ES2862167T3

ES2862167T3 - Preparación apirógena que contiene nanopartículas sintetizadas por una bacteria magnetotáctica para aplicaciones médicas o cosméticas

Info

Publication number: ES2862167T3
Application number: ES16744434T
Authority: ES
Inventors: Edouard Alphandery; Mickaël Durand-Dubief
Original assignee: Nanobacterie
Current assignee: Nanobacterie
Priority date: 2015-06-17
Filing date: 2016-06-15
Publication date: 2021-10-07
Anticipated expiration: 2036-06-15
Also published as: AU2016277897A1; EP3286139A1; JP6885597B2; CA2985163A1; US10980833B2; US20190328777A1; IL255435B; KR20200105963A; EP3286139B1; IL255435A0; KR20180019535A; US10391122B2; JP2018521975A; CA2985163C; CN107708735A; AU2016277897B2; US11759478B2; US20210196752A1; KR102229432B1; FR3037581A1

Abstract

Preparación que comprende por lo menos una nanopartícula sintética, en la que la nanopartícula comprende: - una parte central mineral cristalizada que comprende principalmente un óxido de hierro sintetizado por un organismo vivo, y - un recubrimiento periférico que comprende menos del 10% de material orgánico no desnaturalizado procedente del organismo vivo o que no comprende proteínas procedentes del organismo vivo, en el que dicho organismo vivo es una bacteria magnetotáctica.

Description

DESCRIPCIÓN

Preparación apirógena que contiene nanopartículas sintetizadas por una bacteria magnetotáctica para aplicaciones médicas o cosméticas.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

El campo de la invención es el de las nanopartículas sintéticas de origen bacteriano, modificadas, utilizables en medicina o en cosmética.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Las bacterias magnetotácticas sintetizan nanopartículas de óxido de hierro, denominadas magnetosomas, que poseen propiedades extraordinarias debido, por un lado, a la presencia de una parte central mineral cristalizada de gran tamaño, típicamente del orden de 20 a 120 nm de diámetro, que les confiere propiedades ferromagnéticas ventajosas, y, por otro, a su organización en cadenas que permite evitar la agregación de los magnetosomas. Estas nanopartículas de origen bacteriano presentan propiedades magnéticas ventajosas en comparación con las nanopartículas resultantes de la síntesis química. Por ejemplo, para una concentración equivalente en hierro y cuando se exponen a la aplicación de un campo magnético alterno, las suspensiones de cadenas de magnetosomas extraídas de bacterias magnetotácticas producen más calor que las nanopartículas químicas utilizadas habitualmente para la hipertermia magnética, como las nanopartículas de óxido de hierro superparamagnéticas (SPION) y las nanopartículas de óxido de hierro ferromagnéticas (FION). Cuando estas suspensiones se administran a tumores de cáncer de mama xenoinjertados bajo la piel de ratones y se exponen a varias aplicaciones de un campo magnético alterno, se induce una actividad antitumoral (Alphandéry et al., AcsNano, V. 5, P. 6279 (2011)). Además, para una concentración equivalente en hierro, esta actividad antitumoral es mayor que la observada con SPION o FION.

Sin embargo, estas cadenas de magnetosomas proceden de bacterias gramnegativas y, por tanto, pueden presentar en algunos casos una alta concentración de endotoxinas, así como material biológico, que es difícil de caracterizar con precisión. La presente invención tiene por tanto como objetivo proporcionar un método de producción de magnetosomas que permita solventar estos inconvenientes.

Xie, J. et al, Production, modification and bio-applications of magnetic nanoparticles gestated by magnetotactic bacteria (Nano Res 2, 261-278 (2009)) es una revisión de la historia del descubrimiento de las bacterias magnetotácticas y sobre los esfuerzos posteriores para elucidar los mecanismos de formación de magnetosomas. Se hace hincapié en la forma de utilizar los conocimientos adquiridos gracias a los estudios fundamentales para fabricar nanopartículas funcionales capaces de resolver problemas biomédicos reales.

DESCRIPCIÓN

La presente invención es el resultado de la demostración inesperada por parte del/ de los inventor(es) de que era posible sustituir el recubrimiento natural que rodea a los magnetosomas por otro recubrimiento para obtener nanopartículas sintéticas apirógenas, que pueden utilizarse en la medicina, el diagnóstico y/o la cosmética.

Por consiguiente, la presente invención se refiere a una preparación que comprende por lo menos una nanopartícula sintética, en la que la nanopartícula comprende:

Una parte central mineral cristalizada que comprende predominantemente un óxido de hierro sintetizado por un organismo vivo, y

Un recubrimiento circundante que comprenda menos del 10% de material orgánico no desnaturalizado procedente del organismo vivo o que no comprende proteínas procedentes del organismo vivo, en el que dicho organismo vivo es una bacteria magnetotáctica.

La preparación según la invención puede comprender por lo menos 1, 2 , 3 , 5, 10, 100, 103, 104, 105, 10®, 107, 108, 109 nanopartículas sintéticas contenidas en un volumen de jLim 3, 1 mm3, o 1 dm3 Puede ser una suspensión de nanopartículas sintéticas, preferiblemente contenida en un medio líquido, o puede ser un conjunto de nanopartículas sintéticas contenidas en un medio líquido, sólido o gaseoso.

La presente invención también se refiere a una parte central cristalizada que comprende predominantemente un óxido de hierro sintetizado por un organismo vivo, y que no contiene ningún recubrimiento.

Una nanopartícula sintética es una partícula cuyo tamaño en por lo menos una dimensión es inferior a 10, 5, 2, 5 o 1 pm, preferentemente 750, 500, 400 o 300 ásmpreríierentemente 200 o 1 00 nm, que se encuentra preferentemente en estado sólido y cuyo tamaño es especialmente cuantificable por microscopía electrónica de transmisión (MET). La palabra "sintética" indica que la nanopartícula ha sido fabricada mediante por lo menos una etapa en la que interviene el hombre, en particular mediante los procesos biológicos o químicos.

La nanopartícula sintética según la invención puede presentar por lo menos una propiedad magnética, como: - ser diamagnética, superparamagnética, preferentemente ferrimagnética o ferromagnética,

- presentar por lo menos un dominio magnético,

- presentar por lo menos un momento magnético distinto de cero,

- presentar una coercitividad superior a 0,5, 1, 10, 100 o 1000 Oe a una temperatura superior a 0, 10, 100, 273, 310, 373 o 1000 K, o

- presentar una relación entre la magnetización remanente y la magnetización de saturación que sea superior a 0,01, 0,1, 0,2, 0,5, 0,7, 0,9, 0,95 o 0,99 a una temperatura superior a 0, 10, 100, 273, 310, 373 o 1000 K,

estas propiedades se deben preferentemente a las propiedades de su parte central.

La nanopartícula sintética según la invención es preferentemente una nanopartícula que presenta un único dominio magnético, lo que puede dar lugar a mejores propiedades magnéticas en comparación con las nanopartículas que presentan varios dominios magnéticos.

La nanopartícula sintética según la invención es preferentemente una nanopartícula ferrimagnética o ferromagnética, en particular una nanopartícula cuyo momento magnético es térmicamente estable a temperatura fisiológica y/o cuyo tamaño es superior a 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 o 1000 nm. La nanopartícula sintética según la invención puede ser una nanopartícula superparamagnética, en particular una nanopartícula cuyo momento magnético es térmicamente inestable a una temperatura fisiológica y/o cuyo tamaño es inferior a 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 o 1000 nm.

El diámetro medio de la nanopartícula sintética según la invención puede medirse mediante microscopía electrónica de transmisión (MET) o con la ayuda de un método de dispersión de luz, dinámico o no dinámico.

La parte central de la nanopartícula sintética comprende predominantemente un óxido de hierro, es decir, por lo menos un 10 o 25%, preferentemente por lo menos un 50, 75, 95, 97, 99, 99,5 o 99,9% de óxido de hierro. Este porcentaje de óxido de hierro se corresponde, en particular, con el número de átomos que contiene el óxido de hierro de la parte central dividido por el número de átomos que contiene el óxido de hierro de la nanopartícula sintética o con la masa de óxido de hierro que contiene la parte central dividida por la masa de óxido de hierro que contiene la nanopartícula sintética. Preferentemente, el óxido de hierro es maghemita, magnetita o una composición intermedia entre maghemita y magnetita.

Preferentemente, el organismo vivo que sintetiza la parte central de las nanopartículas sintéticas según la invención es una célula eucariota o una bacteria, más preferentemente una bacteria que sintetiza nanopartículas magnéticas, y aún más preferentemente una bacteria magnetotáctica.

Más preferentemente, las bacterias según la invención pertenecen a las cepas magnetotácticas, en particular Magnetospirillum magneticum AMB-1, Magnetococcusmarinus sp. MC-1, Magnetovirríumblakemorei MV-1, MV-2 y MV-4, Magnetospirillummagnetotacticum MS-1, Magnetospirillumgryphiswaldense MSR-1, Magnetospirillummagneticum MGT-1, y Desulfovibríomagneticus RS-1.

También se observará que la nanopartícula sintética según la invención se diferencia de los magnetosomas extraídos de las bacterias magnetotácticas, normalmente organizados en cadenas, por la ausencia de material orgánico procedente de las bacterias magnetotácticas en su recubrimiento. El recubrimiento preferentemente no contiene material orgánico no desnaturalizado. La desnaturalización se define aquí como la pérdida, por parte de una macromolécula biológica (por ejemplo, un ácido nucleico o una proteína), de su configuración tridimensional habitual. En efecto, la nanopartícula sintética puede contener, en su recubrimiento, materia orgánica desnaturalizada procedente de bacterias magnetotácticas. Esta materia orgánica desnaturalizada puede aparecer después de un tratamiento destinado a purificar las nanopartículas, como un tratamiento químico, térmico o magnético o una combinación de estos tratamientos.

En una forma de realización, el recubrimiento contiene menos del 50%, 25%, 10% o 1% de material orgánico no desnaturalizado procedente de bacterias magnetotácticas, por ejemplo, lípidos, endotoxinas y/o proteínas no desnaturalizadas procedentes de bacterias magnetotácticas. Este porcentaje de material orgánico no desnaturalizado corresponde en particular a la masa de este material contenida en el recubrimiento dividida por la masa de la nanopartícula sintética. Esta pequeña cantidad de material orgánico procedente de las bacterias puede caracterizarse por una masa de grupos funcionales químicos en la superficie o en el interior de la parte central purificada, como fosfatos o aminas, que es inferior a 1 mg, 0,1 mg, 0,01 mg, 0,001 mg, 0,0001 mg o 40 ng por 1 mg de hierro total de la parte central. Esta baja presencia de material orgánico no desnaturalizado puede permitir la producción de una suspensión de nanopartículas sintéticas con un nivel de pirogenicidad suficientemente bajo según las normas vigentes, en particular para permitir la administración a un ser humano o a un animal.

En una forma de realización, la preparación según la invención contiene por lo menos 2, 5, 10, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 500, 10000, 50000 o 100000 nanopartículas sintéticas que están unidas unas a otras por material de conexión.

El material de unión puede presentar por lo menos una de las siguientes propiedades i) estar hecho, por lo menos en parte, del mismo material o materiales que los del recubrimiento de nanopartículas sintéticas, ii) unir por lo menos dos nanopartículas sintéticas entre ellas, a lo largo de una distancia inferior o superior a 1 mm, 100 pm, 10 pm 1 pm, 100 nm, 50 nm, 40 nm, 30 nm, 20 nm, 10 nm, 5 nm, 2 nm, o 1 nm, (iii), promover la internalización celular, (iv), estar cargadas positiva o negativamente o ser neutras, (v), presentar o no un efecto terapéutico o de diagnóstico, (vi), ser suficientemente resistentes para garantizar la unión entre por lo menos dos nanopartículas sintéticas, ya sea cuando la preparación está en un medio líquido, físico, gaseoso o biológico, o después de la esterilización o después de un tratamiento de naturaleza física, biológica o química, por ejemplo con la ayuda de la solución o el medio utilizado para la formulación de la preparación, en particular para la administración a un organismo, vii), contener menos del 20%, 15%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0,1%, 0,01% o 0,001% de material de carbono procedente del organismo vivo, viii), no proceder del organismo vivo.

Las nanopartículas sintéticas pueden estar organizadas en una figura geométrica que puede ser: una cadena recta, un círculo, un cuadrado, un rectángulo, un triángulo, un pentágono, un hexágono, un heptágono, un octágono, un polígono o un poliedro. Estas figuras pueden observarse mediante microscopía electrónica de transmisión.

Una organización de por lo menos dos nanopartículas sintéticas según una figura geométrica puede corresponder a una organización de estas nanopartículas que tenga i), ejes cristalográficos orientados en una dirección preferente, ii), por lo menos dos lados o caras pertenecientes a dos nanopartículas sintéticas diferentes, que son paralelos o perpendiculares, o que forman un ángulo mayor o menor que 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 180, 225, 250, 300, 325, 350 o 379 grados, iii), un alineamiento paralelo a un campo magnético cuando estas nanopartículas se exponen a la aplicación de un campo magnético, en particular un campo de intensidad superior a 10'10 T, 10'9 T, 10'8 T, 10'7 T, 10'6 T, 10'5 T, 10'4 T, 10'3 T, 10'2 T, 101 T, 1T o iv), materiales de unión que unen por lo menos dos nanopartículas sintéticas entre ellas.

Una organización de por lo menos dos nanopartículas sintéticas en una figura geométrica se puede caracterizar mediante una variación del potencial zeta como función del pH, que es una variación continua como una disminución o un aumento continuos, preferentemente una disminución continua cuando el pH aumenta de 1 a 14, de 2 a 12, de 3 a 11, de 4 a 10, de 5 a 9, o de 6 a 8, en la que una disminución o un aumento continuos pueden corresponder a una variación medida entre más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 unidades de pH diferentes que es una disminución o un aumento.

Por el contrario, una organización de por lo menos dos nanopartículas sintéticas, que no es como una figura geométrica, como un agregado, se puede caracterizar por una variación del potencial zeta como función del pH, que es una sucesión de por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9, 10, 12, 15, 20 disminución(es) y aumento(s) cuando el pH aumenta de 1 a 14, 2 a 12, 3 a 11, 4 a 10, 5 a 9, o 6 a 8.

La organización en una figura geométrica puede tener lugar en un medio sólido, líquido o gaseoso, es decir, en particular en un medio que rodea a las nanopartículas sintéticas, como el medio utilizado para la formulación de las nanopartículas sintéticas o el que rodea a estas nanopartículas durante sus estudios o caracterizaciones.

Según la invención, cuando el organismo vivo que sintetiza la parte central de las nanopartículas sintéticas es una bacteria magnetotáctica, se prefiere que las nanopartículas sintéticas según la invención comprendan las partes centrales de los magnetosomas recubiertas con un compuesto.

Preferentemente, la parte central de las nanopartículas sintéticas según la invención presenta porlo menos una de las siguientes propiedades:

(a), una parte cristalina que presenta por lo menos 1, 2, 5, 10, 50, 100, 150 o 200 planos cristalinos, preferentemente en forma mineral, que comprende predominantemente óxido de hierro, preferentemente maghemita, especialmente cuando la parte central se une al oxígeno, magnetita, especialmente cuando la parte central no se mezcla con oxígeno, o una mezcla de maghemita y magnetita,

(P), un comportamiento ferrimagnético o ferromagnético, especialmente a temperaturas fisiológicas,

(%), un único dominio magnético, o monodominio magnético,

(8), una microestructura magnética, que puede caracterizarse por la presencia de líneas de campo magnético y que puede orientarse en una dirección preferente como un eje de magnetización fácil o una dirección cristalográfica de la parte central de las nanopartículas sintéticas como [111], donde dicha microestructura magnética puede ser observable bajo ciertas condiciones, en particular mediante holografía electrónica,

(e), un tamaño entre 1 nm y 2 pm, 5 nm y 1 pm, 5 y 500 nm, 5 y 250 nm, 5 y 100 nm, 5 y 80 nm, 5 y 60 nm, 10 nm y 1 pm, 10 y 500 nm, 10 y 250 nm, 10 y 100 nm, 10 y 80 nm, 10 y 60 nm, 15 nm y 1 pm, 15 y 500 nm, 15 y 250 nm, 15 y 100 nm, 15 y 80 nm, 15 y 60 nm, 20 nm y 1 pm, 20 y 500 nm, 20 y 250 nm, 20 y 100 nm, 20 y 80 nm o 20 y 60 nm,

(<])), un tamaño superior a 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 o 40 nm,

(y), un tamaño inferior a 2000, 1000, 500, 400, 300, 200, 150, 120, 100, 95, 90, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 o 5 nm,

^{( t i ),}la posible presencia de un potencial zeta, una carga, una carga de superficie,

(i), un punto isoeléctrico, preferentemente ácido con un pH inferior o igual a 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1,

(u), un punto isoeléctrico, que se aproxima a 7 cuando una cantidad pequeña de materia orgánica permanece en la superficie de la parte central; cuando queda una cantidad pequeña de materia orgánica, el punto isoeléctrico puede estar entre un pH de 6,5 y un pH de 7,5, entre un pH de 6,2 y un pH de 7,1, o entre un pH de 6,1 y un pH de 7,1.

Como ya es sabido por el experto en la técnica, el potencial zeta, la carga y la carga de superficie dependen generalmente del pH, de la salinidad, de la especie bacteriana que sintetiza la parte central de las nanopartículas sintéticas, del estado de agregación, del porcentaje de materia orgánica en la superficie de estas partes centrales. Pueden ser: (1), positivos a un pH ácido, a un pH igual o inferior a 7, 6, 5, 4, 3, 2, o 1, (2), negativos a un pH básico, a un pH superior o igual a 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, (3), varían en función del pH dentro de un rango comprendido entre -10 y 10 mV, -20 y 20 mV, -30 y 30 mV, -40 y 40 mV, -50 y 50 mV, -60 y 60 mV -70 y 70 mV, -80 y 80 mV, -90 y 90 mV, -100 y 100 mV, -150 y 150 mV, o -200 y 200 mV, (4), varían significativamente en función del pH cuando una cantidad pequeña de material orgánico, preferentemente de carbono, permanece en la superficie de las partes centrales de estas nanopartículas sintéticas.

Preferentemente, la parte central de las nanopartículas sintéticas comprende menos del 50, 25, 10, 5, 2, 1, 0,5, 0,2, 0,1, 0,05, 0,01 o 0,001% de material orgánico. Tal y como se utiliza en el presente documento, este porcentaje de materia orgánica representa el porcentaje en masa o en número de átomos o en volumen de cualquier elemento químico o combinación de elementos químicos contenidos en la materia orgánica, como el carbono, el nitrógeno o el fósforo. Este porcentaje puede medirse con instrumentos de análisis elemental como el carbono orgánico total (COT) o los analizadores de carbono, hidrógeno, nitrógeno, azufre y oxígeno (CHNS/O).

En una forma de realización, el recubrimiento según la invención, también denominado recubrimiento circundante, es un material sólido, líquido o gaseoso, preferentemente en estado sólido, que rodea la parte central, en particular en forma de una capa, cristalizada o no, en particular sobre una distancia medida desde el centro de la parte central, que es inferior a 100 pm, 10 pm, 5 pm, 1 pm, 500 nm, 250 nm, 100 nm, 10 nm, o 1 nm. Este recubrimiento puede servir, en particular, para estabilizar la parte central o para unir las nanopartículas sintéticas entre ellas.

El recubrimiento puede tener por lo menos una propiedad en común con la parte central o por lo menos una propiedad diferente de la parte central.

Según la invención, el recubrimiento circundante preferentemente no comprende material no desnaturalizado procedente del organismo vivo. Puede contener menos del 50, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2, 1, 0,1, 0,05, 0,01, 0,001 o 0. 0001% de este material. Este porcentaje puede definirse como la relación entre el número de átomos procedentes del organismo vivo contenidos en el recubrimiento dividido por el número total de átomos contenidos en el recubrimiento o la proporción entre la masa de átomos procedentes del organismo vivo contenidos en el recubrimiento dividida por la masa total de átomos contenidos en el recubrimiento. Este porcentaje puede corresponder a un porcentaje de carbono o de materia orgánica.

La nanopartícula sintética según la invención es apirógena, donde la apirogenicidad se puede definir midiendo la cantidad de endotoxinas por miligramo de nanopartícula sintética, preferentemente contenida en 1 mililitro de la preparación, que es inferior o igual a 109, 108, 107 o 106, preferentemente inferior o igual a 104 o 103, más preferentemente inferior o igual a 100, 50, 10, 5 o 1 unidad de endotoxina (UE). Como ya sabe el experto en la técnica, 1 UE puede corresponder a una cantidad de 100 pg por mi de endotoxinas procedentes de E-Coli.

Preferentemente, la nanopartícula sintética es apirógena cuando su recubrimiento o su parte central son apirógenos, preferentemente cuando su recubrimiento y su parte central son apirógenos, donde la apirogenicidad puede definirse en este caso midiendo la cantidad de endotoxinas por miligramo de la parte central y/o del recubrimiento de la nanopartícula sintética, preferentemente contenida en 1 mililitro de la preparación, que es inferior o igual a 109, 108, 107 o 10®, preferentemente inferior o igual a 104 o 103, más preferentemente inferior o igual a 100, 50, 10, 5 o 1 unidad de endotoxina (UE).

Tal como se utiliza en el presente documento, una preparación es apirógena cuando las sustancias distintas de las nanopartículas sintéticas contenidas en la preparación, como las sustancias contenidas en el excipiente y/o el disolvente de la preparación y/o la matriz que rodea las nanopartículas sintéticas son apirógenas.

Preferentemente, la preparación apirógena se caracteriza por un porcentaje de endotoxinas inferior o igual al 50, 20, 1, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8 o 10-9%, pudiendo ser este porcentaje: (i), la masa de endotoxina dividida por la masa total de la preparación, (ii), el volumen ocupado por las endotoxinas dividido por el volumen total de la preparación, (i¡¡), el número de átomos contenidos en las endotoxinas de la preparación dividido por el número total de átomos contenidos en la preparación.

Preferentemente, la preparación apirógena se caracteriza por una cantidad de endotoxinas menor o igual a 109, 108, 107 o 106, preferentemente menor o igual a 104 o 103, más preferentemente menor o igual a 100, 50, 10, 5 o 1 UE o UE por miligramo de óxido de hierro o UE por miligramo de óxido de hierro por mililitro.

En una forma de realización, la preparación apirógena es un fármaco administrado a un organismo como una persona o un animal. Preferentemente comprende una cantidad de endotoxinas inferior a: (i), 5 UE por kilogramo de peso corporal de este organismo por hora de administración para la administración no intratecal y, (ii), 0,2 UE por kilogramo de peso corporal de este organismo por hora de administración para la administración intratecal.

En una forma de realización, la preparación apirógena es un dispositivo médico, en particular un dispositivo invasivo. A continuación, contiene preferentemente una cantidad de endotoxina, medida preferentemente en la superficie del dispositivo médico, que es inferior a: (i), 0,5 UE por mililitro de la preparación cuando ésta no está en contacto con el líquido cefalorraquídeo y, (ii), 0,02 UE por mililitro de la preparación cuando ésta está en contacto con este líquido. Preferentemente, la preparación apirógena según la invención contiene una concentración de endotoxinas que cumple con las normas reguladoras aplicables al producto médico, al dispositivo médico o al producto cosmético, en particular cumple con la farmacopea, más preferentemente con la(s) farmacopea(s) europea(s) y/o americana(s). La preparación apirógena puede administrarse opcionalmente a un organismo dentro de un tiempo de administración mayor o igual a los siguientes valores: 1, 30 o 60 segundos, 1, 30 o 60 minutos, 1, 15 o 24 horas, 1 o 5 días, 1 o 4 semanas. En el caso de que la preparación apirógena se administre a un organismo dentro de un tiempo de administración superior o igual a estos valores, la cantidad de endotoxinas contenidas en la preparación puede ser mayor que cuando la misma preparación se administra dentro de un tiempo que es menor a estos valores. Preferentemente, la cantidad de endotoxinas en la preparación se mide mediante un ensayo de lisado de amebocitos de Limulus (LAL). Como podrá comprender el experto en la técnica, es preferible asegurarse de que las nanopartículas no interfieren en el ensayo, en particular mediante la medición de una tasa de recuperación. Esta tasa puede definirse como igual a Ctotal/C1+C2, donde Ctotal es la concentración de endotoxinas de las suspensiones de nanopartículas sintéticas mezcladas con una cantidad conocida de endotoxinas de, por ejemplo, 0,5 UE/ml. En este ejemplo,Ci es la concentración de endotoxinas en las diferentes suspensiones de nanopartículas sintéticas y C2=0,5 UE/ml. Se puede considerar que no existen interferencias cuando esta tasa de recuperación es superior o igual a 10 o 30, preferiblemente 50, 100 o 150%.

La pirogenicidad de la preparación según la invención puede evaluarse mediante un ensayo de pirogenicidad en conejo, en particular según la norma ISO 10993-11, capítulo 151 de la Farmacopea Americana o la Farmacopea Europea. Este ensayo puede llevarse a cabo administrando la preparación por vía intravenosa a 1 o varios conejos, preferentemente 3, utilizando preferentemente una cantidad de nanopartículas sintéticas, que es típicamente pero no necesariamente superior o igual a 1 mg. En particular, en el caso de que la preparación sea un dispositivo médico, dicha cantidad parece ser adecuada, ya que es mayor que 6 cm2 por mi o mg de nanopartículas sintéticas, en particular recomendada por la norma ISO 10993-12. En efecto, considerando la superficie de una nanopartícula sintética cúbica con un lado de 50 nm, que es de 15,1011 cm2, y que 1 mg de nanopartícula sintética compuesta predominantemente por maghemita contiene 1,6 10'12 nanopartículas sintéticas, se puede estimar que 1 mg de nanopartículas sintéticas tiene una superficie de 94 cm2, superior a 6 cm2. La ausencia de pirogenicidad de la preparación se demuestra entonces midiendo la suma de los aumentos de temperatura en tres conejos, que no debe ser superior a 10,5, 2 o 1°C, preferentemente 2,65°C, de acuerdo con la Farmacopea Europea, o midiendo el aumento de temperatura en cada conejo, que no debe ser superior a 10, 5, 2, 1 o 0,1°C, preferentemente 0,5°C de acuerdo con la Farmacopea Americana, o siguiendo las recomendaciones de una o varias farmacopeas, en particular la Europea y la Americana.

Preferentemente, la preparación según la invención es apirógena o no inmunogénica. En particular, la inmunogenicidad o la pirogenicidad pueden ser causadas por sustancias biológicas no minerales, lípidos, proteínas, enzimas, ADN o ARN, tanto si estas sustancias son producidas por un organismo vivo distinto del ser humano como si son sintetizadas, por lo menos en parte, por el ser humano.

Preferentemente, la preparación según la invención es apirógena o no inmunogénica cuando contiene menos de 109, 108, 107, 10®, 10, 104, 103, 102, 101 o 1 molécula(s) biológica(s), como proteínas, lípidos, enzimas, ADN o ARN. En una forma de realización, la preparación según la invención puede considerarse como apirógena o no inmunogénica cuando no induce en sí misma una respuesta significativa del sistema inmunitario, es decir, no presenta una actividad farmacéutica o médica significativa; en particular, la preparación no tiene ninguna actividad antitumoral en sí misma. Como podrá entender el experto en la técnica, la preparación puede tener una actividad farmacéutica o médica, como una actividad antitumoral, cuando se expone a la aplicación de una radiación, como un campo magnético, preferentemente un campo magnético alterno.

En una forma de realización, la preparación, la nanopartícula sintética, su parte central y/o su recubrimiento pueden ser apirógenos e inmunogénicos, o ser apirógenos y no inmunogénicos. La pirogenicidad puede considerarse como una inmunogenicidad causada por las endotoxinas.

Preferentemente, las nanopartículas sintéticas según la invención se agrupan poco, poseen una distribución homogénea en un medio determinado, preferentemente en la preparación y/o en el organismo donde se administran. Esta distribución homogénea se caracteriza por: (i), la presencia de estas nanopartículas sintéticas en el 0,1, 1, 5, 10, 25 o 50% de este medio, donde este porcentaje puede definirse como el volumen ocupado por las nanopartículas sintéticas dividido por el volumen total del medio en cuestión, (ii), una sedimentación de las nanopartículas sintéticas que se produzca en más de una hora, preferentemente en más de una semana, más preferentemente en más de 15 días, (iii), una sedimentación de las nanopartículas sintéticas que se produzca en un tiempo mayor que el tiempo de administración de la preparación en un organismo. La sedimentación de las nanopartículas sintéticas puede revelarse por la presencia de agregados que sedimentan, preferentemente en un líquido, y que son visibles a simple vista, por microscopio óptico o por mediciones espectroscópicas, en particular por absorción.

Preferentemente, las nanopartículas sintéticas según la invención son estables en suspensión o la preparación según la invención es estable. La estabilidad se define como la capacidad de las nanopartículas sintéticas de permanecer en suspensión sin sedimentación. La estabilidad puede medirse, en particular, mediante mediciones de absorción, preferentemente mediante mediciones de la variación de la absorción a lo largo del tiempo a una longitud de onda en la que las nanopartículas sintéticas absorben, típicamente entre 400 nm y 600 nm, más típicamente igual a 480 nm, a una longitud de onda mayor que 1, 50, 100, 200, 300, 400, 450, 500, 600 o 800 nm, 1, 5 o 10 pm, a una longitud de onda menor que 10, 5 o 1 pm, 800, 600, 500, 450, 400, 300, 200, 100, 50 o 1 nm. Preferentemente, la estabilidad es tal que la densidad óptica o la absorción de la suspensión de nanopartículas sintéticas no disminuye en más de 50, 25, 10, 5, 2, 1 o 0,1%, donde este porcentaje de disminución puede definirse como igual a [abs(t0)-abs(t)]/abs(t0), donde abs(t0) y abs(t) son las absorciones medidas al principio y al final de la medición, respectivamente. En particular, esta disminución puede medirse a lo largo de un período de más de 1,5, 15, 25, 45 o 60 segundos, 2, 5, 10, 30, 45 o 60 minutos, 2, 5, 10, 50, 100 o 1000 veces el tiempo necesario para administrar la suspensión de nanopartículas sintéticas a un organismo. Se puede medir justo después de elaborar la preparación, unos días, unas semanas, unos meses, unos años después de elaborar la preparación. Se mide preferentemente después de la homogeneización de la preparación, en particular mediante sonicación, vibración, agitación.

Según una forma de realización, la preparación según la invención es estable para una concentración de hierro de las nanopartículas sintéticas superior a 0,01, 0,05, 1,5, 10, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800 o 900 mg/ml, 1, 2, 5 o 10 g/ml.

En una forma de realización, la nanopartícula sintética tiene una homogeneidad de distribución, una estabilidad, que es(son) superior(es) a la(s) de las nanopartículas sintéticas extraídas de un organismo vivo, preferentemente una bacteria magnetotáctica o superior(es) a la(s) de la parte central de las nanopartículas sintéticas o de SPION o de FION.

En una forma de realización, la nanopartícula sintética puede presentar:

Una propiedad común con su parte central, preferentemente la propiedad (a), (P), (%), (8), (q) (ver páginas 5-6),

Un tamaño, que es mayor que 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1, 2, 3, 45, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 50, 75, 100, 250 o 500 nm, 1, 5, 10, 50 o 100 pm más grande que el tamaño de su parte central y/o recubrimiento.

Un punto isoeléctrico, en particular un punto isoeléctrico que es diferente al de su parte central y/o recubrimiento,

Un potencial zeta, una carga, una carga de superficie, en particular cualquiera de estos tres parámetros y/o la variación en función del pH que sea(n) diferente(s) de la(s) de su parte central y/o del recubrimiento.

Una apirogenicidad inferior, superior o igual a la de su parte central y/o su recubrimiento.

En una forma de realización, el recubrimiento según la invención favorece la adhesión de sustancias a las nanopartículas sintéticas, permitiendo limitar la toxicidad y los resultados en una organización específica como: (i), una organización en cadena, es decir, una organización de por lo menos dos nanopartículas sintéticas unidas entre sí con una posible alineación de los ejes cristalográficos o de las líneas de campo de estas nanopartículas, (ii), una organización en una figura geométrica, (iii), ordenada y caracterizada por la presencia de un patrón geométrico, como un círculo, un rectángulo, un diamante, un cuadrado, una elipse. Dicha organización puede ponerse de manifiesto mediante mediciones de MET, en particular depositando una gota de la preparación de nanopartículas sintéticas a una concentración adecuada para poder observar las organizaciones de las nanopartículas sintéticas en sus agrupaciones.

En una forma de realización, el recubrimiento no tiene su origen en el organismo que sintetiza la parte central de las nanopartículas sintéticas, lo que puede facilitar su caracterización, en particular cuando la estructura o composición del recubrimiento es conocida, simple, identificable o fácilmente caracterizable.

En una forma de realización, el recubrimiento es una sustancia apirógena.

En una forma de realización, el recubrimiento comprende por lo menos un compuesto, que es capaz de establecer interacciones débiles o enlaces covalentes con la parte central de las nanopartículas sintéticas, en particular el óxido de hierro.

En una forma de realización, el recubrimiento comprende por lo menos un compuesto capaz de ser quimio absorbido o fisio absorbido en la parte central de la nanopartícula sintética.

En una forma de realización, el recubrimiento comprende por lo menos un compuesto capaz de establecer interacciones o uniones con iones Fe2+ o Fe3+, hidroxilos OH', óxidos O2-, defectos cristalinos de la parte central, que pueden estar dentro o en la superficie de la parte central de las nanopartículas sintéticas.

En una forma de realización, el recubrimiento comprende por lo menos un compuesto, un átomo, un ion o una función química, como una función de ácido, de ácido carboxílico, de ácido fosfórico o de ácido sulfónico, en la que el compuesto, el átomo o el ion incrustado en el recubrimiento es capaz de establecer interacciones o uniones con la parte central o con por lo menos un átomo de la parte central, una función química de la parte central, un ion de la parte central como Fe2+, Fe3+, Hidroxilo OH', óxido O2' o un defecto cristalino de la parte central.

El átomo, la función química o el ion de la parte central pueden estar en la superficie de la parte central de las nanopartículas sintéticas o dentro de ella.

En una forma de realización, el recubrimiento se selecciona de entre las sustancias que producen un mejor calentamiento para las nanopartículas sintéticas que para el SPION o el FION. Por consiguiente, se prefiere que el recubrimiento comprenda sustancias que sean buenas conductoras térmicas.

En una forma de realización, el recubrimiento se selecciona de entre los compuestos que producen entre las nanopartículas sintéticas una organización o propiedades de agrupación, que favorecen los efectos de una radiación o de un campo magnético tal como un campo magnético alterno sobre estas nanopartículas sintéticas. Los efectos de una radiación o de un campo magnético pueden ser, en particular, movimientos, vibraciones, rotaciones o traslaciones de estas nanopartículas.

En una forma de realización, el recubrimiento tiene un espesor inferior al diámetro medio de la parte central de las nanopartículas sintéticas, menos de la mitad, un cuarto de ese diámetro, menos de 10,5, 2,5 o 1 pm, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2, 1 o 0,5 nm. Este espesor puede ayudar, en particular, a limitar la toxicidad.

En una forma de realización, el recubrimiento tiene un espesor típicamente superior al diámetro medio de la parte central de las nanopartículas sintéticas, superior a la mitad de un cuarto de este diámetro, superior a 0,1, 0,5, 1, 2, 4, 8, 10, 15, 20 o 25 nm. Este grosor puede ayudar, en particular, a unir las nanopartículas sintéticas entre ellas o impedir la formación de agregados. De forma ventajosa, la presencia de un recubrimiento suficientemente grueso permite evitar que las nanopartículas sintéticas se unan entre sí, en particular bajo el efecto de las fuerzas magnéticas que ejercen unas sobre otras y cuya intensidad aumenta cuando estas nanopartículas sintéticas se acercan unas a otras.

En una forma de realización, el porcentaje de variación del grosor del recubrimiento se define como el menor grosor del recubrimiento dividido por el mayor que puede medirse en la(s) nanopartícula(s) sintética(s) en la preparación, utilizando en particular, la MET. En un primer caso, el grosor del recubrimiento es homogéneo. El porcentaje de variación del grosor es entonces preferentemente inferior a 106, 105, 104, 103, 500, 100, 50, 10, 5, 1 o 0,1%. Un grosor homogéneo puede permitir, en particular, una distribución homogénea de las nanopartículas sintéticas. En un segundo caso, el grosor del recubrimiento es homogéneo. El porcentaje de variación del grosor es entonces preferentemente superior a 0,1, 1, 5, 10 , 50, 100 , 500, 103, 104, 10® o 10®%. Un grosor no homogéneo puede dar lugar, en particular, a una distribución de fuerzas magnéticas de intensidad variable.

En una forma de realización, el recubrimiento presenta un contenido de hierro inferior o igual a 1, 2, 5, 10, 102, 103, 104, 10® o10® veces el de la parte central de las nanopartículas sintéticas.

En otra forma de realización, el recubrimiento presenta un contenido de por lo menos un átomo distinto al hierro o al oxígeno que es superior o igual a 1, 2, 5, 10, 102, 103, 104, 10® o 10® veces que el de la parte central de las nanopartículas sintéticas.

En una forma de realización, el recubrimiento es un agente tensioactivo que provoca una variación de la tensión de la superficie en la superficie de las nanopartículas sintéticas, superior a 10'4, 10'3, 10'2, 10'1, 1, 5, 10, 20, 50 o 100%, donde este porcentaje se define como igual a TS(CP)-TS(SN)/TS(CP), en el que TS(CP) y TS(SN) son tensiones en las superficies de las partes centrales y de las nanopartículas sintéticas, respectivamente.

En una forma de realización, el recubrimiento comprende compuestos de carbono.

En una forma de realización, el recubrimiento comprende por lo menos un compuesto seleccionado de entre el grupo que consiste en un quelante, una molécula anfifílica, un polímero polarizado o cargado, un óxido de metal o de silicio, un hidróxido de metal o de silicio, un ácido, un derivado ácido, básico, oxidado, reducido, neutro, cargado positivamente, cargado negativamente de estos compuestos, y una combinación de varios de estos compuestos o derivados.

En una forma de realización, el recubrimiento comprende por lo menos un compuesto seleccionado de entre el grupo que consiste en polisacárido, un ácido graso, un fosfolfpido, un polímero de aminoácidos, sílice polimérico o no polimérico, y un polímero de amina alifática, un derivado ácido, básico, oxidado, reducido, neutro, cargado positivamente, cargado negativamente de estos compuestos y una combinación de varios de estos compuestos o derivados.

En una forma de realización, el recubrimiento no incluye fosfolípidos o proteínas o ARN o ADN o compuestos de origen bacteriano, celular o biológico o compuestos derivados de una bacteria magnetotáctica.

En una forma de realización, el recubrimiento comprende por lo menos un compuesto seleccionado de entre el grupo que consiste en ácidos fosfóricos, ácidos carboxílicos, ácidos sulfónicos, ásteres, amidas, cetonas, alcoholes, fenoles, fióles, aminas, éteres, sulfuras, anhídridos de ácidos, haluros de acilo, amidinas, nitrilos, hidroperóxidos, ¡minas, aldehidos, peróxidos, un derivado ácido, básico, oxidado, reducido, neutro, cargado positivamente, cargado negativamente de estos compuestos y una combinación de varios de estos compuestos o sus derivados.

En una forma de realización, el recubrimiento según la invención se selecciona de entre sustancias esterilizadles, preferentemente en autoclave, biocompatibles, biodegradables, que no inducen efectos metabólicos, inmunológicos, citotóxicos, farmacológicos, y que pueden administrarse por vía intravenosa y/o inmunológica. Dicha sustancia puede ser povidona, PEG 400, poloxamer 188, dextrano, fosfatidilcolina, dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina o un derivado de estas sustancias.

El tipo de recubrimiento puede seleccionarse según los siguientes parámetros:

(i) Vía de administración de las nanopartículas sintéticas: por ejemplo, para una administración intravenosa, se puede acabar seleccionando un recubrimiento que permita evitar que los macrófagos capten las nanopartículas sintéticas, como el PEG o el dextrano,

(¡i) Internalización celular: para favorecerla, se puede seleccionar "finalmente" un recubrimiento con carga positiva, como la poli-L-lisina.

En una forma de realización, la preparación según la invención puede ser utilizada como fármaco o como agente de diagnóstico, en particular en el contexto del tratamiento de un tumor, por ejemplo, utilizando la hipertermia magnética.

En una forma de realización, una intervención o procedimiento médico, veterinario o cosmético que utilice esta preparación implica por lo menos una de las siguientes secuencias, preferentemente en el orden cronológico indicado:

(i) la administración de la preparación a un organismo, en particular a través de una vía local, mucocutánea, enteral, parenteral, intratumoral, intravenosa o intraarterial.

(¡i) dirigir las nanopartículas sintéticas hacia una parte de un organismo, como un órgano, un tumor o un vaso sanguíneo,

(i¡¡) tratamiento o detección de esa parte del organismo.

En una forma de realización, la preparación según la invención puede utilizarse para aplicaciones cosméticas.

En una forma de realización, la preparación según la invención se administra a una concentración que es superior a la concentración máxima a la que puede administrarse una suspensión que contenga cadenas de magnetosomas extraídas de la bacteria magnetotáctica, preferentemente 14 mg/ml en hierro. También se puede administrar a una concentración de hierro superior o igual a 0,01, 0,05, 1,5, 10 o 15 mg/ml, preferentemente 25, 50, 100 o 150 mg/ml, más preferentemente superior o igual a 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 o 900 mg/ml, 1, 2, 5 o 10 g/ml . Esto puede ser posible debido a la mayor solubilidad o a la menor sedimentación de las nanopartículas sintéticas en comparación con la de las cadenas de magnetosomas extraídas de bacterias magnetotácticas y/o la de SPION y/o la de FION.

En una forma de realización, la preparación según la invención se puede administrar a una concentración de hierro inferior o igual a 1 kg/ml, 500, 250, 100, 50, 10, 5, 2 o 1 g/ml, preferentemente inferior o igual a 900, 700, 500 o 400 mg/ml, más preferentemente interioro igual a 300, 200, 150, 100, 10, 1 o 0,1 mg/ml.

En una forma de realización, el tratamiento se puede realizar mediante la aplicación de un campo magnético alterno, una técnica comúnmente conocida como hipertermia magnética, mientras que la detección se puede realizar, en particular, mediante imágenes de resonancia magnética (MRI).

En una forma de realización, la invención se refiere a una composición farmacéutica o fármaco que comprende, como principio activo, una preparación como la descrita anteriormente y opcionalmente por lo menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En una forma de realización, la invención se refiere a un dispositivo médico que comprende la preparación según la invención.

En una forma de realización, la invención se refiere a una composición de diagnóstico que comprende la preparación según la invención.

En una forma de realización, la invención se refiere a una composición cosmética que comprende, como principio activo cosmético, la preparación según la invención.

En una forma de realización, la invención se refiere a un método de tratamiento de un tumor de una persona o animal en el que se administra una cantidad terapéuticamente activa de la preparación según la invención.

En una forma de realización, la invención se refiere a un proceso para la fabricación de una preparación como la descrita anteriormente, que comprende las siguientes secuencias:

(i) , a partir de una preparación de nanopartículas sintetizadas por un organismo vivo que comprende una parte central mineral cristalizada compuesta predominantemente por óxido de hierro y un recubrimiento biológico circundante, que aísla la parte central mineral;

(ii) , tratar la preparación resultante para cubrir la parte central con un recubrimiento circundante;

(iii) , opcionalmente esterilizar la preparación, preferentemente después de la secuencia (i), posiblemente después de la secuencia (ii).

En una forma de realización, la parte central de los magnetosomas está rodeada o no por compuesto(s) o sustancia(s) que no pertenecen a esta parte central.

En una forma de realización, los magnetosomas tratados se asocian a magnetosomas que han sido sometidos a un tratamiento, en particular tras la secuencia de fermentación bacteriana.

En una forma de realización, las secuencias (i) y/o (ii) pueden implicar:

a), un proceso de purificación química, denominado dicho proceso de purificación química, cuyo objetivo es, en particular, retirar, mediante un método químico, todo o parte del material que rodea las partes centrales de los magnetosomas. Puede consistir en mezclar cualquier suspensión de las secuencias (i) o (ii) con una solución química, denominada dicha solución química, preferentemente a una concentración superior a 0,001, 0,01, 0,1, 1, 10 o 100 pM, 1,10 o 100 mM, 1 M, preferentemente a una concentración inferior a 1000, 100, 50, 10, 5, 2 o 1 M, 500, 100, 50, 10, 5 o 1 mM, 10, 5 o 1 pM. Esta solución química puede ser una solución hipoosmótica, un tampón de lisis, una solución para desorber o desprender los magnetosomas de ciertas superficies, una solución para eliminar cualquier material, en particular material orgánico, que no se encuentre dentro de o en la superficie de la parte central del magnetosoma, una solución para eliminar residuos de detergentes. Esta solución química puede contener las siguientes sustancias químicas: (i) desnaturalizantes químicos como el hidróxido de sodio, el hidróxido de potasio o soluciones con pH neutro, ácido o básico, (ii), disolventes orgánicos como el tolueno, el éter, el alcohol, el feniletilo, el dimetilsulfóxido (DMSO), el benceno, el metanol, el cloroformo, (iii), agentes caotrópicos como la urea, el fenol, la guanidina, el cloruro de guanidio, el tiocianato de guandinio, que son capaces, en particular, de introducir compuestos hidrófobos en soluciones acuosas modificando la estructura del agua, iv), agentes quelantes como el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) (v), sustancias utilizadas en la despirogenización como el hidróxido de sodio, la urea, el peróxido de hidrógeno, que permiten eliminar o neutralizar las endotoxinas, (vi), antibióticos, como las tioninas, (vii), agentes tensioactivos como el tritón, el Brij, el Duponal, (viii) agentes reductores como el ditiotreitol (DTT), el tioglicolato.p el mercaptoetanol, que pueden permitir, en particular, romper los enlaces o los puentes disulfuro, (ix), detergentes, compuestos por un grupo hidrocarburo hidrófobo y un extremo cargado hidrófilo, (x), agentes tensioactivos. Entre los detergentes que se pueden utilizar están los detergentes iónicos, catiónicos o aniónicos, los detergentes no iónicos, los detergentes zwitteriónicos, los caotropos, el dodecil sulfato de sodio (SDS), el desoxicolato, el colato, el tritón en particular tritón X100, n-Dodecilip-D-maltósido (DDM), digitonina, tween 20, tween 80, 3-[(3-colamidopropil)dimetilamino]-1-propanosulfonato (CHAPS), urea, clorhidrato de guanidina, nonilfenoxipolietoxietanol (NP-40). Dicha solución química también puede contener agua o cualquiera de los derivados de la(s) sustancia(s) química(s) mencionada(s) anteriormente;

b), un proceso de purificación biológica, denominado dicho proceso de purificación biológica, cuyo objetivo es, en particular, retirar, mediante un proceso biológico todo o parte del material que rodea la parte central de los magnetosomas. En particular, puede implicar un organismo vivo o una sustancia derivada de dicho organismo, como una enzima, en particular una enzima lítica, un fago, una proteína como la proteasa o la manasa;

(c), un proceso de recubrimiento químico, denominado el proceso de recubrimiento químico, que consiste en mezclar la suspensión que contiene las partes centrales de los magnetosomas con cualquier sustancia o combinación de sustancias utilizadas para el recubrimiento de la parte central de los magnetosomas, en el que dicha(s) sustancia(s) se denomina(n) dicha(s) sustancia(s) de recubrimiento;

d), un proceso térmico, denominado dicho proceso térmico, consistente en exponer cualquier suspensión obtenida durante las secuencias (i) o (¡i) a un gradiente de temperatura, en particular mayor o igual a 10, 25, 50, 100, 150, 200, 300, 500, 1000, 2000, 3000 o 5000°C y/o en llevar cualquier suspensión obtenida durante las secuencias (i) y/o (¡i) a una temperatura que es preferentemente inferior o igual a 100, 50, 10, 0, -10, -40, -70, -77, -150, -250°C, 50, 30, 10 o 1 K, que es preferentemente superior o igual a 1, 5, 25, -250, -70, -77, -50, -20, 0, 5, 20, 40, 100, 200, 500, 1000, 2000, 4000 o 5000°C.

(e) , un proceso mecánico, denominado dicho proceso mecánico, que consiste en aplicar cualquiera de las suspensiones obtenidas durante secuencias (i) y/o (¡i); (1), una presión, preferentemente superior a 1 10, 100, 500, 103, 104, 105, 10®, 107, 10® o 109 atmósferas, preferentemente inferiora 109, 10®, 107, 10®, 10®, 104, 10 , 500, 100, 10 o 1 atmósferas, en particular utilizando un instrumento como un homogeneizador de alta presión, una prensa francesa, una bomba de disrupción o un molino de bolas, o (2), la sonicación, en particular a una potencia superior a 0,01, 0,1, 05, 1, 2, 5, 7, 10, 20, 40, 100, 500 o 1000 vatios, a una potencia inferior a 1000, 500, 100, 40, 20, 10, 7, 5, 2, 1, 0,5, 0,1 o 0,01 vatios, en el que el tiempo de sonicación es preferentemente superior a 1, 2, 5, 10, 20, 30, 45 o 60 segundos, más de 2, 5, 10, 20, 30, 45, 60 o 120 minutos, más de 2, 3, 4 o 5 horas, preferentemente menos de 60, 30, 15, 5 o 1 minuto(s), menos de 60, 45, 30, 15, 10 o 1 segundo(s), (3), irradiación, en particular utilizando rayos ionizantes;

(f) , un proceso de selección magnética, denominado dicho proceso de selección magnética, que consiste en el aislamiento de la parte central de los magnetosomas o los magnestosomas tratados que son tratados con sustancias sin magnetismo o con un magnetismo bajo, definidos por ser restos bacterianos, bacterias no Usadas, hierro disuelto, magnetosomas disueltos o cualquier material contenido en cualquier suspensión de las secuencias (i) o (¡i), que no contiene magnetosomas o los contiene en una cantidad baja, preferentemente inferiora 109, 10®, 10', 10®, 10®, 104, 10®, 102 o 10 magnetosomas por mililitro de la preparación. Para ello, se puede aplicar un gradiente de campo magnético a cualquier suspensión de las secuencias (i) o (¡i), donde dicha suspensión está contenida preferentemente en un recipiente como un tubo o un frasco, preferentemente compuesto de vidrio o de un material que no adsorba los magnetosomas modificados o las partes centrales de los magnetosomas. Este gradiente de campo magnético permite, en particular, la migración de las sustancias magnéticas, preferentemente las partes centrales de los magnetosomas o de los magnetosomas modificados, hacia la zona en la que el campo magnético es más intenso, como la pared del recipiente, para concentrarlas en esta zona y así aislarlas. Este gradiente de campo magnético es preferentemente de mayor intensidad que la intensidad del campo magnético terrestre, a 0,1, 1, 10 o 100 pT, 0,1, 1, 10 o 100 mT, 0,1, 1, 10, 50 o 100 T. En particular, tiene una intensidad suficiente para permitir que las sustancias magnéticas, como las partes centrales de magnetosomas o los magnetosomas modificados, se separen de las sustancias sin magnetismo o con un magnetismo bajo. Este gradiente de campo magnético es preferentemente de intensidad inferior a 100 o 50 T, más preferentemente a 5 o 1 T, 100, 50, 10 o 1 mT.

En particular, puede ser de una intensidad lo suficientemente baja como para evitar la atracción de sustancias sin magnetismo o con un magnetismo bajo. Dicho gradiente de campo magnético puede ser aplicado por un imán, como un imán de neodimio, un electroimán o cualquier instrumento o material capaz de generar un campo magnético cuya intensidad varíe preferentemente de forma espacial y/o temporal. El gradiente de campo magnético se puede aplicar durante más de 1,5, 10, 30, 45 o 60 segundos, 5, 10, 30, 45 o 60 minutos, 2, 5, 10, 15 o 20 horas, 1, 2 o 5 día(s), 1, 2, 3 o 4 semana(s), 2, 4 o 6 meses. Tras la aplicación del gradiente de campo magnético, el sobrenadante de la suspensión, que no contiene o contiene una pequeña cantidad de las partes centrales de los magnetosomas o de los magnetosomas modificados, se puede retirar y sustituir por una sustancia como un disolvente, preferentemente apirógeno, como el agua apirógena;

g) otro proceso de selección, denominado dicho otro proceso de selección, durante el cual las partes centrales de los magnetosomas o los magnetosomas modificados se pueden aislar de los residuos bacterianos, en particular utilizando un sistema de filtración tangencial con columnas de poros cuyos tamaños permiten el paso de los residuos bacterianos, pero no de las partes centrales de los magnetosomas, o permiten el paso de las partes centrales de los magnetosomas, pero no de los residuos bacterianos. Este tamaño es particularmente inferior a 100, 50, 20, 10, 5, 1, 0,5, 0,2, 0,1, 0,05, 0,02, 0,01, 0,005 o 0,0001 pM. Este tamáo puede ser preferentemente entre O.O j^rn y 2 pm, preferentemente entre 0,2 pm y 1 pm, más preferentemente entre 0,2 pm y 0,4 pm;

En una forma de realización, la secuencia (i) está precedida por una secuencia de cultivo de un organismo vivo, como una bacteria magnetotáctica, que sintetiza magnetosomas.

En una forma de realización, la secuencia de cultivo del organismo vivo se realiza en condiciones no totalmente controladas, como las condiciones de cultivo de la bacteria magnetotáctica AMB-1 en botella.

En otra forma de realización, la secuencia de cultivo del organismo vivo se realiza en condiciones controladas, como las condiciones de cultivo de la bacteria magnetotáctica MSR-1 en termentador, que implican: (a) una solución nutritiva ácida que contiene hierro para mantener el pH del medio de cultivo constante durante el crecimiento de las bacterias y, (b), un suministro de aire durante el crecimiento de las bacterias para promover este crecimiento manteniendo la concentración de oxígeno del medio de cultivo en un valor bajo, preferentemente inferior a 20 mbar, más preferentemente inferior a 2 mbar, para permitir la síntesis de los magnetosomas.

En una forma de realización, la secuencia (i) se subdivide en tres secuencias seguidas preferentemente pero no necesariamente en el orden indicado: (¡1), lisis de las bacterias magnetotácticas, (¡2), eliminación del material, en particular del material orgánico, que no forma parte de la parte central de los magnetosomas y que no pudo ser eliminado durante ¡1, (¡3), recuperación y lavado de la suspensión que contiene las partes centrales de los magnetosomas. Todas estas secuencias se pueden realizar mediante cualquier combinación de dichos procesos (a) a (g), repetidos una o varias veces.

En una forma de realización, la secuencia (¡1) puede comenzar con la concentración de las bacterias magnetotácticas, en particular mediante centrifugación a 1000-10000 g y/o utilizando dicho otro proceso de selección, preferentemente utilizando un sistema de filtración tangencial, donde el tamaño de los orificios es inferior al tamaño de las bacterias magnetotácticas. La concentración de bacterias al final de esta secuencia puede ser de entre 1,1 y 104 veces mayor que la concentración bacteriana medida al principio de (¡1). A continuación, las bacterias magnetotácticas, concentradas o no, se pueden Usar. La lisis se puede realizar por choque osmótico, utilizando dicho proceso químico en el que dicha solución química es preferentemente un tampón de lisis. Se puede realizar añadiendo un volumen de tampón de lisis superior al volumen de bacterias, preferentemente igual a 2 a 100 veces el volumen de Usado bacteriano, más preferentemente igual a 4 veces el volumen de bacterias. Al final de esta secuencia, se obtiene una suspensión de magnetosomas tratados, extraídos de las bacterias, mezclados con restos bacterianos y posiblemente con una cierta cantidad de bacterias magnetotácticas no Usadas.

En otra forma de realización, la secuencia (¡2) consiste en tratar las suspensiones de magnetosomas obtenidas al final de (¡1) para eliminar los residuos de materia, en particular de materia orgánica, preferentemente mediante dicha solución química, utilizando detergentes, como el fenol o el diclorometano, lo que permite eliminar la membrana o el material, en particular la materia orgánica, que rodea a los magnetosomas tratados.

En otra forma de realización, la secuencia (¡3) consiste en lavar la suspensión obtenida (¡2) varias veces para eliminar todos los residuos procedentes del detergente y obtener una suspensión que contenga las partes centrales de los magnetosomas.

En una forma de realización, la secuencia (¡i) consiste en cubrir la parte central de los magnetosomas con un recubrimiento, preferentemente apirógeno. Se puede realizar mediante dicho proceso de recubrimiento químico, en particular mezclando la suspensión que contiene las partes centrales de los magnetosomas obtenidos al final de (¡3) con una suspensión que contiene el recubrimiento. Esta mezcla se puede obtener por homogeneización, por sonicación, preferentemente de baja potencia, de menos de 500, 250, 100, 50, 25, 10, 5 ,2 o 1 vatio, en particular utilizando un dedo sonicador o un baño sonicador, por agitación, por calentamiento, por radiación y permitiendo así que el recubrimiento se adhiera o se asocie a la superficie de las partes centrales de los magnetosomas. La mezcla se puede realizar a un pH neutro, ácido o básico, preferentemente a un pH que pueda favorecer las interacciones y/o reacciones químicas que produzcan una asociación entre el recubrimiento y las partes centrales de los magnetosomas. La masa del recubrimiento utilizado es preferentemente entre una milésima y mil veces la masa de las partes centrales de los magnetosomas, preferentemente entre una centésima y cien veces esta masa, más preferentemente entre una décima y diez veces esta masa. Al final de la secuencia (¡i) se obtiene una suspensión que contiene las partes centrales de los magnetosomas recubiertas con un recubrimiento apirógeno.

En una forma de realización, la parte central de magnetosomas obtenidas al final de la secuencia (¡3) se esteriliza, preferentemente utilizando un método que no desnaturalice esta parte central, como el autoclave. A continuación, la secuencia (¡i) se realiza preferentemente en un entorno estéril para obtener una preparación apirógena al final de la secuencia (¡i).

En una forma de realización, la suspensión obtenida al final de la secuencia (¡i) se esteriliza, preferentemente utilizando un método como los rayos gamma que no destruye el recubrimiento y la parte central de los magnetosomas.

En una forma de realización, el rendimiento de obtención de la suspensión que contiene las partes centrales recubiertas con los magnetosomas se estima como igual a la cantidad de hierro contenida en esta suspensión dividida por la cantidad de hierro inicial contenida en la suspensión de bacterias magnetotácticas antes de la secuencia de lisis. Este rendimiento es preferentemente superior a 1, 2, 5, 10, 25, 50, 75 o 100%. Este rendimiento se puede optimizar mediante la combinación de varios de dichos procesos entre sí y/o mediante la repetición de uno o más de dichos procesos.

empos expermen aes:

Descripción de las tablas:

Tablas 1 y 2: Propiedades de varios tipos de suspensiones que contienen BNF-Starch, bacterias enteras, partes centrales de magnetosomas sin recubrimiento, partes centrales de magnetosomas recubiertas con poli-L-lisina, chitosán, carboximetildextrano, ácido cítrico, ácido oleico, sílice, ácido fólico, DOPC, alendronato, nerdronato, PEI, Al(OH)3, donde las especies de bacterias magnetotácticas son AMB-1 y MSR-1. En la Tabla 1: La concentración de endotoxina medida en UE por miligramo de hierro por mililitro de suspensión, porcentaje de disminución tras 20 minutos de absorción, medida a 480 nm, de 1 mg de las distintas suspensiones, variación de la temperatura (AT) y pendiente en el origen de esta variación (8T/8t) para las suspensiones mezcladas con células GL-261 tratadas según la condición 3, porcentaje de células vivas para las suspensiones mezcladas con células GL-261 tratadas según las condiciones 1, sin campo (-B), y según la condición 2, con campo con un aumento máximo de la temperatura de 45°C, % de células vivas (+ B). El porcentaje de células vivas es el número de células vivas tratadas en las condiciones 1 o 2 dividido por el número de células vivas no tratadas a 37°C. Para el primer estudio con BNF-Starch, el porcentaje de células vivas es el número de células vivas tratadas en las condiciones 1 o 2 dividido por el número de células vivas no tratadas a 45°C. En la Tabla 2:Grosor del recubrimiento en nm, punto isoeléctrico en unidad de pH, tamaño hidrodinámico en nm, potencial zeta medido en mV en función del pH, de las nanopartículas sintéticas recubiertas o sin recubrir, contenidas en las distintas suspensiones, porcentaje de nitrógeno (%N), carbono (%C), hidrógeno (%H), azufre (%S) en las nanopartículas sintéticas recubiertas o sin recubrir.

Tabla 3: Propiedades de unión de las partes centrales entre ellas para diferentes recubrimientos.

Material y métodos:

Determinación de la concentración en hierro de las diferentes suspensiones de nanopartículas: Las nanopartículas se disuelven primero con ácido clorhídrico 12N y los iones Fe2+ se oxidan a iones Fe3+ con peróxido de hidrógeno. A continuación, se utiliza tiocianato de potasio para formar un complejo con los iones Fe3+ y se determina la concentración de Fe3+ midiendo la absorción del complejo a 476 nm.

Microscopíaelectrónica de transmisión (MET): La METse utiliza para determinar el tamaño, la distribución en tamaño de las diferentes nanopartículas, el grosor del recubrimiento de las nanopartículas y el tipo de organización de las nanopartículas. Para realizar los estudios mediante MET, las diferentes suspensiones se lavan dos veces y se vuelven a suspender en agua autoclavada MilliQ para obtener una concentración en hierro de 300 pg/ml. Se depositan 5 pl de cada suspensión sobre rejillas de carbono. Las rejillas se secan durante por lo menos dos horas a temperatura ambiente y luego se observan bajo MET (JEOL LaB6 JEM-2100).

Ensayo de lisado de amebocitos de Limulus (LAL): Los ensayos de LAL se realizan en condiciones estériles utilizando el kit 88282 de Thermo Scientific denominado "Pierce LAL Chromogenic Endotoxin Quantitation Kit". 1 mi de cada suspensión, homogeneizada por sonicación y lavada con agua apirógena, se calienta primero a 70°C durante 10 minutos en un baño seco para desnaturalizar cualquier proteína residual que pudiera distorsionar los resultados del ensayo de LAL. A continuación, se introducen 25pl de cada suspensión que contiene 10 pg de hierro en los pocilios de una microplaca que se mantiene a una temperatura de 37°C durante toda la duración del experimento. Se añaden 25pl de la solución del kit de LAL para iniciar la reacción. Tras 10 minutos de reacción, se introducen 50 pl del sustrato cromsgpico en los pocilios durante 6 minutos para poder detectar la cantidad de endotoxinas. Por último, se añaden 2[ñ deácido acético para detene r la reacción. La densidad óptica de las suspensiones obtenidas se mide a 405 nm mediante un lector de microplacas. A continuación, se calcula la concentración de endotoxinas utilizando un patrón estándar suministrado con el kit. Para verificar que el ensayo de LAL no interfiere con las nanopartículas, se mide una tasa de recuperación, definida por ser igual a Ctotai/Ci+C2, donde Ctotai es la concentración de endotoxinas de las suspensiones de nanopartículas mezcladas con una cantidad conocida de Endotoxinas d de 0,5 UE/ml, Ci es la concentración de endotoxinas en las diferentes suspensiones de nanopartículas y C2=0,5 UE/ml. La tasa de recuperación estimada durante las diferentes mediciones es superior al 50%, lo que indica que las nanopartículas no interfieren en el ensayo de LAL.

Analizador elemental de carbono, hidrógeno, nitrógeno y azufre (CHNS): Las mediciones se realizan con un analizador CHNS (Flash EA 1112 Analyzer de Thermo Fischer scientific) utilizando 10 mg de hierro de cada suspensión liofilizada, lo que permite determinar el porcentaje en carbono, nitrógeno, hidrógeno y azufre de estas suspensiones.

Mediciones de dispersión: El potencial zeta y el tamaño hidrodinámico (diámetro hidrodinámico en el caso de objetos esféricos) de las distintas nanopartículas se miden con el Zetasizer Nano ZS de Malvern Instruments. Los objetos esféricos se identifican con el perfil exponencial decreciente de la función de correlación. Para las mediciones, las suspensiones de nanopartículas contienen hierro a 30pg/m I y se encuentran a un pH ajustado entre 2 y 12 utilizando soluciones de ácido clorhídrico e hidróxido de sodio.

Mediciones de absorción: La variación en el tiempo de la absorbancia de las diferentes suspensiones de nanopartículas se mide a 480 nm utilizando un espectrofotómetro de absorción UviLine9400 Secomam.

Determinación de la concentración de amina primaria para 1 mg en hierro de la suspensión de partes centrales de la nanopartícula sintética: Un método para controlar la pureza de la parte central es la dosificación de aminas a través del TNBSA (ácido 2,4,6-trinitrobenceno sulfónico), que tiene la particularidad de reaccionar con las aminas primarias. El primer paso consiste en añadir 1 mg de hierro de la parte central a una solución de tampón de bicarbonato sódico 0,1 M a pH 8,5 y, a continuación, se añade TNBSA (R-S03H), lo que provoca la siguiente reacción: R - NH2 R- S 03H<=> H2S03 R’- NH - R. Esta reacción se realiza a 37°C durante 2 h y el compuesto obtenido se tiñe de amarillo (R NH - R), su concentración de amina se determina por absorción a 405 nm. Esta concentración es equivalente a la de la parte central. Se realiza una curva de calibración con glicina que tiene una función de amina primaria.

Determinación de la concentración de fosfato para 1 mg en hierro de la suspensión de la parte central de la nanopartícula sintética: El ensayo de los grupos fosfato de la parte central se realiza por colorimetría. El molibdato de amonio ((NH4)2Mo04) reacciona primero en presencia de fosfato (procedente de una solución madre (DOPC) para la calibración o procedente de las muestras que se van a ensayar tras la digestión con ácido perclórico al 70% durante 2 h a 130°C). El precipitado de molibdato es amarillo e inestable. Muy rápidamente, se añade ácido ascórbico que reducirá este complejo para obtener una sal de molibdato de color azul, que es un compuesto estable (se calienta durante 5 minutos a 100°C en un baño seco para activar esta reducción) y se mide la cantidad de complejo de fosfato por absorbancia a 800 nm.

Toxicidad celular y medición de la temperatura de las distintas nanopartículas expuestas o no a la aplicación de un campo magnético alterno: Las células GL261 se siembran en un frasco T175 hasta alcanzar el 70-80% de confluencia, se retira el sobrenadante, se añaden 4 mi de tripsina-EDTA al 0,25% a las células, se incuban las células durante 5 minutos y se desprenden. La tripsina se desactiva añadiendo 30 mi de medio celular. A continuación, las células se diluyen hasta alcanzar una concentración de 1,25 106 células por mililitro tras centrifugarlas a 700 rpm durante 10 minutos a 4 °C. Se introducen 400 példtes: en tubos Eppendorf para obtener ~ 5.10+5 células por condición. Las distintas suspensiones de nanopartículas sintéticas se añadieron a los tubos a una concentración final de 1 mg/ml en hierro. A continuación, se calientan los tubos eppendorf durante 10 minutos a 37°C. Se siguen 3 condiciones. Para la condición 1 de tratamiento, los tubos se mantienen a 37°C durante 30 minutos utilizando un baño de calor seco. Para la condición 2 de tratamiento, los tubos se mantienen a 45°C durante 30 minutos mediante la aplicación de un campo magnético alterno con una frecuencia de 198 kHz y una intensidad media ajustada de entre 23 y 46 mT para mantener la temperatura a 45°C. Para la condición 3 de tratamiento, los tubos se exponen a la aplicación de un campo magnético alterno con una frecuencia de 198 kHz y una intensidad media de 32 mT durante 30 minutos. Las variaciones de temperatura a lo largo del tiempo se miden con una sonda termopar colocada en los tubos eppendorf. Tras los tratamientos, los contenidos de los tubos se introducen en un frasco T 25 al que se añaden 6 mi de medio RPMI y 10% de suero bovino fetal. Las células se incuban durante 24 horas en presencia de un 5% de C02. Se realiza una prueba de viabilidad celular con azul Trypan, 24 horas después, que permite discriminar las células vivas incoloras de las células muertas teñidas.

Ejemplo 1: Caracterización de suspensiones que contienen BNF-Starch.

Se prueban las nanopartículas sintetizadas químicamente por la empresa Micromod, llamadas BNF-Starch (Referencia: 10-00-102). Estas nanopartículas de óxido de hierro están rodeadas de hidroxietil-almidón y presentan un diámetro hidrodinámico de 119 nm. Presentan un punto isoeléctrico de pH 9,5, un potencial zeta que varía de 7 mV a pH 2 a -20 mV a pH 12 y un porcentaje de carbono medido con el CHNS de 8,7%. Las mediciones MET permiten calcular el espesor del recubrimiento, de 1 a 4 nm. La variación de la absorción con el tiempo, medida a 480 nm, de una suspensión que contiene 1 mg de BNF-Starch no disminuye en 20 minutos, lo que indica la estabilidad de esta suspensión. Un ensayo de LAL, realizado en estas suspensiones, reveló un bajo nivel de endotoxinas (<50 UE/mg/ml). Para una primera serie de mediciones, la Tabla 1 muestra que cuando una mezcla de una suspensión de células BNF-Starch y GL-261 se somete a la condición 3 del tratamiento, la temperatura de la mezcla aumenta ligeramente en 6,2°C, pasando de 36,5°C antes de la aplicación del campo a 42,7°C tras 30 minutos de aplicación del campo. La pendiente en el origen de la variación de la temperatura se estima en 0,009°C/seg. Cuando esta misma mezcla se somete a la condición 2 de tratamiento, la Tabla 1 muestra que el porcentaje de células vivas es del 78+5%, similar al 71+5% obtenido en la condición 1 de tratamiento, sin campo. Esto indica la baja citotoxicidad inducida por BNF-Starch en las células GL261 en presencia de la condición 2 de tratamiento en comparación con las células calentadas a 45°C. En una segunda serie de mediciones, cuando la mezcla se somete a la condición 2 de tratamiento, la Tabla 1 muestra que el porcentaje de células vivas es del 31%, inferior al 86% obtenido durante la condición 1 de tratamiento, sin campo cuando este porcentaje se estima por comparación con el número de células vivas a 37°C. Esto indica la citotoxicidad inducida por el BNF-Starch en las células GL261 en presencia del tratamiento según la condición 2 en comparación con las células calentadas a 37°C.

Ejemplo 2: Cadenas pirógenas de magnetosomas extraídas de la cepa AMB-1.

Preparación: Las bacterias Magnetospirillum AMB-1 (ATCC, cepa 79024) se introducen primero en un medio de cultivo estéril que contiene los nutrientes y aditivos necesarios para la proliferación de las bacterias magnetotácticas y la producción de magnetosomas (medio ATCC 1653) y los medios se introducen en una incubadora a 30°C durante 7 días. Después de 7 días, se centrifuga el medio, se lava el pellet bacteriano, las bacterias magnetotácticas se concentran utilizando un imán, se introducen en un tubo que contiene 1 mi de TRIS 0,05 M, se sonican utilizando un dedo sonicador durante 2 horas a 30°C a 0°C y luego se lavan 17 veces con agua Millipore® estéril con la ayuda de un imán. Se obtiene una suspensión que contiene cadenas de magnetosomas pirógenos extraídos de las bacterias magnetotácticas.

Caracterización: Las mediciones MET mostraron la presencia en estas suspensiones de cadenas de magnetosomas con longitudes entre 50 y 800 nm, y tamaños de magnetosomas entre 5 nm y 60 nm. El grosor del recubrimiento es de 1 a 5 nm. La absorción de estas suspensiones que contienen 1 mg de hierro, medida a 480 nm, disminuye en un 30% después de 20 minutos, lo que demuestra la baja sedimentación de estas suspensiones. Las mediciones de dispersión de luz en estas cadenas indican la presencia de tres poblaciones de cadenas, el 5% con un tamaño hidrodinámico (TH) de 176 nm, el 81% con HS de 986 nm y el 14% con HS de 4363 nm. Presentan un punto isoeléctrico con un pH de 4,2, un potencial zeta que varía de 20 mV a pH 2 a -38 mV a pH 12. El análisis CHNS revela un porcentaje de carbono en estas cadenas del 13,9%. La concentración de endotoxina de estas suspensiones, medida por el ensayo LAL, se estimó en un valor elevado de entre 18.000 y 150.000 UE por mi por mg de óxido de hierro. Las mediciones de absorción de infrarrojos por transformada de Fourrier realizadas con un espectrómetro Nicolet FT-IR modelo 380 sugieren también la presencia de endotoxinas. Estos espectros indican la presencia de picos en 1250 cm'1 y 1050 cm'1, que pueden atribuirse a las vibraciones de los grupos fosfato de los lipopolisacáridos y fosfolípidos. En una primera serie de mediciones, cuando las cadenas de magnetosomas pirógenos extraídos de AMB-1 se mezclan con células GL-261 y la mezcla se somete a la condición 3 de tratamiento, la temperatura de la mezcla aumenta 20,5°C, pasando de 36°C antes de la aplicación del campo a 56,5°C después de 30 minutos de aplicación del campo. La pendiente en el origen de la variación de la temperatura se estima en 0,043°C/seg. Este aumento de la temperatura es superior al observado para el BNF-Starch. En una segunda serie de mediciones, cuando esta mezcla se somete a la condición 2 de tratamiento en presencia del campo, la Tabla 1 muestra que el porcentaje de células vivas es bajo, del 10%, e inferior al 55% obtenido durante la condición 1 de tratamiento, sin campo. Esto indica la citotoxicidad inducida por estos magnetosomas pirógenos en las células GL261 en presencia del tratamiento en las condiciones 1 y 2, con una citotoxicidad mayor para la condición 2 (en presencia del campo) que para la condición 1 (ausencia del campo).

Eficacia antitumoral en tumores U87-Luc implantados en cerebro de ratón: Se realizaron experimentos de eficacia en 7 grupos de diez ratones en los que se cultivaron tumores intracerebrales U87-Luc con volúmenes de entre 1 y 29 mm3 Durante estos experimentos, los ratones son alimentados según los procedimientos vigentes y se les da agua a voluntad. El estado general de los animales se controla diariamente, los ratones se pesan cada dos días y se sacrifican cuando se observa una reducción de su peso corporal superior al 15%, signos de dolor o una postura anormal. Los 7 grupos diferentes de ratones recibieron 8 días después de la inyección de las células U87-Luc en el lugar de inyección de las células tumorales (2.2.0): una solución de 2 pl de NaCI al 0,9% (grupos 1 y 2); 2 pl de una suspensón de magnetosomas en maghemita a 20 mg/ml (grupos 3, 4 y 5)pl2de una suspensón de BNF-Starch en maghemita a 20 mg/ml (grupos 6 y 7). 8 días después de la inyección de células U87-Luc, los volúmenes tumorales medios de los grupos 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7 son 29, 10, 5, 3, 25, 10 y 2 mm3, respectivamente. Los grupos de ratones 2, 4, 5 y 7 se exponen 3 veces por semana durante 5 semanas a un campo magnético alterno de una intensidad media de 25 mT y una frecuencia de 198 kHz durante 30 minutos. Se realizan estudios histológicos en los ratones del grupo 4 para determinar si el tumor desaparece completamente 150 días después de la administración de las cadenas de magnetosomas. Los tejidos estudiados en histología se obtienen de ratones sacrificados, se extraen los cerebros, se fijan con una solución de paraformaldehído al 4%, se cortan en cortes transversales de 2 mm de grosor, se incluyen en bloques de parafina de 3 pm de espesor, se colocan en portaobjetos de vidrio y se tiñen con hematoxilina-eosina (H&E) para distinguir la zona sana de la zona tumoral. Por último, se mide la temperatura durante los diferentes tratamientos mediante una cámara de infrarrojos.En los ratones que sólo contenían tumores, tratados sólo con la administración de nanopartículas (cadena de magnetosomas y BNF) o con las aplicaciones múltiples del campo magnético alterno, los volúmenes tumorales aumentan rápidamente hasta alcanzar un volumen medio de 150 mm3 en menos de 40 días tras la administración de las células tumorales. Los tiempos medios de supervivencia de los ratones pertenecientes a los grupos 1, 2 y 6 se estimaron en 38 días de media. Estos resultados sugieren que ni la aplicación del campo magnético alterno ni la sola administración de cadenas de BNF-Starch o magnetosomas tuvieron un efecto antitumoral significativo en los tumores U87-Luc.

En los ratones tratados mediante la administración de cadenas de magnetosomas y múltiples aplicaciones del campo magnético, se observa un ligero aumento de la temperatura durante las tres primeras sesiones de aplicación del campo, que es similar para los ratones de los grupos 4 y 5 y que es de 4°C (primera sesión), 2°C (segunda sesión) y 0,5°C (tercera sesión). No se observó ningún aumento de la temperatura en las siguientes sesiones de aplicación del campo entre los ratones pertenecientes a los grupos 4 y 5. En los demás grupos no se observó ningún aumento de la temperatura. En el caso de los ratones pertenecientes al grupo 5 con tumores grandes (~ 25 mm3), se observa una disminución significativa del volumen tumoral durante los 7 días siguientes a la administración de las cadenas de magnetosomas, del 64%. En general, el volumen del tumor aumentó significativamente menos en el grupo 5 que en los grupos 1, 2, 3 y 6 durante los 28 días siguientes a la administración de las cadenas de magnetosomas. Además, los ratones del grupo 5 viven de media una semana más que los de los grupos 1, 2 y 6. Para el 40% de los ratones pertenecientes al grupo 4 con tumores pequeños (~ 3 mm3), el volumen medio del tumor disminuye durante los 51 días siguientes a la administración hasta la desaparición completa del tumor. Estos ratones están completamente curados. De hecho, estos ratones siguen vivos 143 días después de la administración de las cadenas de magnetosomas (J143). La curación completa de estos ratones fue confirmada por el estudio de las secciones histológicas de sus cerebros, tomadas en D143, mostrando la ausencia de tumores y lesiones. Para los ratones del grupo 7, tratados con BNF-Starch, el aumento del volumen medio del tumor y el tiempo de 45 días fueron similares a los de los ratones de los grupos 1, 2 y 6. No se observó ningún efecto antitumoral.

Podemos concluir que: (i) para el 40% de los ratones con un volumen medio de tumores U87-Luc tratados de 3mm3, es posible destruir completamente estos tumores administrando 40 pg en maghemita de una suspensbn de cadenas de magnetosomas pirógenos extraídos de AMB-1 en estos tumores y exponiendo estos tumores a múltiples aplicaciones de un campo magnético alterno con una fuerza media de 25 mT y una frecuencia de 198 kHz.

Ejemplo 3: Cadenas pirógenas de magnetosomas extraídas de la cepa MSR-1.

Preparación: Las bacterias MSR-1 se cultivan primero a 30°C durante 5 a 7 días en un gel de agar en presencia de hierro y una baja concentración de oxígeno (0,5% de O2). Las colonias magnéticas se recolectan y se cultivan a 30°C en presencia de aire durante varios días en un medio de precultivo sin hierro que contiene fuentes de carbono, nitrógeno, minerales, oligoelementos y extractos de levadura. Las bacterias magnetotácticas obtenidas del precultivo se cultivan en un termentador de 50 litros a 30°C en un medio similar al del precultivo. Durante el crecimiento, el pH se mantiene entre 6,8 y 7 mediante la adición de un medio nutritivo ácido que contiene una fuente de hierro y se introduce aire comprimido en el medio de cultivo para promover el crecimiento bacteriano mientras se mantiene la concentración en oxígeno por debajo del 0,2% para permitir la síntesis de los magnetosomas. Las bacterias MSR-1 procedentes de la fermentación se concentran hasta una densidad óptica, medida a 565 nm (ODs65nm), de 110-120. A continuación, se mezclan 100 mi de este concentrado bacteriano con 400 mi de NaOH 5M y se calientan a 60°C durante 1h30 a 2h para lisar las bacterias. A continuación, los magnetosomas tratados se aíslan de los restos bacterianos colocando un imán de neodimio durante la noche contra la pared del recipiente que contiene la suspensión de bacterias lisadas y sustituyendo el sobrenadante que contiene hidróxido de sodio y restos bacterianos por PBS 1X. La suspensión obtenida se sonicó durante 20 segundos a 10 W en presencia de PBS 1X, se colocó frente a un imán de neodimio durante 15 minutos, se retira el sobrenadante y se volvieron a suspender los magnetosomas tratados en PBS 1X. Esta secuencia de sonicación y separación magnética se repite cuatro veces. De este modo se obtienen cadenas pirógenas de magnetosomas extraídas de la cepa MSR-1.

Caracterización: Las mediciones MET mostraron la presencia en estas suspensiones de cadenas de magnetosomas con longitudes entre 200 y 1500 nm, y tamaños de magnetosomas entre 20 nm y 60 nm. La absorción de las suspensiones que contienen 1 mg de hierro de estas cadenas, medida a 480 nm, disminuye en un 86% después de 20 minutos, lo que demuestra la baja estabilidad de estas suspensiones. Las mediciones de dispersión de luz realizadas en estas cadenas indican la presencia de dos poblaciones de cadenas con tamaños hidrodinámicos de 535 nm y 2822 nm. Presentan un punto isoeléctrico a un pH de 6,4, un potencial zeta que disminuye de 15 mV a pH 2 a -31 mV a pH 12. El análisis CHNS revela un porcentaje de carbono en estas cadenas de 4,1% deducido de la primera medida y 12,2% de media deducido en las 9 medidas siguientes. En una segunda serie de mediciones, se estimó que la concentración de endotoxina de estas suspensiones, medida mediante el ensayo LAL, era de entre 2000 y 17000 UE por mi por mg de hierro. Las mediciones de absorción de infrarrojos por transformada de Fourrier realizadas con un espectrómetro Nicolet FT-IR modelo 380 sugieren también la presencia de endotoxinas. Estos espectros indican la presencia de picos en 1150 cm'1 y 1030 cm'1, que pueden atribuirse a las vibraciones de los grupos fosfato de los lipopolisacáridos y fosfolípidos. En una primera serie de mediciones, cuando las cadenas de magnetosomas pirógenos extraídas de MSR-1 se mezclan con células GL-261 y se someten a la condición 3 de tratamiento, la temperatura de la mezcla aumenta 9,4°C, pasando de 36,2°C antes de la aplicación del campo a 45,6°C después de 30 minutos de aplicación del campo. La pendiente en el origen de la variación de la temperatura se estima en 0,012°C/seg durante la primera medición y en 0,019°C/seg durante la segunda medición. Este aumento de la temperatura es superior al observado para el BNF-Starch. Cuando esta mezcla se somete a la condición 2 de tratamiento, la Tabla 1 muestra que el porcentaje de células vivas es bajo, un 5% en la primera medición y un 12% en la segunda, y es inferior al 39% obtenido en la condición 1 de tratamiento durante la primera y la segunda medición, sin campo. Esto indica la citotoxicidad inducida por estos magnetosomas pirógenos en las células GL261 en presencia del tratamiento en las condiciones 1 y 2, con una citotoxicidad mayor para la condición 2 (en presencia del campo) que para la condición 1 (ausencia del campo).

Ejemplo 4: Partes centrales de magnetosomas derivadas de MSR-1.

Preparación: Se mezclan 100 pl de la suspensbn que contiene cadenas de magnetosomas pirógenos extraídos de la cepa MSR-1 obtenida en el ejemplo 3 con 200 mi de una solución que contiene 1% de Tritón X-100 y SDS 1%, la mezcla se calienta toda la noche a 50°C, se coloca frente a un imán de neodimio, se retira el sobrenadante y se sustituye por 80 mi de fenol a pH 8. La suspensión obtenida se calienta durante 2 horas bajo sonicación a 60°C, se mantiene toda la noche a 60°C sin sonicación, se coloca frente a un imán, se retira el sobrenadante de la suspensión y se sustituye por 80 mi de cloroformo. La suspensión que contiene el cloroformo se coloca frente a un imán de neodimio, se retira el sobrenadante y se elimina el cloroformo residual adsorbido en la superficie de magnetosomas tratados calentando estos magnetosomas durante 2 horas bajo una campana. Por último, las partes centrales obtenidas de los magnetosomas se desorben de la pared de vidrio de los tubos que los contienen añadiendo 80 mi de NaOH 1M calentado durante 1 hora a 60°C en el baño de sonicación. La suspensión que contiene las partes centrales de los magnetosomas se coloca frente a un imán de neodimio, se retira el sobrenadante y se sustituye por agua estéril MilliQ, la suspensión se sónica durante 20 segundos a 10 W. Esta secuencia de lavado se repite cuatro veces. La suspensión que contiene las partes centrales de los magnetosomas se desgasifica con nitrógeno para evitar la oxidación, se esteriliza en autoclave y se conserva a -80°.

Caracterizaciones: Las mediciones MET revelan la ausencia de recubrimiento que rodea las partes centrales de los magnetosomas. La absorción de las suspensiones que contienen 1 mg de la parte central de los magnetosomas, medida a 480 nm, disminuye en un 60 a un 80% después de 20 minutos, lo que demuestra la baja estabilidad de estas suspensiones. La concentración de endotoxina de estas suspensiones se estimó entre 10 y 100 UE por mililitro por mg de óxido de hierro, lo que demuestra la naturaleza pirógena de esta suspensión. El punto isoeléctrico de estas suspensiones se midió a un pH ácido de 3,5. Además, entre el pH 4 y el pH 6, se observa un aumento del potencial zeta de -8 mV a -1,5 mV, y entre el pH 6 y el pH 8, se observa una disminución del potencial zeta de -1,5 mV a -27 mV, lo que parece ser característico de la presencia de agregados. Las mediciones de dispersión de la luz utilizando el Zetasizer revelan la presencia de un 79% de agregados de tamaño esférico hidrodinámico de 3076 nm y un 21% de agregados de tamaño esférico hidrodinámico de 677 nm. El análisis CHNS de estas suspensiones reveló concentraciones de carbono del 3,3% y de nitrógeno del 0,2%. Estas concentraciones son inferiores a las medidas para las cadenas de magnetosomas pirógenos extraídos de la MSR-1 (%N = 0,7 y %C=4,1) y para la bacteria MSR-1 entera liofilizada (%N=11 y %C=49). Estos resultados sugieren que la cantidad de material orgánico que rodea la parte central de los magnetosomas es significativamente inferior en la muestra que contiene las partes centrales de los magnetosomas que en las que contienen la bacteria MSR-1 entera o las cadenas de magnetosomas pirógenos extraídos de MSR-1. El ensayo de aminas indica que hay entre 260 ng y 1,2 pg de funciones aminas dentro o en la superficie de las partes centrales en la suspensión que contiene 1 mg en hierro de las partes centrales. El ensayo de fosfato indica que hay 10 pg de fóncde fosfato dentro o en la superficie de la parte central en la suspensión que contiene 1 mg en partes de hierro de la parte central. En una segunda serie de mediciones, cuando las partes centrales de los magnetosomas se mezclan con las células GL-261 y se someten a la condición 3 de tratamiento, la temperatura de la mezcla aumenta en 9,8°C tras 30 minutos de aplicación del campo. La pendiente en el origen de la variación de la temperatura se estima en 0,012°C/seg. Cuando esta mezcla se somete a la condición 2 de tratamiento, la Tabla 1 muestra que el porcentaje de células vivas es bajo a 0-9%, e inferior al 77% obtenido en la condición 1 de tratamiento, sin campo.

Ejemplo 5: Partes centrales de magnetosomas derivadas de AMB-1.

Preparación: El cultivo de la bacteria magnetotáctica AMB-1 se realiza según el proceso descrito en el Ejemplo 3. Tras 7 días de cultivo, las bacterias se concentran a 25°C mediante filtración tangencial (columna de 500 kDa, 800 rpm) en un volumen de 1 litro. A continuación, se mezclan mediante agitación en una solución que contiene EDTA 1 mM y protamina a 30 pg/ml a un pH = 7,4, el medíqdido se separa de las bacterias por filtración tangencial, y después las bacterias obtenidas se mezclan con una solución de PBS a un pH = 7,4, el medio líquido se separa de nuevo de las bacterias por filtración tangencial. A continuación, la suspensión de bacterias obtenida se diluye en PBS hasta alcanzar una densidad óptica, medida a 565 nm, que permite Usar las bacterias. La suspensión obtenida se sónica durante 30 minutos a 70 VV a 0°C utilizando una sonda de sonicación de titanio de 13 mm de diámetro. La suspensión obtenida se lava una primera vez colocando un imán contra la pared del recipiente que contiene la suspensión, retirando el sobrenadante, sustituyéndolo por una solución que contiene HEPES 10 mM y NaCI 200 mM a 6°C y sonicando mediante series de 3 pulsos a 30W durante 2 segundos. Se lavó 4 veces más con un método similar, sustituyendo la mezcla de HEPES y NaCI por agua apirógena estéril. Al final de los lavados, se obtienen suspensiones que contienen cadenas de magnetosomas, como se comprueba mediante MET. Las cadenas del magnetosoma se aíslan del sobrenadante utilizando un imán, el sobrenadante se sustituye por un volumen de 30 mi de TRI REAGENT (referencia de Sigma: T9424), la solución resultante se sonicó durante 2 horas a 50°C en un baño de calentamiento por ultrasonidos. A continuación, la suspensión obtenida se coloca frente a un imán a 4°C durante 1 hora, se retira el sobrenadante y se sustituye por una solución de etanoato de sodio y la mezcla se sónica durante 30 minutos a 37°C con un baño de calentamiento ultrasónico. A continuación, los magnetosomas tratados se lavan una primera vez aislando el sobrenadante con un imán, eliminando el sobrenadante, sustituyéndolo por una solución de etanoato de sodio y luego sonicando la suspensión durante 30 minutos a 37°C en un baño de calentamiento por ultrasonidos. Este paso de lavado se repite 3 veces de la misma manera. En particular, para eliminar la bicapa lipídica, la suspensión se coloca frente a un imán, se retira el sobrenadante y se sustituye por una solución que contiene Tritón X114 1%, desoxicolato 1% y EDTA 4mM. A continuación, la suspensión se agita mecánicamente durante 1 hora a 4°C, se coloca contra un imán, se retira el sobrenadante y se sustituye por la solución que contiene Tritón X114 1%, desoxicolato 1% y EDTA 4mM. La mezcla se agita durante una hora a 37°. A continuación, la suspensión se lava una primera vez colocando un imán contra la pared del recipiente que contiene la suspensión, eliminando el sobrenadante, sustituyéndolo por una mezcla de metanol/tampón de fosfato (v/v, 1/1). A continuación, la suspensión obtenida se lava colocándola contra un imán, eliminando el sobrenadante, sustituyéndolo por una mezcla que contenga metanol y un tampón de fosfato y, a continuación, la suspensión obtenida se sónica durante 5 minutos a 30 W utilizando un dedo sonicador. Se realiza un segundo lavado de la misma manera. La suspensión se lava de nuevo colocando la suspensión frente a un imán, retirando el sobrenadante, sustituyéndolo por agua apirógena estéril y sonicando con un baño de sonicación a 37°C durante 1 hora. Se realizan 5 lavados adicionales con agua de la misma manera. A continuación, la suspensión obtenida se esteriliza mediante autoclave a 121°C para obtener suspensiones que contengan las partes centrales de magnetosomas derivadas de AMB-1.

Caracterización: Las mediciones MET revelan la ausencia de recubrimiento que rodea las partes centrales de los magnetosomas. El análisis CHNS de estas suspensiones reveló un porcentaje de carbono del 4,9%, que era significativamente inferior al de la bacteria entera, que era del 32%, y al de las cadenas de magnetosomas pirógenos (13,9%). El nivel de endotoxinas en estas partes centrales es de 20 a 100 UE/mg/ml. La absorción de las suspensiones que contienen 1 mg de la parte central de los magnetosomas, medida a 480 nm, disminuye en un 80 a un 90% después de 20 minutos, lo que demuestra la baja estabilidad de estas suspensiones. El potencial zeta de estas suspensiones disminuye en general de 38 mV a pH 2 a -60 mV a pH 12. El punto isoeléctrico de estas suspensiones se midió a un pH ácido de 4,9. En una segunda serie de mediciones, cuando las partes centrales de los magnetosomas se mezclan con las células GL-261 y se someten a la condición de tratamiento 3, la temperatura de la mezcla aumenta en 23,8°C tras 30 minutos de aplicación del campo. La pendiente inicial de la variación de la temperatura se estima en 0,024°C/seg. Cuando esta mezcla se somete a las condiciones de tratamiento 2 y 1, el porcentaje de células vivas es del 48% y del 30%, respectivamente.

Ejemplo 6: Partes centrales de magnetosomas derivadas de MSR-1 recubiertas con poli-L-lisina.

Preparación: Las partes centrales de magnetosomas derivadas de MSR-1 descritos en el Ejemplo 4 se recubren con poli-L-lisina bajo una campana de flujo laminar en condiciones estériles. La solución de poli (hidrobromuro de L-lisina) de peso molecular 21000 g/mol (Gmac, CAS: 25988-63-0) contiene hidrobromuro de poli (L-lisina) a 40 mg/ml preparado en agua apirógena y filtrado con un filtro PES (polietersulfona) de 0,4$jm, conservado a -80°C. Durante la secuencia de recubrimiento, la masa de poli-L-lisina utilizada es siete veces superior a la masa de las partes centrales de los magnetosomas. Se introducen 25 mi de una suspensión que contiene las partes centrales de los magnetosomas a una concentración de hierro de 3 mg/ml en un tubo de vidrio, el tubo se coloca frente a un imán de NdFeB de 1,3 T, se retira el sobrenadante, se introducen entonces en el tubo 25 mi de una suspensión de polijhidrobromuro de L-lisina) a una concentración final de 20 mg/ml . A continuación, la suspensión obtenida se sónica durante 6 minutos a 4°C utilizando el dedo sonicador a 10°C. El tubo se agita durante 24 horas a 25°C en una rueda a una velocidad de 13 rotaciones por minuto a una temperatura de entre 4 y 8°C, la suspensión se sónica utilizando el dedo sonicador durante 10 segundos a 10 W. Para realizar un primer lavado, el tubo se coloca frente al mismo imán, se retira el sobrenadante y se sustituye por agua estéril MilliQ. Las suspensiones se lavan de esta manera entre 1 y 4 veces. Por último, la suspensión obtenida se sónica durante 2 minutos a 24 W en hielo a una temperatura inferior a 4°C para evitar el calentamiento y se ajusta el pH a 6,8-7,2 con KOH filtrado. De este modo, se obtiene una suspensión que contiene las partes centrales de magnetosomas recubiertas con poli-L-lisina.

Caracterización: La absorción de la suspensión que contiene 1 mg de las partes centrales de magnetosomas recubiertas con poli-L-lisina, medida a 480 nm, disminuyó aproximadamente un 50% después de 20 minutos, lo que indica la mayor estabilidad de esta suspensión en comparación con la suspensión que contiene las partes centrales de magnetosomas no recubiertas. Las imágenes MET mostraron la presencia de un recubrimiento de poli-L-lisina alrededor de las partes centrales de estos magnetosomas con un grosor de 4 a 16 nm, un grosor medio de 8 nm y una organización en cadenas en parte de estas nanopartículas sintéticas. Un ensayo LAL realizado en estas suspensiones reveló una baja concentración de endotoxinas de 78 UE por mililitro por mg de hierro (tasa de recuperación del 119%). Las mediciones de dispersión de la luz realizadas con el zetasizer revelan la presencia de un 92% de agregados de tamaño esférico hidrodinámico de 2489 nm y un 8% de objetos esféricos con un diámetro hidrodinámico de 137 nm que puede corresponder al diámetro hidrodinámico de las partes centrales de magnetosomas recubiertas con poli-L-lisina. El análisis CHNS reveló que la muestra que contenía 10 mg de las partes centrales de magnetosomas recubiertas con poli-L-lisina contenía porcentajes de nitrógeno del 0,4%, de carbono del 3,6%, de hidrógeno del 0,6% y de azufre del 0,03%. La muestra que contiene 10 mg de poli-L-lisina liofilizada contiene 13% de nitrógeno, 33% de carbono, 3,2% de hidrógeno y 0,03% de azufre. Estos resultados indican una menor concentración de carbono en las suspensiones que contienen las partes centrales de magnetosomas, recubiertas o no con poli-L-lisina, que en las que contienen bacterias enteras o cadenas de magnetosomas pirógenos extraídos de MSR-1. Esto sugiere la presencia de menos material orgánico en las suspensiones que contienen las partes centrales del magnetosoma recubiertas o no recubiertas que en las que contienen las bacterias enteras o las cadenas de magnetosomas pirógenos extraídos de MSR-1. La presencia del recubrimiento de poli-L-lisina alrededor de las partes centrales de los magnetosomas se sugiere por el menor porcentaje de carbono en la muestra que contiene las partes centrales de magnetosomas no recubiertas (%C = 3,3%) que en la que contiene las partes centrales de magnetosomas recubiertas con poli-L-lisina (%C = 3,6%). Cuando se mezclan 1,5 mg de una suspensión que contiene las partes centrales de magnetosomas recubiertas con poli-L-lisina con 100 pl de agar al 1% y la mezcla obtenida se somete a la aplicación de un campo magnético alterno de fuerza media 32 mT y frecuencia 198 kHz, la mezcla alcanza una temperatura de calentamiento de 43°C después de 175 segundos. Los geles que contienen 1,5 mg de nanopartículas químicas (Micromod BNF-Starch, referencia 10-00-102, y Micromod M-PEI, referencia 17-00-152), mezclados con 100 pl de agar al 1% se someten al mismo campo magnético alterno. Alcanzan una temperatura de 43°C después de 600 segundos, lo que demuestra mejores propiedades de calentamiento para las suspensiones que contienen las partes centrales de magnetosomas recubiertas con poli-L-lisina que para las que contienen nanopartículas químicas BNF-Starch y M-PEI. Cuando las partes centrales de magnetosomas recubiertas con poli-L-lisina se mezclan con las células GL-261 y la mezcla se somete a la condición 3, la temperatura de la mezcla aumenta en 11,5°C, pasando de 37°C antes de la aplicación del campo a 48,5°C tras 30 minutos de aplicación del campo. La pendiente en el origen de la variación de la temperatura se estima en 0,024°C/seg. Cuando la misma mezcla se somete a la condición 2 de tratamiento, el porcentaje de células vivas es del 53%, mientras que sólo es del 23% sin la aplicación del campo (condición 1 de tratamiento). Esto indica la citotoxicidad provocada por las suspensiones que contienen las partes centrales de magnetosomas recubiertas con poli-L-lisina sobre las células GL261 en presencia del campo magnético.

Citotoxicidad: Se realiza una prueba de citotoxicidad MTS (3-(4,5-d¡metilt¡azol-2-¡l)-5-(3-carbox¡metox¡fen¡l)-2-(4-sulfofenil)-2Htetrazolio) según la norma ISO 10993-5, por un organismo autorizado y en condiciones estériles sobre fibroblastos de ratón L929, utilizando suspensiones que contienen las partes centrales de magnetosomas recubiertas con poli-L-lisina a concentraciones de 0,01 mg/ml, 0,1 mg/ml, 0,5 mg/ml y 1 mg/ml en hierro contenido en medio EMEM10. Estas suspensiones se incuban primero con células L929 a 37°C en presencia de 5% de C02 durante 24 a 26 horas. Después de la incubación, se añaden a las células |2Dde una soluoín de tinción que contiene MTS y el agente fenazinametosulfato (PMS). Entonces las células se incuban de nuevo durante 120 a 135 minutos a una temperatura de 37°C en presencia de un 5% de CO2. La tinción, que da lugar a una absorción a 492 nm, permite demostrar la viabilidad de las células. La observación de las células al microscopio permite confirmar o invalidar la viabilidad de las células. Los resultados obtenidos muestran un porcentaje de células vivas del 100%, 92% y 89% para las suspensiones que contienen las partes centrales de magnetosomas recubiertas con poli-L-lisina a concentraciones de 0,5 mg/ml, 0,1 mg/ml y 0,01 mg/ml de hierro, lo que indica la ausencia de citotoxicidad de estas suspensiones a estas concentraciones. Para una concentración de 1 mg/ml, no fue posible llegar a una conclusión.

Pirogenicidad: Para confirmar la ausencia de pirogenicidad de la suspensión que contiene las partes centrales de magnetosomas recubiertas con poli-L-lisina, sugerida por los resultados del ensayo LAL, se realizó un ensayo pirógeno o en un conejo, según la norma ISO 10993-11, por un organismo autorizado. Para ello, la suspensión que contenía las partes centrales de magnetosomas recubiertas con poli-L-lisina a una concentración de hierro de 5 mg/ml se colocó en el baño de ultrasonidos durante 2 minutos y 1 mi de esta suspensión se diluyó en 119 mi de NaCI al 0,9%. La temperatura de la suspensión se mantuvo a 37°C durante 30 minutos, la suspensión se homogeneizó y se administró a tres conejos a una dosis de 10 mi /kg por vía intravenosa. La temperatura corporal de los tres conejos se midió cada 30 minutos durante 3 horas. Aumenta 0,02°C (primer conejo), 0°C (segundo conejo) y 0,22°C (tercer conejo). Ninguno de los tres conejos muestra un aumento de temperatura superior a 0,5°C y la suma de los aumentos de temperatura en los tres conejos, que es de 0,24°C, es inferior a 2,65°C. Por lo tanto, el producto probado no es pirógeno según los criterios de las farmacopeas Europea y Americana.

Toxicidad aguda: Se realizan pruebas de toxicidad sistémica aguda en ratones hembra C57BL/6 de 6 semanas de edad administrando 100 pl de suspensiones que contienen las partes centrales de magnetosomas recubiertas con poli-L-lisina a una concentración de 0 mg, 0,5 mg, 1 mg, 2 mg, 4 mg y 8 mg de hierro en la cola de los ratones. El peso corporal de cada ratón, medido diariamente durante 12 días después de la inyección, permanece estable, lo que indica que la dosis máxima tolerada por los ratones es superior a 8 mg, es decir, unos 400 mg/kg.

Eficacia antitumoral en tumores GL261 implantados subcutáneamente en ratones:

Utilizando una jeringa de 1 mi y 25 g, se administra un volumen de 50 pl que contiene 2.106 células de glioblastoma murino GL261 por vía subcutánea en el flanco izquierdo, entre la pata y el lomo, de ratones hembra negros 6 C57BL/J. Los tumores crecen durante 10 a 15 días hasta alcanzar un tamaño de entre 40 y 150 mm3 aproximadamente. Cuando los tumores han alcanzado este tamaño, los ratones se anestesian con gas isoflurano y se mantienen a 37°C mediante placas calientes. Utilizando una jeringa Hamilton de 250 pl, se administran 50 pl de dos suspensiones diferentes apirógenas en el centro de los tumores que contienen: (1), glucosa al 5%, (2), las partes centrales de magnetosomas recubiertas con poli-L-lisina a una concentración de 50 mg/ml en hierro, mezclado con glucosa al 5%. La suspensión 2 se administra en una cantidad, medida en pg de hierro, igual a 20.t, donde t es el tamaño de los tumores tratados en mm3. A continuación, los ratones se exponen (o no) durante 30 minutos a un campo magnético alterno de frecuencia 198 kHz e intensidad media variada entre 9 mT y 28 mT para mantener la temperatura intratumoral en un valor entre 43°C y 46°C durante las tres primeras sesiones del campo. Durante las siguientes sesiones de aplicación del campo, la intensidad media del campo magnético alterno se fija en 28 mT. La temperatura intratumoral se mide con un termopar. Las sesiones de aplicación del campo magnético se repiten 3 veces por semana, 15 veces en total. Los ratones cuyos tumores siguen aumentando tras dos sesiones de calentamiento se someten a una segunda administración de la suspensión (2). El tamaño de los tumores se mide con un calibrador y los volúmenes tumorales se estiman mediante la fórmula VtUmoraF0,5 (L.l2), donde L y I representan la longitud y el ancho de los tumores, respectivamente. Los ratones son sacrificados cuando el volumen del tumor supera los 1000 mm3 y/o cuando el peso de los ratones ha disminuido en más de un 20% de una medición a otra. Según este protocolo, se realizan curvas de seguimiento de la supervivencia y del volumen tumoral durante 71 días después de la administración de las suspensiones de nanopartículas.

Se observa que 5 de cada 10 ratones tratados con las partes centrales de magnetosomas recubiertas con poli-L-lisina y varias aplicaciones del campo magnético están totalmente curados 15 días después del inicio de las sesiones de calentamiento. En estos ratones, no hay rastro visible del tumor ni de sus secuelas (costra o cicatriz). Los 5 ratones restantes tratados con las partes centrales de magnetosomas recubiertas y la aplicación del campo magnético, que no están totalmente curados, son sacrificados unos 30 días después del inicio del tratamiento. Los ratones tratados con las partes centrales de magnetosomas recubiertas con poli-L-lisina sin aplicación del campo magnético son todos sacrificados unos 12 días después del inicio del tratamiento. Las tasas de supervivencia, 50 días después del inicio del tratamiento, son del 60% para los ratones tratados con la suspensión que contiene las partes centrales de magnetosomas recubiertas y la aplicación del campo magnético alterno y del 0% para los ratones tratados con la suspensión que contiene las partes centrales recubiertas sin la aplicación del campo. Sin la aplicación del campo magnético, todos los ratones murieron antes de los 20 días posteriores al inicio del tratamiento.

Eficacia antitumoral en tumores U87 implantados en el cerebro del ratón:

Los protocolos de administración de las células tumorales y de seguimiento de los ratones son idénticos a los descritos en el Ejemplo 3. 6 días después de la administración de las células tumorales U87-Luc en el cerebro del ratón, cuando los tumores alcanzan un tamaño entre 0,8 y 2 mm3, se administran 2 pl de dos suspensiones diferentes en coordenadas (0, 2,2) en cerebros de ratones anestesiados. Para los grupos 1 y 2, que contienen 9 ratones cada uno, los ratones recibieron una suspensión que contenía las partes centrales de magnetosomas recubiertas con poli-L-lisina a una concentración de hierro de 250 mg/ml mezclada con glucosa al 5%. Para los grupos 3 y 4, con 9 ratones cada uno, se les administró una suspensión que contenía glucosa al 5%. Los ratones de los grupos 1 y 3 no están expuestos a un campo magnético. Los grupos 2 y 4 se exponen durante 30 minutos a un campo magnético alterno de una intensidad media de 25 mT y una frecuencia de 198 KHz tres veces por semana durante 6 semanas. Para el grupo 2, 4 ratones cuyos tumores reaparecen reciben un tratamiento adicional 8 semanas después de la implantación de las células U87-Luc que consiste en una segunda administración de 2 pl de la suspensión que contiene las partes centrales de magnetosomas recubiertas con poli-L-lisina a una concentración de hierro de 147 mg/ml mezclada con glucosa al 5% y la aplicación del campo magnético alterno de fuerza media 25 mT y frecuencia de 198 KHz tres veces por semana durante 3 semanas. Las variaciones de temperatura se miden durante los diferentes tratamientos mediante una cámara de infrarrojos.

En los ratones tratados mediante la administración de las suspensiones que contienen las partes centrales de magnetosomas recubiertas con poli-L-lisina y mediante múltiples aplicaciones del campo magnético alterno se observó un aumento de la temperatura durante las primeras dieciséis sesiones de aplicación del campo para los ratones del grupo 2, que es en promedio de 8°C (primeras 3 sesiones), 5°C (12 sesiones siguientes) y 1°C (16a sesión). No se observó ningún aumento de la temperatura en las siguientes sesiones de aplicación del campo de los ratones del grupo 2. En el caso de los cuatro ratones del grupo 2 que fueron tratados de nuevo tras las 16 sesiones de calentamiento debido a la desaparición total del tumor, se observa un aumento de la temperatura de 5,5°C durante las 9 sesiones adicionales de aplicación del campo. Para los grupos 1, 3 y 4 no se observó ningún aumento de la temperatura.

En los ratones de los grupos 3 y 4, los volúmenes tumorales aumentan rápidamente hasta alcanzar un volumen medio de 200 mm3 en menos de 45 días tras la administración de las células tumorales. Los tiempos medios de supervivencia de los ratones de los grupos 3 y 4 se estimaron en 40 días de media tras la administración de las células tumorales, lo que sugiere que la sola aplicación del campo magnético alterno no tiene efecto antitumoral. En los ratones del grupo 1, el volumen del tumor aumentó una media de 5 mm3 por semana, mucho menos que en los grupos 3 y 4. Además, 13 semanas después de la implantación de las células U87-Luc, el 50% de los ratones del grupo 1 están vivos, presentando un volumen tumoral medio de 56 mm3. El tratamiento de los ratones del grupo 1 mediante la administración exclusiva de una suspensión que contiene las partes centrales de magnetosomas recubiertas con poli-L-lisina permite ralentizar el crecimiento del tumor y mejorar la supervivencia en comparación con los ratones de los grupos 3 y 4. El volumen medio del tumor disminuye durante los 85 días siguientes a la administración de una suspensión que contiene las partes centrales de magnetosomas recubiertas con poli-L-lisina hasta la desaparición total del tumor que se observa 42 días después de la administración de estas suspensiones (J42) para el 66% de los ratones. En el caso de los 4 ratones del grupo 2 que recibieron un segundo tratamiento debido a la no desaparición de los tumores, el tumor desapareció completamente 20 días después del inicio del segundo tratamiento. En general, 91 días después de la administración de células U87-Luc, todos los ratones del grupo 2 siguen vivos y no muestran señal de bioluminiscencia, lo que sugiere la curación.

Podemos concluir que: (i), cuando las suspensiones que contienen las partes centrales de magnetosomas recubiertas con poli-L-lisina se administran en tumores U87-Luc, el crecimiento del tumor se ralentiza, lo que podría explicarse por la alta concentración de o por la presencia de poli-L-lisina, (ii), cuando estas mismas suspensiones se administran en tumores U87-Luc y se someten a múltiples aplicaciones de un campo magnético alterno de 198 kHz de frecuencia y 25 mT de fuerza media, es posible eliminar completamente estos tumores.

Ejemplo 7: Partes centrales de magnetosomas derivadas de MSR-1 recubiertas con Chitosán.

Preparación: Una suspensión que contiene 1 mg de la parte central de los magnetosomas mezclada con agua apirógena estéril se sónica durante 5 minutos con un dedo sonicador a una potencia de 5 W con pulsos de 0,1 segundos, separados por intervalos de 0,1 segundos. Se mezclan 0,25 mg de chitosán (clorhidrato de chitosán CRS, referencia Sigma Y0000104) con la suspensión que contiene 1 mg de la parte central de los magnetosomas y el pH de la suspensión se ajusta a 6,2 con NaOH 1M. La mezcla obtenida se sónica con el dedo sonicador a una potencia de 5 W, con pulsos de 0,1 segundos, separados por intervalos de 0,1 segundos, durante 60 minutos a 45°C, a continuación durante 15 minutos a 60°C, y posteriormente durante 15 minutos a 70°C. La suspensión obtenida se lava una primera vez colocando un imán de neodimio contra la pared del tubo de vidrio que contiene la suspensión, retirando el sobrenadante y sustituyéndolo por agua apirógena estéril. Se lava una segunda vez de la misma manera.

Caracterización: El nivel de endotoxinas de estos magnetosomas recubiertos con chitosán es de 25 UE/mg/ml. La absorción, medida a 480 nm, de una suspensión que contenía 1 mg de las partes centrales de magnetosomas recubiertas con chitosán disminuyó un 3% durante los 20 minutos de medición, lo que demuestra la estabilidad de esta suspensión. Las mediciones MET realizadas en las partes centrales de los magnetosomas recubiertas con chitosán indican una organización de estas nanopartículas sintéticas en cadena, la presencia de agregados y un recubrimiento que rodea las partes centrales de magnetosomas con un grosor medio de 6 nm. Cuando una suspensión que contiene las partes centrales de magnetosomas recubiertas con chitosán se mezcla con células GL-261 y la mezcla se somete a la condición 3 de tratamiento, la temperatura de la mezcla aumenta en 8,5°C. La pendiente en el origen de la variación de la temperatura se estima en 0,009°C/seg. durante una primera serie de mediciones. Cuando la misma mezcla se somete a la condición 2 de tratamiento, el porcentaje de células vivas es del 0- 5%, mientras que sólo es del 20% sin la aplicación del campo (condición 1 de tratamiento). Esto demuestra la eficacia de la destrucción de las células tumorales por las partes centrales de magnetosomas recubiertas con chitosán en la condición 2 de tratamiento. Se estima que el punto isoeléctrico de estos magnetosomas presenta pH 11. El potencial zeta varía entre 46 mV a pH 2 a -55 mV a pH 12. Los tamaños hidrodinámicos de estos magnetosomas se estiman en 273 nm para el 7% y 1908 nm para el 93% de ellos. El análisis CHNS indica que su porcentaje de carbono es del 3,2%, cercano al porcentaje de carbono del 3,3% medido para los magnetosomas no recubiertos.

Ejemplo 8: Partes centrales de magnetosomas derivadas de MSR-1 recubiertas con carboximetildextrano.

Preparación: Una suspensión que contiene 1 mg de la parte central de los magnetosomas mezclada con agua apirógena estéril se sónica durante 5 minutos con un dedo sonicador a una potencia de 5 W con pulsos de 0,1 segundos, separados por intervalos de 0,1 segundos. Se mezclan 4 mg de carboximetildextrano (referencia SIGMA 86524-10G-F) con 1 mg de la parte central de los magnetosomas y el pH de la mezcla se ajusta a 3,5 con ácido clorhídrico 1M. La mezcla resultante se sónica durante 60 minutos a 45°C utilizando el dedo sonicador a una potencia de 5 W, con pulsos de 0,1 segundos, separados por intervalos de 0,1 segundos. La suspensión obtenida se lava tres veces. Para el primer lavado, se coloca un imán contra la pared del tubo, se retira el sobrenadante y se sustituye por agua apirógena estéril. La suspensión obtenida se lava por segunda vez, y después por tercera vez, de la misma manera.

Caracterización: En una primera serie de mediciones, la absorción, medida a 480 nm, de una suspensión que contiene 1 mg de las partes centrales de magnetosomas recubiertas con carboximetildextrano no disminuye durante los 20 minutos de medición, lo que demuestra la estabilidad de esta suspensión. Las mediciones MET permiten estimar un grosor del recubrimiento que rodea las partes centrales de los magnetosomas de entre 2 y 20 nm. Las mediciones de dispersión de luz de las suspensiones que contienen las partes centrales de magnetosomas recubiertas con carboximetildextrano revelan la presencia de un 79% de objetos esféricos con un diámetro hidrodinámico de 1359 nm (población 1), un 6% de objetos esféricos con un diámetro hidrodinámico de 5124 nm (población 2) y un 15% de objetos esféricos con un diámetro hidrodinámico de 331 nm (población 3). El tamaño de la población 3 podría corresponder al de las partes centrales de los magnetosomas recubiertas con carboximetildextrano. El punto isoeléctrico se estima a pH 3,4 y el potencial zeta disminuye de 20 mV a pH 2 a -31 mV a pH 12. Cuando una suspensión que contiene las partes centrales de magnetosomas recubiertas con carboximetildextrano se mezcla con células GL-261 y la mezcla se somete a la condición 3 de tratamiento, la temperatura de la mezcla aumenta en 29°C. La pendiente en el origen de la variación de la temperatura se estima en 0,023°C/seg. Cuando la misma mezcla se somete a la condición 2 de tratamiento, el porcentaje de células vivas es del 11%, mientras que es del 63% sin la aplicación del campo (condición 1 de tratamiento). Esto demuestra la eficacia de la destrucción de las células tumorales por las partes centrales de los magnetosomas recubiertas con ácido cítrico utilizando la condición 2 de tratamiento. El porcentaje de carbono medido mediante CHNS en estos magnetosomas es del 3,7%.

Ejemplo 9: Partes centrales de magnetosomas derivadas de MSR-1 recubiertas con ácido cítrico.

Preparación: Una suspensión que contiene 50 mg de las partes centrales de los magnetosomas mezclada con 4,5 mi de agua apirógena estéril se sónica durante 5 minutos con el dedo sonicador a una potencia de 5W con pulsos de 0,1 segundos separados por intervalos de 0,1 segundos. 20 mg de esta suspensión, contenidos en un volumen de 1,8 mi, se mezclan con 35 mg de ácido cítrico monohidratado (referencia Sigma 33114-500G) contenidos en 8 mi de agua apirógena estéril. En esta preparación, la masa de hierro es 1,75 veces mayor que la masa de ácido cítrico. El pH de la suspensión se ajusta a 6 con hidróxido de sodio 1M y la mezcla obtenida se sónica a 90°C durante una hora. La suspensión obtenida se lava una primera vez colocando un imán de neodimio contra la pared del tubo de vidrio, retirando el sobrenadante y sustituyéndolo por agua apirógena estéril. Se lava una segunda vez de la misma manera.

Caracterización: La absorción, medida a 480 nm, de una suspensión que contiene 1 mg de las partes centrales de los magnetosomas recubiertas con ácido cítrico disminuye aproximadamente un 15% en 20 minutos, lo que demuestra la estabilidad de esta suspensión. Las mediciones MET de estas nanopartículas sintéticas revelan la presencia de numerosas cadenas, una buena dispersión de estas nanopartículas sintéticas, una baja agrupación y la presencia de un recubrimiento alrededor de la parte central de estos magnetosomas con un grosor de 1 a 15 nm. Un ensayo LAL realizado en estas suspensiones reveló una baja concentración de endotoxinas de 19 UE/mm por mg de hierro (tasa de recuperación del 188%). El análisis CHNS realizado sobre estas suspensiones liofilizadas reveló un porcentaje de nitrógeno del 0,8%, de carbono del 3,7%, de hidrógeno del 0,3% y la ausencia de azufre. La muestra que contiene únicamente ácido cítrico liofilizado contiene un porcentaje de nitrógeno del 0%, de carbono del 36%, de hidrógeno del 4,7% y no contiene azufre. Estos resultados indican un menor porcentaje de carbono en las suspensiones que contienen las partes centrales de los magnetosomas, recubiertas o no con ácido cítrico, que en las que contienen bacterias enteras o cadenas de magnetosomas pirógenos extraídos de MSR-1. Esto también puede sugerir la presencia de menos material orgánico en las suspensiones que contienen las partes centrales de los magnetosomas, recubiertas o no con ácido cítrico, que en las que contienen bacterias enteras o cadenas de magnetosomas pirógenos extraídos de MSR-1. La presencia del recubrimiento alrededor de las partes centrales de magnetosomas recubiertas con ácido cítrico se sugiere debido al menor porcentaje de carbono en la suspensión liofilizada que contiene la parte central de los magnetosomas (%C = 3,3%) que en la suspensión liofilizada que contiene las partes centrales de magnetosomas recubiertas con ácido cítrico (%C = 3,7%). Cuando una suspensión que contiene las partes centrales de los magnetosomas recubiertas con ácido cítrico se mezcla con células GL-261 y la mezcla se somete a la condición 3 de tratamiento, la temperatura de la mezcla aumenta en 25°C, de 35°C antes de la aplicación del campo a 60°C después de la aplicación del campo. La pendiente en el origen de la variación de la temperatura se estima en 0,038°C/seg. Cuando la misma mezcla se somete a la condición 2 de tratamiento, el porcentaje de células vivas es del 26%, mientras que es del 57% sin la aplicación del campo (condición 1 de tratamiento). Esto demuestra la eficacia de la destrucción de las células tumorales por las partes centrales de los magnetosomas recubiertas con ácido cítrico en la condición 2 de tratamiento. Las mediciones de dispersión de luz de estas suspensiones revelan la presencia de objetos no esféricos, que pueden corresponder a cadenas, de tamaño hidrodinámico 788 nm. El punto isoeléctrico se estima en pH 3,7 y el potencial zeta disminuye de 25 mV a pH 2 a -38 mV a pH 12.

Ejemplo 10: Partes centrales de magnetosomas derivadas de MSR-1, recubiertas con ácido oleico, preparados según el primer protocolo.

Preparación: Añadimos a 5 mi de una suspensión que contiene 5 mg de la parte central de los magnetosomas a una concentración de 1 mg/ml de hierro, 10pl de una solucbn de amoníaco NH 4OH (25% en peso molecular) para obtener un pH comprendido entre 10 y 11. La suspensión obtenida se sónica en un baño maría a una temperatura de 80°C durante 15 minutos con un dedo sonicador a una potencia de 6-7 W con pulsos de 0,2 segundos separados entre ellos por pausas de 0,5 segundos. Después, se añaden ya sea 26jZI de una solucón de ácido oleico a 211 mM (condición 1) o bien 50 pl de una solución de ácido oleico a 32 mM (0,4 mg) (condición 2). Después la mezcla se sónica con el dedo sonicador durante 1 hora a una potencia de 6-7 W con pulsos de 0,2 segundos, separados por intervalos de pulsos de 0,5 segundos. La suspensión obtenida se lava después con la ayuda de un imán de Neodimio que se coloca contra el tubo de vidrio que contiene la suspensión, el sobrenadante se retira y se sustituye por agua apirógena estéril. La suspensión se lava por segunda vez, y después por tercera y cuarta vez, de la misma manera. Después del último lavado, se toman alícuotas con el fin de realizar varias pruebas de caracterización. La suspensión se conserva a 4°C hasta su uso.

Caracterización: La absorción, medida a 480 nm, de una suspensión que contiene las partes centrales de magnetosomas recubiertas con ácido oleico no disminuye durante 20 minutos, lo que indica su estabilidad. Las mediciones MET de las partículas centrales de magnetosomas recubiertas con ácido oleico preparadas según la Condición 2 demuestran la presencia de agregados de nanopartículas y un recubrimiento que rodea las partes centrales de los magnetosomas de un grosor de 0,5 a 5 nm. Las mediciones de dispersión de la luz llevadas a cabo en estos magnetosomas recubiertos, sintetizados según la condición 2 , revelan la presencia de objetos esféricos estables, que no se agregan con un diámetro hidrodinámico de 123 nm que puede corresponder al diámetro hidrodinámico de estos magnetosomas recubiertos. El punto isoeléctrico se estima a pH 3,5 y el potencial zeta muestra la presencia de dos poblaciones cuyo potencial zeta disminuye para una población de 30 mV a pH = 2 a -60 mV a pH = 12 y para la otra población de -10 mV a pH = 6 a -35 mV a pH = 12. Cuando una suspensión que contiene las partes centrales de los magnetosomas recubiertas con ácido cítrico se mezcla con células GL-261 y la mezcla se somete a la condición 3 de tratamiento, la temperatura de la mezcla aumenta de 28°C. La pendiente en el origen de la variación de la temperatura se estima en 0,051 °C/seg.

Ejemplo 11 Partes centrales de magnetosomas derivadas de MSR-1, recubiertas con ácido oleico, preparadas según el segundo protocolo.

Preparación: La parte central puede estar recubierta con ácido oleico de la siguiente manera. Añadimos a 1 mi de una suspensión que contiene 10 mg de las partes centrales de los magnetosomas a una concentración de 1 mg/ml en hierro, 100 mg de una solución de ácido oleico a 10 mg/ml a pH 11. La suspensión obtenida se sónica durante 5 con un dedo sonicador a una potencia de 20 W, de forma continua y a temperatura ambiente. Después se congela la suspensión a -80°C durante 30 minutos y después se calienta a 80°C durante 5 minutos. Después la mezcla se sónica con el dedo sonicador durante 1,5 horas a una potencia de 10 W con pulsos de 3 segundos, separados por intervalos entre pulsos de 3 segundos. La suspensión obtenida se lava después con la ayuda de un imán de Neodimio que se coloca contra el tubo de vidrio que contiene la suspensión, el sobrenadante se retira y se sustituye por agua apirógena estéril. La suspensión se lava por segunda vez y después por tercera vez de la misma manera. Después del último lavado, se toman alícuotas con el fin de realizar varias pruebas de caracterización. La suspensión se conserva a 4°C hasta su uso.

Caracterización: Las propiedades de las partes centrales de magnetosomas recubiertas con ácido oleico pueden ser las siguientes. La absorción, medida a 480 nm, de una suspensión de las partes centrales de los magnetosomas recubiertas con ácido oleico que contiene 1 mg de hierro no disminuye durante 20 minutos, lo que indica su estabilidad. Cuando una suspensión que contiene las partes centrales de magnetosomas recubiertas con ácido oleico se mezcla con células GL-261 y la mezcla se somete a la condición 3 de tratamiento, la temperatura de la mezcla aumenta de 5°C. La pendiente en el origen de la variación de la temperatura se estima en 0,012°C/seg. Cuando esta mezcla se somete a la condición 2 de tratamiento, el porcentaje de células vivas es del 14%, mientras que es del 53% en ausencia del campo (condición 1 de tratamiento). El porcentaje de carbono en estos magnetosomas es del 3,4%.

Ejemplo 12: Partes centrales de magnetosomas derivadas de MSR-1 recubiertas con ácido fólico.

Preparación: Una suspensión que contiene 50 mg en hierro de las partes centrales de los magnetosomas mezclada con 4,5 mi de agua apiróegna estéril se sónica durante 5 minutos con un dedo sonicador a una potencia de 30 W con pulsos de 30 segundos, con intervalos de 10 segundos entre los pulsos. Un volumen de 1,8 mi que contiene 20 mg en hierro de las partes centrales de los magnetosomas, se introduce en un tubo de vidrio estéril de 10 mi colocado contra un imán, el sobrenadante se retira y se sustituye por 8 mi de una solución de ácido fólico a 2 mg/ml (Fisher BioReagents, reference: 59-30-3) mezclado con agua apirógena estéril, ajustada anteriormente a pH 9,5 con una solución de hidróxido de sodio 1M y se esteriliza por filtración (filtro de 0,45 pm). En esta preparación, la masa de hierro es 1,25 veces superior a la de la masa de ácido fólico. La mezcla obtenida se sónica durante 1,5 horas con el dedo sonicador a una potencia de 30 W, con pulsos de 30 segundos, separados por intervalos entre pulsos de 10 segundos. La suspensión obtenida de volumen 8 mi está contenida en un tubo de vidrio de 10 mi. Se lava una primera vez colocando un imán de neodimio contra la pared del tubo de vidrio, retirando el sobrenadante y sustituyéndolo por agua apirógena Hyclone y sonicando durante 1 minuto a 30W. Se lava cuatro veces más de la misma manera.

Caracterización: La absorción, medida a 480 nm, de una suspensión que contiene 1 mg de las partes centrales de magnetosomas recubiertas con ácido fólico no disminuye durante 20 minutos, lo que demuestra la estabilidad de esta suspensión. Las medidas de difusión de esta suspensión muestran la presencia de un 90% de agregados esféricos con un diámetro hidrodinámico de 2876 nm y un 10% de objetos esféricos con un diámetro hidrodinámico de 235 nm que podrían corresponder a los magnetosomas recubiertos de ácido fólico. El punto isoeléctrico de esta suspensión se estima a un pH 7,9 y el potencial zeta disminuye de 45 mV a pH 2 a -43 mV a pH 12. El grosor del recubrimiento que rodea las porciones centrales de estos magnetosomas se midió en un valor entre 1 y 4 nm. Cuando una suspensión que contiene las partes centrales de los magnetosomas recubiertas con ácido cítrico se mezcla con células GL-261 y la mezcla se somete a la condición 3 de tratamiento, la temperatura de la mezcla aumenta de 20°C. La pendiente inicial de la variación de la temperatura se estima en 0,042°C/seg. Cuando la misma mezcla se somete a la condición 2 de tratamiento, el porcentaje de células vivas es del 9%, mientras que es del 93% en ausencia del campo (condición 1 de tratamiento). Esto demuestra la eficacia de la destrucción de las células tumorales por las partes centrales de los magnetosomas recubiertas con ácido cítrico en la condición 2 de tratamiento. El porcentaje de carbono en estos magnetosomas se estima en 3,9%.

Ejemplo 13: Partes centrales de magnetosomas derivadas de MSR-1 recubiertas con DOPC.

Preparación: En un tubo de vidrio de 10 mi se solubilizaron 40 mg de DOPC (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina, referencia Sigma: P6354) en 100 pl de cloroformo y despiés se evaporó el disolvente durante 10 minutos utilizando gas inerte (nitrógeno) para formar una película lipídica homogénea en el tubo. Una suspensión que contiene las partes centrales de magnetosomas con 20 mg de hierro mezclada con 8 mi de agua apirógena estéril, se introduce en el tubo que contiene la película lipídica y se sónica durante 1,5 horas con el dedo sonicador a una potencia de 30 W con pulsos de 10 segundos, separados por intervalos de 0,5 segundos. Durante la preparación, la masa de DOPC es dos veces mayor que la masa de hierro. La suspensión obtenida se lava una primera vez colocando un imán de neodimio contra la pared del tubo de vidrio, retirando el sobrenadante y después sustituyéndolo por agua apirógena estéril y sonicando durante 1 minuto a 30W. Se lava cinco veces más de la misma manera.

Caracterización: En una primera serie de mediciones, la absorción, medida a 480 nm, de una suspensión que contiene las partes centrales de magnetosomas recubiertas con DOPC no disminuye durante los 20 minutos de medición, lo que demuestra la estabilidad de esta suspensión. Las mediciones MET indican la presencia de un recubrimiento que rodea las partes centrales de estos magnetosomas de un grosor que va de 0,6 a 3 nm. Las mediciones de dispersión de la luz realizadas en estas suspensiones revelan la presencia de un 87% de agregados esféricos con un diámetro hidrodinámico de 1871 nm y un 13% de objetos esféricos con un diámetro hidrodinámico de 278 nm que pueden corresponder a los tamaños de las partes centrales de los magnetosomas recubiertas con DOPC. El punto isoeléctrico se estima a pH 3 y el potencial zeta disminuye de 10 mV a pH 2 a -35 mV a pH 12. Cuando una suspensión que contiene las partes centrales de los magnetosomas recubiertas con DOPC se mezcla con células GL-261 y la mezcla se somete a la condición 3 de tratamiento, la temperatura de la mezcla aumenta de 33,5°C. La pendiente en el origen de la variación de la temperatura se estima en 0,05°C/seg. Cuando la misma mezcla se somete a la condición 2 de tratamiento, el porcentaje de células vivas es del 0- 5%, mientras que sólo es del 13% sin la aplicación del campo (condición 1 de tratamiento). Esto indica la citotoxicidad inducida por las partes centrales de magnetosomas recubiertas de DOPC sobre las células GL261 en presencia de un campo magnético alterno. El porcentaje de carbono en estos magnetosomas se estima en 7,5%.

Ejemplo 14: Partes centrales de los magnetosomas derivados de AMB-1 recubiertas con DOPC.

Preparación: En un tubo de vidrio cónico de 35 mi se solubilizaron 280 mg de DOPC (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina, referencia Sigma: P6354) en 500 pl de cloroformo y désp&e evaporó el disolvente durante 15 minutos utilizando con nitrógeno para formar una película lipídica homogénea en el tubo. Una suspensión que contiene las partes centrales de los magnetosomas con 10 mg de hierro mezclada con 15 mi de agua apirógena estéril, se introduce en el tubo que contiene la película lipídica y se sónica durante 30 minutos con el dedo sonicador a una potencia de 20 W con pulsos de 10 segundos, separados por intervalos entre pulsos de 20 segundos. Durante la preparación, la masa de DOPC es 28 veces mayor que la masa de hierro. La suspensión resultante se purificó utilizando una columna de exclusión por tamaño SEPHADEX G-25 (GE Healthcare, Buckimghamshire, Reino Unido). La suspensión de color marrón se recoge y después se concentra colocando un imán de neodimio contra la pared del tubo de vidrio, retirando una porción del sobrenadante que se sustituye por agua apirógena estéril y sonicando la muestra durante 1 minuto a 30W.

Caracterización: Las mediciones MET de estas suspensiones permiten estimar un grosor del recubrimiento comprendido entre 50 y 150 nm.

Ejemplo 15: Partes centrales de magnetosomas derivadas de AMB-1 recubiertas con Alendronato.

reparación: Un volumen de 2 mi, que contienelO mg en hierro, se introduce en un tubo de vidrio de 25 mi (apirógeno) y luego se coloca contra un imán. Se retira el sobrenadante y se sustituye por 10 mi de una solución que contiene alendronato a11,6 mg/ml mezclado con agua estéril MilliQ, previamente ajustada a pH 2,5 con una solución de ácido clorhídrico 0,1 M y esterilizada por Filtración (filtro plen)0,45h esta preparam, la masa de alendronato es 11,6 veces superior a la masa de hierro. La mezcla obtenida se sónica continua durante 15 minutos con el dedo de sonicación a una potencia de 30 W. A continuación, la suspensión se calienta en un microondas a 70 W, 3 veces durante 1 minuto con un intervalo de 5 minutos, en el que la muestra se enfría en un baño de hielo. La suspensión obtenida se lava una primera vez colocando un imán de neodimio contra la pared del tubo de vidrio, retirando el sobrenadante y después sustituyéndolo por agua estéril MilliQ y sonicando durante 1 minuto a 30W. Se lava diez veces de la misma manera colocando un imán de neodimio contra la pared del tubo de vidrio, retirando el sobrenadante y después sustituyéndolo por agua estéril MilliQ y sonicando durante 1 minuto a 30W.

Caracterización: Las mediciones del ensayo LAL permiten estimar la cantidad de endotoxinas en estas suspensiones entre 53 y 144 UE/mg/ml. La absorción, medida a 480 nm, de una suspensión de las partes centrales de magnetosomas recubiertas con Alendronato que contenía 1 mg de hierro disminuyó de 1% durante los 20 minutos de medición, lo que demuestra la estabilidad de esta suspensión. Las mediciones MET indican que la matriz rodea estas magnetosomas. Estos magnetosomas poseen un punto isoeléctrico de pH 3,5, tamaños hidrodinámicos de 527 nm para el 14% de ellos y de 2735 nm para el 86%, un potencial zeta que varía de 25 mV a pH 2 a - 47 mV a pH 12. Cuando una suspensión que contiene las partes centrales de magnetosomas recubiertas con alendronato se mezcla con células GL-261 y la mezcla se somete a la condición 3 de tratamiento, la temperatura de la mezcla aumenta de 18,3°C. La pendiente en el origen de la variación de la temperatura se estima en 0,28°C/seg. Cuando la misma mezcla se somete a la condición 2 de tratamiento, el porcentaje de células vivas es del 2%, mientras que sólo es del 17% sin la aplicación del campo (condición 1 de tratamiento). Esto indica la citotoxicidad inducida por las partes centrales de magnetosomas recubiertas con alendronato sobre las células GL261 en presencia de un campo magnético alterno. El porcentaje de carbono en estos magnetosomas se estima en 9%.

Ejemplo 16: Partes centrales de magnetosomas derivadas de MSR-1 recubiertas con neridronato.

Preparación: Una suspensión que contiene 50 mg de las partes centrales de los magnetosomas mezclada con 4,5 de agua apirógena estéril se sonican durante 5 minutos con el dedo sonicador a una potencia de 30W con pulsos de 30 segundos separados por intervalos entre pulsos de 10 segundos. Un volumen de 1,8 mi, que contiene 20 mg en hierro de la suspensión obtenida, se introduce en un tubo de vidrio de 10 mi colocado contra un imán, se retira el sobrenadante de la suspensión y se sustituye por 8 mi de una solución que contiene neriodronato a 20 mg/ml mezclada con agua apirógena estéril y cuyo pH se ajusta a 2,5. En esta preparación, la masa de neridronato es 8 veces superior a la masa de hierro. La mezcla obtenida se sónica durante 2 minutos con el dedo sonicador a una potencia de 30 W, con pulsos de 30 segundos, separados por intervalos entre pulsos de 10 segundos. La suspensión se lava una primera vez colocando un imán de neodimio contra la pared del tubo de vidrio, retirando el sobrenadante y sustituyéndolo por agua apirógena estéril previamente ajustada a pH 11. Se lava cinco veces más de la misma manera.

Caracterización: La absorción, medida a 480 nm, de la suspensión que contiene las partes centrales de los magnetosomas recubiertas con neridronato no disminuye durante 20 minutos, lo que indica la estabilidad de esta suspensión. Las mediciones MET indican la presencia de un recubrimiento alrededor de las partes centrales de estos magnetosomas con un grosor que va de 19 a 200 nm. Las mediciones de dispersión de la luz realizadas en estas suspensiones revelan la presencia de un 1% de agregados esféricos con un diámetro hidrodinámico de 5560 nm y un 59% de agregados esféricos con un diámetro hidrodinámico de 710 nm y un 40% de objetos esféricos con un diámetro hidrodinámico de 207 nm que pueden corresponder a los tamaños de las partes centrales de los magnetosomas recubiertas con neridronato. Cuando una suspensión que contiene las partes centrales de magnetosomas recubiertas con neridronato se mezcla con células GL-261 y se somete a la condición 3 de tratamiento, la temperatura de la mezcla aumenta de 37,2°C antes de la aplicación del campo a 43,9°C después de 30 minutos de aplicación del campo. La pendiente inicial de la variación de la temperatura se estima en 0,017°C/seg. Cuando la misma mezcla se somete a la condición 2 de tratamiento, el porcentaje de células vivas es del 28%, mientras que sólo es del 44% sin la aplicación del campo (condición 1 de tratamiento). Esto indica la citotoxicidad inducida por las partes centrales de los magnetosomas recubiertas con neridronato sobre las células GL261 en presencia de la condición 2 de tratamiento. El punto isoeléctrico de estas naopartículas sintéticas recubiertas con neridronato se estima a pH 3,5 y el potencial zeta disminuye de 40 mV a pH 2 a -42 mV a pH 12. El porcentaje en carbono de estos magnetosomas se estima en 18,1%.

Ejemplo 17: Partes centrales de los magnetosomas derivados de MSR-1 recubiertas con PEI.

Preparación: Una suspensión de minerales de magnetosomas que contiene 50 mg de hierro mezclada con 4,5 mi de agua apirógena estéril se sónica durante 5 minutos con un dedo sonicador a una potencia de 30 W con pulsos de 30 segundos separados por intervalos de 10 segundos. Un volumen de 1,8 mi, que contiene 20 mg de hierro de esta suspensión se introduce en un tubo de vidiro de 10 mi colocado contra un imán. Se retira el sobrenadante y se sustituye por 8 mi de una solución de PEI a una concentración de 25 mg/ml, mezclada con agua apirógena estéril con un pH ajustado a 9,5. En esta preparación, la masa de PEI es 10 veces superior a la masa de hierro. La mezcla obtenida se sónica durante 2 horas con el dedo sonicador a una potencia de 30 W, con pulsos de 30 segundos, separados por intervalos de 10 segundos. La suspensión obtenida se lava una primera vez colocando un imán de neodimio contra la pared del tubo de vidrio, retirando el sobrenadante y después sustituyéndolo por agua apirógena estéril y sonicando durante 1 minuto a 30W. Se lava cinco veces más de la misma manera.

Caracterización: La absorción de la suspensión que contiene las partes centrales de magnetosomas recubiertas con PEI, medida a 480 nm, no disminuye durante los 20 minutos de medición, lo que demuestra la estabilidad de esta suspensión. Las mediciones MET indican un grosor de recubrimiento que va de 8 a 10 nm. Las mediciones de dispersión de luz de esta suspensión indican la presencia de objetos esféricos con un diámetro hidrodinámico de 175 nm que podrían corresponder a las partes centrales de los magnetosomas recubiertas con PEI. El punto isoeléctrico se estima en 11 y el potencial zeta disminuye de 42 mV a pH 2 a -16 mV a pH 12. Las mediciones del CHNS muestran un porcentaje de nitrógeno del 1,1% y un porcentaje de carbono del 4,5%, ambos mayores que los porcentajes de nitrógeno y carbono del 0,2% y el 3,3%, respectivamente, en las partes centrales de magnetosomas no recubiertas, lo que sugiere la presencia del recubrimiento. En una segunda serie de mediciones, cuando una suspensión que contiene las partes centrales de los magnetosomas recubiertas con PEI se mezcla con células GL-261 y se somete a la condición 3 de tratamiento, la temperatura de la mezcla aumenta de 37°C antes de la aplicación del campo a 43°C después de 30 minutos de aplicación del campo. La pendiente en el origen de la variación de la temperatura se estima en 0,014°C/seg. Cuando la misma mezcla se somete a la condición 2 de tratamiento, el porcentaje de células vivas es del 15%, mientras que sólo es del 40% sin la aplicación del campo (condición 1 de tratamiento). Esto indica la citotoxicidad inducida por las partes centrales de magnetosomas recubiertas con PEI sobre las células GL261 en presencia de la condición 2 de tratamiento.

Ejemplo 18: Partes centrales de magnetosomas derivadas de AMB-1 recubiertas con PEI

Preparación: Una suspensión que contiene 10 mg de hierro de las partes centrales de los magnetosomas mezclada con 10 mi de agua apirógena estéril, se sónica durante 5 minutos con el dedo sonicador a una potencia de 30W con pulsos de 30 segundos separados por intervalos de 10 segundos. Esta suspensión se coloca contra un imán, se retira el sobrenadante y se sustituye por 10 mi de una solución de PEI a 20 mg/ml, mezclada con agua apirógena estéril a pH 9,5. Durante la preparación, la masa de PEI es dos veces mayor que la masa de hierro. La mezcla obtenida se sónica durante 30 minutos con el dedo sonicador a una potencia de 20 W, con pulsos de 10 segundos, separados por intervalos entre pulsos de 20 segundos. La suspensión se enfría cada dos minutos en un baño de hielo. Se lava una primera vez colocando un imán de neodimio contra la pared del tubo de vidrio, retirando el sobrenadante y sustituyéndolo por agua apirógena Hyclone y sonicando durante 1 minuto a 30W. Se lava diez veces más de la misma manera.

Caracterización: En ensayo LAL revela una concentración de endotoxinas inferior a 50 UE/mg/ml en estas suspensiones. Las mediciones MET permiten estimar el grosor del recubrimiento que rodea las partes centrales de estos magnetosomas de entre 4 y 18 nm. La absorción de la suspensión de las partes centrales de magnetosomas recubiertas con PEI que contienen 1 mg en hierro, medida a 480 nm, disminuyó de 64% durante los 20 minutos de medición. Las mediciones de dispersión de luz de esta suspensión indican la presencia de objetos de tamaño hidrodinámico de 125 nm para el 6% de ellos, de 5445 nm para el 1% de ellos y de 1067 nm para el 93% de ellos. El punto isoeléctrico se estima en 11,3 y el potencial zeta disminuye de 50 mV a pH 2 a -10 mV a pH 12. Las mediciones del CHNS revelan un porcentaje de carbono de 6,6%. Cuando una suspensión que contiene las partes centrales de magnetosomas recubiertas con PEI se mezcla con células GL-261 y se somete a la condición 3 de tratamiento, la temperatura de la mezcla aumenta de 12°C después de 30 minutos de aplicación del campo. La pendiente en el origen de la variación de la temperatura se estima en 0,04°C/seg. Cuando la misma mezcla se somete a la condición 2 de tratamiento, el porcentaje de células vivas es del 12%, mientras que sólo es del 26% sin la aplicación del campo (condición 1 de tratamiento). Esto indica la citotoxicidad inducida por las partes centrales de magnetosomas recubiertas con PEI sobre las células GL261 en presencia de la condición 2 de tratamiento.

Ejemplo 19: Partes centrales de magnetosomas derivadas de MSR-1 recubiertas con AI(OH⁾³

Preparación: La suspensión que contiene 7 mg por mililitro de la parte central de los magnetosomas se sónica primero durante 5 minutos a una potencia de 5 W con pulsos de 0,1 segundos e intervalos entre pulsos de 0,1 segundos. Una suspensión que contiene 2 mg de la parte central de los magnetosomas se introduce en un tubo de vidrio de 8 mi, la suspensión se coloca contra un imán de neodimio, se retira el sobrenadante y se sustituye por 600 pl de hidóxido de aluminio a 10 mg/ mi. La mezcla se sónica durante 90 minutos de forma continua a 20 W. Se realiza un primer lavado colocando la suspensión contra un imán, retirando el sobrenadante y sustituyéndolo por agua Hyclone. Se realizan tres lavados adicionales de la misma manera.

Caracterización: La absorción de la suspensión que contiene las partes centrales de los magnetosomas recubiertas con AI(OH)3, medida a 480 nm, no disminuye durante los 20 minutos de medición, lo que demuestra la estabilidad de esta suspensión. Las mediciones MET revelan la presencia de un gel que rodea las partes centrales de estos magnetosomas. Las mediciones de dispersión de luz de esta suspensión indican la presencia de objetos de tamaño hidrodinámico de 204 nm para el 5% de ellos y de 1810 nm para el 95% de ellos. El punto isoeléctrico se estima a pH 2,5 y el potencial zeta disminuye de 5 mV a pH 2 a -30 mV a pH 12. Las mediciones del CHNS revelan un porcentaje de carbono de 3,3%. Cuando una suspensión que contiene las partes centrales de los magnetosomas recubiertas con AI(OH)3, se mezcla con células GL-261 y se somete a la condición 3 de tratamiento, la temperatura de la mezcla aumenta de 21,3°C después de 30 minutos de aplicación del campo. La pendiente en el origen de la variación de la temperatura se estima en 0,034°C/seg. Cuando la misma mezcla se somete a la condición 2 de tratamiento, el porcentaje de células vivas es del 26%, mientras que es del 91% sin la aplicación del campo (condición 1 de tratamiento). Esto indica la citotoxicidad inducida por las partes centrales de los magnetosomas recubiertas con AI(OH)3 sobre las células GL261 en presencia de la condición 2 de tratamiento.

Ejemplo 20: Partes centrales de magnetosomas derivadas de MSR-1 recubiertas con sílice (APTS)

Preparación: La suspensión que contiene 7 mg por mililitro de la parte central de los magnetosomas se sónica primero durante 5 minutos a una potencia de 5 W con pulsos de 0,1 segundos e intervalos entre pulsos de 0,1 segundos. Una suspensión que contiene 10 mg de la parte central de los magnetosomas se introduce en un tubo de vidrio de 8 mi, la suspensión se coloca contra un imán de neodimio, se retira el sobrenadante y se sustituye por $jí de una mezcla de hexano y etanol absoluto (1:1; v/v). La suspensión se sónica durante unos minutos antes de añadir 200 pl de APTS ((3-Aminopropil) trietoxisilano, APTS; referencia Sigma: 440140), es decir. 211 mg y 500 pl de NaOH 5M. La mezcla se sónica durante 10 minutos a una temperatura de 85°C a una potencia de 5 W, con pulsos de 0,1 segundos e intervalos entre pulsos de 0,1 segundos. Se realiza un primer lavado colocando la suspensión contra un imán, retirando el sobrenadante y sustituyéndolo por un volumen de 1,5 mi de una mezcla de hexano y etanol absoluto (1/1; v/v). Después la suspensión se sónica durante 30 segundos a una potencia de 5 W con pulsos de 0,1 segundos e intervalos entre pulsos de 0,1 segundos. Se realizan tres lavados adicionales de la misma manera. A continuación, se añade un volumen de 1 mililitro de hidróxido de sodio 5M a la suspensión de nanopartículas y después la mezcla se sónica durante 15 minutos a una temperatura de 80°C a una potencia de 5W con pulsos de 0,1 segundos e intervalos entre pulsos de 0,1 segundos. Se realiza un primer lavado colocando la suspensión contra un imán, retirando el sobrenadante y sustituyéndolo por agua Hyclone. Se realizan dos lavados adicionales de la misma manera.

Caracterización: La absorción de la suspensión de las partes centrales de magnetosomas recubiertas con Sílice que contienen 1 mg en hierro, medida a 480 nm, disminuyó de 90% durante los 20 minutos de medición. Las mediciones MET revelan la presencia de un gel que rodea las partes centrales de estos magnetosomas. Las mediciones de dispersión de luz de esta suspensión indican la presencia de objetos de tamaño hidrodinámico de 235 nm para el 10% de ellos, de 277 nm para el 7% de ellos y de 1986 nm para el 93% de ellos. El punto isoeléctrico se estima a pH 6,7 y el potencial zeta disminuye de 39 mV a pH 2 a -31 mV a pH 12. Las mediciones del CHNS revelan un porcentaje de carbono de 7,4%. Cuando una suspensión que contiene las partes centrales de los magnetosomas recubiertas con Sílice se mezcla con células GL-261 y se somete a la condición 3 de tratamiento, la temperatura de la mezcla aumenta de 26,9°C después de 30 minutos de aplicación del campo. La pendiente en el origen de la variación de la temperatura se estima en 0,1°C/seg. Cuando la misma mezcla se somete a la condición 2 de tratamiento, el porcentaje de células vivas es del 2,5%, mientras que es del 40% sin la aplicación del campo (condición 1 de tratamiento). Esto indica la citotoxicidad inducida por las partes centrales de los magnetosomas recubiertas con Sílice sobre las células GL261 en presencia de la condición 2 de tratamiento.

Ejemplo 21: Diferentes protocolos de recubrimiento.

A partir de los protocolos descritos en los Ejemplos de 6 a 20, puede ser posible recubrir la parte central de los magnetosomas con agentes de recubrimiento poli-L-Msina, chitosán, Carboximetil-dextrano, ácido cítrico, ácido oleico, sílice, ácido fólico, DOPC, alendronato, neridronato, PEI AI(OH)3 utilizando para la mezcla de las partes centrales y el agente de recubrimiento una relación entre la masa del recubrimiento y la masa de la parte central entre 10'9 y 109, 10'6 y 10®, o entre 10'2 y 102, un tiempo de sonicación entre 10'9 y 109 segundos, entre 10'6 y 10® segundos, o entre 10'2 y 102 segundos o una potencia de sonicación entre 10'9 y 109 W, entre 10 ® y 10® W, o entre 10^y 102 W.

Ejemplo 22: Propiedades de unión entre las partes centrales.

Las mediciones MET realizadas en las partes centrales recubiertas con diferentes recubrimientos (PEI, DOPC, Neridronato, Chitosán, ácido cítrico, dextrano, AIOH3, sílice, ácido fólico) revelan que la distancia que separa la superficie exterior de dos partes centrales separadas por un material de unión está entre 0 y más de 400 nm, que el número de partes centrales unidas entre ellas por un material de unión está entre 2 y más de 10000, que las partes centrales unidas entre ellas por el material de unión forman diferentes formas como cadenas, círculos, rombos, cuadriláteros (tabla 3), que las cadenas se caracterizan por la presencia de diferentes partes centrales cuyos lados son paralelos, lo que sugiere un alineamiento de los ejes cristalográficos de las diferentes partes centrales en la dirección de elongación de las cadenas.

TABLA 1

TABLA 2

Parte central de Poli-L-lisina MSR-1 4 a 16 8,7 2489 43 35 24,5 5 -14 -34 0,4 3,6 0,6 0,3 magne

Parte magne Parte magne

Parte magne

Parte magne Parte magne Parte magne

Parte magne

Parte magne Parte magne

Parte magne Parte

magne Parte magne Parte magne

Parte magne

Parte magne Parte magne Parte magne Parte magne

Parte magne Parte magne

TABLA 3

Claims

REIVINDICACIONES

1. Preparación que comprende por lo menos una nanopartícula sintética, en la que la nanopartícula comprende: una parte central mineral cristalizada que comprende principalmente un óxido de hierro sintetizado por un organismo vivo, y

un recubrimiento periférico que comprende menos del 10% de material orgánico no desnaturalizado procedente del organismo vivo o que no comprende proteínas procedentes del organismo vivo,

en el que dicho organismo vivo es una bacteria magnetotáctica.

2. Preparación según la reivindicación 1, en la que el recubrimiento periférico comprende menos del 1% de proteínas no desnaturalizadas procedentes de bacterias magnetotácticas.

3. Preparación según la reivindicación 1 o 2, en la que la parte central comprende maghemita y/o magnetita.

4. Preparación según una de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la nanopartícula sintética es apirógena.

5. Preparación según la reivindicación 4, en la que la nanopartícula sintética presenta una concentración de endotoxina inferior a 109 unidades de endotoxina por miligramo de óxido de hierro o unidades de endotoxina por mililitro o unidades de endotoxina por miligramo de óxido de hierro por mililitro.

6. Preparación según una de las reivindicaciones 1 a 5, en la que las nanopartículas sintéticas están organizadas según una figura geométrica seleccionada de entre una cadena recta, un círculo, un cuadrado, un rectángulo, un triángulo, un pentágono, un hexágono, un heptágono, un octágono, un polígono o un poliedro.

7. Preparación según una de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el recubrimiento comprende por lo menos un compuesto capaz de establecer interacciones débiles o enlaces covalentes con la parte central de las nanopartículas sintéticas.

8. Preparación según una de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el recubrimiento comprende por lo menos un compuesto capaz de establecer interacciones o enlaces con iones Fe2+ o Fe3+, hidroxilos OH', óxidos O2, defectos cristalinos de la parte central.

9. Preparación según una de las reivindicaciones 1 a 8, en la que el recubrimiento comprende compuestos de carbono.

10. Preparación según una de las reivindicaciones 1 a 9, en la que el recubrimiento comprende por lo menos un compuesto seleccionado de entre el grupo que consiste en un agente quelante, una molécula anfifática, un polímero polarizado o cargado, un óxido metálico o de silicio, un hidróxido metálico o de silicio, un ácido, un derivado ácido, básico, oxidado, reducido, neutro, cargado positivamente, cargado negativamente de estos compuestos y una combinación de varios de estos compuestos o sus derivados.

11. Preparación según una de las reivindicaciones 1 a 10, en la que el recubrimiento comprende por lo menos un compuesto seleccionado de entre el grupo que consiste en un polisacárido, un ácido graso, un fosfolípido, un polímero de aminoácidos, de sílice polimérico o no polimérico y de un polímero amino alifático, un derivado ácido, básico, oxidado, reducido, neutro, cargado positivamente o cargado negativamente de estos compuestos y de una combinación de varios de estos compuestos o de sus derivados.

12. Preparación según una de las reivindicaciones 1 a 11, en la que el recubrimiento comprende por lo menos un grupo seleccionado de entre el grupo que consiste en ácido carboxílico, ácido fosfórico, funciones de ácido sulfónico, amidas, cetonas, alcoholes, fenoles, fióles, aminas, éteres, sulfuras, anhídridos ácidos, haluros de acilo, amidinas, nitrilos, hidroperóxidos, ¡minas, aldehidos, peróxidos, un derivado ácido, básico, oxidado, reducido, neutro, cargado positivamente, cargado negativamente de estos compuestos, y una combinación de varios de estos compuestos o sus derivados.

13. Preparación según una de las reivindicaciones 1 a 12, para su uso como medicamento o agente de diagnóstico, en particular en el contexto del tratamiento de un tumor, por ejemplo con hipertermia magnética.

14. Uso de la preparación según una de las reivindicaciones 1 a 13 para aplicaciones cosméticas.

15. Composición farmacéutica o medicamento que comprende, como principio activo, una preparación como la definida en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 y opcionalmente por lo menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.

16. Dispositivo médico que comprende la preparación definida en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.

17. Composición para el diagnóstico que comprende la preparación definida en cualquiera de las reivindicaciones 1

18. Composición cosmética que comprende, como principio activo cosmético, la preparación definida en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.

19. Proceso de fabricación de la preparación definida en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que comprende las siguientes secuencias:

(i), a partir de una preparación de nanopartículas sintetizadas por un organismo vivo que comprende una parte central mineral cristalizada compuesta principalmente por un óxido de hierro y un recubrimiento biológico periférico, que aísla la parte central mineral;

(¡i) tratar la preparación obtenida para cubrir la parte central con un recubrimiento periférico;

(i¡¡), opcionalmente esterilizar la preparación, preferentemente después de la secuencia (i), posiblemente después de la secuencia (¡i).