ES2861901T3 - Análisis de monotipia de células T - Google Patents

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Abstract

Un método de determinación de si una población de células T es neoplásica o no neoplásica, que comprende: a) proporcionar una muestra obtenida de un sujeto; b) usar uno o más reactivos de detección específicos que detectan específicamente TRBC1, y uno o más reactivos de detección que detectan específicamente TRBC2, y determinar la razón de células T en la muestra, o en un subconjunto de células T en la muestra, que expresan TRBC1 con respecto a TRBC2, en el que el reactivo de detección específico que detecta TRBC1 no detecta TRBC2, y el reactivo de detección específico que detecta TRBC2 no detecta TRBC1; y/o c) usar uno o más reactivos de detección específicos que detectan específicamente TRGC1, y uno o más reactivos de detección que detectan específicamente TRGC2, y determinar la razón de células T en la muestra, o en un subconjunto de células T en la muestra, que expresan TRGC1 con respecto a TRGC2, en el que el reactivo de detección específico que detecta TRGC1 no detecta TRGC2, y el reactivo de detección específico que detecta TRGC2 no detecta TRGC1, en el que si más del 80 % de las células T expresan la misma región de cadena constante de TCR beta o TCR gamma, entonces la población se define como neoplásica.

Description

DESCRIPCIÓN
Análisis de monotipia de células T
Esta invención se refiere a métodos para investigar la monotipia de células T. La presente invención también se refiere a métodos para distinguir infiltrados de células T inflamatorias de infiltrados de células T neoplásicas.
El análisis de la monotipia de linfocitos infiltrantes de tejido es una cuestión clinicopatológica importante y común para diferenciar los infiltrados inflamatorios de los infiltrados neoplásicos (por ejemplo, linfoma o leucemia). En el contexto del linfoma de células B, esto se lleva a cabo frecuentemente en una fase temprana de la investigación mediante el uso de reactivos de detección que son específicos para las cadenas ligeras kappa y lambda. Una razón de kappa:lambda sesgada aumenta la posibilidad de que un infiltrado de células B de tejido sea neoplásico en lugar de reactivo/inflamatorio. Cuando todas las células B en una población de células B expresan solo una cadena ligera (solo kappa o solo lambda), se conoce como población monotípica. La presencia de una población monotípica respalda la posibilidad de que esté presente una población de células B clonales o neoplásicas, por lo que es una investigación diagnóstica comúnmente usada en la práctica clínica. Una población monoclonal de células B tendría todas las regiones V idénticas; esto solo puede determinarse determinando la secuencia exacta de la región V o algún sustituto de la secuencia, por ejemplo, el tamaño del fragmento de PCR usando cebadores específicos.
Sin embargo, en el contexto de infiltrados de células T, la designación de monotipia no ha sido posible porque las cadenas kappa y lambda no se expresan por las células T. En su lugar, el diagnóstico de una neoplasia de células T está respaldado por la realización de estudios de reordenamiento de genes de receptores de células T donde los genes de receptores de células T reordenados se amplifican por PCR y luego se caracterizan por análisis de gel o de escáner génico para examinar la presencia de regiones variables de receptores de células T amplificados clonalmente dominantes (alfa, beta, gamma o delta). Este es un enfoque costoso y lento en comparación con la tinción de kappa/lambda, y solo se realiza en centros especializados. Además, todavía es a menudo difícil distinguir los infiltrados reactivos de los neoplásicos usando estudios de reordenamiento de genes de receptores de células T, ya que los infiltrados reactivos también se asocian frecuentemente con expansiones de células T específicas de antígeno oligoclonal y las poblaciones neoplásicas pueden tener una respuesta antitumoral u otra respuesta inflamatoria de células T asociada. Por lo tanto, la interpretación de los datos está altamente especializada y abierta al debate. En la práctica, los estudios de reordenamiento de genes de receptores de células T se interpretan en el contexto de los antecedentes clínicos y las características histológicas asociadas, pero la interpretación se ve obstaculizada por la incapacidad de visualizar histológicamente las células T que contribuyen a la mono/oligo o policlonalidad, a diferencia de las células B donde pueden usarse kappa y lambda. Por lo tanto, una prueba simple para distinguir las poblaciones de células T inflamatorias de las poblaciones de células T neoplásicas sería valiosa en la práctica clinicopatológica y también como herramienta de investigación en sistemas humanos y no humanos para examinar el grado de monotipia de las poblaciones de células T, como sustituto de la clonalidad de células T. Ejemplos de aplicaciones de un sistema de este tipo serían el análisis de la monotipia de células T en tejidos de ganglios linfáticos, piel, intestino, médula ósea, pulmón, riñón, sangre y, de hecho, cualquier otro tejido. Adicionalmente, la determinación de si una población de células T es monotípica como sustituto de la clonalidad podría ser importante para predecir el pronóstico en una gama de afecciones distintas del linfoma de células T, donde los efectos de la población de células T son importantes, por ejemplo (pero sin limitación), poblaciones de células T que se infiltran en otros tumores, o poblaciones de células T que provocan patología en diversos órganos, tal como en enfermedades autoinmunitarias o después del trasplante de médula ósea u órganos sólidos.
Un objetivo de la presente invención es proporcionar métodos y reactivos que permitan el análisis de la monotipia de células T y proporcionen evidencia de apoyo de la clonalidad. Esta información puede usarse entonces para distinguir células inflamatorias de células neoplásicas y/o para comentar la probabilidad de que una población sea clonal en otras circunstancias donde esto puede ser predictivo del desenlace, la respuesta a fármacos, etc.
Todas las células T, incluidas las células T citolíticas naturales (células NKT), expresan múltiples copias de un receptor de células T (TCR) en su superficie. Los TCR están compuestos por dos cadenas (una cadena alfa y beta o una cadena gamma y una delta), cada una de las cuales tiene una región constante y una región variable. La región variable, debido a las recombinaciones somáticas (genéticas) durante el desarrollo de las células T, puede existir en muchos millones de secuencias diferentes. Para que sea monoclonal, una población de células T debe tener células T en las que todas las regiones V son idénticas. Cada cadena también tiene una región constante. Todas las regiones constantes alfa son iguales, sin embargo, las regiones constantes beta pueden existir en dos formas como TRBC1 (también conocida como TCRBC1) y TRBC2 (también conocida como TCRBC2). TRBC1 y TRBC2 se comentan en Droese et al. Leukemia (2004) 18, 1531-1538. De manera similar, la cadena gamma comprende una de dos regiones constantes muy similares denominadas TRGC1 (también conocida como TCRG1) y TRGC2 (también conocida como TCRG2). La estructura global del receptor de células T determina su especificidad para la unión al antígeno presentado por MHC o moléculas similares a MHC. En una población monotípica, todas (o sustancialmente todas) las células T en una población tendrán la misma región constante, por ejemplo, todas serán TCRBC1 o TCRBC2. En una población politípica de células T, algunas de las células T tienen receptores con una forma de cada una de estas regiones constantes y algunas células T tienen receptores con la otra forma de cada una de estas regiones constantes, pero cada célula T individual solo tendrá un tipo de región constante.
El documento WO2014/042226 A1 da a conocer polinucleótidos que codifican CDR3 en genes de cadena TCR-a y TCR-p de células T auxiliares CD4+ que son específicos de péptidos auxiliares WT1. Maclean et al., 1997, Immunogenetics, 45:223-225 dan a conocer la identificación de una variante de secuencia predominante del gen de TCRBC1 de receptor de células T. Tunnacliffe et al., 1985, Nature, 5068-5072 dan a conocer la identificación de las secuencias de nucleótidos de TRBC1 y TRBC2. Braissant et al, 1998, Biochemica, 10-16 dan a conocer un protocolo de hibridación in situ que usa sondas etiquetadas de manera no radiactiva para detectar ARNm en secciones de tejido. Droese et al., 2004, Leukaemia. 18:9(1531-1538) dan a conocer experimentos de PCR múltiple para la detección de reordenamientos de genes de TCRB en tumores malignos de células T. El documento WO2015/132598 A1 da a conocer un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende un dominio de unión a antígeno que se une selectivamente a TRBC1 o TRBC2, células tales como células T que comprenden un CAR de este tipo y el uso de tales células para el tratamiento de un linfoma o leucemia de células T en un sujeto.
En un primer aspecto, la presente invención proporciona un método de determinación de si una población de células T es neoplásica o no neoplásica, que comprende:
a) proporcionar una muestra obtenida de un sujeto;
b) usar uno o más reactivos de detección específicos que detectan específicamente TRBC1, y uno o más reactivos de detección que detectan específicamente TRBC2, y determinar la razón de células T en la muestra, o en un subconjunto de células T en la muestra, que expresan TRBC1 con respecto a TRBC2, en donde el reactivo de detección específico que detecta TRBC1 no detecta TRBC2, y el reactivo de detección específico que detecta TRBC2 no detecta Tr Bc 1; y/o
c) usar uno o más reactivos de detección específicos que detectan específicamente TRGC1, y uno o más reactivos de detección que detectan específicamente TRGC2, y determinar la razón de células T en la muestra, o en un subconjunto de células T en la muestra, que expresan TRGC1 con respecto a TRGC2, en donde el reactivo de detección específico que detecta TRGC1 no detecta TRGC2, y el reactivo de detección específico que detecta TRGC2 no detecta TRGC1,
en el que si más del 80 % de las células T expresan la misma región de cadena constante de TCR beta o TCR gamma entonces la población se define como neoplásica.
Las células T pueden definirse como células que expresan un receptor de células T a nivel de ARN y/o proteína. Una población de células T puede incluir todas las células T en una muestra o todas las células T con una morfología particular o todas las células T definidas por la expresión particular de biomarcadores a nivel de proteína/ARN/ADN/hidrato de carbono. Las células T pueden ser cualquier tipo de células T, por ejemplo, células T auxiliares, células T citotóxicas, células T de memoria, células T reguladoras o células T citolíticas naturales. Una población de células T donde todas las células expresan una región constante beta o una región constante gamma puede definirse como monotípica. Una población monoclonal de células T resulta de la expansión de una única célula y, por lo tanto, las células T en la población tienen receptores de células T con regiones constantes idénticas y regiones variables idénticas. Una población de células T monotípicas es una población de células T que expresan todas la misma variante de región constante, o bien TRBC1 o bien TRBC2 y o bien TRGC1 o bien TRGC2. También es probable que una población de células T completamente monotípica sea una población monoclonal, pero someter a prueba la monotipia de una o incluso ambas regiones constantes del receptor de células T no demuestra definitivamente la monoclonalidad, aunque es un excelente sustituto de la misma. El cribado de la monotipia es más barato y fácil que el cribado de la monoclonalidad, pero proporciona las mismas o mejores opciones diagnósticas, terapéuticas y predictivas. Una población monotípica se define como una población donde la mayoría de las células T en la población tienen el mismo tipo de TRBC (es decir, todas TRBC1 o TRBC2 dependiendo de qué segmento génico de TRBC se use; la misma región constante), mientras que la monoclonalidad se define como todas las células T en la población que tienen la misma secuencia de región variable. Hay muchos millones de secuencias de regiones variables, pero solo dos posibles tipos de TRBC. Es mucho más fácil y barato cribar dos tipos de TRBC que millones de regiones variables.
El método puede comprender detectar dos de TRBC1, TRBC2, TRGC1 y TRGC2. El método puede comprender detectar tres de TRBC1, TRBC2, TRGC1 y TRGC2. El método puede comprender detectar todos de TRBC1, Tr BC2, TRGC1 y TRGC2.
Una variante de la región constante beta del receptor de células T que se detecta específicamente puede ser tanto TRBC1 como TRBC2. Tal como se describió anteriormente, TRBC1 y TRBC2 son un par de regiones constantes de cadena beta alternativas y una célula T expresará o bien TRBC1 o bien TRBC2 pero no ambos. Por lo tanto, en una población de células T, el porcentaje de células que expresan TRBC1 o TRBC2 puede determinarse detectando ambas variantes.
Una variante de la región constante gamma del receptor de células T que se detecta específicamente puede ser tanto de TRGC1 como de TRGC2. Tal como se describió anteriormente, TRGC1 y TRGC2 son un par de regiones constantes de cadena gamma alternativas, y una célula T expresará o bien TRGC1 o bien TRGC2 pero no ambos. Por lo tanto, en una población de células T, el porcentaje de células que expresan TRGC1 o TRGC2 puede determinarse detectando ambas variantes.
El método puede comprender detectar tanto la(s) variante(s) de cadena constante beta como la(s) variante(s) de cadena constante gamma.
Preferiblemente, el método de la invención comprende la detección de TRBC1 y TRBC2, y/o TRGC1 y TRGC2. Preferiblemente, la cantidad relativa de TRBC1 con respecto a TRBC2 y/o TRGC1 con respecto a TRGC2 en una población celular se determina en el método de la invención. Preferiblemente, el método de la invención permite la determinación del número de células, o el número relativo de células en una población particular de células T que expresan una región constante de TCR particular.
Puede usarse cualquier método adecuado para la detección de uno o más de TRBC1, TRBC2, TRGC1 y/o TRGC2. Las diferencias en las regiones constantes de estos receptores pueden detectarse a uno o más del nivel de ADN, ARN o proteína. El experto apreciará que hay muchas formas de detectar diferencias en las regiones constantes del receptor de células T y que los ejemplos presentados en el presente documento no pretenden ser exhaustivos.
A continuación, puede usarse la PCR para detectar las cantidades relativas de uno o más de TRBC1, TRBC2, TRGC1 y TRGC2. La PCR puede realizarse en ADN o ARN extraído, o en células T completas o muestras de tejido. El método puede comprender el uso de un par de oligonucleótidos adecuados para su uso en una reacción PCR para detectar específicamente TRBC1, TRBC2, TRGC1 o TRGC2. El método puede comprender el uso simultáneo de más de un par de oligonucleótidos adecuados para su uso en reacciones PCR para detectar específicamente más de uno de TRBC1, TRBC2, TRGC1 o TRGC2. Una ventaja de usar PCR para detectar ADN o ARN de TRBC1, TRBC2, TRGC1 y/o TRGC2 es que solo se requiere una pequeña muestra de células y no hay necesidad de proporcionar una sección adecuada de tejido. Una ventaja adicional de usar PCR para detectar ADN o ARN de Tr Bc 1, TRBC2, TRGC1 y/o TRGC2 es que puede hacerse en muestras de tejidos no sólidos tales como sangre y aspirados de médula ósea, así como en ADN o ARN extraído de muestras de tejido sólido o no sólido.
El ADN, ARN o proteína de TRBC1, TRBC2, TRGC1 y/o TRGC2 puede detectarse in situ en células T en una muestra de tejido, sección o cultivo celular.
El ADN o ARN o proteína de TRBC1, TRBC2, TRGC1 y/o TRGC2 pueden detectarse in situ, por ejemplo, en una sección de tejido, mediante inmunohistoquímica e hibridación in situ. Tales métodos pueden usar anticuerpos que pueden distinguir entre las diferentes regiones constantes de cadena beta y gamma. Alternativamente, pueden usarse sondas de ADN o ARN etiquetadas que pueden distinguir entre las diferentes regiones constantes de cadena beta y gamma. Los anticuerpos o las sondas de ADN o ARN pueden etiquetarse directa o indirectamente. Una etiqueta usada para facilitar la detección de una molécula, tal como un oligonucleótido o anticuerpo, puede incluir cualquier etiqueta conocida, incluyendo etiquetas fluorescentes, luminiscentes, de dispersión de luz y/o colorimétricas. Etiquetas adecuadas incluyen enzimas y restos fluorescentes y cromogénicos, así como radionucleótidos, sustratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas y similares. Si la etiqueta es una enzima, puede ser peroxidasa del rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, glucosa oxidasa y similares, así como diversas proteasas y fosfolipasas. Otras etiquetas incluyen fluoróforos o haptenos tales como digoxigenina o dinitrofenilo/dinitrofenol. Tales sondas etiquetadas se usan comúnmente en métodos de hibridación in situ. La unión de anticuerpos o sondas de ADN o ARN etiquetadas puede detectarse “a simple vista” o usando técnicas analíticas de patología digital. Pueden usarse usar técnicas analíticas de patología digital para evaluar la muestra de tejido o secciones etiquetadas con uno o más reactivos de detección específicos, cada uno de los cuales reconoce específicamente una de las regiones constantes. Por ejemplo, las técnicas analíticas de patología digital pueden contar el número de células que se etiquetan con un reactivo de detección específico y pueden calcular el porcentaje de células T que expresan una región constante particular. Las técnicas analíticas de patología digital también pueden procesar una imagen, por ejemplo, de una sección de tejido teñida para evaluar la distribución de células T etiquetadas con un reactivo de detección específico que reconoce específicamente una de las regiones constantes del receptor de células T. El análisis de patología digital también puede decidir si las células individuales deben considerarse positivas o no para la detección de una región constante particular, por ejemplo, contando los números de puntos asociados con una célula, donde los puntos representan tinción positiva o analizando la intensidad de la tinción. El experto apreciará que, dependiendo del método usado para detectar la región constante de células T, serán apropiados diferentes enfoques analíticos de patología digital y los ejemplos anteriores no son exhaustivos.
El ADN o ARN o proteína de TRBC1, TRBC2, TRGC1 y/o TRGC2 puede detectarse en células usando citometría de flujo. Tales métodos pueden usar anticuerpos que pueden distinguir entre las diferentes regiones constantes de cadena beta y gamma, o pueden usar sondas de ADN o ARN etiquetadas que pueden distinguir entre las diferentes regiones constantes de cadena beta y gamma.
La frase “reactivo de detección específico” se usa en el presente documento para referirse a un reactivo que es capaz de distinguir entre TRBC1, TRBC2 , TRGC1 y/o TRGC2 a nivel de ADN, A r N o proteína, e incluye, por ejemplo, cebadores de PCR, sondas de oligonucleótidos y anticuerpos.
También puede usarse análisis proteómico de poblaciones de células T para detectar proteína TRBC1, TRBC2, TRGC1 y/o TRGC2 en poblaciones de células T.
La región constante de la cadena beta o gamma del receptor de células T (una de TRBC1, TRBC2, TRGC1 o TRGC2) puede detectarse usando técnicas de secuenciación de ADN o ARN, por ejemplo, secuenciación de pistola génica de transcriptoma completo (secARN).
Además de TRBC1, TRBC2, TRGC1 y/o TRGC2, la expresión de otros marcadores también puede detectarse, particularmente por medio de inmunohistoquímica, hibridación in situ y citometría de flujo, por ejemplo, pero sin limitación, CD2, CD3, CD5, CD4, CD7, CD8 o CD30, CD56, granzima, perforina, Mib-1, Ki-67, PD1, CD10, CXCL13 y bcl6. La detección de tales otros marcadores puede llevarse a cabo simultáneamente con la detección de TRBC1, TRBC2, TRGC1 y/o TRGC2.
Una ventaja de detectar ADN o ARN o proteína de TRBC1, TRBC2, TRGC1 y/o TRGC2 mediante hibridación in situ, inmunohistoquímica o citometría de flujo es que otros factores tales como la morfología celular y el inmunofenotipo y, en el caso de inmunohistoquímica e hibridación in situ, el patrón de distribución arquitectónico de células T que expresan una región constante particular, pueden detectarse al mismo tiempo.
Puede emplearse más de uno, preferiblemente 2, 3, 4 o más, oligonucleótidos diferentes únicos para cada región constante para los fines de hibridación in situ en el método de la invención. Esto tiene dos ventajas: en primer lugar aumenta la sensibilidad del método y en segundo lugar aumenta la intensidad de la señal.
La región constante de cadena beta o gamma del receptor de células T variante puede detectarse usando anticuerpos, anticuerpos biespecíficos, miméticos de anticuerpos o fragmentos o variantes de los mismos. El método de determinación de la razón de TRBC1:TRBC2 o de TRGC1:TRGC2 en una población de células T puede usar anticuerpos, miméticos de anticuerpos o fragmentos de los mismos. TRBC1/TRBC2 y TRGC1/TRGC2 son muy similares a nivel de proteína, pero los anticuerpos pueden distinguir sus secuencias proteicas. Los anticuerpos pueden usarse como reactivos de detección específicos o reactivo de detección además de, o en lugar de, los reactivos de detección específicos de oligonucleótidos en técnicas inmunohistoquímicas.
El método puede comprender determinar el porcentaje de células T en una población particular que expresan una región constante de cadena beta o gamma del receptor de células T específico. La expresión de uno o más de TRBC1, TRBC2, TRGC1 y TRGC2 puede detectarse en una población de células T. Puede determinarse el porcentaje de células T en la población que expresan la región constante del receptor de células T detectada (TRBC1, TRBC2, TRGC1 y/o Tr Gc 2). Puede detectarse la expresión de dos o más de TRBC1, TRBC2, TRGC1 y TRGC2. Puede detectarse la expresión de tres o más de TRBC1, TRBC2, TRGC1 y TRGC2. Puede detectarse la expresión de los cuatro de TRBC1, TRBC2, TRGC1 y TRGC2. Preferiblemente, se determina la expresión de al menos TRBC1 y TRBC2, y/o TRGC1 y TRGC2.
El método puede comprender determinar la razón de células que expresan TRBC1 con respecto a células que expresan TRBC2 en la población de células T o determinar la razón de células que expresan TRGC1 con respecto a células que expresan TRGC2 en la población de células T o ambas.
La razón de TRBC1 con respecto a TRBC2 o la razón de TRGC1 con respecto a TRGC2 puede determinarse detectando específicamente una de las regiones constantes de un par y comparando el número de células donde se detecta un marcador con el número de células donde no se detecta ningún marcador. Alternativamente, pueden detectarse tanto TRBC1 como TRBC2 y/o pueden detectarse tanto TRGC1 como TRGC2 y puede determinarse la razón de TRBC1 con respecto a TRBC2 o la razón de TRGC1 con respecto a TRGC2 o ambas.
La determinación del grado de monotipia en una población de células T puede usarse como herramienta para proporcionar información sobre si una población de células T es una población de células T inflamatorias o neoplásicas. Una población de células T que tiene un alto grado de monotipia, en comparación con lo que se espera para las poblaciones de células T en ese tipo de tejido o ese individuo, puede diagnosticar que es una población de células T neoplásicas. Esto puede indicar la necesidad de una investigación adicional usando otros indicadores para determinar si está presente una neoplasia de células T, o puede usarse sola para diagnosticar definitivamente una neoplasia de células T.
El porcentaje de TRBC1, TRBC2, TRGC1 y/o TRGC2 o la razón de TRBC1:TRBC2 o de TRGC1:TRGC2 en una población de células T (una población de prueba de células T) puede compararse con el porcentaje de TRBC1, TRBC2, TRGC1 y/o TRGC2 o la razón de TRBC1:TRBC2 o de TRg C1:TRGC2 en una población de referencia de células T. La población de referencia de células T puede ser una población de células T que se sabe que es una población de células T inflamatorias. La población de referencia de células T puede ser una población de células T que se sabe que es una población de células T neoplásicas. La población de referencia de células T puede ser una población de células T que se sabe que es una población de células T no neoplásicas o no inflamatorias. La población de referencia de células T puede ser una población de células T del mismo sujeto que la población de prueba o de un sujeto diferente de la población de prueba. La población de referencia de células T puede ser de un tipo de tejido similar o un sujeto similar. La población de referencia de células T también puede incluir una línea de linterna de células T inmortalizada hecha crecer in vitro.
Un alto nivel de monotipia en una población de prueba de células T, en comparación con una población de referencia de células T, puede indicar que la población de células T es una población de células T neoplásicas en lugar de una población de células T inflamatorias. Es posible que la razón de TRBC1:TRBC2 o de TRGC1:TRGC2 esté alterada en una población inflamatoria de células T debido a la expansión clonal de las células T en respuesta a un antígeno. Por lo tanto, la información sobre la razón de TRBC1:TRBC2 y/o de TRGC1:TRGC2 en una población de células T puede usarse sola o combinarse con otra información sobre las células para determinar si una población de células T es una población de células T inflamatorias o una población de células T neoplásicas. Por ejemplo, la otra información puede incluir si las células TRBC1 (o TRBC2) parecen atípicas/pleomórficas (por ejemplo, tienen mitosis o núcleos grandes o anómalos), o la ubicación de las células T (por ejemplo, en la epidermis o dermis de biopsias de piel), o qué porcentaje de las células T en la población se tiñen con otros marcadores (incluyendo, pero sin limitación, CD2, c D3, CD5, CD4, CD7, CD8 o CD30, CD56, granzima, perforina, Mib-1, Ki-67, PD1, CD10, CXCL13 y bcl6).
La razón de TRBC1:TRBC2 o de TRGC1:TRGC2 puede ser cualquier razón y puede depender de las circunstancias específicas de la población de células T. La razón de TRBC1:TRBC2 o de TRGC1:TRGC2 en una población neoplásica de células T puede estar más alejada de 1:1 que la razón de TRBC1:TRBC2 o de TRGC1:TRGC2 en una población de células T inflamatorias. Es posible que las poblaciones de células T tanto inflamatorias como neoplásicas tengan una razón de TRBC1:TRBC2 o de TRGC1:TRGC2 que no es de 1:1.
Una población politípica de células T puede tener una razón más cercana a 1:1 que una población monotípica de células T. Una población de células T que parece politípica puede ser una población de células T inflamatorias.
Una población monotípica de células T puede tener una razón más alejada de 1:1 que una población politípica de células T. Una población de células T que parece monotípica puede ser una población de células T neoplásicas.
Si más de aproximadamente el 60 %, o más de aproximadamente el 70 %, o más de aproximadamente el 80 %, o más de aproximadamente el 85 %, o más de aproximadamente el 90 %, de las células T en una muestra expresan una cadena constante beta o gamma particular, ya sea TRBC1, TRBC2, TRGC1 o TRGC2, entonces la población puede definirse como monotípica y probablemente sea clonal. Si una población se define como monotípica y, por lo tanto, es probable que sea clonal, también puede definirse como neoplásica. En una realización, si una población de células T tiene más del 80 % de sus células que expresan una región de cadena constante de TCR beta o gamma particular, entonces la población puede considerarse neoplásica.
Una población de células T puede ser un grupo de células T. La población de células T puede estar en una muestra o aislada de una muestra de un sujeto. La población de células T puede estar en una muestra o aislada de una muestra de un tejido particular o de sangre o médula ósea. Una población de células T puede ser parte o la totalidad de las células T en un tejido particular. Una población de células T puede ser parte o la totalidad de las células T en una muestra tomada de un tejido particular y/o un sujeto particular.
El sujeto puede ser un mamífero humano o no humano. Un mamífero no humano puede incluir uno o más de un ratón, rata, gato, perro, oveja, cabra, vaca, caballo, primate, alpaca o llama.
Una muestra puede ser todo o parte de un tejido o fluido o suspensión de un sujeto o de una muestra de sangre, aspirado de ganglios linfáticos o espécimen de aspirado de médula ósea. Una muestra puede ser un trozo de un tejido. Una muestra puede ser tejido de una biopsia. Una muestra puede ser parte o la totalidad de un tejido, ganglio linfático o parte o la totalidad de un bulto, hinchazón o tumor. La muestra puede ser de un tejido o parte de un tejido que parece macroscópicamente normal.
El tejido puede ser cualquier muestra de tejido, o muestra de sangre o muestra de médula ósea o una parte de la misma. El tejido puede ser parte o la totalidad de un ganglio linfático. El tejido puede ser, por ejemplo, piel, tracto gastrointestinal, médula ósea, pulmón, hígado, bazo, grasa, riñón o sangre. Dado que los linfomas, las leucemias y los infiltrados de células T inflamatorias pueden producirse en cualquier parte del cuerpo, el tejido puede ser cualquier tejido y la muestra puede ser una muestra sólida o fluida de cualquier tejido.
TRBC1, TRBC2, TRGC1 y/o TRGC2 pueden detectarse en la población de células T que están dentro de una muestra de tejido (tal como se describió anteriormente). TRBC1, TRBC2, TRGC1 y/o TRGC2 pueden detectarse en una población de células T que se han separado del tejido antes de la prueba. La proteína, ADN o ARN de TRBC1, TRBC2, TRGC1 y/o TRGC2 pueden detectarse en una muestra de proteína, ADN o ARN extraída de una muestra o una población de células T.
En el presente documento dado a conocer se proporciona un método de determinación de si una población de células T es una población de células T neoplásicas o una población de células T inflamatorias, en donde el método comprende determinar la razón de TRBC1:TRBC2 y/o de TRGC1:TRGC2, en una población de células T usando cualquier método que sea capaz de cuantificar o definir de otro modo la expresión de TRBC1, TRBC2, TRGC1 y/o TRGC2 y puede usarse para proporcionar una indicación del porcentaje de células T que expresan un receptor de células T con TRBC1, TRBC2, TRGC1 y/o TRGC2.
Preferiblemente, si, en la población de células T estudiada, más del 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 % de las células T expresan TRBC1, entonces la muestra puede definirse como neoplásica. Preferiblemente, si en la población de células T estudiada más del 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 % o más de las células T expresan TRBC2, entonces la muestra puede definirse como neoplásica. Preferiblemente, si en la población de células T estudiada más del 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 % o más de las células T expresan TRGC1, entonces la muestra puede definirse como neoplásica. Preferiblemente, si en la población de células T estudiada, más del 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 % o más de las células T expresan TRGC2, entonces la muestra puede definirse como neoplásica. Preferiblemente, si en la población de células T estudiadas, más del 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 % de las células T expresan la misma región constante de TCR, entonces la muestra puede definirse como neoplásica.
La divulgación proporciona un par de oligonucleótidos adecuados para su uso en una reacción PCR para detectar específicamente TRBC1, TRBC2, TRGC1 o TRGC2. El par de oligonucleótidos puede usarse en la determinación de la razón de TRBC1:TRBC2 o de TRGC1:TRGC2 en una población de células T. Los oligonucleótidos pueden ser adecuados para su uso en una reacción PCR para determinar la razón de TRBC1:TRBC2 o de TRGC1:TRGC2 en una población de células T.
El par de oligonucleótidos puede detectar específicamente TRBC1 pero no TRBC2. El par de oligonucleótidos puede unirse específicamente a y amplificar una parte o la totalidad de TRBC1 pero no TRBC2. Uno o ambos del par de oligonucleótidos pueden unirse dentro de TRBC1 pero no TRBC2. Uno o ambos del par de oligonucleótidos pueden unirse dentro de la región no traducida en 3' de TRBC1, por ejemplo, pueden unirse dentro de la secuencia establecida en SEQ ID NO: 1. El par de oligonucleótidos que se unen específicamente a y amplifican parte o la totalidad de TRBC1 pero no TRBC2 puede tener las secuencias establecidas en SEQ ID NO: 9 y SEQ ID n O: 10.
El par de oligonucleótidos puede detectar específicamente TRBC2 pero no TRBC1. El par de oligonucleótidos puede unirse específicamente a y amplificar una parte o la totalidad de TRBC2 pero no TRBC1. El par de oligonucleótidos puede unirse dentro de TRBC2 pero no TRBC1. Uno o ambos del par de oligonucleótidos pueden unirse dentro de la región no traducida en 3' de TRBC2, por ejemplo, pueden unirse dentro de la secuencia establecida en SEQ ID NO: 2. El par de oligonucleótidos que se unen específicamente a y amplifican parte o la totalidad de TRBC2 pero no TRBC1 puede tener las secuencias establecidas en SEQ ID NO:11 y SEQ ID NO:12. Puesto que las regiones no traducidas en 3' (UTR en 3') de TRBC1 y TRBC2 difieren entre sí, pueden diseñarse oligonucleótidos para que se unan dentro de la Ut R en 3' para distinguir entre TRBC1 y TRBC2.
La divulgación proporciona un oligonucleótido o un conjunto de oligonucleótidos que pueden unirse específicamente a solo uno de TRBC1, TRBC2, TRGC1 o TRGC2. El/los oligonucleótido(s) puede(n) etiquetarse directa o indirectamente y detectarse por medios cromogénicos, fluorescentes, radioisotópicos u otros. El oligonucleótido puede ser adecuado para su uso en hibridación in situ. Un oligonucleótido dado a conocer en el presente documento puede unirse a cualquier parte de la secuencia de ADN o ARN de TRBC1, TRBC2, TRGC1 o TRGC2 que difiera de las otras. Por lo tanto, las secuencias de TRBC1, TRBC2, TRGC1 o TRGC2 mostradas en la presente solicitud pueden usarse para diseñar oligonucleótidos de cualquier longitud siempre que se unan específicamente a la secuencia de solo uno de TRBC1, TRBC2, TRGC1 o TRGC2. Al menos 2, o al menos 3, o al menos 4 o más oligonucleótidos pueden usarse para detectar cada uno de TRBC1, TRBC2, TRGC1 o TRGC2.
El oligonucleótido puede tener una secuencia seleccionada de cualquiera del grupo que comprende SEQ ID NO. 9, 10, 11 o 12, o una secuencia que tiene el 80 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad con Se Q ID NO. 9, 10, 11 o 12 o el complemento de cualquiera de estas secuencias.
Las sondas de oligonucleótidos pueden incluir una o más, preferiblemente al menos 2, 3 o 4 sondas, que se unen a secuencias con la ID de secuencia NO: 15 (parte de TRBC1) o la ID de secuencia NO: 16 (parte de TRBC2).
Para detectar TRBC1, pueden usarse una o más sondas de oligonucleótidos de la secuencia de SEQ ID NOS: 17 a 22. Preferiblemente se usan 17 y 18. Preferiblemente, se usan una o más, 2 o más, 3 o más, o todas las SEQ ID NOS: 19 a 22.
Para detectar TRBC2, pueden usarse una o más sondas de oligonucleótidos de la secuencia de las SEQ ID NOS: 23 a 29. Preferiblemente se usan sondas de oligonucleótidos con secuencia de una o más, 2 o más, o todas, de las SEQ ID NOS: 23 a 25. Alternativamente, se usan sondas de oligonucleótidos con secuencia de una o más, 2 o más, 3 o más, o todas de las SEQ ID NOS: 26 a 29. Alternativamente, se usan sondas de oligonucleótidos con secuencia de una o más, 2 o más, 3 o más, 4 o más, o todas, de las SEQ ID NOS: 23 a 29. Las sondas de oligonucleótidos se etiquetan preferiblemente, directa o indirectamente, y la unión puede detectarse a simple vista o digitalmente, por ejemplo, bajo un microscopio por el ojo humano o digitalmente, tal como mediante el uso de citometría de flujo u otros medios de detección digital.
En el presente documento se da a conocer un reactivo de diagnóstico que comprende un oligonucleótido o un anticuerpo que se une específicamente a solo uno de TRBC1, TRBC2, TRGC1 o TRGC2. El reactivo de diagnóstico también puede comprender una etiqueta detectable, por ejemplo, un reactivo coloreado, fluorescente, radiactivo, de unión específica, de tamaño específico.
Las secuencias de nucleótidos TRBC1 y TRBC2 difieren en las secuencias mostradas en una fuente más grande en la figura 7. Un oligonucleótido, conjunto de oligonucleótidos, reactivo de detección específico o reactivo que se une a parte o a toda esta secuencia o incluye esta secuencia puede usarse para detectar específicamente solo TRBC1 o solo TRBC2 pero no ambos.
Las secuencias de nucleótidos de TRGC1 y TRGC2 difieren en la secuencia mostrada en una fuente más grande en la figura 8. TRGC2 tiene uno o más exones adicionales en comparación con TRGC1. Un oligonucleótido, conjunto de oligonucleótidos, sonda o reactivo que se une a parte o toda esta secuencia adicional o incluye esta secuencia puede usarse para detectar específicamente solo TRGC1 o solo TRGC2 pero no ambos.
La divulgación proporciona el uso de un conjunto de oligonucleótidos para determinar la razón de TRBC1:TRBC2 o de TRGC1:TRGC2 en una población de células T.
Los oligonucleótidos pueden tener más del 60 %, más del 70 %, más del 80 %, más del 90 %, más del 95 %, más del 98 %, más del 99 % o el 100 % de identidad de secuencia con una secuencia que es complementaria a la secuencia a la que se une específicamente.
El conjunto de oligonucleótidos puede comprender uno o más de los oligonucleótidos descritos en el presente documento como que tienen la secuencia de las SEQ ID NOS: 9 a 12 y 17 a 29.
Los oligonucleótidos deben ser lo suficientemente largos como para unirse específicamente a su secuencia de ADN o ARN diana. Los oligonucleótidos pueden tener entre 5 y 50 nucleótidos de longitud, entre 10 y 40 nucleótidos de longitud, entre 15 y 30 nucleótidos de longitud o entre 20 y 25 nucleótidos de longitud.
Para la unión específica, pueden usarse oligonucleótidos más largos de entre 50 y 100 nucleótidos, o entre 100 y 1000 nucleótidos, o entre 200 y 800 nucleótidos, o entre 500 y 700 nucleótidos de longitud.
Preferiblemente, los oligonucleótidos se etiquetan directa o indirectamente para permitir la visualización de la unión.
La divulgación proporciona uno o más anticuerpos, miméticos de anticuerpos, anticuerpos biespecíficos o fragmentos de los mismos que se unen específicamente a un polipéptido seleccionado de TRBC1, TRBC2, TRGC1 y TRGC2. El anticuerpo puede unirse a o bien TRBC1 o bien TRBC2 pero no a ambos. El anticuerpo puede unirse a o bien TRGC1 o bien TRGC2 pero no a ambos. Los anticuerpos pueden usarse para distinguir los niveles de expresión de cada una de estas proteínas a nivel de proteína. Los anticuerpos pueden usarse para cuantificar la expresión de un par de regiones constantes alternativas y, por lo tanto, para determinar la razón de TRBC1:TRBC2 o de TRGC1:TRGC2 en una población de células T. Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos o miméticos pueden modificarse o etiquetarse. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos policlonales. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos pueden ser adecuados para su uso en inmunohistoquímica. Un anticuerpo dado a conocer en el presente documento puede unirse a una región de uno de TRBC1, TRBC2, TRGC1 o TRGC2 que difiere de los otros. Un sitio de unión probable en TRBC1, TRBC2, TRGC1 o TRGC2 para un anticuerpo dado a conocer en el presente documento puede identificarse comparando las secuencias polipeptídicas de TRBC1, TRBC2, TRGC1 o TRGC2 e identificando regiones de diferencia.
La divulgación proporciona el uso de un oligonucleótido o un anticuerpo según la presente divulgación en la investigación de la monotipia de células T.
Un método de la presente invención puede ser un método in vitro. Un método de la presente invención puede realizarse en cultivo celular. Un método de la presente invención puede realizarse en una muestra citológica sólida o líquida o aspirado de tejido. Un método de la presente divulgación puede ser un método in vivo.
Un oligonucleótido de la presente divulgación puede unirse directamente a una etiqueta o a través de varias capas. Por ejemplo, un reactivo de detección específico de oligonucleótido puede unirse a una etiqueta fluorescente, cromogénico u otra forma de etiqueta usando capas de polímeros de ADN ramificados que amplifican la señal. La etiqueta puede ser una etiqueta fluorescente, cromogénica, radioactiva u otra etiqueta.
La presente divulgación proporciona además el uso de un reactivo de detección específico de oligonucleótido, péptido o anticuerpo para determinar la razón de TRBC1:TRBC2 o de TRGC1:TRGC2 en una población de células T.
La presente divulgación proporciona además un oligonucleótido o un conjunto de oligonucleótidos según la presente divulgación, un par de oligonucleótidos según la presente divulgación o un anticuerpo según la presente divulgación para su uso en medicina. Un oligonucleótido o anticuerpo según la presente divulgación puede unirse selectivamente a células T que expresan una de las regiones constantes del receptor de células T TRBC1, TRBC2, TRGC1 o TRGC2 seleccionadas. Puede usarse un oligonucleótido o anticuerpo u otra modalidad terapéutica según la presente divulgación en un tratamiento para seleccionar como diana células T que expresan una región constante del receptor de células T seleccionada de TRBC1, TRBC2, TRGC1 o TRGC2. Esto puede ser útil en el tratamiento o la prevención de linfoma o rechazo de trasplante, una enfermedad autoinmunitaria o una enfermedad inflamatoria, ya que las células T que expresan una región constante del receptor de células T pueden inhibirse o destruirse selectivamente mientras que las células T que expresan la otra región constante de células T no se ven afectadas. Esto limita la cantidad de supresión inmunitaria del tratamiento. Una vez que se identifican células T que expresan una región constante del receptor de células T particular, mediante los métodos de la presente invención o mediante otros métodos, como resultado de una expansión clonal no deseada, las células T que expresan la región constante que se ha identificado pueden seleccionarse como diana selectivamente por medicamentos que comprenden reactivos de detección específicos de la presente divulgación.
La presente divulgación proporciona además un kit que comprende una o más sondas de oligonucleótidos, péptidos o anticuerpos de la presente divulgación, e instrucciones para usar las sondas y/o el kit para determinar el nivel de expresión de uno o más de TRBC1, TRBC2, TRGC1 y TRGC2 en una población de células T, o en material extraído de las mismas.
El kit puede comprender además un oligonucleótido o sonda de control negativo. El kit puede estar destinado para su uso con técnicas de hibridación in situ o técnicas de PCR. Puede usarse con un ensayo RNAscope® o con otros reactivos de detección patentados de cualquier fabricante.
La presente divulgación proporciona además un método de diagnóstico que comprende el uso de una sonda de oligonucleótido, péptido o anticuerpo de la presente divulgación para obtener una indicación de la monotipia o clonalidad de una población de células T. El método puede comprender determinar la razón de TRBC1:TRBC2 o de TRGC1:TRGC2 en una población de células T. El método puede comprender el uso de una sonda para visualizar células T que expresan uno o más de TRBC1, TRBC2, TRGC1, TRGC2 en una población de células T. El método puede comprender realizar hibridación in situ o inmunohistoquímica en una muestra usando sondas de oligonucleótidos o sondas de anticuerpos. El método puede comprender realizar PCR en una muestra usando sondas de oligonucleótidos específicas de TRBC1, TRBC2, TRGC1 o t Rg C2.
La divulgación proporciona además un método para detectar la monotipia de células T, comprendiendo el método:
I) obtener una muestra que contiene células T de un sujeto;
II) usar oligonucleótidos etiquetados directa o indirectamente para determinar el nivel de expresión de TRBC1 y TRBC2, y/o TRGC1 y TRGC2, en las células T obtenidas en I;
III) detectar la señal asociada con la hibridación de la sonda de oligonucleótido;
IV) concluir que hay monotipia de células T, indicativa de clonalidad, si más de aproximadamente el 60 %, 70 %, 80 %, 85 % o 90 % de las células T expresan la misma región constante.
El método puede comprender además concluir que una muestra contenía células T neoplásicas si se observa monotipia de células T, indicativa de clonalidad. Preferiblemente, para concluir la monotipia de células T como una indicación de clonalidad, al menos el 80 % o más de las células T deben expresar la misma región constante del receptor de células T.
La unión de uno o más oligonucleótidos a las células en la muestra puede determinarse mediante hibridación in situ.
Por lo tanto, el método de la invención puede usarse para diagnosticar una neoplasia. También puede usarse para monitorizar la progresión de la enfermedad y/o la respuesta a la terapia y/o el estado de remisión observando los cambios con el tiempo en el patrón de expresión de la región constante de TCR de células T. También puede usarse para monitorizar las respuestas inmunitarias en busca de indicaciones de si son monoclonales. Estas respuestas inmunitarias pueden ser naturales o manipuladas por terapias de diversos tipos, por ejemplo, respuestas de células T a tumores con o sin tratamiento con medicamentos tales como ipilimumab; respuestas de células T en médula ósea y otros órganos después del trasplante de médula ósea; respuestas de células T en afecciones autoinmunitarias con o sin tratamientos y respuestas de células T en enfermedades infecciosas tales como tuberculosis, lepra e infecciones virales.
Las células T que expresan una región constante de células T seleccionada de TRBC1, TRBC2, TRGC1 y TRGC2 pueden seleccionarse como diana específicamente para aumentar o modular el comportamiento o la función de esas células T con fines terapéuticos o experimentales (investigación). Los métodos para la selección como diana específica pueden incluir oligonucleótidos específicos, anticuerpos específicos, anticuerpos biespecíficos, miméticos de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos o variantes de los mismos o cualquier otro reactivo de detección específico.
La divulgación puede proporcionar además un método de tratamiento de una afección neoplásica, por ejemplo, usando las sondas para seleccionar como diana las células y administrar agentes tóxicos a las células Alternativamente, la divulgación podría usarse para marcar células en una población que es neoplásica que luego podría eliminarse de la población, por ejemplo, usando FACS, y la población de células sin las células neoplásicas podría devolverse entonces al sujeto. Esto podría usarse para tratar linfomas o leucemias tratando muestras de médula ósea de esta manera.
El experto apreciará que las características preferidas de cualquier realización y/o aspecto y/o reivindicación de la invención pueden aplicarse a todas las demás realizaciones y/o aspectos y/o reivindicaciones de la invención.
Ahora sigue a modo de ejemplo solo una descripción detallada de la presente invención con referencia a los dibujos adjuntos, en los que;
la figura 1 muestra regiones de ARNm después del corte y empalme que incluyen diferencias de secuencia entre TRBC1 y TRBC2. El final de los últimos exones se muestra en negrita, la UTR en 3' se muestra en fuente normal y el sitio de poliadenilación (AATAA) está subrayado. El sitio donde se unen los cebadores inversos (mostrados en la figura 2) se resalta en una fuente más grande, subrayada y en negrita.
La figura 2 muestra cebadores para amplificar TRBC1 y TRBC2. En principio, muchas otras regiones que contienen el ARN no traducido en 3' podrían usarse como un sitio para la unión del cebador o reactivo de detección específico. Por ejemplo, podría usarse la totalidad o parte de la UTR en 3' o la UTR en 3' podría incluirse dentro de reactivos de detección específicos que se unen a regiones más grandes de TRBC1 y TRBC2. En este ejemplo, los cebadores inversos se unen en los sitios mostrados en una fuente más grande en la figura 1, mientras que los cebadores directos se unen en el sentido de 5' en la región codificante.
La figura 3 muestra los resultados de la PCR de TRBC1 y TRBC2 de dos poblaciones de células T policlonales (C12 y C14) y una población clonal (38), que muestra que esta última expresa solo TRBC2,
la figura 4 muestra los resultados de la rtPCR cuantitativa para TRBC1 (CB1) y TRBC2 (CB2) de muestras de ARN aisladas de secciones incrustadas en parafina de tejido reactivo y tejido de linfoma de células T, * muestras de linfoma de células T. La línea de puntos por encima representa P<0,05.
La figura 5 muestra regiones de diversidad de proteínas entre TRGC1 y TRGC2. Los aminoácidos codificados por el exón adicional de TRGC2 están subrayados.
La figura 6 muestra la secuencia proteica de TRBC1 (SEQ ID NO: 5) y la secuencia proteica de TRBC2 (SEQ ID NO: 6).
La figura 7 muestra la secuencia de nucleótidos de TRBC1 (SEQ ID NO: 3) y TRBC2 (SEQ ID NO: 4). Los sitios donde se unen los oligonucleótidos de la figura 2 están subrayados. El área principal donde TRBC1 y TRBC2 difieren en secuencia se indica en una fuente más grande. El codón de terminación tga (TRBC1) o tag (TRBC2) y la señal de poliadenilación de aataaa principal se indican con cursiva y subrayado.
La figura 8 muestra la secuencia de nucleótidos de TRGC1 y TRGC2. El área donde TRBC1 y TRBC2 difieren en secuencia se indica en una fuente más grande. TRGC2 tiene un exón adicional en comparación con TRGC1. El codón de terminación de taa y la señal de poliadenilación de aataaa principal se indican con subrayado.
Las figuras 9A y 9B demuestran que las sondas de oligonucleótidos según la invención muestran tinción positiva en muestras de ganglios linfáticos no neoplásicos (benignos). La figura 9A muestra tinción positiva con sondas dirigidas a TRBC1 y la figura 9B muestra tinción positiva con sondas dirigidas a TRBC2.
La figura 10 demuestra que las sondas de oligonucleótidos según la invención pueden distinguir entre líneas celulares clonales, más específicamente en células Jurkat que expresan exclusivamente TRBC1.
La figura 11 demuestra además que las sondas de oligonucleótidos según la invención pueden distinguir entre la expresión de TRBC en una línea celular clonal, más específicamente células CEM que expresan exclusivamente TRBC2. En esta figura, TRBC2 se detecta usando las sondas de las SEQ ID NOS: 26 a 29.
La figura 12 demuestra que las sondas de oligonucleótidos según la invención pueden detectar células de linfoma usando hibridación in situ.
La figura 13 demuestra además que las sondas de oligonucleótidos según la invención pueden detectar células de linfoma usando hibridación in situ. En esta figura, TRBC1 se detecta usando las sondas de las SEQ ID NOS: 19 a 22 y TRBC2 se detecta usando las sondas de las SEQ ID NOS: 26 a 29.
Las figuras 14 y 15 demuestran que las sondas de TRBC1 y TRBC2 según la invención se unen a poblaciones de células T no neoplásicas, benignas.
La figura 16 detalla las secuencias de diversas sondas de oligonucleótidos usadas en la presente invención.
La figura 17 detalla dónde en TRBC2 se ubican oligonucleótidos con la secuencia de las SEQ ID NOS: 26 a 29 en la secuencia diana invertida y complementada.
La figura 18 detalla dónde en TRBC1 se ubican oligonucleótidos con la secuencia de las SEQ ID NOS: 19 a 22 en la secuencia diana invertida y complementada.
La estructura general del receptor de células T determina su especificidad para la unión al antígeno presentado por MHC o moléculas similares a MHC. Las células T pueden expresar receptores de células T alfa-beta o receptores de células T gamma-delta. La cadena beta comprende una de dos regiones constantes alternativas, pero muy similares, denominadas TRBC1 y TRBC2. De manera similar, la cadena gamma comprende una de dos regiones constantes muy similares denominadas TRGC1 y TRGC2. En una población de células T, algunas de las células T tienen receptores con una forma de cada una de estas regiones constantes y algunas células T tienen receptores con la otra forma de cada una de estas regiones constantes. Por lo tanto, una célula T que expresa alfa-beta expresará uno de TRBC1 o TRBC2 como la región constante de la cadena beta. De manera similar, una célula T que expresa gammadelta expresará uno de TRGC1 o TRGC2 como la región constante de la cadena gamma.
La expresión diferencial de cada una de estas regiones constantes podría usarse como método para ayudar a determinar la monotipia y clonalidad de las células T y, por lo tanto, distinguir infiltrados de células T inflamatorias, también conocidos como reactivas o benignas, de las neoplásicas, también conocidas como infiltrados de células T malignas o linfomatosas o leucémicas.
Las secuencias proteicas de TRBC1 y TRBC2 humanos difieren en solo unos pocos aminoácidos, lo que las hace muy difíciles de diferenciar. Las secuencias de ARN difieren solo ligeramente dentro de la región codificante, sin embargo, en esta invención, las diferencias en la región no traducida en 3' se usan para diferenciar TRBC1 y TRBC2. Las secuencias de ARNm de las regiones no traducidas en 3' de los alelos comunes de TRBC1 y TRBC2 se muestran en la figura 1. Las secuencias son de la base de datos IMGT especializada, pero cabe destacar que, en algunas publicaciones y presentaciones de secuencias, los autores se han referido a los nombres de secuencia al revés. Los TRBC1 y TRBC2 usados se presentan en la figura 1, donde la secuencia resaltada representa diferencias que pueden usarse como medio para investigar poblaciones de células T que expresan TRBC1 y TRBC2.
Las UTR en 3' de los alelos de TRGC1 y TRGC2 son idénticas, pero existen diferencias en la región codificante, un ejemplo de las cuales se muestra en la figura 5. Todos los alelos de TRCG2 tienen uno o dos exones adicionales en comparación con los alelos de TRGC1. Pueden usarse diferencias resaltadas en la secuencia de aminoácidos o la secuencia de ARNm de TRGC1 y TRGC2 para diferenciar entre sí.
Uso de PCR para distinguir entre regiones constantes de receptor de células T
Se diseñaron cebadores de PCR (figura 2) que pueden usarse para amplificar específicamente partes de las regiones no traducidas en 3' únicas que diferían entre TRBC1 y TRBC2. El cebador directo se une dentro de la región codificante de TRBC1 o TRBC2 y los cebadores inversos se unen en la UTR en 3' en las posiciones mostradas en una fuente más grande en la figura 1. Se generó ADNc a partir de ARN aislado de secciones de tejido (incluidas secciones incrustadas en parafina, secciones frescas o secciones congeladas) o de células aisladas en cultivo. Se confirmó que, usando cebadores donde el cebador inverso se unió dentro de la región no traducida en 3' y el cebador directo se unió en el sentido de 5', TRBC1 y TRBC2 podían distinguirse usando rtPCR de células hechas crecer en cultivo, incluyendo clones y poblaciones de células T policlonales (figura 3).
Se usó rtPCR cuantitativa para comparar la razón de TRBC1 y TRBC2 en ARN aislado de tejido incrustado en parafina fijado con formalina reactivo o neoplásico. Hubo expresión diferencial de TRBC1 y TRBC2 en todas las muestras, ya que el tejido reactivo puede contener expansiones de células T específicas de antígeno. Sin embargo, cuatro muestras mostraron razones de TRBC1/TRBC2 que eran significativamente diferentes (P<0,05) a las muestras reactivas (figura 4). Todas estas se aislaron de ganglios linfáticos que contenían principalmente linfoma de células T. Estos datos confirman que el análisis de la razón de expresión de TRBC1 y TRBC2 puede usarse para someter a prueba poblaciones de células T en cultivo o en tejidos para examinar su monotipia y clonalidad relativa.
Se ha usado un enfoque basado en PCR como validación, pero alternativamente podría usarse un enfoque de hibridación de ARN in situ o inmunohistoquímico/inmunocitoquímico para analizar las razones, ya que esto permite la generación simultánea de datos arquitectónicos, morfológicos y/o inmunofenotípicos y la detección de TRBC1 o TRBC2 en diferentes subpoblaciones de células (por ejemplo, células CD4+ o CD8+, o células en diferentes ubicaciones tisulares, por ejemplo, células dérmicas o epidérmicas en biopsias de piel), esto puede potenciar la capacidad para distinguir además poblaciones de células T reactivas (o benignas o inflamatorias) de poblaciones de células T neoplásicas o linfomatosas o malignas.
Por último, aunque las secuencias proteicas de TRBC1 y TRBC2 son similares, pueden generarse anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a un polipéptido seleccionado de TRBC1, TRBC2, TRGC1 y TRGC2 que pueden distinguir TRBC1 de TRBC2 y TRGC1 de TRGC2, permitiendo potencialmente la determinación de niveles de expresión diferencial a nivel de proteína.
La región de ARN no traducida en 3' contiene diferencias en la secuencia de ARN que pueden usarse para examinar los niveles diferenciales de expresión. La detección de ARN in situ o basada en PCR podría basarse en la expresión de cualquier región de diferencia de secuencia entre TRBC1 y TRBC2.
Los estudios preliminares han usado TRBC1 y TRBC2 ya que la mayoría de los infiltrados de células T humanas neoplásicas (por ejemplo, linfomas) se derivan de células T que expresan TCR alfa-beta, pero rara vez existen infiltrados de células T gamma-delta neoplásicas (por ejemplo, linfomas). Las figuras 5 y 8 muestran regiones de TRGC1 y TRGC2 que serían susceptibles de análisis de expresión diferencial similares a los niveles de proteína o ARN.
En resumen, los presentes experimentos muestran que la razón de expresión de genes de la región constante del receptor de células T puede usarse para identificar si las poblaciones de células T son reactivas/inflamatorias o neoplásicas. El uso de la región no traducida en 3' de TRBC1 y TRBC2 soluciona el problema de que las secuencias génicas codificantes son similares y, por lo tanto, el uso de métodos que detectan la región no traducida en 3' sería particularmente útil para detectar específicamente los niveles de expresión de TRBC1 y TRBC2.
Método de RT-PCR
La extracción de ARN y la síntesis de ADNc a partir de tejidos incrustados en parafina fijados con formalina se realizaron usando el kit RNeasy FFPE (QIAGEN 73504) y el sistema de síntesis de primera hebra SuperScript® III (Life Technologies 18080-051) según las instrucciones del fabricante. Se diseñaron los siguientes conjuntos de cebadores
TRBC1
Directo ACCCTGTATGCTGTGCTGGT (SEQ ID NO: 9);
Inverso GGGATGCAGAGAGGTGAGAG (SEQ ID NO: 10)
TRBC2
Directo ACCTTGTATGCCGTGCTGGT (SEQ ID NO: 11);
Inverso CTGGGATGGTTTTGGAGC’TA (SEQ ID NO: 12)
ACTINA
Directo GGACTTCGAGCAAGAGATGG(SEQ ID NO: 30);
Inverso AGCACTGTGTTGGCGTACAG (SEQ ID NO: 31)
Las reacciones se realizaron usando la mezcla maestra de PCR Power SYBR® Green (4367659) en un termociclador rápido 7500 (Applied Biosystems). Se prepararon mezclas de reacción de PCR en tiempo real añadiendo 25 |il de mezcla maestra de PCR SYBR® Green, conjuntos de cebadores 300 nM, 10 |il de ADNc y H2O (hasta 50 |il). Las condiciones de RT-PCR fueron las siguientes: Activación enzimática (mantenimiento) 95 °C durante 10 min, 40 ciclos de 95 °C durante 15 s y 60 °C durante 1 minuto.
Uso de hibridación in situ para distinguir entre regiones constantes de receptor de células T y para diagnosticar una afección neoplásica
Ejemplo 1 - RNAScope para validar los niveles de expresión de TRBC1 y TRBC2 en células T puede determinarse usando RNAScope
Para confirmar que el ARN se conservaba cuando se colocaban muestras de biopsia en un portaobjetos, se realizaron experimentos de hibridación in vitro usando una sonda de RNAScope dirigida contra transcritos de ARN con un bajo nivel de expresión, por ejemplo, PPIB, en muestras de biopsia en portaobjetos. Los resultados obtenidos mostraron una buena conservación del ARN en el experimento de control.
La siguiente etapa fue determinar si había una señal usando RNAScope (Minca EC et al. J Cutan Pathol. Febrero de 2015; 42(2):82-9) y sondas para TRBC1 y TRBC2. Cuando se aplicaron sondas etiquetadas específicas para cualquiera de TRBC1 y TRBC2 a muestras de tejido de ganglio linfático no neoplásico (benigno), se observaron señales en todos los portaobjetos (figura 9). La tinción en la figura 9 es representativa de un ganglio linfático normal donde las células T expresan una mezcla de expresión de TRBC1 y TRBC2.
Para demostrar que la expresión de TRBC1/TRBC2 puede detectarse por separado, se tiñeron líneas celulares clonales que expresan solo TRBC1 (células Jurkat) o TRBC2 (células CEM) con las mismas sondas etiquetadas específicas para TRBC1 o TRBC2. Los resultados se muestran en las figuras 10 y 11, a partir de las cuales queda claro que las células T son monotípicas para TRBC1 o TRBC2 cuando son parte de una población clonal, tal como las líneas celulares mostradas en este caso. Los resultados observados en este estudio histológico fueron respaldados por análisis de RT-PCR.
Cuando se contó el número de células en las líneas celulares clonales teñidas con TRBC1 y TRBC2, se observaron los siguientes resultados:
Datos de la línea celular individual (porcentaje de células positivas):
CEM (TRBC2 restringida por PCR)
TRBC1 0,17 (0,04-0,53) %
TRBC2 95,56 % (94,48 - 96,44)
MOLT-4 (TRBC2 restringida por PCR)
TRBC1 0,06 (0,00 -0 ,37)%
TRBC2 97,06 (96,14 - 97,77) %
RPMI8402 (TRBC1 restringida por PCR)
TRBC1 86,00 (84,29 - 87,55) %
TRBC2 22,00 (20,12 - 24,00) %
Jurkat (TRBC1 restringida por PCR)
TRBC1 90,72 (89,26 - 92,00) %
TRBC2 3,17 (2,43 -4 ,12)%
Todas las líneas celulares se puntuaron por 3 observadores, puntuando cada uno 600 células para TRBC1 y 600 células para TRBC2, lo que significa que se puntuaron 1800 células conjuntamente por línea celular. Para todas las puntuaciones (todas las líneas celulares y los conjuntos de sondas tomados juntos), la correlación entre los resultados obtenidos por cualquier par de observadores fue de entre 0,99 y 1,00 (de Spearman). Se calcularon intervalos de confianza del 95 % usando el procedimiento de Wilson con una corrección para la continuidad.
Habiendo demostrado en las figuras 10 y 11 que TRBC1 y TRBC2 pueden usarse para distinguir diferentes líneas celulares neoplásicas clonales, la cuestión fue demostrar que el principio podría trasladarse a muestras de pacientes y podría usarse, por ejemplo, para el diagnóstico de linfoma. La dificultad es distinguir las células de linfoma de las células T reactivas (no neoplásicas) asociadas, que pueden, en algunos casos, representar >50 % del infiltrado. Las células T reactivas no son clonales y deben ser una mezcla aproximadamente igual de células que expresan TRBC1 y TRBC2. Sin embargo, a veces las células de linfoma son identificables morfológicamente (grandes, pleomórficas, etc.). Mediante el uso del método de la invención para teñir células TRBC1 y TRBC2 in situ, los resultados pueden combinarse con análisis morfológicos para dar un diagnóstico. Esto se ilustra en las figuras 12 y 13, que demuestran ambas que los linfomas de células T parecen expresar predominantemente solo un tipo de TRBC.
Además de examinar la morfología diferencial de las células T que expresan cada TRBC, también puede ser posible usar tinción conjunta con otros marcadores de células T, lo que probablemente mejore significativamente la sensibilidad de la detección de linfoma.
La figura 14 demuestra además las propiedades diagnósticas de la invención. En la figura 14, el tejido de ganglios linfáticos benignos no neoplásicos se tiñe con sondas de TRBC1 (sondas con las SEQ ID NOS: 17 y 18) y sondas de TRBC2 (sondas con las s Eq ID NOS: 26 a 29). Los resultados muestran que aproximadamente la mitad de las células T en la paracorteza (área de células T) mostradas son positivas con cada conjunto de sondas (puntos marrones, detección de DAB). En la parte superior de cada imagen, hay un área negativa alargada claramente definida, que es un seno cortical de los ganglios linfáticos. Estos raramente contienen células T.
La figura 15 muestra un resultado similar a la figura 14 pero usando conjuntos de sondas diferentes y una metodología de detección diferente. La hibridación se realizó en un tampón de formamida y SSC en un instrumento Ventana Discovery Ultra Immunostainer totalmente automatizado (Ventana Medical Systems Inc, Tuscon, AZ). Los cócteles de sondas (sondas de TRBC1 con secuencias de SEQ ID NOS: 19 a 22 y sondas de TRBC2 con secuencias de SEQ ID NOS: 26 a 29) se usaron para la hibridación a entre 37 °C y 46 °C. Se realizaron tres lavados de rigurosidad usando SSC al 0,1 % a entre 37 °C y 48 °C. Las sondas se etiquetaron con digoxigenina y se detectaron por medio de un anticuerpo monoclonal de ratón anti-digoxigenina etiquetado con HRP con un sistema de amplificación multimérico patentado unido (Ventana Medical Systems Inc, Tuscon, AZ). Esto fue seguido por amplificación de tiramida, depositando el hapteno BF (Rimsza et al. Diagnostic Pathology 2014 9:144), que se detectó con un anticuerpo anti-BF de ratón etiquetado con HRP. Se siguió el desarrollo con diaminobencidina, dejando sustrato marrón en todos los sitios donde se unieron las sondas. Las secciones se contratiñeron con hematoxilina y se montaron en Depex. De nuevo, aproximadamente la mitad de las células T en la paracorteza (área de células T) mostradas son positivas con cada conjunto de sondas (puntos marrones, detección de DAB). En la parte superior de cada imagen, hay un área negativa alargada claramente definida, que es un seno cortical de ganglios linfáticos en la tinción de TRBC1 y un vaso sanguíneo en TRBC2 (ambos contienen raramente células T).
Ahora siguen ejemplos de cómo la presente invención podría usarse para alterar y mejorar la práctica clínica actual en relación con el linfoma y la leucemia.
1. Linfomas de piel (incluyendo, pero sin limitación, micosis fungoide; síndrome de Sezary; linfoma periférico de células T, no especificado de otro modo; linfoma anaplásico de células grandes; papulasis linfomatoide; linfoma cutáneo primario de células T pleomórficas de tamaño pequeño/medio positivas para CD4).
Los linfomas de piel presentan aspectos, generalmente parches rojos, similares a afecciones cutáneas inflamatorias benignas. A menudo se toman biopsias de estas, pero las afecciones benignas y los linfomas son difíciles de distinguir por los medios morfológicos e inmunohistoquímicos actuales. Los estudios de reordenamiento de genes de receptores de células T basados en PCR pueden fallar o dar resultados que son monoclonales, oligoclonales o policlonales, que muestran una correlación incompleta con el diagnóstico clínico, a saber, los linfomas son a menudo monoclonales, pero las respuestas inmunitarias fuertes que se producen como parte de los procesos inflamatorios también pueden dar resultados monoclonales. Por el contrario, pueden observarse resultados policlonales u oligoclonales con mayor frecuencia en afecciones cutáneas inflamatorias benignas, pero una proporción de linfomas dará resultados policlonales u oligoclonales porque hay una gran población de células T benignas que reaccionan al linfoma que oscurece cualquier resultado monoclonal obtenido de las células de linfoma. En todas estas situaciones, se produce la dificultad porque la población de células responsables de producir cualquier pico clonal en los resultados de la PCR no se puede distinguir de otras poblaciones. En una alta proporción de casos, no se alcanza un diagnóstico concluyente, a pesar de estos análisis, por lo que pueden llevarse a cabo investigación radiológica y análisis de laboratorio de muestras de sangre y médula ósea en un intento de alcanzar un diagnóstico concluyente. Estas investigaciones adicionales rara vez ayudan y se adopta un enfoque expectante (“observar y esperar”). Se espera a que el paciente regrese y repita el análisis de biopsia, con la esperanza de un resultado más concluyente, y se realiza una investigación radiológica y análisis de laboratorio de muestras de sangre y médula ósea.
El análisis de TRBC1/2 tal como se describe en la presente invención solucionaría este problema. Por ejemplo, usando oligonucleótidos o anticuerpos dados a conocer en el presente documento, el análisis de TRBC1/2 puede aplicarse a una población de células que también puede definirse basándose en su aspecto morfológico, inmunofenotipo (por ejemplo, tamaño mayor, expresión de CD4 o CD8 o CD30) u otras características. Si, por ejemplo, el 90 % (o el 80 % o el 70 % o el 60 %) de las células T CD4+ están restringidas a TRBC1 (es decir, expresan TRBC1, no TRBC2), entonces puede concluirse que este es un linfoma en lugar de una afección inflamatoria benigna de la piel y tratar al paciente con radioterapia, quimioterapia u otros tratamientos apropiados. También debe indicarse que tal análisis de TRBC1/2 según la invención puede realizarse de manera económica y rápida, en menos de 24 horas, mientras que los estudios de reordenamiento de genes de receptores de células T tardarán de una a varias semanas. La presente invención proporciona un resultado más fiable, concluyente y rápido que puede obtenerse de manera más económica.
2. Linfoma de células T asociado a enteropatía/enfermedad celíaca refractaria del intestino delgado
La enfermedad celíaca es una enfermedad autoinmunitaria, desencadenada por una respuesta de células T a la proteína gluten, que se encuentra en la cebada, el centeno y el trigo. Un pequeño porcentaje de pacientes celiacos desarrollan linfoma de células T asociado a enteropatía, una afección que prácticamente nunca se ve en ausencia de enfermedad celíaca. La diferencia clave entre la enfermedad celíaca y el linfoma asociado a enteropatía es que las características histológicas (linfocitos en el epitelio del intestino delgado con daño en las vellosidades del intestino delgado) y los síntomas (diarrea, hinchazón abdominal, anemia, fatiga) de la enfermedad celíaca se resuelven al evitar estrictamente el gluten en la dieta, pero los del linfoma asociado a enteropatía y la enfermedad celíaca refractaria (que se considera cada vez más como una forma temprana de linfoma asociado a enteropatía) no lo hacen. Sin embargo, una proporción de individuos tienen una exposición continua al gluten sin darse cuenta y sus síntomas no se resuelven, a pesar de una dieta aparentemente libre de gluten (en la que no son conscientes de la exposición continua al gluten). A menudo se someten a biopsia duodenal porque existe sospecha de linfoma de células T asociado a enteropatía en evolución y se realizan examen histológico y estudios de clonalidad en la biopsia. Al igual que con las discusiones sobre linternas de piel anteriores, los estudios de clonalidad existentes no distinguen de manera fiable la afección benigna, la enfermedad celíaca activa, de las afecciones linfomatosas, enfermedad celiaca refractaria/linfoma asociado a enteropatía. La investigación radiológica y el análisis de laboratorio de muestras de sangre y médula ósea no siempre pueden ayudar en esta distinción y el paciente puede observarse y someterse a manipulación dietética y biopsia adicional en un intento de alcanzar un diagnóstico definitivo.
Tal como se describe con referencia a los linfomas de piel, el análisis de TRBC1/2 por técnicas de la presente invención, tales como (pero sin limitación) histología puede aplicarse específicamente a una población de células definidas en función de su aspecto morfológico, inmunofenotipo (por ejemplo, tamaño mayor, expresión de CD4 o CD8 o CD30) u otras características para determinar si hay sesgo hacia TRBC1 o TRBC2. Si, por ejemplo, el 90 % (o el 80 % o el 70 % o el 60 %) de las células T CD8+ están restringidas a TRBC1 (es decir, expresan TRBC1, no TRBC2), entonces puede concluirse que esta es una de las afecciones linfomatosas, enfermedad celiaca refractaria/linfoma asociado a enteropatía y tratar al paciente con quimioterapia. Cuanto antes pueda provocarse esto en los linfomas asociados a enfermedad celiaca agresivos, mejor será el pronóstico. Tal como se comentó anteriormente, el análisis de TRBC1/2 de la presente invención puede llevarse a cabo de forma económica y rápida, en menos de 24 horas, proporcionando un resultado más fiable, concluyente y rápido.
3. Linfomas y leucemias de células T en médula ósea
La leucemia linfocítica celular grande de células T (T-LGL) es una proliferación clonal de linfocitos T CD8+, que provoca neutropenia (es decir, disminución del número de neutrófilos en sangre periférica), anemia (es decir, disminución del número de glóbulos rojos en sangre periférica) y/o trombocitopenia (es decir, disminución del número de plaquetas en sangre periférica). Esta afección a menudo está asociada con trastornos autoinmunitarios, especialmente artritis reumatoide, y otros trastornos linfoproliferativos. El diagnóstico a veces se sugiere mediante citometría de flujo que demuestra un mayor número de células T CD8+ CD57+ y, en una proporción de casos, esto se confirma mediante estudios de reordenamiento de genes de receptores de células T. Alternativamente, la T-LGL puede diagnosticarse en una trefina de médula ósea, a veces como un hallazgo incidental no sospechoso. En una trefina, puede haber un aumento cualitativo en los números de células T, a veces con formación de agrupamientos y habitualmente con una inversión de la razón de células T CD4+:CD8+, aunque este hallazgo no es específico para T-LGL.
Los estudios de reordenamiento de genes de receptores de células T basados en PCR pueden fallar (un problema común en las trefinas de médula ósea) o dar resultados que son monoclonales, oligoclonales o policlonales, que muestran una correlación incompleta con el diagnóstico clínico, a saber, T-LGL es a menudo monoclonal, pero respuestas inmunitarias fuertes al linfoma o a otras afecciones en la médula ósea o ganglio linfático, tales como la presencia de otra neoplasia, por ejemplo, un linfoma de células B, mieloma o un síndrome mielodisplásico, pueden hacer que los resultados monoclonales sean más difíciles de documentar. De manera similar, la presencia de solo un pequeño número de células T puede dar como resultado un resultado monoclonal, conocido como pseudoclonalidad. Los estudios de reordenamiento de genes de células T realizados en sangre periférica están sujetos a limitaciones similares. Por lo tanto, en una proporción significativa de casos en los que puede estar presente T-LGL, no puede alcanzarse un diagnóstico concluyente y se adopta un enfoque de “observar y esperar” expectante.
Tal como se describe con referencia a los linfomas de piel, el análisis de TRBC1/2 por técnicas de la presente invención, tales como (pero sin limitación) histología puede aplicarse específicamente a una población de células definidas en función de su aspecto morfológico, inmunofenotipo (por ejemplo, tamaño mayor, expresión de CD4 o CD8 o CD30) u otras características para determinar si hay sesgo hacia TRBC1 o TRBC2. Si, por ejemplo, el 90 % (o el 80 % o el 70 % o el 60 %) de las células T CD8+ están restringidas a TRBC1 (es decir, expresan TRBC1, no TRBC2), entonces puede concluirse que esto es T-LGL y tratar al paciente con agentes quimioterápicos tales como esteroides, metotrexato, ciclofosfamida. Cuanto antes pueda provocarse esto, mejor será el pronóstico. Tal como se comentó anteriormente, el análisis de TRBC1/2 de la presente invención puede llevarse a cabo de forma económica y rápida, en menos de 24 horas, proporcionando un resultado más fiable, concluyente y rápido.
Los métodos de la invención usados para analizar los niveles de expresión de TRBC1/2 permiten un diagnóstico más preciso de la presencia o ausencia de linfoma en una muestra de médula ósea o ganglio linfático u otro tejido o sangre. Esto es de importancia crítica para determinar si un linfoma de piel, por ejemplo, se trata mediante radioterapia local en la piel o mediante quimioterapia sistémica.
Además, algunos linfomas sistémicos de células T pueden presentarse inicialmente con niveles relativamente bajos de implicación de la médula ósea (por ejemplo, el linfoma contribuye al 20-30 % de las células en la médula) y el diagnóstico no es concluyente incluso después del examen morfológico e inmunohistoquímico y los estudios de reordenamiento de genes de receptores de células T basados en PCR. Puede intentarse el examen radiológico y el análisis de sangre periférica, para tratar de alcanzar el diagnóstico, pero a menudo no son concluyentes. A continuación, se adopta un enfoque expectante (“observar y esperar”), hasta que o bien una segunda trefina o biopsia de ganglios linfáticos muestre un nivel mucho más alto de implicación por linfoma que permita un diagnóstico concluyente en un examen morfológico e inmunohistoquímico o bien se espera a que se desarrolle una masa en algún lugar que pueda identificarse radiológicamente y tomarse una biopsia de la misma para producir un diagnóstico histológico definitivo. Debe indicarse que una proporción de pacientes mueren debido a la incapacidad de alcanzar un diagnóstico y el consiguiente retraso en el tratamiento. En cuanto a la T-LGL anterior, la aplicación del análisis de TRBC1/2 mediante técnicas tales como (pero sin limitación) histología podría conducir a un diagnóstico rápido en la trefina inicial de la médula ósea, lo que conduciría a una instigación mucho más rápida del tratamiento y un mejor desenlace del paciente.
4. Linfomas de células T en ganglios linfáticos
Mientras que algunos linfomas de células T están compuestos por células de aspecto claramente neoplásico cuando se observan bajo el microscopio. En un ganglio linfático, con frecuencia crecen en la paracorteza, la parte del ganglio linfático que habitualmente contiene abundantes células T. Entonces puede ser muy difícil determinar si un linfoma está presente o no y se realizan estudios de clonalidad basados en PCR costosos y lentos, que a menudo no dan un resultado concluyente, ya que también hay muchas células no neoplásicas en el ganglio linfático que pueden oscurecer la naturaleza clonal del estudio de PCR.
El análisis de TRBC1/2 tal como se describe en la presente invención solucionaría este problema. Por ejemplo, usando oligonucleótidos o anticuerpos dados a conocer en el presente documento. El análisis de TRBC1/2 puede aplicarse a una población de células que también puede definirse en función de su aspecto morfológico, inmunofenotipo (por ejemplo, tamaño mayor, expresión de CD4 o CD8 o CD30) u otras características. Si, por ejemplo, el 90 % (o el 80 % o el 70 % o el 60 %) de las células T CD4+ están restringidas a TRBC1 (es decir, expresan TRBC1, no TRBC2), entonces puede concluirse que este es un linfoma en lugar de una población benigna de células T y tratar al paciente con radioterapia, quimioterapia u otros tratamientos apropiados. También debe indicarse que dicho análisis de TRBC1/2 según la invención puede realizarse de manera económica y rápida, en menos de 24 horas, mientras que los estudios de reordenamiento de genes de receptores de células T tardarán de una a varias semanas. La presente invención proporciona un resultado más fiable, concluyente y rápido que puede obtenerse de manera más económica. ID de secuencia
SEQ ID NO: 1 región no traducida en 3' de ARNm de TRBC1, mostrada en la figura 1, el extremo del último exón se muestra en negrita y el sitio de poliadenilación en 3' principal se muestra subrayado GTCAAGAGAAAGGATTTCTGAAGGCAGCCCTGGAAGTGGAGTTAGGAGCTTC TAACCCGTCATGGTTTCAATACACATTCTTCTTTTGCCAGCGCTTCTGAAGAGC TGCTCTCACCTCTCTGCATCCCAATAGATATCCCCCTATGTGCATGCACACCTG CACACTCACGGCTGAAATCTCCCTAACCCAGGGGGACCTTAGCATGCCTAAGT GACTAAACCAATAAA SEQ ID NO: 2 región no traducida en 3' de ARNm de TRBC2, mostrada en la figura 1, el extremo del último exón se muestra en negrita y el sitio de poliadenilación de 3' principal se muestra subrayado GTCAAGAGAAAGGATTCCAGAGGCTAGCTCCAAAACCATCCCAGGTCATTCT TCATCCTCACCCAGGATTCTCCTGTACCTGCTCCCAATCTGTGTTCCTAAAAGT GATTCTCACTCTGCTTCTCATCTCCTACTTACATGAATACTTCTCTCTTTTTTCT GTTTCCCTGAAGATTGAGCTCCCAACCCCCAAGTACGAAATAGGCTAAACCA ATAAA SEQ ID NO: 3 Exones de TRBC1 y UTR en 3' mostrados en la figura 7.
SEQ ID NO: 4 Exones de TRBC2 y UTR en 3' mostrados en la figura 7.
SEQ ID NO: 5 Secuencia de proteína TRBC1 mostrada en la figura 6.
SEQ ID NO: 6 Secuencia de proteína TRBC2 mostrada en la figura 6.
SEQ ID NO: 7 Secuencia de proteína TRGC1 mostrada en la figura 5
XKQLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGS QEGNTMKTNDTYMKFSWLTVPEKSLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIFPPIKTDV ITMDPKDNCSKDANDTLLLQLTNTSAYYMYLLLLLKSVVYFAIITCCLLRRTAFC CNGEKS SEQ ID NO: 8 secuencia de proteína TRGC2 mostrada en la figura 5 XKQLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDIIKIHWQEKKSNTILGS QEGNTMKTNDTYMKFSWLTVPEESLDKEHRCIVRHENNKNGIDQEIIFPPIKTDV TTVDPKYNYSKDANDVITMDPKDNWSKDANDTLLLQLTNTSAYYTYLLLLLKS VVYFAIITCCLLRRTAFCCNGEKS
SEQ ID NO: 9 Cebador directo de TRBC1 Cpi: ACCCTGTATGCTGTGCTGGT, mostrado en la figura 2.
SEQ ID NO: 10 Cebador inverso de TRBC1 cpi: GGGATGCAGAGAGGTGAGAG^ mostrado en la figura 2.
SEQ ID NO: 11 Cebador directo de TRBC2 Cp2: ACCTTGTATGCCGTGCTGGT, mostrado en la figura 2.
SEQ ID NO: 12 Cebador inverso de TRBC2 Cp2: CTGOOATGOTTTTGGAOCTA mostrado en la figura 2.
SEQ ID NO: 13 Exones de TRGC1 y UTR en 3' mostrados en la figura 8.
SEQ ID NO: 14 Exones de TRGC2 y UTR en 3' mostrados en la figura 8.
SEQ ID NO: 15- CCATGTCAAGAGAAAGGATTTCTGAAGGCAGCCCTGGAAGT GGAGTTAGGAGCTTCTAACCCGTCATGGTTTCAATACACATTCTTCTTTTGCCA GCGCTTCTGAAGAGCTGCTCTCACCTCTCTGCATCCCAATAGATATCCCCCTA TGTGCATGCACACCTGCACACTCACGGCTGAAATCTCCCTAACCCAGGGGGAC CTTAGCATGCCTAAGTGACTAAACC SEQ ID NO: 16 -CATGGTGTCAAGAGAAAGGATTCCAGAGGCTAGCTCC AAAACCATCCCAGGTCATTCTTCATCCTCACCCAGGATTCTCCTGTACCTGCTC CCAATCTGTGTTCCTAAAAGTGATTCTCACTCTGCTTCTCATCTCCTACTTACA TGAATACTTCTCTCTTTTTTCTGTTTCCCTGAAGATTGAGCTCCCAACCCCCAA GTACGAAATAGGCTAAACC
SEQ ID NO: 17 - AC C ATG AC G G G TTAG AAG C T
SEQ ID NO: 18 - TTA G G G A G A TTTC A G C C G TG A
SEQ ID NO: 19 - T G G G TT A G G G A G A T T T C A G C C
SEQ ID NO: 20 - ATTGGGATGCAGAGAGGTGAG
SEQ ID NO: 21 - TGTGTATTG A A ACC ATGACGG
SEQ ID NO: 22 - CTAACTCCACTTCCAGGGCTG
SEQ ID NO: 23 - TGTA AGTAGGAGATGAG AAGC A

Claims (10)

  1. REIVINDICACIONES
    i. Un método de determinación de si una población de células T es neoplásica o no neoplásica, que comprende:
    a) proporcionar una muestra obtenida de un sujeto;
    b) usar uno o más reactivos de detección específicos que detectan específicamente TRBC1, y uno o más reactivos de detección que detectan específicamente TRBC2, y determinar la razón de células T en la muestra, o en un subconjunto de células T en la muestra, que expresan TRBC1 con respecto a TRBC2, en el que el reactivo de detección específico que detecta TRBC1 no detecta TRBC2, y el reactivo de detección específico que detecta TRBC2 no detecta TRBC1; y/o
    c) usar uno o más reactivos de detección específicos que detectan específicamente TRGC1, y uno o más reactivos de detección que detectan específicamente TRGC2, y determinar la razón de células T en la muestra, o en un subconjunto de células T en la muestra, que expresan TRGC1 con respecto a TRGC2, en el que el reactivo de detección específico que detecta TRGC1 no detecta TRGC2, y el reactivo de detección específico que detecta TRGC2 no detecta TRGC1,
    en el que si más del 80 % de las células T expresan la misma región de cadena constante de TCR beta o TCR gamma, entonces la población se define como neoplásica.
  2. 2. El método según la reivindicación 1, en el que cuando la población de células T se determina como no neoplásica, la población de células T es inflamatoria.
  3. 3. El método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la muestra es una muestra de tejido o célula sólida o líquida o una sección de tejido de un mamífero humano o no humano.
  4. 4. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende teñir células en una muestra de tejido o célula sólida o líquida con los reactivos de detección específicos, por ejemplo, usando inmunohistoquímica; y/o
    que comprende teñir una sección de tejido con los reactivos de detección específicos.
  5. 5. El método según la reivindicación 3, que comprende además teñir de manera conjunta la muestra de tejido o célula sólida o líquida, o sección de tejido con uno o más reactivos de detección específicos adicionales que detectan uno o más marcadores celulares adicionales, y opcionalmente en el que el reactivo de detección específico adicional detecta uno o más marcadores que incluyen, pero no se limitan a CD2, CD3, CD5, CD4, CD7, CD8 o CD30, CD56, granzima, perforina, Mib-1, Ki-67, PD1, CD10, CXCL13 y bcl6.
  6. 6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los reactivos de detección específicos se etiquetan o bien directa o bien indirectamente con una etiqueta detectable.
  7. 7. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que uno o más de los reactivos de detección específicos que distinguen entre TRBC1 y TRBC2, y/o TRGC1 y TRGC2 son una sonda de oligonucleótido, un par de oligonucleótidos o un conjunto de oligonucleótidos en el que al menos uno de los oligonucleótidos se une específicamente a una región que es diferente entre TRBC1 y TRBC2 o entre TRGC1 y TRGC2; y/o
    en el que los reactivos de detección específicos son oligonucleótidos adecuados para realizar una reacción PCR para determinar la razón de TRBC1 con respecto a TRBC2 o de TRGC1 con respecto a TRGC2; y/o
    en el que el uno o más reactivos de detección específicos son sondas de oligonucleótidos que se unen específicamente a TRBC1, TRBC2, TRGC1 o TRGC2, por ejemplo, para su uso en inmunohistoquímica e hibridación in situ.
  8. 8. El método según la reivindicación 7, en el que al menos una de las sondas reconoce específicamente la UTR en 3' de TRBC1 o TRBC2 pero no ambas.
  9. 9. El método según la reivindicación 7 u 8, en el que una o más de las sondas tienen la secuencia de una de SEQ ID NOS: 19 a 28.
  10. 10. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el uno o más reactivos de detección es un par de oligonucleótidos que comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 9 y 10, o SEQ ID NO: 11 y 12.
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