ES2861305T3 - Biotransformación continua de ácidos carboxílicos aromáticos sustituidos a sus aldehídos y alcoholes correspondientes - Google Patents

Biotransformación continua de ácidos carboxílicos aromáticos sustituidos a sus aldehídos y alcoholes correspondientes Download PDF

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Abstract

Un método para la reducción biológica de un ácido arilcarboxílico con la siguiente estructura: **(Ver fórmula)** a su correspondiente aldehído con la siguiente estructura: **(Ver fórmula)** o su correspondiente alcohol con la siguiente estructura: **(Ver fórmula)** en donde R, R1 y R2 representan cada uno independientemente H, OH, NH2, alcoxi, alquilo o halógeno, con alta pureza y rendimiento, comprendiendo el método: a) preparar la suspensión de esporas del cultivo Pycnoporus cinnabarinus NCIM-1181; b) cultivar el hongo Pycnoporus cinnabarinus NCIM-1181 de la suspensión de esporas en un fermentador que contiene un medio de cultivo de pH en el rango de 2-6 durante 48-96 horas para obtener gránulos celulares para reducción biológica; c) añadir el ácido arilcarboxílico al fermentador del paso (b) para obtener una concentración final de 1-3 g/L del ácido arilcarboxílico y mantener el pH en el rango de 3-5; en donde el ácido arilcarboxílico se consume durante 50-90 horas para obtener un caldo de fermentación que contiene el aldehído o el alcohol; d) filtrar el caldo de fermentación para obtener una fracción de permeado y una fracción de retenido; e) pasar la fracción de permeado a través de una columna de captura empaquetada con adsorbente hidrófobo y ajustada a un pH de 5-8, que extrae selectivamente el aldehído o alcohol obtenido en la etapa (c); f) hacer eluir la columna de captura con un disolvente orgánico para proporcionar un disolvente de elución que comprende el aldehído o el alcohol en alta concentración; y g) cristalizar el aldehído o alcohol de la etapa (f) y así obtener aldehído o alcohol puro.

Description

DESCRIPCIÓN
Biotransformación continua de ácidos carboxílicos aromáticos sustituidos a sus aldehidos y alcoholes correspondientes
Campo de la invención
La presente invención describe un método novedoso para la reducción biológica de los ácidos carboxílicos a sus correspondientes aldehídos y/o alcoholes con alta productividad y alto rendimiento utilizando el hongo Pycnoporus cinnabarinus NCIM-1181 de la división de los basidiomicetos. Esta reducción es específica y selectiva para su grupo funcional (-COOH), sin afectar a otro grupo funcional como los grupos -R (-OH, -NH2, -alquilo, -alcoxi) y su posición, número en el anillo aromático.
Antecedentes de la invención
Con la mejora de las condiciones de vida, se ha incrementado el deseo de los consumidores por productos sanos y ecológicos de origen natural y por tanto se ha acelerado la actividad de lanzamiento de productos de origen natural. A diferencia de la síntesis química, la síntesis biológica tiene las ventajas de una condición de reacción suave, menos subproductos, menor contaminación ambiental, selectividad y procesamiento simple aguas abajo. Por lo tanto, la investigación dirigida hacia la vía biosintética microbiana para producir sabores naturales, estabilizadores de alimentos, etc., está ganando importancia. Los compuestos aromáticos naturales que incluyen benzaldehído, vainillina, ácido p-hidroxibenzoico ya tienen demanda y representan un tamaño de mercado muy grande en la industria alimentaria y de los sabores.
Los aldehídos aromáticos, alifáticos y alicíclicos y el alcohol son productos intermedios útiles en las industrias química, farmacéutica, alimentaria y de sabores. Los métodos químicos para la conversión de ácidos carboxílicos en aldehído o alcohol son limitados y generalmente requieren derivación (esterificación) y desbloqueo del producto con reactivos que contienen grupos funcionales competidores (JP2010227893A).
Una ruta eficaz para sintetizar arilaldehídos y alcoholes a partir de ácidos arílicos s es utilizar el sistema de enzimas reductoras de basidiomicetos de pudrición blanca como biocatalizador. Los hongos de pudrición blanca con actividades reductoras incluyen Trametes versicolor (Farmer et al., Biochim. Biophys.Acta. 35 (1959) 202-211), Sporotrichum pulverulentum (Ander et al. Arch Microbiol 125 (1980) 189-202), Phlebia radiata (Lundell et al. Appl. Environ. Microbiol. 56 (1990) 2623-2629), Phanerochaete chrysosporium (Muheim et al., Eur. J Biochem. 195 (1991) 369-375), Bjerkandera sp (De Jong et al. Appl. Environ. Microbiol. 60 (1994) 271-277).
La Patente de Estados Unidos No. 6261814 divulga el uso de un sistema enzimático aislado y purificado de ácido carboxílico reductasa de la cepa Nocardia sp, NRRL 5646 como biocatalizador para la reducción de ácidos carboxílicos. Requiere la adición externa de cofactores costosos como ATP, NADPH que son difíciles de regenerar en el sistema y dificultan el aislamiento del producto. Por tanto, este proceso no es comercialmente viable en términos de rendimiento y coste.
Otra Patente de los Estados Unidos No. 5866380 divulga un proceso para la conversión de ácido vainílico en vainillina en donde se usa el hongo de la pudrición blanca y solo da un rendimiento del 31 % de aldehído. También divulga el uso de resina adsorbente en el medio de fermentación.
La Patente No. US6162637 divulga un proceso para la conversión de ácido vanílico en vainillina usando Phanerochaete chrysosporium, en donde se usa una concentración de sustrato de 0.3g/L durante 3 días junto con 0.3 g/L todos los días, se añadió un 10 % de resina de amberlite XAD para finalmente producir 0.628g/L de vainillina. La Patente Estadounidense No. 6162637 describe usos de Phanerochaete chrysosporium, MIC 247 para reducir el ácido vanílico a vainillina, en donde se añaden 1.8 g/L de ácido vanílico en dosis de 0.3 g/L cada día hasta 6 días, que es un tiempo muy largo para una biotransformación. Al final de los 6 días, se acumulan 0.628 g/L de vainillina, pero solo se observa una conversión del sustrato del 46.5 %, lo que finalmente contribuye a una menor productividad del proceso general.
La Patente de Estados Unidos No. 6844019 divulga el uso del organismo Micromucor isabellinus (Zyl 849) para convertir ácido vainílico en vainillina, en donde se usa ácido vanílico para el crecimiento del cultivo iniciador, lo que da como resultado un rendimiento de biotransformación menor. En total se añaden 18g de ácido vanílico y se obtienen 8.5g de vainillina con una conversión de sustrato del 43.8 %.
Hage y Schoemaker (1999) emplearon la cepa de basidiomicetos Bjerkandera sp cepa BOS55 para reducir el ácido p-anísico al aldehído y alcohol correspondientes. Sin embargo, los rendimientos molares totales de aldehído y alcohol juntos fueron solo del 75 % (Hage et al. Appl Microbiol Biotechnol (1999) 52: 834-838). Otros sustratos estudiados fueron el ácido verátrico, el ácido 3-cloro-4-metoxibenzoico, el ácido 3, 5-dicloro-4-metoxibenzoico, el ácido 3, 4-diclorobenzoico, el ácido 4-fluorobenzoico y los ácidos 3-nitrobenzoico. Todos estos ácidos se redujeron, sin embargo, los hongos establecieron un equilibrio entre la producción de aldehido y alcohol. El rendimiento molar total de aldehído y alcohol fue 74-85 %. No se obtuvo selectividad con respecto al aldehído y/o al alcohol. Por tanto, se requiere una tecnología de separación adicional para aislar los metabolitos individuales. Además, los rendimientos individuales de aldehído y alcohol correspondientes son muy bajos. La Patente de Estados Unidos No.
7462470 divulga la producción de vainillina a partir de ácido vanílico usando Pycnoporus cinnabarinus CGMCC 1115. Se obtuvo un rendimiento del 80 % de vainillina sobre 2g/L de concentración de ácido vanílico. Pero la composición del medio utilizada para cultivar el organismo contenía una cantidad muy alta de fuente de nitrógeno y también un porcentaje más alto de inóculo inicial que finalmente dio células de biomasa en alta concentración. Entonces, esta alta concentración de biocatalizador convierte/biotransforma una mayor concentración de sustrato. Los procesos biocatalíticos para la fabricación de moléculas pequeñas y altamente funcionalizadas con frecuencia tienen una productividad limitada. Una razón común para esto es la presencia de productos de reacción que pueden causar efectos inhibidores o tóxicos (haciendo un mal uso de la enzima) o promover equilibrios desfavorables (dando bajas conversiones). En cada caso, el producto debe eliminarse tan pronto como se forme para superar estas limitaciones y por lo tanto aumentar la productividad del proceso biocatalítico. Se emplean técnicas ISPR, es decir, técnicas de eliminación de productos in-situ, en las que se añade una resina adsorbente en el medio de biotransformación para capturar el producto o se añade un disolvente adecuado que extrae el producto. Sin embargo, cuando se agrega una resina adsorbente en el medio de biotransformación, la separación de la resina de la biomasa es difícil y, además, dependiendo de su capacidad de unión, la cantidad de resina a agregar también es una limitación en los casos en que una gran cantidad de resina no puede ser agregado. El uso de disolventes para la captura del producto tiene su propia limitación de presentar toxicidad a las células, afectando así la eficiencia de la biotransformación. Además, en ambos casos, las células una vez tratadas con disolvente o añadidas con resina no pueden reutilizarse para biotransformaciones posteriores y, por tanto, estas técnicas no pueden utilizarse para procesos continuos. La reducción microbiana de ácidos a aldehídos presenta un problema común de reducción adicional inmediata a alcoholes debido a la toxicidad de los aldehídos en las células. Además, una alta concentración de aldehído provoca un gran decaimiento del producto en la fermentación, lo que da como resultado la disminución de la eficiencia de biotransformación. La selectividad del proceso para obtener aldehído en alta concentración y rendimiento está fuertemente influenciada por el pH de la reacción. La mayoría de las reducciones se llevan a cabo en el rango de pH de 4-6.
La invención proporciona una solución al problema de la técnica anterior mencionado anteriormente. La ventaja de esta invención es la selectividad de aldehído y/o alcohol con mayores rendimientos, bajo coste de producción debido a medios más baratos y reciclaje de la biomasa, alta concentración de producto final y alta productividad debido al sistema continuo, fácil procesamiento posterior, proceso limpio y producto ecoamigable.
Resumen de la invención
Un objeto de la presente invención es proporcionar un método para la reducción biológica de los ácidos arilcarboxílicos a sus correspondientes aldehídos y/o alcoholes con alta pureza y alto rendimiento.
Otro objeto de la invención es proporcionar un método para la reducción biológica de ácidos arilcarboxílicos a sus correspondientes aldehídos y/o alcoholes para evitar el efecto de inhibición del sustrato y el efecto de inhibición del producto final.
Otro objetivo más de la presente invención es proporcionar el uso de disolvente para la captura del producto sin envenenar las células, lo que da como resultado un aumento de la eficacia de la biotransformación.
Otro objeto de la invención es proporcionar un proceso con alcohol con mayores rendimientos, bajo coste de producción debido a medios más baratos y reciclado de la biomasa, alta concentración de producto final y alta productividad debido al sistema continuo.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar un proceso para la recuperación y reciclado de cultivo celular que hace que el proceso sea continuo y aumente la productividad.
Otro objeto más de la presente invención es proporcionar una condición de reacción suave, un procesamiento posterior fácil, un proceso limpio y un producto ecoamigable.
Por tanto, la invención proporciona un método para la reducción biológica de un ácido arilcarboxílico con la siguiente estructura:
Figure imgf000004_0001
a su correspondiente aldehido con la siguiente estructura:
Figure imgf000004_0002
o su correspondiente alcohol con la siguiente estructura:
Figure imgf000004_0003
en donde R, R1 y R2 representan cada uno independientemente H, OH, NH2 , alcoxi, alquilo o halógeno, con alta pureza y rendimiento, comprendiendo el método:
a) preparar la suspensión de esporas del cultivo Pycnoporus cinnabarinus NCIM-1181;
b) cultivar el hongo Pycnoporus cinnabarinus NCIM-1181 a partir de la suspensión de esporas en un fermentador que contiene un medio de cultivo de pH en el rango de 2 a 6 durante 48 a 96 horas para obtener gránulos celulares para la reducción biológica;
c) añadir el ácido arilcarboxílico al fermentador de la etapa (b) para obtener una concentración final de 1-3 g/ L del ácido arilcarboxílico y mantener el pH en el rango de 3-5; en donde el ácido arilcarboxílico se consume durante 50­ 90 horas para obtener un caldo de fermentación que contiene el aldehído o el alcohol;
d) filtrar el caldo de fermentación para obtener una fracción de permeado y una fracción de retenido;
e) hacer pasar la fracción de permeado a través de una columna de captura empaquetada con adsorbente hidrófobo y ajustada a un pH de 5-8, que extrae selectivamente el aldehído o alcohol obtenido en la etapa (c);
f) hacer eluir la columna de captura con un disolvente orgánico para proporcionar un disolvente de elución que comprende el aldehído o el alcohol en alta concentración; y
g) cristalizar el aldehído o alcohol de la etapa (f) y así obtener aldehído o alcohol puro.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: muestra la reducción selectiva de ácido arílico a arilaldehído, en donde R y/o R1 y/o R2 = H, OH, NH2, alcoxi, halógeno, alquilo.
Figura 2: muestra la reducción selectiva de ácido arílico a alcohol arílico, en la que R y/o R1 y/o R2 = H, OH, NH2, alcoxi, halógeno y alquilo.
Figura 3: muestra la reducción selectiva de arilaldehído a alcohol arílico en donde R y/o R1 y/o R2 = OH, NH2, OCH3 y Cl.
Figura 4: muestra una representación esquemática del proceso de la invención, en donde L significa Línea de Flujo; P significa Bomba; F para Filtro de Membrana/Filtro G1; columna de captura-C; recipiente de reacción-B; controlador PC-pH.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a un método novedoso para la reducción selectiva de ácidos arílicos a aldehído y/o alcoholes. Esta reducción es específica y selectiva para su grupo funcional carboxílico (-COOH), sin afectar a otro grupo funcional como los grupos -R (por ejemplo, -OH, -NH2, -alquilo, -alcoxi, -Br, -Cl) y su posición, número en anillo aromático.
El método de la invención emplea un hongo de pudrición blanca, Pycnoporus cinnabarinus, un organismo de la especie basidiomiceto, que crece en recipiente/columna. La presente invención también emplea extracción continua de producto selectivo sobre adsorbente hidrófobo.
El método es adecuado para la reducción selectiva de ácidos arílicos a aldehído y/o alcoholes mediante el empleo de un hongo de pudrición blanca, Pycnoporus cinnabarinus, un organismo de la especie basidiomiceto, sin afectar a otros grupos funcionales como los grupos R (por ejemplo, -OH, -NH2, - alquilo, - alcoxi, -Br, -Cl) y su posición, número en el anillo aromático. La presente invención también emplea extracción continua de producto selectivo sobre adsorbente hidrófobo con elución selectiva de aldehído y/o alcohol con disolvente natural y/o sintético.
El método de reducción biológica de los ácidos aril carboxílicos a sus correspondientes aldehídos y/o alcoholes con alta pureza y alto rendimiento comprende:
(a) preparar la suspensión de esporas del cultivo Pycnoporus cinnabarinus (NCIM-1181);
(b) cultivar el hongo Pycnoporus cinnabarinus (NCIM-1181) en un fermentador con pH 2-6 durante 48-96 horas para obtener gránulos celulares para biotransformación (reducción biológica);
(c) añadir sustrato de ácido arilcarboxílico al fermentador del paso (b) anterior para obtener la concentración final de 1-3 g/L para ácido arilcarboxílico y mantener el pH en el rango de 3-5; en donde el sustrato de ácido arilcarboxílico se consume durante 50-90 horas y se obtiene la masa de reacción o caldo de fermentación que contiene aldehído y/o producto alcohólico;
(d) filtrar esta masa de reacción o caldo de fermentación para obtener fracciones de retenido y permeado,
(e) hacer pasar la fracción de permeado a través de una columna de captura empaquetada con adsorbente hidrófobo y ajustada a un pH de 5-8, que extrae selectivamente el aldehído o alcohol obtenido en la etapa (c). Por ejemplo, el proceso puede comprender conectar la columna de captura al fermentador para la extracción selectiva de un producto de aldehído obtenido de dicho paso anterior y el fermentador circulante en la columna de captura para extraer el aldehído selectivamente, y luego se puede capturar un alcohol después de completar el proceso de biotransformación;
(f) hacer eluir la columna de captura con un disolvente orgánico para proporcionar un disolvente de elución que comprende el aldehído crudo y / o el producto alcohólico en alta concentración; y
(g) cristalizar el producto crudo para obtener un producto de aldehído y/o alcohol puro.
El proceso se puede realizar en fermentador unido con control de pH, oxígeno disuelto, sistema de membranas, y extractor de producto.
El ácido arílico usado para la biotransformación se puede obtener del grupo que consiste en ácido 4-hidroxi-3-metoxibenzoico, ácido 3-hidroxi-4-metoxibenzoico, ácido p-hidroxibenzoico, ácido gálico, ácido siríngico, ácido anísico.
Los ácidos aril carboxílicos que se reducen biológicamente a su correspondiente aldehído o alcohol en el método de la presente invención tienen la estructura que se muestra en la Figura 1. Los grupos R, R1, R2 representan cada uno independientemente H, OH, NH2 , alcoxi, alquilo o halógeno. Los grupos R, R1 y R2 pueden seleccionarse independientemente entre -OH, -NH2, -alquilo, -alcoxi, -Br, -Cl.
Cuando el proceso de la invención es un proceso para la biotransformación de ácido aril carboxílico en aldehídos y/o alcohol, el arilaldehído puede obtenerse del grupo que consiste en 4-Hidroxi-3-metoxibenzaldehído, 3-hidroxi-4-etoxibenzaldehído, p-hidroxibenzaldehído, 3,5-Dimetoxi-4-hidroxibenzaldehído, 3-Amino-5-clorobenzaldehído. El método de la invención puede ser un proceso para la reducción selectiva de ácido arílico a alcohol arílico, en donde el alcohol arílico puede obtenerse del grupo que consiste en alcohol 4-hidroxi-3-metoxibencílico, alcohol phidroxibencílico, 3-Amino-5 -alcohol clorobencílico, alcohol 3-Hidroxi-4-metoxibencílico.
El sustrato de ácido arilcarboxílico puede añadirse en su forma de sal para lograr la concentración final requerida. La biotransformación del ácido arílico en sus arilaldehídos y/o alcohol se puede llevar a cabo en forma discontinua y/o continua.
La biotransformación en un lote alimentado se puede llevar a cabo mediante la adición de dosis posteriores de sustrato con una concentración en el rango de 1-3 g/L después del consumo completo del sustrato que se agrega en el primer lote con los mismos parámetros de biotransformación.
La operación por lotes alimentada de la biotransformación de ácido arílico en aldehído arílico y/o alcohol arílico puede realizarse alimentando directamente la solución de sustrato, es decir, el ácido arílico al medio de biotransformación y el producto arílico se aísla continuamente en operación continua, mientras que la concentración de sustrato se mantiene constante en el medio de biotransformación mediante la adición gradual o gota a gota del sustrato de arilo.
La filtración se puede llevar a cabo utilizando un filtro de membrana/filtro G1/placas perforadas, con un tamaño de poro de al menos 0.22 micrones antes de la adsorción en la columna de captura.
La filtración puede realizarse para obtener un retenido que comprende células de cultivo/esporas/micelios/ gránulos, y un permeado que comprende un líquido que contiene arilaldehídos y/o alcoholes que se hace pasar a través de la columna para la adsorción.
El caudal de circulación del caldo de fermentación a través de la columna se puede ajustar de tal manera que el producto formado se adsorba completamente en la columna y se pausa la biotransformación adicional del producto. La columna de captura está empaquetada con adsorbente hidrófobo.
El adsorbente hidrófobo utilizado en la columna de captura puede ser poliestireno hidrófobo basado en divinil benceno o cualquier resina adsorbente polimérica basada en poliestireno metacrilato, se selecciona del grupo que consiste en Amberlite XAD-2, Amberlite XAD-7, XAD 16, lewatit OC 1600 u OC 1064 Tulsion ADS 600, SP 700, Relite EXA 118.
El pH de la columna de captura se ajusta a 5-8 para favorecer la unión selectiva del producto.
En la realización más preferida de la presente invención, un proceso de columna de captura para la separación del producto de las impurezas, comprende una primera elución de la columna de captura con NaHCO3 para eliminar las trazas del sustrato de ácido arilcarboxílico unido sin reaccionar y luego elución con un disolvente orgánico polar/ no polar dependiendo de la solubilidad o miscibilidad del producto.
La elución de la columna de captura se puede llevar a cabo usando un disolvente orgánico polar seleccionado del grupo que consiste en metanol, etanol, isopropanol, butanol, agua, acetona, acetato de etilo, lo más preferiblemente metanol.
El producto crudo puede obtenerse concentrando el disolvente de elución por destilación al vacío a una temperatura en el rango de 55 °C a 65 °C y luego permitiendo que el producto concentrado se enfríe gradualmente durante 6-12 horas y/o a una temperatura en el rango de 10-30 °C.
La biotransformación de ácido arílico en aldehído arílico y/o alcohol durante la etapa (c) se lleva a cabo manteniendo el pH en el rango de 3-5.
La cristalización del producto crudo puede realizarse en agua destilada o agua potable.
El rendimiento y la pureza del arilaldehído y/o alcohol pueden estar entre 84-93 % y 96-99.5 % respectivamente. Ventajas de la tecnología:
1) La presente invención implica el uso de un hongo de pudrición blanca para la reducción selectiva de ácidos arílicos a sus correspondientes aldehídos y/o alcohol con mayores rendimientos, sin la formación de subproductos u otros metabolitos.
2) La presente invención proporciona la recuperación y el reciclaje de células que dan como resultado una reacción de catalización continua en medio estéril con una adición mínima de energía y/o fuente de nutrientes.
3) La presente invención también proporciona un proceso con bajo consumo de energía, bajo coste operativo y menor requerimiento de tiempo, reciclando el sustrato dando como resultado un bajo coste de producción, lo que mejora la productividad.
4) Así la presente invención hace que el proceso sea conveniente y ecológico.
La divulgación se ilustrará ahora con ejemplos prácticos, los cuales pretenden ilustrar el funcionamiento de la divulgación. A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la técnica a la que pertenece esta descripción.
Ejemplo 1
Se raspa una masa micelial de una rama recién cultivada de Pycnoporus cinnabarinus (NCIM-1181) usando una varilla de vidrio y se agrega a 10 ml de agua estéril para hacer una suspensión de esporas con un recuento de esporas de 1-4X107/ml. Se formula 2L de medio de crecimiento que contiene 2 % de maltosa, 0.18 % de tartrato de diamonio, 0.05 % de extracto de levadura, 0.05 % de sulfato de magnesio, 0.002 % de dihidrogenofosfato de potasio, pH ajustado a 5.5 y vertido en fermentador de 5L/recipiente/columna. Se esteriliza en autoclave a 121 °C durante 20 minutos. Después de enfriar lo suficiente, se inocula el 0.1 % de la suspensión de esporas en el medio de cultivo. La incubación se realizó durante 72 horas a 37°C. La concentración de oxígeno disuelto se fijó al 30 % usando aireación y/o agitación. Después de 72 horas de período de crecimiento, se obtuvieron pequeños gránulos de un diámetro de alrededor de 2-4 mm de células de P. cinnabarinus.
Ejemplo 2
Reducción del ácido 4-hidroxi-3-metoxibenzoico a 4-Hidroxi-3-metoxibenzaldehído se disolvieron 1.5 g de ácido 4-hidroxi-3-metoxibenzoico en 10 ml de agua destilada usando 3 ml de NaOH 2 M y se añadió a las células cultivadas en el fermentador de Ejemplo 1 para llevar la concentración final de sustrato a 1.5 g/L. Después de la adición del sustrato, el pH del caldo se ajustó a 4 y la concentración de oxígeno disuelto se ajustó al 30 %, el pH se controló a 4. La transformación se llevó a cabo a 37°C. Después de 5 horas de adición de sustrato, se inició la circulación del caldo a través de la columna de captura con un caudal de 19 ml/minuto y el proceso continuó hasta que se consumió el sustrato total de ácido 4-hidroxi-3-metoxibenzoico. Después del consumo completo del sustrato, la columna se separa del recipiente de reacción y se lava con 100 ml de NaHCO30.1 M para eluir las trazas del sustrato unido sin reaccionar. Luego, el producto 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehído se eluye selectivamente con 300 ml de metanol. El producto eluido se somete a destilación a vacío a 60 °C y el residuo se deja enfriar gradualmente. Se obtienen los cristales brutos de 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehído con un 90 % de pureza que se separan por filtración de las aguas madres. Los cristales brutos se recristalizan en 15 ml de agua destilada. Los cristales formados se filtran a través de un filtro de vacío y se lavan con DW enfriado para obtener cristales blancos y brillantes de 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehído con una pureza del 99.5 % y un rendimiento del 87 %.
Ejemplo 3
Reducción del ácido p-hidroxibenzoico a p-Hidroxibenzaldehído
Se disolvieron 1.5 g de ácido 4-hidroxibenzoico en 10 ml de agua destilada usando 3.5 ml de NaOH 2 M y se añadieron a las células cultivadas en el fermentador del Ejemplo 1 para llevar la concentración final de sustrato a 1.5 g/L. Después de la adición del sustrato, el pH del caldo se ajustó a 4. Después de 5 horas de adición de sustrato, se inició la circulación del caldo a través de la columna de captura con un caudal de 21.5 ml/min. La concentración de oxígeno disuelto se estableció en 30 % y el pH se controló en 4. La transformación se llevó a cabo a 37 °C y el proceso continuó hasta que se consumió el sustrato total de ácido 4-hidroxibenzoico. Después del consumo completo del sustrato, la columna se separa del recipiente de reacción y se lava con 100 ml de NaHCO30.1 M para eluir las trazas del sustrato unido sin reaccionar. Luego, el producto 4-hidroxibenzaldehído se eluye selectivamente con 300 ml de metanol. El producto eluido se somete a destilación a vacío a 60 °C y el residuo se deja enfriar gradualmente. Se obtienen los cristales brutos de 4-hidroxibenzaldehído con un 91 % de pureza que se separan por filtración de las aguas madres. Los cristales brutos se recristalizan en 20 ml de agua destilada. Los cristales formados se filtran a través de un filtro de vacío y se lavan con DW enfriado para obtener cristales blancos y brillantes de 4-Hidroxibenzaldehído con una pureza del 98.2 % y un rendimiento del 85 %.
Ejemplo 4
Reducción del ácido 3-Amino-5-clorobenzoico a 3-Amino-5-clorobenzaldehído
Se disolvieron 1.5 g de ácido 3-amino-5-clorobenzoico en 10 ml de agua destilada usando 2 ml de NaOH 2 M y se añadieron a las células cultivadas en el fermentador del Ejemplo 1 para llevar la concentración final de sustrato a 1.5 g/L. Después de la adición del sustrato, el pH del caldo se ajustó a 4. Después de 5 horas de adición del sustrato, se inició la circulación del caldo a través de la columna de captura con un caudal de 25 ml/min. La concentración de oxígeno disuelto se estableció en 30 % y el pH se controló en 4. La transformación se llevó a cabo a 37 °C y el proceso continuó hasta que se consumió el sustrato total de ácido p-hidroxicinámico. Después del consumo completo del sustrato, la columna se separa del recipiente de reacción y se lava con 100 ml de NaHCO30.1 M para eluir las trazas del sustrato unido sin reaccionar. Luego, el producto 3-Amino-5-clorobenzaldehído se eluye selectivamente con 300 ml de metanol. El producto eluido se somete a destilación a vacío a 60 °C y el residuo se deja enfriar gradualmente. Se obtienen los cristales brutos de p-hidroxicinamaldehído con 89.5 % de pureza que se separan por filtración de las aguas madres. Los cristales brutos se recristalizan en 20 ml de agua destilada. Los cristales formados se filtran a través de un filtro de vacío y se lavan con DW enfriado para obtener cristales blancos de 3-Amino-5-clorobenzaldehído con una pureza del 98.5 % y un rendimiento del 86 %.
Ejemplo 5
Reducción de ácido 3,5-Dimetoxi-4-hidroxibenzoico a 3,5-Dimetoxi-4-hidroxibenzaldehído
Se disolvieron 1.5 g de ácido 3,5-Dimetoxi-4-hidroxibenzoico en 15 ml de agua destilada usando 3.2 ml de NaOH 2M y se añadieron a las células cultivadas en el fermentador del Ejemplo 1 para llevar la concentración final de sustrato a 1.5 g/L. Después de la adición del sustrato, el pH del caldo se ajustó a 4. Después de 5 horas de adición de sustrato, se inició la circulación del caldo a través de la columna de captura con un caudal de 20 ml/minuto. La concentración de oxígeno disuelto se estableció en 30 % y el pH se controló en 4. La transformación se llevó a cabo a 37 °C y el proceso continuó hasta que se consumió el sustrato total de ácido 3,5-Dimetoxi-4-hidroxibenzoico. Después del consumo completo del sustrato, la columna se separa del recipiente de reacción y se lava con 100 ml de NaHCO30.1 M para eluir las trazas del sustrato unido sin reaccionar. A continuación, el producto 3,5-Dimetoxi-4-hidroxibenzaldehído se eluye selectivamente con 300 ml de metanol. El producto eluido se somete a destilación al vacío a 65 °C y el residuo se deja enfriar gradualmente. Se obtienen los cristales brutos de 3,5-Dimetoxi-4-hidroxibenzaldehído con un 86.56 % de pureza que se separan por filtración de las aguas madres. Los cristales brutos se recristalizan en 30 ml de agua destilada. Los cristales formados se filtran a través de un filtro de vacío y se lavan con DW enfriado para obtener cristales blancos de 3,5-Dimetoxi-4-hidroxibenzaldehído con una pureza del 96.54 % y un rendimiento del 84.96 %.
Ejemplo 6
Reducción del ácido 4-hidroxi-3-metoxibenzoico a alcohol 4-hidroxi-3-metoxibencílico
Las células de P. cinnabarinus se cultivan en fermentador como en el Ejemplo 1. Se disolvieron 1.5 g de sustrato ácido 4-hidroxi-3-metoxibenzoico en 10 ml de agua destilada y 3 ml de NaOH 2 M y se añadieron a las células crecidas del fermentador para obtener la concentración final de sustrato a 1.5 g/L. Después de la adición del sustrato, el pH se ajusta a 4 y la concentración de oxígeno disuelto se fija al 30 %. La transformación se llevó a cabo a 37 °C y el proceso continuó hasta que el sustrato total de ácido p-hidroxi cinámico se consumió y se mantuvo durante la biotransformación. La reacción continúa hasta la conversión completa del sustrato ácido y el aldehído intermedio y cuando la concentración de alcohol ha alcanzado su nivel más alto. Luego se pasa caldo de biotransformación rico en producto, alcohol 4-hidroxi-3-metoxibencílico por la columna de captura empaquetada con resina hidrófoba con condición controlada de pH con 15 ml/min de caudal. Después de pasar el caldo total de la columna, casi el 98 % del alcohol formado se adsorbe selectivamente en la columna sin otras impurezas. La columna se lavó con 100 ml de NaHCO30.1 M para eluir las trazas de sustrato unido sin reaccionar. Luego se eluye selectivamente alcohol 4-hidroxi-3-metoxibencílico con 300 ml de metanol. El producto eluido se somete a destilación al vacío a 50 °C y el residuo se deja enfriar gradualmente. Se obtienen los cristales brutos de alcohol 4-hidroxi-3-metoxibencílico con un 90 % de pureza que se separan por filtración de las aguas madres. Los cristales brutos se recristalizan en 25 ml de agua destilada. Los cristales formados se filtran a través de un filtro de vacío y se lavan con DW enfriado para obtener cristales blancos de alcohol 4-hidroxi-3-metoxibencílico con una pureza del 99 % y un rendimiento del 92.5 %.
Ejemplo 7
Reducción del ácido p-hidroxibenzoico a alcohol p-hidroxibencílico
Las células de P. cinnabarinus se cultivan en un fermentador como en el Ejemplo 1. Se disolvieron 1.5 g de sustrato ácido p-hidroxibenzoico en 10 ml de agua destilada y 3.5 ml de NaOH 2 M y se añadieron a las células cultivadas del fermentador para obtener la concentración final de sustrato a 1.5 g/L. Después de la adición del sustrato, el pH se ajusta a 4 y la concentración de oxígeno disuelto se fija al 30 %. La transformación se llevó a cabo a 37 °C y el proceso continuó hasta que el sustrato total de ácido p-hidroxibenzoico se consumió y se mantuvo durante toda la biotransformación. La reacción continúa hasta la conversión completa del sustrato ácido y el aldehído intermedio y cuando la concentración de alcohol ha alcanzado su nivel más alto. Luego se pasa caldo de biotransformación rico en producto, alcohol p-hidroxibencílico por la columna de captura empaquetada con resina hidrófoba con condición controlada de pH con 20 ml/min de caudal. Después de pasar el caldo total de la columna, casi el 95.5 % del alcohol formado se adsorbe en la columna de forma selectiva sin otras impurezas. La columna se lavó con 100 ml de NaHCO3 0.1 M para eluir las trazas de sustrato unido sin reaccionar. Luego se eluye selectivamente alcohol phidroxibencílico con 300 ml de metanol. El producto eluido se somete a destilación al vacío a 50 °C y el residuo se deja enfriar gradualmente. Se obtienen los cristales brutos de alcohol p-hidroxibencílico con un 92.3 % de pureza que se separan por filtración de las aguas madres. Los cristales brutos se recristalizan en 30 ml de agua destilada. Los cristales formados se filtran a través de un filtro de vacío y se lavan con DW enfriado para obtener cristales blancos de alcohol p-hidroxibencílico con un 99 % de pureza y un rendimiento del 92.5 %.
Ejemplo 8
Reducción de ácido arílico a alcohol arílico
A) Reducción del ácido 3-Amino-5-clorobenzoico a alcohol 3-Amino-5-clorobencílico
Las células de P. cinnabarinus se cultivan en fermentador como en el Ejemplo 1. Se disolvieron 1.5 g de sustrato ácido 3-Amino-5-clorobenzoico en 10 ml de agua destilada y 2.5 ml de NaOH 2 M y se añadieron a las células crecidas del fermentador para obtener la concentración final de sustrato a 1.5 g/L. Después de la adición del sustrato, el pH se ajusta a 4 y la concentración de oxígeno disuelto se fija al 30 %. La transformación se llevó a cabo a 37 °C y el proceso continuó hasta que el sustrato total ácido 3-Amino-5-clorobenzoico se consumió y se mantuvo durante toda la biotransformación. La reacción continúa hasta la conversión completa del sustrato ácido y el aldehído intermedio y cuando la concentración de alcohol ha alcanzado su nivel más alto. Luego se pasa caldo de biotransformación rico en producto, alcohol 3-Amino-5-clorobencílico por la columna de captura empaquetada con resina hidrófoba con condición controlada de pH con 25 ml/min de caudal. Después de pasar el caldo total de la columna, casi el 98 % del alcohol formado se adsorbe selectivamente en la columna sin otras impurezas. La columna se lavó con 100 ml de NaHCO30.1 M para eluir las trazas de sustrato unido sin reaccionar. Luego se eluye selectivamente alcohol p-hidroxicinamílico con 300 ml de metanol. El producto eluido se somete a destilación a vacío a 60 °C y el residuo se deja enfriar gradualmente. Se obtienen los cristales brutos de alcohol p-hidroxicinamílico con 89.2 % de pureza que se separan por filtración de las aguas madres. Los cristales brutos se recristalizan en 30 ml de agua destilada. Los cristales formados se filtran a través de un filtro de vacío y se lavan con DW frío para obtener cristales blancos de alcohol p-hidroxicinamílico con una pureza del 96.3 % y un rendimiento del 88.8 %.
Ejemplo 9
B) Reducción de 4-Hidroxi-3-metoxibenzaldehído a alcohol 4-Hidroxi-3-metoxibencílico
Las células de P. cinnabarinus se cultivan en fermentador como en el Ejemplo 1. Se disolvieron 1.5 g de sustrato 4-Hidroxi-3-metoxibenzaldehído en 5ml de agua destilada y 2.5 ml de NaOH 2 M y se añade a las células crecidas del fermentador para llevar la concentración final de sustrato a 1.5 g/L. Después de la adición del sustrato, el pH se ajusta a 4 y la concentración de oxígeno disuelto se fija al 30 %. La transformación se llevó a cabo a 37 °C y el proceso continuó hasta que el sustrato total 4-Hidroxi-3-metoxibenzaldehído se consumió y se mantuvo durante toda la biotransformación. La reacción continúa hasta la conversión completa del aldehído. Luego se pasa caldo de biotransformación rico en producto, alcohol 4-Hidroxi-3-metoxibencílico por la columna de captura empaquetada con resina hidrófoba con condición controlada de pH con 20 ml/min de caudal. Después de pasar el caldo total de la columna, casi el 98 % del alcohol formado se adsorbe selectivamente en la columna sin otras impurezas. La columna se lavó con 100 ml de NaHCO30.1 M para eluir las trazas de sustrato unido sin reaccionar. Luego se eluye selectivamente alcohol 4-Hidroxi-3-metoxibencílico con 300 ml de metanol. El producto eluido se somete a destilación a vacío a 60 °C y el residuo se deja enfriar gradualmente. Se obtienen los cristales brutos de alcohol phidroxicinamílico con un 92 % de pureza que se separan por filtración de las aguas madres. Los cristales brutos se recristalizan en 20 ml de agua destilada. Los cristales formados se filtran a través de un filtro de vacío y se lavan con DW frío para obtener cristales blancos de alcohol p-hidroxicinamílico con una pureza del 99 % y un rendimiento del 91 %.
Ejemplo 10
Reducción de 4-Hidroxibenzaldehído a alcohol 4-Hidroxibencílico
Las células de P. cinnabarinus se cultivan en fermentador como en el Ejemplo 1. Se disolvieron 1.5 g de sustrato 4-Hidroxibenzaldehído en 5ml de agua destilada y 2.5 ml de NaOH 2 M y se añadieron a las células cultivadas del fermentador para obtener la concentración final de sustrato hasta 1.5 g/L. Después de la adición del sustrato, el pH se ajusta a 4 y la concentración de oxígeno disuelto se fija al 30 %. La transformación se llevó a cabo a 37 °C y el proceso continuó hasta que el sustrato total 4-Hidroxibenzaldehído se consumió y se mantuvo durante la biotransformación. La reacción se continúa hasta la conversión completa del aldehído. Luego se hace pasar caldo de biotransformación rico en producto, alcohol 4-Hidroxibencílico a través de la columna de captura empaquetada con resina hidrófoba con condiciones controladas de pH con 20 ml/min de caudal. Después de pasar el caldo total de la columna, casi el 95 % del alcohol formado se adsorbe en la columna de forma selectiva sin otras impurezas. La columna se lavó con 100 ml de NaHCO30.1 M para eluir las trazas de sustrato unido sin reaccionar. Luego se eluye selectivamente alcohol 4-Hidroxibencílico con 300 ml de metanol. El producto eluido se somete a destilación a vacío a 60 °C y el residuo se deja enfriar gradualmente. Se obtienen los cristales brutos de alcohol p-hidroxicinamílico con un 89 % de pureza que se separan por filtración de las aguas madres. Los cristales brutos se recristalizan en 20 ml de agua destilada. Los cristales formados se filtran a través de un filtro de vacío y se lavan con DW enfriado para obtener cristales blancos de alcohol 4-Hidroxibencílico con una pureza del 98 % y un rendimiento del 92.56 %.
Ejemplo 11
Reducción de 3-Hidroxi-4-metoxibenzaldehído a alcohol 3-Hidroxi-4-metoxibencílico
Las células de P. cinnabarinus se cultivan en fermentador como en el Ejemplo 1. Se disolvieron 1.5 g de sustrato 3-Hidroxi-4-metoxibenzaldehído en 10 ml de agua destilada y 3 ml de NaOH 2 M y se añade a las células crecidas del fermentador para llevar la concentración final de sustrato a 1.5 g/L. Después de la adición del sustrato, el pH se ajusta a 4 y la concentración de oxígeno disuelto se fija al 30 %. La transformación se llevó a cabo a 37 °C y el proceso continuó hasta que el sustrato total 3-Hidroxi-4-metoxibenzaldehído se consumió y se mantuvo durante la biotransformación. La reacción continúa hasta la conversión completa del aldehído. Luego se pasa caldo de biotransformación rico en producto, alcohol 3-Hidroxi-4-metoxibencílico por la columna de captura empaquetada con resina hidrófoba con condición controlada de pH con 20 ml/minuto de caudal. Después de pasar el caldo total de la columna, casi el 93 % del alcohol formado se adsorbe en la columna de forma selectiva sin otras impurezas. La columna se lavó con 100 ml de NaHCO30.1 M para eluir las trazas de sustrato unido sin reaccionar. Luego se eluye selectivamente alcohol 4-hidroxibencílico con 300 ml de metanol. El producto eluido se somete a destilación a vacío a 60 °C y el residuo se deja enfriar gradualmente. Se obtienen los cristales brutos de alcohol 3-Hidroxi-4-metoxibencílico con un 91.45 % de pureza que se separan por filtración de las aguas madres. Los cristales brutos se recristalizan en 20 ml de agua destilada. Los cristales formados se filtran a través de un filtro de vacío y se lavan con DW enfriado para obtener cristales blancos de alcohol 3-Hidroxi-4-metoxibencílico con una pureza del 97.45 % y un rendimiento del 93.25 %.
Ejemplo 12
Reducción del ácido 4-hidroxi-3-metoxibenzoico a 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehído en forma de alimentación por lotes
Se cultivaron células de P. cinnabarinus en fermentador como en el Ejemplo 2. El producto formado se extrajo utilizando la columna de captura. De nuevo, se añade una segunda dosis de sustrato ácido 4-hidroxi-3-metoxibenzoico a una concentración de 1.5 g/L a las células en el fermentador y la reacción continúa en las mismas condiciones. El producto se adsorbe en la columna de captura de adsorbente y nuevamente se agrega sustrato fresco en el fermentador. La reacción continúa hasta el agotamiento completo del sustrato. Después del agotamiento completo del sustrato, la columna se separó del recipiente y se sometió a elución con 100 ml de NaHCO30.1 M para eluir las trazas de sustrato unido sin reaccionar. Luego, el producto 4-Hidroxibenzaldehído se eluye selectivamente con 300 ml de metanol. El producto eluido se somete a destilación al vacío a 60 °C y se deja enfriar el residuo. Se obtienen los cristales brutos de 4-hidroxibenzaldehído con un 89 % de pureza que se separan por filtración de las aguas madres. Los cristales brutos se recristalizan en 20 ml de agua destilada. Los cristales formados se filtran a través de un filtro de vacío y se lavan con DW enfriado para obtener cristales blancos y brillantes de 4-hidroxibenzaldehído con una pureza del 99 % y un rendimiento del 88.52 %.
Ejemplo 13
La reducción del ácido 4-hidroxi-3-metoxibenzoico a alcohol 4-hidroxi-3-metoxibencílico en forma de alimentación por lotes
La reducción se realiza utilizando células de P. cinnabarinus cultivadas en fermentador como en el Ejemplo 2. El producto formado se extrae utilizando la columna de captura. De nuevo, se añade una segunda dosis de sustrato ácido 4-hidroxi-3-metoxibenzoico a una concentración de 1.5 g/L a las células en el fermentador y la reacción continúa en las mismas condiciones. La reacción continúa hasta el agotamiento completo del sustrato y del metabolito intermedio aldehído. Después de completar el consumo de sustrato, la columna se conecta al recipiente de reacción y la adsorción tiene lugar con condiciones controladas de pH y 20 ml/min de caudal. Después del proceso de adsorción, aproximadamente el 95 % del producto formado se unió a la columna. Después de la adsorción, la columna se separó del recipiente y se sometió a elución con 100 ml de NaHCO30.1M para eluir las trazas de sustrato unido sin reaccionar. A continuación, el producto 4-hidroxi-3-metoxi bencil alcohol se eluye selectivamente con 300 ml de metanol. El producto eluido se somete a destilación al vacío a 60 °C y se deja enfriar el residuo. Se obtienen los cristales brutos de 4-hidroxibenzaldehído con un 92 % de pureza que se separan por filtración de las aguas madres. Los cristales brutos se recristalizan en 20 ml de agua destilada. Los cristales formados se filtran a través de un filtro de vacío y se lavan con DW enfriado para obtener cristales blancos de alcohol 4-hidroxi-3-metoxibencílico con una pureza del 98.5 % y un rendimiento del 92.8 %.
Ejemplo 14
Reducción de 4-Hidroxi-3-metoxibenzaldehído a alcohol 4-Hidroxi-3-metoxibencílico en alimentación por lotes La reducción del ácido arílico 4-Hidroxi-3-metoxibenzaldehído a alcohol 4-hidroxi-3-metoxibencílico se realiza utilizando células de P. cinnabarinus cultivadas en fermentador como en el Ejemplo 2. El producto formado se extrae utilizando la columna de captura. De nuevo, se añade una segunda dosis de sustrato 4-Hidroxi-3-metoxibenzaldehído a una concentración de 1.5 g/L a las células en el fermentador y la reacción continúa en las mismas condiciones. La reacción continúa hasta el agotamiento completo del sustrato y del metabolito intermedio un aldehído. Después de completar el consumo de sustrato, la columna se conecta al recipiente de reacción y la adsorción tiene lugar con condiciones controladas de pH y 20 ml/minuto de caudal. Después del proceso de adsorción, aproximadamente el 97 % del producto formado se unió a la columna. Después de la adsorción, la columna se separó del recipiente y se sometió a elución con 100 ml de NaHCO3 0.1 M para eluir las trazas de sustrato unido sin reaccionar. A continuación, el producto 4-hidroxi-3-metoxibencil alcohol se eluye selectivamente con 300 ml de metanol. El producto eluido se somete a destilación al vacío a 60 °C y se deja enfriar el residuo. Se obtienen los cristales brutos de alcohol 4-Hidroxi-3-metoxibencílico con un 89 % de pureza que se separan por filtración de las aguas madres. Los cristales brutos se recristalizan en 20 ml de agua destilada. Los cristales formados se filtran a través de un filtro de vacío y se lavan con DW enfriado para obtener cristales blancos de alcohol 4-hidroxi-3-metoxibencílico con una pureza del 97 % y un rendimiento del 91.18 %.
Ejemplo 15
Proceso continuo para la reducción del ácido 4-hidroxi-3-metoxibenzoico a 4-hidroxi-3-metoxi benzaldehído
Se cultivaron células de P. cinnabarinus en fermentador como en el Ejemplo 1. Ácido 4-hidroxi-3-metoxibenzoico a una concentración de 1.5 g/L, glucosa 0.1 g/L y extracto de levadura 0.01 g/L. (Fermentador) se añadió continuamente usando una bomba a través de un filtro de membrana al fermentador y la reacción continuó como en el ejemplo 2. Se unieron cuatro columnas adsorbentes en paralelo. El producto se adsorbe en la columna de captura. Después de completar la capacidad de la primera columna, el proceso de adsorción cambia a la segunda columna. La primera columna se separó del recipiente y se sometió a elución con 100 ml de NaHCO30.1 M para eluir las trazas de sustrato unido sin reaccionar. Luego, el producto 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehído se eluye selectivamente con 300 ml de etanol natural. El producto eluido se somete a destilación al vacío a 60 °C y se deja enfriar el residuo. Se obtienen los cristales brutos de 4-Hidroxi-3-metoxibenzaldehído con un 89 % de pureza que se separan por filtración de las aguas madres. Los cristales brutos se recristalizan en 20 ml de agua destilada. Los cristales formados se filtran a través de un filtro de vacío y se lavan con DW enfriado para obtener cristales blancos y brillantes de 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehído con 99 % de pureza. En total, se recogieron 19.1 g de 4-hidroxi-3-metoxi benzaldehído después de 15 días.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un método para la reducción biológica de un ácido arilcarboxílico con la siguiente estructura:
Figure imgf000012_0001
a su correspondiente aldehído con la siguiente estructura:
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o su correspondiente alcohol con la siguiente estructura:
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en donde R, R1 y R2 representan cada uno independientemente H, OH, NH2 , alcoxi, alquilo o halógeno,
con alta pureza y rendimiento, comprendiendo el método:
a) preparar la suspensión de esporas del cultivo Pycnoporus cinnabarinus NCIM-1181;
b) cultivar el hongo Pycnoporus cinnabarinus NCIM-1181 de la suspensión de esporas en un fermentador que contiene un medio de cultivo de pH en el rango de 2-6 durante 48-96 horas para obtener gránulos celulares para reducción biológica;
c) añadir el ácido arilcarboxílico al fermentador del paso (b) para obtener una concentración final de 1-3 g/L del ácido arilcarboxílico y mantener el pH en el rango de 3-5; en donde el ácido arilcarboxílico se consume durante 50-90 horas para obtener un caldo de fermentación que contiene el aldehído o el alcohol;
d) filtrar el caldo de fermentación para obtener una fracción de permeado y una fracción de retenido;
e) pasar la fracción de permeado a través de una columna de captura empaquetada con adsorbente hidrófobo y ajustada a un pH de 5-8, que extrae selectivamente el aldehído o alcohol obtenido en la etapa (c);
f) hacer eluir la columna de captura con un disolvente orgánico para proporcionar un disolvente de elución que comprende el aldehído o el alcohol en alta concentración; y
g) cristalizar el aldehído o alcohol de la etapa (f) y así obtener aldehído o alcohol puro.
2. El método como se reivindica en la reivindicación 1, en donde
(a) el ácido arilcarboxílico se selecciona de ácido 4-hidroxi-3-metoxibenzoico, ácido 3-hidroxi-4-metoxibenzoico, ácido p-hidroxibenzoico, ácido 3-amino-5-clorobenzoico y ácido 3,5-dimetoxi-4-hidroxibenzoico;
(b) el aldehído se selecciona de 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehído, 3-hidroxi-4-etoxibenzaldehído, phidroxibenzaldehído, 3,5-dimetoxi-4-hidroxibenzaldehído y 3-amino-5-clorobenzaldehído; y/o
(c) el alcohol se selecciona de alcohol 4-hidroxi-3-metoxibencílico, alcohol p-hidroxibencílico, alcohol 3-amino-5-clorobencílico y alcohol 3-hidroxi-4-metoxibencílico.
3. El método como se reivindica en la reivindicación 1, en donde el ácido arilcarboxílico se añade en su forma de sal.
4. El método como se reivindica en la reivindicación 1, en donde la reducción biológica se lleva a cabo en forma de alimentación por lotes o continua.
5. El método como se reivindica en la reivindicación 4, en donde en el modo de alimentación por lotes, el ácido arilcarboxílico se añade en lotes a un volumen de lote preseleccionado y una frecuencia de adición de lote durante el tiempo total de alimentación.
6. El método reivindicado en la reivindicación 5, en donde la frecuencia de adición de lotes es un lote cada 24-30 horas.
7. El método como se reivindica en la reivindicación 1, en donde la filtración se lleva a cabo utilizando un filtro de membrana o una placa perforada que tiene un tamaño de poro de al menos 0.22 micrómetros.
8. El método como se reivindica en la reivindicación 1, en donde la fracción retenida comprende células de cultivo/esporas/micelios/gránulos, y la fracción permeada comprende un líquido que contiene aldehído o alcohol.
9. El método como se reivindica en la reivindicación 1, en donde el adsorbente hidrófobo usado en la columna de captura es una resina de poliestireno divinilbenceno hidrófobo o una resina adsorbente polimérica basada en metacrilato de poliestireno.
10. El método como se reivindica en la reivindicación 1, en donde la primera elución se realiza con NaHCO3 y luego con un disolvente orgánico polar/no polar dependiendo de la solubilidad o miscibilidad del aldehído o alcohol.
11. El método como se reivindica en la reivindicación 10, en donde el disolvente orgánico polar se selecciona del grupo que consiste en metanol, etanol, isopropanol, butanol, agua, acetona, acetato de etilo, preferiblemente metanol.
12. El método como se reivindica en la reivindicación 1, en donde:
(a) antes del paso g) el disolvente de elución del paso f) se concentra por destilación al vacío a una temperatura de 60 °C y luego el producto concentrado resultante se deja enfriar gradualmente durante 6-12 horas a una temperatura en el rango de 10-30 °C; o
(b) la cristalización se realiza en agua destilada o agua potable.
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