ES2872674B2 - Metodo para la deteccion y cuantificacion de fosfomicina y de sus impurezas y/o productos de degradacion - Google Patents

Metodo para la deteccion y cuantificacion de fosfomicina y de sus impurezas y/o productos de degradacion Download PDF

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Description

DESCRIPCIÓN
MÉTODO PARA LA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE FOSFOMICINA Y DE SUS IMPUREZAS Y/O PRODUCTOS DE DEGRADACIÓN
Campo de la técnica
La presente invención se refiere a un método para detectar y cuantificar el antibiótico fosfomicina y sus impurezas y/o productos de degradación, tanto en muestras del principio activo solo, como en composiciones farmacéuticas que lo contienen.
Estado de la técnica anterior
La fosfomicina es un antibiótico de amplio espectro con actividad contra bacterias grampositivas, incluidos los patógenos resistentes a múltiples fármacos (MDR) asociados con infecciones potencialmente mortales. Su mecanismo de acción está relacionado con la inhibición de la síntesis de la pared celular bacteriana mediante la inhibición de la enzima fosfoenolpiruvato transferasa.
La fosfomicina puede administrarse tanto por vía oral como por inyección intramuscular o intravenosa.
Cuando se administra por vía oral, la fosfomicina se utiliza generalmente en forma de sal cálcica o de sal trometamol y está disponible en formas farmacéuticas tales como cápsulas, o granulado o polvo para ser reconstituido con agua, y está indicada principalmente para el tratamiento de infecciones urinarias.
Las composiciones inyectables generalmente comprenden la sal disódica de fosfomicina y están disponibles como polvo estéril, normalmente con ácido succínico como excipiente, para ser reconstituido antes de su inyección.
Por vía intramuscular, la fosfomicina está principalmente indicada para el tratamiento de infecciones del tracto genitourinario, del tracto respiratorio y en infecciones de tejidos blandos, entre otras, mientras que las principales indicaciones de la fosfomicina intravenosa son infecciones complicadas del tracto urinario, osteomielitis, infecciones nosocomiales del tracto respiratorio inferior y meningitis bacteriana, entre otras.
Como para cualquier otro principio activo farmacéutico, es fundamental contar con métodos analíticos efectivos para la determinación cuantitativa de fosfomicina y sus impurezas y/o productos de degradación, tanto en muestras del principio activo como en composiciones farmacéuticas, con el fin de asegurar que se cumplen los niveles de pureza necesarios.
La determinación de fosfomicina es problemática porque es una molécula pequeña, de carácter ácido, hidrofílica y altamente polar, por lo que las técnicas más habituales, como la cromatografía líquida en fase reversa o en fase normal, son inadecuadas. Otra dificultad añadida es que la molécula de fosfomicina carece de cromóforo, por lo que el uso de un detector ultravioleta (UV) estándar también es ineficaz.
En consecuencia, existen pocas descripciones en la técnica anterior sobre métodos efectivos para determinar fosfomicina en muestras farmacéuticas, y mucho menos para determinar fosfomicina y sus impurezas y productos de degradación.
En el artículo de Liu et al., Determinaron of fosfomycin tmmetamol and its related substances in the bulk drug by ion-pair HPLC with evaporative light scattering detection, J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol., 2006, 29, 15-24, se describe un método de HPLC de fase reversa de par iónico para determinar fosfomicina y sólo una impureza de la misma (impureza A) en una muestra de un fármaco a granel de fosfomicina trometamol. Usando una columna C18, la fase móvil optimizada fue una solución de octilamina 15 mM (ajustada a pH 5,2 con ácido acético glacial) con acetonitrilo (92:8). Se utilizó un detector de dispersión de luz evaporativa (ELSD).
Por tanto, sigue existiendo la necesidad de un método analítico eficaz para la determinación de fosfomicina y sus impurezas y/o productos de degradación, tanto en muestras del principio activo como en composiciones farmacéuticas, que permita la identificación y cuantificación de esencialmente todas las impurezas y/o productos de degradación presentes en las muestras.
Objeto de la invención
El objeto de la presente invención es un método para la detección y cuantificación de fosfomicina y de sus impurezas y/o productos de degradación.
Otro aspecto de la invención es un proceso para fabricar fosfomicina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma que tenga un grado de pureza especificado que comprende el uso de dicho método.
Otro aspecto de la invención es un proceso para fabricar una composición farmacéutica que comprende fosfomicina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable que tiene un grado de pureza especificado que comprende el uso de dicho método.
Descripción de las Figuras
- La Figura 1 muestra un cromatograma representativo utilizando cromatografía líquida de alta resolución HILIC y detección CAD (HILIC-HPLC-CAD) de la solución diluyente (acetato de amonio 25 mM en acetonitrilo, 50:50, v/v) (Ejemplo 1). El eje x representa el tiempo de retención (en minutos) y el eje y indica la respuesta del detector (área del pico).
- La Figura 2 muestra un cromatograma representativo por HILIC-HPLC-CAD de la solución vehículo de succínico (0,040 mg/ml de ácido succínico) (Ejemplo 1). El eje x representa el tiempo de retención (en minutos) y el eje y indica la respuesta del detector (área del pico).
- La Figura 3 muestra un cromatograma representativo por HILIC-HPLC-CAD del estándar de referencia de Fosfomicina disódica (Ejemplo 1). El eje x representa el tiempo de retención (en minutos) y el eje y indica la respuesta del detector (área del pico).
- La Figura 4 muestra un cromatograma representativo por HILIC-HPLC-CAD de una muestra de producto farmacéutico de fosfomicina para inyección en viales que contienen una mezcla de polvo seco estéril de 6 g de fosfomicina (correspondiente a 7,92 g de fosfomicina disódica) y 150 mg de ácido succínico (1,86% en peso) (Ejemplo 1). El eje x representa el tiempo de retención (en minutos) y el eje y indica la respuesta del detector (área del pico).
- La Figura 5 muestra un cromatograma representativo por HILIC-HPLC-CAD de una muestra de producto farmacéutico de fosfomicina para inyección en viales que contienen una mezcla de polvo seco estéril de 6 g de fosfomicina (correspondiente a 7,92 g de fosfomicina disódica) y 150 mg de ácido succínico (1,86% en peso) (Ejemplo 2). El eje x representa el tiempo de retención (en minutos) y el eje y indica la respuesta del detector (área del pico).
- La Figura 6 muestra un cromatograma representativo por HILIC-HPLC-CAD del estándar de referencia de impureza A (Ejemplo 2). El eje x representa el tiempo de retención (en minutos) y el eje y indica la respuesta del detector (área del pico).
- La Figura 7 muestra un cromatograma representativo por HILIC-HPLC-CAD de una muestra envejecida de producto farmacéutico de fosfomicina para inyección (mezcla de fosfomicina disódica y ácido succínico 1,86% en peso) y de sustancia activa fosfomicina disódica no estéril sola (Ejemplo 2). El eje x representa el tiempo de retención (en minutos) y el eje y indica la respuesta del detector (área del pico).
- La Figura 8 muestra un cromatograma representativo por HILIC-HPLC-CAD de la sustancia activa fosfomicina disódica y una muestra a granel del producto farmacéutico fosfomicina disódica para inyección (mezcla de fosfomicina disódica y ácido succínico al 1,86% en peso) (Ejemplo 2). El eje x representa el tiempo de retención (en minutos) y el eje y indica la respuesta del detector (área del pico).
- La Figura 9 muestra una representación esquemática del acoplamiento de la columna de HPLC con un detector de aerosol cargado (CAD) y con un espectrómetro de masas (MS), según un procedimiento de combinación LC-CAD-MS.
Descripción detallada de la invención
El objeto de la presente invención es un método para la detección y cuantificación de fosfomicina y de sus impurezas y/o productos de degradación en muestras de fosfomicina o de una sal farmacéuticamente aceptable de la misma o de composiciones farmacéuticas que comprenden fosfomicina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, caracterizado porque comprende:
(a) someter la muestra a cromatografía líquida de interacción hidrofílica (HILIC) con elución en gradiente utilizando como fase móvil una mezcla de acetonitrilo (fase móvil A) y una solución acuosa de acetato de amonio (fase móvil B); y
(b) detectar y cuantificar la fosfomicina, impurezas y/o productos de degradación separados en la etapa a) utilizando un detector de aerosol cargado (CAD).
Tras evaluar infructuosamente muchas opciones analíticas, los autores de la presente invención han desarrollado un método basado en la cromatografía líquida de interacción hidrofílica (HILIC) combinada con un detector de aerosol cargado (CAD) que, sorprendentemente, permite identificar muchas más impurezas o productos de degradación de la fosfomicina que con los métodos descritos hasta ahora en el estado de la técnica. Es decir, se identificaron y cuantificaron con éxito más de 10 sustancias o productos de degradación diferentes.
A lo largo de la presente descripción, así como en las reivindicaciones, las expresiones en singular, generalmente precedidas por los artículos “el” , “la”, “un”, “una” que pretenden incluir también las formas plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Además, los valores numéricos precedidos por el término "aproximadamente" pretenden incluir el valor indicado exacto y también una cierta variación alrededor de dicho valor, es decir, una variación de ± 5% de la cantidad indicada. Los rangos numéricos definidos por puntos finales inferiores y superiores están destinados a incluir también dichos puntos finales indicados. A menos que se indique lo contrario, los porcentajes (%) se expresan como porcentajes peso/peso. Es parte del conocimiento general de una persona experta en la técnica que una composición farmacéutica comprende al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable (ver más abajo donde se describe explícitamente).
La fosfomicina
La fosfomicina es la denominación común internacional (INN) correspondiente al ácido [(2R,3S)-3-metiloxiran-2-il]fosfónico (número CAS 23155-02-4, fórmula molecular C3H7O4P, peso molecular 138,06 g/mol) y presenta la siguiente estructura:
Figure imgf000006_0001
Es un antibiótico de amplio espectro que actúa inhibiendo la síntesis de la pared celular bacteriana. Químicamente, es una sustancia ácida, concretamente un ácido fosfónico, y se utiliza habitualmente en terapia en forma de sal, por ejemplo, como sal disódica, sal cálcica o sal con trometamina.
En una realización preferida, el método de la invención es para la detección y cuantificación de fosfomicina y sus impurezas y/o productos de degradación en muestras que contienen fosfomicina en forma de sal disódica de fosfomicina.
La fosfomicina disódica, en particular, tiene la fórmula química C3H5Na3O4P y el peso molecular es 182,02 g/mol.
En las monografías de las sales disódica, cálcica y trometamina de fosfomicina de la Farmacopea Europea, solo se identifica una impureza, denominada "impureza A", que corresponde a (1,2-dihidroxipropil)fosfonato, es decir, a la apertura del anillo epóxido. Por ejemplo, para el caso de la fosfomicina disódica, la impureza A tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000007_0001
En una realización de la invención, el método se refiere a la detección y cuantificación de fosfomicina y sus impurezas y/o productos de degradación en una muestra de fosfomicina o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo principio activo (muestra API), preferiblemente en una muestra de fosfomicina disódica API.
En otra realización, el método se refiere a la detección y cuantificación de fosfomicina y sus impurezas y/o productos de degradación en una muestra de una composición farmacéutica que comprende fosfomicina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, preferiblemente fosfomicina disódica, como principio activo y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
La composición farmacéutica puede estar en forma de diferentes formas de dosificación, por ejemplo, como polvo, granulado, cápsula o comprimido para administración oral, como polvo para reconstitución para preparar una solución inyectable o como solución inyectable.
Entre las diversas formas de dosificación de fosfomicina disponibles comercialmente, hay una forma inyectable que contiene fosfomicina disódica como principio activo y ácido succínico como excipiente.
En una realización, la composición farmacéutica es un polvo para reconstitución para inyección.
En otra realización, la composición farmacéutica es una cápsula o comprimido.
En una realización, la composición farmacéutica comprende ácido succínico como excipiente.
En una realización preferida de la invención, la composición farmacéutica consiste esencialmente en fosfomicina o en una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, preferiblemente fosfomicina disódica, y ácido succínico, preferiblemente en donde la cantidad de ácido succínico en la composición está entre 1-5% (p/p), en relación con el peso total de la composición.
El método analítico de la invención
Detector de aerosol cargado (CAD)
Los detectores de aerosoles cargados (CAD), también conocidos como "Corona", son bien conocidos como detectores universales para su uso junto con la cromatografía líquida. En resumen, su acción se basa en nebulizar en gotitas el eluyente que contiene los analitos cuando sale de la columna, posteriormente evaporar el solvente para formar partículas, cargar las partículas en una cámara de reacción por colisión con nitrógeno ionizado, que se forma al pasar el nitrógeno sobre un hilo de corona, y medir la carga de las partículas con un electrómetro sensible. Esto genera una señal directamente proporcional a la cantidad de analito presente. Cualquier analito, siempre que forme una partícula, puede medirse mediante detección de aerosol cargado, independientemente de su estructura química.
Los principios y usos de la detección de aerosoles cargados (CAD) son bien conocidos en la técnica y se describen ampliamente en la literatura, por ejemplo, en el libro Charged Aerosol Detection for Liquid Chromatography and Related Separation Techniques, PH Gamache Editor, John Wiley & Sons, 2017.
Los detectores CAD están disponibles comercialmente para ser utilizados junto con columnas de cromatografía líquida, por ejemplo de la empresa Thermo Fisher Scientific.
Cromatografía líquida de interacción hidrofílica (HILIC)
La cromatografía líquida de interacción hidrofílica (HILIC), como es bien conocido en el campo de la química analítica, es un tipo de cromatografía líquida de alta resolución que se caracteriza por utilizar mezclas de agua o solución tampón y solventes orgánicos como fase móvil, mientras que las fases estacionarias son adsorbentes polares altamente hidrofílicas (ver, por ejemplo, Hydropilic Interaction Chromatography. A Guide forPractitioners. B.A. Olsen & B.W. Pack, Editors, John Wiley & Sons, 2013).
Ejemplos de fases estacionarias son sílice sin modificar o sílice con algún grupo polar enlazado, como aminas, amidas, polioles, ciano o zwitteriones. Típicamente, en las fases estacionarias zwitteriónicas el grupo polar enlazado combina un grupo de amonio cuaternario y un grupo sulfónico (como se describe, por ejemplo, en García-Gómez et al., Stationary phases for separation of nucleosides and nucleotides by hydrophilic interaction liquid chromatography, Trends Anal Chem., 2013, 47, 111-128 o en A practical guide to HILIC, induding ZIC®-HILIC applications, Editor: T. Jonsson, Merck SeQuant, 2009).
En una realización preferida de la invención se usa una fase estacionaria zwitteriónica.
Estos tipos de columnas, adecuadas para HILIC, están ampliamente disponibles comercialmente.
Por ejemplo, se puede usar la columna de HPLC zwitteriónica disponible comercialmente ZIC®-pHILIC (Merck SeQuant AB).
La fase móvil es una mezcla de acetonitrilo (fase móvil A) y una solución acuosa de acetato de amonio (fase móvil B).
Generalmente, la concentración de acetato de amonio en la fase móvil B está comprendida entre 10 y 40 mM, preferiblemente entre 15 y 35 mM, más preferiblemente entre 20 y 30 mM, aún más preferiblemente es aproximadamente 25 mM y aún más preferiblemente es 25 mM.
El tiempo de elución de la fase móvil generalmente está comprendido entre 45 y 60 minutos, preferiblemente es de aproximadamente 50 minutos y más preferiblemente es de 50 minutos.
El caudal de la fase móvil generalmente está comprendido entre 0,7 y 1 ml/min, preferiblemente es de aproximadamente 0,8 ml/min y más preferiblemente es de 0,8 ml/min.
La fase móvil recorre la fase estacionaria según un modo de elución en gradiente, es decir, la composición de la fase móvil cambia durante el recorrido, es decir, la proporción entre la fase móvil A (acetonitrilo) y la fase móvil B (solución acuosa de acetato de amonio). (A:B) en la mezcla de solventes cambia durante la elución.
Preferiblemente, dicho gradiente implica cambiar de una relación inicial A:B de aproximadamente 85:15 (t=0) a una relación A:B de aproximadamente 40:60 a los 35 minutos aproximadamente, y posteriormente volver de nuevo a aproximadamente 85:15 al final del tiempo de elución.
En una realización preferida, la relación inicial y final A:B, que es preferiblemente de aproximadamente 85:15, se mantiene constante durante un corto período de tiempo, por ejemplo comprendido entre 3 y 15 minutos, al principio y/o al final de la elución; más preferiblemente, la relación 85:15 se mantiene constante:
- al principio de la elución durante aproximadamente de 3 a 8 minutos, preferiblemente durante aproximadamente de 4 a 6 minutos, más preferiblemente durante aproximadamente 5 minutos y aún más preferiblemente durante 5,0 minutos; y/o
- al final de la elución durante aproximadamente de 8 a 15 minutos, preferiblemente durante aproximadamente de 10 a 12,5 minutos, más preferiblemente durante aproximadamente 12 minutos y aún más preferiblemente durante 11,9 minutos.
En otra realización preferida, la relación A:B más baja, que es preferiblemente de aproximadamente 40:60, y que se alcanza preferiblemente a los 35 minutos aproximadamente, se mantiene constante durante un corto período de tiempo, típicamente comprendido entre 2 y 5 minutos, preferiblemente durante aproximadamente 3 minutos, antes de volver a la relación A:B más alta, que es preferiblemente de aproximadamente 85:15. Más preferiblemente, la relación A:B de aproximadamente 40:60 se mantiene constante durante aproximadamente 3 minutos aproximadamente desde los 35 minutos hasta los 38 minutos.
En una realización particularmente preferida de la invención, el tiempo de elución es de 50 minutos, y el gradiente expresado como la relación entre la fase móvil A y la fase móvil B en cada punto de tiempo es: 85:15 (0 min), 85:15 (5,0 min), 40:60 (35,0 min), 40:60 (38,0 min), 85:15 (38,1 min) y 85:15 (50,0 min).
Las únicas sustancias descritas conocidas que se espera que se determinen mediante el método analítico de la presente invención son fosfomicina, impureza A, así como posibles excipientes cuando la muestra es una composición farmacéutica de fosfomicina.
Sin embargo, los autores de la presente invención observaron que, sorprendentemente, usando el método analítico de la invención se logra una separación óptima entre fosfomicina y sus impurezas y/o productos de degradación. Por tanto, como se describe en los Ejemplos, es posible separar más de 10 sustancias diferentes (ver Tabla 9), incluyendo la "impureza A".
Para identificar y cuantificar fosfomicina, impureza A y los excipientes conocidos, se pueden utilizar sustancias de referencia puras, y generalmente se realiza una calibración adecuada a partir de muestras estándar de referencia conocidas. Alternativamente, la calibración puede realizarse utilizando mezclas de estándares de referencia, para evitar un posible efecto de matriz. Por ejemplo, la calibración de la impureza A se puede realizar con una muestra que contiene una mezcla de estándares de referencia de impureza A y fosfomicina.
Para cuantificar otras sustancias, se puede suponer que todas las impurezas y productos de degradación tienen el mismo factor de respuesta que la impureza A.
Las sustancias que se utilizan como estándares de referencia en el método se pueden obtener comercialmente, y se prefiere que su pureza sea de al menos 94%, más preferiblemente de al menos 95%, aún más preferiblemente de al menos 96%, aún más preferiblemente de al menos 97%, aún más preferiblemente de al menos 98% y aún más preferiblemente de al menos 99%.
El método analítico desarrollado permite determinar concentraciones de impurezas o productos de degradación en muestras de fosfomicina tan bajas como 0,10%.
Espectrometría de Masas (MS)
Para identificar sustancias desconocidas detectadas por HILIC-CAD, se utilizó espectrometría de masas (MS), utilizando una estrategia combinada LC-CAD-MS (cromatografía líquidadetección de aerosoles cargados-espectrometría de masas).
La espectrometría de masas es una técnica analítica bien conocida que se basa esencialmente en la generación de iones a partir de compuestos por cualquier método adecuado, la separación de estos iones por su relación masa/carga (m/z) y su detección. Generalmente, los espectrómetros de masas consisten en una fuente de iones, un analizador de masas y un detector que funcionan en condiciones de alto vacío.
Se utiliza ventajosamente la espectrometría de masas en tándem (MS/MS). MS/MS somete los iones de masa seleccionada a un segundo análisis espectrométrico de masas, de acuerdo con dos etapas combinadas de espectrometría de masas (MS1 y MS2).
Los principios y aspectos prácticos de la espectrometría de masas son bien conocidos por el experto en análisis químico y también se describen en muchos libros de referencia, por ejemplo, en Mass Spectrometry. A textbook. J H. Gross, segunda edición, Springer, 2011.
Normalmente, un espectro de masas de una sustancia es la representación bidimensional de la intensidad de la señal (ordenadas) frente a m/z (abscisas). La intensidad del pico se correlaciona con la abundancia de ese ion. A menudo, el pico de mayor m/z resulta de la detección de la molécula ionizada intacta, el ion molecular. El pico del ion molecular suele ir acompañado de varios picos de menor m/z generados por la fragmentación del ion molecular quedar lugar a iones fragmentados.
En el presente método, la espectrometría de masas se emplea en asociación con la cromatografía líquida, como detector cromatográfico, para identificar cada sustancia eluida a través de su espectro de masas. Más concretamente, la cromatografía líquida se acopla simultáneamente con un detector de aerosoles cargados y un espectrómetro de masas (LC-CAD-MS) con el fin de identificar las diferentes sustancias eluidas y detectadas en CAD. En la Figura 9 se muestra un esquema del aparato LC-CAD-MS.
Por lo tanto, la muestra analizada pasa a través de la columna HILIC HPLC, se aplica un mezclador en forma de T como válvula de desvío inmediatamente después de la columna, por lo que el flujo posterior a la columna se divide en el MS y el CAD. Generalmente, la relación de flujo entre MS y CAD es aproximadamente 1:2.
Usos del método analítico de la invención
El método analítico de la invención puede incluirse en un proceso para fabricar fosfomicina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, para asegurar que se obtiene un principio activo farmacéutico de la pureza requerida.
Por tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere a un proceso de fabricación de fosfomicina o de una sal farmacéuticamente aceptable de la misma que tiene un grado de pureza especificado, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:
(i) proporcionar un lote de fosfomicina o de una sal farmacéuticamente aceptable de la misma; (ii) cuantificar las impurezas de fosfomicina y/o los productos de degradación en una muestra del lote de la etapa (i) utilizando el método de la invención; y
(iii) validar el lote solo si el porcentaje de impurezas en la muestra cumple el grado de pureza especificado.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a fosfomicina o a una sal farmacéuticamente aceptable de la misma que tiene un grado de pureza especificado, preparada mediante las siguientes etapas:
(i) proporcionar un lote de fosfomicina o de una sal farmacéuticamente aceptable de la misma; (ii) cuantificar las impurezas de fosfomicina y o los productos de degradación en una muestra del lote de la etapa (i) utilizando el método de la invención; y
(iii) validar el lote solo si el porcentaje de impurezas en la muestra cumple el grado de pureza especificado.
El grado de pureza especificado de fosfomicina o de una sal farmacéuticamente aceptable de la misma puede variar dependiendo del uso previsto o de los requisitos reglamentarios aplicables. El grado de pureza puede expresarse típicamente como un porcentaje máximo permisible de impurezas, ya sea referido a las impurezas totales, o referido a una impureza específica en particular.
Para proporcionar el lote de fosfomicina o de una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, de acuerdo con el paso (i), se puede usar cualquier fuente, en particular, se puede usar cualquier proceso sintético adecuado para preparar fosfomicina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, incluyendo opcionalmente una etapa de purificación.
Posteriormente, en la etapa (ii), se toma una muestra del principio activo del lote y se somete al método analítico de la invención, descrito anteriormente, para cuantificar la cantidad de impurezas.
Finalmente, el porcentaje de impurezas de la muestra se compara con el grado de impureza requerido; normalmente, se evalúa si el porcentaje de impurezas no excede el grado de impureza máximo permitido. Si se cumple dicho requisito, se valida el lote de fosfomicina o de una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, es decir, se clasifica como adecuado para su uso posterior, es decir, para ser utilizado como principio activo farmacéutico para ser incorporado en composiciones farmacéuticas.
Si la muestra no cumple con los requisitos de pureza, se descarta, es decir, se considera no apta para su uso como principio activo farmacéutico. Los lotes descartados pueden someterse a un proceso de purificación, por ejemplo.
De manera análoga, el método analítico de la invención se puede incluir en un proceso para fabricar una composición farmacéutica que comprende fosfomicina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable, para asegurar que se obtiene una composición farmacéutica de la pureza requerida.
Por tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere a un proceso para fabricar una composición farmacéutica que comprende fosfomicina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable que tiene un grado de pureza especificado, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:
(i) proporcionar un lote de una composición farmacéutica que comprende fosfomicina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable;
(ii) cuantificar las impurezas de fosfomicina y/o los productos de degradación en una muestra del lote de la etapa (i) utilizando el método de la invención; y
(iii) validar el lote solo si el porcentaje de impurezas cumple los requisitos de pureza requeridos.
Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende fosfomicina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable que tiene un grado de pureza especificado, preparado mediante las siguientes etapas:
(i) proporcionar un lote de una composición farmacéutica que comprende fosfomicina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable;
(ii) cuantificar las impurezas de fosfomicina y/o los productos de degradación en una muestra del lote de la etapa (i) utilizando el método de la invención; y
(iii) validar el lote solo si el porcentaje de impurezas cumple los requisitos de pureza requeridos.
El lote de la composición farmacéutica de la etapa (i) puede ser a granel, es decir, típicamente polvo, comprimidos o cápsulas no envasadas, o puede ser una composición farmacéutica terminada envasada adecuadamente, por ejemplo, polvo para uso oral en sobres monodosis, o polvo para inyección en viales, o comprimidos o cápsulas en blísteres o en frascos u otros envases.
Para proporcionar el lote de una composición farmacéutica que comprende fosfomicina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable, de acuerdo con el paso (i), se puede usar cualquier fuente, en particular, dicho lote se puede obtener usando cualquier proceso de fabricación estándar, como son bien conocidos en el campo de la tecnología farmacéutica, como se describe en libros de referencia bien conocidos en el campo, por ejemplo, en el libro Aulton's Pharmaceutics. The design and manufacture of medicines, M.E. Aulton y K.M.G. Taylor, editores, Churchill Livingstone Elsevier, cuarta edición, 2013; o en el libro Remington Essentials of Pharmaceutics, L. Felton, editor, Pharmaceutical Press, 2013; o en el Pharmaceutics. Basic principies and application to pharmacy practice. A.K. Dash, S. Singh y J. Tolman, editores, Academic Press, Elsevier, 2014.
Posteriormente, en la etapa (ii), se toma una muestra del lote de la composición farmacéutica y se somete al método analítico de la invención, descrito anteriormente, para cuantificar la cantidad de impurezas.
Finalmente, el porcentaje de impurezas de la muestra se compara con el grado de impureza requerido; típicamente, se evalúa si el porcentaje de impurezas no excede el grado de impureza máximo permitido, ya sea referido a la cantidad total de impurezas o a una impureza específica en particular. Si se cumple dicho requisito, el lote de la composición se valida, es decir, se clasifica como adecuado para un uso seguro en terapia.
Si la muestra no cumple con los requisitos de pureza, se descarta.
Ejemplos
Ejemplo 1: Método HILIC-HPLC con detección CAD: cuantificación de fosfomicina en muestras de fosfomicina
Se analizaron las siguientes muestras de fosfomicina:
- Fosfomicina inyectable producto terminado ("Fosfomycin DP"): viales que contienen una mezcla de polvo seco estéril de 6 g de fosfomicina (correspondiente a 7,92 g de fosfomicina disódica) y 150 mg de ácido succínico (1,86% en peso).
- Fosfomicina inyectable a granel (“Fosfomicina BDP”): misma mezcla de polvo seco de fosfomicina disódica y ácido succínico, en la misma proporción (1,86% en peso de ácido succínico), pero conservada en tambores, aún no acondicionada en viales estériles.
- Principio activo farmacéutico de fosfomicina disódica ("Fosfomicina API")
Equipo empleado
Figure imgf000016_0001
Parámetros operativos del método HPLC:
Fase móvil A: Acetonitrilo
Fase móvil B: Acetato de amonio 25 mM
Velocidad de flujo: 0,8 ml / min
Volumen de inyección: 12 μl
Temperatura de la columna: 50°C
Temperatura del inyector automático: 5°C
CAD: Temperatura del nebulizador: 30°C
Tasa de recolección: 10 Hz
Tiempo de elución: 50 min
Gradiente:
Figure imgf000016_0002
Reactivos/Estándares de referencia
• Agua de pureza alta (Milli-Q)
• Acetonitrilo, Fisher, grado Optima LC/MS
• Acetato de amonio, Fisher, grado HPLC/ACS
• Diluyente de la muestra: mezcla 1:1 (v/v) de fase móvil A:fase móvil B
• Ácido succínico, Sigma-Aldrich, BioXtra > 99,0%
• Estándar de referencia de sal disódica de fosfomicina ("Fosfomicina RS") (Ercros) (pureza total 98,8% en peso)
Preparación de la fase móvil B
La fase móvil B es acetato de amonio 25 mM, el pH es de aproximadamente 6,8, aunque no se requiere la medición del pH. Se añadieron 3,9 g de acetato de amonio a un matraz aforado de 2000 ml y se añadió agua hasta un volumen total de 2000 ml.
Preparación de las soluciones de ácido succínico.
Se preparó una solución madre de ácido succínico (“ácido succínico 20x”) como sigue: se pesaron 80 ± 1 mg de ácido succínico en un matraz aforado de 100 ml; se añadieron aproximadamente 40 ml de la fase móvil B y se mezclaron hasta su disolución; a continuación se añadieron y mezclaron aproximadamente 40 ml de fase móvil A (acetonitrilo); y finalmente se añadió la cantidad suficiente de diluyente de la muestra hasta un volumen de 100 ml.
La solución “vehículo de succínico” se preparó transfiriendo 0,5 ml de la solución de ácido succínico 20x a un matraz aforado de 10 ml y añadiendo diluyente de la muestra hasta un volumen de 10 ml. La concentración de la solución vehículo de succínico fue de 0,04 mg/ml. La solución se conservó a 5°C.
Preparación y calibración de la solución estándar de fosfomicina disódica
Se preparó una solución estándar de fosfomicina disódica ("Solución Stock") a 2,75mg/ml como sigue: se pesaron 55 ± 1 mg de Fosfomicina RS en un matraz aforado de 20 ml; se añadieron 10 ml de fase móvil B y se mezclaron hasta disolución, luego se añadieron y mezclaron 10 ml de fase móvil A y finalmente se añadió la cantidad suficiente de diluyente de la muestra (mezcla 1:1 de fases móviles A y B) hasta un volumen de 20 ml. La solución se conservó a 5°C.
La concentración molar de fosfomicina disódica en la solución madre fue 14,92 mM y se calculó teniendo en cuenta el contenido de agua de Fosfomicina RS (0,03% en peso) y la pureza total de Fosfomicina RS (98,8% en peso).
La calibración de la solución estándar se realizó en el intervalo del 75% al 125% de la concentración del ensayo. La calibración se utilizó para cuantificar el contenido de la fosfomicina en las muestras.
Se preparó una solución estándar de linealidad del 100% diluyendo 4 ml de “Solución Stock” con diluyente de la muestra a 5 ml (concentración final 11,9 mM). La solución se conservó a 5°C. Se prepararon soluciones adicionales como se describe en la Tabla 1 (al 125%, la solución madre se usa directamente para preparar una muestra de HPLC):
TABLA 1
Figure imgf000018_0001
Se creó una curva de calibración trazando el área del pico frente a la cantidad teórica (mM) de principio activo (fosfomicina) y de impureza A. Se utilizó una ecuación polinómica de segundo orden para ajustar los datos:
F (x ) = c bx a x2
Donde a, b y c son coeficientes de calibración.
Preparaciones de muestra
Para preparar la muestra de API de fosfomicina disódica (Fosfomicina API), se pesaron 44 ± 1 mg de Fosfomicina API en un matraz aforado de 20 ml, se añadieron 10 ml de fase móvil B y se agitó hasta su disolución, luego se añadieron 10 ml de fase móvil A y se mezcló, y finalmente se añadió la cantidad suficiente de diluyente de la muestra (mezcla 1:1 de fases móviles A y B) hasta un volumen de 20 ml. La solución se etiquetó como " Muestra de trabajo API" y se conservó a 5°C.
Para preparar la muestra de producto farmacéutico fosfomicina (Fosfomicina DP), se disolvió el contenido de un vial del medicamento en polvo, que contenía 6 g de fosfomicina (correspondiente a 7,92 g de fosfomicina disódica) y 150 mg de ácido succínico (1,86% p/p) en fase móvil B hasta un volumen de 250 ml. Se transfirieron 10 ml de esta solución a un matraz aforado de 150 ml, se añadieron 10 ml de la fase móvil A (acetonitrilo) y se añadió la solución diluyente hasta 150 ml. La solución muestra fue de aproximadamente 11,8 mM como ácido libre puro de fosfomicina. Se etiquetó como “Muestra de trabajo DP” y se conservó a 5°C.
Para preparar la muestra de producto farmacéutico a granel (BDP) (Fosfomicina BDP), primero se disolvieron 45 ± 1 mg de producto farmacéutico a granel de fosfomicina con 10 ml de fase móvil B en un matraz aforado de 20 ml, luego se añadieron 10 ml de fase móvil A, y finalmente se añadió la cantidad suficiente de diluyente de la muestra hasta un volumen de 20 ml. La solución se etiquetó como "Muestra de trabajo BDP" y se conservó a 5°C.
Resultados
La fosfomicina se identificó en los cromatogramas de muestra cuando el tiempo de retención estaba dentro de ± 5% del tiempo de retención promedio de los picos de fosfomicina (n=6) en la solución estándar.
En base a la calibración con el estándar de fosfomicina, la concentración en mM del fármaco en muestras desconocidas se calculó a partir de ecuaciones conocidas, partiendo del área del pico principal, y usando el factor de dilución (DF) para determinar la concentración (mM) de fosfomicina en la muestra original (solución madre de muestra):
Ecuación 1: Concentración de fosfomicina
Figure imgf000019_0001
Donde:
a, b, c Coeficientes definidos por la calibración polinomial de segundo orden
DF 1 para API
DF 1 para productos farmacéuticos a granel (BDP)
DF 15 para producto farmacéutico (DP)
Ecuación 2: Cantidad de fosfomicina en productos farmacéuticos terminados
Figure imgf000020_0001
Donde:
Conc. = Concentración (mM) de equivalentes de ácido libre de fosfomicina según la Ecuación 1
Vol. = Volumen de las soluciones muestra de trabajo DP originales (0,250 l para DP)
PM = 138,06 mg/mmol (fosfomicina como ácido libre en DP)
Ecuación 3: Cantidad de fosfomicina en productos farmacéuticos a granel y API
Figure imgf000020_0002
Donde:
Conc. = Concentración (mM) de fosfomicina disódica según la Ecuación 1
Vol. = Volumen de soluciones muestra de trabajo API y BDP (0,020 l para BDP y API)
PM = 182,02 mg/mmol (fosfomicina como sal disódica en API y BDP)
Ecuación 4: Porcentaje declarado en el etiquetado del producto farmacéutico terminado
Figure imgf000020_0003
Ecuación 5: Cantidad esperada de fosfomicina en BDP y API (corregida con % de humedad y % de pureza)
Figure imgf000020_0004
Donde % ácido succínico es 1,86% para BDP y 0% para API
Ecuación 6: Porcentaje de contenido para API y BDP
Figure imgf000020_0005
Donde:
Fosfomicina Observada = Cantidad observada (mg) de fosfomicina disódica según la Ecuación 3
Fosfomicina Esperada = Cantidad Esperada (mg) de fosfomicina disódica según la Ecuación 5
Con fines ilustrativos, las figuras 1 a 4 muestran algunos cromatogramas obtenidos, en los que el eje x representa el tiempo de retención (en minutos) y el eje y indica la respuesta del detector (área del pico):
- Diluyente (acetato de amonio 25 mM en acetonitrilo, 50:50, v/v) (Figura 1) Se muestran los siguientes picos: 15,968 y 26,779 (trímero).
- Solución vehículo de succínico (0,040 mg/ml de ácido succínico) (Figura 2). Se muestran los siguientes picos: 14,593 (pre-pico 1), 19,460 (ácido succínico) y 26,767 (trímero).
- Fosfomicina RS al 100% (Figura 3). Se muestran los siguientes picos: 13,618 (pre-pico 2), 14,594 (pre-pico 1), 15,336 (fosfomicina), 18,199 (impureza A), 20,984 (post-pico 1) y 21,250 (post-pico 2) y 26,746 (trímero).
- Fosfomicina DP al 100% (Figura 4). Se muestran los siguientes picos: 10,447 (pre-pico_10RT), 11,124, 11,633 (pre-pico_11RT), 13,105 (pre-pico 3), 13,606 (pre-pico 2), 14,554 (pre-pico 1), 15,365 (fosfomicina), 18,165 (impureza A), 19,389, 19,854, 21,005, 21,238 (impureza_21RT), 21,859, 22,969, 23,778 y 26,757 (trímero).
Ejemplo 2: Método HILIC-HPLC con detección CAD: cuantificación de impurezas y productos de degradación en muestras de fosfomicina
El equipo, los parámetros operativos de HPLC, los reactivos, los estándares de referencia, la fase móvil A y B y el diluyente de la muestra fueron los mismos que los descritos en el Ejemplo 1. Las únicas diferencias fueron que, en este caso, el detector CAD utilizado fue específicamente Corona Veo y el volumen de inyección fue 25 μl, en lugar de 12 μl.
Además, en este ejemplo, se utilizó el siguiente estándar de referencia adicional:
• Estándar de referencia de la impureza A (Impureza A RS): P-[(1R, 2R)-1,2-dihidroxipropil)]-ácido fosfónico, sal de amonio (Toronto Research Chemicals). C3Ht05P(NH3)2; PM = 190,14 (pureza total 94,6% en peso).
Las soluciones de ácido succínico (soluciones de “ácido succínico 20x” y “vehículo de succínico”) se prepararon de forma análoga a como se describe en el Ejemplo 1.
Así, para la preparación de la solución “ácido succínico 20x” se pesaron 84 ± 1 mg de ácido succínico en un matraz aforado de 100 ml, se añadieron 40 ml de fase móvil B y se mezclaron hasta disolución, posteriormente se añadieron 40 ml de fase móvil A y se mezclaron, y finalmente se añadió la cantidad suficiente de diluyente de la muestra hasta 100 ml.
Para preparar la solución "vehículo de succínico", se añadieron 0,5 ml de solución de "ácido succínico 20x" en un matraz aforado de 10 ml y se añadió la cantidad suficiente de diluyente de la muestra hasta 10 ml.
Las muestras de fosfomicina analizadas fueron:
- Fosfomicina inyectable ("Fosfomicina DP"): viales que contienen una mezcla de polvo seco estéril de 6 g de fosfomicina (correspondiente a 7,92 g de fosfomicina disódica) y 150 mg de ácido succínico (1,86% en peso).
- Fosfomicina inyectable a granel (“Fosfomicina BDP”): misma mezcla de polvo seco de fosfomicina disódica y ácido succínico, con la misma proporción (1,86% en peso de ácido succínico), pero sin envasar en viales estériles.
- Principio activo farmacéutico de fosfomicina disódica ("Fosfomicina API")
En este Ejemplo, también se analizaron muestras de fosfomicina API no estériles, que tenían un contenido más elevado de impurezas, como huella dactilar para la asignación de los picos de impurezas.
Preparación y calibración de la solución estándar de impureza A
Se preparó una solución estándar madre de Impureza A ("Stock de impureza A"), a 11 mM. En un matraz aforado de 20 ml se disolvieron 47 ± 1 mg de sal de amonio de la impureza A de la fosfomicina, añadiendo primero 10 ml de fase móvil B hasta su disolución, luego añadiendo 10 ml de fase móvil A y finalmente añadiendo la cantidad suficiente de diluyente de la muestra hasta un volumen de 20 ml. La solución se etiquetó como “Stock de impureza A” y se conservó a 5°C.
La concentración molar de impureza A en la solución estándar madre de impureza A fue 10,98 mM, y se calculó teniendo en cuenta el contenido de agua de la impureza A RS (6,1% en peso) y la pureza total de la impureza A RS (94,6% en peso).
Se preparó una solución estándar de trabajo de impureza A (“LL Estd. 2”) diluyendo 2,0 mi de la solución stock de impureza A con diluyente de la muestra hasta 100 ml (concentración final 0,230 mM). La solución se conservó a 5°C.
A partir del estándar de trabajo de Impureza A ("LL Estd. 2"), se prepararon estándares de linealidad a baja concentración (LL Estd.) utilizando diluyente de la muestra tal y como se describe en la Tabla 2. Se utilizó una calibración basada en estos estándares para cuantificar el contenido de las impurezas en las muestras, tanto como impureza A como otras impurezas desconocidas.
TABLA 2
Figure imgf000023_0001
Se utilizaron LL Estd. 0,5, 0,10, 0,20 y 0,50 para la calibración en cinco puntos en respuestas del pico de Impureza A a baja concentración, representando el área del pico frente a la concentración teórica (mM).
Preparaciones de muestra
Las muestras de API (Fosfomicina API) se prepararon de forma análoga a la descrita en el Ejemplo 1, se etiquetaron como "Muestra de trabajo API" y se conservaron a 5°C.
De manera análoga, se preparó una solución "muestra de resolución API", pero utilizando API no estéril, que tenía niveles más altos de impurezas y se utilizó para seleccionar las columnas en función de la resolución y como huella dactilar para la asignación de los picos de impurezas.
Para preparar la muestra de producto farmacéutico fosfomicina (Fosfomicina DP) se abrió un vial que contenía 6 g de fosfomicina (correspondiente a 7,92 g de fosfomicina sódica) y 150 mg de ácido succínico (1,86% p/p) y se disolvieron 45 ± 1 mg de Fosfomicina DP añadiendo primero 10 ml de fase móvil B a un matraz aforado de 20 ml, luego 10 ml de fase móvil A, y finalmente añadiendo diluyente de la muestra hasta 20 ml. Se etiquetó como “Muestra de trabajo DP” y se conservó a 5°C.
Se prepararon muestras de fosfomicina BDP como se describe en el Ejemplo 1, y la solución se etiquetó como "Muestra de trabajo BDP" y se conservó a 5°C.
Denominación de los picos
La denominación de los picos se basó en el estudio de identificación de los picos de impurezas LC/MS/MS del Ejemplo 3. La denominación de los picos fue ligeramente diferente para API y para DP y BDP porque estos últimos contenían ácido succínico, por lo que había algunos picos de impurezas relacionados con ácido succínico en DP y BDP, pero no en API.
Las muestras de API no estériles tenían un contenido elevado de la mayoría de las impurezas (véase la Figura 7) y podrían usarse como huella dactilar para obtener una guía adicional para la asignación de los picos de impurezas.
Los picos que no pudieron ser identificados fueron etiquetados como "desconocidos" con RT y RRT.
Resultados
La identificación/denominación de los picos de impurezas y otros picos importantes para la muestra de Fosfomicina API se muestran en la Tabla 3.
TABLA 3
Figure imgf000025_0001
La identificación/denominación de los picos de impurezas y otros picos principales de Fosfomicina DP y Fosfomicina BDP se muestran en la Tabla 4:
TABLA 4
Figure imgf000026_0001
Figure imgf000026_0002
El tiempo de retención de la impureza A en las soluciones muestra fue ± 5% del tiempo de retención medio de los picos de impureza A (n=6) en las soluciones estándar.
Se creó una curva de calibración trazando el área del pico frente a la concentración teórica (mM) de impureza A en la calibración a baja concentración (los niveles incluyen 0%, 0,05%, 0,10%, 0,20% y 0,50%). Se utilizó una ecuación polinomial de segundo orden:
F(x) = c bx ax2
Donde a, b y c son coeficientes de calibración.
En base a la calibración con el estándar de impureza A, la concentración en mM de cada impureza en una muestra desconocida podría calcularse a partir del área del pico de cada impureza, teniendo en cuenta el factor de dilución (DF) para determinar la concentración (mM) de cada impureza en la muestra original (solución madre de muestra), mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000027_0001
Donde a, b, c son coeficientes definidos por la calibración polinomial de segundo orden.
El contenido de cada impureza desconocida en la muestra original podría calcularse usando la siguiente fórmula (este cálculo asumió que todas las impurezas tienen el mismo factor de respuesta que la impureza A):
Figure imgf000027_0002
Donde:
Conc. Concentración (mM) de cada impureza a partir de la calibración del estándar de Impureza A
Vol. Volumen de las soluciones muestra de trabajo originales (0,020 l para muestras DP, BDP y API)
PM 154,06 mg/mmol (Impureza A como ácido libre)
Para las muestras de API, la cantidad de fosfomicina seca se calcula en función del contenido de agua medido, de acuerdo con la siguiente fórmula:
Cantidad Fosfomicina seca (mg) = Peso muestra API (mg) x
Figure imgf000027_0003
Para muestras de DP y BDP, la cantidad de fosfomicina seca se puede calcular de acuerdo con la siguiente formula:
Cantidad Fosfomicina seca (mg) = Peso muestra DP (mg) x
Figure imgf000028_0001
Donde 1,86 es el porcentaje de excipiente de ácido succínico en formulaciones de DP/BDP y 138,06/182,02 es la fracción en peso de ácido libre de fosfomicina en la muestra de fosfomicina disódica.
El porcentaje en peso individual de cada impureza y el porcentaje en peso de todas las impurezas en las muestras de API, BDP y DP se calcularon en relación con la cantidad de ácido libre de fosfomicina seca, utilizando las siguientes fórmulas:
Figure imgf000028_0002
Con fines ilustrativos, en las figuras 5 a 8 anexas se muestran algunos cromatogramas representativos, en los que el eje x representa el tiempo de retención (en minutos) y el eje y indica la respuesta del detector (área del pico):
- Fosfomicina disódica DP (Figura 5). Se muestran los siguientes picos: 10,763 (aducto de etanol), 11,021 (ácido olefínico saturado aducto de etanol), 13,652 (ácido olefínico), 14,480 (aducto de metanol), 15,402 (fosfomicina), 18,060 (impureza A), 19,519 (succínico 1), 19,974 (succínico 2), 20,707 (dímero 1), 20,936 (dímero 2), 22,589 (sodio) y 26,319 (trímero).
- Impureza A RS al 2% (Figura 6). Se muestran los siguientes picos: 14,316, 15,757 (fosfomicina) y 17,927 (impureza A).
- Muestras de fosfomicina disódica API (no estéril) y DP (envejecida) (Figura 7). En el primer cromatograma se muestran los siguientes picos: 10,132, 10,426 (aducto de etanol), 11,450 (ácido olefínico saturado aducto de etanol), 11,913 (ácido olefínico saturado), 13,316 (relacionado con el ácido olefínico), 13,798 (ácido olefínico), 14,727 (aducto de metanol), 15,357 (fosfomicina), 18,196 (impureza A), 20,270 (aducto de metanol aducto de ácido olefínico), 21,363 (dímero 1), 21,533 (dímero 2), 22,167 (dímero 3), 22,413 (dímero 4), 23,264 (dímero 5), 23,872 (dímero 6), 24,460, 26,532 (trímero 1), 27,431 (trímero 2), 27,721 (trímero 3) y 28,382 (trímero 4). En el segundo cromatograma, se muestran los siguientes picos: 10,515 (aducto de etanol), 13,431 (relacionado con ácido olefínico), 13,833 (ácido olefínico), 14,742 (aducto de metanol), 15,357 (fosfomicina), 18,297 (impureza A), 19,073 (succínico ácido 1), 19,342 (ácido succínico 2), 20,315 (aducto de metanol aducto de ácido olefínico), 21,250 (dímero 1), 21,530 (dímero 2), 22,361 (dímero 3/dímero 4), 23,262 (dímero 5 aducto de ácido succínico ), 24,027 (dímero 6), 24,460, 26,896 (trímero 1).
- Muestras de Fosfomicina disódica API y BDP (Figura 8). En el primer cromatograma, se muestran los siguientes picos: 10,768 (aducto de etanol), 10,993 (ácido olefínico saturado aducto de etanol), 13,583 (ácido olefínico), 14,392 (aducto de metanol), 15,368 (fosfomicina), 17,942 (impureza A), 20,544 (dímero 1), 20,760 (dímero 2), 22,488 (dímero 5 aducto de ácido succínico), 23,137 (dímero 6), 23,628, 26,095 (trímero 1). En el segundo cromatograma, se muestran los siguientes picos: 10,777 (aducto de etanol), 10,994 (aducto de etanol), 13,575 (ácido olefínico), 14,434 (aducto de metanol), 15,368 (fosfomicina), 17,933 (impureza A), 19,442 (ácido succínico) 1), 19,720 (ácido succínico 2), 20,524 (dímero 1), 20,765 (dímero 2), 21,636 (dímero 3), 22,490 (dímero 5 aducto de ácido succínico), 23,135 (dímero 6), 23,628 y 26,057 (trímero 1).
Ejemplo 3: HPLC-CAD-MS para la identificación de los picos
La identificación de los picos de impurezas se realizó usando HPLC junto con un detector de aerosol cargado (CAD) y de espectrometría de masas (MS).
Las muestras analizadas fueron:
- Producto farmacéutico fosfomicina (Fosfomicina DP) tras 48 meses de estabilidad acelerada a 30°C;
- Muestra envejecida de fosfomicina API (fabricada en abril de 2013)
Se esperaba que estas muestras proporcionaran un perfil completo de los picos de impurezas.
Se utilizó un espectrómetro de masas Waters Q-Tof Premier.
Los reactivos, los estándares de referencia y el equipo y las condiciones de HPLC fueron los mismos que los descritos en el Ejemplo 2.
Además, se utilizaron las siguientes soluciones de calibración del espectrómetro de masas: - Leucina encefalina (1 ng/^l)
- Formiato de sodio (ácido fórmico al 10%: NaOH 0,1 M: acetonitrilo en una proporción de 1:1:8)
Se aplicó un mezclador en forma de T como válvula de desvío inmediatamente después de la columna de HPLC. A continuación, el flujo posterior a la columna se dividió en una relación de 1:2 hacia el MS y el CAD, respectivamente. La relación se ajustó usando diferentes longitudes de tubo de PEEK (poliéter éter cetona). Una longitud más larga resultó en una velocidad de flujo más baja hacia el MS, y una longitud más corta resultó en una velocidad de flujo más alta hacia el CAD. Aunque estas diferentes longitudes de los tubos dan como resultado diferentes tiempos de retención en los dos detectores, el tiempo de retención relativo (RRT) de cada pico en relación con la fosfomicina se utilizó para comparar los resultados del MS y del CAD.
Las condiciones de ionización y fragmentación se desarrollaron utilizando la inyección directa del producto farmacéutico fosfomicina. Los voltajes del cono, del capilar y de colisión se variaron a intervalos de 30 segundos y se examinaron los espectros para cada condición. Los valores finales para los voltajes del cono y del capilar se eligieron para alcanzar la mayor intensidad sin fragmentar las moléculas originales. Los parámetros del método final se detallan en la Tabla 5 (parámetros de la página de ajuste) y en la Tabla 6 (parámetros del método MS):
TABLA 5
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TABLA 6
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El espectrómetro de masas se calibró en modo de resolución negativa para el análisis de fosfomicina. Se usó leucina encefalina como estándar y formiato de sodio como solución de calibración.
Preparaciones de muestra
Para la preparación de la muestra de API se disolvieron 44 ± 1 mg de fosfomicina API en un matraz aforado de 20 ml con 10 ml de fase móvil B, luego se añadieron 10 ml de fase móvil A y finalmente se añadió la cantidad suficiente de diluyente hasta 20 ml.
Para preparar la muestra de producto farmacéutico Fosfomicina (DP), se disolvieron 22,5 ± 0,5 mg de fosfomicina DP en un matraz aforado de 10 ml usando 5 ml de diluyente bajo sonicación y añadiendo diluyente adicional hasta 10 ml.
Resultados
Los cromatogramas CAD y TIC se realizaron con una muestra envejecida del producto farmacéutico Fosfomicina (DP) y una muestra de Fosfomicina API y se etiquetaron en sus tiempos de retención absolutos. Sobre la base de los tiempos de retención relativos y los perfiles cromatográficos, los picos observados en el cromatograma CAD coincidieron con los picos observados en MS TIC.
La identificación de cada pico se realizó basándose en los datos de la relación masa/carga (m/z) y en los fragmentos de disociación inducida por colisión (CID), de acuerdo con procedimientos conocidos en espectrometría de masas.
Un resumen de los picos observados y de las sustancias identificadas se enumera en la Tabla 7 para Fosfomicina DP y en la Tabla 8 para Fosfomicina API.
La primera columna (ID) es la identificación de la sustancia, RT es el tiempo de retención (min), RRT es el tiempo de retención relativo de cada pico en relación con la Fosfomicina, m/z es la relación masa/carga y la última columna muestra la estructura de cada sustancia identificada. En algunos casos (marcados con un asterisco “*” en las tablas) fue posible más de una estructura isomérica, con la misma masa y los mismos fragmentos:
TABLA 7
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TABLA 8
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Se consideró que la mayoría de las impurezas eran impurezas de proceso del proceso de síntesis.
Ejemplo 4: Análisis de estabilidad del producto farmacéutico fosfomicina inyectable usando el método analítico de la invención
Como parte de un estudio de estabilidad del producto farmacéutico fosfomicina inyectable, se realizó el análisis de impurezas de acuerdo con el método de la presente invención, usando el método HILIC-HPLC con detección CAD, como se describe, por ejemplo, en el Ejemplo 2.
La muestra sometida al estudio de estabilidad fue fosfomicina inyectable, es decir, viales que contenían una mezcla de polvo seco estéril de 7,92 g de fosfomicina disódica y 150 mg de ácido succínico.
Las muestras se conservaron a 25°C y 60% HR. El análisis de impurezas se realizó en los siguientes puntos en el tiempo: 0, 1, 3, 6, 9 y 12 meses. Los resultados del análisis de impurezas se muestran en la Tabla 9. Las impurezas se reportan en un porcentaje en peso > 0,05% (límite de detección del método). "Dtd." en la tabla significa "detectado", lo que significa que la impureza se detecta pero está por debajo del límite de detección (0,05% en peso). ND significa "no detectado".
TABLA 9
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Método para la detección y cuantificación de fosfomicina y sus impurezas y/o productos de degradación en muestras de fosfomicina o de una sal farmacéuticamente aceptable de la misma o en composiciones farmacéuticas que comprenden fosfomicina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, caracterizado porque comprende:
a) someter la muestra a cromatografía líquida de interacción hidrófila (HILIC) con elución en gradiente utilizando como fase móvil una mezcla de acetonitrilo (fase móvil A) y una solución acuosa de acetato de amonio (fase móvil B); y
b) detectar y cuantificar fosfomicina, impurezas y/o productos de degradación separados en el paso a) utilizando un detector de aerosol cargado (CAD).
2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque las muestras contienen fosfomicina en forma de sal disódica de fosfomicina.
3. Método según las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque se utiliza una fase estacionaria de tipo zwitteriónico.
4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la fase móvil B es una solución acuosa de acetato de amonio con una concentración comprendida entre 10 y 40 mM, preferiblemente con una concentración de aproximadamente 25 mM.
5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el tiempo de elución de la fase móvil está comprendido entre 45 y 60 minutos, y preferiblemente es de aproximadamente 50 minutos.
6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el caudal de la fase móvil está comprendido entre 0,7 y 1 ml/min, y preferiblemente es de aproximadamente 0,8 ml/min.
7. Método según las reivindicaciones 5 o 6, caracterizado porque la elución en gradiente es tal que la relación entre las fases móviles A: B cambia de aproximadamente 85:15 en el tiempo 0 a aproximadamente 40:60 a los 35 min aproximadamente y vuelve a cambiar a aproximadamente 85:15 al final del tiempo de elución.
8. Método según la reivindicación 7, caracterizado porque la relación 85:15 entre las fases móviles A:B se mantiene constante durante aproximadamente 3 a 8 minutos al inicio de la elución y/o durante aproximadamente 8 a 15 minutos al final de la elución. .
9. Método según las reivindicaciones 7 u 8, caracterizado porque una relación constante entre las fases móviles A:B de aproximadamente 40:60 se mantiene constante alrededor de 3 minutos aproximadamente desde los 35 minutos hasta los 38 minutos.
10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, caracterizado porque el gradiente expresado como la relación de las fases móviles A: B es: 85:15 (0 min), 85:15 (5,0 min), 40:60 (35,0 min), 40:60 (38,0 min), 85:15 (38,1 min) y 85:15 (50,0 min).
11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la identificación de las impurezas y/o productos de degradación de la fosfomicina se realiza mediante espectrometría de masas (MS).
12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque se refiere a la detección y cuantificación de fosfomicina y sus impurezas y/o productos de degradación en una muestra de fosfomicina o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo principio activo, preferiblemente en un muestra de principio activo fosfomicina disódica.
13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque se refiere a la detección y cuantificación de fosfomicina y sus impurezas y/o productos de degradación en una muestra de una composición farmacéutica que comprende fosfomicina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, preferiblemente fosfomicina disódica, como principio activo y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable; preferiblemente, la composición farmacéutica consiste esencialmente en fosfomicina disódica y ácido succínico como excipiente.
14. Proceso de fabricación de fosfomicina o de una sal farmacéuticamente aceptable de la misma con un grado de pureza especificado, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:
(i) proporcionar un lote de fosfomicina o de una sal farmacéuticamente aceptable de la misma; (ii) cuantificar las impurezas de fosfomicina y/o los productos de degradación en una muestra del lote del paso (i) usando el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11; y (iii) validar el lote solo si el porcentaje de impurezas en la muestra cumple el grado de pureza especificado.
15. Proceso de fabricación de una composición farmacéutica que comprende fosfomicina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable que tiene un grado de pureza especificado, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:
(i) proporcionar un lote de una composición farmacéutica que comprende fosfomicina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable;
(ii) cuantificar las impurezas de fosfomicina y/o los productos de degradación en una muestra del lote del paso (i) usando el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11; y
(iii) validar el lote solo si el porcentaje de impurezas cumple los requisitos de pureza requeridos.
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