ES2860354A1

ES2860354A1 - Seleccion de espermatozoides capacitados

Info

Publication number: ES2860354A1
Application number: ES202030263A
Authority: ES
Inventors: Parra Carmen Matas; Luis Alberto Vieira; Aguirregomezcorta Jon Romero
Original assignee: Euskal Herriko Unibertsitatea; Universidad de Murcia
Current assignee: Euskal Herriko Unibertsitatea; Universidad de Murcia
Priority date: 2020-04-01
Filing date: 2020-04-01
Publication date: 2021-10-04
Also published as: WO2021198547A1

Abstract

Selección de espermatozoides capacitados. Se describe un procedimiento de selección espermática, de análisis espermático útil en las técnicas de fecundación in vitro. En particular, se describe un dispositivo para la selección de espermatozoides, así como el procedimiento de selección de espermatozoides o de fecundación in vitro que comprende el uso de dicho dispositivo.

Description

DESCRIPCI N

SELECCIÓN DE ESPERMATOZOIDES CAPACITADOS

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se encuadra en el campo de la reproducción asistida de mamíferos, incluida la especie humana y, en concreto, en las técnicas de selección espermática, de análisis espermático y en las técnicas de fecundación in vitro. Más en particular, la presente invención describe un dispositivo para la selección de espermatozoides, así como el procedimiento de selección de espermatozoides y de técnicas de fecundación in vitro que comprenden el uso de dicho dispositivo.

ESTADO DE LA TÉCNICA

En condiciones in vivo, los espermatozoides deben superar una serie de obstáculos en el aparato genital femenino, de modo que de entre los millones de espermatozoides que son eyaculados en la vagina, el número que llega al oviducto o trompa de Falopio está en el rango de decenas a cientos. Curiosamente, este bajo número de espermatozoides es suficiente para encontrar y fecundar al ovocito in vivo, mientras que, para que una fecundación asistida sea exitosa, se requieren, en muchas ocasiones, varios miles. Esta discrepancia podría explicarse por la presencia de diferentes poblaciones de espermatozoides dentro del eyaculado que varían en madurez o calidad intrínseca. En este sentido, se ha demostrado que solo una fracción de espermatozoides del eyaculado es capaz de navegar por el tracto genital femenino para fecundar el ovocito. Por lo tanto, hay una fuerte presión de selección que promueve el movimiento de una pequeña subpoblación de espermatozoides de calidad óptima hacia el lugar de fecundación (oviducto o trompa de Falopio).

Los espermatozoides, una vez eyaculados y en el tracto genital femenino, alcanzan la madurez a través de un proceso conocido como capacitación, el cual les confiere la capacidad de fecundar. Sin embargo, este proceso solo tiene lugar aproximadamente en el 10% de los espermatozoides eyaculados. Se ha observado también que esta fracción espermática tiene la capacidad de seguir señales de migración hacia el ovocito a través del oviducto [Perez-Cerezales, et al., (2015). Asian J Androl 17(4), 628-32]. Asimismo, dentro de los diferentes mecanismos descritos para guiar a los espermatozoides, dos de ellos, termotaxis y quimiotaxis, actúan solo sobre espermatozoides capacitados. La termotaxis es el movimiento dirigido de las células a lo largo de un gradiente de temperatura, como guía a largo plazo en el oviducto [Bahat, A. et al., (2003) Nat Med 9(2), 149-50], mientras que la quimiotaxis es el movimiento de las células hacia un gradiente de concentración, como guía a corto plazo, mecanismo que actúa cerca del ovocito dentro de la ampolla del oviducto, donde tiene lugar la fecundación [Eisenbach, M. et al.,(2006) Nat Rev Mol Cell Biol 7(4), 276-85]. Por lo tanto, ambos fenómenos, termotaxis y quimiotaxis, pueden ser vistos como mecanismos para seleccionar espermatozoides capacitados y, por ende, óptimos para fecundar al ovocito.

Diferentes estudios han demostrado que los espermatozoides humanos se acumulaban in vitro en el líquido folicular y que hay una notable correlación entre esta acumulación in vitro y la fecundación de los ovocitos, por lo que la quimiotaxis hacia el líquido folicular parece estar altamente correlacionada con la posibilidad de fecundar al ovocito. Experimentos posteriores han confirmado que esta acumulación es, de hecho, consecuencia de la quimiotaxis y que este fenómeno se producía tanto en especies de fecundación externa (especies marinas), como de fecundación interna (mamíferos). En este sentido, el fluido presente en el oviducto, denominado fluido oviductal (FO), también es un quimioatrayente (sustancia que produce un proceso de quimiotaxis) y es posible que, a medida que los espermatozoides se acercan al sitio de fecundación, perciban un gradiente de quimioatrayente que se origina en las células del cúmulus del ovocito y que los guíe hacia él.

Además, recientemente se ha comenzado a considerar las vesículas secretadas por las células como una nueva clase de factores de comunicación intercelular con roles importantes en diferentes procesos fisiológicos. Dentro de este tipo de vesículas se encuentran los exosomas, los cuales transportan materiales bioactivos que incluyen proteínas y microARNs en diferentes fluidos corporales, siendo estos últimos, moléculas de ARN no codificantes que regulan la expresión génica durante la diferenciación celular y el desarrollo de los tejidos. Se demostró inicialmente que dichas vesículas extracelulares se encontraban presentes en el FO de ratón, denominándose oviductosomas. Posteriormente la presencia de estos oviductosomas se ha demostrado en diferentes especies, como en la especie bovina, en la cual se ha comprobado que su adición a los medios de cultivo mejora el desarrollo y la calidad de los embriones producidos [Lopera-Vasquez, R. et al, (2017) Reproduction 153(4), 461-470]. También se ha demostrado la presencia de estas vesículas extracelulares en el FO humano, conteniendo diferentes tipos de microARNs no codificantes [Canovas, S. et al, (2017a) Human Reproduction 32, 111-111].

Por otro lado, se ha observado que los espermatozoides que llegan al oviducto (istmo y ampolla) presentan una mayor integridad del ADN. Sin embargo, todavía se desconoce el proceso de selección, el mecanismo involucrado y las características que identifican a esta fracción óptima de espermatozoides. En efecto, la falta de un método eficaz de selección de espermatozoides in vitro para uso en las técnicas de reproducción asistida podría ser una de las razones adicionales de las bajas tasas de gestación y nacimientos logradas de esta manera.

Por otro lado, dentro del término “fecundación asistida” se incluyen diferentes técnicas, entre las que se encuentran la inseminación artificial (uterina), la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) y la fecundación in vitro (FIV).

En la actualidad, las clínicas de reproducción asistida se han inclinado a utilizar de forma casi exclusiva, la ICSI, aunque el problema de fertilidad no se deba al factor masculino. En este procedimiento (ICSI), es el propio técnico el que selecciona y decide el espermatozoide que va a microinyectar, por lo que los procesos fisiológicos que debe experimentar un espermatozoide, como son el reconocimiento de gametos, la reacción acrosómica, la penetración de la zona pelúcida y la fusión de membranas, son obviados. Consecuencia de ello, se podría estar utilizando un espermatozoide con una alteración no visible al microscopio, como es el daño del ADN, que haría fracasar todo el proceso. Además, en el caso de que la gestación llegue a término, dependiendo del tipo de alteración en el ADN que pudiera presentar el espermatozoide, podría llegar a afectar a la salud del niño/a o del individuo adulto procedente de dicha ICSI.

Por lo tanto, el desarrollo de un procedimiento de selección de espermatozoides in vitro que excluya efectivamente a los espermatozoides con ADN dañado y que seleccione de manera efectiva preferentemente aquellos espermatozoides que sean capaces de fecundar un ovocito, es uno de los principales desafíos actuales de las técnicas de reproducción asistida, especialmente de la ICSI.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Un primer aspecto de la presente invención se refiere a un dispositivo para seleccionar espermatozoides que comprende:

- al menos un primer compartimento hueco (1), con una apertura (A1) y con una altura (H1);

- al menos un segundo compartimento hueco (2) con una apertura (A2) y con una altura (H2);

- un conducto (3) que se encuentra entre ambos compartimentos huecos (1) y (2), de longitud (L3) perpendicular a la altura (H1, H2), que los comunica a una altura (T3) medida desde la apertura (A1, A2) y que es menor que la altura (H1, H2);

- tapones (4), en igual número al número de compartimentos huecos (1, 2), configurados para ser introducidos en la apertura (A1, A2) dentro del compartimento hueco (1,2) hasta una altura (T1) o (T2), en donde la altura (T1) y (T2) es menor que la altura (H1) y (H2) respectivamente y que la altura (T3), medidas dichas alturas desde la apertura (A1, A2); de manera que cuando todos los tapones (4) cierran todos los compartimentos huecos (1, 2), el dispositivo queda cerrado herméticamente.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de dicho dispositivo de la invención para la selección in vitro de espermatozoides o para técnicas de fecundación in vitro.

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a un procedimiento de selección de espermatozoides in vitro caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

(i) proporcionar el dispositivo descrito en el primer aspecto de la invención;

(ii) cerrar herméticamente el primer compartimento hueco (1) y el al menos segundo compartimento hueco (2) con los tapones (4);

(iii) abrir el primer compartimento hueco (1), añadir un medio de capacitación (C) que comprende de 0,1% a 2% v/v de fluido folicular en dicho compartimento hueco (1) hasta una altura (H1-T1) y, volver a cerrarlo con un tapón (4);

(iv) abrir el al menos un segundo compartimento hueco (2), añadir medio de capacitación (C) que comprende espermatozoides en dicho al menos un segundo compartimento hueco (2) hasta una altura (H2-T2) y, volver a cerrarlo con un tapón (4);

(v) incubar el dispositivo;

(vi) destapar el primer compartimento hueco (1); y recuperar el medio de dicho primer compartimento hueco (1).

Finalmente, otro aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento de fecundación in vitro caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

(i) proporcionar el dispositivo descrito en el primer aspecto de la invención;

(v) incubar el dispositivo;

(vi) destapar el primer compartimento hueco (1); y depositar un ovocito y cerrar dicho primer compartimento hueco (1) con un tapón (4) para proceder a una fecundación in vitro incubando el dispositivo en condiciones adecuadas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

FIGURA 1. La figura 1A es una representación en alzado de una realización particular del dispositivo de la invención en el que se pueden distinguir dos compartimentos huecos (1) y (2) de aperturas (A1) y (A2) respectivamente. La figura 1B es una vista superior de dicha realización particular en la que se ve las aperturas (A1, A2) de cada uno de los dos compartimentos huecos (1, 2), siendo los diámetros de cada una de dichas aperturas (D1) y (D2) respectivamente y el conducto (3) que une dichos compartimentos huecos (1,2).

FIGURA 2. La figura 2A muestra una representación en alzado de una realización particular de un tapón (4) del dispositivo de la invención en el que se puede distinguir una parte (6) externa con un reborde (B) configurado para quedar en el exterior de los compartimentos huecos (1, 2), no mostrados, cuando el tapón (4) cierra herméticamente dichos compartimentos (1, 2); una parte (5) interna con una junta tórica (J5) que permite el cierre hermético de los compartimentos (1, 2) con dicho tapón (4). La figura 2B muestra una vista lateral de dicha realización particular del tapón (4) en el que se puede apreciar la altura (E6) y el reborde (B) de la parte (6) externa, así como la altura (T1, T2) de la parte (5) interior del tapón (4) con una junta tórica (J5).

FIGURA 3. La figura 3A muestra una representación en alzado, y la figura 3B muestra una vista superior, de una realización particular del dispositivo de la invención en la que se pueden distinguir dos compartimentos huecos (1) y (2), cerrados con tapones (4), con una parte (6) exterior de diámetro D6 y un conducto (3) que comunica ambos compartimentos huecos (1, 2).

FIGURA 4. La figura 4A muestra un corte transversal de una realización particular del dispositivo de la invención con los compartimentos huecos (1, 2) abiertos, mostrando la altura (H1, H2) de dichos compartimentos (1, 2) y el conducto (3) que los comunica posicionado a una altura T3. La figura 4B muestra un corte transversal de dicha realización particular del dispositivo en la que los compartimentos (1, 2) se encuentran cerrados por tapones (4) que se introducen hasta una altura (T1, T2) medida desde la apertura (A1, A2), definiendo un volumen de altura (H1-T1) o (H2-T2) dentro de cada compartimento hueco (1,2).

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Así, el dispositivo de la invención está adaptado para contener medio de capacitación adecuado para mantener la motilidad de los espermatozoides de mamíferos, incluyendo la de espermatozoides humanos. En una realización dicho dispositivo es estéril o aséptico, preferentemente de uso desechable. Preferentemente el dispositivo está fabricado de un material biocompatible que no sea citotóxico de acuerdo con los estándares establecidos en el campo de la técnica de los métodos de fecundación in vitro. Es decir, el dispositivo está fabricado, preferentemente, en un material no citotóxico y compatible con la viabilidad celular y que, además, permita que los espermatozoides se muevan y que no se adhieran al fondo. Ejemplos adecuados, no limitantes, de materiales biocompatibles, adecuados para la fabricación del dispositivo de la invención son: poliestireno de clase VI polipropileno, policarbonato y cicloolefinas, que cumplan los estándares de la farmacopea de Estados Unidos (por sus siglas en inglés: USP) o de la Sociedad Americana para la Evaluación de Materiales (por sus siglas en inglés: ASTM), entre otros.

A efectos de la presente invención el término altura, referido a las dimensiones (H1, H2), (T1, T2), (T3), (H1-T1) o (H2-T2) se refiere a una dimensión que tiene la dirección de la fuerza de la gravedad. Por tanto, la longitud (L3) del conducto (3) es perpendicular a dicha fuerza de la gravedad.

En una realización, la apertura (A1, A2) está dispuesta en uno de los extremos de la altura (H1, H2). Es decir, los compartimentos huecos (1, 2) forman un volumen vacío con una apertura (A1, A2) y altura (H1, H2).

El tamaño de los compartimentos huecos (1), (2), así como del de tapones (4) y del conducto (3) puede ser seleccionado dependiendo de las necesidades y, en particular, de la especie de mamífero de la cual provengan los espermatozoides.

Además, el dispositivo de la invención puede tener el número de compartimentos huecos (1) y (2) unidos entre sí por un conducto (3), que sean necesarios, con la finalidad de llevar a cabo varios experimentos de forma simultánea.

En una realización particular de la invención, el dispositivo cuenta con dos compartimentos huecos (1) y (2) unidos por un conducto (3), así como dos tapones (4) que cierran herméticamente el dispositivo.

El tapón (4) consta al menos de dos partes:

- una primera parte (5) interna, de altura (T1, T2), que queda introducida dentro de los compartimentos huecos (1, 2) cuando el tapón (4) cierra herméticamente dichos compartimentos (1) y (2), formándose una cavidad de altura (H1-T1) o (H2-T2) en cada uno de los compartimentos (1, 2) respectivamente, en donde la altura (T1, T2) es menor que la altura (H1) y (H2) respectivamente y que la altura (T3) medida desde la apertura (A1, A2); y

- una segunda parte (6) externa, de altura E6, que queda fuera de los compartimentos huecos (1) y (2); de manera que cuando todos los tapones (4) cierran los compartimentos huecos (1,2), el dispositivo queda cerrado herméticamente.

Los tapones (4) cierran herméticamente el dispositivo, dado que no comprenden ningún orificio, de manera que cuando todos los tapones (4) cierran los compartimentos huecos (1,2), no existe conexión entre el interior del dispositivo y el exterior.

La parte (6) externa permite extraer fácilmente el tapón (4) del compartimento hueco (1, 2).

El tapón (4) cierra herméticamente el compartimento hueco (1,2), por su abertura (A1, A2) de varias maneras: mediante un sistema de rosca, mediante inserción por presión, o cualquier otro medio que permita el cierre hermético de los compartimentos.

Dependiendo del volumen de muestra a seleccionar o de la concentración espermática de ésta, se utilizarán dispositivos con un número de compartimentos huecos (1, 2) variable. Debe entenderse que el dispositivo no está limitado a ningún tamaño, forma o geometría. Se puede emplear cualquier configuración que pueda proporcionar una subpoblación de espermatozoides mejorada de acuerdo con los principios de la presente invención.

Preferentemente, los compartimentos huecos (1, 2) y la parte (5) interna de los tapones (4) son cilíndricos, de manera que el diámetro (D1, D2) de los compartimentos huecos (1) y (2), respectivamente, es algo mayor que el diámetro D5 de la parte (5) interna los tapones (4) y de manera que los tapones (4) cierran herméticamente dichos compartimentos al ser introducida la parte (5) interna del tapón (4) en los compartimentos huecos (1, 2).

En una realización preferente, todos los compartimentos huecos (1, 2) tienen las mismas dimensiones.

Las figuras incluidas en el presente documento muestran una realización preferente, pero de ninguna manera limitante, del dispositivo de la invención, que comprende dos compartimentos huecos (1) y (2) cilíndricos e iguales, con aberturas circulares (A1, A2) iguales y altura (H1, H2) también igual.

En una realización particular de la invención cada compartimento hueco (1) y (2) tiene una altura igual (H1=H2) comprendida de entre 8,5 mm y 13,5 mm y forma cilíndrica, preferentemente con un mismo diámetro (D1=D2) comprendido entre 4,5 mm y 9,5 mm. Además, preferentemente, la parte (5) interna del tapón (4) tiene siempre una misma altura (T1=T2) comprendida entre 2,5 mm y 5 mm y un mismo diámetro (D5) de 4 mm a 9,3 mm. En dicha realización particular de la invención, la parte (6) externa del tapón (4) es de forma cilíndrica y tiene una altura (E6) de entre 5 mm y 10 mm y un diámetro (D6) comprendido entre 5 mm y 13 mm.

En una realización preferente, la parte (5) interna se divide a su vez en dos partes separadas por una pequeña hendidura, más preferentemente de entre 0,8 mm y 1,8 mm, donde se inserta una junta tórica (J5), fabricada en un material flexible, que permite el cierre hermético del dispositivo.

Los compartimentos se encuentran comunicados por un conducto (3), de longitud (L3) perpendicular a la altura (H1, H2), a una altura (T3), medida desde la apertura (A1, A2), en donde dicha altura (T3) es menor que, respectivamente, la altura (H1) y (H2). Así el conducto (3) comunica los compartimentos huecos (1, 2), en un punto entre la apertura (A1, A2) y el fondo del compartimento hueco (1, 2). Cuando el tapón (4) cierra el compartimento (1, 2), su parte (5) interna queda insertada dentro del compartimento hueco (1,2) hasta una altura (T1, T2) medida desde la apertura (A1, A2), que es menor que las alturas (H1, H2) y (T3), también medidas desde la apertura (A1, A2). Así, cuando el tapón (4) cierra el compartimento hueco (1, 2), la parte (5) interna del tapón (4) queda por encima del punto en el que el conducto (3) comunica ambos compartimentos huecos (1, 2). Preferentemente, el conducto (3) cuenta con una longitud (L3) comprendida entre 2 mm y 50 mm y un diámetro (D3) de entre 0,1 mm y 10 mm.

Las dimensiones de los compartimentos huecos (1,2) y del conducto (3) permiten poder disponer de un volumen suficiente de medio una vez seleccionados los espermatozoides para analizar diferentes parámetros con la misma muestra en paralelo, a la vez que las medidas señaladas permite no usar medio en exceso y, por tanto, desperdiciarlo. Además, es aplicable a todas las especies de mamíferos con las que se desea trabajar. Asimismo, el investigador o técnico tiene la opción de elegir el tamaño de los compartimentos huecos (1,2) en función de las necesidades y la especie con la finalidad de rentabilizar y, por consiguiente, abaratar el coste tanto del material como del medio.

Más preferentemente el conducto (3) tiene una longitud (L3) y un diámetro (D3) (no mostrado en las figuras), seleccionados en función de la especie animal de la cual proceden los espermatozoides.

A efectos de la presente invención, el término "comprende” indica que incluye un grupo de características, pero no excluye la presencia de otras características, siempre y cuando la presencia de las otras características no haga la invención impracticable. Además, los términos "consta de”, "contiene”, "incluye”, "tiene”, "abarca” y sinónimos de dichos términos, deben ser interpretados de la misma manera que el término "comprende”.

Adicionalmente, a efectos de la presente invención, el término "comprende” puede ser reemplazado por cualquiera de los términos "consiste de”, "consiste en”, "consisten sustancialmente de” o "consisten sustancialmente en”. Así, cuando el término "comprende” se refiere a un grupo de características técnicas A, B y C, debe interpretarse que puede incluir adicionalmente otras características técnicas además de las características técnicas A, B y C, siempre y cuando la presencia de las otras características no haga la invención impracticable, pero también puede interpretarse como que solamente comprende dichas características A, B y C o, sustancialmente dichas características A, B y C y, por tanto, el término "comprende” referido a un grupo que comprende las características A, B y C debe interpretarse que incluye un grupo que consiste de las características A, B y C, o que consiste sustancialmente de las características A, B y C.

El dispositivo de la invención está configurado para contener el medio de capacitación adecuado para mantener la motilidad de espermatozoides de mamíferos, incluyendo los seres humanos. Es estéril o aséptico y puede ser, preferentemente, desechable.

Así, el dispositivo de la invención permite la selección de espermatozoides potencialmente fértiles a partir de un eyaculado, con el objetivo principal de seleccionar espermatozoides adecuados para uso en técnicas de reproducción asistida o para estudios de fertilidad, seleccionando solamente aquellos espermatozoides con mayor probabilidad de producir un embrión viable y sano. En particular dicho dispositivo es útil para la selección de espermatozoides para su uso en la técnica ICSI, pero también es útil para otros tipos de técnicas de reproducción asistida, en humanos u otros mamíferos.

Por tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere al uso del dispositivo de la invención para la selección de espermatozoides. Preferentemente dichos espermatozoides están capacitados y son útiles en técnicas de reproducción asistida o en estudios de fertilidad.

Por otro lado, otro aspecto adicional de la presente invención se refiere al uso del dispositivo de la invención en una técnica de reproducción asistida in vitro. Adicionalmente, la presente invención se refiere también al uso del dispositivo de la invención en un estudio de fertilidad masculina in vitro.

Así, un aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento de selección in vitro de espermatozoides caracterizado porque comprende:

(i) proporcionar un dispositivo de acuerdo con la presente invención, que comprende:

- tapones (4), en igual número al número de compartimentos huecos (1, 2), configurados para ser introducidos por la apertura (A1, A2) dentro del compartimento hueco (1, 2) hasta una altura (T1) o (T2), en donde la altura (T1) y (T2) es menor que la altura (H1) y (H2) respectivamente y que la altura (T3), medidas dichas alturas desde la apertura (A1, A2); de manera que cuando todos los tapones (4) cierran todos los compartimentos huecos (1, 2), el dispositivo queda cerrado herméticamente;

(iii) abrir el primer compartimento hueco (1), añadir un medio de capacitación (C1) que comprende de 0,1% a 2% v/v de fluido folicular en dicho compartimento hueco (1) hasta una profundidad (H1-T1) y, volver a cerrarlo con un tapón (4);

(iv) abrir el al menos segundo compartimento hueco (2), añadir medio de capacitación (C2) que comprende espermatozoides en dicho al menos segundo compartimento hueco (2) hasta una profundidad (H2-T2) y, volver a cerrarlo con un tapón (4);

(v) incubar el dispositivo;

Además, otro aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento de fecundación in vitro caracterizado porque comprende:

(v) incubar el dispositivo;

(vi) destapar el primer compartimento hueco (1); y depositar un ovocito y cerrar dicho primer compartimento hueco (1) con un tapón (4) para proceder a una fecundación in vitro incubando el dispositivo en condiciones adecuadas.

De esta manera, dado que, los tapones (4) no tienen ningún orificio, cierran herméticamente el dispositivo. Por ello, al proceder, en el paso (iii), a abrir y llenar el primer compartimento hueco (1) hasta una profundidad (H1-T1) con medio de capacitación (C1) que comprende fluido folicular, y proceder, después, a su cierre, estando el al menos un segundo compartimento hueco (2) también cerrado, el aire que ocupaba el volumen donde se inserta el tapón (4) desplaza y empuja parcialmente el medio de capacitación (C1) con fluido folicular dentro del conducto (3). Así, cuando se procede, en el paso (iv), a abrir y llenar el al menos un segundo compartimento hueco (2) con medio de capacitación (C2) que comprende espermatozoides, y después a su cierre, el aire que ocupaba el volumen donde se inserta el tapón (4) desplaza y empuja parcialmente el medio de capacitación (C2) con espermatozoides dentro del conducto (3), haciendo que, en este momento, que los medios de capacitación de ambos compartimentos huecos (1, 2) entren en contacto, pero sin que sea posible la mezcla significativa entre los líquidos contenidos en dichos compartimentos huecos (1, 2). Una vez en contacto, se incuba el dispositivo produciéndose una migración de los espermatozoides que tengan movilidad, por el conducto (3), desde el al menos un segundo compartimento hueco (2) en el cual han sido añadidos, hasta el primer compartimento hueco (1) en el que se encuentra el medio de capacitación (C1) con el fluido folicular.

Dichos procedimientos pueden ser llevados a cabo con espermatozoides de cualquier especie de mamífero. Preferentemente dicha especie de mamífero es un ser humano. también preferentemente dicha especie es un mamífero no humano.

Preferentemente las condiciones adecuadas, para llevar a cabo la fecundación in vitro tras el paso (vi), comprenden, entre otras, una humedad relativa de entre 90 y 100%.

Cuando la fecundación in vitro se refiere a la especie humana, el procedimiento de fecundación in vitro de la presente invención lleva a cabo, tras depositar un ovocito humano y cerrar dicho primer compartimento hueco (1) del dispositivo con un tapón (4) en el paso (vi), una incubación de dicho dispositivo a una humedad relativa de 90-100%, durante 15-20 horas, a 37°C y en presencia de 5% de O ² y 5% CO ² . Más preferentemente durante 18 horas.

Cuando la fecundación in vitro se refiere a ratones, el procedimiento de fecundación in vitro de la presente invención lleva a cabo, tras depositar un ovocito de ratón y cerrar dicho primer compartimento hueco (1) del dispositivo con un tapón (4) en el paso (vi), una incubación de dicho dispositivo a una humedad relativa de 90-100%, durante 4-7 horas, a 37°C y en presencia de 5% CO ² . Más preferentemente durante 5 horas.

Cuando la fecundación in vitro se refiere a la especie porcina o equina, el procedimiento de fecundación in vitro de la presente invención lleva a cabo, tras depositar un ovocito de cerdo o equino y cerrar dicho primer compartimento hueco (1) del dispositivo con un tapón (4) en el paso (vi), una incubación de dicho dispositivo a una humedad relativa de 90-100%, durante 15-20 horas, a 38,5°C y en presencia de 5% CO ² . Más preferentemente durante 18 horas.

Cuando la fecundación in vitro se refiere a la especie bovina, el procedimiento de fecundación in vitro de la presente invención lleva a cabo, tras depositar un ovocito bovino y cerrar dicho primer compartimento hueco (1) del dispositivo con un tapón (4) en el paso (vi), una incubación de dicho dispositivo a una humedad relativa de 90-100%, durante 18-25 horas, a 38,5°C y en presencia de 5% CO ² . Más preferentemente durante 20 a 22 horas.

Tal como se puede observar en los ejemplos mostrados a continuación, en el presente documento, los procedimientos de la invención permiten seleccionar espermatozoides que producen el mayor número de uniones a la zona pelúcida, así como el mayor porcentaje de ovocitos penetrados. Por tanto, la utilización de los procedimientos de la invención permite seleccionar aquellos espermatozoides que tienen mayor capacidad de producir una fecundación exitosa en técnicas de fecundación asistida.

Esto quiere decir que, aunque la utilización de otros quimioatrayentes, diferentes al fluido folicular, en el procedimiento de la invención, produzcan una mayor quimiotaxis (produzcan una mayor acumulación de espermatozoides), la utilización de los procedimientos de la invención, con fluido folicular, permiten seleccionar de manera más efectiva aquellos espermatozoides que tienen una mayor posibilidad de producir una fecundación (medido como mayor número de uniones a la zona pelúcida y/o mayor porcentaje de ovocitos penetrados), es decir, aquellos espermatozoides con una mayor capacitación espermática.

A efectos de la presente invención se denomina sustancia quimioatrayente a aquellas sustancias que producen un proceso de quimiotaxis, es decir, una sustancia que provoca la migración mediante gradiente de concentración, de espermatozoides.

A efectos de la presente invención se denomina estado de capacitación espermática a aquellas características funcionales o metabólicas que permiten a los espermatozoides disponer de una mayor capacidad de fecundación de un ovocito.

Los espermatozoides no tienen la capacidad de sintetizar proteínas como respuesta a estímulos externos, sino que llevan a cabo modificaciones, como la fosforilación de proteínas, metilaciones o nitrosilación de proteínas. Se ha comprobado que, durante la capacitación espermática, se produce una fosforilación de proteínas en los espermatozoides, concretamente en los aminoácidos serina, treonina y tirosina de las proteínas. La fosforilación del aminoácido tirosina se ha descrito como una señal que se produce durante la capacitación y, por ello, es utilizado como medida de este fenómeno. El aumento de los niveles de fosforilación en tirosina de las proteínas es un indicador primordial de la probabilidad de éxito en la fecundación.

Así, la utilización del dispositivo de la invención permite mantener el estado de capacitación espermática (medido como fosforilación de tirosina), viabilidad y daño acrosomal, motilidad, receptores de progesterona y morfología de los espermatozoides durante todo el procedimiento.

De manera preferente el medio de capacitación (C1) y el medio de capacitación (C2) son iguales. Sin embargo, dichos medios de capacitación pueden ser diferentes, siempre y cuando la viscosidad de ambos medios sea idéntica.

La composición de los medios de capacitación (C1) y (C2) varía en función de la especie animal para la cual se lleva a cabo el procedimiento de selección de espermatozoides de la invención. En una realización preferente, el medio de capacitación (C1) y (C2) son un medio Tyrode modificado con albúmina.

Más preferentemente el medio de capacitación (C1) y el medio de capacitación (C2) son ambos una solución de Tyrode con albúmina, lactato y piruvato (TALP).

En una realización preferente, cuando la especie para la cual se lleva a cabo los procedimientos es la especie equina, el medio de capacitación (C1) y el medio de capacitación (C2) son ambos un medio Tyrode modificado que comprende NaCl, KCl, MgSO ⁴ , KH ² PO ⁴ , HEPES, glucosa, lactato, piruvato y albúmina.

En otra realización preferente, cuando la especie para la cual se lleva a cabo los procedimientos es la especie bovina, el medio de capacitación (C1) y el medio de capacitación (C2) son ambos un medio Tyrode modificado que comprende NaCl, KCl, NaH ² PO ⁴ , ácido láctico, CaCl ² , MgCl ² , HEPES, bicarbonato y albúmina, suplementado con piruvato, penicilina y estreptomicina.

En otra realización preferente, cuando la especie para la cual se lleva a cabo los procedimientos es la especie porcina, el medio de capacitación (C1) y el medio de capacitación (C2) son ambos un medio Tyrode modificado que comprende NaCl, KCl, MgCh, lactato, NaH ² PO ⁴ , glucosa, bicarbonato, cafeína, lactato, polivinilacetato (PVA), kanamicina y rojo fenol suplementado con albúmina y piruvato, ajustando el pH a 7,4.

En otra realización preferente, cuando la especie para la cual se lleva a cabo los procedimientos es la especie caprina, el medio de capacitación (C1) y el medio de capacitación (C2) son ambos un medio Tyrode modificado que comprende NaCl, KCl, NaH ² PO ⁴ , ácido láctico, CaCh, MgCh, HEPES, bicarbonato y albúmina libre de ácidos grasos, suplementado con suero de cabra en celo y heparina.

Los procedimientos de la invención seleccionan espermatozoides que son capaces de moverse hacia el medio de capacitación con fluido folicular, que actúa como quimioatrayente, pero, además, los espermatozoides seleccionados también se habrán impregnado de factores maternos presentes en las vesículas extracelulares de dicho fluido folicular. Tal como se explicó anteriormente, dentro de este tipo de vesículas se encuentran los exosomas, los cuales transportan materiales bioactivos que incluyen proteínas y microARNs en diferentes fluidos corporales, siendo estos últimos, moléculas de ARN no codificantes que regulan la expresión génica durante la diferenciación celular y el desarrollo de los tejidos.

De manera preferente, los espermatozoides comprendidos en el medio del paso (iv) se han procesado previamente a su utilización en el procedimiento de la invención mediante: lavado, gradiente de densidad o swim-up.

En el caso que los espermatozoides comprendidos en el medio del paso (iv) no hayan sido procesados previamente mediante las técnicas mencionadas, permanecerán más tiempo en el medio de capacitación antes de que dicho medio sea añadido al dispositivo para llevar a cabo la incubación del paso (v), dependiendo de la especie y/o tipo de conservación previamente realizada.

A efectos de la presente invención, se denomina capacitación espermática al procesado del esperma que permite adquirir a los espermatozoides la capacidad de fecundar un óvulo. La capacitación de los espermatozoides se produce de forma natural a lo largo del tracto reproductor femenino. Las técnicas de reproducción asistida realizan técnicas de capacitación in vitro para mejorar las probabilidades de éxito en la fecundación. De entre las técnicas de capacitación in vitro pueden ser mencionadas: capacitación por lavado, capacitación por swim-up y capacitación por gradiente de densidad.

El lavado consiste en una centrifugación de la muestra de semen para eliminar plasma seminal. Aunque dicha técnica se engloba dentro de las técnicas de capacitación, no implica ningún proceso de selección de espermatozoides.

El swim-up es un procedimiento que comprende realizar una incubación en medio de cultivo en la cual se seleccionan los espermatozoides que ascienden a la superficie dado que son los que tienen mejor movilidad.

En la capacitación por gradiente de densidad se coloca la muestra de semen en la parte superior de un tubo de centrifugación en el que se han incluido varios medios con diferente densidad colocados de manera que forman un gradiente. Tras el centrifugado los espermatozoides que hayan sido capaces de descender hasta el fondo del tubo, superando todos los gradientes de densidad, son seleccionados.

Además, preferentemente, el medio de capacitación del paso (iv) comprende espermatozoides con una concentración de entre 1x103 espermatozoides/ml a 50x106 espermatozoides/mL.

También, de manera preferente, el fluido folicular utilizado en el procedimiento de la invención es fluido folicular procedente de un folículo maduro. Más preferentemente el fluido folicular proviene del folículo ovárico del cual se aísla el ovocito que va a ser fecundado en una técnica de reproducción asistida.

Los folículos ováricos, que se encuentran en el interior de los ovarios comprenden un ovocito, células granulosas y fluido folicular. Dichos folículos sufren un proceso de maduración (foliculogénesis) que culmina en la formación un folículo maduro que se encuentra listo para la ovulación (folículo de Graaf).

En una realización de la invención el medio de capacitación (C) con fluido folicular utilizado en el procedimiento de la invención se obtiene mediante los pasos de:

- puncionar el folículo ovárico in vitro, separando el ovocito del fluido folicular;

- centrifugar el fluido folicular para retirar restos celulares;

- opcionalmente, criopreservar dicho fluido folicular centrifugado a -80oC; y

- añadir el fluido folicular después de su centrifugación o después de descongelar al medio de capacitación (C); preferentemente a una concentración de 0,1% a 2% (v/v).

El paso de incubación (v) puede variar entre 10 minutos hasta unas pocas horas, generalmente de 3 a 5 horas, dependiendo de la especie animal en la que se aplique. En una realización, el paso (v) comprende incubar el dispositivo durante 10 minutos a 5 horas. Más preferentemente durante 10 a 30 minutos.

Además, preferentemente, el paso (v) comprende incubar el dispositivo a entre 35°C y 39°C y con 0% a 8% de CO ² .

Dado que el dispositivo de la invención se encuentra configurado para uso en la selección de espermatozoides de seres humanos o de otros mamíferos (cerdos, vacas, ovejas, ratones, conejos, etc.), en una realización preferente, el medio del paso (iv) comprende espermatozoides procedentes de seres humanos.

Cuando el procedimiento de la invención es un procedimiento de selección de espermatozoides in vitrn, el paso (vi) comprende destapar el primer compartimento (1); y recuperar el medio de dicho primer compartimento hueco (1).

Cuando el procedimiento de la invención es un procedimiento de fecundación in vitro, el paso (vi) comprende destapar el primer compartimento (1); y depositar un ovocito y cerrar dicho primer compartimento hueco (1) con un tapón (4) para proceder a una fecundación in vitro.

Así, cuando el procedimiento de la invención es un procedimiento de selección de espermatozoides in vitro, se podrá utilizar el medio con los espermatozoides seleccionados para llevar a cabo técnicas de reproducción asistida tales como: la inyección intracitoplasmática de espermatozoides, inseminación artificial intravaginal, inseminación artificial intracervical, inseminación artificial intrauterina e inseminación artificial intratubárica.

En cambio, cuando el procedimiento de la invención es un procedimiento de fecundación in vitro, permite llevar a cabo la fecundación de un ovocito directamente en el mismo compartimento hueco (1) en el que han migrado los espermatozoides seleccionados, por lo que el procedimiento de la invención permite disminuir el tiempo de manipulación, el nivel de estrés y, consecuentemente, las posibles alteraciones epigenéticas producidas por factores ambientales de manipulación.

EJEMPLOS

A continuación, se expone un ejemplo no limitante de aplicación de la invención. En concreto la especie utilizada como modelo experimental en que se basa este ejemplo es la especie porcina, habiéndose usado espermatozoides obtenidos de verracos fértiles con edad comprendida entre 12 y 24 meses, en régimen de colecta para su utilización en programas de inseminación artificial. Los verracos pertenecían a la Granja Veterinaria de la Facultad de Veterinaria, Universidad de Murcia. Las fases del procedimiento se muestran a continuación:

Ejemplo 1. Determinación de la concentración de quimioatrayente.

Para evaluar la capacidad de diferentes sustancias como quimioatrayentes, se eligieron, en base a pruebas realizadas previamente en laboratorio con resultados relevantes en la fecundación in vitro [Soriano-Ubeda, C. et al. (2017) SciRep 7, 12]: fluido folicular (FF), fluido oviductal (FO), progesterona (P4) y medio condicionado (MC), dentro de rangos de concentración fisiológicos [Ballester, L. et al., Fertil Steril. 2014; 102, (1762-1768)]. Se empleó progesterona de uso comercial Sigma (Sigma; P8783-5g). El FF se obtuvo de folículos antrales de tamaño comprendido entre 3 y 6 mm de diámetro, el FO procedió de oviductos de cerdas próximas a la ovulación y el MC se obtuvo tras la maduración de los ovocitos en el medio NCSU-37 (North Caroline State University 37 Medium).

La composición del medio NCSU se describe en la tabla 1 a continuación:

Tabla 1

A la solución stock se le añade Cisteína (0,57 mM), p-mercaptoetanol (50 pM), insulina (5 mg/L) y 10% de fluido folicular porcino (v/v). Para la evaluación de dichas sustancias se emplearon las siguientes concentraciones (% en v/v): FF: 0,13, 0,25, 0,5, 1 y 1,5%; FO: 0,13, 0,25, 0,5, 1 y 1,5%; MC: 0,033, 0,065, 0,13, 0,25 y 0,5%.

Las concentraciones de progesterona (P4) se analizaron en dos etapas porque tras efectuar el estudio con concentraciones de 1 pM a 10 pM se observó que la mayor concentración (10 pM) utilizada atrajo mayor porcentaje de espermatozoides, y se diseñó, por tanto, una segunda etapa en la que se estudiaron mayores concentraciones de progesterona, partiendo de 10 pM hasta 20 pM:

- primera etapa con concentraciones: 1 pM, 2,5 pM, 5 pM, 7,5 pM y 10 pM; y

- segunda etapa con concentraciones: 10 pM, 12,5 pM, 15 pM, 17,5 pM y 20 pM.

Los espermatozoides procedieron de animales fértiles y se lavaron a través de un gradiente de densidad con Percoll® (45/90). Se prepararon muestras de 500 pL de medio Tyrode modificado con albúmina y piruvato, para especie porcina (TALP) con cada una de las concentraciones de FF, FO, MC y P4, así como una muestra control sin quimioatrayente (TALP). El medio TALP utilizado modificado para especie porcina tenía la siguiente composición que se indica en la tabla 2:

Tabla 2: Tyrode’s Albúmina Lactato Piruvato modificado para especie porcina

Inmediatamente después de preparar la mezcla se mide el pH ajustándolo a 7,4 y se suplementó con 3 mg/mL de albúmina de suero bovino (BSA, SIGMA A 9647) y 0,12 mg/mL de piruvato sódico (SIGMA P 2256).

Las muestras de medio TALP modificado con cada uno de los quimioatrayentes, o el control de TALP, se cargaron en el compartimento hueco (1) del dispositivo, mientras que el compartimento hueco (2) permaneció cerrado. Posteriormente, se cerró herméticamente el compartimento hueco (1) y, se abrió el compartimento hueco (2) y se añadió medio de capacitación TALP con una concentración de 20x106/mL, cerrándolo de nuevo a continuación. El dispositivo se incubó durante 20 minutos y, a continuación, se recogió el contenido del compartimento hueco (1) para evaluar las concentraciones de los espermatozoides en todos los grupos.

Las concentraciones de espermatozoides se determinaron con una cámara de recuento celular Neubauer. Cuando se realizó la curva de concentración se observó que las concentraciones de 0,25% de FF (Tabla 3), 0,25% de FO (Tabla 4), 0,065% y 0,13% de MC (Tabla 5) y 10 pM de la P4 (Tablas 6.1 y 6.2), seleccionaron el mayor porcentaje de espermatozoides (P < 0,05).

Tabla 3. Concentración de espermatozoides tras 20 minutos de incubación en el compartimento hueco (1) suplementado con distintas concentraciones de FF. Se expresa en total de espermatozoides (SPZ ) recogidos y el porcentaje de los que han migrado del total (%SPZ). (N= número de muestras analizadas). * diferencias significativas P <0,05.

Tabla 4. Concentración de espermatozoides tras 20 minutos de incubación en el compartimento hueco (1) suplementado con distintas concentraciones de FO. Se expresa en total de espermatozoides (SPZ ) recogidos y el porcentaje de los que han migrado del total (%SPZ). (N= número de muestras analizadas). * diferencias significativas P <0,05.

Tabla 5. Concentración de espermatozoides tras 20 minutos de incubación en el compartimento hueco (1) suplementado con distintas concentraciones de MC. Se expresa en total de espermatozoides (SPZ ) recogidos y el porcentaje de los que han migrado del total (%SPZ). (N= número de muestras analizadas). * diferencias significativas P <0,05.

Tabla 6.1. Concentración de espermatozoides tras 20 minutos de incubación en el compartimento hueco (1) que se había sido suplementado con distintas concentraciones de progesterona (1-10 pM). Se expresa en total de espermatozoides (SPZ ) recogidos y el porcentaje de los que han migrado del total (%SPZ). (N= número de muestras analizadas). diferencias significativas P <0,05.

Tabla 6.2. Concentración de espermatozoides tras 20 minutos de incubación en el compartimento hueco (1) que se había sido suplementado con distintas concentraciones de progesterona (10-20 pM). Se expresa en total de espermatozoides (SPZ ) recogidos y el porcentaje de los que han migrado del total (%SPZ). (N= número de muestras analizadas). * diferencias significativas P <0,05.

Las concentraciones marcadas en negrita (FF 0,25%, FO 0,25%, MC 0,13% y P410 pM) son las que, para cada una de las sustancias evaluadas como quimioatrayente, indujeron una migración de un mayor % de espermatozoides.

En base a dichos resultados se seleccionaron dichas concentraciones marcadas en negrita (FF 0,25%, FO 0,25%, MC 0,13% y P4 10 pM) para establecer el medio que selecciona espermatozoides de mayor calidad.

Ejemplo 2. Selección de espermatozoides capacitados.

Fluido folicular (FF), fluido oviductal (FO), progesterona (P4) y medio condicionado (MC), se mezclaron con medio de capacitación Tyrode con albúmina, lactato y piruvato (TALP) modificado para medio porcino, de acuerdo con la tabla 2 indicada anteriormente, y fueron añadidas al compartimento hueco (1) de un dispositivo según la invención. El medio de capacitación se equilibró previamente durante 3 horas a 38,5°C, 5% de CO ² en atmósfera saturada de humedad.

Asimismo, se utilizaron espermatozoides procedentes de animales fértiles, que fueron procesados mediante gradiente de densidad utilizando Percoll® (45/90) para eliminar el plasma seminal y restos celulares. Finalmente, las concentraciones de espermatozoides se determinaron con una cámara de recuento celular Neubauer.

Se preparó además un control de solamente medio de capacitación TALP y otro en el que se estudió el efecto de todos los biofluidos juntos como quimioatrayentes (TALP con FF, FO, MC, identificado como I). Se analizó el porcentaje de espermatozoides que respondieron a los quimioatrayentes, así como el estado funcional mediante fecundación in vitro de dichos espermatozoides.

Los resultados mostraron que el FF presentaba la mayor tasa de penetración (P <0,05). En vista de los resultados de este primer ensayo, mostrados en la tabla 5, se puede concluir que el medio que contiene fluido folicular FF es el quimioatrayente, bajo condiciones in vitro, que mejor resultado ofrece.

Tabla 7. Utilización de los espermatozoides seleccionados en un procedimiento de fecundación in vitro (FIV). * diferencias significativas (P<0,05). ZP BINDING: número de espermatozoides unidos a la zona pelúcida, PEN (%): porcentaje de ovocitos penetrados. (N= número de muestras analizadas).

Sorprendentemente, tal como se aprecia en la tabla 7, el uso de FF produjo un mayor % de ovocitos penetrados. Esto quiere decir que, aunque en el ejemplo anterior pudiera parecer que el uso de, por ejemplo, progesterona, produce una mayor acumulación de espermatozoides, los espermatozoides seleccionados cuando se utiliza fluido folicular tienen una mayor posibilidad de producir una fecundación. Además, la mezcla de todas las sustancias no produjo una mejora en la capacidad de selección (tal como se ve en los resultados obtenidos, I).

Así, solamente el uso de fluido folicular produce una selección de espermatozoides con mayor calidad, medida como capacidad de penetrar ovocitos.

Tras el ensayo descrito anteriormente se llevó a cabo el diseño e impresión en 3D de un dispositivo con material biocompatible MED-610™ para mejorar la manipulación de los gametos y medios. El estado de capacitación espermática (evaluado mediante fosforilación de tirosina), viabilidad, motilidad, receptores de progesterona y formas anormales, no se vio afectado por el material utilizado ni por los quimioatrayentes utilizados tal como se ve en las tablas a continuación:

Tabla 8: Fosforilación de tirosina en espermatozoides decerdo. Evaluación del efecto de distintosquimioatrayentessobre la capacitacion mediante imunofluorescencia (IFI). *diferencias significativas P <0,05.

En la tabla 8 se observa el resultado de la capacitación de los espermatozoides porcino evaluado por la inmunofluorescencia indirecta con cinco patrones diferentes (patrón I: sin señal, patrón II: región acrosomal, patrón III: región postacrosomal (triangulo), patrón IV: región acrosomal y postacrosomal, patrón V: cola). Patrón I, II: baja capacitación, patrón III, V: capacitación intermedia y patrón: IV: capacitado. No se observaron diferencia significativa entre los tratamientos (TALP, FF, FO, MC, Y) P>0,05.

En este sentido, los espermatozoides sin señales o con las señales en la región acrosomal, no serían capaces de penetrar a los ovocitos, y si lo hacen, el porcentaje de penetración sería muy bajo. Sin embargo, los espermatozoides de patrón IV sí que tienen un porcentaje de penetración alto. En anteriores trabajos se ha demostró la correlación de cada patrón mencionado con la tasa de penetración (López-Úbeda et al., Asian Journal of Andrology (2017) 19, 396-403).

Tabla 9. Morfoanomalia de espermatozoides porcino despues 20 minutos de incubación. *diferencias significativas P <0,05

En base a dichos datos, los tratamientos FF y P4 seleccionarion mayor porcentaje de espermatozoides normales que los demás tratamientos (TALP, FO,MC, Y) P<0,05.

Tabla 10. Localización mediante inmufluorescencia indirecta de receptores de progesterona en espermatozoides porcinos seleccionados tras la incubación. Patrones de localización de los receptores de progesterona: patrón I: no marcado, patrón II: región subecuatorial, patrón III: región subecuatorial y flagelo, patrón IV: flagelo y patrón V: cabeza espermática (región subecuatorial y acrosomal). En la especie porcina, el patrón más importante es el V (región de la cabeza). Los resultados indican que no se observaron diferencias significativas entre los tratamientos (P > 0,05).

Tabla 11. Motilidad de espermatozoides porcino después de 20 min de incubación con diferentes concentraciones de varios quimioatrayentes (FF-FO-MC-P4) comparada con motilidad de semen fresco eyaculado sin ningún tratamiento (SEM). * diferencias significativas P <0,05. VCL (pm/s): velocidad curvilínea, VSL (pm/s): velocidad rectilínea, VAP (pm/s): Velocidad media, ALH (pm/s): Amplitud del desplazamiento lateral de la cabeza, LIN (%): índice de linealidad, STR (%): índice de rectitud, WOB (%): índice de oscilación, BCF (HZ): frecuencia de batido de la cabeza.

En cuanto la motilidad tampoco se ha observado diferencia significativa entre los tratamientos. Por tanto, si bien, las características de motilidad y fenotípicas no se ven alteradas con la utilización de fluido folicular como quimioatrayente, frente al uso de otros fluidos, sorprendentemente, tal como se puedo apreciar en la tabla 7, el uso de FF produjo un mayor % de ovocitos penetrados. Esto quiere decir que, aunque pudiera parecer que el uso de, por ejemplo, progesterona, produce una mayor acumulación de espermatozoides, o que todos los tratamientos seleccionan espermatozoides con características similares, los espermatozoides seleccionados cuando se utiliza fluido folicular tienen una mayor posibilidad de producir una fecundación.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Dispositivo para seleccionar espermatozoides que comprende:

- un conducto (3) que se encuentra entre ambos compartimentos huecos (1) y (2), de longitud (L3) perpendicular a la altura (H1, H2), y que los comunica a una altura (T3) medida desde la apertura (A1, A2) y que es menor que la altura (H1, H2);

- tapones (4), en igual número al número de compartimentos huecos (1, 2), configurados para ser introducidos en la apertura (A1, A2) dentro del compartimento hueco (1, 2) hasta una altura (T1) o (T2), en donde la altura (T1) y (T2) es menor que la altura (H1) y (H2) respectivamente y que la altura (T3), medidas dichas alturas desde la apertura (A1, A2); de manera que cuando todos los tapones (4) cierran todos los compartimentos huecos (1, 2), el dispositivo queda cerrado herméticamente.

2. Dispositivo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el conducto (3) tiene una longitud (L3) y un diámetro (D3) seleccionados en función de la especie animal de la cual proceden los espermatozoides.

3. Dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el conducto (3) tiene una longitud (L3) comprendida entre 2 mm y 50 mm.

4. Dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el conducto (3) tiene un diámetro (D3) comprendido entre 0,1 mm y 10 mm.

5. Dispositivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho dispositivo está fabricado con un material biocompatible.

6. Uso de un dispositivo de las reivindicaciones 1 a 5 para la selección in vitro de espermatozoides.

7. Uso de un dispositivo de las reivindicaciones 1 a 5 en una técnica de fecundación in vitro.

8. Procedimiento de selección in vitro de espermatozoides caracterizado porque comprende:

(i) proporcionar el dispositivo de las reivindicaciones 1 a 5;

(iv) abrir el al menos un segundo compartimento hueco (2), añadir medio de capacitación (C2) que comprende espermatozoides en dicho al menos un segundo compartimento hueco (2) hasta una profundidad (H2-T2) y, volver a cerrarlo con un tapón (4);

(v) incubar el dispositivo;

9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en que el medio del paso (iv) comprende espermatozoides previamente procesados mediante: lavado, gradiente de densidad o swim-up.

10. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9, en el que el medio de capacitación (C2) del paso (iv) comprende espermatozoides con una concentración de entre 1x103 espermatozoides/mL a 50x106 espermatozoides/mL.

11. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el que el fluido folicular es fluido folicular procedente de un folículo maduro.

12. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en el que el paso (v) comprende incubar el dispositivo durante 10 minutos a 30 minutos.

13. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, en el que el paso (v) comprende incubar el dispositivo a entre 35°C y 39°C y con 0% a 8% de CO ² .

14. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, en el que el medio de capacitación (C1) y el medio de capacitación (C2) son iguales.

15. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14, en el que el medio de capacitación (C1) y el medio de capacitación (C2) son ambos una solución de Tyrode con albúmina, lactato y piruvato (TALP).

16. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15, en el que el medio de capacitación (C2) del paso (iv) comprende espermatozoides de una especie de mamífero no humano.

17. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15, en el que el medio de capacitación (C2) del paso (iv) comprende espermatozoides humanos.

18. Procedimiento de fecundación in vitro caracterizado porque comprende:

(i) proporcionar el dispositivo de las reivindicaciones 1 a 5;

(v) incubar el dispositivo;

19. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18, en que el medio del paso (iv) comprende espermatozoides previamente procesados mediante: lavado, gradiente de densidad o swim-up.

20. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 o 19, en el que el medio de capacitación (C2) del paso (iv) comprende espermatozoides con una concentración de entre 1x103 espermatozoides/mL a 50x106 espermatozoides/mL.

21. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, en el que el fluido folicular es fluido folicular procedente de un folículo maduro.

22. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, en el que el paso (v) comprende incubar el dispositivo durante 10 minutos a 30 minutos.

23. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22, en el que el paso (v) comprende incubar el dispositivo a entre 35°C y 39°C y con 0% a 8% de CO ² .

24. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 23, en el que el medio de capacitación (C1) y el medio de capacitación (C2) son iguales.

25. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 25, en el que el medio de capacitación (C1) y el medio de capacitación (C2) son ambos una solución de Tyrode con albúmina, lactato y piruvato (TALP).

26. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 25, en el que el medio de capacitación (C2) del paso (iv) comprende espermatozoides de una especie de mamífero no humano.

27. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 25, en el que el medio de capacitación (C2) del paso (iv) comprende espermatozoides humanos.

28. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 27, en el que cuando el medio de capacitación (C2) del paso (iv) comprende espermatozoides humanos, tras depositar un ovocito humano y cerrar el primer compartimento hueco (1) del dispositivo con un tapón (4), en el paso (vi), se procede a una fecundación in vitrn, incubando el dispositivo a una humedad relativa de 90-100%, durante 15-20 horas, a 37°C y en presencia de 5% de O ² y 5% CO ² .