra realización preferida del método de conservación de la invención, éste se caracteriza por que en la etapa b) se introducen al menos 5 larvas de S. selloanae/g de sustrato, preferiblemente de 5 a 8 larvas/g de sustrato.In another preferred embodiment of the preservation method of the invention, it is characterized in that in step b) at least 5 S. selloanae larvae/g of substrate are introduced, preferably 5 to 8 larvae/g of substrate.

En otra realización preferida del método de conservación de la invención, éste se caracteriza por que una vez contactadas las larvas con el sustrato en la etapa b), éstas se guardan en recipientes estériles, preferiblemente placas Petri, de un diámetro preferido de 5,5 cm y se sellan, preferiblemente con parafilm, para evitar su contaminación. En otra realización preferida del método de conservación de la invención, el recipiente de almacenamiento, comprende al menos 4 gramos de sustrato con las larvas.In another preferred embodiment of the preservation method of the invention, it is characterized in that once the larvae have been contacted with the substrate in stage b), they are stored in sterile containers, preferably Petri dishes, with a preferred diameter of 5.5 cm and sealed, preferably with parafilm, to prevent contamination. In another preferred embodiment of the preservation method of the invention, the storage container comprises at least 4 grams of substrate with the larvae.

En otra realización preferida del método de conservación de la invención, éste se caracteriza por que se almacena, en oscuridad y a una temperatura de entre 2°C a 10°C, preferiblemente de 2°C a 8°C, más preferiblemente de 3°C a 6°C, más preferiblemente aún de 4°C a 5°C. La elección de la temperatura preferida de conservación de entre 4 a 5°C es debida a que se pretende reproducir las condiciones que se dan en la fase de diapausa o letargo invernal que sufren las larvas en el medio natural.In another preferred embodiment of the preservation method of the invention, it is characterized in that it is stored in the dark and at a temperature of between 2°C to 10°C, preferably 2°C to 8°C, more preferably 3°C. C to 6°C, more preferably still 4°C to 5°C. The choice of the preferred storage temperature between 4 to 5°C is due to the fact that it is intended to reproduce the conditions that occur in the diapause phase or winter lethargy suffered by the larvae in the natural environment.

En otra realización particular del método de conservación de la invención, éste se caracteriza porque las larvas se mantienen almacenadas en las condiciones indicadas en la etapa c) durante al menos un periodo de 9 meses.In another particular embodiment of the preservation method of the invention, it is characterized in that the larvae are kept stored under the conditions indicated in step c) for at least a period of 9 months.

Cualquier valor en un intervalo dado aquí se puede extender o alterar sin perder los efectos buscados, como sería aparente para una persona experta en Ia materia. Así, los intervalos dados, tales como concentraciones, y similares se deberían considerar aproximados, a menos que se especifique Io contrario.Any value in a range given here can be extended or altered without losing the desired effects, as would be apparent to a person skilled in the art. Thus, given ranges, such as concentrations, and the like should be considered approximate, unless otherwise specified.

Siguiendo el método de conservación de las larvas del agente de control de la presente invención, los inventores han obtenido una viabilidad de las mismas del 100% en las condiciones mostradas en los ejemplos (véase Tabla 1).Following the method of conservation of the larvae of the control agent of the present invention, the inventors have obtained a viability of the same of 100% in the conditions shown in the examples (see Table 1).

Composición y usosComposition and uses

Otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición, a partir de ahora composición de la invención, que comprende al menos un agente de control según se describe en la presente invención, preferiblemente estando dicho agente de control en el estadío de larva, en combinación con un sustrato que comprende tierra vegetal, un elemento que permita la aireación, tal como por ejemplo, arena fina, y un elemento con capacidad para retener la humedad, tal como por ejemplo, perlita y/o vermiculita, como se han descrito previamente a lo largo del presente documento.Another aspect of the present invention relates to a composition, hereinafter composition of the invention, comprising at least one control agent as described in the present invention, preferably said control agent being in the larva stage, in combination with a substrate comprising topsoil, an element that allows aeration, such as, for example, fine sand, and an element with the capacity to retain moisture, such as, for example, perlite and/or vermiculite, as previously described throughout this document.

A efectos de la presente invención el término “composición” se refiere a una composición para eliminar plantas o especies vegetales indeseadas, o bien para controlar el desarrollo de las mismas. A efectos de la presente invención, dicha composición va dirigida específicamente a controlar el crecimiento y la expansión de plantas de la especie C. selloana. En una realización más preferida, la composición de la invención, como se ha mencionado anteriormente, comprende el agente de control de la invención y el sustrato, como se ha definido a lo largo del presente documento. For the purposes of the present invention, the term "composition" refers to a composition to eliminate unwanted plants or plant species, or to control their development. For the purposes of the present invention, said composition is specifically aimed at controlling the growth and expansion of plants of the C. selloana species. In a more preferred embodiment, the composition of the invention, as mentioned above, comprises the control agent of the invention and the substrate, as defined throughout this document.

Tanto el agente de control, preferiblemente en el estadio de larva, como el sustrato que forman parte de la composición de la invención se han definido previamente, y dichas definiciones aplican de la misma manera al presente aspecto de la invención.Both the control agent, preferably at the larva stage, and the substrate that form part of the composition of the invention have been previously defined, and said definitions apply in the same way to the present aspect of the invention.

En una realización preferida de la composición de la invención, esta se caracteriza porque el agente de control se encuentra en estadío larvario, y a una densidad de al menos 5 larvas por gramo de sustrato.In a preferred embodiment of the composition of the invention, it is characterized in that the control agent is in the larval stage, and at a density of at least 5 larvae per gram of substrate.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de la composición de la invención en el control biológico de la especie invasora C. selloana. Another aspect of the present invention refers to the use of the composition of the invention in the biological control of the invasive species C. selloana.

Método de control biológico C. selloana mediante el uso del agente de control S. selloanae Biological control method C. selloana by using the control agent S. selloanae

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método de control biológico, de aquí en adelante método de control biológico de la invención, de C. selloana mediante el uso del agente de control S. selloanae, preferiblemente en su estadío larvario, o de la composición de la invención, donde dicho método se caracteriza porque comprende las siguientes etapas:In another aspect, the present invention relates to a biological control method, hereinafter biological control method of the invention, of C. selloana by using the control agent S. selloanae, preferably in its larval stage, or of the composition of the invention, where said method is characterized in that it comprises the following steps:

a) Contactar plantas de la especie C. selloana con una cantidad efectiva de S.a) Contact plants of the species C. selloana with an effective amount of S.

selloanae, preferiblemente en su estadío larvario, o de la composición de la invención, selloanae, preferably in its larval stage, or of the composition of the invention,

b) Dejar actuar durante el tiempo suficiente para que el agente de control, preferiblemente en estadío larvario, se transforme en individuo adulto para llegar hasta las inflorescencias de las plantas C. selloana y proceder a su infección, preferiblemente, dicho tiempo será de al menos 15 días, más preferiblemente, de al menos 20 días, yb) Allow to act long enough for the control agent, preferably in the larval stage, to transform into an adult individual to reach the inflorescences of the C. selloana plants and proceed to infect them, preferably, said time will be at least 15 days, more preferably at least 20 days, and

c) Opcionalmente repetir los pasos a) y b).c) Optionally repeat steps a) and b).

A efectos de la presente invención el término "cantidad efectiva” o "concentración efectiva” se refiere a la cantidad agente de control biológico o de la composición de la invención que se utiliza para llevar a cabo la eliminación efectiva de las semillas de la especie C. selloana. For the purposes of the present invention, the term "effective amount" or "effective concentration" refers to the amount of biological control agent or composition of the invention that is used to carry out the effective elimination of the seeds of species C .selloana

Cualquier valor en un intervalo dado aquí se puede extender o alterar sin perder los efectos buscados, como sería aparente para una persona experta en la materia. Así, los intervalos dados, tales como concentraciones, y similares se deberían considerar aproximados, a menos que se especifique lo contrario.Any value in a range given herein can be extended or altered without losing the intended effects, as would be apparent to a person skilled in the art. So the intervals given, such as concentrations, and the like should be considered approximate, unless otherwise specified.

En una realización preferida del método de control biológico de la presente invención, éste se caracteriza porque en la etapa a) el contacto se produce al menos dos semanas antes de que comience la floración de las plantas de la especie C. selloana, más preferiblemente, el contacto se produce al menos una semana antes de que comience la floración.In a preferred embodiment of the biological control method of the present invention, it is characterized in that in step a) the contact occurs at least two weeks before the flowering of the plants of the C. selloana species begins, more preferably, contact occurs at least a week before flowering begins.

En otra realización preferida del método de control biológico de la presente invención, éste se caracteriza porque las etapas a) y b) se pueden repetir tantas veces como sea necesario hasta que se establezca una población del agente de control S. selloanae de la invención, estable, que reduzca o disminuya la producción de semillas de las inflorescencias, y por tanto, la expansión de la planta invasora C. selloana. En otra realización más preferida, el agente de control es capaz de reducir al menos un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100%, la producción de semillas de las inflorescencias infectadas de C. selloana. En otra realización más preferida, dichas repeticiones de las etapas a) y b) se llevan a cabo durante la misma temporada de floración o en diferentes temporadas de floración.In another preferred embodiment of the biological control method of the present invention, it is characterized in that steps a) and b) can be repeated as many times as necessary until a stable population of the control agent S. selloanae of the invention is established. , which reduces or diminishes the production of seeds from the inflorescences, and therefore, the expansion of the invasive plant C. selloana. In another more preferred embodiment, the control agent is capable of reducing at least 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% or 100%, seed production from infected inflorescences of C. selloana. In another more preferred embodiment, said repetitions of steps a) and b) are carried out during the same flowering season or in different flowering seasons.

En una realización preferida del método de control biológico de la invención, este se caracteriza por que la composición de la invención, que preferiblemente se encuentra en un recipiente o placa, a partir de aquí se utilizará el término placa para hacer referencia al lugar donde se encuentra la composición de la invención, tal y como se ha detallado previamente en el presente documento, se introduce en un recipiente desechable que se depositará, a temperatura ambiente en el entorno de las plantas a infectar, al menos dos semanas antes de la floración de las plantas, aunque más preferiblemente, al menos una semana antes de la floración de las plantas.In a preferred embodiment of the biological control method of the invention, it is characterized in that the composition of the invention, which is preferably found in a container or plate, from here on the term plate will be used to refer to the place where it is stored. finds the composition of the invention, as previously detailed in this document, it is introduced into a disposable container that will be deposited, at room temperature in the environment of the plants to be infected, at least two weeks before the flowering of the plants, although more preferably, at least one week before the flowering of the plants.

Dicho recipiente desechable, preferiblemente es de cartón, aunque puede utilizarse cualquier material adecuado para el uso requerido. El recipiente desechable preferiblemente presenta unas dimensiones de 120 mm de ancho x 60 mm de alto (Fig. 2a). En dicho recipiente desechable se introducen al menos 4 placas (placa Petri o similar donde se haya almacenado la composición de la invención) con la composición de la invención, preferiblemente al menos 2 placas, más preferiblemente al menos 4 placas con la composición de la invención por planta de C. selloana que se quiere infectar. Dichos recipientes desechables que comprenden las placas con la composición de la invención se colocarán a una distancia, entre ellos, de al menos un metro, pudiendo dicha distancia variar dependiendo de la densidad de la población de plantas de C. selloana que se quieran infectar. Cualquier experto en la materia sería capaz de determinar cuántas placas serán necesarias y a qué distancia deberían colocarse para que el método de control biológico descrito en la presente invención sea efectivo.Said disposable container is preferably made of cardboard, although any material suitable for the required use can be used. The disposable container preferably has dimensions of 120 mm wide x 60 mm high (FIG. 2a). At least 4 plates (Petri dish or similar where the composition of the invention has been stored) with the composition of the invention are introduced into said disposable container, preferably at least 2 plates, more preferably at least 4 plates with the composition of the invention per C. selloana plant to be infected. sayings disposable containers that comprise the plates with the composition of the invention will be placed at a distance of at least one meter from each other, said distance being able to vary depending on the density of the population of C. selloana plants that are to be infected. Any person skilled in the art would be able to determine how many plates will be necessary and at what distance they should be placed so that the biological control method described in the present invention is effective.

En otra realización preferida del método de control biológico de la invención, éste se caracteriza porque los recipientes desechables con las placas que comprenden la composición de la invención en su interior, se colocan bajo las plantas que se quieren infectar, a una distancia máxima de dicha planta de un metro, o bien dichos recipientes desechables se fijan a un cilindro, o a cualquier otro elemento que tenga cualquier forma, con la condición de que pueda colocarse alrededor de la inflorescencia de la planta, siendo dicho elemento preferiblemente de tela (Ver Fig. 2 b, c). Una vez depositados los recipientes desechables con las placas de la composición de la invención en su interior, se procede a su apertura de dichas placas para que los adultos que emerjan de las larvas y puedan acceder a las inflorescencias de las plantas, aparearse, volver a depositar los huevos y que éstos hagan su función tal y como se ha explicado anteriormente en el presente documento.In another preferred embodiment of the biological control method of the invention, it is characterized in that the disposable containers with the plates that comprise the composition of the invention inside, are placed under the plants that are to be infected, at a maximum distance from said plant of one meter, or said disposable containers are fixed to a cylinder, or to any other element that has any shape, with the condition that it can be placed around the inflorescence of the plant, said element being preferably fabric (See Fig. 2b,c). Once the disposable containers with the plates of the composition of the invention inside have been deposited, said plates are opened so that the adults that emerge from the larvae and can access the inflorescences of the plants, mate, return to lay the eggs and make them do their job as explained earlier in this document.

Realizaciones alternativas de los recipientes desechables de la presente invención, en el caso, por ejemplo, de que las condiciones climáticas durante la fase de aplicación del método de control biológico de la invención no lo permitan, comprenden conectar dicho recipiente desechable a un elemento preferiblemente rectangular, más preferiblemente con forma de prisma o rectangular que permita colocarlo alrededor de la inflorescencia de la planta, preferiblemente con un tamaño aproximado de 200 mm de diámetro x 500 mm de alto, aunque el tamaño dependerá del tamaño de la inflorescencia, formado por una estructura de alambre o malla de plástico de aproximadamente 10mm x 10 mm de luz de malla recubierta por un material con luz de malla inferior a 1 mm, preferiblemente un material que no retenga la humedad, más preferiblemente siendo dicho material tela de nylon (Fig. 2b). Dicho cilindro o prisma se coloca sobre la inflorescencia femenina que se quiera infectar y, dependiendo de las condiciones del terreno y de la planta, puede además, opcionalmente fijarse al suelo para evitar su caída (Fig. 2c). Alternative embodiments of the disposable containers of the present invention, in the case, for example, that the climatic conditions during the application phase of the biological control method of the invention do not allow it, comprise connecting said disposable container to a preferably rectangular element , more preferably with a prism or rectangular shape that allows it to be placed around the inflorescence of the plant, preferably with an approximate size of 200 mm in diameter x 500 mm high, although the size will depend on the size of the inflorescence, formed by a structure of wire or plastic mesh of approximately 10mm x 10mm mesh size covered by a material with a mesh size of less than 1mm, preferably a material that does not retain moisture, more preferably said material being nylon fabric (Fig. 2b ). Said cylinder or prism is placed on the female inflorescence to be infected and, depending on the conditions of the land and the plant, it can also optionally be fixed to the ground to prevent it from falling (Fig. 2c).

Para evitar potenciales contaminaciones de cualquier organismo, se recomienda un tratamiento adecuado para los recipientes desechables y placas que comprenden la composición de la invención a los 20 días tras la colocación bajo las plantas. Aunque los recipientes se hayan esterilizado previamente, es posible que los propágulos porten esporas de hongos, por lo que el recipiente desechable con los recipientes de la composición de la invención en su interior, se recomienda ser esterilizado para un mejor aprovechamiento del método de control biológico de la invención.To avoid potential contamination from any organism, an adequate treatment is recommended for the disposable containers and plates that comprise the composition of the invention 20 days after placement under the plants. Although the containers have been previously sterilized, it is possible that the propagules carry fungal spores, so the disposable container with the containers of the composition of the invention inside it is recommended to be sterilized for better use of the biological control method. of the invention.

Tal y como se muestra en el Ejemplo 3 de la presente invención, se consigue una reducción de al menos un 75% de los propágulos de C. selloana, lo que repercutirá en una menor expansión de dicha planta invasora, llevándose a cabo un control biológico de la misma mediante el método propuesto en la presente invención.As shown in Example 3 of the present invention, a reduction of at least 75% of the propagules of C. selloana is achieved, which will result in a lower expansion of said invasive plant, carrying out a biological control. thereof by the method proposed in the present invention.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o etapas. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.Throughout the description and claims the word "comprise" and its variants are not intended to exclude other technical characteristics, additives, components or steps. Other objects, advantages and features of the invention will be apparent to those skilled in the art in part from the description and in part from the practice of the invention. The following examples and drawings are provided by way of illustration, and are not intended to be limiting of the present invention.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURASBRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

Figura 1. Aspecto general de un adulto hembra (a) y de una larva (b) de S. selloanae. La barra de escala representa 1mm.Figure 1. General appearance of an adult female (a) and a larva (b) of S. selloanae. The scale bar represents 1mm.

Figura 2. Diseño propuesto para el recipiente de transporte que contienen el agente de control de la invención (a). El recipiente puede unirse a un tubo con estructura de malla plástica cubierta de tela si las condiciones de aplicación lo requieren (b). Este tubo cubierto de tela podrá ser, opcionalmente, fijado al suelo según las condiciones del terreno (c).Figure 2. Proposed design for the transport container containing the control agent of the invention (a). The container can be attached to a tube with a fabric-covered plastic mesh structure if the application conditions require it (b). This fabric-covered tube may optionally be fixed to the ground depending on the ground conditions (c).

EJEMPLOSEXAMPLES

A continuación, se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, en los que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invención. Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la invención y no deben ser considerados como limitativos del alcance de la misma.Next, the invention will be illustrated by means of tests carried out by the inventors, in which the effectiveness of the product of the invention is revealed. The The following examples serve to illustrate the invention and should not be considered as limiting its scope.

Ejemplo 1. Identificación y caracterización de S. selloanae. Example 1. Identification and characterization of S. selloanae.

Materiales y métodos.Materials and methods.

Se ha extraído el ADN genómico de ocho larvas y nueve adultos recogidos en la localidad de Zapateira, A Coruña, España, utilizando un kit comercial (High Pure PCR Témplate Preparation Kit, Roche), siguiendo las instrucciones del fabricante. Una vez obtenido el ADN, se han secuenciado dos regiones tomando como referencia la secuencia del gen citocromo mitocondrial c oxidasa subunidad I (COI), del genoma mitocondrial de la especie de cecidómido Mayetiola destructor, identificado en la base de datos GeneBank: GQ387648.1:1145-2680, concretamente se han tomado como referencia las posiciones 1176 a 1874 de dicho gen. Para la secuenciación se utilizaron los cebadores CeciLCOf (5’-TTC TAC TAA TCA TAA AGA TAT TGG-3’ SEQ ID NO: 3) (Folmer et al. 1994; Molecular Marine Biology and Biotechnology, 3(5): 294-299); y CeciNancyr (5’-CCW GGT AAA ATT AAA ATA TAA ACT TC-3’, SEQ ID NO: 4) (Simon et al. 1994; Annals of the Entomological Society of America, 87(6): 651-701). Las condiciones de reacción consistieron en un ciclo de dos minutos a 95°C seguido de 35 ciclos de 45 segundos a 94°C, 50°C y 68°C. Finalmente, un ciclo de siete minutos a 68°C. Los fragmentos amplificados se purificaron y secuenciaron en un analizador Applied Biosystems. La inspección de los electroferogramas y los alineamientos se realizó con el programa CODONCODES 3.7.1.1.Genomic DNA was extracted from eight larvae and nine adults collected in Zapateira, A Coruña, Spain, using a commercial kit ( High Pure PCR Template Preparation Kit, Roche), following the manufacturer's instructions. Once the DNA was obtained, two regions were sequenced taking as reference the sequence of the mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I (COI) gene, from the mitochondrial genome of the gall midge species Mayetiola destructor, identified in the GeneBank database: GQ387648.1 :1145-2680, specifically positions 1176 to 1874 of said gene have been taken as reference. For sequencing, the CeciLCOf primers were used (5'-TTC TAC TAA TCA TAA AGA TAT TGG-3' SEQ ID NO: 3) (Folmer et al. 1994; Molecular Marine Biology and Biotechnology, 3(5): 294-299 ); and CeciNancyr (5'-CCW GGT AAA ATT AAA ATA TAA ACT TC-3', SEQ ID NO: 4) (Simon et al. 1994; Annals of the Entomological Society of America, 87(6): 651-701). The reaction conditions consisted of a cycle of two minutes at 95°C followed by 35 cycles of 45 seconds at 94°C, 50°C and 68°C. Finally, a cycle of seven minutes at 68°C. The amplified fragments were purified and sequenced on an Applied Biosystems analyzer. The inspection of the electropherograms and the alignments was carried out with the CODONCODES 3.7.1.1 program.

Se identificaron dos haplotipos que difieren entre ellos en la sustitución de la posición 327 de la secuencia del gen COI de Mayetiola destructor (número de acceso en GenBank: GQ387648.1:1145-2680), concretamente las posiciones 1176-1874 de dicho gen. Se trata de una transición guanina-adenina en el comienzo de un codón (G/A)AC. El haplotipo 1 (SEQ ID NO: 1) presenta el codón (GAC) que codifica para glicina y el haplotipo 2 (SEQ ID NO: 2) presenta el codón (AAC) que codifica para ácido glutámico.Two haplotypes were identified that differ from each other in the substitution of position 327 of the Mayetiola destructor COI gene sequence (GenBank access number: GQ387648.1:1145-2680), specifically positions 1176-1874 of said gene. This is a guanine-adenine transition at the beginning of a (G/A)AC codon. Haplotype 1 (SEQ ID NO: 1) has the codon (GAC) that codes for glycine and haplotype 2 (SEQ ID NO: 2) has the codon (AAC) that codes for glutamic acid.

Los haplotipos identificados (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2) se introdujeron en la base de datos NCBI utilizando BLASTN 2.9.0+ (Zhang et al.2000: Journal of Computational Biology, 7:203-214) y en el Sistema de identificación BOLD (Ratnasingham & Hebert 2007, Molecular Ecology Notes, 7: 355-364), para identificar cuáles eran las especies más cercanas a ésta, así como sus porcentajes de identidad. Las especies más próximas identificadas fueron Macmlabis fagicola (número de acceso en GenBank: JQ684878.1) y Janetiella glechomae (número de acceso en GenBank: KR742308.1 utilizado para el haplotipo 1 (SEQ ID NO: 1) y los números de acceso: KR740388, KR743364 y KR956680 utilizados para el haplotipo 2 (SEQ ID NO: 2)), siendo los porcentajes de identidad obtenidos los siguientes:The identified haplotypes (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2) were entered into the NCBI database using BLASTN 2.9.0+ (Zhang et al. 2000: Journal of Computational Biology, 7:203-214) and into the BOLD Identification System (Ratnasingham & Hebert 2007, Molecular Ecology Notes, 7: 355-364), to identify which were the most close to it, as well as their identity percentages. The closest species identified were Macmlabis fagicola (GenBank accession number: JQ684878.1) and Janetiella glechomae (GenBank accession number: KR742308.1 used for haplotype 1 (SEQ ID NO: 1) and accession numbers: KR740388, KR743364 and KR956680 used for haplotype 2 (SEQ ID NO: 2)), the identity percentages obtained being the following:

- Macmlabis fagicola (número de acceso en GenBank: JQ684878.1): muestra un 90,29% de identidad frente al haplotipo 1 (SEQ ID NO: 1) de S. selloanae, y un 90,27% de identidad frente al haplotipo 2 (SEQ ID NO: 2), y- Macmlabis fagicola (GenBank accession number: JQ684878.1): shows 90.29% identity against haplotype 1 (SEQ ID NO: 1) of S. selloanae, and 90.27% identity against haplotype 2 (SEQ ID NO: 2), and

Ejemplo 2. Análisis de la viabilidad de las larvas de S. selloanae tras ser conservadas mediante el método de conservación de la invención.Example 2. Viability analysis of S. selloanae larvae after being preserved by the preservation method of the invention.

En la época de dispersión de la planta C. selloana se seleccionaron 120 larvas viables de las inflorescencias de pies femeninos. Las larvas seleccionadas se conservan sin alterar el propágulo infectado, manteniendo la cubierta protectora (lema o glumela inferior). Las 120 larvas se introdujeron en 6 placas Petri (aproximadamente, unas 20 larvas en cada placa de Petri) donde cada una de las placas comprendía 4 gramos de sustrato. El sustrato comprende 40% arena grano fino, 40% tierra vegetal y 20% de perlita, y presenta un grado de humedad aproximado del 40%.During the dispersal season of the C. selloana plant, 120 viable larvae were selected from the inflorescences of female feet. The selected larvae are preserved without altering the infected propagule, maintaining the protective cover (lemma or lower glumella). The 120 larvae were placed in 6 Petri dishes (approximately 20 larvae in each Petri dish) where each dish comprised 4 grams of substrate. The substrate comprises 40% fine-grained sand, 40% topsoil and 20% perlite, and has an approximate humidity level of 40%.

Los componentes de dicho sustrato fueron previamente esterilizados (temperatura de 121°C durante 20 minutos a una 1 atmósfera de presión).The components of said substrate were previously sterilized (temperature of 121°C for 20 minutes at 1 atmosphere of pressure).

A continuación, las larvas junto con el sustrato, se conservan en oscuridad a una temperatura de entre 4°C-5°C, siguiendo el protocolo del método de conservación descrito en la presente invención.Next, the larvae together with the substrate are kept in the dark at a temperature between 4°C-5°C, following the protocol of the preservation method described in the present invention.

Tras un mes de conservación, la viabilidad de las larvas se ha analizado mediante la visualización en dos placas de Petri de una muestra de al menos diez propágulos infectados, cada una con una larva en su interior, en cada placa. Esta operación se ha realizado de nuevo tras dos meses de conservación, en la que se volvieron a visualizar las dos placas anteriores y dos nuevas, y tras tres meses de conservación, en la que se visualizaron las cuatro placas anteriores y dos nuevas adicionales.After one month of conservation, the viability of the larvae has been analyzed by visualizing a sample of at least ten propagules in two Petri dishes. infected, each with a larva inside, on each plate. This operation was carried out again after two months of conservation, in which the two previous plates and two new ones were visualized again, and after three months of conservation, in which the four previous plates and two additional new ones were visualized.

Para la determinación de la viabilidad, se han estudiado en el laboratorio dos indicadores de viabilidad: color y movimiento. Así, un color o pigmentación naranja muy llamativa es característica de las larvas vivas o viables. Un color crema o blanquecino indica que la larva ha perdido viabilidad, o bien un color marrón o ennegrecido, que indica la muerte de la larva. El movimiento se determina por la estimulación física suave sobre la larva con aguja, que provoca una respuesta en forma de ligeras contracciones corporales y demuestra viabilidad.To determine viability, two viability indicators have been studied in the laboratory: color and movement. Thus, a very striking orange color or pigmentation is characteristic of live or viable larvae. A cream or whitish color indicates that the larva has lost viability, or a brown or blackish color, which indicates the death of the larva. Movement is determined by gentle physical stimulation on the larva with a needle, which elicits a response in the form of slight body contractions and demonstrates viability.

En la Tabla 1 mostrada a continuación se observa que las larvas analizadas muestran un 100% de viabilidad tras ser sometidas al protocolo de conservación de la invención.Table 1 shown below shows that the larvae analyzed show 100% viability after being subjected to the conservation protocol of the invention.

Tabla 1. Análisis de la viabilidad de las larvas de S. selloanae conservadas siguiendo el método descrito en la invención. La viabilidad se comprueba con los indicadores de pigmentación y reacción motriz a estimulación física.Table 1. Viability analysis of S. selloanae larvae preserved following the method described in the invention. The viability is verified with the indicators of pigmentation and motor reaction to physical stimulation.

Placa número 11/12/2019 15/01/2020 14/02/2020Plate number 12/11/2019 01/15/2020 02/14/2020

Ejemplo 3. Control biológico C. selloana mediante el uso del agente de control de la invención.Example 3. Biological control of C. selloana through the use of the control agent of the invention.

Las placas almacenadas y conservadas en frio, que comprenden la composición de la invención se introducen, para su transporte y colocación en el lugar de tratamiento, en un recipiente desechable fabricado con cualquier material, preferiblemente cartón, y que presenta un tamaño aproximado de 120 mm de ancho x 60 mm de alto (Fig. 2a). Dicho recipiente se deposita a temperatura ambiente en el entorno de las plantas hembra de la especie C. selloana, preferiblemente al menos dos semanas antes, más preferiblemente al menos una semana antes, de la floración de las mismas.The plates stored and kept cold, comprising the composition of the invention, are introduced, for transport and placement at the treatment site, in a disposable container made of any material, preferably cardboard, and having an approximate size of 120 mm. wide x 60 mm high (Fig. 2a). Said container is placed at room temperature in the environment of the female plants of the C. selloana species, preferably at least two weeks before, more preferably at least one week before, their flowering.

Cada recipiente desechable contiene a su vez en su interior al menos 4 placas que comprenden la composición de la invención. Es recomendable usar de entre 1 a 2 placas con la composición de la invención por planta que se pretende infectar. Es recomendable colocar los recipientes desechables a una distancia de al menos un metro de distancia entre ellos, pero dependerá de la densidad de plantas que haya en el lugar donde se lleve a cabo el tratamiento.Each disposable container contains in its interior at least 4 plates that comprise the composition of the invention. It is recommended to use between 1 to 2 plates with the composition of the invention per plant that is intended to be infected. It is advisable to place the disposable containers at a distance of at least one meter from each other, but it will depend on the density of plants in the place where the treatment is carried out.

Cuando la población está formada por pocas plantas, por ejemplo, unas 10 plantas o menos, o estas se encuentran dispersas a cierta distancia, por ejemplo, a una distancia aproximada de al menos 5 metros o más, entre ellas, los recipientes desechables se sitúan individualmente para cada planta. Cuando la población está formada por numerosas plantas en una densidad alta, por ejemplo, una densidad de plantas mayor de 0,5 plantas/m2, las placas se sitúan en un intervalo regular en forma de malla, con una distancia entre placas de 3-5 metros.When the population consists of few plants, for example, about 10 plants or less, or these are scattered at a certain distance, for example, at an approximate distance of at least 5 meters or more, between them, the disposable containers are placed individually for each plant. When the population is made up of numerous plants at a high density, for example, a plant density greater than 0.5 plants/m2, the plates are placed at a regular interval in the form of a mesh, with a distance between plates of 3- 5 meters.

Si las condiciones climáticas durante la fase de aplicación de los recipientes desechables con la composición de la invención para llevar a cabo el control biológico de C. selloana son desfavorables, sobre todo con vientos fuertes, se puede asegurar el método de infección conectando el recipiente desechable que contiene las placas con la composición de la invención a un cilindro o prisma rectangular capaz de colocarse alrededor de la inflorescencia de la planta, y que puede tener un tamaño aproximado de 200 mm de diámetro x 500 mm de alto, formado por una estructura de alambre o malla de plástico de aproximadamente 10mm x 10 mm de luz de malla recubierta por una tela de nylon o tejido similiar de luz de malla inferior a 1 mm y que no retenga humedad (Fig. 2b). Dicho cilindro o prisma se coloca sobre la inflorescencia femenina que se quiera infectar y, dependiendo de las condiciones del terreno y de la planta, puede, además, fijarse al suelo para evitar su caída (Fig. 2c). Este elemento, podrá variar en cualquier forma y tamaño, siempre teniendo en cuenta que se utiliza para proteger la inflorescencia y que se produzca la infección de una manera más directa, sobre todo cuando las condiciones climáticas no son idóneas. Alternativamente, el elemento protector de la inflorescencia se podrá retirar durante la época de dispersión de las semillas de C. selloana, que suele ocurrir alrededor de al menos 2 meses después del inicio de la infección.If the climatic conditions during the application phase of the disposable containers with the composition of the invention to carry out the biological control of C. selloana are unfavorable, especially with strong winds, the infection method can be ensured by connecting the disposable container that contains the plates with the composition of the invention to a cylinder or rectangular prism capable of being placed around the inflorescence of the plant, and that can have an approximate size of 200 mm in diameter x 500 mm high, formed by a structure of wire or plastic mesh with a mesh size of approximately 10mm x 10mm covered by a nylon fabric or similar fabric with a mesh size of less than 1mm and that does not retain moisture (Fig. 2b). said cylinder or prisma is placed on the female inflorescence to be infected and, depending on the conditions of the land and the plant, it can also be fixed to the ground to prevent it from falling (Fig. 2c). This element can vary in any shape and size, always bearing in mind that it is used to protect the inflorescence and that the infection occurs in a more direct way, especially when the weather conditions are not ideal. Alternatively, the protective element of the inflorescence can be removed during the seed dispersal season of C. selloana, which usually occurs around at least 2 months after the start of the infection.

El recipiente desechable que contiene en su interior las placas con la composición de la invención se coloca bajo las plantas que se quieren infectar, a una distancia máxima de un metro de éstas, o bien fijadas a cualquier parte del elemento rectangular utilizado para proteger las inflorescencias, evitando dispersar la composición de la invención, particularmente el sustrato de la composición de la invención. Una vez depositados los recipientes, se procede a abrir las placas para que los adultos que emergen de las larvas puedan acceder a las inflorescencias de las plantas y hacer su función.The disposable container containing the plates with the composition of the invention inside is placed under the plants to be infected, at a maximum distance of one meter from them, or fixed to any part of the rectangular element used to protect the inflorescences. , avoiding dispersing the composition of the invention, particularly the substrate of the composition of the invention. Once the containers have been deposited, the plates are opened so that the adults that emerge from the larvae can access the inflorescences of the plants and carry out their function.

Es conocido que el cecidómido Stenodiplosis sorghicola que afecta a los cultivos de sorgo en Australia, utilizando un protocolo de infección similar al descrito en la presente invención, mediante recipientes/placas con 10 individuos de S. sorghicola cada placa, infectaron inflorescencias de Sorghum halepense cubiertas por una estructura con tela de nylon, siendo capaz cada hembra de depositar 21,6 huevos, de los que eclosionarán las larvas (Sharma, HC, & Franzmann, BA. J. Appl. Ent. 2001;125:109-114). Dicha cantidad de huevos por hembra se acerca a datos obtenidos para otra especie de cecidómido, Feltiella acarisuga, en la que las hembras producen una media de 33,3 huevos a lo largo de su vida adulta (Mo, TL & Liu TX Environ Entomol. 2007;36(2):369-75).It is known that the gall midge Stenodiplosis sorghicola that affects sorghum crops in Australia, using an infection protocol similar to that described in the present invention, by means of containers/plates with 10 individuals of S. sorghicola each plate, infected Sorghum halepense inflorescences covered by a structure with nylon fabric, each female being capable of depositing 21.6 eggs, from which the larvae will hatch (Sharma, HC, & Franzmann, BA. J. Appl. Ent. 2001;125:109-114). This number of eggs per female is close to data obtained for another species of gall midge, Feltiella acarisuga, in which females produce an average of 33.3 eggs throughout their adult lives (Mo, TL & Liu TX Environ Entomol. 2007;36(2):369-75).

Para el caso de la presente invención, es interesante mencionar que el agente de control biológico, S. selloanae, produce al menos una segunda generación de adultos a partir de las larvas conservadas llevando a cabo el método descrito en la presente invención. Así, asumiendo una producción de entre 15 y 20 huevos viables por hembra, durante la vida de la inflorescencia podrán desarrollarse entre 5000 y 10000 larvas aproximadamente. Teniendo en cuenta que una inflorescencia de C. selloana puede producir unas 100000 semillas viables, el método de control biológico descrito en la presente invención supondrá la reducción de al menos el 5% de sus semillas viables con una única aplicación. Si además, se tiene en cuenta que en el medio natural donde se ha encontrado el agente de control biológico de la invención se han observado inflorescencias donde las larvas ocupan el 75% de las flores, la aplicación repetida del método de control biológico propuesto aquí reducirá el número de semillas viables al menos en este porcentaje.In the case of the present invention, it is interesting to mention that the biological control agent, S. selloanae, produces at least a second generation of adults from the larvae preserved by carrying out the method described in the present invention. Thus, assuming a production of between 15 and 20 viable eggs per female, approximately 5,000 to 10,000 larvae may develop during the life of the inflorescence. Taking into account that an inflorescence of C. selloana can produce about 100,000 viable seeds, the biological control method described in the present invention will involve the reduction of at least 5% of its viable seeds with a single application. Yes In addition, it is taken into account that in the natural environment where the biological control agent of the invention has been found, inflorescences where the larvae occupy 75% of the flowers have been observed, the repeated application of the biological control method proposed here will reduce the number of viable seeds at least in this percentage.

Para evitar potenciales contaminaciones de cualquier organismo, se recomienda un tratamiento adecuado para los recipientes que comprenden la composición de la invención a los 20 días tras la colocación bajo las plantas. Aunque los recipientes se hayan esterilizado previamente, es posible que los propágulos infectados porten esporas de hongos, por lo que el recipiente desechable con los recipientes de la composición de la invención en su interior, se recomienda ser esterilizado para un mejor aprovechamiento del método de control biológico de la invención. To avoid potential contamination from any organism, an adequate treatment is recommended for the containers that comprise the composition of the invention 20 days after placement under the plants. Although the containers have been previously sterilized, it is possible that the infected propagules carry fungal spores, so the disposable container with the containers of the composition of the invention inside it is recommended to be sterilized for better use of the control method. biologic of the invention.

Claims

1. Composition comprising at least one biological control agent for the species Spanolepis selloanae in combination with a substrate comprising topsoil, a non-porous, chemically inert ingredient with dimensions less than 5 mm, and another porous ingredient.

2. Composition according to claim 1, where the control agent is in the larval stage and in a proportion of at least 5 larvae/g of substrate.

3. Composition according to any of claims 1 to 2, where the substrate comprises a concentration of at least 35% of topsoil, at least 35% of the non-porous ingredient, and at least 15% of the porous ingredient, with respect to the total concentration of the composition.

4. Composition according to any of claims 1 to 3, where the substrate comprises a concentration of 40% of topsoil, 40% of the non-porous ingredient, and 20% of the porous ingredient, with respect to the total concentration of the composition.

5. Composition according to any of claims 1 to 4, where the substrate comprises topsoil, fine sand as a non-porous ingredient and perlite and/or vermiculite as a porous ingredient.

6. Composition according to any of claims 1 to 5, characterized in that it has a moisture content of at least 30%, preferably 40%.

7. Use of the biological control agent for the species S. selloanae and/or of the composition according to any of claims 1 to 6, as biological control agents against the plant species Cordaderia selloana.

8. Method for obtaining the composition according to any one of claims 1 to 6, comprising the steps of:

a. collect the control agent S. selloanae, preferably in the larval stage, from the inflorescences of the female plants of C. selloana , b. introduce the control agent collected in step a) in a substrate comprising topsoil, fine sand, and perlite and/or vermiculite, where said substrate has been previously sterilized,

c. store the control agent together with the substrate in dark conditions and at a temperature between 2 °C to 10 °C.

9. Obtaining method according to claim 8, characterized in that the collection of the control agent is carried out between the months of October to November.

10. Production method according to any of claims 8 to 9, characterized in that in the harvesting stage, the control agent, preferably in the larval stage, is harvested alive, and preferably together with the plant propagate.

11. Production method according to any of claims 8 to 10, characterized in that the substrate comprises at least 35%, at least 40%, topsoil, at least 35%, preferably 40%, fine sand, and at least 15%, preferably 20%, of perlite and/or vermiculite, with respect to the total concentration of the composition.

12. Production method according to any of claims 8 to 11, characterized in that in step b) at least 5 control agents are introduced, preferably in the larval stage, per gram of substrate.

13. Production method according to any of claims 8 to 12, characterized in that in step c) the temperature varies between 4°C and 5°C.

14. Production method according to any of claims 8 to 13, characterized in that the control agent, preferably in the larval stage, is kept in stage c) for at least 9 months.

15. Method of biological control of the growth and expansion of C. selloana, which includes the following stages:

a) contacting plants of the C. selloana species with an effective amount of the control agent for the S. selloanae species and/or a composition according to any of claims 1 to 6,

b) Allow the control agent and/or the composition of step a) to act long enough to allow the agent to transform into an adult individual and infect the inflorescences of the C. selloana plants, preferably, said time will be at least 15 days, more preferably, at least 20 days, and

c) Optionally repeating steps a) and b).