ES2857865T3 - Método de detección electroquímica de micobacterias - Google Patents

Abstract

Método de detección electroquímica de micobacterias en una muestra biológica, comprendiendo dicho método las etapas de: a) seleccionar un sustrato de al menos una aciltransferasa y su cofactor; b) poner en contacto dicha muestra biológica con dichos sustrato y cofactor; c) detectar electroquímicamente el producto resultante de la actividad catalítica de dicha al menos una aciltransferasa.

Description

DESCRIPCIÓN

Método de detección electroquímica de micobacterias

Campo de la invención

La presente invención tiene como objetivo un proceso o método de detección de micobacterias basado en la medición de la actividad de aciltransferasa, en particular la actividad catalítica del Antígeno 85, mediante un método de análisis electroquímico.

La presente invención encuentra sus aplicaciones en medicina humana y veterinaria, para el diagnóstico de micobacteriosis y tuberculosis humana y animal, así como en diagnóstico ambiental.

En la descripción que sigue a continuación, las referencias entre corchetes ([ ]) se refieren al listado de referencias presentado al final del texto.

Estado de la técnica

Las micobacterias pertenecen al filo de las actinobacterias y se caracterizan por una pared rica en ácidos micólicos que les confieren propiedades tintóreas particulares relacionadas con la resistencia de su pared a sucesivas decoloraciones por un ácido y luego por alcohol de 90° (BAAR: Bacilos Ácido-Alcohol Resistentes). Hasta la fecha se han identificado unas 200 especies pertenecientes al género Mycobacterium.

Entre ellas, las micobacterias denominadas tuberculosas son bacterias patógenas obligatorias con un tropismo predominantemente respiratorio responsables de la tuberculosis en seres humanos y animales. Las micobacterias no tuberculosas (denominadas atípicas o ambientales) agrupan bacterias oportunistas que causan micobacteriosis en seres humanos y animales. La lepra también es una enfermedad causada por una micobacteria, Mycobacterium leprae.

La tuberculosis humana se debe principalmente a M. tuberculosis, pero también puede ser causada por M. africanum, M. canettii, M. bovis en particular. La tuberculosis humana representa un problema de salud mundial importante porque es la enfermedad infecciosa más mortal del mundo (aproximadamente 1,5 millones de muertes en 2013) junto con el VIH (SIDA). La OMS (Organización Mundial de la Salud) calcula un número de nuevos casos de aproximadamente 9 millones cada año.

En cuanto a los animales, la tuberculosis afecta a muchas especies: bovinas, caprinas así como numerosas especies silvestres como los pequeños roedores, por ejemplo.

Las micobacterias atípicas, que se encuentran ampliamente en el medio ambiente (suelo y agua), presentan una patogenicidad muy variable en seres humanos y animales. En seres humanos, la incidencia de infecciones relacionadas con micobacterias atípicas parece aumentar en los países industrializados. Generalmente ocurren en un campo de inmunodepresión local o general, causando principalmente infecciones pulmonares (por ejemplo, M. avium y M. intracellulare, M. xenopi, M. kansasii, M. malmoense), infecciones ganglionares (M. avium e intracellulare, M. kansasii, M. scorofulaceum), cutáneas (M. marinum, M. ulcerans, M. chelonae), incluso sistémicas (M. avium e intracellulare, M. kansasii, M. haemophilum, M. xenopi, M. gevanense)... En los animales, algunas causan infecciones contagiosas con alta morbilidad y mortalidad (paratuberculosis en bovinos: M. avium ssp. paratuberculosis y "tuberculosis" en aves; M. avium ssp. avium por ejemplo). La persistencia de las micobacterias atípicas en el medio ambiente, su resistencia a los detergentes y la capacidad de ciertas especies para formar biopelículas, especialmente en los sistemas hídricos, pueden explicar la contaminación de las aguas superficiales y las redes de distribución para explicar la contaminación humana.

La detección de micobacterias en seres humanos, animales o en el medio ambiente se basa en las técnicas siguientes. El método de detección histórico se basa en un examen microscópico de las muestras (frotis de esputo, homogenado de lesión...) que permite demostrar la presencia de Bacilos Ácido-Alcohol Resistentes (BAAR), característica parcialmente específica de las micobacterias. En seres humanos, el examen microscópico se realiza en un frotis de una muestra biológica o el sedimento de centrifugación obtenido después de la fluidificación-descontaminación de los productos patológicos contaminados. Se usan dos tinciones: tinción de Ziehl-Neelsen (microscopía convencional) y tinción de auramina (microscopía de fluorescencia). Este es un examen fundamental, ya que la mayoría de los casos de tuberculosis en los países de alta incidencia se diagnostican de esta manera en los centros periféricos de microscopía. El examen microscópico también sigue siendo el punto de partida del esquema de diagnóstico adoptado en los laboratorios de diagnóstico de los países desarrollados. El examen microscópico es fácil de realizar (poco material, personal poco calificado), con resultados rápidos (2 a 3 horas) y de bajo coste. Sin embargo, este examen tiene varios inconvenientes: una realización que depende del operario, una interpretación subjetiva del resultado, una falta de sensibilidad (detección del 50 al 70 % de los casos de tuberculosis pulmonar), así como una ausencia de identificación de la especie implicada. Sus rendimientos son incluso más reducidos en pacientes infectados por el VIH y en niños (muestras paucibacterianas).

Con respecto a la detección bacteriológica de tuberculosis y micobacteriosis en seres humanos y animales, así como la de la contaminación ambiental, la técnica de referencia sigue siendo el cultivo en un medio adecuado (sólido: Coletsos, Lowenstein-Jensen, Middlebrook 7H11 o líquido: Middlebrook 7H9) opcionalmente suplementado con antibióticos y antifúngicos. El cultivo de bacterias a partir de esputos, homogenados tisulares, otras muestras biológicas o muestras ambientales se usa comúnmente y tiene la ventaja de ser sensible. Los sistemas de cultivo líquido automatizados como Bactec MGIT™ (Becton Dickinson) o BacT/Alert® (Bio Mérieux) combinan la incubación y la medición espectroscópica del crecimiento bacteriano. Sin embargo, este método solo permite un diagnóstico tardío ya que, desde un punto de vista microbiológico y de cultivo, las micobacterias tuberculosas y una parte de las micobacterias atípicas son microorganismos de crecimiento lento: es necesario un mínimo de 1 a 6 semanas de incubación a 37 °C para observar el crecimiento de la bacteria en los medios de cultivo. Sea cual sea la naturaleza de la muestra, un tratamiento previo de descontaminación asociado o no a la fluidificación con agentes fisicoquímicos (N-acetilcisteína - sosa, hipoclorito sódico, ácidos, detergentes) es indispensable antes de su cultivo para prevenir el desarrollo de microorganismos de crecimiento rápido, reduciendo la sensibilidad del método. Después del cultivo, la identificación de la especie puede realizarse mediante métodos de hibridación de ADN opcionalmente acoplados a PCR, secuenciación génica, genotipado (secuencias de inserción, espoligotipado...), mediante identificación de biomarcadores (análisis de ácidos micólicos por cromatografía en fase líquida, perfil proteico por espectrometría de masas de tipo MALDI-TOF, por ejemplo). Sin embargo, todas estas técnicas requieren equipos de laboratorio costosos y personal altamente cualificado y, por tanto, no son adecuadas para diagnóstico rápido y deslocalizado de infecciones micobacterianas.

En la actualidad, debido a su rapidez (devolución del resultado en el día), los métodos de biología molecular también se usan ampliamente en laboratorios de diagnóstico para seres humanos, animales y el medio ambiente. Al basarse en la amplificación específica de genes micobacterianos diana, permiten tanto la detección de la bacteria como su identificación, incluso sus posibles resistencias a antibióticos (solo diagnóstico humano). Sin embargo, su uso requiere generalmente infraestructuras adecuadas, equipos caros así como personal cualificado (extracción de ADN e interpretación de los resultados). La tecnología GeneXpert® desarrollada por el laboratorio Cepheid para el diagnóstico molecular de la tuberculosis humana limita los inconvenientes mencionados anteriormente gracias al uso de un sistema automatizado que realiza todas las etapas sin intervención humana. El resultado obtenido en 2 horas permite detectar la presencia de una micobacteria tuberculosa así como su potencial resistencia a la rifampicina, antibiótico de primera línea usado en el tratamiento de la tuberculosis humana. Sin embargo, su precio constituye un freno a su generalización en países de bajos ingresos. Además, esta tecnología no permite hacer más de veinte análisis al día.

En animales, el diagnóstico de la tuberculosis se realiza post mortem después de cribado profiláctico o descubrimiento de lesiones en el matadero. Se realiza sobre homogenados de lesiones o ganglios linfáticos. Al igual que en el ser humano, las muestras pueden cultivarse después de descontaminación y/o analizarse mediante métodos de biología molecular. Los límites de esta detección son idénticos a los mencionados anteriormente: obtención del resultado retardado con el cultivo y sistemas automatizados de biología molecular caros con personal cualificado.

En cuanto a la detección de micobacterias en el medio ambiente, su búsqueda no está estandarizada y actualmente no hay ninguna norma disponible. El cultivo en un medio adecuado después de la descontaminación química se encuentra con los mismos límites que el de las muestras biológicas: crecimiento lento con resultados tardíos y contaminación de los medios de cultivo por bacterias de crecimiento rápido en particular. La biología molecular ha permitido ignorar esta etapa de cultivo, pero no siempre permite una cuantificación adecuada.

Para proponer nuevos métodos de identificación de micobacterias se contempló la detección de antígenos específicos como Ag MPT64 o los del complejo Antígeno 85 (Ag85). Para ello, se comercializó (SD Bioline TB Ag MPT64, Standard Diagnostic, Inc.) un ensayo inmunocromatográfico basado en la identificación de Ag MPT64 después del cultivo (presente en micobacterias tuberculosas, ausente en atípicas). En la bibliografía se describen ensayos ELISA usados para detectar Ag85 e infiltrados de cultivos líquidos, suero o en líquido cefalorraquídeo (Phunpae et al., Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 78(3):242-248, 2014 [1]; Kashyap et al., BMC infectious diseases, 7:74, 2007 [2]; Kashyap et al., Clin Diagn Lab Immunol., 12(6):752-758, 2005 [3]).

El complejo Antígeno 85 (Ag85) está compuesto por tres proteínas homólogas secretadas: antígeno 85A (Ag85A), antígeno 85B (Ag85B) y antígeno 85C (85C) que comparten una identidad de secuencia elevada (68-79 %) en sus formas maduras secretadas. Se trata de micoliltransferasas (enzimas con un peso molecular de aproximadamente 30.000 Da) que intervienen específicamente en la construcción y mantenimiento de las paredes de las corinebacterias - orden al que pertenece el género Mycobacterium - catalizando la transferencia de ácido micólico a estructuras polisacáridas (arabinogalactano, trehalosa). Más generalmente, Ag85 es una aciltransferasa que no solo es capaz de transferir grupos micolilo sino también otros grupos acilo.

Dado que la detección y la actividad de Ag85 Al se estudia ampliamente para investigación y evaluación de nuevos métodos de diagnóstico y el seguimiento de la eficacia de los tratamientos de quimioterapia antituberculosa (Elamin et al., J Microbiol Methods, 79(3):672-678, 2002 [4]), se han descrito varios métodos espectrofotométricos (UV-visible, fluorescencia, etc...) para el análisis de esta proteína mediante la medición de su actividad de aciltransferasa (Boucau et al., Analytical Biochem., 385:120-127, 2009 [5]; Favrot et al., J. Biol. Chem., 289(36):25031-25040, 2014 [6]).

La solicitud internacional WO 2011/030160 [7] describe un método para detectar la presencia de micobacterias en un organismo o una muestra biológica demostrando la actividad catalítica de Ag85 durante la etapa de cultivo. Para ello, se sintetizaron sondas moleculares compuestas por un polisacárido (trehalosa y otros derivados osídicos) marcado (radiotrazador, fluoróforo, nanopartículas, biotina) y se añadieron al medio de cultivo para su incorporación a la pared de las bacterias en el transcurso del crecimiento bacteriano gracias a la actividad de transferasa de Ag85. Al final de esta etapa, las bacterias se enjuagan y se aíslan del medio de cultivo y después se detectan mediante una técnica adecuada (contador de centelleo, fluorómetro, microscopía, RMN, técnicas de imagen in vivo, etc...). Sin embargo, este método, que permite la detección de micobacterias viables marcándolas, solo puede contemplarse para el análisis de muestras muy contaminadas (del orden de 107 bacilos.ml-1) o después de una etapa de cultivo suficientemente larga. Además, se requieren varias etapas de enjuague de bacterias para eliminar el exceso de sonda marcada no incorporada. Finalmente, la detección del marcador se realiza mediante técnicas instrumentales de laboratorio frágiles y caras que requieren de personal cualificado para su realización e interpretación de los resultados.

La solicitud de patente CN102087283 [8] describe un método de detección electroquímica de M. tuberculosis usando un inmunosensor enzimático basado en una solución de quitosano, nanopartículas de oro y un anticuerpo específico para la pared celular de M. tuberculosis. La medición cuantitativa se realiza comparando la señal del producto generada por la fosfatasa alcalina en presencia de a-naftilfosfato antes y después de incubación con la muestra. Sin embargo, aunque este método se ha aplicado a la detección de M. tuberculosis en muestras de leche, su uso no puede contemplarse en el diagnóstico de rutina. De hecho, el uso de electrodos de carbono vítreo para la construcción del inmunosensor es muy restrictivo: pulir la superficie y limpiar en una mezcla piraña (ácido sulfúrico y peróxido de hidrógeno) antes de cada nuevo uso. Además, la preparación de la superficie sensible del inmunosensor requiere varias etapas: 1 ) electrodeposición de una solución que contiene nanopartículas de oro, quitosano y un anticuerpo de cabra anti-ratón marcado con una fosfatasa alcalina y después 2) incubación de una solución de anticuerpo anti-M. tuberculosis producido en ratones. Finalmente, una vez construido, el inmunosensor debe conservarse a 4 °C.

Por tanto existe la necesidad de un método para detectar micobacterias que sea sencillo y rápido de realizar y que supere los inconvenientes de los métodos de la técnica anterior.

Descripción de la invención

Con el fin de satisfacer esta necesidad de un ensayo de diagnóstico más eficaz para la tuberculosis humana, animal y/o ambiental, para la que hasta la fecha no existe una solución adecuada, los inventores han desarrollado un nuevo método electroquímico capaz de detectar rápidamente (obtención de resultados en aproximadamente 2 a 5 h) la presencia o ausencia de micobacterias en muestras como por ejemplo en un medio de cultivo y en muestras respiratorias humanas: el método EDMYC (Electrochemical Detection of MYCobacteria).

Por tanto, los inventores han desarrollado un nuevo método de detección electroquímica de micobacterias mediante la medición electroquímica de la actividad de aciltransferasa en micobacterias, en particular la actividad catalítica de Ag85 en presencia de un sustrato enzimático, por ejemplo p-aminofenil-6-O-octanoil-p-D-glucopiranósido (p-AP-OG) y un cofactor o cosustrato, por ejemplo trehalosa. De hecho, como Ag85 es excretado muy ampliamente por micobacterias, por ejemplo, por Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium bovis, en medios de cultivo líquidos, la detección de la actividad de aciltransferasa, en particular la actividad catalítica de Ag85, en el medio de cultivo permite demostrar la presencia de micobacterias.

El principio de la invención se basa en el hecho de que las aciltransferasas tales como Ag85 hidrolizan el enlace éster del sustrato y transfieren el grupo acilo liberado así al cofactor. A continuación, el producto se detecta mediante voltamperometría. De acuerdo con una realización particular, la presente invención se basa en la capacidad de las aciltransferasas, en particular de Ag85, para hidrolizar el enlace éster del p-AP-OG y transferir el grupo octanoílo del p-AP-OG a un azúcar, por ejemplo, trehalosa, de acuerdo con un mecanismo de ping-pong, para generar respectivamente p-aminofenil-p-D-glucopiranósido (p-AP-G) y formar acil-trehalosa (figura 1). La diferencia entre los potenciales de los picos de oxidación de p-AP-OG y p-AP-G observados en los voltamogramas (o voltamperogramas) (figura 2), que se explica respectivamente por la presencia o ausencia del grupo octanoílo en la molécula, hace posible, por tanto, la detección específica de la actividad de aciltransferasa, en particular la actividad catalítica de Ag85, en presencia de p-AP-OG. La intensidad del pico de oxidación del p-AP-G, elegida como respuesta analítica, es proporcional a la cantidad de aciltransferasas, en particular Ag85, y por tanto a la de las micobacterias presentes en la muestra analizada.

Por tanto, los inventores han desarrollado un método de detección simple y rápida de micobacterias y su viabilidad con o sin etapa de cultivo previa.

Hasta la fecha, la prueba de concepto del método se ha demostrado con éxito con la detección de varias especies de micobacterias que se encuentran frecuentemente en infecciones pulmonares, incluyendo M. tuberculosis - el principal agente de tuberculosis en seres humanos - en cultivos líquidos y sólidos. El método tiene muchas ventajas con respecto al examen microscópico como su sencillez de realización o incluso una fácil interpretación de los resultados (medición cuantificada) con un dispositivo pequeño, portátil y económico. Además, con respecto a los métodos ópticos, la técnica electroquímica resulta especialmente ventajosa ya que permite el análisis de muestras turbias o coloreadas, con la posibilidad de ofrecer una medida cuantificada, con buena sensibilidad, usando sensores serigrafiados de un solo uso. Por tanto, cumple perfectamente con las especificaciones impuestas por la OMS para un ensayo capaz, por ejemplo, de sustituir al examen microscópico de los frotis de esputos.

Además, los inventores han demostrado una mejora de la especificidad del método de detección frente a micobacterias y Ag85 al proponer 1) el uso de un sustrato de la enzima con grupos acilo que tienen cadenas de carbono más largas que la del p-AP-OG, por ejemplo, cadenas de alquilo que varían de C7H15 a C29H59, y/o 2) un método de extracción y descontaminación de muestras reales para aislar micobacterias.

Por tanto la presente invención tiene como objetivo un método de detección electroquímica de micobacterias en una muestra biológica, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) seleccionar un sustrato de al menos una aciltransferasa y su cofactor;

b) poner en contacto dicha muestra biológica con dichos sustrato y cofactor;

c) detectar electroquímicamente el producto resultante de la actividad catalítica de dicha al menos una aciltransferasa.

De acuerdo con una realización particular del método de detección de la presente invención, la muestra biológica se elige entre el grupo formado por: cultivos bacterianos, muestras biológicas de origen humano o animal, muestras ambientales, etc. Un cultivo bacteriano puede obtenerse, por ejemplo, en una gelosa nutriente o en un medio de cultivo líquido, de acuerdo con técnicas bien conocidas por el experto en la materia. Una muestra biológica de origen humano puede ser, por ejemplo, una muestra de origen pulmonar (esputos, secreciones bronquiales, biopsia), una muestra de sangre, una muestra de líquido cefalorraquídeo, una muestra de orina, una muestra de origen intestinal (biopsia intestinal, heces), así como cualquier otra muestra tisular. Una muestra biológica de origen animal puede ser, por ejemplo, una muestra tisular (ganglio linfático, pulmón, hígado, bazo...), una muestra fecal o una muestra de leche. Una muestra de origen ambiental puede ser, por ejemplo, una muestra de aguas residuales o aguas residuales hospitalarias, una muestra de aguas residuales tratadas, una muestra de lodos obtenidos del tratamiento de aguas residuales o una muestra de suelo.

De acuerdo con una realización particular del método de detección de la presente invención, el sustrato de aciltransferasa se elige entre el grupo formado por: p-aminofenil-6-O-octanoil-p-D-glucopiranósido, sustratos con grupos acilo que tienen cadenas de alquilo que varían de C7H15 a C29H59.

De acuerdo con una realización particular del método de detección de la presente invención, el cofactor es un azúcar elegido entre el grupo formado por: trehalosa, D-glucosa.

Preferentemente el sustrato es p-aminofenil-6-O-octanoil-p-D-glucopiranósido, y el cofactor es trehalosa. El producto formado después de hidrólisis enzimática por las aciltransferasas, en particular Ag85, es p-aminofenil-p-D-glucopiranósido.

De acuerdo con una realización particular del método de detección de la presente invención, la etapa de detección electroquímica c) se realiza usando un sensor amperométrico, químicamente modificado (por ejemplo, con nanotubos de carbono, grafeno) o no. Preferentemente dicho sensor es un sensor serigrafiado, preferentemente de un solo uso. De acuerdo con la invención, un medio de análisis electroquímico para realizar la invención puede ser una medición potenciométrica, una medición de impedancia, una medición culombimétrica o una medición amperométrica.

De acuerdo con una realización ventajosa del método de detección de la presente invención, el análisis electroquímico se realiza mediante una medición amperométrica.

En el sentido de la presente invención, por "medición amperométrica" se entiende una medición de corriente eléctrica en función de una diferencia de potencial establecida entre el electrodo de trabajo y el electrodo de referencia. La medición de la corriente eléctrica se puede realizar mediante técnicas amperométricas conocidas, preferentemente mediante una voltamperometría de barrido de potencial que puede ser lineal, cíclica, de pulsos o incluso del tipo salto de potencial, tal como cronoamperometría.

En una realización particularmente ventajosa del método de detección de la presente invención, la presencia de p-aminofenil-p-D-glucopiranósido se mide mediante voltamperometría cíclica o lineal.

La realización de estas técnicas requiere un montaje que puede ser de dos o incluso tres electrodos, es decir, un montaje que comprende un electrodo de trabajo, un electrodo de referencia y opcionalmente un electrodo auxiliar (contraelectrodo). El electrodo de trabajo, cuya superficie sirve como lugar para la transferencia de electrones, puede ser a base de carbono o un metal noble o incluso a base de óxido metálico. El electrodo de referencia es un electrodo con un potencial constante, que permite imponer un potencial definido con precisión sobre el electrodo de trabajo. El electrodo de referencia puede ser un electrodo de Ag/AgCl. El contraelectrodo, que establece el paso de la corriente eléctrica con el electrodo de trabajo, puede estar fabricado con un material inerte, tal como platino o carbono. El experto en la materia sabrá elegir y combinar los electrodos apropiados de acuerdo con sus conocimientos generales. Con respecto al modo de fabricación de los electrodos, la técnica de serigrafía es preferente, aunque pueden contemplarse otros métodos de fabricación industrial tales como rotagrabado, impresión por chorro de tinta, 3D u opcionalmente fotolitografía. Los electrodos obtenidos por serigrafía son particularmente adecuados porque pueden producirse en masa con un coste bajo y, por tanto, opcionalmente son de un solo uso. Además, tanto su forma geométrica como su tamaño se pueden modular fácilmente. Estos electrodos pueden serigrafiarse en forma de sensor y opcionalmente integrarse en el fondo de los pocillos de una microplaca u otros soportes o sistemas que permitan la filtración de suspensiones bacterianas y la incubación de p-aminofenil-6-O-octanoil-p-D-glucopiranósido y trehalosa. De acuerdo con una realización particular del método de detección de la presente invención, la medición amperométrica se realiza con un sensor serigrafiado. Permite realizar la medición en un pequeño volumen de solución del orden de varios microlitros.

De acuerdo con una realización particular del método de detección de la presente invención, la medición amperométrica se realiza con un dispositivo que implica tres electrodos: un electrodo de referencia de Ag/AgCl, un electrodo de trabajo de carbono y un contraelectrodo de carbono.

De acuerdo con otra realización particular del método de detección de la presente invención, la medición amperométrica se realiza con un sensor serigrafiado que comprende un electrodo de referencia de Ag/AgCl, electrodo de trabajo de carbono y un contraelectrodo de carbono.

La presencia del p-aminofenil-p-D-glucopiranósido se indica por la presencia de una corriente de oxidación anódica en un intervalo de potenciales y la ausencia de dicha corriente para un control desprovisto de p-aminofenil-6-O-octanoil-p-D-glucopiranósido hidrolizado.

Cuando el p-aminofenil-p-D-glucopiranósido se somete a una medición por voltamperometría cíclica, su presencia se indica mediante un pico de corriente de oxidación anódica específico para el p-aminofenil-p-D-glucopiranósido en un intervalo de potenciales determinado (+0,3 a 0,5 V frente a Ag/AgCl).

Preferentemente, la muestra biológica a analizar se prepara para aislar las micobacterias que contiene y eliminar la mayor cantidad de contaminantes antes de las etapas de contacto y detección. Para ello, es necesaria una etapa de extracción con un disolvente apolar tal como por ejemplo hexano para aislar selectivamente las micobacterias - cuya pared es muy hidrófoba - de la muestra disuelta previamente en un fluidificante tal como N-acetilcisteína para una muestra de origen respiratorio o en un tampón fosfato de pH neutro para una muestra de suelo, por ejemplo. En el caso de muestras complejas como el suelo, donde pueden coexistir millones de especies bacterianas diferentes, la etapa de extracción puede ir seguida de una descontaminación del extracto con, por ejemplo, un ácido (HCl, H2SO4) y/o una base (NaOH) o un amonio cuaternario.

Por tanto, la presente invención también tiene como objetivo un método de aislamiento de micobacterias de una muestra biológica, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) poner en solución dicha muestra biológica;

b) tratar con un disolvente apolar la solución obtenida en la etapa a); y

c) recuperar las micobacterias por filtración o centrifugación de la solución obtenida en la etapa b); y d) recuperar las micobacterias del filtrado o sedimento de centrifugación obtenido al final de la etapa c).

De acuerdo con una realización particular del método de aislamiento de micobacterias de la presente invención, la etapa de extracción b) se realiza con una solución de hexano o una mezcla de hexano-isopropanol.

De acuerdo con una realización particular del método de aislamiento de micobacterias de la presente invención, el método puede comprender además una etapa de descontaminación a') de la muestra biológica puesta en solución al final de la etapa a) y antes de la etapa b), y/o una etapa de descontaminación c') de la membrana filtrante al final de la etapa c) y antes de la etapa d), con soluciones ácidas (por ejemplo, solución de ácido clorhídrico) y/o básicas (por ejemplo, solución de sosa o amonio cuaternario), y/o adición de hipoclorito sódico, y/o con al menos otro compuesto desinfectante (por ejemplo, chlorhexidina o escualamina).

De acuerdo con una realización particular del método de aislamiento de micobacterias de la presente invención, la etapa c') puede ir seguida, antes de la etapa d), por una etapa de enjuague c"), por ejemplo en presencia de tampón fosfato, para eliminar el hipoclorito sódico (lejía) del filtro (preferentemente de teflón).

De acuerdo con una realización particular del método de aislamiento de micobacterias de la presente invención, la etapa d) de recuperación de micobacterias se realiza raspando el filtro con un asa bacteriológica (asa) para despegar las células del filtro. A continuación las micobacterias recuperadas de ese modo se colocan en cultivo en un medio apropiado (medio 7H11 enriquecido y suplementado), durante aproximadamente dos meses, a 37 °C, para permitir su recuento.

La presente invención también tiene como objetivo un kit para realizar el método de detección electroquímica de micobacterias en una muestra biológica de acuerdo con la presente invención, comprendiendo dicho kit:

a) un dispositivo y reactivos para recogida y preparación de la muestra biológica a analizar;

b) un dispositivo que comprende un sustrato de Ag85 y su cofactor para incubación con Ag85;

c) un dispositivo para detección electroquímica mediante un lector adecuado.

Por "dispositivo" de la etapa a), en el sentido de la presente invención, se entiende un recipiente hermético, preferentemente desechable, por ejemplo un tubo o una columna de un solo uso equipado con un sistema de filtración en el que se realizan las etapas de dilución de la muestra, extracción, descontaminación, si fuera necesaria, y recuperación de micobacterias.

Por "dispositivo" de la etapa b), en el sentido de la presente invención, se entiende un recipiente hermético, preferentemente de un solo uso, por ejemplo un tubo de un solo uso equipado con un sistema de filtración en el que se realiza la incubación de las micobacterias con el sustrato y el cosustrato.

Por "dispositivo para la detección electroquímica" de la etapa c), en el sentido de la presente invención, se entiende, por ejemplo, un sensor amperométrico, preferentemente serigrafiado y de un solo uso, por ejemplo los comercializados por las compañías Dropsens y Palmsens. El sensor amperométrico puede estar opcionalmente integrado en el dispositivo de la etapa b. Como ejemplo de lector adecuado, se pueden mencionar los lectores portátiles basados en el principio del glucómetro, por ejemplo los comercializados por las compañías Dropsens y Palmsens y que permiten realizar las mediciones en varios segundos.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 representa el esquema del principio de la reacción enzimática catalizada por Ag85 con p-AP-OG y trehalosa como sustrato y cosustrato, respectivamente.

La figura 2 representa los voltamogramas lineales (v = 50 mV.s'1) de una solución de sustrato (p-AP-OG; S) y producto (p-AP-G; curva de línea discontinua; P) a 5 x 10-4 M en PBS (pH 7,5) - DMSO al 0,2 %.

La figura 3 representa los voltamogramas lineales (v = 50 mV.s'1) registrados para una solución de Ag85 (16 jg .m l-1) incubada durante 4 h a 37 °C con p-AP-OG (2 x 10-4 M) y trehalosa (10 mM) en PBS en presencia (curva de línea discontinua) y en ausencia (curva de línea continua) de p-AP-G (10-4 M). La curva con línea ------corresponde al voltamograma obtenido después de incubación en las mismas condiciones de una solución de p-AP-OG (2 x 10-4 M) en PBS. Volúmenes de reacción = 15 |jl.

La figura 4 representa las etapas realizadas durante la detección de Ag85 en el sobrenadante de un cultivo de micobacterias.

La figura 5 representa los voltamogramas lineales (v = 50 mV.s-1) registrados después de la realización del protocolo de la Figura 4 para el análisis de 5 ml de medio 7H9 (curva de línea continua) y 5 ml de cultivo de M. bovis BCG (1,1 x 107 ufc.ml-1).

La figura 6 representa las etapas realizadas durante la detección de Ag85 en el sedimento bacteriano resultante de un cultivo de micobacterias.

La figura 7 representa los voltamogramas lineales (v = 50 mV.s-1) registrados analizando volúmenes de 10 ml de un cultivo líquido de M. bovis BCG a 2 x 106 ufc.ml-1 de acuerdo con los protocolos de las Figuras 4 y 6. La curva con línea — corresponde a la respuesta registrada por el sobrenadante y la de línea contínua se obtuvo para el análisis de los sedimentos bacterianos.

La figura 8 representa los voltamogramas lineales (v = 50 mV.s-1) registrados analizando 1 ml de medio de cultivo 7H9 OADC (control negativo; curva de línea continua) que contiene (A) M. intracellulare, (B) M. avium y (C) M. xenopi a ~106 bacilos.ml-1 (curvas en línea — ) analizadas de acuerdo con el protocolo descrito en el párrafo 1.5. La figura 9 representa los voltamogramas lineales (v = 50 mV.s-1) registrados para el análisis cualitativo de un cultivo líquido de M. tuberculosis (A) sobrenadante de cultivo, (B) sedimento bacteriano y (C) de colonias aisladas de M. tuberculosis de acuerdo con el protocolo descrito en el párrafo 1.6. Las curvas en línea — corresponden a la respuesta de M. tuberculosis mientras que las curvas en línea continua se obtuvieron para el control negativo. La figura 10 representa los voltamogramas lineales (v = 50 mV.s-1) registrados después de la realización del protocolo descrito en el párrafo 1.7 para el análisis de 1 ml de esputo inoculado con 106 bacilos de M. intracellulare (curva en línea discontinua) o no inoculado (curva de línea continua).

La figura 11 representa el voltamograma lineal (v = 50 mV.s-1) registrado analizando 1 ml de cultivo de M. intracellulare a ~105 bacilos.ml-1 de acuerdo con el protocolo descrito en el párrafo 1.5., así como los valores i p-AP-OG e i p-AP-G necesarios para calcular la respuesta analítica R.

Ejemplos

Ejemplo 1: Material y métodos

1.1. Reactivos y soluciones

- El p-aminofenil-6-O-octanoil-p-D-glucopiranósido (C20H31NO7; p-AP-OG) así como el p-aminofenil-6-p-D-glucopiranósido (C12H17NO6; p-AP-G) se sintetizaron en el Instituto de Química Molecular de la Universidad de Bourgogne.

- La trehalosa y el dimetilsulfóxido (DMSO) fueron proporcionados por Sigma-Aldrich.

- Ag85B de Mycobacterium tuberculosis (Ag 85; ab73632) se adquirió en Abcam y se reconstruyó de acuerdo con las recomendaciones del proveedor.

- El hexano y el isopropanol provienen del laboratorio Carl Roth.

- El tampón fosfato (16,7 mM de NaH2PO4, 2 H2O; 33,3 mM de Na2HPO4, 12 H2O - pH 7,550 mM) se preparó con agua Milli-Q 18 MO (Sistema Millipore).

- Los medios líquidos (Base de caldo de cultivo Middlebrook 7H9, Fluka) y sólido (Base de Agar Middlebrook 7H11, Fluka), así como los componentes del producto de enriquecimiento (ácido oleico, albúmina bovina, dextrosa y catalasa) fueron proporcionados por Sigma-Aldrich. La triptona (peptona de caseína) fue proporcionada por VWR. El suero bovino inactivado por calor fue proporcionado por Dutscher.

- Los tubos de medio líquido BD BACTEC™ MGIT™ (tubos indicadores de crecimiento micobacteriano) fueron proporcionados por Becton Dickinson, así como el suplemento de crecimiento BACTEC™ MGIT™ y el complejo de antibióticos BBL MGIT™ PANTA liofilizado. El medio se preparó de acuerdo con las recomendaciones del distribuidor.

1.2. Cepas y medios de cultivo

- Las cepas de Mycobacterium intracellulare, M. avium ssp. avium, M. bovis BCG cepa Pasteur (cepa de vacuna avirulenta) y M. xenopi fueron proporcionadas por el Laboratorio Nacional de Referencia para la tuberculosis bovina en Maisons-Alfort. La cepa M. avium ssp. paratuberculosis K10 fue proporcionada por INRA en Tours. Estas cepas se manipularon en un laboratorio de contención de tipo L2.

- La cepa de M. tuberculosis H37Rv proviene del Laboratorio asociado al Centro Nacional de Referencia de Micobacterias y Resistencia de Micobacterias a la Antituberculosis (Hospitales Universitarios St Louis-Lariboisiére-F. Widal). Como las cepas de M. tuberculosis pertenecen a la categoría de riesgo infeccioso "Clase 3", todos los experimentos con la cepa de M. tuberculosis H37Rv se realizaron en un laboratorio de tipo L3.

- Las cepas de Staphylococcus aureus (DMSZ20231), Staphylococcus epidermidis (DSMZ20044), Pseudomonas monteilii (DMSZ14164), Enterococcus faecalis (DMSZ20478), Enterococcus faecium (DMSZ20477), Escherichia coli (DMSZ30083), y Stenotrophomonas maltophilia (DMSZ50170) se enviaron al Instituto Leibniz DSMZ- Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares.

- Las cepas de Streptococcus pyogenes, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Rhodococcus corallinus, Achromobacter xylosoxidans, Citrobacter freundii, Enterobacter cloacae y Klebsiella pneumoniae fueron amablemente proporcionadas por el INRA y el CHU de Dijon.

- El medio de cultivo líquido se preparó diluyendo 5,9 g de Base de caldo de cultivo Middlebrook 7H9 y 1,25 g de triptona en 1 l de agua milli-Q y después se trató en autoclave 15 minutos a 121 grados.

- El medio de cultivo sólido se preparó diluyendo 18,9 g de Base de agar Middlebrook 7H11 en 800 ml de agua milli-Q y después se trató en autoclave 15 minutos a 121 grados.

Para favorecer el crecimiento de micobacterias, los medios de cultivo líquido y sólido se enriquecieron con un 10 % de una mezcla constituida por ácido oleico, albúmina, dextrosa y catalasa (OADC; Tabla 1). El medio 7H11 también se suplementa con suero bovino inactivado por calor al 10 %. El ácido oleico y los ácidos grasos de cadena larga son esenciales para el metabolismo de las micobacterias. La dextrosa es una fuente de energía. La catalasa permite neutralizar los peróxidos, que pueden ser tóxicos para las bacterias. La albúmina desempeña un papel protector contra los agentes tóxicos.

Tabla 1. Composición del enriquecimiento con OADC

1.3. Sensores y aparato de medición

Las mediciones electroquímicas se realizaron mediante voltamperometría lineal (v = 50 mV.s-1) con un potenciostato 910 PSTAT mini (Metrohm, Francia) alimentado por la conexión USB del ordenador y controlado por el software PSTAT (versión 1.0). Para ello, se depositaron gotas de solución de 30-50 j l sobre la superficie de sensores de carbono serigrafiados de un solo uso proporcionados por Dropsens (DRP-110) y conectados al potenciostato a través del conector (DRP-DSC). La detección amperométrica del producto generado durante la reacción catalizada por Ag85 siempre se realizó después de una etapa de filtración de la mezcla de reacción con un dispositivo de filtración (Microcon 10 kDa, Millipore). Todos los potenciales se miden contra el electrodo de referencia Ag/AgCl.

1.4. Detección de Ag85 en el sobrenadante de un cultivo líquido de M. bovis BCG

El principio de este protocolo de 7 etapas se muestra esquemáticamente en la Figura 4. Cuatro ml de un cultivo de M. bovis BCG de tres semanas se centrifugaron a 4000 x g durante 6 min. (etapa 1). El sobrenadante se recuperó (etapa 2) y se depositó en el reservorio de un dispositivo de filtración Amicon® Ultra 4 ml (porosidad de 50 kD dejando pasar el complejo Ag85, Merck Millipore, Francia) para eliminar las proteínas interferentes del medio de cultivo, en particular BSA y catalasa, y se centrifugó 10 min. a 7000 x g (etapa 3). El filtrado se deposita en el reservorio de un segundo Amicon® Ultra 4 ml de porosidad 10 kD permitiendo la concentración del complejo Ag85 después de centrifugación 10 min. a 7000 x g. La membrana filtrante se enjuaga con 500 j l de PBS y se centrifuga de acuerdo con los mismos parámetros que anteriormente (etapa 4). El volumen retenido por la membrana (200-250 j l ) a continuación se deposita en un dispositivo Microcon® de porosidad 10 kD, se centrifuga 20 min. a 14000 x g a continuación se enjuaga con PBS (etapa 5). El dispositivo de filtración se voltea y se centrifuga 3 min. a 1000 x g para desprender el complejo Ag85 (volumen final de aproximadamente 80 j l ) (etapa 6). Finalmente se añaden 10 j l de una solución de trehalosa a 5 x 10-3 M en PBS y 10 j l de una solución de p-AP-oG a 2 x 10-3 M en PBS al filtrado. Después de incubación a 37 °C durante 24 h, el medio de reacción se filtra sobre un dispositivo Microcon® de porosidad 10 kD (15 min. a 14000 x g) después 30 j l de filtrado se depositan en el sensor y se analiza por voltamperometría (etapa 7).

1.5. Detección de Ag85 en el sedimento bacteriano obtenido a partir de cultivos líquidos de M. intracellulare, M. avium y M. xenopi

Los volúmenes de 1 ml de cultivo líquido de cada especie de micobacteria (~106 bacilos.ml-1) se centrifugaron a 6000 x g durante 6 minutos. Una vez eliminado el sobrenadante, los sedimentos bacterianos se enjuagaron con 1 ml de PBS y a continuación se centrifugó a 6000 x g durante 6 minutos. Después de eliminar el sobrenadante, 10 j l de p-AP-OG a 2 x 10-3 M, y 10 j l de trehalosa a 5 x 10-3 M se añaden a los sedimentos bacterianos. Después de una etapa de incubación de 4 horas a 37 °C con agitación, la medición electroquímica del producto de la reacción enzimática se realizó de acuerdo con el protocolo descrito en el párrafo 1.3.

Un control negativo (medio 7H9 enriquecido sin bacterias) se analizó por duplicado de la misma manera.

1.6. Detección de Ag85 en M. tuberculosis

1.6.1. Cultivo líquido

Dos muestras de 7,5 ml de cultivo líquido de M. tuberculosis (~107 bacilos.ml'1) se centrifugaron a 7000 x g durante 10 minutos. Para analizar por separado el sedimento bacteriano y el sobrenadante, este último se transfirió a tubos estériles.

* Análisis del sedimento bacteriano:

Cada sedimento bacteriano se pagó añadiendo 100 j l de PBS, a continuación el líquido se eliminó volteando el tubo sobre un papel absorbente (Whatman). 20 j l de p-AP-OG a 2 x 10'3 M y 20 j l de trehalosa a 5 x 10'3 M se añadieron a los tubos y se incubó 4 horas a 37 °C sin agitación. Los controles negativos (PBS) se analizaron por duplicado de la misma manera. La medición electroquímica del producto de la reacción enzimática se realizó de acuerdo con el protocolo descrito en el párrafo 1.3.

* Análisis del sobrenadante:

Seis ml de cada sobrenadante de cultivo se centrifugaron a 7000 x g durante 20 min., en un dispositivo de Filtración Amicon 50 kDa (Millipore). El líquido filtrado se transfirió a un dispositivo de filtración Amicon 10 kDa, a continuación se centrifugó a 7000 x g durante 20 min. Entonces el filtro se nos pagó con 1 ml de PBS, a continuación se centrifugó a 7000 x g durante 20 min. El volumen de líquido residual que permanece sobre el filtro se transfirió a un tubo en el que se añadieron 30 j l de p-AP-OG a 2 x 10'3 M y 30 j l de trehalosa a 5 x 10'3 M. La mezcla de reacción se incubó 4 horas a 37 °C sin agitación. Un control negativo (medio 7H9 enriquecido sin bacterias) se analizó por duplicado de la misma manera. La medición electroquímica del producto de la reacción enzimática se realizó de acuerdo con el protocolo descrito en el párrafo 1.3.

1.6.2. Colonias aisladas

Varias colonias mantenidas en una gelosa 7H11 se depositaron en un tubo de 2 ml. Las colonias se enjuagaron con PBS, los tubos se centrifugaron el sobrenadante se eliminó. Se añadieron 20 pl de p-AP-OG a 2 x 10-3 M y 20 pl de trehalosa a 5 x 10'3 M a los tubos y se incubó 4 horas a 37 °C sin agitación. Un control negativo (PBS) se analizó por duplicado de la misma manera. La medición electroquímica del producto de la reacción enzimática se realizó de acuerdo con el protocolo descrito en el párrafo 1.3.

1.7. Extracción y detección de M. intracellulare en una muestra de origen respiratorio

Las muestras respiratorias (esputos, productos de aspiración traqueal y aspiración bronquial) de pacientes no tuberculosos fueron proporcionadas por el CHU de Dijon. Las muestras se fluidificaron previamente en el CHU de Dijon con el kit Digest-EUR (Eurobio).

Los volúmenes de 1 ml de muestra respiratoria se distribuyeron en tubos estériles de 15 ml, a continuación se incubó con 200 pl de un cultivo líquido de M. intracellulare que contenía 106 bacilos o 200 pl de medio líquido estéril (control negativo) durante 1 noche a 37 °C.

* Extracción de M. intracellulare

Se añadieron 9 ml de mezcla de hexano-isopropanol (3:2, v/v) a cada tubo de muestra respiratoria y se agitó durante 1 minuto. Después de una etapa de centrifugación a 3000 x g durante 2 minutos. El sobrenadante (es decir, hexano, y la interfaz) se extrajo, a continuación se filtró al vacío sobre una membrana (Durapore, 25 mm; 0,45 pM). Una vez enjuagada con PBS, la membrana se depositó en un pequeño sobre de polietileno con cierre ZIP adaptado a las dimensiones de la membrana.

* Detección electroquímica de M. intracellulare en el extracto

Un volumen de 100 pl de la mezcla de sustrato a 2 x 10'3 M y trehalosa a 5 x 10'3 M preparado en PBS se introdujo en el sobre antes de su cierre. Después de una etapa de incubación a 37 °C durante 4 horas, la medición electroquímica del producto de la reacción enzimática se realizó de acuerdo con el protocolo descrito en el párrafo 1.3.

1.8. Extracción y detección de M. bovis BCG en una muestra de suelo

* Extracción de M. bovis BCG

Los microcosmos de suelo se prepararon a partir de un suelo arcillo-limoso de pH 7,75 tratados en autoclave dos veces 15 min a 121 °C a 48 h de intervalo para liberarse de la flora microbiana endógena. Se prepararon microcosmos de 5 g de suelo estéril en tubos Falcon de 45 ml, luego se inocularon con M. bovis BCG (2,6 x 106 ufc). Después de 12 h de incubación a temperatura ambiente en la oscuridad, cada microcosmos se sometió al siguiente protocolo de extracción. Un volumen de 15 ml de tampón fosfato 0,1 M se añadió a cada microcosmo, a continuación el suelo se resuspendió agitando vorticialmente durante 2 min. A continuación, se añadió un volumen de 10 ml de hexano a la suspensión de suelo para extraer selectivamente los microorganismos del suelo que tenían una envoltura hidrófoba. Esta mezcla se agitó durante 15 min en un agitador rotatorio. Cada tubo se centrifugó durante 10 min a 4000 x g (rotor basculante de cubeta, centrifugadora Beckman GS-15R) para separar las diferentes fases líquidas y sedimentar las partículas de suelo en el fondo del tubo. La interfaz que contiene los microorganismos diana se encuentra entre la fase acuosa y la fase orgánica. Se extrajo con una pipeta y un cono de 1 ml cuya punta se cortó y luego se depositó sobre una membrana filtrante de teflón de 2,5 cm con una porosidad de 0,45 pM (Durapore, Millipore, Francia). La membrana se sometió a filtración por aspiración al vacío para eliminar la fase líquida y concentrar las bacterias en la membrana. Esta se colocó en un pastillero que contenía 1 ml de tampón fosfato para la etapa de descontaminación.

* Descontaminación del extracto y recuento

Esta etapa es muy útil, incluso indispensable para eliminar la flora microbiana edáfica interferente del suelo. Para ello, el protocolo de descontaminación combinó una descontaminación ácida (adición de 100 pl de ácido clorhídrico al 4 %, incubación durante 20 min.) con un pH estimado de 1,3 y una descontaminación básica (adición de 200 pl de sosa al 4 %, incubación durante 20 min.) con un pH estimado de 12,6, luego la mezcla se neutralizó mediante la adición de 100 pl de ácido clorhídrico antes de añadir 1 ml de mezcla de hipoclorito sódico y sosa. Después de 15 minutos de incubación, el sobrenadante se extrae, se deposita sobre una nueva membrana filtrante De teflón y se enojó con 20 ml de tampón fosfato 0,1 M para eliminar la lejía. La membrana entonces se depositó en un nuevo pastillero que contenía 1 ml de 7H9 enriquecido y se raspó con un asa bacteriológica (asa) para despegar las células del filtro. Para hacer el recuento de las micobacterias extraídas, se inocularon 100 pl de cada suspensión final por triplicado sobre 7H11 enriquecido y suplementado, y se incubó dos meses a 37 °C.

Ejemplo 2: Resultados

2.1. Comportamiento voltamétrico de p-AP-OG y p-AP-G

Los voltamogramas presentados en la Figura 2 muestran que es posible distinguir la respuesta voltamperométrica del sustrato p-AP-OG (S) de la del producto p-AP-G (P). De hecho, los picos de oxidación detectados a potenciales de ~+0,2 V y ~+0,4 V (frente a Ag/AgCl) se registraron respectivamente para p-AP-OG y p-AP-G. Esta diferencia de potencial de pico, relacionada con la presencia o ausencia del grupo octanoílo electroatractor, indica que p-AP-OG puede usarse como sustrato para la detección amperométrica de la actividad de aciltransferasa de Ag85.

De hecho, como se muestra en el esquema de la Figura 1, Ag85 es capaz de hidrolizar el enlace éster del p-AP-OG y transferir el grupo octanoílo a la trehalosa para generar respectivamente p-AP-G y acil-trehalosa de acuerdo con un mecanismo de ping-pong. Por tanto, la intensidad del pico de oxidación del p-AP-G medido hacia ~+0,4 V frente a Ag/AgCl puede elegirse como respuesta analítica ya que su valor es proporcional a la cantidad de p-AP-G producido, por tanto a la de Ag85 e indirectamente a la de las micobacterias presentes en la muestra a analizar.

2.2. Detección electroquímica de la actividad de aciltransferasa de la proteína Ag85

Para demostrar la actividad aciltransferasa de Ag85 en presencia de p-AP-OG y un aceptor de grupos acilo, la mezcla de reacción que contenía la proteína Ag85, p-AP-OG y trehalosa se incubó en presencia y ausencia de p-AP -G con agitación durante 4 horas a 37 °C. En paralelo, un control negativo que contenía solo p-AP-OG se analizó en las mismas condiciones.

Como se muestra en la serie de voltamogramas presentada en la Figura 3, la curva registrada para el control negativo (curva con línea — ) presenta un potencial de pico de oxidación del p-AP-OG hacia ~+0,2 V frente a Ag/AgCl mientras que la respuesta voltamétrica obtenida en presencia de Ag85 (curva de línea continua) tiene dos picos de oxidación situados hacia ~+ 0,4 y 0,55 V frente a Ag/AgCl, respectivamente.

Un estudio complementario (resultados no mostrados) mostró que el valor del potencial del pico de oxidación del p-AP-OG aumenta en función la concentración de iones cloruro en la solución. Además, las informaciones sobre el Ag85 comercializado indican que la proteína se liofilizó a partir de un tampón que contenía NaCl 0,1 M. Por tanto, los valores más altos de los potenciales del pico de oxidación de p-AP-OG y p-AP-G registrados en presencia de Ag85 se deben probablemente al de los cloruros en la solución.

Para validar esta hipótesis, también se incubó Ag85 en presencia de trehalosa y una mezcla de p-AP-OG y p-AP-G. La comparación de los voltamogramas (curva de línea continua y curva en línea discontinua) de la Figura 3 confirma la identidad de cada pico y muestra que es posible contemplar la detección electroquímica de Ag85 usando p-AP-OG como sustrato.

2.3. Detección electroquímica de la actividad de aciltransferasa de Ag85 en un cultivo líquido de M. bovis BCG Con el objetivo de aplicar el método de detección electroquímica de Ag85 para demostrar el crecimiento de micobacterias en un medio de cultivo líquido, se contempló el análisis del sobrenadante de un cultivo de M. bovis BCG cepa Pasteur (cepa de vacuna y modelo de micobacterias tuberculosas avirulentas) así como el del sedimento bacteriano. Las concentraciones de sustrato y cosustrato, la duración de la reacción de catálisis enzimática, así como la necesidad de incluir una etapa de filtración antes de la medición electroquímica, se estudiaron en una serie de experimentos preliminares.

2.3.1. Análisis del sobrenadante

1. Se demostró que Ag85 es un producto de secreción principal de M. tuberculosis en fase replicativa (Wiker y Harboe, Microbiol. Rev., 56(4): 648-661, 1992) [9]. El protocolo esquematizado en la Figura 4 y descrito en el párrafo 1.4 se realizó para analizar 5 ml de un cultivo de M. bovis BCG que contenía 1,1 x 107 ufc.ml-1. Un control negativo (medio 7H9 enriquecido sin bacterias) se analizó en paralelo de acuerdo con el mismo protocolo y los resultados se presentan en la Figura 5. La respuesta voltamétrica del control negativo (curva de línea continua) corresponde globalmente al pico de oxidación del p-AP-OG situado hacia ~+0,25 V frente a Ag/AgCl mientras que el registrado para el sobrenadante del cultivo (curva con lín ea ------) presenta no solo el pico de oxidación del p-AP-OG (con menor intensidad) sino también el pico de oxidación del p-AP-G. La presencia de este último indica la presencia de Ag85 en el sobrenadante de cultivo y por tanto de las micobacterias en el cultivo analizado.

2.3.2. Análisis del sedimento bacteriano

Dado que Ag85 también interviene en la reparación y construcción de la pared de las micobacterias, el protocolo esquematizado en la Figura 6 se realizó para analizar 10 ml de un cultivo de M. bovis BCG que contenía 2 x 106 ufc.ml-1. En paralelo, el sobrenadante de este mismo cultivo se analizó como anteriormente.

El voltamograma (curva con línea-----) presentado en la Figura 7 confirma la detección de actividad de Ag85 en el sobrenadante de cultivo con la presencia de picos de oxidación de p-AP-OG y p-AP-G. Por otro lado, la respuesta voltamétrica registrada para el análisis de sedimento bacteriano (curva de línea continua) muestra solo el pico de oxidación del p-AP-G con alta intensidad. Este resultado indica que todo el sustrato p-AP-OG se convirtió en p-AP-G durante la etapa de incubación y, por tanto, sugiere que el sedimento bacteriano contiene una mayor cantidad de Ag85 que el sobrenadante para un volumen de cultivo dado. Un estudio adicional sobre la especificidad del método mostró que las aciltransferasas presentes en Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas monteilii, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes, Rhodococcus corallinus, Achromobacter xylosoxidans, Citrobacter freundii, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Klebsiella pneumoniae y Stenotrophomonas maltophilia son capaces de transformar p-AP-OG en p-AP-G en presencia de trehalosa.

Por tanto, la respuesta amperométrica del p-AP-G medida durante el análisis del sedimento bacteriano de M. bovis BCG resulta probablemente, por un lado, de la actividad de aciltransferasa de Ag85 presente en la envoltura micobacteriana y, por otro lado, de las aciltransferasas contenidas en las micobacterias.

2.4. Detección electroquímica de varias especies de micobacterias en cultivos líquidos.

La prueba de concepto de la detección electroquímica de micobacterias en presencia de p-AP-OG y trehalosa se realizó para el análisis de varias especies de micobacterias manipulables en un laboratorio de contención L2. Las especies seleccionadas son las que se encuentran frecuentemente en muestras respiratorias: M. intracellulare, M. avium ssp. avium y M. xenopi. Para ello, se realizó el protocolo descrito en el párrafo 1.4 y los resultados obtenidos para el análisis de los sedimentos bacterianos que contenían aproximadamente 106 bacilos se presentan en la Figura 8. La obtención de un pico de oxidación específico del producto de hidrólisis del sustrato por Ag85 (p-AP-G) para el análisis de cada especie (curvas en línea — , E - 0,4 V frente a Ag/AgCl) confirma que es posible detectar, mediante un método electroquímico, la presencia de micobacterias con p-AP-OG como sustrato y trehalosa como cosustrato. Para cada especie, se calcularon umbrales de cuantificación comprendidos entre 103 y 104 bacterias.ml'1 de cultivo.

2.5. Detección de M. tuberculosis

La detección electroquímica de M. tuberculosis, microorganismo de clase 3 responsable de la tuberculosis humana, se realizó analizando cultivos de la cepa H37Rv en medio líquido 7H9 en medio de gelosa 7H11 de acuerdo con modos de operación del párrafo 1.6. En el caso del cultivo líquido, la detección de Ag85 se contempló en el sedimento bacteriano así como en el sobrenadante de cultivo.

Con un pico de oxidación específico del producto de hidrólisis del p-AP-OG, la serie de voltamogramas presentados en la Figura 9 A confirma que la cepa de M. tuberculosis produce Ag85 en gran cantidad en el medio de cultivo. Estos resultados confirman que es posible contemplar la detección de M. tuberculosis mediante la medición electroquímica de la actividad de Ag85 en el medio de cultivo.

Además, los picos de oxidación del p-AP-G registrados para el análisis de células bacterianas (Figuras 9B, 9C; curvas en línea-----) indican que el método electroquímico que implica a p-AP-OG como sustrato y trehalosa como aceptor de grupos acilo también permite la detección de M. tuberculosis en forma de sedimentos bacterianos y colonias aisladas.

2.6. Extracción y detección de M. intracellulare en una muestra respiratoria

Para proponer un método de detección electroquímica directa (es decir, sin cultivo previo) de micobacterias en muestras de origen pulmonar (esputos, productos de aspiración traqueal y aspiración bronquial), se inocularon muestras de pacientes no tuberculosos con una cantidad conocida de M. intracellulare y se analizaron de acuerdo con el protocolo del párrafo 1.7.

Como los métodos de fluidificación-descontaminación comercializados útiles para la preparación de muestras - que combinan N-acetilcisteína e hidróxido sódico - no son compatibles con la detección electroquímica (señales mal definidas), se contempló el desarrollo de un protocolo para la extracción de micobacterias en muestras de origen pulmonar. El método propuesto implica una mezcla de hexano-isopropanol como disolvente de extracción. Al precipitar los constituyentes de la muestra respiratoria, el isopropanol permite superar la naturaleza viscosa de la muestra mientras que el disolvente apolar, hexano, extrae selectivamente las micobacterias cuya pared es muy hidrófoba. Una vez recuperadas por filtración, las micobacterias se incubaron con la mezcla sustrato-cosustrato para realizar la detección electroquímica de la actividad de aciltransferasa (Ag85 y otras enzimas presentes en la célula micobacteriana).

Los voltamogramas presentados en la Figura 10 muestran que es posible detectar micobacterias mediante el método electroquímico en muestras de origen respiratorio previamente tratadas con una mezcla de hexano-isopropanol. De hecho, el pico de oxidación específico del producto de hidrólisis del p-AP-OG por Ag85 se obtiene para el esputo inoculado con M. intracellulare (curva con línea — , E ~+0,4 V frente a Ag/AgCl) mientras que ningún pico de oxidación relacionado con la presencia del p-AP-G se registró para el esputo no inoculado (curva de línea continua).

2.7. Extracción y detección de M. bovis BCG en una muestra de suelo

Para evaluar el impacto del volumen de hexano en el rendimiento de extracción, se inoculó suelo estéril (5 g) con la cepa de M. bovis BCG (1,5 x 105 ufc por microcosmo) y se sometió al protocolo de extracción descrito en el párrafo 1.8 usando volúmenes de hexano de 2 ml, 5 ml y 10 ml. El rendimiento máximo de extracción se obtuvo usando un volumen de hexano de 10 ml. En estas condiciones, se extrajo un 50 % de las micobacterias inoculadas en los microcosmos. Este buen rendimiento de extracción está relacionado con la fuerte afinidad entre el hexano y la membrana hidrófoba de las micobacterias. Además, el hexano tiene probablemente un papel en la ruptura de los enlaces (fisisorción, quimisorción) que provocan la adhesión de las micobacterias a las partículas del suelo.

Las características particulares de M. bovis, y particularmente su crecimiento muy lento, necesitan generalmente una etapa de descontaminación del extracto antes de su cultivo para eliminar la mayoría de microorganismos endógenos de los sustratos ambientales conservando las micobacterias. Se evaluaron varios protocolos y solo el que combinaba variaciones extremas de pH y una incubación en presencia de hipoclorito sódico fue suficientemente eficaz para destruir toda la flora microbiana interferente del suelo coextraída con hexano al mismo tiempo que M. bovis BCG. Aplicando el protocolo de extracción-descontaminación descrito en el párrafo 1.8 a muestras de suelo estéril inoculadas (5 g) con M. bovis BCG (2,6 x 106 ufc por microcosmo), se obtuvo un rendimiento de 2,5 ± 0,8 % (n = 4). C Este resultado sugiere que la descontaminación es la etapa limitante en el proceso ya que elimina un 95 % de las micobacterias que se extrajeron con hexano. Sin embargo, esta etapa es muy útil o incluso indispensable para eliminar los microorganismos contaminantes que tienen una envoltura hidrófoba aproximada a la de M. bovis, tales como los diversos géneros encontrados en actinobacterias.

Aunque el método de extracción-descontaminación de micobacterias en el suelo de la invención permitió recuperar solo aproximadamente un 2,5 % de las bacterias inoculadas en suelo estéril, este rendimiento es claramente superior al descrito en la bibliografía para el análisis de muestras ambientales contaminadas naturalmente mediante un método de inmunocaptura magnética (0,1 %) (Sweeney et al., Lett. Appl Microbiol., 43(4): 364-369, 2006; Sweeney et al., Appl Environ Microbiol., 73(22): 7471-7473, 2007) [10, 11].

2.8. Aspectos cuantitativos del método

Para tener en cuenta todos los errores aleatorios durante la realización de los protocolos, se eligió p-AP-OG como patrón interno y la respuesta analítica del método se definió como la relación de la intensidad del pico de oxidación del p-AP-G con respecto a la intensidad del pico de oxidación del p-AP-OG:

R _ i p-AP-G

í p-AP-OG

Las cantidades ¡p-ap-og e íp-ap-g se definieron en el voltamograma que se presenta en la Figura 11.

Como muestran los valores de R recogidos en la Tabla 2 a continuación, el método electroquímico propuesto por los inventores permitió detectar cantidades de M. intracellulare inferiores a 100 bacilos.ml'1. Este resultado permite contemplar aplicaciones del método para el análisis de muestras reales, después de la extracción de micobacterias, sin tener que recurrir a una etapa de cultivo previa.

Tabla 2: Respuestas analíticas R normalizadas (R0 corresponde a la respuesta analítica registrada para el medio de cultivo sin bacterias) calculadas a partir de los voltamogramas registrados para el análisis de M. intracellulare a 102, _____________ 103, 104, 105 y 106 bacilos.ml'1 de acuerdo con el protocolo descrito en el párrafo 1.4.______________

M. intracellulare (bacilos.ml’1) R/R0

0 1

102 2,9

103 4,5

104 7,4

105 12,2

106 40

Finalmente, se realizó un primer estudio de repetibilidad para el análisis del sedimento de un cultivo de M. intracellulare que contenía 5 x 106 bacilos.ml-1. Un coeficiente de variación del 94 % se calculó para 5 repeticiones.

2.9. Aplicación del método de detección electroquímica de la invención para monitorizar el crecimiento de Mycobacterium tuberculosis H37Rv en medio líquido

2.9.1. Comparación del tiempo de positividad de un cultivo líquido de Mvcobacterium tuberculosis H37Rv con el sistema automatizado BD BACTEC™ MGIT™

Para ello, se prepararon tres volúmenes de medio (volúmenes, A, B y C) para analizar el método de detección descrito en la invención (Tabla 3).

T l : V l m n l if r n r iv r r r r l m i liv

Se preparó una suspensión bacteriana de M. tuberculosis y después se diluyó dos veces a la décima en medio de cultivo 7H9 (muestras -1 y -2). Estas suspensiones diluidas sirvieron para inocular los diferentes tubos.

Los tubos incubados en el sistema automatizado BACTEC™ se beneficiaron de una medición automática de la fluorescencia una vez por hora. El tiempo de positividad se expresó en días.

Los tubos se analizaron diariamente con el método de la invención, tomando un volumen de 30 pl del cultivo y colocándolo sobre la superficie de un sensor serigrafiado sin tratamiento previo. Las mediciones se realizaron mediante voltamperometría lineal y la positividad de la muestra corresponde a la aparición de un pico de oxidación de p-AP-G hacia ~+0,50 V frente a Ag/AgCl. Como las mediciones electroquímicas no se realizaron de forma continua (una vez al día en el mejor de los casos), por el momento existe una incertidumbre sobre la aparición del momento exacto de la positividad, de ahí la expresión de los resultados en forma < x días.

Tabla 4: Tiempos de positividad obtenidos con el sistema automatizado BACTEC™ y con el método electroquímico in i n nr l in l n M. r l i H 7Rv 1 2 r i i n r m r

Los resultados de la Tabla 4 indican que el método electroquímico permitió monitorizar el cultivo de M. tuberculosis en volúmenes menores (Volumen C) que el método BACTEC™, y así, reducir el tiempo de positividad de la muestra (< 2 días en lugar de 4 días para la dilución -1 y < 3-4 días en lugar de 6 días para la dilución -2).

2.9.2. Comparación del tiempo de positividad de cuatro muestras respiratorias inoculadas o no con M. tuberculosis H37Rv, después de fluidificación-descontaminación con el sistema automatizado BD BACTEC™ MGIT™

El CHU de Dijon proporcionó cuatro muestras respiratorias (Muestra 1 y 2: fibroscopia, Muestra 3: lavado broncoalveolar y Muestra 4: esputo). Para cada muestra, una alícuota de 3 ml se contaminó con 500 pl de suspensión de M. tuberculosis H37Rv, una segunda alícuota no contaminada sirvió como control. Después de una etapa de fluidificación-descontaminación (Kit NacPac Biocentric), cada sedimento se resuspendió en 1,1 ml de medio de cultivo. Después, se introducen dos volúmenes de 500 pl de la solución anterior respectivamente en un tubo BACTEC™ y un tubo Falcon que contienen el medio A (Tabla 3).

Los tubos incubados en el sistema automatizado BACTEC™ se beneficiaron de una medición automática de la fluorescencia una vez por hora. El tiempo de positividad se expresó en días.

Los cultivos realizados en los volúmenes de medio A (Tabla 3) se incubaron a 37 °C y se analizaron con el método electroquímico de la invención. Las mediciones electroquímicas y su interpretación se realizaron como en el párrafo 2.9.1. anterior.

Tabla 5: Tiempo de positividad de cuatro muestras respiratorias contaminadas o no inoculadas (controles) en tubos MGIT obtenidos con el método electro uímico el sistema automatizado BACTEC

Los resultados recopilados en la Tabla 5 muestran que el método electroquímico fue tan eficaz como BACTEC™ para la detección en cultivo líquido de muestras respiratorias contaminadas artificialmente con M. tuberculosis.

Finalmente, al combinar los resultados de las Tablas 4 y 5, el método electroquímico de la invención es capaz de demostrar más rápidamente el crecimiento de M. tuberculosis en un cultivo líquido (tiempo ~2 veces menor) y por tanto su presencia en una muestra respiratoria.

Listado de referencias

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3. Kashyap et al., Clin Diagn Lab Immunol., 12(6):752-758, 2005

4. Elamin et al., J. Microbiol. Methods, 79(3): 672-678, 2002

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8. Solicitud de patente CN102087283

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11. Sweeney et al., Appl. Environ. Microbiol., 73(22):7471-7473, 2007.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Método de detección electroquímica de micobacterias en una muestra biológica, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) seleccionar un sustrato de al menos una aciltransferasa y su cofactor;

b) poner en contacto dicha muestra biológica con dichos sustrato y cofactor;

c) detectar electroquímicamente el producto resultante de la actividad catalítica de dicha al menos una aciltransferasa.

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha al menos una aciltransferasa es el Antígeno 85.

3. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la muestra biológica se elige entre cultivos bacterianos, muestras biológicas de origen humano o animal, y muestras ambientales.

4. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho sustrato de dicha al menos una aciltransferasa se elige entre p-aminofenil-6-O-octanoil-p-D-glucopiranósido, un sustrato con grupos acilo que tienen cadenas de alquilo que varían de C7H15 a C29H59.

5. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho cofactor es un azúcar elegido entre el grupo formado por trehalosa y D-glucosa.

6. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la etapa de detección electroquímica c) se realiza usando un sensor amperométrico.

7. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha muestra biológica se ha tratado previamente mediante un método de aislamiento de micobacterias que comprende las etapas de:

A. poner en solución dicha muestra biológica;

B. tratar con un disolvente apolar la solución obtenida en la etapa A);

C. recuperar las micobacterias por filtración o centrifugación de la solución obtenida en la etapa B); y

D. recuperar las micobacterias del filtrado o del sedimento de centrifugación obtenido al final de la etapa C).

8. Método de acuerdo con la reivindicación 7, que comprende además una etapa de descontaminación A') de la muestra biológica puesta en solución al final de la etapa A) y antes de la etapa B), y/o una etapa de descontaminación C') de la membrana filtrante al final de la etapa C) y antes de la etapa D).

9. Método de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la etapa C') se realiza con soluciones ácidas y/o básicas, y/o adición de hipoclorito sódico, y/o adición de al menos un compuesto desinfectante.

10. Método de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, que comprende además una etapa de enjuague C") de la membrana filtrante al final de la etapa C') y antes de la etapa D).

11. Método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la etapa de enjuague C") se realiza con un tampón fosfato.

12. Kit para realizar el método de detección electroquímica de micobacterias en una muestra biológica tal como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 que comprende:

i. un dispositivo y reactivos para recogida y preparación de la muestra biológica a analizar;

ii. un dispositivo que comprende un sustrato de Ag85 y su cofactor para incubación con Ag85;

iii. un dispositivo para detección electroquímica mediante un lector adecuado.

13. Kit de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el dispositivo para la detección electroquímica de la etapa iii) es un sensor amperométrico, preferentemente un sensor serigrafiado.