ES2873946T3 - Composiciones de nanocápsulas para la liberación controlada de agentes de interés terapéutico - Google Patents

Abstract

Nanocápsula polimérica que comprende: a. una cubierta polimérica; y b. una o más proteasas metálicas y/o serina proteasas encapsuladas o incorporadas en la cubierta polimérica, en la que la cubierta polimérica de a) comprende: - al menos dos monómeros estructurales de fórmula I: **(Ver fórmula)** en la que en el primer monómero estructural R1, R2, y R3, son hidrógeno o grupos alquilo de C1 a C4, X es NH y R4 es -H; en la que en el segundo monómero estructural R1, R2, y R3, son hidrógeno o grupos alquilo de C1 a C4, X es O, y -R4 es un alquil de C1 a C4-NH2; y - al menos un agente reticulante degradable y al menos uno no degradable de fórmula II: **(Ver fórmula)** en la que en el agente reticulante degradable R1 (1'), R2 (2'), R3 (3'), R5, R6 y R7 son hidrógeno o grupos alquilo de C1 a C4, R4 (4') es un grupo alquilo de C1 a C4 y X (5' y 6') es O; y en la que en el agente reticulante no degradable R1 (1'), R2 (2'), R3 (3'), R5, R6 y R7 son hidrógeno o grupos alquilo de C1 a C4, R4 (4') es un grupo alquilo de C1 a C4 y X (5' y 6') es NH; y en la que la razón proteasa:monómero y la razón molar entre el primer monómero estructural/segundo monómero estructural/agente reticulante degradable/agente reticulante no degradable son, respectivamente, 1:2420 y 7:6:1:1.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones de nanocápsulas para la liberación controlada de agentes de interés terapéutico

Campo técnico de la invención

La invención se refiere al campo de composiciones de nanocápsulas capaces de liberar agentes de interés terapéutico con una cinética controlada y un efecto prolongado y sostenible a lo largo del tiempo y a usos de las mismas. Las composiciones de nanocápsulas de la presente invención se adaptan para encapsular agentes de interés terapéutico, concretamente proteasas metálicas y/o serina proteasas, tales como colagenasa.

Antecedentes de la invención

La fibrosis es una lesión común en diferentes estados patológicos y se define por la acumulación excesiva de colágeno y otras proteínas de la matriz extracelular en el tejido conjuntivo de diferentes órganos en los que provoca disfunción del órgano. El colágeno corresponde a alrededor del 30% de todas las proteínas en los cuerpos de los mamíferos, y es la principal proteína extracelular de diferentes órganos tales como la piel, cartílago, huesos, dientes y córnea. Esta proteína estructural se compone de una triple hélice de cadenas polipeptídicas; un tercio de los aminoácidos que componen la molécula son glicina, prolina e hidroxiprolina. Los colágenos son sintetizados por fibroblastos y otras células mesenquimatosas y la sobreproducción o remodelación y degradación inapropiadas conduce a la formación de lesiones fibróticas. El proceso puede producirse de manera sistémica (es decir, esclerodermia generalizada) o de manera local (es decir, cirrosis hepática) como un proceso de reparación anómalo tras lesiones inflamatorias. Esto puede observarse en cicatrización patológica, que conduce a cicatrices anómalas, hipertróficas o queloides o de manera espontánea, en diferentes enfermedades tales como esclerodermia localizada (morfea) y otras lesiones fibróticas primarias locales que provocan de manera frecuente disfunción local (es decir, erecciones dolorosas en la enfermedad Peyronie o contracturas de las manos en la enfermedad de Dupuytren). Las cicatrices anómalas y este tipo de lesiones fibróticas focales pueden eliminarse a través de cirugía con éxito variable. En muchos casos, el proceso presenta una recaída después de la cirugía o es seguida por diferentes complicaciones tales como deformidades y disfunción de órganos.

Los procedimientos basados en enzimas han presentado una alternativa rentable de estos tipos de procedimientos ya que son técnicas mínimamente invasivas que reducen el número y gravedad de las complicaciones quirúrgicas y reducen el tiempo de recuperación.

La colagenasa Clostridium histolyticum (CCH) es una mezcla de metaloproteinasas de matriz dependientes de zinc de colagenasas AUXI y AUXII que actúan de manera sinérgica para hidrolizar el colágeno, que es el componente primario del cordón fibrótico denso. La lisis de las moléculas de colágeno se produce a través del enlace peptídico entre secuencias repetidas de Gly-Pro y un residuo X (que a menudo es hidroxil-prolina o prolina). AUXI rompe de manera preferente las fibras de colágeno cerca de los extremos N y C-terminal de los dominios de triple hélice del colágeno, mientras que AUXII cataliza la rotura del colágeno a partir de los dominios internos. Esta enzima muestra alta especificidad por lo que no afecta a las fibras elásticas, músculo liso vascular y vainas de mielina axónicas. La CCH ha demostrado efectos terapéuticos en un amplio número de trastornos relacionados con este depósito de colágeno. Alguna de las aplicaciones terapéuticas de esta enzima se relacionan con el tratamiento de hernia de disco intravertebral, oclusiones arteriales, mioma uterino, degradación de la retención de placenta humana, dolor de pezones, glaucoma, vitrectomía, quemaduras, cicatrización anómala y queloides, así como las enfermedades de Dupuytren y Peyronie. La CCH fue aprobada como un tratamiento enzimático por la Administración de Alimentos y Medicamentos en los EE.UU. en febrero de 2010 y por la Agencia Europea para la Evaluación de Medicamentos (EMEA) desde enero de 2011, y se ha comercializado con el nombre de Xiaflex (Auxilium pharmaceuticals, Inc) para el tratamiento de la enfermedad de Dupuytren y posteriormente, en diciembre de 2013, para el tratamiento de la enfermedad de Peyronie. El protocolo común para el uso de Xiaflex en pacientes con Dupuytren consiste en su administración 3 veces por cordón en intervalos de 4 semanas y, en el caso de Peyronie, consiste en ciclos de tratamiento en intervalos de 6 semanas de dos inyecciones cada 3 días. Estas tasas de administración se deben a la naturaleza lábil de las enzimas que presentan habitualmente baja estabilidad química y física y experimentan degradación una vez que se exponen a las proteasas presentes en los tejidos vivos. De manera adicional, como consecuencia de su corta vida útil en el huésped, los tratamientos con enzimas necesitan habitualmente la inyección de dosificaciones mayores que las requeridas y, por tanto, existe un riesgo asociado de toxicidad secundario debido a una sobredosis local transitoria. En el caso de las inyecciones de CCH, estas altas tasas y dosis de administración producen problemas graves, como por ejemplo, roturas corporales del pene producidas comúnmente 5 días después de la segundo inyección de cada ciclo. Una disminución en el número de inyecciones y dosificación podría reducir de manera previsible este riesgo asociado y el malestar del paciente, aumentando la tolerabilidad.

En los últimos años, la nanotecnología ha proporcionado estrategias interesantes para la administración controlada de agentes terapéuticos sensibles tales como proteínas, enzimas o incluso genes, de manera que su unión o encapsulación en nanopartículas, o el anclaje de polímeros en la superficie de proteínas de las nanopartículas aumenta su tiempo de circulación en sangre. Algunas de estas estrategias, se basan en la unión de las proteínas en la superficie de nanoportadores, ya que este enfoque no sólo proporciona a la proteína de un estabilidad coloidal mayor, sino que también proporciona nanoportadores con nuevas propiedades. Como ejemplo, la enzima CCH se ha anclado en la superficie de diferentes nanodispositivos de administración de fármacos para mejorar su penetración dentro de tumores sólidos ya que estos tipos de neoplasias malignas están protegidas habitualmente por una barrera densa de colágeno que impide fuertemente la difusión de nanoportadores. Las nanopartículas con enzimas proteolíticas tales como colagenasa o hialuronidasa, entre otras, inmovilizadas sobre su superficie han demostrado un aumento en la penetración hacia el centro del tumor en comparación con nanopartículas no modificadas. Sin embargo, estos tipos de sistemas no permiten una actividad enzimática sostenida.

En este sentido, otro enfoque para la administración controlada de agentes terapéuticos sensibles tales como proteínas, enzimas o incluso genes, es la encapsulación de dichos agentes terapéuticos sensibles dentro de nanocápsulas poliméricas, tales como en el documento WO 2017205541 A1 que proporciona un sistema de liberación controlada a nanoescala diseñado para controlar la liberación sostenida de una carga de proteínas in vivo. Esta estrategia ha recibido una mayor atención en los últimos años. La encapsulación de enzimas dentro de una cápsula polimérica no sólo proporciona protección contra agentes externos presentes en el huésped, que es un punto prioritario, sino que estas cápsulas poliméricas pueden modificarse por ingeniería para liberar las enzimas atrapadas en el lugar diana de una manera controlada o incluso en respuesta a determinados estímulos. Villegas et al. han notificado recientemente que la encapsulación de colagenasa dentro de cápsulas poliméricas degradables por pH que liberaron la colagenasa encapsulada en 3-10 horas. En este caso, y también en los otros métodos conocidos para la encapsulación de colagenasa, las enzimas se liberan durante un corto periodo de tiempo, en particular durante un periodo menor de 12 horas. Además, ACS Appl. Mater. Interfaces, 2015, 7, 24075-24081 divulga en el esquema 1, página 24076 y página 24079, nanocápsulas poliméricas que comprenden una cubierta polimérica que comprende un polímero derivado de una mezcla de monómeros de acrilamida, metacrilato de 2-aminoetilo y el agente reticulante dimetilacrilato de etilenglicol para encapsular colagenasa. Sin embargo, aunque las nanocápsulas descritas en dicho documento mantuvieron la actividad durante los primeros 2-3 días, mostraron un descenso abrupto en la actividad después de eso. Esta limitación impide la aplicación de estos tipos de nanocápsulas para el tratamiento de enfermedades que requieren una administración sostenida de enzimas durante tiempos más prolongados (más de 1 semana).

Por tanto, existe todavía la necesidad de proporcionar portadores o vehículos de proteasas capaces de lograr una liberación constante y continua de las proteasas encapsuladas dentro en dosis terapéuticas durante un periodo de tiempo suficiente para el tratamiento de enfermedades que requieren una administración sostenida de proteasas durante periodos de tratamiento mayores de 1 semana.

Sumario de la invención

La invención está definida por las reivindicaciones 1 a 10. La presente invención resuelve los problemas mencionados anteriormente proporcionando nanocápsulas poliméricas de liberación sostenida capaces de liberar proteasas metálicas y/o serina proteasas tales como colagenasa con una cinética controlada y un efecto prolongado y sostenible a lo largo del tiempo (hasta más de 10 días). De manera adicional, estas nanocápsulas protegen la proteasa alojada, preferiblemente colagenasa, frente a agresiones externas manteniendo su actividad catalítica. De esta manera, esta invención supera los problemas actuales asociados con la administración de colagenasa usando una combinación precisa de monómeros y agentes reticulantes, tal como se describe en las reivindicaciones que permite la formación de nanocápsulas poliméricas degradables con colagenasa incorporada en su interior. Estas cápsulas proporcionan una liberación sostenida de la enzima alojada proporcionando así una mejora terapéutica en comparación con las terapias actuales disminuyendo así la necesidad de inyecciones repetidas o altas dosis de colagenasa. La eficacia de estas cápsulas se ha sometido a prueba usando un modelo murino de fibrosis dérmica loca inducida por inyección dérmica repetida de bleomicina, en el que se observó una mayor de la fibrosis usando los nanoportadores de la presente invención en comparación con la administración convencional de colagenasa libre.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Esquema de síntesis de nanocápsulas de colagenasa.

Figura 2: Estudio de estabilidad de nanocápsulas de colagenasa con diferentes razones AA/Am. Micrografía mediante microscopía electrónica de transmisión a) AA/Am/EG=7,5/6,5/1, b) AA/Am/EG=7/7/1 c) AA/Am/EG=8/6/1 (la escala gráfica blanca corresponde a 100 nm) y d) DLS.

Figura 3: Estudio de estabilidad de nanocápsulas de colagenasa con diferentes razones EG/MBA. Micrografía mediante microscopía electrónica de transmisión a) AA/Am/EG/MBA=7/6/1/1, b) AA/Am/EG/MBA=7/6/1,5/0,5 c) AA/Am/EG/MBA=7/6/0,5/1,5 (las escalas gráficas blancas corresponden a 100 nm) y d) DLS.

Figura 4: Estudio de biocompatibilidad de nanocápsulas. Se administró a los ratones una cantidad fija de nanocápsulas o colagenasa libre. Se determinó la fibrosis de la piel mediante la tinción tricrómica de Masson. Los datos son representativos de un experimento con 5 ratones por grupo. Barra de 50 |im.

Figura 5: Evaluación de la eficacia de nanocápsulas de colagenasa empleando un modelo murino in vivo de fibrosis de la piel inducía por inyección de bleomicina. Ratones C3H recibieron inyecciones subcutáneas diarias de bleomicina y se trataron con colagenasa libre o nanocápsulas. Se les inyectó diariamente a los ratones de control solución salina. Se midió la fibrosis como el aumento en veces del área teñida de Masson del colágeno ajustada al área normal (grupo de solución salina). Los datos son representativos de dos experimentos independientes con 10 ratones por grupo. Barra de 50 |im.

Descripción detallada de la invención

Según la presente invención, se proporcionan nanocápsulas biodegradables mejoradas capaces de liberar agentes de interés terapéutico con una cinética controlada y un efecto prolongado y sostenible a lo largo del tiempo. Las nanocápsulas biodegradables de la presente invención son nanocápsulas poliméricas. Las nanocápsulas biodegradables de la presente invención pueden adaptarse para encapsular agentes de interés terapéutico y administrar el mismo en in vivo tras la administración a un receptor. Además, las composiciones de nanocápsulas de la presente invención pueden adaptarse para prolongar la liberación sostenible con una cinética controlada y un efecto prolongado y sostenible a lo largo del tiempo, del agente encapsulado contenido en las mismas. En el presente documento se demuestra un nuevo enfoque, junto con colagenasa para proporciona una composición de nanocápsulas que tiene una tasa controlada mejorada de liberación, in vivo.

Por tanto, la presente invención proporciona una nueva composición de nanocápsulas que puede adaptarse para encapsular y administrar de manera eficaz agentes de interés terapéutico. Por ejemplo, junto con colagenasa, la composición de nanocápsulas puede emplearse para proporciona un sustituto para la administración convencional de colagenasa libre. Aumentado la tasa controlada de liberación de un agente encapsulado, la composición de nanocápsulas de la presente invención puede aumentar significativamente la duración del funcionamiento del agente encapsulado in vivo, mejorando así el efecto terapéutico de la composición. Además, la composición de nanocápsulas de la presente invención puede administrarse de manera eficaz a una dosificación dada de un agente terapéutico de una manera controlada, mejorando así la eficacia de la dosificación mientras que se reduce la administración total requerida.

En este sentido, y para llegar a la presente invención, los autores de la invención conocían que para el tratamiento de enfermedades fibróticas, deben modificarse por ingeniería Colnc eficaces para proporcionar una liberación sostenida de proteasa durante largos periodos de tiempo, manteniendo inalterada la actividad catalítica de la enzima. Para este propósito, se estudiaron una mezcla de tres tipos de monómeros, acrilamida (AA), clorhidrato de metacrilato de 2-aminoetilo (Am) y el agente reticulante degradable dimetacrilato de etilenglicol (EG). La razón proteasa:monómero usada fue de 1:2420 y la razón entre monómeros fue de AA/Am/EG 7/6/2. Finalmente, se usaron persulfato de sodio (AP) y W,W,W,W'-tetrametiletilendiamina (TMEDA) (1:1,5) como iniciadores de radicales en una razón 423:644 con la proteasa. Sin embargo, desafortunadamente usando estas condiciones, las nanocápsulas formadas liberaron prácticamente toda la colagenasa después de tan solo 10-12 h. Tal como se ha mencionado de manera amplia anteriormente, este periodo de tiempo es claramente insuficiente para muchas de las aplicaciones terapéuticas para las que se usa actualmente colagenasa. Por tanto, y para aumentar el tiempo de liberación de la colagenasa, se siguió un nuevo método para la producción de nanocápsulas de colagenasa.

En primer lugar, se varió la razón proteasa:monómero aumentando dicha razón, lo que condujo a la formación de agregados grandes, y también se produjo una razón menor que condujo a menores rendimientos de formación de nanocápsulas. Por tanto, esta relación se fijó en la razón inicial proteína:monómero, 1:2420.

En segundo lugar, las proporciones del agente reticulante degradable se variaron para reducir la cinética de hidrólisis de Colnc. La proporción de este monómero se redujo manteniendo constante la razón proteasa:monómero total que se encontró óptima. Con esta estrategia, se sintetizaron diferentes Colnc disminuyendo la relación del agente reticulante degradable (EG) con el resto de monómeros. En todos los casos, los resultados no fueron completamente satisfactorios ya que la efectividad de la proteasa se mantuvo sólo hasta tres días. Cuando la proporción del agente reticulante degradable se redujo luego hasta la mitad de la cantidad inicial, se formaron Colnc tal como se demuestra mediante dispersión de luz dinámica (DLS) y microscopía electrónica de transmisión (TEM) en la figura 2, sin embargo, estas nanocápsulas formados perdieron casi completamente su actividad enzimática después de sólo tres días (figura 2). Si la proporción de agente reticulante se redujo luego hasta 1/4, no se formaron apenas Colnc ya que la presencia de determinadas cantidades de agente reticulante es un requisito obligatorio para crear un cubierta polimérica homogénea alrededor de la proteasa.

En vista de estos resultados, fue necesario modificar el enfoque de síntesis para producir nanocápsulas capaces de liberar colagenasa de una manera sostenida durante periodos de tiempo prolongados. En este sentido, la estrategia de síntesis usada consistió en el uso de un agente reticulante adicional en la composición de la cápsula; en este caso, un agente reticulante no degradable tal como bismetacrilamida (MBA). La idea era que la incorporación de este agente reticulante no degradable permitiría la formación de la cápsula ya que la razón de total agente reticulante se mantuvo en la composición de monómeros y podría aumentar el tiempo de degradación de la cápsula logrando un sistema capaz de liberar colagenasa durante periodos de tiempo prolongados. Con esto en mente, se estudiaron diferentes combinaciones de agentes reticulantes usando diferentes porcentajes de cada agente reticulante (degradable y no degradable) manteniendo constante la razón proteasa:monómero a 1:2420 y la razón AA/Am/agente reticulante a 7/6/2. La adición del nuevo agente reticulante no alteró el tamaño y morfología de las Colnc resultantes. Entre las diferentes Colnc formadas con diferentes razones de agente reticulante, las nanocápsulas formadas empleando una razón 1:1 de agentes reticulantes degradables:no degradables presentaron propiedades de liberación de colagenasa asombrosas tal como se muestra en la figura 3 (a). Estas nanocápsulas mostraron una liberación sostenida de colagenasa manteniendo la actividad de la enzima en algún lugar cercano al 50% de la inicial, incluso después de 5 días. De manera adicional, estas nanocápsulas presentaron una actividad enzimática sostenida durante más de 10 días, manteniendo el 15% de su actividad después de 12 días. Desafortunadamente, las otras combinaciones sometidas a prueba, aunque mantuvieron la actividad durante los primeros 2-3 días, mostraron un descenso abrupto en la actividad después de eso (véase la figura 3).

Por tanto, las Colnc obtenidas con AA/Am/EG/MBA (7/6/1/1) se eligieron como el mejor sistema para una evaluación clínica adicional con modelos murinos. Tal colagenasa liberada lograda puede ser muy beneficiosa en los tratamientos basados en colagenasa, ya que el efecto prolongado obtenido durante un periodo de tiempo prolongado puede evitar la necesidad de usar dosis altas de la enzima. Además, la alta estabilidad conferida por esta composición de recubrimiento proporciona una reducción significativa en el ciclo de administración. Por consiguiente, las nanocápsulas de la presente invención proporcionan un avance clínico prometedor del tratamiento clínico actual de enfermedades fibróticas. La efectividad de estas nanocápsulas se sometió a prueba en comparación con el tratamiento actual empleando un modelo murino fibrótico tal como se describe en los ejemplos de la presente memoria descriptiva. Por tanto, un primer aspecto de la presente invención proporciona una nanocápsula polimérica que comprende: a. una cubierta polimérica; y

b. una o más proteasas metálicas y/o serina proteasas encapsuladas o incorporadas en la cubierta polimérica, en la que la cubierta polimérica de a) comprende:

- al menos dos monómeros estructurales de fórmula I

Fórmula I

en la que en el primer monómero estructural R1, R2, y R3, son hidrógeno o grupos alquilo de C1 a C4, X es NH y R4 es -H;

en la que en el segundo monómero estructural R1, R2, y R3, son hidrógeno o grupos alquilo de C1 a C4, X es O y -R4 es un alquil de C1 a C4-NH2; y

- al menos un agente reticulante degradable y al menos uno no degradable de fórmula II

Fórmula II

en la que en el agente reticulante degradable R1 (i ), R2 (2), R3 (3), R5, R6y R7 son hidrógeno o grupos alquilo de C1 a C4, R4 (4) es un grupo alquilo de C1 a C4 y X (5'y 6) es O; y en la que en el agente reticulante no degradable R1 (1), R2 (2), R3 (3), R5, R6y R7 son hidrógeno o grupos alquilo de C1 a C4, R4 (4) es un grupo alquilo de C1 a C4y X (5'y 6) es NH; y

en la que la razón proteasa:monómero y la razón molar entre el primer monómero estructural/segundo monómero estructural/agente reticulante degradable/agente reticulante no degradable son, respectivamente, 1:2420 y 7:6:1:1. Se observa que tal como se usa en el presente documento, el término “nanocápsula” se refiere a una partícula que tienen un núcleo que está rodeado por una cubierta, de manera que la partícula tiene un tamaño de menos de aproximadamente 1.000 nanómetros. En particular, la nanocápsula de la presente invención incluye un componente bioactivo, el componente bioactivo está ubicado en el núcleo que está rodeado por la cubierta de la nanocápsula.

Se indica que en el contexto de la presente invención, el término “aproximadamente” se entiende como una desviación de /-10%. Se indica además que para todos los intervalos mencionados en toda la memoria descriptiva, los límites del intervalo se incluyen dentro del intervalo.

En otra realización preferida del primer aspecto de la invención o de cualquiera de sus realizaciones preferidas, la proteasa metálica y/o serina proteasa es colagenasa y/o tripsina.

En otra realización preferida del primer aspecto de la invención o de cualquiera de sus realizaciones preferidas, en el agente reticulante degradable R1 (1), R2 (2), R3 (3), R5, R6 y R7 son hidrógeno y R4 (4) es un grupo alquilo de C1 a C2 y X(5' y 6') es O; y en el agente reticulante no degradable R-icd, R2 (2), R3 (3), R5, R6 y R7 son hidrógeno y R4 (4) es un grupo alquilo de C1 a C2 y X(5’ y 6) es NH.

En otra realización preferida del primer aspecto de la invención o de cualquiera de sus realizaciones preferidas, en el segundo monómero estructural R1, R2, y R3, son hidrógeno, X es O y -R4 es un alquil de C1 a C2-NH2.

En la presente invención, “grupos alquilo” se entiende que indica, en particular, un grupo hidrocarbonado de cadena lineal, cadena ramificada o cíclico que tiene habitualmente desde 1 hasta 20 átomos de carbono, preferiblemente que tiene desde 1 hasta 8 átomos de carbono, más preferiblemente desde 1 hasta 4 átomos de carbono, todavía más preferiblemente desde 1 hasta 2 átomos de carbono. Los ejemplos de grupos alquilo incluyen metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, pentilo, neopentilo, hexilo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo y ciclohexilo.

En otra realización preferida del primer aspecto de la invención o de cualquiera de sus realizaciones preferidas, el agente reticulante degradable es dimetacrilato de etilenglicol (EG) y el agente reticulante no degradable es bismetacrilamida (MBA).

En otra realización preferida del primer aspecto de la invención o de cualquiera de sus realizaciones preferidas, el primer monómero estructural es acrilamida (AA) y el segundo monómero estructural es clorhidrato de metacrilato de 2-aminoetilo (AM).

En otra realización preferida del primer aspecto de la invención o de cualquiera de sus realizaciones preferidas, el agente reticulante degradable es dimetacrilato de etilenglicol (EG) y el agente reticulante no degradable es bismetacrilamida (MBA), y el primer monómero estructural es acrilamida (AA) y el segundo monómero estructural es clorhidrato de metacrilato de 2-aminoetilo (AM). Más preferiblemente, la proteasa metálica y/o serina proteasa es colagenasa.

Un método para la preparación de la composición de nanocápsulas del primer aspecto de la invención, se ejemplifica de la siguiente manera (figura 1):

1) en la primera etapa, se disuelven los monómeros en un tampón NaHCO3 desoxigenado a pH 8,5 en presencia de colagenasa. Se agitó la suspensión a temperatura ambiente en un agitador orbital durante un determinado tiempo para proporcionar tiempo para la adsorción de los monómeros en la superficie de las proteínas mediante enlaces de hidrógeno electrostáticos e interacciones de Van der Waals.

2) Se añadió una mezcla de iniciadores de radicales (persulfato de sodio, APS y W,W,W',W'-tetrametiletilendiamina, TMEDA) a la disolución de proteínas-monómeros a una velocidad controlada para comenzar el procedimiento de polimerización por radicales. Luego, se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 90 min. Se aislaron las nanocápsulas de colagenasa (Colnc) mediante separación centrífuga con filtros cortadores de 10 KDa (AMICON Ultra-2 ml 10 KDa).

Por tanto, se divulga un método para obtener la nanocápsula del primer aspecto de la invención o de cualquiera de sus realizaciones preferidas, en el que el método comprende:

a) disolver los monómeros y agentes reticulantes en presencia de la molécula bioactiva;

b) agitar la suspensión de a), preferiblemente a temperatura ambiente (aproximadamente 25°C), preferiblemente durante aproximadamente 10 min para proporcionar tiempo para la adsorción de los monómeros en la superficie de la biomolécula;

c) añadir una mezcla de iniciadores de radicales, tales como por ejemplo persulfato de sodio (APS) y N,N,N’,N’-tetrametiletilendiamina (TMEDA), preferiblemente en una razón molar 1:2 entre ellos y en una relación molar de 1:200 a 1:500 de proteína:APS, preferiblemente aproximadamente 1:423, para comenzar el procedimiento de polimerización por radicales;

d) agitar la mezcla; y

e) aislar las nanocápsulas.

Según la presente invención, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteasa metálica y/o serina proteasa, tal como colagenasa y/o tripsina, se encapsula en la composición de nanocápsulas. Por tanto la presente invención proporciona un nuevo sistema de administración para la liberación controlada de un agente terapéutico en circulación in vivo.

Por tanto, un segundo aspecto de la invención se refiere al uso de las nanocápsulas poliméricas del primer aspecto de la invención o de cualquiera de sus realizaciones preferidas, como cosmético de portador farmacéutico de principios activos; preferiblemente, como portador cosmético y/o farmacéutico de actividad de colagenasa y/o tripsina.

Además, se divulga pero no se reivindica cuando un agente de interés terapéutico, por ejemplo, puede encapsularse por la composición de nanocápsulas de la presente invención e introducirse en la circulación in vivo de un receptor mediante uno cualquier de una variedad de métodos de administración de nanocápsulas. Por ejemplo, una composición de nanocápsulas de la presente invención puede administrarse, sin limitación, mediante administración intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutánea, por vía oral o mediante administración tópica, preferiblemente mediante administración tópica. Por tanto, se contempla totalmente que la composición de nanocápsulas de la presente invención puede adaptarse para encapsular de manera virtual cualquier agente de interés terapéutico incluyendo macromoléculas, en una concentración terapéuticamente eficaz, con el propósito de proporcionar un sistema de administración de fármacos controlado.

Por tanto, un tercer aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende las nanocápsulas poliméricas del primer aspecto de la invención o de cualquiera de sus realizaciones preferidas, para su uso en el tratamiento de enfermedades de la piel, preferiblemente a través de una administración tópica, preferiblemente a la piel, usando, por ejemplo, actividad de colagenasa y/o tripsina. Preferiblemente, dichas enfermedades de la piel son enfermedades fibróticas provocadas por una producción elevada de colágeno. Más preferiblemente, tal composición farmacéutica se usar para el tratamiento de hernia de disco intravertebral, oclusiones arteriales, mioma uterino, degradación de retención de placenta humana, dolor de pezones, glaucoma, vitrectomía, quemaduras, cicatrización anómala y queloides, así como las enfermedades de Dupuytren y Peyronie.

Por último, un cuarto aspecto de la invención se refiere a una composición cosmética que comprende las nanocápsulas poliméricas del primer aspecto de la invención o de cualquiera de sus realizaciones preferidas. Preferiblemente, tal composición cosmética se usa como vehículo o portador de moléculas bioactivas tales como proteasa metálica y/o serina proteasa, tal como actividad de colagenasa y/o tripsina a la piel. Más preferiblemente, tal composición cosmética se usa, preferiblemente a través de una administración tópica, en un sujeto o receptor que padece enfermedades fibróticas provocadas por una producción elevada de colágeno. Más preferiblemente, tal sujeto o receptor padece hernia de disco intravertebral, oclusiones arteriales, mioma uterino, degradación de retención de placenta humana, dolor de pezones, glaucoma, vitrectomía, quemaduras, cicatrización anómala y queloides, así como las enfermedades de Dupuytren y Peyronie.

La presente invención se entenderá más fácilmente haciendo referencia a los siguientes ejemplos que se proporcionan para ilustrar la invención en lugar de limitar su alcance.

Ejemplos

Ejemplo 1. Evaluación en modelos de ratón de las nanocápsulas de la invención

Se sometió a prueba la biocompatibilidad de las nanocápsulas de colagenasa tal como se describe en la figura 3 (a) usando un modelo in vivo basado en ratones sanos. Con este propósito, se inyectó por vía subcutánea la misma cantidad de enzima (300 microgramos) encapsulada y libre, en ratones sanos. Después de 10 días, se sacrificaron los animales y se observó la ausencia de toxicidad local en los estudios histológicos (figura 4). Para analizar la eficacia terapéutica de las nanocápsulas de colagenasa in vivo, se un usó un modelo animal inducido por bleomicina de fibrosis dérmica. Se indujo la fibrosis de la piel en ratones hembra de 6 semanas de edad C3H/HeNHsd mediante inyección diaria subcutánea de 100 microgramos de bleomicina (1 mg/ml) o solución salina (0,9%) en un área afeitada de la piel del lomo cada día mediante inyecciones subcutáneas durante 4 semanas. Después de ese tiempo, se inyectaron por vía subcutánea 300 microgramos de las nanocápsulas encapsuladas tal como se describe en la figura 3 (a) o colagenasa libre y se mantuvieron durante 10 días. Se evaluó la fibrosis como el aumento en el área teñida de colágeno en secciones de piel teñidas con tinción tricrómica de Masson. La administración de una única dosis de nanocápsulas de colagenasa produjo una disminución significativa del área de colágeno en el área afectada en comparación con la administración de la misma dosis de colagenasa libre (figura 5).

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

   i . Nanocápsula polimérica que comprende:

   a. una cubierta polimérica; y

   b. una o más proteasas metálicas y/o serina proteasas encapsuladas o incorporadas en la cubierta polimérica, en la que la cubierta polimérica de a) comprende:

   - al menos dos monómeros estructurales de fórmula I:

   

   Fórmula I

   en la que en el primer monómero estructural R1, R2, y R3, son hidrógeno o grupos alquilo de C1 a C4, X es NH y R4 es -H;

   en la que en el segundo monómero estructural R1, R2, y R3, son hidrógeno o grupos alquilo de C1 a C4, X es O, y -R4 es un alquil de C1 a C4-NH2; y

   - al menos un agente reticulante degradable y al menos uno no degradable de fórmula II:

   

   en la que en el agente reticulante degradable R1 (1), R2 (2), R3 (3), R5, R6 y R7 son hidrógeno o grupos alquilo de C1 a C4, R4 (4) es un grupo alquilo de C1 a C4 y X (5' y6') es O; y en la que en el agente reticulante no degradable R1 (1), R2 (2), R3 (3), R5, R6y R7 son hidrógeno o grupos alquilo de C1 a C4, R4 (4) es un grupo alquilo de C1 a C4 y X (5'y 6) es NH; y

   en la que la razón proteasa:monómero y la razón molar entre el primer monómero estructural/segundo monómero estructural/agente reticulante degradable/agente reticulante no degradable son, respectivamente, 1:2420 y 7:6:1:1.
2. 2. Nanocápsula polimérica según la reivindicación 1, en la que la proteasa metálica y/o serina proteasa es colagenasa y/o tripsina.
3. 3. Nanocápsula polimérica, según la reivindicación 1, en la que la proteasa metálica y/o serina proteasa es colagenasa.
4. 4. Nanocápsula polimérica, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que en el agente reticulante degradable R1 (1), R2 (2), R3 (3), R5, R6y R7 son hidrógeno y R4 (4) es un grupo alquilo de C1 a C2, y X (5'y 6) es O; y en la que en el agente reticulante no degradable R1 (1), R2 (2), R3 (3), R5, R6 y R7 son hidrógeno y R4 (4) es un grupo alquilo de C1 a C2 y X (5 y6) es NH.
5. 5. Nanocápsula polimérica, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que en el segundo monómero estructural R1, R2, y R3, son hidrógeno, X es O y -R4 es un alquil de C1 a C2-NH2.
6. 6. Nanocápsula polimérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el agente reticulante degradable es dimetacrilato de etilenglicol (EG) y el agente reticulante no degradable es bismetacrilamida (MBA).
7. 7. Nanocápsula polimérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el primer monómero estructural es acrilamida (AA) y el segundo monómero estructural es clorhidrato de metacrilato de 2-aminoetilo (AM).
8. 8. Nanocápsula polimérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el agente reticulante degradable es dimetacrilato de etilenglicol (EG) y el agente reticulante no degradable es bismetacrilamida (MBA), y en la que el primer monómero estructural es acrilamida (AA) y el segundo monómero estructural es clorhidrato de metacrilato de 2-aminoetilo (AM).
9. 9. Nanocápsula polimérica según la reivindicación 8, en la que la molécula bioactiva es colagenasa.
10. 10. Uso de las nanocápsulas poliméricas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, como cosmético de portador farmacéutico de principios activos.