ES2867749T3 - Conectores y su aplicación con respecto a los CAF - Google Patents

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ES2867749T3 ES15822852T ES15822852T ES2867749T3 ES 2867749 T3 ES2867749 T3 ES 2867749T3 ES 15822852 T ES15822852 T ES 15822852T ES 15822852 T ES15822852 T ES 15822852T ES 2867749 T3 ES2867749 T3 ES 2867749T3
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Jian Li
Yong Cang
Shuhui Chen
Gang Li
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Abstract

Un conector de fórmula (I) para conectar fármacos a los anticuerpos, **(Ver fórmula)** , en donde el resto de **(Ver fórmula)** es **(Ver fórmula)** L2 es una unidad dipeptídica seleccionada de **(Ver fórmula)** R8 se selecciona del grupo que consiste en metilo, propilo, isopropilo, sec-butilo, bencilo y **(Ver fórmula)** R9 se selecciona del grupo que consiste en (CH2)4NH2, (CH2)3NHCONH2, (CH2)3NHC(=NH)NH2, **(Ver fórmula)** s es 0, 1, 2, 3 o 4; L3 es una unidad autoinmolativa seleccionada del grupo que consiste en **(Ver fórmula)** R10 se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo(C1-3) opcionalmente sustituido con 1, 2 o 3 de los sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en halógeno, OH, NH2, NHMe y NMe2; cada R11 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H y alquilo(C1-3) opcionalmente sustituido con 1, 2 o 3 de los sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en halógeno, OH, NH2, NHMe y NMe2; dos R11 geminales pueden estar opcionalmente unidos para formar un anillo de 3 a 6 miembros con un átomo de carbono al que están unidos; dos R11 adyacentes pueden estar opcionalmente unidos para formar un anillo de 5 a 7 miembros con un átomo de carbono al que están unidos; R12 se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo(C1-3) opcionalmente sustituido con 1, 2 o 3 de los sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en halógeno, OH, NH2, NHMe y NMe2; y R13 se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo(C1-3) opcionalmente sustituido con 1, 2 o 3 de los sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en halógeno, OH, NH2, NHMe y NMe2.

Description

DESCRIPCIÓN
Conectores y su aplicación con respecto a los CAF
Campo de la invención
La presente invención se refiere a conectores, que contienen sustitutos de amida con una unidad dipeptídica nueva o regular escindible enzimáticamente en el lisosoma, para conectar fármacos citotóxicos a los anticuerpos. La presente invención también se refiere a los CAF (conjugados de anticuerpos y fármacos) derivados de estos conectores sustitutos de amida para el tratamiento de los cánceres.
Antecedentes de la invención
Los conjugados de anticuerpos y fármacos (CAF) son prometedores como tratamiento dirigido específico y eficaz para una serie de enfermedades, p. ej., infecciones bacterianas y cánceres, pero al mismo tiempo con un perfil mejorado de efectos secundarios sistémicos.
El concepto de combinar un anticuerpo específico deseado con un compuesto citotóxico es muy simple y elegante. Un anticuerpo se conoce bien por su capacidad para reconocer un antígeno de una manera específica, y la actividad citolítica a menudo insuficiente que sigue a una respuesta inmunitaria limita su potencial terapéutico. Por otro lado, los compuestos citotóxicos se usan ampliamente en el tratamiento de los cánceres y su eficacia se ve obstaculizada por acontecimientos adversos sistémicos inespecíficos asociados al uso de dosis más altas. Por lo tanto, la combinación de un anticuerpo con un compuesto citotóxico puede conducir a un agente terapéutico con una eficacia mejorada con respecto al anticuerpo y a la reducción de los efectos secundarios sistémicos del fármaco citotóxico, lo que se atribuye a la administración específica sobre la diana gracias al anticuerpo y minimiza la exposición al fármaco de los tejidos normales.
Una de las claves del éxito de los CAF se basa en la identificación de conectores idóneos que sean estables durante la circulación en el torrente circulatorio, pero que se escinden rápidamente para liberar el compuesto citotóxico en la diana para proporcionar la actividad citolítica. Un ejemplo exitoso demostrado es el conector, tal como el de Adcertris, que incorpora un componente peptídico escindible enzimáticamente en el lisosoma. El enlace amida del extremo carboxilo en esta parte del conector, que lo pueden escindir con facilidad en las células diana las enzimas lisosómicas, es esencial para el mecanismo de liberación del fármaco. Otros enlaces amida en el conector, si se rompen prematuramente, pueden producir efectos secundarios indeseables (fórmula B-1).
Figure imgf000002_0001
Las patentes de los EE. UU. US2008226657A1 y US2008311134A1 describen Ab-MC-vc-PAB-MMAE para su uso en el tratamiento del cáncer. La solicitud de patente internacional n.° WO2009141240A1 describe conjugados antitumorales de doble diana que contienen un resto de reconocimiento de una integrina avp3 y avp5 conectado a un fármaco citotóxico mediante nuevos puentes moleculares que contienen tres unidades.
Esta solicitud describe el reemplazo del enlace amida del extremo amino del péptido escindible enzimáticamente en el lisosoma con un sustituto de amida (fórmula B-2). Esta modificación puede mejorar aún más la estabilidad de los CAF resultantes en circulación.
Figure imgf000003_0001
Descripción de la invención
Las realizaciones de la presente invención se reflejan en las reivindicaciones independientes 1 a 3 y 11 a 13. Las realizaciones preferidas se reflejan en las reivindicaciones dependientes 4 a 10. La presente invención da a conocer un conector de fórmula (I) para conectar los fármacos a los anticuerpos,
Figure imgf000003_0002
en donde,
el resto de
Figure imgf000003_0003
es
Figure imgf000003_0004
L2 es una unidad dipeptídica seleccionada de
Figure imgf000003_0005
R8 se selecciona del grupo que consiste en metilo, propilo, isopropilo, sec-butilo, bencilo y
Figure imgf000003_0006
R9 se selecciona del grupo que consiste en (CH2)4NH2, (CH2)3NHCONH2, (CH2)3NHC(=NH)NH2,
Figure imgf000003_0007
s es 0, 1, 2, 3 o 4;
L3 es una unidad autoinmolativa seleccionada del grupo que consiste en
Figure imgf000004_0001
R10 se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo(Ci-3) opcionalmente sustituido con 1 ,2 o 3 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en halógeno, OH, NH2 , NHMe y NMe2 ;
cada R11 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H y alquilo(C1-3) opcionalmente sustituido con 1,2 o 3 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en halógeno, OH, NH2 , NHMe y NMe2 ;
dos R11 geminales pueden unirse opcionalmente para formar un anillo de 3-6 miembros con un átomo de carbono al que están unidos;
dos R11 adyacentes pueden unirse opcionalmente para formar un anillo de 5-7 miembros con un átomo de carbono al que están unidos;
R12 se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo(C1-3) opcionalmente sustituido con 1 ,2 o 3 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en halógeno, OH, NH2 , NHMe y NMe2 ; y
R13 se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo(C1-3) opcionalmente sustituido con 1 ,2 o 3 sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en halógeno, OH, NH2 , NHMe y NMe2.
La presente invención también da a conocer un conjugado de fármaco y conector de fórmula (II),
Figure imgf000004_0002
en donde,
el resto de
Figure imgf000004_0003
es
Figure imgf000004_0004
M es un fármaco; y
otras variables son las definidas más arriba.
La presente invención también da a conocer un conjugado de anticuerpo y fármaco (CAF) de fórmula (III),
Figure imgf000005_0001
Y es un anticuerpo;
a es un número entero o decimal seleccionado de 1 a 8;
M es un fármaco; y
otras variables son las definidas más arriba.
En determinadas formas de realización de esta invención, a es 1,2, 3, 3,4, 3,5, 4, 4,2, 5, 6, 7 u 8.
En determinadas formas de realización de esta invención, el anticuerpo mencionado anteriormente se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo monoclonal resuperficializado, un anticuerpo monoclonal monocatenario resuperficializado o un fragmento de anticuerpo monoclonal resuperficializado que se fija preferentemente a una célula diana.
En determinada realización de esta invención, el anticuerpo mencionado más arriba se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo monoclonal humanizado, un anticuerpo monoclonal monocatenario humanizado o un fragmento de anticuerpo monoclonal humanizado.
En determinada realización de esta invención, el anticuerpo mencionado más arriba se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo quimérico, un fragmento de anticuerpo quimérico, un anticuerpo de dominio o un fragmento de anticuerpo de dominio del mismo.
En determinada realización de esta invención, el anticuerpo mencionado más arriba se selecciona del grupo que consiste en MY9, anti-B4, EpCAM, CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD11, CD19, CD20, CD22, CD26, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD44, CD56, CD79, CD105, CD138, receptores de EphA, receptores de EphB, EGFR, EGFRvlll, HER2, HER3, mesotelina, cripto, integrina av03, av05, av06 o C242.
En determinada realización de esta invención, el anticuerpo mencionado más arriba se selecciona del grupo que consiste en My9-6, B4, C242, N901, DS6, receptor EphA2, CD38, IGF-IR, CNTO 95, B-B4, trastuzumab, tertuzumab, bevatuzumab, sibrotuzumab, rituximab y adalimumab.
En determinada realización de esta invención, el anticuerpo mencionado más arriba se selecciona del grupo que consiste en Herceptin y Erbitux.
En determinada realización de esta invención, el anticuerpo mencionado más arriba se fija a las células diana seleccionadas de células tumorales; células infectadas por virus, células infectadas por microorganismos, células infectadas por parásitos, células autoinmunitarias, células activadas, células mieloides, linfocitos T activados, linfocitos B o melanocitos; células que expresan uno o más de IGF-IR, CanAg, EGFR, MUCI, MUCI 6, VEGF, TF, MY9, anti-B4, EpCAM, CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD11, CD11a, CD18, CD19, CD20 , CD22, CD26, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD44, CD56, CD70, CD79, CD105, CD138, receptores de EphA, receptores de EphB, EGFRvlll, HER2/neu, HER3, mesotelina, cripto, integrina av03, integrina av05, integrina av06, Apo2 y antígenos de C242; o células que expresan el receptor del factor de crecimiento insulínico, el receptor del factor de crecimiento epidérmico y el receptor de folato.
En determinada realización de esta invención, las células tumorales mencionadas más arriba se seleccionan de células de cáncer de mama, células de cáncer de próstata, células de cáncer de ovario, células de cáncer colorrectal, células de cáncer de estómago, células de cáncer epidermoide, células de cáncer de pulmón microcítico y células de cáncer de testículo.
En determinada realización de esta invención, el fármaco mencionado más arriba es un fármaco citotóxico.
En determinada realización de esta invención, el fármaco mencionado más arriba se selecciona del grupo que consiste en maitansinoide, fármaco de fijación al ADN y su análogo, caliqueamicina, doxorrubicina y su análogo, alcaloide vinca, criptoficina, dolastatina, auristatina y análogo de los mismos, tubulisina, epotilona, taxoide y siRNA.
En determinada realización de esta invención, el fármaco de fijación al ADN mencionado más arriba es CC-1065. En determinada realización de esta invención, la M mencionada más arriba se selecciona del grupo que consiste en:
Figure imgf000006_0001
En determinada realización de esta invención, el fármaco mencionado más arriba es un reactante de diagnóstico o detección.
En determinada realización de esta invención, el fármaco mencionado más arriba es un compuesto radiomarcado. En determinada realización de esta invención, el fármaco mencionado más arriba está marcado con 3H, 18F, 11C, 13N, 15O, 201TI, 32P, 51Cr, 67Ga, 123I, 125I, 131I, 132I, 131Cs, 113Xe, 133Xe, 169Yb, 198Au, 203Hg, 99mTc, 113mIn, 133mIn, 75Se, 186Re, 153Sm y 89Sr.
En determinada realización de esta invención, la L2 mencionada más arriba se selecciona del grupo que consiste en:
Figure imgf000006_0003
En determinada realización de esta invención, la L2 mencionada más arriba se selecciona del grupo que consiste en:
Figure imgf000006_0002
y
Figure imgf000007_0001
En determinada realización de esta invención, el anillo mencionado más arriba formado por dos R11 gemínales o dos R11 adyacentes es ciclohexilo.
En determinada realización de esta invención, la L3 mencionada más arriba se selecciona del grupo que consiste en:
Figure imgf000007_0002
En determinada realización de esta invención, el conector mencionado más arriba se selecciona del grupo que consiste en:
Figure imgf000008_0001
En determinada realización de esta invención, el conjugado mencionado más arriba se selecciona del grupo que consiste en:
Figure imgf000009_0001
En determinada realización de esta invención, el CAF mencionado más arriba se selecciona del grupo que consiste en:
Ċ
Figure imgf000010_0001
y
Figure imgf000011_0001
Y es un anticuerpo, a es un número entero o decimal seleccionado de 1 a 8, opcionalmente a es 1,2, 3, 3,4, 3,5, 4, 4,2, 5, 6, 7 u 8.
En determinada realización de esta invención, el CAF mencionado más arriba se selecciona del grupo que consiste en:
Figure imgf000012_0001
a es un número entero o decimal seleccionado de 2 a 6, opcionalmente a es 2, 3, 3,4, 3,5, 4, 4,2, 5 o 6.
La presente invención también da a conocer un compuesto intermedio para la síntesis del conjugado de fármaco y conector de fórmula (II) o el CAF de fórmula (III), que tiene una estructura de:
Figure imgf000012_0002
La presente invención también da a conocer una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz del CAF mencionado más arriba y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
La presente invención también da a conocer el CAF antes mencionado o la composición antes mencionada para ser usada en el tratamiento de los cánceres.
Definiciones y explicaciones
Ci-6 se selecciona del grupo que consiste en C i, C2 , C3 , C4 , C5 , y C6, en donde el número denota el número de átomos de carbono; C3-6 se selecciona del grupo que consiste en C3 , C4 , C5 y C6.
Alquilo(Ci-6), heteroalquilo(Ci-6), ciclohidrocarbilo(C3-6), heterociclohidrocarbilo(C3-6), alquilo(Ci-6) sustituido por ciclohidrocarbilo(C3-6) o heterociclohidrocarbilo(C3-6) y heteroalquilo(C1-6) sustituido por ciclohidrocarbilo(C3-6) o heterociclohidrocarbilo(C3-6) incluyen, pero no se limitan a: metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, -CH2C(CH3)(CH3)(OH), ciclopropilo, ciclobutilo, propilmetileno, cicropropilacilo, benciloxilo, ciclopropilalquileno, trifluorometilo, aminometilo, i2
hidroximetilo, metiloxilo, metilacilo, metiloxilcarbonilo, metilsulfonilo, metilsulfinilo, etiloxilo, etilacilo, etiisulfonilo, etiloxilcarbonilo, dimetilamino, dietilamino, dimetilaminocarbonilo, y dietilaminocarbonilo;
N(CH3)2, NH(CH3), -CH2CF3 , -CH2 CH2CF3 , -CH2CH2F, -CH2CH2S(=O)2CH3, -CH2CH2CN,
Figure imgf000013_0001
-CH2CH(OH)(CH3)2, -CH2CH(F)(CH3)2, -CH2CH2F, -CH2CF3 , -CH2CH2CF3 , -CH2CH2NH2 , -CH2CH2OH, -CH2CH2OCH3 , -CH2CH2CH2OCH3 , -CH2CH2N(CH3)2, -S(=O)2CH3, -CH2CH2S(=O)2CH3, , , ,
Figure imgf000013_0002
El término "sustituido", tal y como se usa en la presente memoria, significa que uno o más hidrógenos en el átomo designado está reemplazado con una selección del grupo indicado, incluido el átomo de deuterio "D", una variante del hidrógeno, siempre y cuando no se exceda la valencia normal del átomo designado, y que la sustitución dé como resultado un compuesto estable. Cuando un sustituyente es ceto (es decir, =O), entonces se reemplazan 2 hidrógenos del átomo. Los sustituyentes de tipo ceto no están presentes en los restos aromáticos. El término "opcionalmente sustituido", tal y como se usa en la presente memoria, significa que el átomo designado puede estar sustituido o no sustituido por los sustituyentes y, a menos que se indique lo contrario, la especie y el número de sustituyentes no se definen siempre y cuando puedan conseguirse en la química.
Cuando cualquier variable (por ejemplo, R) aparece más de una vez en cualquier constituyente o fórmula de un compuesto, su definición en cada aparición es independiente de su definición en cualquier otra aparición. Así, por ejemplo, si se muestra que un grupo está sustituido con 0-2 R, entonces dicho grupo puede estar opcionalmente sustituido con hasta dos grupos R, y R en cada aparición se selecciona independientemente a partir de la definición de R. Además, las combinaciones de los sustituyentes y/o variables son permisibles solo si tales combinaciones dan como resultado compuestos estables.
Cuando se muestra que un enlace con un sustituyente cruza un enlace que conecta dos átomos en un anillo, entonces tal sustituyente puede estar unido a cualquier átomo del anillo. Cuando se enumera un sustituyente sin indicar el átomo a través del cual dicho sustituyente está unido al resto del compuesto de una fórmula dada, entonces dicho sustituyente puede estar unido a través de cualquier átomo de dicho sustituyente. Las combinaciones de sustituyentes y/o variables son permisibles solo si tales combinaciones dan como resultado compuestos estables.
Los sustituyentes de los radicales alquilo y heteroalquilo (incluidos los grupos a menudo denominados alquileno, alquenilo, heteroalquileno, heteroalquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquenilo y heterocicloalquenilo) se denominan genéricamente "sustituyentes de grupo alquilo", y pueden ser uno o más de una serie de grupos seleccionados de, pero sin limitación: -R', -OR', =O, =NR', =N-Or', -NR'R",
-SR', -halógeno, -SiR'R"R"', OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R",
-OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', NR'C(O)NR"R"', -NR"C(O)2R',
-NR""'-C(NR'R"R"')=NR"", NR""C(NR'R")=NR'", -S(O)R', -S(O)2R',
-S(O)2NR'R", NR"SO2 R', -CN, -NO2 , -N3 , -CH(Ph)2 , fluoroalcoxi(Ci-C4) y fluoroalquilo(Ci-C4), en un número que varía de cero a (2m' 1), en donde m' es el número total de átomos de carbono de dicho radical. R', R", R"', R"" y R...cada uno preferiblemente se refiere independientemente a hidrógeno, heteroalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido 0 no sustituido, por ejemplo, arilo sustituido con 1 a 3 halógenos, alquilo sustituido o no sustituido, grupos alcoxi o tioalcoxi, o grupos arilalquilo. Cuando un compuesto de la invención incluye más de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R se selecciona independientemente como lo son cada grupo R', R", R"', R"" y R...cuando más de uno de estos grupos está presente. Cuando R' y R" están unidos al mismo átomo de nitrógeno, pueden combinarse con el átomo de nitrógeno para formar un anillo de 5, 6 o 7 miembros. Por ejemplo, -NR'R" incluye, pero sin limitación, 1 -pirrolidinilo y 4-morfolinilo. A partir de la explicación de más arriba de los sustituyentes, el experto en la técnica entenderá que el término "alquilo" pretende incluir grupos que incluyen átomos de carbono unidos a grupos distintos de los grupos de hidrógeno, tales como haloalquilo (p. ej., -CF3 y -CH2CF3) y acilo (por ejemplo, -C(O)CH3 , -C(O)CF3 , -C(O)CH2OCH3, y similares).
De manera similar a los sustituyentes descritos para el radical alquilo, los sustituyentes de los grupos arilo y heteroarilo se denominan genéricamente "sustituyentes del grupo arilo". Los sustituyentes se seleccionan de, por ejemplo: -R', -OR', -NR'R", -SR', -halógeno, -SiR'R"R"', OC(O)R', -C(O)R', -CO2 R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', NR'C(O)NR"R"', -NR"C(O)2R', -NR""' -C(NR'R"R'")=NR"", NR"" C(NR'R")=NR'", -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", NR"SO2 R', -CN, -NO2 , -N3 , -CH(Ph)2 , fluoroalcoxi(C1-C4) y fluoroalquilo(C1-C4), en un número que varía desde cero hasta el número total de valencias abiertas en el sistema de anillo aromático; y donde R', R", R"', R"" y R.. se seleccionan preferiblemente de manera independiente de hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, heteroalquilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido y heteroarilo sustituido o no sustituido. Cuando un compuesto de la invención incluye más de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R se selecciona independientemente como lo son cada grupo R', R", R"', R"" y R""' cuando más de uno de estos grupos está presente.
Dos de los sustituyentes en átomos adyacentes del anillo arilo o heteroarilo pueden opcionalmente estar sustituido con un sustituyente de la fórmula -TC(O)-(CRR')q-U-, en donde T y U son independientemente -NR-, -O-, -CRR'- o un enlace sencillo, y q es un número entero de 0 a 3. Como alternativa, dos de los sustituyentes en átomos adyacentes del anillo arilo o heteroarilo pueden opcionalmente estar sustituidos con un sustituyente de fórmula -A (CH2)r B-, en donde A y B son independientemente -CRR'-, -O-, -NR-, -S-, -S(O)-, S(O)2-, -S(O)2NR'- o un enlace sencillo, y r es un número entero de 1 a 4. Uno de los enlaces sencillos del nuevo anillo así formado puede estar sustituido opcionalmente por un enlace doble. Como alternativa, dos de los sustituyentes en átomos adyacentes del anillo arilo o heteroarilo pueden estar sustituidos opcionalmente con un sustituyente de la fórmula -(CRR')s-X-(CR"R'")d-, en donde s y d son independientemente números enteros de 0 a 3, y X es -O-, -NR'-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, o -S(O)2NR'-. Los sustituyentes R, R', R" y R'" se seleccionan preferiblemente de manera independiente entre hidrógeno o alquilo(C1-C6) sustituido o no sustituido.
Los términos "halo" o "halógeno", por sí solos o como parte de otro sustituyente, significan, a menos que se indique lo contrario, un átomo de flúor, cloro, bromo o yodo. Además, se pretende que términos como "haloalquilo" incluyan monohaloalquilo y polihaloalquilo. Por ejemplo, el término "haloalquilo(C1-C4)" incluye, pero no se limita a ellos, trifluorometilo, 2,2,2-trifluoroetilo, 4-clorobutilo, 3-bromopropilo y similares.
Los ejemplos de haloalquilo incluyen, pero no se limitan a ellos, trifluorometilo, triclorometilo, pentafluoroetilo y pentacloroetilo. "Alcoxi" representa un grupo alquilo tal y como se definió más arriba con el número indicado de átomos de carbono unidos a través de un puente de oxígeno. Alcoxi(C1-6) pretende incluir grupos alcoxi C1, C2, C3, C4, C5 y C6. Los ejemplos de alcoxi incluyen, pero no se limitan a ellos, metoxi, etoxi, n-propoxi, i-propoxi, n-butoxi, s-butoxi, tbutoxi, n-pentoxi y s-pentoxi. "Cicloalquilo" pretende incluir grupos de anillo saturados, tales como ciclopropilo, ciclobutilo o ciclopentilo. Se pretende que el cicloalquilo(C3-7) incluya grupos cicloalquilo C3, C4, C5, C6 y C7. "Alquenilo” pretende incluir cadenas de hidrocarburos de configuración lineal o ramificada y uno o más enlaces carbono-carbono insaturados que pueden aparecer en cualquier punto estable a lo largo de la cadena, tal como etenilo y propenilo.
"Halo" o "halógeno", tal y como se usa en la presente memoria, se refieren a flúor, cloro, bromo y yodo.
Tal y como se usa en la presente memoria, el término "hetero", significa, a menos que se indique lo contrario, "heteroátomo" o "heteroradical" (es decir, un radical que contiene heteroátomos), que incluye átomos distintos de carbono (C) e hidrógeno (H), que incluye también los radicales que contienen estos heteroátomos antes mencionados. Los ejemplos incluyen oxígeno (O), nitrógeno (N) azufre (S), silicio (Si), germanio (Ge), aluminio (Al) y boro (B), también incluyen opcionalmente -C(=O)N(H)-, -N(H)-, -C(=NH)-, -S(=O)2N(H)-, o -S(=O)N(H)- sustituidos.
"Anillo", tal y como se usa en la presente memoria, significa un cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquenilo, heterocicloalquenilo, cicloalquinilo, heterocicloalquinilo, arilo o heteroarilo sustituidos o no sustituidos. Un anillo incluye restos de anillo mono, bi, espiro, condensados y con puente. El número de átomos en un anillo se define típicamente por el número de miembros en el anillo. Por ejemplo, un "anillo de 5 a 7 miembros" significa que hay de 5 a 7 átomos en la disposición cíclica. A menos que se especifique lo contrario, el anillo incluye opcionalmente de uno a tres heteroátomos. Por tanto, el término "anillo de 5 a 7 miembros" incluye, por ejemplo, fenilo, piridinilo y piperidinilo. El término "anillo heterocicloalquilo de 5 a 7 miembros", por otro lado, incluiría piridinilo y piperidinilo, pero no fenilo. El término "anillo" incluye además un sistema de anillos que comprende más de un "anillo", en donde cada "anillo" se define independientemente como más arriba.
Tal y como se usa en la presente memoria, el término "heterociclo" o "grupo heterocíclico" pretende significar un anillo estable monocíclico, bicíclico o tricíclico que contiene un heteroátomo o un heteroradical, que es saturado, parcialmente insaturado o insaturado (aromático), y que consiste en átomos de carbono y 1,2, 3 o 4 heteroátomos de anillo seleccionados independientemente del grupo que consiste en N, O y S y que incluye cualquier grupo bicíclico en donde cualquiera de los anillos heterocíclicos definidos más arriba está condensado con un anillo de benceno. Los heteroátomos de nitrógeno y azufre se pueden oxidar opcionalmente (es decir, NO y S (O) p). El átomo de nitrógeno puede estar sustituido o no sustituido (es decir, N o NR en donde R es H u otro sustituyente, si se define). El anillo heterocíclico puede estar unido a su grupo colgante en cualquier heteroátomo o átomo de carbono que dé como resultado una estructura estable. Los anillos heterocíclicos descritos en la presente memoria pueden estar sustituidos en un átomo de carbono o de nitrógeno si el compuesto resultante es estable. Un nitrógeno del heterociclo puede ser opcionalmente cuaternario. Se prefiere que cuando el número total de átomos de S y O en el heterociclo excede a 1, entonces estos heteroátomos no sean adyacentes entre sí. Se prefiere que el número total de átomos de S y O en el heterociclo no sea de más de 1. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "grupo heterocíclico aromático" o "heteroarilo" significa un anillo estable monocíclico de 5, 6 o 7 miembros o bicíclico, o un anillo estable aromático heterocíclico bicíclico de 7, 8, 9 o 10 miembros que consiste en átomos de carbono y 1, 2, 3 o 4 heteroátomos seleccionados independientemente del grupo que consiste en N, O y S. El átomo de nitrógeno puede estar sustituido o no sustituido (es decir, N o NR, en donde R es H u otro sustituyente, si se define). Los heteroátomos de nitrógeno y de azufre pueden estar opcionalmente oxidados (es decir, NO y S (O) p). Cabe señalar que el número total de átomos de S y O en el heterociclo aromático no es de más de 1. Los anillos con puente también están incluidos en la definición de heterociclo. Un anillo con puente se produce cuando uno o más átomos (es decir, C, O, N o S) enlazan dos átomos de carbono o nitrógeno no adyacentes. Los puentes preferidos incluyen, pero no se limitan a ellos, un átomo de carbono, dos átomos de carbono, un átomo de nitrógeno, dos átomos de nitrógeno y un grupo carbono-nitrógeno. Cabe señalar que un puente siempre convierte un anillo monocíclico en un anillo tricíclico. Cuando un anillo tiene un puente, los sustituyentes enumerados para el anillo también pueden estar presentes en el puente.
Los ejemplos de heterociclos incluyen, pero no se limitan a, acridinilo, azocinilo, bencimidazolilo, benzofuranilo, benzotiofuranilo, benzotiofenilo, benzoxazolilo, benzoxazolinilo, benzotiazolilo, benzotriazolilo, benzotetrazolilo, benciloxazolilo, benzoisotiazolilo, bencimidazolinilo, carbazolilo, 4aH-carbazolilo, carbolinilo, cromanilo, cromenilo, cinolinilo, decahidroquinolinilo, 2H, 6H-1, 5,2-ditiazinilo, dihidrofuro[2,3-b]tetrahidrofurano, furanilo, furazanilo, imidazolidinilo, imidazolinilo, imidazolilo, 1 H-indazolilo, indolenilo, indolinilo, indolizinilo, indolilo, 3H-indolilo, isatinoilo, isobenzofuranilo, isocromanilo, isoindazolilo, isoindolinilo, isoindolilo, isoquinolinilo, isotiazolilo, isoxazolilo, metilendioxifenilo, morfolinilo, naftiridinilo, octahidroisoquinolinilo, oxadiazolilo, 1,2,3-oxadiazolilo, 1,2,4-oxadiazolilo, 1,2,5-oxadiazolilo, 1,3,4-oxadiazolilo, oxazolidinilo, oxazolilo, oxindolilo, pirimidinilo, fenantridinilo, fenantrolinilo, fenazinilo, fenotiazinilo, fenoxatinilo, fenoxazinilo, ftalazinilo, piperazinilo, piperidinilo, piperidonilo, 4-piperidonilo, piperonilo, pteridinilo, purinilo, piranilo, pirazinilo, pirazolidinilo, pirazolinilo, pirazolilo, piridazinilo, piridooxazol, piridoimidazol, piridotiazol, piridinilo, piridilo, pirimidinilo, pirrolidinilo, pirrolinilo, 2H-pirrolilo, pirrolilo, quinazolinilo, quinolinilo, 4H-quinolizinilo, quinoxalinilo, quinuclidinilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidroisoquinolinilo, tetrahidroquinolinilo, tetrazolilo, 6H-1,2,5-tiadiazinilo, 1,2,3-tiadiazolilo, 1,2,4-tiadiazolilo, 1,2,5-tiadiazolilo, 1,3,4-tiadiazolilo, tiantrenilo, tiazolilo, tienilo, tienotiazolilo, tienooxazolilo, tienoimidazolilo, tiofenilo, triazinilo, 1,2,3-triazolilo, 1,2,4-triazolilo, 1,2,5-triazolilo, 1,3,4-triazolilo y xantenilo. También se incluyen compuestos espiro y de anillo condensado que contienen, por ejemplo, los heterociclos de más arriba.
El término "hidrocarbilo" o su concepto inferior (tal como alquilo, alquenilo, alquinilo y fenilo, etc.) por sí solo o como parte de otro sustituyente, significa, a menos que se indique lo contrario, un radical de hidrocarburo de cadena lineal o ramificada, o cíclico, o una combinación de los mismos, que puede estar completamente saturado, mono- o poliinsaturado, y puede incluir radicales di- y multivalentes, que tienen el número de átomos de carbono designado (es decir, C1-C10 significa de uno a diez carbonos). "Hidrocarbilo" incluye, pero no se limita a ellos, hidrocarbilo alifático e hidrocarbilo aromático, y el hidrocarbilo alifático incluye los lineales y los cíclicos, que incluyen específicamente, pero no se limitan a ellos, alquilo, alquenilo y alquinilo, y el hidrocarbilo aromático incluye, pero no se limita a ellos, hidrocarbilo aromático de 6 a 12 miembros, por ejemplo, benceno y naftaleno. En algunas realizaciones, el término "alquilo" significa una cadena lineal o ramificada, o combinaciones de las mismas, que pueden estar completamente saturadas, monoinsaturadas o poliinsaturadas, y pueden incluir radicales di- y multivalentes. Los ejemplos de radicales de hidrocarburo saturado incluyen, pero no se limitan a ellos, grupos tales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, nbutilo, t-butilo, isobutilo, sec-butilo, ciclohexilo, (ciclohexil)metilo, ciclopropilmetilo, homólogos e isómeros de, por ejemplo, n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo y similares. Un grupo alquilo insaturado es uno que tiene uno o más dobles enlaces o triples enlaces. Los ejemplos de grupos alquilo insaturados incluyen, pero no se limitan a ellos, vinilo, 2-propenilo, crotilo, 2-isopentenilo, 2-(butadienilo), 2,4-pentadienilo, 3-(1,4-pentadienilo), etinilo, 1- y 3-propinilo, 3-butinilo y los homólogos e isómeros superiores.
El término "heterohidrocarbilo" o su concepto inferior (tal como heteroalquilo, heteroalquenilo, heteroalquinilo y heteroarilo, etc.) por sí solo o en combinación con otro término, significa, a menos que se indique lo contrario, un radical hidrocarburo estable de cadena lineal o ramificada, o cíclico, o combinaciones de los mismos, que consisten en el número indicado de átomos de carbono y al menos un heteroátomo. En algunas realizaciones, el término "heteroalquilo", por sí solo o en combinación con otro término, significa una cadena lineal o ramificada estable, o combinaciones de las mismas, que consisten en el número indicado de átomos de carbono y al menos un heteroátomo. En una realización ejemplar, los heteroátomos pueden seleccionarse del grupo que consiste en B, O, N y S, y en donde los átomos de nitrógeno y de azufre pueden estar opcionalmente oxidados y el heteroátomo de nitrógeno puede opcionalmente ser cuaternario. El heteroátomo o heteroátomos B, O, N y S pueden colocarse en cualquier posición interior del grupo de heterohidrocarbilo (que incluye la posición en donde el grupo hidrocarbilo está unido al resto de la molécula). Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a ellos, -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2, -S(O)-CH3, -CH2-CH2-S(O)2-CH3, -CH=CH-O-CH3, -CH2-CH=N-OCH3 y -CH=CH-N(CH3)-CH3. Hasta dos heteroátomos pueden ser consecutivos, tal como, por ejemplo, -CH2-NH-OCH3.
Los términos "alcoxi", "alquilamino" y "alquiltío" (o tioalcoxi) se utilizan en su sentido convencional y se refieren a los grupos alquilo unidos al resto de la molécula mediante un átomo de oxígeno, un grupo amino o un átomo de azufre, respectivamente.
Los términos "ciclohidrocarbilo", "heterociclohidrocarbilo" o sus conceptos inferiores (tales como arilo, heteroarilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquenilo, heterocicloalquenilo, cicloalquinilo y heterocicloalquinilo, etc.) por sí solos o en combinación con otros términos, representan, a menos que se indique lo contrario, versiones cíclicas de "hidrocarbilo" o "heterohidrocarbilo", respectivamente. Además, para el heterohidrocarbilo o el heterociclohidrocarbilo (tal como heteroalquilo y heterocicloalquilo), un heteroátomo puede ocupar la posición en donde el heterociclo está unido al resto de la molécula. Los ejemplos de cicloalquilo incluyen, pero no se limitan a ellos, ciclopentilo, ciclohexilo, 1-ciclohexenilo, 3-ciclohexenilo, cicloheptilo y similares. Los ejemplos no limitantes de restos de heterocicloalquilo incluyen 1 -(1,2,5,6-tetrahidropiridilo), 1 -piperidinilo, 2-piperidinilo, 3-piperidinilo, 4-morfolinilo, 3-morfolinilo, tetrahidrofurán-2-ilo, tetrahidrofurán-3-ilo, tetrahidrotién-2-ilo, tetrahidrotién-3-ilo, 1 -piperazinilo, 2-piperazinilo.
El término "arilo" significa, a menos que se indique lo contrario, un sustituyente aromático poliinsaturado que puede ser un solo anillo o múltiples anillos (preferiblemente de 1 a 3 anillos), que están condensados entre sí o unidos covalentemente. El término "heteroarilo" se refiere a grupos (o anillos) de arilo que contienen de uno a cuatro heteroátomos. En una realización ejemplar, el heteroátomo se selecciona de B, N, O y S, en donde los átomos de nitrógeno y de azufre están opcionalmente oxidados, y el átomo o átomos de nitrógeno son opcionalmente cuaternarios. Se puede unir un grupo heteroarilo al resto de la molécula a través de un heteroátomo. Los ejemplos no limitantes de grupos arilo y heteroarilo incluyen fenilo, 1 -naftilo, 2-naftilo, 4-bifenilo, 1 -pirrolilo, 2-pirrolilo, 3-pirrolilo, 3-pirazolilo, 2-imidazolilo, 4-imidazolilo, pirazinilo, 2-oxazolilo, 4-oxazolilo, 2-fenil-4-oxazolilo, 5-oxazolilo, 3-isoxazolilo, 4-isoxazolilo, 5-isoxazolilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolilo, 5-tiazolilo, 2-furilo, 3-furilo, 2-tienilo, 3-tienilo, 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 2-pirimidilo, 4-pirimidilo, 5-benzotiazolilo, purinilo, 2-bencimidazolilo, 5-indolilo, 1 -isoquinolilo, 5- isoquinolilo, 2-quinoxalinilo, 5-quinoxalinilo, 3-quinolilo y 6-quinolilo. Los sustituyentes para cada uno de los sistemas de anillos de arilo y heteroarilo indicados más arriba se seleccionan del grupo de sustituyentes aceptables que se describen a continuación.
Por brevedad, el término "arilo" cuando se usa en combinación con otros términos (por ejemplo, ariloxi, ariltío, arilalquilo) incluye anillos tanto de arilo como de heteroarilo, tal y como se definieron más arriba. Por tanto, el término "arilalquilo" pretende incluir los radicales en los que un grupo arilo está unido a un grupo alquilo (por ejemplo, bencilo, fenetilo, piridilmetilo y similares), que incluye los grupos alquilo en los que un átomo de carbono (por ejemplo, un grupo metileno) ha sido reemplazado, por ejemplo, por un átomo de oxígeno (por ejemplo, fenoximetilo, 2-piridiloximetilo, 3-(1-naftiloxi)propilo y similares).
El término "grupo saliente" significa un grupo funcional o átomo que puede ser desplazado por otro grupo funcional o átomo en una reacción de sustitución, tal como una reacción de sustitución nucleófila. A modo de ejemplo, los grupos salientes representativos incluyen grupos triflato, cloro, bromo y yodo; grupos de éster sulfónico, tales como mesilato, tosilato, brosilato, nosilato y similares; y grupos aciloxi, tales como acetoxi, trifluoroacetoxi y similares.
El término "grupo protector" incluye, pero no se limita a ellos, "grupo protector de amino", "grupo protector de hidroxi" y "grupo protector de tiol". El término "grupo protector de amino" significa un grupo protector idóneo para impedir las reacciones no deseadas en un nitrógeno de tipo amino. Los grupos protectores de amino representativos incluyen, pero no se limitan a ellos, formilo; grupos acilo, por ejemplo, grupos alcanoílo, tales como acetilo, tricloroacetilo o trifluoroacetilo; grupos alcoxicarbonilo, tales como ferí-butoxicarbonilo (Boc); grupos arilmetoxicarbonilo, tales como benciloxicarbonilo (Cbz) y 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc); grupos arilmetilo, tales como bencilo (Bn), tritilo (Tr) y 1,1-di-(4'-metoxifenil)metilo; grupos sililo, tales como trimetilsililo (TMS) y ferí-butildimetilsililo (TBS); y similares. El término "grupo protector de hidroxi" significa un grupo protector idóneo para impedir las reacciones no deseadas en un grupo hidroxi. Los grupos protectores de hidroxi representativos incluyen, pero no se limitan a ellos, grupos alquilo, tales como metilo, etilo y ferí-butilo; grupos acilo, por ejemplo, grupos alcanoílo, tales como acetilo; grupos arilmetilo, tales como bencilo (Bn), p-metoxibencilo (PMB), 9-fluorenilmetilo (Fm) y difenilmetilo (benzhidrilo, DPM); grupos sililo, tales como trimetilsililo (TMS) y ferf-butildimetilsililo (TBS); y similares.
Cuando el "anticuerpo" es un agente de fijación a las células, se fija a un antígeno que es un polipéptido y puede ser una molécula transmembranaria (por ejemplo, un receptor) o un ligando tal como un factor de crecimiento.
Los antígenos ejemplares incluyen moléculas tales como renina; una hormona de crecimiento, que incluye la hormona de crecimiento humana y la hormona de crecimiento bovina; factor de liberación de la hormona de crecimiento; hormona paratiroidea; hormona estimulante de la tiroides; lipoproteínas; a-1-antitripsina; cadena A de la insulina; cadena B de la insulina; proinsulina; hormona foliculoestimulante; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; factores de coagulación, tales como factor vmc, factor IX, factor tisular (TF) y factor von Willebrand; factores anticoagulantes, como la proteína C; factor natriurético auricular; tensioactivo pulmonar; un activador de plasminógeno, tal como urocinasa u orina humana o activador de plasminógeno de tipo tisular (t-PA); bombesina; trombina; factor de crecimiento hematopoyético; factores a y p de la necrosis tumoral; encefalinasa; RANTES (citocina expresada y secretada por el linfocito T normal en función de su grado de activación); proteína inflamatoria de macrófagos humanos (MIP-1-a); una albúmina de suero, tal como la seroalbúmina humana; sustancia inhibidora de Mueller; cadena A de la relaxina; cadena B de la relaxina; prorrelaxina; péptido asociado a la gonadotropina de ratón; una proteína microbiana, tal como la p-lactamasa; ADNasa; IgE; un antígeno asociado a los linfocitos T citotóxicos (CTLA), tal como CTLA-4; inhibina; activina; factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF); receptores de hormonas o factores de crecimiento; proteína A o D; factores reumatoides; un factor neurotrófico tal como el factor neurotrófico derivado del hueso (BDNF), neurotrofina-3, -4, -5 o -6 (NT-3, NT-4, NT-5 o NT-6), o un factor de crecimiento nervioso tal como NGF-p; factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF); factor de crecimiento de los fibroblastos tales como aFGF y bFGF; factor de crecimiento epidérmico (EGF); factor de crecimiento transformante (TGF) tal como TGF-a y TGF-p, entre ellos TGF-p, TGF-p2, TGF-p3, TGF-p4 o TGF-p5; factor de crecimiento similar a la insulina I y II (IGF-I e IGF-II); des(I-3)-IGF-I (IGF-I cerebral), proteínas de unión al factor de crecimiento similar a la insulina, EpCAM, GD3, FLT3, PSMA, PSCA, MUCI, MUC16, STeAP, CEA, TENB2, receptores de EphA, receptores de EphB, receptor de folato, FOLRI, mesotelina, cripto, avpe, integrinas, VEGF, VeGFR, receptor de transferrina, IRTAI, IRTA2, IRTA3, IRTA4, IRTA5; proteínas CD tales como CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD8, CD11, CD14, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD26, CD28, CD30, CD33, CD36, CD37, CD38, CD40, CD44, CD52, CD55, CD56, CD59, CD70, CD79, CD80, CD81, CDI 03, CDI 05, CDI 34, cDi 37, CDI 38, CdI 52; eritropoyetina; factores osteoinductivos; inmunotoxinas; una proteína morfogénica del hueso (BMP); un interferón, tal como el interferón a, p y y; factores estimulantes de colonias (CSF), por ejemplo, M-CSF, GM-CSF y G-CSF; interleucinas (IL), por ejemplo, IL-1 a IL-10; superóxido dismutasa; receptores de los linfocitos T; proteínas superficiales de la membrana; factor de aceleración de la descomposición; antígeno viral tal como, por ejemplo, una parte de la envoltura del VIH; proteínas de transporte; receptores de migración dirigida; adresinas; proteínas reguladoras; integrinas, tales como CDI la, CDI lb, CDI lc, CDI 8, un ICAM, VLA-4 y VCAM; un antígeno asociado a un tumor, tal como el receptor HER2, HER3 o HER4; y fragmentos de cualquiera de los polipéptidos enumerados más arriba, el anticuerpo que imita a las adnectinas (solicitud de patente de los EE. UU. US 20070082365), o un anticuerpo que se fija a uno o más antígenos asociados a los tumores o receptores de la superficie celular descritos en las publicaciones de patente de los EE. UU. n.os US 20080171040 o US 20080305044.
Los antígenos concretos para los anticuerpos abarcados por la presente invención incluyen las proteínas CD tales como CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD8, CD11, CD14, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD26, CD27, CD28, CD30 , CD33, CD36, CD37, CD38, CD40, CD44, CD52, CD55, CD56, CD70, CD79, CD80, CD81, CD103, CD105, CD134, CD137, CD138 y CD152; miembros de la familia de receptores ErbB, tales como el receptor de EGF, el receptor HER2, HER3 o HER4; moléculas de adhesión celular, tales como lFa-I, Macl, p150.95, VLA-4, ICaM-I, VCAM, EpCAM, integrina a4/p7 e integrina a5/p3, incluidas las subunidades a o p de las mismas (por ejemplo, anticuerpos anti-CD11a, anti-CD18 o anti-CD11b); factores de crecimiento, tales como VEGF; factor tisular (TF); TGF-p; interferón a (IFN-a); una interleucina, tal como IL-8; IgE; antígenos del grupo sanguíneo Apo2, receptor de muerte; receptor flk2/flt3; receptor de la obesidad (OB); receptor de mpl; CTLA-4; proteína C, etc.
Las dianas más concretas en la presente memoria son IGF-IR, CanAg, EphA2, MUC1, MUC16, VEGF, TF, CD19, CD20, CD22, CD27, CD33, CD37, CD38, CD40, CD44, CD56, CD138, CA6, Her2/neu, EpCAM, CRIPTO (una proteína producida en niveles elevados en la mayoría de las células del cáncer de mama humano), darpinas, integrina av/p3, integrina av/p5, integrina av/p6, TGF-p, CD11 a, CD18, Apo2 y C242 o un anticuerpo que se fija a uno o más antígenos asociados a tumores o receptores de la superficie celular descritos en la publicación de los EE. UU. n.° US 20080171040 o en la publicación de patente de los EE. UU. n.° US 20080305044.
Los antígenos concretos para los anticuerpos abarcados por la presente invención también incluyen las proteínas CD tales como CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD27, CD34, CD37, CD38, CD46, CD56, CD70 y CD138; miembros de la familia de los receptores ErbB tales como el receptor de EGF, el receptor HER2, HER3 o HER4; moléculas de adhesión celular tales como LFA-I, Macl, pl50.95, VLA-4, ICAM-I, VcAm, EpCAM, integrina a4/p7 e integrina av/p3, incluidas las subunidades tanto a como p de las mismas (por ejemplo, anti-CD11 a , anticuerpos anti-CD18 o anti-CD11 b); factores de crecimiento tal como VEGF; factor tisular (TF); TGF-p; interferón a (IFN-a); una interleucina, tal como IL-8; IgE; antígenos del grupo sanguíneo Apo2, receptor de muerte; receptor flk2/flt3; receptor de la obesidad (OB); receptor de mpl; CTLA-4; proteína C, etc. Las dianas más concretas en la presente memoria son IGF-IR, CanAg, EGF-R, EGF-RvlII, EphA2, MUCI, MUC16, VEGF, TF, CD19, CD20, CD22, CD27, CD33, CD37, CD38, CD40 , CD44, CD56, CD70, CD138, CA6, Her2/neu, CRIPTO (una proteína producida a concentraciones elevadas en la mayoría de las células de cáncer de mama humano), integrina av/p3, integrina av/p5, TGF-p, CDI 1 a, CD18, Apo2, EpCAM y C242.
Las técnicas de anticuerpos monoclonales permiten la producción de agentes de fijación a células específicos en forma de anticuerpos monoclonales. En concreto se conocen bien en el oficio las técnicas para crear anticuerpos monoclonales producidos por la inmunización de ratones, ratas, hámsteres o cualquier otro mamífero con el antígeno de interés, tal como la célula diana intacta, antígenos aislados de la célula diana, virus completo, virus completo atenuado, y proteínas virales, tales como las proteínas de la cubierta viral. También se pueden usar células humanas sensibilizadas. Otro método para crear anticuerpos monoclonales es el uso de genotecas de fagos de sFv (región variable monocatenaria), específicamente sFv de humano (véase, por ejemplo, Griffiths et al, patente de los EE. UU. n.° 5,885,793; McCafferty et al., solicitud de patente internacional WO 92/01047; Liming et al, solicitud de patente internacional WO 99/06587).
La selección del anticuerpo es una cuestión de elección que depende de la población celular en concreto sobre la que se va a actuar, pero en general se prefieren los anticuerpos monoclonales y sus fragmentos de unión a epítopo, si se dispone de uno apropiado.
Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal My9 es un anticuerpo IgG2a murino que es específico del antígeno CD33 que se encuentra en las células de la leucemia mieloide aguda (AML) (Roy et al. Blood 77: 2404-2412 (1991))) y se puede utilizar para tratar a los pacientes con leucemia mieloide aguda. De igual forma, el anticuerpo monoclonal anti-B4 es una IgGi murina que se une al antígeno CD19 en los linfocitos B (Nadler et al., J Immunol. 131: 244-250 (1983))) y se puede utilizar si las células diana son linfocitos B o células enfermas que expresan este antígeno, como ocurre en el linfoma de no Hodgkin o en la leucemia linfoblástica crónica. El anticuerpo N901 es un anticuerpo monoclonal IgGi murino que se fija a CD56 que se encuentra en las células del carcinoma microcítico de pulmón y en las células de otros tumores de origen neuroendocrino (Roy et al. J Nat. Cáncer Inst. 88: 1136-1145 (1996))); huC242 es un anticuerpo que se fija al antígeno CanAg; el trastuzumab es un anticuerpo que se fija a HER2/neu; y el anticuerpo contra el receptor de EGF se fija al receptor de EGF.
La unidad de fármaco utilizada en esta invención puede ser cualquier fármaco citotóxico, citostático o inmunosupresor, que también se denomina en la presente memoria agente citotóxico, citostático o inmunosupresor. Los ejemplos de fármacos incluyen isótopos radiactivos, agentes quimioterapéuticos y toxinas tales como moléculas pequeñas tóxicas o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, que incluyen análogos sintéticos y derivados de los mismos. La unidad de fármaco tiene un átomo que puede formar un enlace con la unidad conectora, en algunas realizaciones, la unidad de fármaco tiene un átomo de nitrógeno que puede formar un enlace con la unidad conectora. En otras realizaciones, la unidad de fármaco tiene un ácido carboxílico que puede formar un enlace con la unidad conectora. En otras realizaciones, la unidad de fármaco tiene un grupo sulfhidrilo que puede formar un enlace con la unidad conectora. En otras realizaciones, la unidad de fármaco tiene un grupo hidroxilo o de cetona que puede formar un enlace con la unidad conectora.
Las clases útiles de agentes citotóxicos o inmunosupresores incluyen, por ejemplo, antitubulínicos, auristatinas, fijadores del surco menor del ADN, inhibidores de la replicación del ADN, agentes alquilantes (por ejemplo, complejos de platino como c/'s-platino, mono(platino), bis(platino) y complejos de platino trinucleares y carboplatino), antraciclinas, antibióticos, antifolatos, antimetabolitos, sensibilizadores de quimioterapia, duocarmicinas, etopósidos, pirimidinas fluoradas, ionóforos, lexitropsinas, nitrosoureas, platino, compuestos preformantes, antimetabolitos de purina, puromicinas, sensibilizadores de radiaciones, esteroides, taxanos, inhibidores de las topoisomerasas, alcaloides de la vinca o similares. Ejemplos en concreto de clases útiles de agentes citotóxicos incluyen, por ejemplo, fijadores del surco menor del ADN, agentes alquilantes del ADN e inhibidores de la tubulina. Los ejemplos de agentes citotóxicos incluyen, por ejemplo, auristatinas, camptotecinas, duocarmicinas, etopósidos, maitansinas y maitansinoides (por ejemplo, DM1 y DM4), taxanos, benzodiacepinas (por ejemplo, pirrolo[1,4]benzodiacepinas (PBD), indolinobenzodiacepinas y oxiazolidinobenzociacepinas). y alcaloides de la vinca. Los fármacos seleccionados que contienen benzodiacepinas se describen en las solicitudes de patente internacional WO 2010/091 150, WO 2012/1 12708, WO 2007/085930 y WO 201 1/023883.
Los agentes citotóxicos o inmunosupresores independientes incluyen, por ejemplo, un andrógeno, antbramicina (AMC), asparaginasa, 5-azacitidina, azatioprina, bleomicina, busulfano, butionina sulfoximina, caliqueamicina, camptotecina, carboplatino, carmustina (BSNU), CC-1065, clorambucilo, cisplatino, colchicina, ciclofosfamida, citarabina, citidina arabinósido, citocalasina B, dacarbazina, dactinomicina (antes actinomicina), daunorrubicina, dacarbazina, docetaxel, doxorrubicina, etopósido, un estrógeno, 5-fluordesoxiuridina, 5-fluorouracilo, gemcitabina, gramicidina D, hidroxiurea, idarrubicina, ifosfamida, irinotecán, lomustina (CCNU), mayiansina, mecloretamina, melfalán, 6-mercaptopurina, metotrexato, mitramicina, mitomicina C, mitoxantrona, nitroimidazol, paclitaxel, toxina pali, plicamicina, procarbicina, rizoxina, estreptozotocina, tenopósido, 6-tioguanina, tioTEPA, topotecán, vinblastina, vincristina, vinorelbina, VP-16 y VM-26.
En determinadas formas de realización típicas, los agentes citotóxicos idóneos incluyen, por ejemplo, fijadores del surco menor del ADN (p. ej., enediínos y exitropsinas, un compuesto de CBI; véase también la patente de los EE. UU. n.° U.S. 6,130,237), duocarmicras (véase la publicación de los EE. UU. n.° 20060024317), taxanos (p. ej., paclitaxel y docetaxel), puromicinas, alcaloides de la vinca, CC-1065, SN-38, topotecán, morfolinodoxorrubicina, rizoxina, cianomorfolinodoxorrubicina, equinomicina, combretastatina, netropsina, epotilona A y B, estramustina, criptofisinas, cemadotina, maitansinoides, discodermoiída, eleuterobina y mitoxantrona.
En determinadas realizaciones, la unidad de fármaco es un agente antitubulínico. Los ejemplos de agentes antitubulínicos incluyen, entre otros, taxanos (p. ej., Taxol® (paclitaxel), Taxotere © (docetaxel)), T67 (Tularik) y alquiloides de vinca (p. ej., vincristina, vinblastina, vindesmo y vinorelbina). Otros agentes antitubulínicos incluyen, por ejemplo, derivados de la bacatina, análogos del taxano (por ejemplo, epotilona A y B), nocodazol, colchicina y colcimida, estramustina, criptofisinas, cemadotina, maitansinoides, combretastatinas, discodermoiída y eleuterobina.
En determinadas realizaciones, el agente citotóxico es la maitansina o un maitansinoide, otro grupo de agentes antitubulínicos (ImmunoGen, Inc.: véase también Chari et al, 1992, Cáncer Res. 52: 127-131 y la patente de los EE. UU. n.2 U.S. 8,163,888).
En determinadas realizaciones, la unidad de fármaco es una auristatina. Las auristatinas incluyen, pero no se limitan a ellas, AE, AFP, AEB, AEVB, MMAF y MMAE. La síntesis y estructura de las auristatinas se describen en las publicaciones de solicitud de patente de los EE. UU. n.os. 2003-0083263, 2005-0238649 2005-0009751, 2009-01 1 1756, y 201 1 - 0020343: publicación de solicitud de patente internacional n.° WO 04/010957, publicación de solicitud de patente internacional n.° WO 02/088172, y las patentes de los EE. UU. n.os 7,659,241 y 8,343,928. Las auristatinas ejemplares de la presente invención se fijan a la tubulina y ejercen un efecto citotóxico o citostático sobre la línea celular deseada.
Las unidades de fármaco de auristatina ejemplares tienen las siguientes fórmulas o una sal farmacéuticamente aceptable de las mismas, en las que la línea ondulada indica el sitio de unión a la unidad conectora:
Figure imgf000019_0001
En determinadas formas de realización, el fármaco es una benzodiacepina (que incluye fármacos que contienen benzodiacepinas, por ejemplo, pirrolo[1,4]benzodiacepíricos (PBD), indolinobenzodiacepinas y oxazolidinobenzodiacepinas). Los PBD tienen la estructura general:
Figure imgf000019_0002
pero pueden diferir en el número, tipo y posición de los sustituyentes, tanto en sus anillos aromáticos A como en los anillos de pirrolo C, y en el grado de saturación del anillo C. En el anillo B hay una imina (N=), una carbinolamina (NH-CH(OH))> o un éter metílico de carbinolamina (NH-CH(OMe)) en la posición N10-C11, que es el centro electrófilo responsable de la alquilación del ADN. Todos los productos naturales conocidos tienen una configuración (S) en la posición quiral CI la que les proporciona un giro dextrógiro cuando se ven desde el anillo C hacia el anillo A. Esto les da la forma tridimensional apropiada para la isohelicidad con el surco menor del ADN en forma B, lo que lleva a un ajuste perfecto en el sitio de fijación. La capacidad de los PBD para formar un aducto en el surco menor les permite interferir con el procesamiento del ADN, de ahí su uso como agentes antitumorales. La actividad biológica de estas moléculas se puede potenciar, por ejemplo, mediante la unión de dos unidades de PBD a través de sus funcionalidades C8/C-hidroxilo mediante un conector de alquileno flexible. Se cree que los dímeros de PBD forman lesiones de ADN selectivas de secuencia, como el entrecruzamiento palindrómico 5'-Pu-GATC-Py-3' entre cadenas, que se cree que es el principal responsable de su actividad biológica.
Método general para preparar conectores, conjugados de fármacos y conectores y CAF:
Método 1
Figure imgf000019_0003
Un aminoalcohol 1 se hace reaccionar con un hemiacetal, tal como hemiacetal de trifluoroacetaldehído y metilo, en un disolvente, tal como tolueno, a la temperatura de reflujo con la eliminación concomitante de agua para dar un intermedio de oxazolidina 2. La oxazolidina 2 se hace reaccionar luego con un reactivo de Grignard o alcalino derivado de un precursor apropiado para producir un aminoalcohol intermedio 3. La oxidación en una condición apropiada, tal como el reactante de Jones o el ácido peryódico con una cantidad catalítica de trióxido de cromo y seguida de esterificación, proporciona el intermedio de tipo éster 4. La manipulación apropiada de los grupos funcionales en el intermedio 4 proporciona el intermedio 5 con las asas adecuadas para las posteriores transformaciones.
Método 2
Figure imgf000020_0001
El aminoalcohol 3 del método 1 también se puede preparar de una manera diastereoselectiva tal y como se describe en Gosselin, F. et. al., Org. Lett.. 2004, 6, 641 y Roy, A., et. al., J. Org. Chem. 2006, 71, 4320 para dar 3a con gran diestereoselectividad.
Método 3
Figure imgf000020_0002
El aminoácido 7 se protege con un grupo protector idóneo en el resto amino y luego se acopla con el alcohol 4-aminobencílico para dar el intermedio 8 de manera estándar. A continuación, se retira el grupo protector de la amina para dar el intermedio 9.
Método 4
Figure imgf000020_0003
El intermedio 5 o 6 del método 1 y el intermedio 8 del método 3 se hacen reaccionar en las condiciones idóneas para dar el intermedio 10. A continuación, el intermedio 10 se convierte en el carbonato de 4-nitrofenilo 11 intermedio. Método 5
Figure imgf000021_0001
Intermedio 11 del método 4 se hace reaccionar con MMAE en una condición apropiada para dar intermedio de fármaco unido a conector 12.
Método 6
Figure imgf000021_0002
El intermedio 12 se acopla con el anticuerpo deseado en una condición apropiada tal y como se describe en la sección experimental correspondiente.
Procedimiento general para la conjugación del intermedio fármaco-conector a Herceptin:
Etapa 1: Reducción del puente disulfuro del anticuerpo y purificación.
Para producir 240 mg de CAF, se mezclaron 8,955 ml de Herceptin (26,8 mg/ml, alrededor de 30 mg/ml) con 8,95 pl de TCEP a 0,5 M (la concentración final de TCEP en la mezcla de reacción fue de 0,5 mM) y la reacción se realizó a temperatura ambiente durante 2 h. Luego, la solución de la reacción se cargó en una columna de afinidad con la proteína A de 1 ml para eliminar el TCEP que quedaba y otras impurezas distintas del Acm. Después de la purificación, se ajustó el pH del eluyente a aproximadamente 6,0 con Tris a 1 M y se midió la concentración del Acm mediante nanogotas. El volumen final de la solución fue de aproximadamente 20 ml y la concentración del Acm fue de 11,6 mg/ml.
Etapa 2: Conjugación del fármaco-conector al anticuerpo
La solución se dividió por igual en dos tubos (de 10 ml cada uno), y se le añadió a cada tubo 1 ml de la solución de DMSO del intermedio fármaco-conector (25 mg/ml). La relación entre el intermedio fármaco-conector y el Acm era de 6:1. La reacción se llevó a cabo a temperatura ambiente durante aproximadamente 12 h. Cuando se terminó, se juntó la solución de cada uno de los dos tubos, se centrifugó a 5000 rpm durante 5 min y se cargó en una columna de afinidad con la proteína A para retirar el intermedio fármaco-conector que no reaccionó. El pH del eluyente de la columna se ajustó a 6,0 con el tampón de Tris a 1 M. La proporción de fármaco por anticuerpo (DAR) se determinó mediante una HPLC basada en cromatografía de interacción hidrófoba (HIC).
La invención se describe ahora adicionalmente mediante los ejemplos. Los compuestos de la presente invención se pueden preparar de varias formas conocidas por el experto en la técnica de la síntesis orgánica. Los ejemplos de la presente invención se pueden sintetizar con los métodos descritos a continuación, junto con los métodos de síntesis conocidos en la técnica de la química orgánica sintética, o mediante variaciones de los mismos, como apreciarán los expertos en la técnica. Los métodos concretos incluyen, pero no se limitan a ellos, los que se describen a continuación.
Todos los solventes utilizados están disponibles comercialmente y se utilizan sin purificación adicional. Las reacciones se realizan típicamente con disolventes anhidros en una atmósfera inerte de nitrógeno. La RMN de protones se registra en un espectrómetro Bruker Avance III 400 (400 MHz) y los desplazamientos químicos se describen como (ppm) campo abajo desde el tetrametilsilano. Los espectros de masas se determinan en el Agilent 1200 series plus 6110 (y 1956a ). La CL/EM, o Shimadzu EM que consiste en un detector DAD: SPD-M20A (CL) y un detector Micromass 2020 de Shimadzu. El espectrómetro de masas está equipado con una fuente de iones por electropulverización (ESI) que funciona en modo positivo o negativo.
Se utilizan las siguientes abreviaturas: CAF es un conjugado de anticuerpo y fármaco; aq es acuoso; Acm es un anticuerpo monoclonal; MTMH es 1-maleinimidil-6-trifluorometilhex-6-ilo con la estructura de
Figure imgf000022_0001
(S)-MTMH es
Figure imgf000022_0002
(R)-MTMH es
Figure imgf000022_0003
PABO(CO) es
Figure imgf000022_0004
ABA es
Figure imgf000022_0005
MMAE es
Figure imgf000022_0006
Fmoc-CI es cloroformiato de 9-fluorenilmetilo; DIAD es azodicarboxilato de diisopropilo; Z-Glu-OMe es ácido (S)-4-(((benciloxi)carbonil)amino)-5-metoxi-5-oxopentánico; HATU es hexafluorofosfato de 3-óxido de 1-[bis(dimetilamino)metilén]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio; EDCI es 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida; DMSO es sulfóxido de dimetilo; HOBT es hidroxibenzotriazol; DCM es diclorometano; PE es éter de petróleo; DMF es N,N-dimetilformamida; DMSO es sulfóxido de dimetilo; EtOAc es acetato de etilo; EtOH es etanol; MeOH es metanol; Cbz es benciloxicarbonilo, un grupo protector de amina; BOC es tert-butilcarbonilo, un grupo protector de amina; HOAc es ácido acético; NaBH(OAc)3 es triacetoxiborohidruro de sodio; r.t. es la temperatura ambiente; THF es tetrahidrofurano; Boc2O es dicarbonato de di-te/t-butilo; TFA es ácido trifluoroacético; DIPEA es diisopropiletilamina; Pd(dppf)Cl2 es [1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno]dicloropaladio(II); POCl3 es oxicloruro de fósforo; NaH es hidruro de sodio; La H es hidruro de litio y aluminio; Pd(OAc)2 es acetato de paladio(II); Pd2(dba)3 es tris(dibencilidenoacetona)dipaladio; Pd(PPh3)4 es tetraquis(trifenilfosfina)paladio; Et3SiH es trietilsilano; PPh3 es trifenilfosfina; Xantphos es 4,5-bis(difenilfosfino)-9,9-dimetilxanteno; MeSO3H es ácido metanosulfónico; Xphos es 2-diciclohexilfosfino-2',4',6'-triisopropilbifenilo; el reactante de Lawesson es 2,4-bis(4-metoxilfenil)-1,3-ditia-2,4-difosfetano-2,4-disulfuro; NBS es N-bromosuccinimida; t-BuOK es te/t-butilato de potasio.
Los compuestos se nombran manualmente o con el uso de ChemDraw®, o con el uso del nombre del catálogo de los proveedores, si está disponible comercialmente.
Breve descripción de las figuras
En la figura 1 se muestra la actividad antiproliferativa de Herceptin y diferentes CAF, y el resultado sugirió que el ADC001 en estudio (ejemplo 9) y el ADC-HA de control mostraban una actividad comparable a la hora de inhibir el crecimiento de la línea celular de cáncer de mama HCC1954 in vitro. La monoterapia de Herceptin es ineficaz en este ensayo.
En la figura 2 se muestran las curvas de crecimiento tumoral de cada grupo. El resultado sugirió que el ADC001 en estudio (ejemplo 9) y el ADC-HA de control mostraban una actividad comparable para inhibir el crecimiento tumoral en el modelo de ratones con xenoinjerto de HCC1954.
En las figuras 3 y 4 se muestra la actividad antiproliferativa de Herceptin y los CAF (ADC002 a ADC006, ejemplos 10 a 14) y el resultado sugirió que los CAF del estudio y el ADC-HA de control mostraban una actividad comparable a la hora de inhibir el crecimiento de la línea celular de cáncer de mama HCC1954 in vitro. La monoterapia de Herceptin es ineficaz en este ensayo.
En las figuras 5 a 10 se muestran las curvas de crecimiento tumoral para el ADC-HA de control y los CAF (ADC-002 a ADC006, ejemplos 10 a 14).
En la figura 11 se muestra la comparación del tamaño de los tumores al final del estudio entre el ADC-HA de control y los ADCC-002 a ADC006.
En la figura 12 se muestra la actividad antiproliferativa de Erbitux, el ADC-EA de control, el ADC007 (ejemplo 15) y el ADC008 (ejemplo 16).
En la figura 13 se muestran las curvas de crecimiento tumoral para el ADC-EA de control, el ADC007 (ejemplo 15) y el ADC008 (ejemplo 16).
Descripción detallada de la realización preferida
Para describir la presente invención con más detalle, se proporcionan los siguientes ejemplos y ejemplos comparativos. Sin embargo, el alcance de la presente invención no se limita a ellos.
Intermedio comparativo 1
Figure imgf000023_0001
(2S)-2.5-D¡oxop¡rrolidín-1 -il-2-{[7-(2.5-d¡oxo-2.5-d¡h¡dro-1 H-pirrol-1 -il)-1,1,1 -trifluoroheptán-2-il1amino}-3-metilbutanoato
Etapa 1: (2S)-3-Metil-2-[(1,1,1 -tr¡fluorooct-7-en-2-il)am¡no1bután-1 -ol
Figure imgf000023_0002
A una suspensión agitada de Mg (10,2 g, 420 mmol) con algunos pequeños cristales de yodo en 80 ml de THF se le añadió una pequeña resto de una solución de 6-bromohex-1-eno (22,8 g, 140 mmol) en THF anhidro (40 ml). Una vez iniciada la reacción, se le añadió gota a gota la solución restante de 6-bromohex-1-eno en THF a una velocidad que mantuviera un reflujo suave. Una vez completada la adición, la mezcla resultante se calentó a 70 °C durante 1 h. El reactante de Grignard (~120 ml en THF) obtenido se utilizó luego directamente para la siguiente etapa.
El reactante de Grignard anterior se enfrió a -78 °C y se le añadió gota a gota una solución de (4S)-4-isopropil-2-(trifluorometil)oxazolidina (17 g, 93,4 mmol) en THF (40 ml). La mezcla resultante se calentó hasta 0 °C y se agitó durante 1,5 h. La reacción se detuvo con una solución de NH4Cl saturado (50 ml), y se extrajo con EtOAc (4 x 100 ml). La fase orgánica se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida eluida con éter de petróleo/EtOAc (0 a 4 %) para dar el compuesto del título (11,5 g, 46 %) como un aceite amarillo.
Etapa 2: Ácido (2S)-3-met¡l-2-[(1■1■1-tr¡fluorooct-7-en-2-¡l)am¡no1butano¡co
A una solución de H5 IO6 (33,2 g, 145,8 mmol) en CH3CN anhidro (100,0 ml) se le añadió CrÜ3 (486 mg, 4,86 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. La mezcla se enfrió a continuación a 0 °C y se le añadió gota a gota una solución de (2S)-3-metil-2-[(1,1,1-trifluorooct-7-en-2-il)amino]-bután-1-ol (6,5 g, 24,3 mmol, en 20 ml de CH3CN). La mezcla resultante se agitó a 0 °C durante 1,5 h, se inactivó con K2HPO4 (16,3 g en 50 ml de H2O) y se extrajo con EtOAc (3 x 100 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na2SÜ4, se filtraron y se concentraron. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida eluida con éter de petróleo/EtOAc (0 - 4 % - 10 % de EtOAc) para dar el compuesto del título (1,04 g, 12,7 %) como un aceite amarillo.
Etapa 3: (2S)-3-Met¡l-2-r(1.1.1-tr¡fluorooct-7-en-2-il)am¡no1butanoato de tert-butilo
Figure imgf000024_0001
A una solución de ácido (2S)-3-metil-2-[(1,1,1-trifluorooct-7-en-2-il)amino]butanoico (650 mg, 2,3 mmol) en t-BuOAc (10,0 ml) se le añadió gota a gota HClO4 al 70 % (398 mg, 2,8 mmol) a 0 °C y se agitó durante 1 h a esta temperatura. Después de calentar a temperatura ambiente y agitar durante 16 h más, la mezcla de reacción se vertió en EtOAc (50 ml), se lavó sucesivamente con H2O (30 ml), NaHCO3 saturado acuoso (30 ml) y salmuera, se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida eluida con éter de petróleo/EtOAc (0 ~ 2 % ~ 5 % ~ 10 % de EtOAc) para dar el compuesto del título (0,56 g, 72 %) como un aceite incoloro.
Etapa 4: (2S)-3-Met¡l-2-r(1.1.1-tr¡fluoro-7-h¡drox¡heptán-2-¡nam¡nolbutanoato de fórt-butilo
Figure imgf000024_0002
A una solución de (2S)-3-metil-2-[(1,1,1 -trifluorooct-7-en-2-il)amino]butanoato de tert-butilo (1,4 g, 4,2 mmol) en DCM anhidro (6 ml) y MeOH (6 ml) se enfrió a -78 °C y se cargó con O3 durante 2 min. Luego, la mezcla se calentó a 0 °C y NaBH4 (481 mg, 12,7 mmol). La mezcla resultante se agitó a la misma temperatura durante 2 h, se inactivó con una solución de NH4Cl saturado acuoso (4 ml), se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida eluida con éter de petróleo/EtOAc (4 % ~ 10 % de EA) para dar el compuesto del título 7 (1,05 g, 72 %) como un aceite incoloro.
1H RMN (CDCl3) ó 3,63 (t, J = 6,5 Hz, 2 H), 3,06 (d, J = 6,0 Hz, 1 H), 3,01 (d, J = 4,6 Hz, 1 H), 2,90 - 2,79 (m, 1 H), 1,92 - 1,80 (m, 1 H), 1,67 - 1,55 (m, 5 H), 1,44 (s, 8 H), 1,42 - 1,31 (m, 3 H), 0,95 - 0,83 (m, 6 H).
Etapa 5: (2S)-2-((7-(2.5-d¡oxo-2.5-d¡h¡dro-1H-p¡rrol-1-¡l)-1.1.1-tr¡fluoroheptán-2-¡nam¡no)-3-met¡lbutanoato de fórt-but¡lo
Figure imgf000024_0003
A una solución de trifenilfosfina (845 mg, 3,2 mmol) en THF (35 ml) a -78 °C en N2 se le añadió DIAD (651 mg, 3,2 mmol) gota a gota. La mezcla de reacción amarilla se agitó a -78 °C durante 5 min y se le añadió (2S)-3-metil-2-[(1,1,1-trifluoro-7-hidroxiheptán-2-il)amino]butanoato de tert-butilo (1,1 g, 3,22 mmol) en THF (5 ml). Después de agitar durante 5 min más, se le añadieron alcohol neopentílico (142 mg, 1,61 mmol) y 1H-pirrol-2,5-diona (313 mg, 3,22 mmol) a la mezcla de reacción como sólidos. Después, la reacción se agitó durante una noche a temperatura ambiente y se concentró. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida eluida con éter de petróleo/EtOAc (EtOAc al 0 ~ 15 %) para dar el compuesto del título (550 mg, 40,7 %) como un aceite incoloro.
1H RMN (CDCh) ó 6,69 (s, 2 H), 3,52 (t, J = 7,2 Hz, 2 H), 3,06-3,01 (m, 1 H), 2,84-2,82 (m, 1 H), 1,89-1,87 (m, 1 H), 1,66-1,52 (m, 8 H), 1,50-1,25 (m, 9 H), 0,95-0,86 (m, 6 H).
Etapa 6: (2S)-2.5-D¡oxop¡rrol¡dín-1 -¡l-2-fr7-(2.5-d¡oxo-2.5-d¡h¡dro-1 H-p¡rrol-1 -¡l)-1.1.1 -tr¡fluoroheptán-2-¡l1am¡no)-3-met¡lbutanoato
Figure imgf000024_0004
A una solución de (2S)-2-((7-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1 -il)-1,1,1-trifluoroheptán-2-il)amino)-3-metilbutanoato de tert-butilo (350 mg, 0,84 mmol) en DCM anhidro (6 ml) en N2 a 0 °C se le añadió gota a gota TFA (6 ml). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 h, se concentró y se coevaporó con tolueno (2 x 10 ml) para eliminar el TFA. A continuación, el residuo se volvió a disolver en THF anhidro (5 ml) en N2 a 0 °C y se le añadió trietilamina (251 mg, 2,492 mmol) seguido de DCC (171 mg, 0,83 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante 5 min, se le añadió N-hidroxisuccinimida (96 mg, 0,83 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 16 h, se filtró y se concentró para dar el compuesto del título en bruto (260 mg), que se usó para la siguiente etapa de reacción sin purificación adicional.
Intermedio comparativo 2 e intermedio comparativo 3
Figure imgf000025_0001
Ácido (S)-2-(((R)-7-(2.5-d¡oxo-2.5-d¡h¡dro-1H-p¡rrol-1-¡0-1.1.1-tr¡fluoroheptán-2-¡0am¡no)-3-met¡l-butano¡co. (R) -MTMH-Val, y ácido (S)-2-(((S)-7-(2.5-dioxo-2.5-dihidro-1H-pirrol-1-i0-1.1.1-trifluoroheptán-2-il)amino)-3-metilbutanoico. (S)-MTMH-Val
Etapa 1: (4S)-4-isopropil-2-(trifluorometi0oxazolidina
Figure imgf000025_0002
A una mezcla de (S)-2-amino-3-metilbután-1-ol (85 g, 824 mmol, 1,0 eq) y 2,2,2-trifluoro-1-metoxietanol (75 g, 577 mmol, 0,7 eq ) en tolueno (1,5 l) se le añadió PPTS (10,4 g, 41,2 mmol, 0,05 eq) en una resto a temperatura ambiente en N2. La mezcla se calentó a reflujo durante 3 h con retirada azeotrópica de metanol/agua (trampa Dean-Stark). La TLC mostró que la reacción se había completado. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente, se filtró y se concentró al vacío para producir el compuesto del título (86 g, bruto) como un aceite amarillo.
Etapa 2: (2S)-3-Metil-2-r(1.1.1-trifluorooct-7-en-2-i0amino1bután-1-ol
Figure imgf000025_0003
A una mezcla de magnesio (18,2 g, 750 mmol, 1,5 eq) y I2 (cat) en THF (500 ml) se le añadió gota a gota una solución de 6-bromohex-1-eno (81,5 g, 499,8 mmol, 1,0 eq) en THF (500 ml) a 20 °C durante un período de 30 min en N2. Durante la adición, la temperatura de reacción se elevó y se mantuvo a 60 °C. Después de agitar más a 60 °C durante otras 1,5 h, la mezcla se enfrió a temperatura ambiente y se usó para la siguiente etapa sin purificación.
Al reactante de Grignard, el bromo(hex-5-enil) magnesio (0,5 M, 500 ml, 1,25 eq) de más arriba a -78 °C en N2 , se le añadió gota a gota una solución de (4S)-4-isopropil-2-(trifluorometil)oxazolidina (36,6 g, 200 mmol, 1,00 eq) en THF (300 ml). La mezcla se agitó a -78 °C durante 30 min, luego se calentó a 20 °C y se agitó durante 4,5 h. La TLC (PE:EA = 5:1) mostró que la reacción se había completado. La mezcla se inactivó con NH4Cl (500 ml) y se extrajo con EtOAc (1000 ml x 3). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera saturada (500 ml x 2), se secaron con Na2SO4, se filtraron y se concentraron. El residuo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (éter de petróleo:EtOAc = 20:1) para producir el compuesto del título (19 g, rendimiento del 35,5 %) en forma de un aceite amarillo.
Etapa 3: Ácido (2S)-3-metil-2-r(1.1.1 -tr¡fluorooct-7-en-2-¡0amino1butano¡co
Figure imgf000025_0004
A una mezcla de (2S)-3-metil-2-[(1,1,1-trifluorooct-7-en-2-il)amino]bután-1-ol (19 g, 71 mmol, 1 eq) en CH3CN (515 ml) se le añadió pentahidroxi(oxo)-yodano (48,6 g, 213,2 mmol, 3 eq), CrO3 (142 mg, 1,4 mmol, 0,02 eq) y agua (4 ml) a 0 °C. La mezcla se agitó a 0 °C durante 4 h. La TLC mostró que la reacción se había completado. La mezcla se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (éter de petróleo:EtOAc = 10:1) para producir el compuesto del título (16 g, rendimiento del 80 %) en forma de un aceite amarillo.
Etapa 4: (2S)-3-Metil-2-r(1,1,1 -trifluorooct-7-en-2-¡0amino1butanoato de tert-butilo
Figure imgf000026_0001
A una mezcla de ácido (2S)-3-metil-2-[(1,1,1-trifluorooct-7-en-2-il)amino]butanoico (7 g, 24,9 mmol, 1 eq) en acetato de tert-butilo (200 ml) se le añadió HClO4 al 70 % (7,5 g, 74,7 mmol, 3 eq) en una resto a 30 °C en N2. La mezcla se agitó a 30 °C durante 3 h. La TLC mostró que la reacción se había completado. La mezcla se diluyó con EtOAc (400 ml) y se lavó con agua (400 ml). La capa orgánica se secó sobre Na2SO4 y se concentró. El residuo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (éter de petróleo:EtOAc = 60:1) para producir el compuesto del título (7 g, rendimiento del 83,4 %) como un aceite amarillo.
Etapa 5: (2S)-3-Metil-2-r(1,1,1 -trífluoro-7-h¡droxiheptán-2-¡0am¡no1butanoato de tert-butilo
Figure imgf000026_0002
Se burbujeó ozono en una solución de (2S)-3-metil-2-[(1,1,1-trifluorooct-7-en-2-il)amino]butanoato de tert-butilo (14,0 g, 41,5 mmol, 1 eq) en DCM (100 ml) y MeOH (10 ml) a -78 °C durante 3 min. Después de pugar el exceso de O3 con N2 , se le añadió NaBH4 (4,7 g, 124,5 mmol, 3 eq) a 0 °C. La mezcla se agitó a 20 °C durante 3 h. La TLC mostró que el material de partida se consumió por completo. Después de enfriar con NH4Cl acuoso saturado (50 ml), la mezcla se extrajo con EtOAc (200 ml). La capa orgánica se concentró para dar el producto bruto. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice eluido con (éter de petróleo:EtOAc = 20:1) para dar el compuesto del título (11 g, rendimiento del 77,7 %) en forma de un aceite amarillo.
Etapa 6: (2S)-2-((7-(2.5-D¡oxo-2.5-d¡h¡dro-1 H-pirrol-1 -il)-1,1.1-tr¡fluoroheptán-2-¡^am¡no)-3-met¡lbutanoato de tert-butilo
Figure imgf000026_0003
A una solución de PPh3 (4,61 g, 17,57 mmol, 1,50 eq) en THF (40 ml) a -78 °C en N2 se le añadió gota a gota DIAD (3,55 g, 17,57 mmol, 1,50 eq). Después de agitar a -78 °C durante 5 min, se le añadió (2S)-3-metil-2-[(1,1,1 -trifluoro-7-hidroxiheptán-2-il)amino]butanoato de tert-butilo (4,0 g, 11,7 mmol, 1 eq) en THF (5 ml) y se agitó durante 5 min. A continuación, se le añadieron 2,2-dimetilpropán-1-ol (774,6 mg, 8,8 mmol, 0,75 eq) y 1H-pirrol-2,5-diona (1,7 g, 17,6 mmol, 1,5 eq) a la mezcla de reacción como sólidos. La reacción se agitó durante 3 h a 30 °C. La TLC mostró que se consumió el material de partida. La mezcla se concentró y se purificó con una columna de gel de sílice (éter de petróleo:EtOAc = 10:1) para dar el compuesto del título (4,00 g, 9,51 mmol, rendimiento del 81,17 %) en forma de un sólido blanco.
Etapa 7: ácido (S)-2-(((R)-7-(2■5-d¡oxo-2■5-d¡h¡dro-1H-p¡rrol-1-¡0-1■1■1-trífluoroheptán-2-¡0am¡no)-3-metilbutanoico. (R)-MTMH-Val, y ácido (S)-2-(((S)-7-(2.5-d¡oxo-2.5-d¡h¡dro-1H-p¡rrol-1-¡0-1.1.1-trífluoroheptán-2-¡l)am¡no)-3-met¡lbutano¡co, (S)-MTMH-Val
Figure imgf000026_0004
Una mezcla de (2S)-2-((7-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-1,1,1-trifluoroheptán-2-il)amino)-3-metilbutanoato de tert-butilo (6,0 g, 14,3 mmol, 1 eq) en DCM (40 ml) y TFA (40 ml) se agitó a 30 °C durante 12 h. A continuación, la mezcla se concentró y se purificó mediante HPLC preparativa (instrumento: bomba Shimadzu LC-20A; columna: SYNERGI 200 * 5010um; fase móvil: A para H2O (añadir 0,75 %o de TFA, v/v) y B para CH3CN; gradiente: B 30-60 %; tiempo de gradiente: 30 min; tiempo de retención: 25-30 min; velocidad de flujo: 80 ml/min) para producir el pico 1: intermedio 2 (3,20 g, 8,78 mmol, rendimiento del 61,55%) como un sólido blanco y el pico 2, intermedio 3 (1,10 g, 3,02 mmol, rendimiento del 21,16 %) como un aceite amarillo.
Intermedio 2, (R)-MTMH-Val: 1H RMN (CDCb) 56,72 (s, 2H), 3,54 (t, 2H), 3,30 (d, 1 H), 3,00 (m, 1 H), 2,13 (m, 1H), 1,75-1,25 (m, 8H), 1,03 (d, 3H), 0,98 (d, 3H). CL-EM: 365,1 (MH+).
Intermedio 3, (S)-MTMH-Val: 1H RMN (CDCI3) 56,72 (s, 2H), 3,54 (t, 2H), 3,33 (d, 2H), 2,97 (m, 1H), 2,02 (m, 1H), 1,75-1,25 (m, 8H), 1,03 (d, 3 H), 0,99 (d, 3 H). CL-EM: 365,1 (MH+).
Intermedio comparativo 4
Figure imgf000027_0001
Cit-PAB-OH
Etapa 1: Fmoc-Cit
Figure imgf000027_0002
A una solución de L-citrulina (20,00 g, 114,16 mmol, 1,00 eq) en Na2CO3 al 10 % (200 ml) se le añadió gota a gota una solución de Fmoc-CI (35,40 g, 136,84 mmol, 1,20 eq) en dioxano (100 ml) a 0 °C durante un período de 5 min en N2. La mezcla de reacción se calentó a 20 °C durante 4 h. La TLC mostró que el material de partida se consumió por completo. A la mezcla de reacción se le añadió H2O (50 ml). La fase acuosa se separó y se ajustó a pH 2-3 con HCl a 2 M (50 ml). La mezcla se extrajo con EtOAc (150 ml x 3). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera saturada (100 ml x 2), se secaron sobre Na2SO4 anhidro, se filtraron y se concentraron para dar el compuesto del título (40,00 g, 100,65 mmol, rendimiento del 88,17 %) como un sólido blanco. CL-EM (ESI): 398,1 (MH+).
Etapa 2: Fmoc-Cit-PAB-OH
Figure imgf000027_0003
A una solución de Fmoc-cit (40,00 g, 100,65 mmol, 1,00 eq) y alcohol 4-aminobencílico (14,87 g, 120,78 mmol, 1,2 eq) en DCM (1000 ml) se le añadió gota a gota una solución de EEDQ (49,78 g, 201,30 mmol, 2,0 eq) en MeOH (500 ml) a 20 °C durante un período de 30 min en N2. La mezcla de reacción se agitó a 20 °C durante 16 h. La TLC (MeOH:EtOAc = 1:10) mostró que el material de partida se consumió por completo. La mezcla de reacción se concentró y el residuo se lavó con éter de te/t-butilo y metilo (200 ml x 3), se filtró y se concentró para dar el compuesto del título en bruto (45,00 g, 89,54 mmol, 88,96 % de rendimiento) como un sólido blanco.
Etapa 3: Cit-PAB-OH
Figure imgf000027_0004
A una solución de Fmoc-cit-PAB-OH (15,00 g, 29,85 mmol, 1,00 eq) en DMF (124,5 ml) se le añadió gota a gota una solución de piperidina (21,93 g, 257,58 mmol, 8,63 eq) en DMF (20 ml) a 20 °C durante un período de 10 min. La mezcla de reacción se agitó a 20 °C durante 3 h. La TLC (DCM:MeOH = 5:1) mostró que el material de partida se consumió por completo. La reacción se lavó con DMF (30 ml x 2). Las fases orgánicas combinadas se concentraron para dar el residuo que se purificó por HPLC preparativa (ácido fórmico) para dar el compuesto del título (7,50 g, 26,76 mmol, rendimiento del 89,63 %) como un sólido blanco. Cl-EM (ESI): 218,1 (MH+).
Intermedio 5 comparativo
Figure imgf000028_0001
(S)-2-Am¡no-N-(4-(h¡drox¡met¡0fen¡0-5-morfolinopentanam¡da
Etapa 1: (S)-2-(((Bencilox0carboni0amino)-5-morfolino-5-oxopentanoato de metilo
Figure imgf000028_0002
A una solución de Z-Glu-OMe (10 g, 33,87 mmol) en DMF seco (100 ml) se le añadió DIPEA (13,13 g, 101,60 mmol), HATU (15,45 g, 40,64 mmol) y morfolina (4,43 g, 50,8 mmol) y luego se agitó a 20 °C durante 16 h. La mezcla se vertió en agua (200 ml) y EtOAc (500 ml). La capa orgánica se separó, se lavó con agua (100 ml x 2) y salmuera (100 ml), se secó sobre NaSO4 anhidro y se concentró para dar el compuesto del título (11 g, bruto) como un aceite. EM: 365 (MH+)
Etapa 2: (S)-2-(((Bencilox0carboni0amino)-5-morfolinopentanoato de metilo
Figure imgf000028_0003
A una solución de (S)-2-(((benciloxi)carbonil)amino)-5-morfolino-5-oxopentanoato de metilo (3 g, 8,2 mmol) en THF seco (40 ml) se le añadió una solución del complejo de sulfuro de metilborano a 10 M en THF (4 ml) a 0 °C y luego se agitó a 16 °C durante 16 h. La mezcla se inactivó con CH3OH y seguido de HCl acuoso a 1 M (40 ml), se agitó a 90 °C durante 30 min y se evaporó hasta la sequedad. El residuo se disolvió con agua (100 ml), se ajustó a pH 10 con NaOH acuoso y se extrajo con EtOAc (100 ml x 3). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (50 ml x 2), se secaron sobre NaSO4 anhidro y se concentraron a presión reducida. El residuo de cuatro reacciones paralelas se combinó y se purificó mediante cromatografía en columna (DCM:MeOH = 10:1) para dar el compuesto del título (5,5 g, rendimiento del 47,7 %) como un aceite. EM: 351 (MH+)
Etapa 3: Ácido (S)-2-(((benc¡lox¡)carbon¡l)am¡no)-5-morfol¡nopentanoico
Figure imgf000028_0004
A una solución de (S)-2-(((benciloxi)carbonil)amino)-5-morfolinopentanoato de metilo (5,5 g, 15,70 mmol) en THF (50 ml) se le añadió UOH-H2O (1,32 g, 31,39 mmol). Luego, la mezcla se agitó a 0 °C durante 2 h y se evaporó hasta la sequedad para dar el compuesto del título en bruto (5,0 g, en bruto).
Etapa 4: (SH1-((4-(H¡drox¡met¡0fen¡0am¡no)-5-morfol¡no-1-oxopentán-2-¡l)carbamato de bencilo
Figure imgf000029_0001
A una solución de ácido (S)-2-(((benciloxi)carbonil)amino)-5-morfolinopentanoico (3,00 g, 8,92 mmol) en DMF seca (200 ml) se le añadió HOBt (1,21 g, 8,92 mmol), EDCI (1,71 g, 8,92 mmol) y alcohol 4-aminobencílico (1,65 g, 13,38 mmol y luego se agitó a 0 °C durante 6 h. La mezcla se vertió en agua (100 ml) y EtOAc (150 ml). La capa orgánica se separó, se lavó con agua (50 ml x 2), salmuera (50 ml), se secó sobre NaSO4 anhidro y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna (DCM:MeOH = 10:1) para producir el compuesto del título (1,2 g, rendimiento del 30,47 %). EM: 442 (MH+)
Etapa 5: (S)-2-Am¡no-N-(4-(h¡drox¡met¡0fen¡0-5-morfol¡nopentanam¡da
Figure imgf000029_0002
A una solución de (S)-(1-((4-(hidroximetil)fenil)amino)-5-morfolino-1-oxopentán-2-il)carbamato de bencilo (600,00 mg, 1,36 mmol) en MeOH (50 ml) se le añadió Pd/C (200,00 mg) en N2. La suspensión se desgasificó al vacío y se purgó con H2 varias veces. La mezcla se agitó en H2 (15 psi) a 25 °C durante 0,5 h. El catalizador se retiró por filtración y el filtrado se concentró para producir el compuesto del título en bruto (350,00 mg). EM: 308 (MH+)
Intermed¡o 6 comparat¡vo
Figure imgf000029_0003
((trans-4-(2-Am¡no-3-((4-(h¡drox¡met¡0fen¡0am¡no)-3-oxoprop¡0c¡clohex¡0met¡Qcarbamato de tert-but¡lo
Etapa 1: Ácido trans-4-(((tert-butox¡carbon¡nam¡no)met¡l)c¡clohexanocarboxíl¡co
HOOC,
frans-4-(aminometil)ciclohexaXnocaX ,NHBoc
A una mezcla de ácido rboxílico (50 g, 318 mmol) y Boc2O (69,4 g, 318 mmol) en H2O (500 ml) se le añadió una solución de NaOH (12,7 g, 318 mmol) en H2O (500 ml) en una resto a 15 °C en N2. La mezcla se agitó a 15 °C durante 16 h. La TLC mostró que se consumió la mayor parte del material de partida. La mezcla se ajustó a pH 3 con HOAc (40 ml) y se extrajo con EtOAc (400 ml x 3). Las fases orgánicas combinadas se secaron con Na2SO4 anhidro, se filtraron y se concentraron para producir el compuesto del título en bruto (77 g) como un sólido blanco.
1H RMN (CDCh) ó 4,62 (m, 1 H), 2,98 (m, 2 H), 2,25 (m, 1 H), 2,04 (d, 2 H), 1,83 (d, 2 H), 1,438-1,37 (m, 12 H), 0,96 (m, 2H).
Etapa 2: ((trans-4-(H¡drox¡met¡l)c¡clohex¡nmet¡ncarbamato de tert-butUo
Figure imgf000029_0004
A una mezcla de ácido frans-4-(((te/t-butoxicarbonil)amino)metil)ciclohexanocarboxílico (37,0 g, 143,8 mmol) en THF (1 l) se le añadió LiAIH4 (8,2 g, 215,7 mmol) a 0 °C en N2. La mezcla se agitó a 15 °C durante 16 h. La TLC mostró que se había terminado la reacción. La mezcla se inactivó con agua (8,2 ml), seguido de la solución acuosa de NaOH al 15 % (8,2 ml), agua (24,6 ml) y se filtró. El filtrado se concentró y el residuo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (éter de petróleo:EtOAc = 2:1) para producir el compuesto del título (19,0 g, 54,3 % de rendimiento) en forma de un sólido blanco.
1H RMN (CDCl3) 54,61 (s ancho, 1 H), 3,45 (d, 2 H), 2,98 (t, 2 H), 1,81 (m, 4 H), 1,44 (m, 11 H), 0,95 (m, 4 H). Etapa 3: ((trans-4-Form¡lc¡clohexil)met¡0carbamato de tert-butilo
Figure imgf000030_0001
A una mezcla de cloruro de oxalilo (11,9 g, 93,7 mmol) en DCM (375 ml) se le añadió una solución de DMSO (11,0 g, 140,5 mmol) en DCM (675 ml) a -65 °C en N2. La mezcla se agitó a -65 °C durante 30 min. A continuación, se añadió una solución de ((trans-4-(hidroximetil)ciclohexil)metil)carbamato de terf-butilo (19,00 g, 78,08 mmol) en DCM (150 ml) a -65 °C. La mezcla se agitó adicionalmente a -65 °C durante otros 30 min. La TLC mostró que se consumió la mayor parte del material de partida. Se le añadió una solución de Et3N (19,4 g, 191,3 mmol) en DCM (75 ml) a -65 °C y se agitó durante 30 min. La mezcla se calentó a 20 °C, se inactivó con una solución de NH4Cl saturado (150 ml) y se extrajo con DCM (300 ml x 3). Las fases orgánicas combinadas se secaron con Na2SO4 anhidro, se filtraron y se concentraron para dar el compuesto del título en bruto (19 g) como un aceite amarillo.
Etapa 4: 2-(((Benc¡lox¡)carbon¡l)am¡no)-3-(trans-4-(((tert-butox¡carbon¡l)am¡no)met¡l)c¡clohex¡l)acr¡lato de metilo
Figure imgf000030_0002
A una mezcla de ((trans-4-formilciclohexil)metil)carbamato de tert-butilo (19,0 g, 78,7 mmol) y 2-(((benciloxi)carbonil)amino)-2-(dimetoxifosforil)acetato de metilo (28,7 g, 86,6 mmol) en DCM (600 ml) se le añadió DBU (18,0 g, 118,1 mmol) en una resto a 20 °C en N2. La mezcla se agitó a 20 °C durante 2 h. La TLC mostró que la reacción se había terminado. La mezcla se lavó con NaHCO3 saturado (300 ml x 2). La capa orgánica se concentró y el residuo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (éter de petróleo:EtOAc = 3:1) para producir el compuesto del título (20 g, rendimiento del 56,9 %) como un aceite incoloro.
1H RMN (CDCl3) 57,35 (m, 5 H), 6,45 (d, 1 H), 6,08 (s ancho, 1 H), 5,15 (s, 2 H), 4,60 (s ancho, 1 H), 3,74 (s, 3 H), 2,97 (m, 2 H), 2,32 (m, 1 H), 1,77 (m, 4 H), 1,45 (s, 9 H), 1,12 (m, 2 H), 0,95 (m, 3 H).
Etapa 5: Ácido 2-(((benc¡lox0carbon¡l)am¡no)-3-(trans-4-(((tert-butox¡carbon¡l)am¡no)met¡0c¡clohex¡0acríl¡co
Figure imgf000030_0003
A una mezcla de 2-(((benciloxi)carbonil)amino)-3-(trans-4-(((tert-butoxicarbonil)amino)metil)ciclohexil)acrilato de metilo (20,0 g, 44,8 mmol) en MeOH (150 ml) se le añadió UOH-H2O (5,6 g, 134,4 mmol) en H2O (50 ml) a 25 °C en N2. La mezcla se agitó a 25 °C durante 16 h. La TLC mostró que la reacción se había terminado. La mezcla se ajustó a pH 3 con HOAc y se concentró para eliminar el MeOH. La fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (50 ml x 3). Las fases orgánicas combinadas se secaron con Na2SO4 anhidro, se filtraron y se concentraron para producir el compuesto del título en bruto (18,00 g) como un aceite incoloro.
Etapa 6: (1-(frans-4-(((ferf-Butox¡carbon¡l)am¡no)met¡l)c¡clohex¡l)-3-((4-(h¡drox¡lmet¡l)fen¡l)am¡no)-3-oxoprop-1-en-2-il)carbamato de bencilo
Figure imgf000030_0004
Una mezcla de ácido 2-(((benciloxi)carbonil)amino)-3-(trans-4-(((terf-butoxicarbonil)amino)metil)ciclohexil)acrílico (18,0 g, 41,6 mmol), alcohol 4-aminobencílico (7,7 g, 62.4 mmol), HAtU (23,7 g, 62,4 mmol) y DIPEA (16,1 g, 124,9 mmol) en DMF (600 ml) se agitaron a 25 °C durante 16 h en N2. La TLC mostró que la reacción se había terminado. La mezcla se diluyó con acetato de etilo (600 ml) y se lavó con una solución de NH4CI saturado (600 ml x 3). La capa orgánica se separó, se secó con Na2SO4 anhidro, se filtró y se concentró. El residuo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (éter de petróleo:EtOAc = 1:1) para proporcionar el compuesto del título (14,00 g, 26,04 mmol, rendimiento del 62,56 %) en forma de un sólido marrón. eM: 538 (MH+).
Etapa 7: ((trans-4-(2-am¡no-3-((4-(h¡drox¡met¡l)fen¡l)am¡no)-3-oxoprop¡l)c¡clohex¡l)met¡l)carbamato de tert-butilo
Figure imgf000031_0001
A una solución de (1-(f/-ans-4-(((te/t-butoxicarbonil)amino)metil)ciclohexil)-3-((4-(hidroxilmetil)fenil)amino)-3-oxoprop-1-en-2-il)carbamato de bencilo (7,0 g, 13,0 mmol) en MeOH (100 ml) se le añadió Pd/C al 10 % (1,0 g) en N2. La suspensión se desgasificó al vacío y se purgó con H2 varias veces. La mezcla se agitó en H2 (15 psi) a 25 °C durante 20 min. La TLC mostró que el material de partida se consumió por completo. La mezcla de reacción se filtró y el filtrado se concentró. El residuo se purificó mediante HPLC preparativa para dar el compuesto del título (1,4 g, rendimiento del 26,3 %) en forma de un sólido blanco. EM: 406 (MH+)
Intermed¡o 7 comparat¡vo
Figure imgf000031_0002
C¡t-ABA-PAB-OH
Etapa 1: Ácido 4-((((9H-fluorén-9-¡l)metox¡)carbon¡l)am¡no)butano¡co
Figure imgf000031_0003
A una mezcla de ácido 4-aminobutanoico (5,0 g, 48,5 mmol, 1 eq) en Na2CO3 acuoso al 10 % (16,5 g, 155,7 mmol, 3,2 eq, 150 ml de H2O) se le añadió gota a gota una solución de carbonoclorhidato de (9H-fluorén-9-il)metilo (13,8 g, 53,3 mmol, 1,1 eq) en dioxano (100 ml) a 0 °C durante un período de 10 min en N2. La mezcla se agitó a 20 °C durante 4 h. La TLC mostró que la reacción se había terminado. La mezcla se separó y se ajustó a pH 2-3 con HCl a 2 M y se extrajo con EtOAc (250 ml x 3). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera saturada (150 ml x 2), se secaron sobre Na2SO4 anhidro, se filtraron y se concentraron al vacío para producir el compuesto del título en bruto (16 g) como un sólido blanco. CL-EM: 326,1 (MH+)
Etapa 2: (4-((4-(h¡drox¡met¡l)fen¡l)am¡no)-4-oxobut¡l)carbamato de (9H-fluorén-9-¡nmet¡lo
Figure imgf000031_0004
A una solución de ácido 4-((((9H-fluorén-9-il)metoxi)carbonil)amino)butanoico (16,0 g, 49 mmol, 1 eqj en DMF (200 ml) y luego HATU (20,6 g, 54,1 mmol, 1,1 eq) y DIPEA (19,1 g, 147,5 mmol, 3 eq) a 20 °C, y se agitó durante 30 min. A continuación, se le añadió alcohol 4-aminobencílico (7,3 g, 59,0 mmol, 1,2 eq) en una resto a 20 °C. La mezcla se agitó a 20 °C durante 16 h. La TLC mostró que la reacción se había terminado. La mezcla de reacción se concentró al vacío. El residuo se lavó con TBME (300 ml x 3), se filtró y se concentró para producir el compuesto del título en bruto (15 g) como un sólido amarillo. CL-EM: 431,2 (MH+)
Etapa 3: 4-Am¡no-N-(4-(h¡drox¡met¡l)fen¡l)butanam¡da
Figure imgf000031_0005
A una solución de (4-((4-(hidroximetil)fenil)amino)-4-oxobutil)-carbamato de (9H-fluorén-9-il)metilo (5,0 g, 11,6 mmol, 1 eq) en DMF (40 ml) se le añadió piperidina (7,9 g, 92,9 mmol, 8 eq) en una resto a 20 °C. A continuación, la mezcla se agitó a 20 °C durante 3 h. La TLC (DCM:MeOH = 5:1) mostró que el material de partida se consumió por completo. La mezcla de reacción se concentró para dar el compuesto del título en bruto (5 g) como un sólido amarillo. CL-EM: 209,1 (MH+)
Etapa 4: Fmoc-Cit-ABA-PAB-OH
Figure imgf000032_0001
A una solución de 4-amino-N-(4-(hidroximetil)fenil)butanamida (600 mg, 2,9 mmol, 1 eq) y Fmoc-cit (1,3 g, 3,2 mmol, 1,1 eq) en DCM (8 ml) se le añadió lentamente una solución de EEDQ (1,4 g, 5,8 mmol, 2 eq) en MeOH (8 ml) a 20 °C. La mezcla se agitó a 20 °C durante 16 h. La TLC (DCM:MeOH = 5:1) mostró que la reacción se había terminado. La mezcla de reacción se concentró y el residuo se purificó mediante TLC preparativa (SiO2 , DCM:MeOH = 5:1) para dar el compuesto del título (440 mg, rendimiento del 26 %) como un sólido blanco. CL-EM: 588,3 (MH+)
Etapa 5: Cit-ABA-PAB-OH
Figure imgf000032_0002
A una solución de Fmoc-Cit-ABA-PAB-OH (440 mg, 749 umol, 1 eq) en DMF (10 ml) se le añadió piperidina (510 mg, 6 mmol, 8 eq) en una resto a 20 °C. La mezcla se agitó a 20 °C durante 3 h. La TLC (DCM:MeOH = 5:1) mostró que la reacción se había terminado. La mezcla de reacción se concentró y el residuo se purificó mediante TLC preparativa (SiO2 , DCM:MeOH = 5:1) para dar el compuesto del título en bruto (320 mg) como un sólido blanco. CL-EM: 366,2 (MH+)
Ejemplo comparativo 1
Figure imgf000032_0003
MTMH-Val-Cit-PABO(CO)-MMAE
Etapa 1: MTMH-Val-Cit-PAB-OH
Figure imgf000032_0004
A una solución de (2S)-2,5-dioxopirrolidín-1 -il-2-{[7-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1 -il)-1,1,1 -trifluoro-heptán-2-il]amino}-3-metilbutanoato (intermedio 1) (0,56 mmol) en DMF (5 ml) se le añadió Cit-PAB-OH (intermedio 4) (0,56 mmol) en N2. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 16 h. Se eliminó el solvente al vacío. El residuo oleoso espeso se lavó con éter de tert-butilo y metilo (10 ml x 2) para dar el compuesto del título en bruto, que se usó para la etapa siguiente sin purificación adicional. CL-EM (ESI): 627,3 (MH+)
Etapa 2: Carbonato de MTMH-Val-Cit-PAB y (4-nitrofenilo)
Figure imgf000033_0001
A una solución de MTMH-Val-Cit-PAB-OH (260 mg en bruto, 0,56 mmol) en DMF (3 ml) se le añadió bis(4-nitrofenil)carbonato (340 mg 1,12 mmol) y DIPEA (108 mg, 0,84 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 hora y se concentró. El residuo se lavó con éter de tert-butilo y metilo (10 ml x 2) para dar el compuesto del título, que se usó directamente para la siguiente etapa sin purificación adicional. Cl-EM (ESI): 792,3 (MH+)
Etapa 3: MTMH-Val-Cit-PABO(CO)-MMAE
Figure imgf000033_0002
A una solución de MMAE (0,28 mmol) y carbonato de MTMH-Val-Cit-PAB y (4-nitrofenilo) (0,56 mmol) en DMF anhidra (2,5 ml) se le añadió HOBt (23 mg, 0,17 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente durante 2 min, se le añadió piridina (0,5 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas y luego se concentró. El residuo se purificó mediante HPLC preparativa para dar el compuesto del título (40 mg, 10,4%) como un sólido blanco, CL-EM (ESI): = 685,9 [(M/2) H+]
Ejemplo 2
Figure imgf000033_0003
(S)-MTMH-Val-Cit-PABO(CO)-MMAE
Etapa 1: (S)-MTMH-Val-Cit-PAB-OH
Figure imgf000033_0004
Una mezcla de (S)-MTMH-Val (intermedio 3) (300 mg, 823 umol, 1 eq), HOBt (133.5 mg, 988 umol, 1,20 eq), EDCI (189 mg, 988 umol, 1,20 eq), DIPEA (426 mg, 3,3 mmol, 4 eq) y Cit-PAB-OH (intermedio 4) (277 mg, 988 umol, 1,20 eq) en DMF (10 ml) se agitó a 30 °C durante 6 h. La TLC mostró que la reacción se había terminado. La mezcla se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante TLC preparativa (EtOAc:MeOH = 10:1) para producir el compuesto del título (410 mg, rendimiento del 52,3 %) en forma de un sólido blanco. EM: 627 (MH+)
Etapa 2: Carbonato de (S)-MTMH-Val-Cit-PAB y (4-nitrofenilo)
Figure imgf000034_0001
A una mezcla de (S)-MTMH-Val-Cit-PAB-OH (250 mg, 399 umol, 1 eq) en DMF (10 ml) se le añadió DIPEA (77 mg, 598 umol, 1,5 eq) y carbonato de bis(4-nitrofenilo) (243 mg, 798 umol, 2,0 eq) en una resto a 25 °C en N2. La mezcla se agitó a 25 °C durante 15 h. La CL-EM mostró que la reacción se había terminado. La mezcla se concentró al vacío. El residuo se purificó por TLC preparativa (EtOAc) para producir el compuesto del título (185 mg, 58,6 % de rendimiento) como un sólido blanco. EM: 792 (MH+)
Etapa 3: (S)-MTMH-Val-Cit-PABO(CO)-MMAE
Figure imgf000034_0002
A una mezcla de MMAE (200 mg, 279 umol, 1 eq) y carbonato de (S)-MTMH-Val-Cit-PAB y (4-nitrofenilo) (250 mg, 316 umol, 1,13 eq) en DMF (10 ml) se le añadió HOBt (25 mg, 185 umol, 0,66 eq) y piridina (980 mg, 12,4 mmol, 44,5 eq) en una resto a 25 °C en N2. Y luego se dejó agitar la mezcla de reacción a 25 °C durante 15 h. La CL-EM mostró que la reacción se había terminado. La mezcla se diluyó con EtOAc (200 ml) y se lavó con agua (150 ml x 3). La capa orgánica se concentró para dar el residuo que se purificó por HPLC preparativa (FA) para dar el compuesto del título (109 mg, 30 % de rendimiento) como un sólido blanco. CL-EM (ESI): 686 [(M/2) H+]
Ejemplo comparativo 3
Figure imgf000034_0003
(R)-MTMH-Val-Cit-PABO(CO)-MMAE
El compuesto del título se preparó de una manera similar a la descrita para (S)-MTMH-Val-Cit-PABO(CO)-MMAE (ejemplo 2), etapas 1 a 3, a partir de (R)-MTMH-Val (intermedio 2) y Cit-PAB-OH (intermedio 4). CL-EM (ESI): 686,1 [(M/2) H+]
Ejemplo comparativo 4
Figure imgf000034_0004
(R)-MTMH-DP1 -PABO(CO)-MMAE
Etapa 1: (R)-MTMH-DP1-PAB-OH
Figure imgf000035_0001
A una solución de (S)-MTMH-Val (intermedio 2) (350 mg, 0,96 mmol) en DMF (15 ml) se le añadió HOBt (155,75 mg, 1,15 mmol), EDCI (220,97 mg, 1,15 mmol), DIPEA (496,59 mg, 3,84 mmol) y (S)-2-amino-N-(4-(hidroximetil)fenil)-5-morfolinopentanamida (intermedio 5) (390 mg, 1,1 mmol) en N2 y luego se agitó a 25 °C durante 6 h. La mezcla de reacción se evaporó a sequedad y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna (EtOAc:MeOH = 10:1) para producir el compuesto del título (400 mg, rendimiento del 63,70 %). EM: 654 (MH+)
Etapa 2: Carbonato de (R)-MTMH-DP1-PAB y (4-nitrofenilo)
Figure imgf000035_0002
A una solución de (R)-MTMH-DP1-PAB-OH en DMF (10 ml) se le añadió DIEA (77,10 mg, 0,597 mmol) y carbonato de bis(4-nitrofenilo) (349 mg, 1,15 mmol) en N2. La mezcla se agitó a 25 °C durante 16 h y se evaporó hasta la sequedad. El residuo se purificó mediante TLC preparativa (EtOAc) para producir el compuesto del título (300 mg, rendimiento del 79,84 %). EM: 819 (MH+)
Etapa 3: (R)-MTMH-DP1-PABO(CO)-MMAE
Figure imgf000035_0003
A una solución de carbonato de (R)-MTMH-DP1-PAB y (4-nitrofenilo) (200 mg, 0,244 mmol) en DMF (4 ml) se le añadió MMAE (200 mg, 0,278 mmol), HOBt (10 mg, 0,074 mmol) y piridina (0,8 ml) en N2. La mezcla se agitó a 25 °C durante 16 h, se diluyó con EtOAc (50 ml), se lavó con agua (20 ml x 2), salmuera (20 ml) y se concentró. El residuo se purificó mediante HPLC preparativa (FA) para producir el compuesto del título (160 mg, rendimiento del 46,87 %). CL-EM (ESI): 699,5 [(M/2) H+]
Ejemplo comparativo 5
Figure imgf000035_0004
(R)-MTMH-DP2-PABO(CO)-MMAE
El compuesto del título se preparó de manera similar a (R)-MTMH-DP1-PAB(CO)-MMAE (ejemplo 4), pero con piperidina para reemplazar la morfolina del intermedio 5 para el intermedio correspondiente requerido. CL-EM (ESI): 698,6 [(M/2) H+]
Ejemplo comparativo 6
Figure imgf000036_0001
(R)-MTMH-DP3-PABO(CO)-MMAE
Etapa 1: (R)-MTMH-Boc-DP3-PAB-OH
Figure imgf000036_0002
A una mezcla de (S)-MTMH-Val (intermedio 2) (225,0 mg, 617,5 umol) en DMF (12 ml) se le añadió HOBt (108,5 mg, 802,8 umol), EDCI (153,9 mg, 802,8 umol) y DIEA (239,4 mg, 1,9 mmol) a 25 °C en N2. Al cabo de 5 min, se le añadió ((trans-4-(2-amino-3-((4-(hidroximetil)fenil)amino)-3-oxopropil)ciclohexil)metil)carbamato de tert-butilo (intermedio 6) (300,5 mg, 741,0 umol) y la mezcla se agitó a 25 °C durante 4 h más. La TLC mostró que se consumió la mayor parte del material de partida. La mezcla se diluyó con EtOAc (20 ml), se lavó con una solución de NH4G saturado (30 ml x 3) y se concentró. El residuo se purificó mediante TLC preparativa y luego SFC para dar el compuesto del título (pico 1: 140 mg, rendimiento del 30 %) como un sólido blanco.
Etapa 2: (R)-MTMH-Boc-DP3-PABO(CO)-MMAE
Figure imgf000036_0003
El compuesto del título se preparó de una manera similar a la descrita para (S)-MTMH-Val-Cit-PABO(CO)-MMAE (ejemplo 2), etapas 2 a 3, a partir de (R)-MTMH-Boc-DP3-PAB-OH. CL-EM [((M-100)/2) H+]: 698.5
Etapa 3: (R)-MTMH-DP3-PAB-MMAE
Figure imgf000036_0004
A una mezcla de (R)-MTMH-Boc-DP3-PABO(CO)-MMAE (200,00 mg, 133,70 umol) en CH3CN (4,25 ml) y H2O (0,25 ml) se le añadió TFA (0,5 ml) en una resto a 25 °C. La mezcla se agitó a 25-29 °C durante 16 h. La CL-EM mostró que la reacción se había completado. La mezcla se concentró a presión reducida a 40 °C. El residuo se purificó por HPLC preparativa (FA), sin concentración adicional y se liofilizó directamente para dar el compuesto del título (105,00 mg, 56,3 % de rendimiento) como un sólido blanco. CL-EM: 698,7 [(M/2) H+]
Ejemplo 7
Figure imgf000037_0001
(S)-MTMH-Val-Cit-PABO(CO)-ABA-M MAE
Etapa 1: (S)-MTMH-Val-Cit-PABO(CO)-ABA
Figure imgf000037_0002
A una mezcla de carbonato de (S)-MTMH-Val-Cit-PAB y (4-nitrofenilo) (420 mg, 531 umol, 1 eq) y ácido 4-aminobutanoico (109 mg, 1,1 mmol, 2 eq) en DMF (8 ml) se le añadió DIPEA (205 mg, 1,6 mmol, 3 eq) en una resto a 20 °C en N2. Y luego se dejó agitar la mezcla de reacción a 20 °C durante 12 h. La TLC (diclorometano:metanol = 10:1) mostró que la reacción se había completado. La mezcla se diluyó con EtOAc (50 ml), se lavó con agua (50 ml) y se concentró al vacío. El residuo se purificó mediante TLC preparativa (DCM/MeOH = 10:1) para dar el compuesto del título (236 mg, 46,47 % de rendimiento, ~79% de pureza) como un sólido blanco. EM: 756,3 (MH+)
Etapa 2: (S)-MTMH-Val-Cit-PABO(CO)-ABA-MMAE
A una mezcla de (S)-MTMH-Val-Cit-PABO(CO)-ABA (50 mg, 66 umol, 1 eq) y DIEA (26 mg, 198 umol, 3 eqj en DMF (3 ml) se le añadió HATU (30 mg, 79 umol, 1,2 eq) en una resto a 10 °C en N2. La mezcla se agitó a 10 °C durante 30 min, luego se le añadió MMAE (47,5 mg, 66 umol, 1 eq) y la mezcla se agitó a 28 °C durante 12 h más. La CL-EM mostró que la reacción se había terminado. La mezcla se concentró y el residuo se purificó por HPLC preparativa (columna, Phenomenex Synergi C18 150*25*10 um; condición, 0,225 % FA-CAN; comienzo B, 45; fin B, 75; duración del gradiente (min), 10; tiempo de retención en B al 100 % (min), 2; velocidad de flujo (ml/min), 25) para dar el compuesto del título (25 mg, rendimiento del 26 %) como un sólido blanco. CL-EM: 728,7 [(M/2) H+]
Ejemplo 8
Figure imgf000037_0003
(S)-MTMH-Val-Cit-ABA-PABO(CO)-MMAE
Etapa 1: (S)-MTMH-Val-Cit-ABA-PAB-OH
Figure imgf000038_0001
A una solución de (S)-MTMH-Val (intermedio 3) (383 mg, 1,05 mmol, 1,2 eq) en DMF (8 ml) se le añadió DIPEA (453 mg, 3,50 mmol, 4 eq), HOBt (142 mg, 1,05 mmol, 1,2 eq) y EDCI (202 mg, 1,05 mmol, 1,2 eq) en una resto a 20 °C y se agitó durante 10 min en N2. El Cit-ABA-PAB-OH (intermedio 7) (320 mg, 876 umol, 1 eq) se añadió en una resto a 20 °C y la mezcla se agitó adicionalmente a 20 °C durante 16 h en N2. La TLC (DCM:MeOH = 5:1) mostró que la reacción se había terminado. La mezcla de reacción se concentró y el residuo se purificó mediante TLC preparativa (SiO2 , DCM:MeOH = 5:1) para dar el compuesto del título en bruto (370 mg). CL-EM: 712,2 (MH+)
Etapa 2: carbonato de (S)-MTMH-Val-Cit-ABA-PAB y (4-nitrofenilo)
Figure imgf000038_0002
A una solución de (S)-MTMH-Val-Cit-ABA-PAB-OH (370 mg, 520 umol, 1 eq) en DMF (10 ml) se le añadió DIPEA (80,6 mg, 624 umol, 1,2 eq) a 20 °C, se le añadió carbonato de bis(4-nitrofenilo) (206 mg, 676 umol, 1,3 eq) en una resto a 20 °C en N2. La mezcla se agitó a 20 °C durante 16 h. La TLC (DCM:MeOH = 10:1) mostró que el material de partida se consumió por completo. La mezcla se concentró y el residuo se purificó mediante TLC preparativa (SiO2 , DCM:MeOH = 10:1) para dar el compuesto del título (70 mg, 79,83 umol, rendimiento del 15,36 %) como un aceite amarillo. CL-EM: 877,3 (MH+)
Etapa 3: (S)-MTMH-Val-Cit-ABA-PABO(CO)-MMAE
Figure imgf000038_0003
A una solución de carbonato de (S)-MTMH-Val-Cit-ABA-PAB y (4-nitrofenilo) (70 mg, 80 umol, 1 eq) y MMAE (57,3 mg, 79,8 umol, 1 eq) en DMF (6 ml) se le añadió HOBt (5,4 mg, 39,9 umol, 0,5 eq) y piridina (63,1 mg, 798 umol, 10 eq) a 20 °C. La mezcla se agitó a 20 °C durante 16 h. La TLC (DCM:MeOH = 10:1) mostró que la reacción se había terminado. La mezcla se concentró al vacío y el residuo se purificó por HPLC preparativa (condición FA; columna: Phenomenex Synergi Max-RP 250*8010u; condición: 0,225 % FA-ACN; comienzo de B: 40; fin de B: 70) para producir el compuesto del título (40,8 mg, 48,6 % de rendimiento) como un sólido blanco. CL-EM: 728,5 [(M/2) H+].
Ejemplo comparativo 9
Figure imgf000039_0001
Se acoplaron Herceptin (240 mg) y el intermedio fármaco-conector MTMH-Val-Cit-PAB-OH (11,3 mg), ejemplo 1, de acuerdo con el procedimiento general para la conjugación del intermedio fármaco-conector a Herceptin para dar el CAF del título (168 mg, 70 %).
Se prepararon otros ejemplos de CAF con Herceptin de una manera similar al ejemplo 9 comparativo:
Figure imgf000040_0001
Figure imgf000041_0001
Los ejemplos de CAF con Erbitux también se prepararon de manera similar al ejemplo 9:
Ċ
Figure imgf000043_0001
Cribado de unidades dipeptídicas idóneas para los intermedios fármaco-conector
Se desarrolló un método cómodo para identificar las unidades dipeptídicas idóneas para su uso en los intermedios fármaco-conector . Se prepararon dipéptidos protegidos con Cbz que incorporaron una etiqueta fluorescente (7-amino-4-metilcuramina, 7-AMC) mediante un fragmento de para-aminobencilcarbonilo mediante la química de péptidos estándar, tal y como se muestra en el esquema 1. Estos sustratos dipeptídicos se incubaron luego con catepsina B bovina en una condición similar a la descrita por Dubowchik (Biorg. Med. Chem. Lett. 1998, 8, 3341 -3346). La velocidad de hidrólisis por catepsina B bovina se midió mediante la liberación de 7-AMC (tabla 1). Se rechazaron los nuevos dipéptidos con una velocidad de hidrólisis más lenta que la del sustrato A . Se seleccionaron las tres unidades dipeptídicas de FS-9, FS-10 y FS-11 como unidades dipeptídicas adicionales para la preparación de los intermedios fármaco-conector.
Figure imgf000044_0001
Figure imgf000044_0002
Figure imgf000045_0001
Figure imgf000046_0001
Estudio de citotoxicidad in vitro
(a) Línea celular de cáncer de mama HCC1954
La línea celular de cáncer de mama HCC1954 se cultivó en el medio RPMI1640 complementado con suero bovino fetal al 10 % y se mantuvo en una atmósfera de CO2 al 5 % en una incubadora humidificada a 37 °C.
El día antes del tratamiento, se recogieron las células y se sembraron en placas de 96 pocillos (2000 células por pocillo). El segundo día, las células se trataron con una concentración diluida de Herceptin y los CAF de esta invención (1,0,3333, 0,1111,0,037, 0,0123, 0,0041,0,0014, 0,00046 y 0,00015 pg/ml). Cada tratamiento se realizó por triplicado. Al cabo de 72 h de tratamiento, se valoró la viabilidad celular mediante el kit Cell Titer-Glo (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
El estudio se comparó con un CAF de control (ADC-HA) con el enlace amida normal en el centro del carbono que lleva el grupo trifluorometilo.
Figure imgf000047_0001
(b) Línea celular A-431
La línea celular de carcinoma epidermoide A431 se cultivó en el medio DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10 % y se mantuvo en una atmósfera de CO2 al 5 % en una incubadora humidificada a 37 °C.
El día antes del tratamiento, se recogieron las células y se sembraron en placas de 96 pocillos (2000 células por pocillo). El segundo día, las células se trataron con una concentración diluida de Erbitux y los CAF de esta invención (10, 3,33, 1,11,0,37, 0,123, 0,041,0,014, 0,0046 y 0,0015 pg/ml). Cada tratamiento se realizó por triplicado.
Al cabo de 72 horas de tratamiento, se valoró la viabilidad celular mediante el kit Cell Titer-Glo (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
El estudio se comparó con un CAF de control (ADC-EA) con el enlace amida normal en el centro del carbono que lleva el grupo trifluorometilo.
Figure imgf000047_0002
(a) Modelo de ratones con xenoinjerto de HCC1954
A las ratonas hembra NOD-SCID de 7 a 8 semanas de edad se inyectaron por vía subcutánea las células HCC1954. El tratamiento se inició 7 días después de la inyección de las células una vez que la masa tumoral media estimada alcanzó los 153 mm3. Las ratonas se agruparon aleatoriamente de acuerdo con el volumen del tumor y el peso corporal (8 animales por grupo). Los animales se trataron con los CAF de esta invención (15 mpk), Herceptin (15 mpk), así como el control de vehículo el día 0 y el día 15. Los animales se sacrificaron el día 28 después del inicio del tratamiento, cuando el volumen tumoral del grupo de control con el vehículo alcanzó una masa de 1092 mm3.
(b) Modelo de ratones con xenoinjerto de A-431
A las ratonas atímicas hembra Balb/c de 6 a 8 semanas de edad se les inyectaron por vía subcutánea las células A431. El tratamiento se inició 10 días después de la inyección de las células una vez que la masa tumoral media estimada alcanzó los 172 mm3. Las ratonas se agruparon aleatoriamente de acuerdo con el volumen del tumor y el peso corporal (8 animales por grupo). Los animales se trataron con los CAF de esta invención (10 mpk), Erbitux (10 mpk), así como el control del vehículo el día 0 y el día 15. Los animales se sacrificaron el día 25 después del inicio del tratamiento, cuando el volumen del tumor del grupo de control con el vehículo alcanzó una masa de 2000 mm3.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un conector de fórmula (I) para conectar fármacos a los anticuerpos,
Figure imgf000049_0001
en donde
el resto de
Figure imgf000049_0002
es
Figure imgf000049_0003
L2 es una unidad dipeptídica seleccionada de
Figure imgf000049_0004
R8 se selecciona del grupo que consiste en metilo, propilo, isopropilo, sec-butilo, bencilo y
Figure imgf000049_0005
R9 se selecciona del grupo que consiste en (CH2)4NH2, (CH2)3NHCONH2, (CH2)3NHC(=NH)NH2,
Figure imgf000049_0006
s es 0, 1, 2, 3 o 4;
L3 es una unidad autoinmolativa seleccionada del grupo que consiste en
Figure imgf000050_0001
R10 se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo(Ci-3) opcionalmente sustituido con 1, 2 o 3 de los sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en halógeno, OH, NH2 , NHMe y NMe2 ; cada R11 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H y alquilo(C1-3) opcionalmente sustituido con 1,2 o 3 de los sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en halógeno, OH, NH2, NHMe y NMe2 ;
dos R11 geminales pueden estar opcionalmente unidos para formar un anillo de 3 a 6 miembros con un átomo de carbono al que están unidos;
dos R11 adyacentes pueden estar opcionalmente unidos para formar un anillo de 5 a 7 miembros con un átomo de carbono al que están unidos;
R12 se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo(C1-3) opcionalmente sustituido con 1, 2 o 3 de los sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en halógeno, OH, NH2 , NHMe y NMe2 ; y R13 se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo(C1-3) opcionalmente sustituido con 1, 2 o 3 de los sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en halógeno, OH, NH2 , NHMe y NMe2.
2. Un conjugado de fármaco y conector de fórmula (II),
Figure imgf000050_0002
en donde
el resto de
Figure imgf000050_0003
es
Figure imgf000050_0004
M es un fármaco; y
otras variables son tal y como se definen en la reivindicación 1.
3. Un conjugado de anticuerpo y fármaco (CAF) de fórmula (III) que contiene el conector de la reivindicación 1
Figure imgf000051_0001
en donde
Y es un anticuerpo;
a es un número entero o decimal seleccionado de 1 a 8;
opcionalmente, a es 1,2, 3, 3,4, 3,5, 4, 4,2, 5, 6, 7 u 8;
M es un fármaco; y
otras variables son tal y como se definen en la reivindicación 1.
4. El conector de la reivindicación 1 o el CAF de la reivindicación 3, en donde el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo monoclonal resuperficializado, un anticuerpo monoclonal monocatenario resuperficializado, o un fragmento de anticuerpo monoclonal resuperficializado que se fija opcionalmente a una célula diana;
o el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo monoclonal humanizado, un anticuerpo monoclonal monocatenario humanizado, o un fragmento de anticuerpo monoclonal humanizado;
o el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo quimérico, un fragmento de anticuerpo quimérico, un anticuerpo de dominio, o un fragmento de anticuerpo de dominio del mismo;
o el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en MY9, anti-B4, EpCAM, CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD11, CD19, CD20, CD22, CD26, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD44, CD56, CD79, CD105, CD138, receptores de EphA, receptores de EphB, EGFR, EGFRvIII, HER2, HER3, mesotelina, cripto, integrina av03, av05, av06 o C242; o el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en My9-6, B4, C242, N901, DS6, receptor EphA2, CD38, IGF-IR, CNTO 95, B-B4, trastuzumab, tertuzumab, bevatuzumab, sibrotuzumab, rituximab y adalimumab;
o el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en Herceptin y Erbitux;
y/o el anticuerpo se fija a las células diana seleccionadas entre células tumorales; células infectadas por virus, células infectadas por microorganismos, células infectadas por parásitos, células autoinmunitarias, células activadas, células mieloides, linfocitos T activados, linfocitos B o melanocitos; células que expresan uno o más de IGF-IR, CanAg, EGFR, MUCI, MUCI 6, VEGF, TF, MY9, anti-B4, EpCAM, CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD11, CD11a, CD18, CD19, CD20 , CD22, CD26, CD30, CD33, CD37, CD38, CD40, CD44, CD56, CD70, CD79, CD105, CD138, receptores de EphA, receptores de EphB, EGFRvlll, HER2/neu, HER3, mesotelina, cripto, integrina av03, integrina av05, integrina av06, Apo2 y los antígenos de C242; o las células que expresan el receptor del factor de crecimiento insulínico, el receptor del factor de crecimiento epidérmico y el receptor de folato, concretamente las células tumorales se seleccionan entre células de cáncer de mama, células de cáncer de próstata, células de cáncer de ovario, células de cáncer colorrectal, células de cáncer de estómago, células de cáncer escamoso, células de cáncer de pulmón microcítico y células de cáncer de testículo.
5. El conector de la reivindicación 1, el conjugado de fármaco y conector de la reivindicación 2, o el CAF de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el fármaco es un fármaco citotóxico,
opcionalmente, el fármaco se selecciona del grupo que consiste en maitansinoide, fármaco de unión al ADN y su análogo, caliqueamicina, doxorrubicina y su análogo, alcaloide de vinca, criptoficina, dolastatina, auristatina y análogo de los mismos, tubulisina, epotilona, taxoide y siRNA,
más opcionalmente, el fármaco de unión al ADN es CC-1065,
más opcionalmente, M se selecciona del grupo que consiste en
Figure imgf000052_0001
o el fármaco es un reactivo de diagnóstico o detección, opcionalmente el fármaco es un compuesto radiomarcado, opcionalmente el fármaco está marcado con 3H, 18F, 11C, 13N, 15O, 201Tl, 32P, 51Cr, 67Ga, 123I, 125I, 131I, 132I, 131Cs, 113Xe, 133Xe, 169Yb, 198Au, 203Hg, 99mTc, 113mIn, 133mIn, 75Se, 186Re, 153Sm y 89Sr.
6. El conector de la reivindicación 1, el conjugado de fármaco y conector de la reivindicación 2, o el CAF de la reivindicación 3, en donde L2 se selecciona del grupo que consiste en
Figure imgf000052_0003
opcionalmente L2 se selecciona del grupo que consiste en
Figure imgf000052_0002
y/o el anillo formado por dos R11 geminales o dos R11 adyacentes es ciclohexilo.
7. El conector de la reivindicación 1, el conjugado de fármaco y conector de la reivindicación 2, o el CAF de la reivindicación 3, en donde L3 se selecciona del grupo que consiste en
Figure imgf000053_0001
8. El conector de la reivindicación 1 o el CAF de la reivindicación 3, en donde el conector se selecciona del grupo que consiste en
Figure imgf000053_0002
9. El conjugado de fármaco y conector de la reivindicación 2, se selecciona del grupo que consiste en
Ċ
Figure imgf000054_0001
y
Figure imgf000055_0001
10. El CAF la reivindicación 3, se selecciona del grupo que consiste en
Figure imgf000055_0002
Figure imgf000056_0001
Y es un anticuerpo, a es un número entero o decimal seleccionado de 1 a 8, opcionalmente a es 1,2, 3, 3,4, 3,5, 4, 4,2, 5, 6, 7 u 8;
opcionalmente, el CAF se selecciona del grupo que consiste en
Figure imgf000057_0001
y a es un número entero o decimal seleccionado de 2 a 6, opcionalmente a es 2, 3, 3,4, 3,5, 4, 4,2, 5 o 6.
11. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz del CAF de al menos una de las reivindicaciones 3 a 10, y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
12. El CAF de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 3 a 10 o la composición farmacéutica la reivindicación 11, para su uso en el tratamiento de los cánceres.
13. Un compuesto intermedio para la síntesis del conjugado de fármaco y conector de fórmula (II) en la reivindicación 2 o el CAF de fórmula (III) en la reivindicación 3, que tiene una estructura de
Figure imgf000058_0001
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