ES2854952T3

ES2854952T3 - Portamuestras para análisis de espectrometría de masas en modo MALDI, producción y uso del portamuestras

Info

Publication number: ES2854952T3
Application number: ES17794072T
Authority: ES
Inventors: Emanuele Barborini; Simone Vinati; Marc Baumann
Original assignee: Tethis SpA
Current assignee: Tethis SpA
Priority date: 2016-10-05
Filing date: 2017-10-04
Publication date: 2021-09-23
Anticipated expiration: 2037-10-04
Also published as: EP3523820A1; US11398374B2; IT201600099710A1; US20190252171A1; WO2018065908A1; EP3523820B1

Abstract

Portamuestras (10; 10') para su uso en la técnica de MALDI, que comprende: - un soporte, seleccionado entre: a) un soporte (11) hecho de un polímero no elastomérico cargado con carbón grafítico (relleno de negro de carbono), que tiene una resistividad del volumen inferior a 1012Ωx cm y un ángulo de contacto en una medición de la humectabilidad al agua al menos igual a 90°; o b) un soporte (11') que tiene al menos una cara cubierta con una capa (14) de un polímero no elastomérico cargado con carbono grafítico (relleno de negro de carbono), que tiene una resistividad de la superficie inferior a 10 kΩ x cuadrado y un ángulo de contacto en una medición de la humectabilidad al agua al menos igual a 90°; - en una cara (12) del soporte en el caso a) o en dicha cara cubierta (12') en el caso b), uno o más depósitos (13) de un óxido de un metal del grupo 4 de la tabla periódica de los elementos, que tiene un espesor entre 100 y 400 nm y consiste en nanopartículas de dicho óxido que tienen un tamaño entre 2 y 50 nm, dichos uno o más depósitos rodeados completamente por el polímero del soporte en el caso a) o por el polímero de dicha capa en el caso b); en el que dichos uno o más depósitos de óxidos se obtienen mediante un crecimiento balístico a partir de dichas nanopartículas y tienen una estructura autoafín, que tiene una jerarquía de porosidad de un nanómetro a cien nanómetros; y en el que la superficie del portamuestras sobre la que se encuentran dichos uno o más depósitos de óxido se trata con radiación UV de tal manera que los depósitos muestran un ángulo de contacto menor de 5° a una medición de la humectabilidad al agua mientras se realiza el mismo tratamiento con radiación UV no altera la hidrofobidad del soporte en el caso a) o del polímero de dicha capa en el caso b).

Description

DESCRIPCIÓN

Portamuestras para análisis de espectrometría de masas en modo MALDI, producción y uso del portamuestras

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un portamuestras para realizar un análisis de espectrometría de masas en modo MALDI, en particular para muestras biológicas; la invención también se refiere a la producción del portamuestras y a su uso en dicha técnica.

Técnica anterior

La técnica de MALDI es una técnica de ionización utilizada en espectrometría de masas, en particular para la ionización de muestras delicadas, por ejemplo, compuestos termolábiles y de alto peso molecular, como compuestos farmacéuticos y, en particular, determinadas clases de moléculas biológicas (biopolímeros como proteínas, péptidos y azúcares), particularmente frágiles y propensos a una destrucción demasiado rápida con las técnicas de ionización convencionales. El nombre de MALDI es un acrónimo derivado de desorción/ionización láser asistida por matriz.

La técnica consiste en preparar una solución (en agua o una mezcla de agua y un disolvente orgánico) que contiene el compuesto a analizar (analito) y el material de la matriz, en general un compuesto orgánico (glicerol, ácido picolínico, ácido succínico, ácido cafeico, ácido sinápico, etc.); depositar una gota de la solución en un portamuestras; esperar (o provocar) la evaporación del disolvente, lo que determina la cristalización del material de la matriz y la cocristalización del analito con la propia matriz; y finalmente irradiar la matriz sólida que contiene el analito con un pulso de láser.

Después de la irradiación con láser, se produce la desorción del analito, que se libera en forma "agrupada", es decir, complejado con el material de la matriz, con la formación de una fase de vapor enrarecido que contiene los dos compuestos. La matriz mitiga los efectos del haz láser, asegurando así una adecuada protección al analito que se vaporiza y se ioniza por el exceso de energía transferida secundariamente por la propia matriz.

Se obtienen así iones "cuasimoleculares", en general de carga única, como los creados por la adquisición o la pérdida de un protón.

La parte de la carga generada en la ionización y no transferida al analito se disipa a través del portamuestras, que debe estar fabricado (o tener la superficie cubierta) con un material conductor.

Además del uso bien establecido para el análisis de moléculas individuales, la técnica de MALDI se ha adoptado recientemente en las actividades rutinarias de los laboratorios de microbiología para la identificación de bacterias, y se espera que en un futuro próximo se extienda también a los análisis de otras entidades biológicas (como exosomas y microvesículas).

Además, existe una variante de la técnica, la denominada imagenología por MALDI, mediante la cual resulta posible mapear la distribución de moléculas específicas en muestras histológicas, por ejemplo para estudios proteómicos, en los que se desea caracterizar la distribución de una proteína dentro del tejido, o para estudios farmacocinéticos, en los que se desea caracterizar la distribución de un ingrediente activo (o uno o más metabolitos generados a partir de él) dentro de una muestra histológica obtenida a partir de un órgano de cobaya previamente sometido a una administración o perfusión farmacológica.

Para cada una de estas aplicaciones, es necesario que la muestra a analizar se deposite en un portamuestras adecuado.

En el caso del análisis de especies moleculares, los portamuestras en general utilizados hasta la fecha son placas metálicas no desechables, comúnmente acero inoxidable. Estas placas no poseen elementos estructurales de contención de la gota de muestra; en cambio, están presentes muescas, típicamente circulares con un diámetro de aproximadamente 2 mm, cuya función es definir áreas para dispensar la gota de la muestra para una fácil identificación de la misma en la fase de análisis, cuando la placa está dentro del espectrómetro de masas. Las placas metálicas tienen el problema de que no se controla su humectabilidad, de modo que la gota de la solución inicial se coloca y se extiende de forma no repetible sobre su superficie, muchas veces cruzando parcialmente la muesca para la identificación de la posición de dispensación, que prácticamente no tiene propiedades de contención en particular; por lo tanto, la irradiación láser posterior debe realizarse bajo una cuidadosa inspección visual por parte de un operador.

A causa de la ausencia de estructuras de contención y de la humectabilidad incontrolada, los rasgos característicos que determinan el comportamiento incontrolado de la gota sobre la superficie de metal, la concentración de analito por unidad de superficie, después de la evaporación del disolvente, no está bien definida y, en algunos casos puntos, puede reducirse algo en comparación con lo que se produciría si la gota de solución se evaporara quedando dentro de un perímetro inicial bien definido en el portamuestras. Finalmente, esto conduce a una dispersión en las intensidades de pico de las mediciones de espectrometría de masas en función del punto donde el láser incide en la superficie y, cuando la gota se agranda particularmente en la superficie, también una sensibilidad reducida de la prueba.

También se sabe que algunas muestras, en particular biológicas, antes del análisis deben ser sometidas a tratamientos como lavados para eliminar componentes salinos y digestiones enzimáticas, por ejemplo tratamientos con tripsina en el caso de muestras proteicas, o tratamientos ácidos en el caso de bacterias; en este sentido, véase, por ejemplo, el artículo "Formic acid- based direct, on-plate testing of yeast and Corynebacterium species by Bruker Biotyper matrixassisted laser desorption ionization - time of flight mass spectrometry", de E. S. Theel y col., J. Clin. Microbiol. 2012, 50 (9), páginas 3093-3095. Estos tratamientos son difíciles, si no imposibles, de realizar en portamuestras de acero, por ejemplo porque los tratamientos con ácidos corroen la superficie del mismo, provocando una contaminación de la muestra, o porque la falta de estructuras de contención de los líquidos provocaría una mayor dispersión de las muestras en la superficie, con la consiguiente reducción adicional de la concentración de analito por unidad de superficie, además del riesgo adicional de contaminación cruzada entre las siguientes muestras. Por lo tanto, todos los tratamientos necesarios de preparación de muestras deben realizarse con antelación, en general en viales y sobre el volumen total de solución inicial; esto requiere el uso de mayores cantidades de reactivos, y además corre el riesgo, bien conocido por los expertos en la técnica, de perder parte de la muestra, por ejemplo por adherencia sobre las paredes plásticas hidrófobas de los viales, con posibles alteraciones de los resultados del análisis.

Con el fin de superar algunos de estos problemas, en la bibliografía se han descrito portamuestras avanzados para el análisis de MALDI de especies moleculares y, en algunos casos, también están disponibles en el mercado.

El portamuestras Bruker AnchorChip™ (descrito en la patente estadounidense 6.287.872 B1) es una placa de acero inoxidable no desechable en la que está presente un recubrimiento altamente hidrófobo, aparte de áreas pequeñas (áreas circulares de diámetro de 0,4 a 2 mm, llamadas "anclajes") en las que la superficie metálica es accesible. Esto tiene como objetivo aumentar la sensibilidad de la prueba al inducir la concentración de la muestra solo en las áreas hidrófilas. Dado que este portamuestras no es desechable, tiene determinadas limitaciones, como la necesidad de limpieza y el consiguiente riesgo de contaminación cruzada, el posible deterioro de los rasgos característicos de la superficie por reutilización o almacenamiento inadecuado, y especialmente el hecho de que el recubrimiento hidrófobo es incompatible con tratamientos ácidos o básicos, por lo que existen los mismos problemas de incapacidad de realizar tratamientos de la muestra en el portamuestras que se presentan con las placas de acero sencillas; estos problemas se describen en el manual del usuario suministrado con el producto, disponible en Internet en:

http://www.rib.okayama-u.ac.ip/saka/MALDI-TOF/Images/AnchorChip%20Manual 2 0-1.pdf

La solicitud de patente estadounidense 2004/0197921 A1 divulga un portamuestras derivado de una evolución del AnchorChip™, en el que las áreas hidrófilas están rodeadas por un anillo de un material hidrófobo, pero menos hidrófobo que el recubrimiento de la placa. La finalidad del dispositivo es aprovechar la captura de biomoléculas en el anillo por interacción hidrófoba, para realizar el lavado de posibles contaminantes solubles en agua y posteriormente proceder a la elución y concentración de biomoléculas sobre los "anclajes" hidrófilos. Sin embargo, dado que también este dispositivo está hecho de acero y no es desechable, tiene las mismas limitaciones ya descritas para el AnchorChipTM. Además, dado que el área de captura (el anillo hidrófobo) es diferente del área de análisis (el área hidrófila), se requiere una etapa de elución para separar las biomoléculas del anillo y llevarlas al área hidrófila; en esta operación se puede perder una parte de la muestra. Estos puntos críticos son destacados por los propios autores de la invención en los párrafos [0032], [0056] y [0066] de la solicitud de patente citada.

La solicitud de patente GB 2391066 A describe otro portamuestras que tiene una estructura similar a la del AnchorChipTM, pero de plástico y desechable. En este dispositivo los "anclajes" hidrófilos simplemente consisten en un depósito, preproducido sobre el sustrato plástico, del material matriz utilizado en la técnica de MALDI. Al ser desechable, este portamuestras no presenta problemas de degradación de sus propiedades ni contaminación cruzada en análisis posteriores. Sin embargo, también este portamuestras tiene una serie de inconvenientes: en primer lugar, prácticamente no permite ningún tratamiento de la muestra, puesto que incluso un sencillo lavado podría eliminar los depósitos de la matriz; además, en el caso de digestión enzimática, por ejemplo con tripsina, el carácter ácido de la matriz ya presente inhibiría la acción de la enzima que, como saben los expertos en la técnica, requiere un entorno básico a pH 7-9; además, el usuario no puede elegir la matriz, ya que está depositada previamente; finalmente, el portamuestras está construido para impedir cualquier reutilización, por lo que una vez desconectado de su soporte, no se puede volver a colocar y someter a una nueva medición, por ejemplo para confirmar o integrar los resultados de un primer análisis.

Otros documentos describen portamuestras más complejos.

La solicitud de patente estadounidense 2014/0308728 A1 describe la funcionalización de áreas de la superficie (los anclajes) del portamuestras con nanotubos de óxido de titanio. La patente estadounidense 8598511 B1 divulga un portamuestras similar, en el que los anclajes están hechos de nanotubos de carbono, cultivados localmente después de haber depositado de forma selectiva sobre las capas superficiales de un catalizador para el crecimiento de estos nanotubos (como el níquel). La patente estadounidense 8294090 B1 describe un portamuestras con puntos de anclaje hechos de metal (en particular, platino u oro) o con polímeros hidrófobos como poliestireno, polietileno o polipropileno; este portamuestras está diseñado específicamente y solo es adecuado para el análisis de MALDI de ácidos nucleicos o proteínas. Finalmente, la solicitud de patente WO 2012/115380 A2 divulga un portamuestras de metal con puntos de anclaje de la muestra fabricado con nanohilos de óxidos de metal. Estos portamuestras son en general de producción compleja, y algunos están hechos con una placa metálica, por lo que tienen el problema descrito anteriormente de incapacidad de tratamiento in situ de la muestra.

La solicitud de patente estadounidense 2010/0248388 A1 describe un portamuestras para el análisis de MALDI que consta de un soporte conductor sobre el que están presentes una pluralidad de depósitos de un óxido poroso ("fase de sorción"; los depósitos se disponen en general según una geometría ordenada). El depósito poroso se obtiene por sinterización de nanopartículas, y es capaz de absorber una muestra de naturaleza proteica y de unir de forma selectiva el componente de péptidos fosforilados u otros componentes, tras la adecuada funcionalización de las nanopartículas que constituyen el depósito poroso. A pesar de que el portamuestras descrito permite la captura selectiva de componentes de muestras biológicas dentro de los depósitos, no posee ninguna capacidad de contención de las gotas sobre los mismos y, por lo tanto, requiere estructuras adecuadas de contención de líquidos ("dispositivo fluídico", párrafos [0037] y [0039]) para la ejecución de todos los tratamientos descritos. En este sentido, véase en particular la descripción del párrafo [0037], hecha en referencia a la Fig. 2, en la que se dice que "un cilindro 6 montado en la punta se utiliza como depósito para mantener la solución 7 empobrecida de la muestra" (la punta antes mencionada es la del elemento dispensador de la solución).

En general, siempre se requieren estructuras de contención externas para fomentar la interacción entre una muestra en fase líquida y una superficie funcionalizada. En este sentido, por ejemplo, la solicitud de patente estadounidense 2011/0281267 A1 muestra diversas configuraciones fluídicas externas diseñadas para facilitar la interacción de una muestra citológica con una superficie funcionalizada para la adherencia celular (Fig. 1, 3, 4 y 5); mientras que, por ejemplo, la solicitud de patente estadounidense 2006/0169917 A1 muestra claramente un elemento de contención en la Fig. 1, aunque no se menciona en el texto.

En lo que respecta al análisis de bacterias, se han desarrollado portamuestras "específicos" que están especializados, en tamaño y forma, para ser utilizados exclusivamente con un espectrómetro de masas particular. Los instrumentos más populares de hoy en el mercado son BioMerieux VITEK® MS y Bruker Biotyper. Los portamuestras para su uso con el primero de estos instrumentos son sencillas plataformas desechables de plástico conductor con una fina capa de acero inoxidable. Los portamuestras para su uso con el espectrómetro Bruker son placas de silicona o acero inoxidable. Ninguno de estos portamuestras está diseñado para el tratamiento de la muestra biológica, es decir, ninguno de estos portamuestras tiene rasgos característicos que permitan la absorción, la captura selectiva o cualquier tipo de captura genérica de la muestra biológica; además, ninguno de estos portamuestras dispone de elementos de contención de líquidos, aunque en algunos casos un tratamiento adecuado de la muestra podría ayudar, por ejemplo, en la identificación de cepas bacterianas específicas como se informa, por ejemplo, en la publicación antes mencionada de E.S. Theel y col.

Los portamuestras actualmente disponibles también son problemáticos para usar en imagenología por MALDI (o IMS, "imagenología por espectrometría de masas"). En esta técnica, los pulsos de láser se emiten según un patrón geométrico adecuado, típicamente cartesiano con distancias entre los puntos de irradiación de entre 10 y 200 gm, con el fin de realizar un barrido de la muestra histológica sometida a análisis y adquirir un espectro de masas para cada punto; el objetivo es generar, como resultado, mapas de color falso del tejido que representen la distribución espacial de una masa dada (por lo tanto, una especie química específica). Los portamuestras actualmente disponibles son en general placas de vidrio ("portaobjetos") con una superficie cubierta por una película conductora transparente de una mezcla de óxido de indio y estaño (comúnmente denominada ITO, óxido de indio y estaño). En imagenología por MALDI, por lo tanto, la muestra, preparada en el criomicrotomo, se coloca sobre el portaobjetos y, después de haber inducido la adherencia del mismo por descongelación sencilla, se trata con productos químicos en fase líquida para realizar, por ejemplo, la deshidratación, fijación y deslipidación del mismo. Un problema que se encuentra con estos portamuestras es que durante los tratamientos con líquidos, algunos cortes de tejido pueden moverse, doblarse sobre sí mismos o solaparse con otros cortes de tejido posiblemente presentes en el mismo portamuestras, impidiendo de este modo el análisis. Esto se produce a causa de la interferencia en la adherencia del tejido al portaobjetos por los compuestos químicos utilizados para el tratamiento del tejido, con los que el propio tejido tiene una mayor afinidad. Otra limitación se refiere a la eliminación (realizada por medios químicos, p. ej., mediante soluciones de metanol) de la matriz de MALDI para análisis posteriores en la misma muestra (p. ej., por inmunotinción): también en este caso, la solución para la eliminación de la matriz de MALDI interfiere con la adherencia del portaobjetos al tejido, provocando el desprendimiento y, por lo tanto la pérdida, de la muestra histológica.

Además de las limitaciones identificadas anteriormente para los distintos tipos de portamuestras, otro problema de la técnica consiste precisamente en el hecho de que se requiere un portamuestras diferente en forma y tamaño para cada tipo de análisis, o incluso para cada instrumento.

El objetivo de la presente invención es proporcionar un portamuestras que supere los inconvenientes de los portamuestras actualmente conocidos o en uso.

Compendio de la invención

Este objetivo se consigue con la presente invención, que en un primer aspecto de la misma se refiere a un portamuestras para su uso en la técnica de MALDI según la reivindicación 1.

Preferiblemente, el portamuestras de la invención tiene una pluralidad de dichos depósitos, dispuestos en dicha cara del soporte con una disposición geométrica regular.

En un segundo aspecto de la misma, la invención se refiere al proceso para producir dicho portamuestras, como se define en la reivindicación 10.

Breve descripción de las figuras

Las Figs. 1a y 1b muestran dos posibles realizaciones alternativas de portamuestras de la invención;

la Fig. 2 muestra una representación esquemática de la estructura microscópica de un depósito de óxido metálico de un portamuestras de la invención;

la Fig. 3 muestra una fotografía de un portamuestras de la invención en una realización preferida;

la Fig. 4 muestra una fotografía de un portamuestras de la invención en el que, sobre los depósitos de óxido metálico, se depositaron gotas de solución acuosa;

las Figs. 5a y 5b muestran dos microfotografías con diferentes aumentos tomadas con el microscopio electrónico de barrido de la superficie de un depósito de óxido metálico presente en el portamuestras de la invención;

la Fig. 6 muestra otra posible realización de un portamuestras de la invención;

las Figs. 7 y 8 muestran dos espectros de masas realizados con la técnica de MALDI utilizando un portamuestras de la invención, antes y después del tratamiento in situ de la muestra, respectivamente.

Descripción detallada de la invención

La invención se describe a continuación en detalle con referencia a las figuras.

En las figuras, el mismo número corresponde a un mismo elemento; además, para una mayor claridad de representación, los elementos mostrados no están necesariamente a escala.

El portamuestras de la invención consiste en un soporte formado por, o que tiene al menos una cara recubierta con, un material antiestático e hidrófobo no metálico, donde el término hidrófobo significa la característica de una superficie sobre la que se realiza una medición del ángulo de contacto con agua proporciona un valor igual o superior a 90°. La primera posibilidad (caso a, soporte constituido por material no metálico con una resistividad del volumen inferior a 1012 Q x cm) se representa en la Fig. 1a, en la que el portamuestras, 10, consiste en un soporte, 11, fabricado íntegramente con dicho material antiestático e hidrófobo no metálico. En una cara, 12, del soporte 11, hay un depósito, 13, de un óxido de metal del grupo 4 constituido por nanopartículas.

La segunda posibilidad (caso b, soporte con una cara cubierta con una capa de un material no metálico con una resistividad de la superficie inferior a 10 kQ x cuadrado) se representa en la Fig. 1b; en este caso, el portamuestras de la invención, 10', consiste en un soporte, 11', que tiene una cara cubierta con una capa 14 de material no metálico antiestático e hidrófobo. En la cara expuesta 12' de la capa 14, se encuentra el depósito 13 de nanopartículas de óxido.

En el portamuestras 10, el soporte 11 está hecho de un material polimérico (tal como polipropileno, polietileno, poliestireno, poli(metacrilato de metilo) o policarbonato) relleno de carbono grafítico.

En el caso del portamuestras 10', el soporte 11' puede estar fabricado con cualquier material que tenga propiedades mecánicas adecuadas para el propósito, y que permita la adherencia de la capa 14 (por ejemplo, puede ser de vidrio, plástico o metal ); la capa 14 está hecha con uno de los materiales mencionados anteriormente para la producción del soporte 11.

Los materiales preferidos para fabricar el soporte 10' son polímeros (por ejemplo, polipropileno, polietileno, poliestireno, poli(metacrilato de metilo), policarbonato) cargados con polvo de grafito o portaobjetos de vidrio con una cara cubierta con ITO.

Las dimensiones del soporte pueden variar dentro de amplios límites, pero son adecuadamente similares a las de los portaobjetos ya empleados en análisis rutinarios, automatizados o no, en el campo médico y biológico, que permitan la gestión (manipulación, almacenamiento) del portamuestras de la invención en modos de funcionamiento estándar, incluido el uso de medios e instrumentación automatizados ya empleados en el sector también para análisis distintos de MALDI; por ejemplo, un portamuestras típico de la invención puede tener unas dimensiones laterales de 25 x 75 mm y un espesor de 1 mm, valores estándar de los portaobjetos de vidrio comunes.

En una de las caras principales del soporte 11, o en la cara expuesta de la capa 14, hay al menos un depósito poroso 13 de un óxido de un metal del grupo 4, preferiblemente titanio y circonio, completamente rodeado por el material de soporte 11 o de la capa 14.

El depósito (cuya producción se describe a continuación) está formado por partículas de dicho óxido que tienen un tamaño de entre aproximadamente 2 nm y 50 nm, con un máximo de la curva de distribución del tamaño de partículas del mismo en el intervalo entre 5 y 15 nm. Además, el depósito tiene un espesor de entre aproximadamente 100 y 400 nm, y preferiblemente entre aproximadamente 150 y 300 nm. La porosidad del depósito es consecuencia de un modo de crecimiento del propio depósito debido al modelo "balístico", en el que las nanopartículas voladoras se detienen en el punto exacto en el que impactan sobre el sustrato o sobre las nanopartículas ya depositadas, sin difusión o reordenamientos. A causa del modo balístico de crecimiento y de los valores de espesor indicados anteriormente, el depósito tiene, dentro de determinados límites, una estructura autoafín o, más genéricamente, fractal. La autoafinidad consiste en que la geometría tridimensional (o una sección bidimensional de la misma) del depósito de óxido siempre parece similar a sí mismo incluso cuando se observa a diferentes aumentos, en los que los detalles de diferentes tamaños se muestran con el mismo tamaño aparente para algunos órdenes de magnitud; para una confirmación de la naturaleza autoafín de estos depósitos, véanse, por ejemplo, los artículos "Self-affine properties of cluster-assembled carbon thin films", R. Buzio y col., Surface Science 444 (2000), y "Nanomanufacturing of titania interfaces with controlled structural and functional properties by supersonic cluster beam deposition", A. Podesta y col., Journal of Applied Physics 118 (2015). En el caso particular de los depósitos de óxido de la presente invención, existe una estructura porosa autoafín caracterizada por una jerarquía de porosidad, de un tamaño de un nanómetro a cien nanómetros. Esta situación se esquematiza en la Fig. 2, que muestra una serie de partículas 20 de diferentes tamaños, ensambladas en modo balístico para formar un depósito sobre un soporte (no se muestra en la figura); el número de referencia 21 muestra a modo de ejemplo, representado por círculos discontinuos, unos espacios vacíos de diferentes tamaños que representan de forma esquemática la estructura jerárquica de porosidad observada en el depósito y a causa del modo balístico de crecimiento del depósito 13. En particular, la estructura porosa de la materia se caracteriza por que las condiciones para la nucleación de proteínas y biomoléculas en general se determinan dentro de los poros y esto permite una captura particularmente eficaz de las propias biomoléculas en cantidades que superan lo esperado por el aumento geométrico del área de la superficie específica, como se describe en los artículos "The effect of surface nanometrescale morphology on protein adsorption", P. E. Scopelliti y col., PLoS One 5(7), e11862 (2010); y "Nanoscale roughness affects the activity of enzymes adsorbed on cluster-assembled titania films", L. Gailite y col., Langmuir 30(20), 5973-5981 (2014).

A causa de la distribución del tamaño de las nanopartículas, de entre 2 y 50 nm aproximadamente, y centradas entre 5 y 15 nm, la superficie del depósito tiene una rugosidad peculiar mínima, relacionada con esta distribución, e independiente del nivel de desarrollo de la estructura jerárquica de la porosidad.

El material preferido para hacer el depósito 13 es el óxido de titanio, TiO².

Este óxido tiene la peculiaridad de poder volverse superhidrófilo como resultado de la irradiación UV, como se describe inicialmente en el artículo "Light-induced amphiphilic surfaces", R. Wang y col., Nature 388,431 (1997). El término superhidrófilo, en la presente invención, se refiere al rasgo característico de una superficie en la que una medición del ángulo de contacto realizada con agua proporciona un valor igual o menor de 5°. Una posible explicación de este fenómeno se indica en el artículo "TiO²photocatalysis: A Historical Overview and Future Prospects", K. Hashimoto y col., Japanese Journal of Applied Physics 44(12), 8269-8285 (2005); el rasgo característico descrito en el artículo de Hashimoto y col. para el TiO²también se encuentra en la circonia, ZrO², como se muestra en el artículo "Light-Controlled ZrO²Surface Hydrophilicity", Rudakova A.V. y col., Scientific Reports 6, 34285 (2016).

A diferencia de otros procesos para el tratamiento de superficies como, por ejemplo, la exposición a un plasma de oxígeno (como se describe por ejemplo en el párrafo [0060] de la solicitud de patente estadounidense 2011/0281267 A1, cedida al presente solicitante), que tiene el efecto conocido de inducir la hidrofilidad indistintamente en diferentes materiales expuestos a ella, incluidos materiales poliméricos, se observó que la irradiación UV no tenía efecto sobre la hidrofobidad original del soporte.

Si, por un lado, la hidrofobidad original del soporte no se ve alterada por la radiación UV, se sabe, sin embargo, que la radiación UV también puede provocar la fotodesorción de compuestos volátiles a partir de materiales poliméricos. Estos compuestos pueden volver a asentarse en las superficies dispuestas en las inmediaciones del material polimérico irradiado, provocando una modificación sustancial de la humectabilidad del mismo: en particular, las superficies inicialmente hidrófilas, dispuestas en las inmediaciones de los materiales poliméricos, pueden hacerse hidrófobas mediante este mecanismo. El fenómeno se describe claramente, por ejemplo, en el artículo Nagai H. y col. "Flexible manipulation of microfluids using optically regulated adsorption/desorption of hydrophobic materials", Biosensors and Bioelectronics 22, 1968-1973 (2007), donde se usa para hacer una superficie de TiO²hidrófila hidrófoba.

Sorprendentemente, los autores de la invención han observado que dicho proceso de fotodesorción de compuestos volátiles y la consecuente inducción de hidrofobidad de las superficies en las inmediaciones del polímero irradiado no se produce en el caso de polímeros como polipropileno, poli(metacrilato de metilo), policarbonato y otros polímeros no elastoméricos similares. En particular, los autores de la invención han observado inesperadamente que áreas de TiO² de tamaño muy limitado (puntos de 1 mm de diámetro) depositadas sobre los polímeros mencionados anteriormente y completamente rodeadas por ellos, cuando se someten a irradiación UV no adquieren ningún rasgo característico de hidrofobidad como resultado de la fotodesorción de compuestos volátiles del polímero circundante y, a la inversa, se vuelven superhidrófilos.

Por lo tanto, la radiación UV puede aprovecharse ventajosamente para hacer superhidrófilos los depósitos porosos de óxidos de metales del grupo 4 y al mismo tiempo no afectar al carácter hidrófobo del soporte. Esto conduce al notable resultado de generar una fuerte discontinuidad hidrófila-hidrófoba en las propiedades de humectabilidad de la superficie del portamuestras, y, en particular, en el borde del depósito poroso de óxido. La barrera hidrófila-hidrófoba actúa, por lo tanto, como una estructura de contención de gotas de líquido y permite el tratamiento in situ de las muestras biológicas sin la ayuda de estructuras de contención física externas.

El tratamiento UV del portamuestras se puede realizar fácilmente como sea conveniente por el operador del análisis de MALDI, antes de utilizar el portamuestras, mediante irradiación durante al menos media hora mediante una lámpara UV de 30 W de potencia, mantenida a una distancia de aproximadamente 40 cm del portamuestras de la invención. Obsérvese que una radiación como la que se describe en la presente memoria se puede obtener fácilmente dentro de una campana de aspiración química equipada con un esterilizador de lámpara UV, comúnmente disponible en cualquier laboratorio de biología. En el caso de campanas de aspiración con lámparas UV de diferente potencia, siempre es posible volver a escalar adecuadamente la distancia y el tiempo para obtener fácilmente la irradiación descrita.

Si bien se ha descrito hasta ahora que el portamuestras de la invención tiene un solo depósito 13, será evidente para los expertos en la técnica que en la realización preferida del mismo, tendrá una pluralidad de depósitos de tipo 13; esta configuración permite realizar múltiples tratamientos y análisis en paralelo de muestras similares, o repetir tratamientos y análisis en múltiples fracciones de la misma muestra para mejorar la fiabilidad de los resultados.

El depósito (o depósitos) 13 son preferiblemente de forma circular y tienen un diámetro entre 1 y 3 mm.

Cuando en la muestra existen depósitos de múltiples tipos 13, estos normalmente se encuentran en una disposición geométrica ordenada, y preferiblemente centrados en los nodos de una retícula cuadrada, cuyo espaciado corresponde al estándar adoptado en los portamuestras utilizados en otros análisis en el campo biomédico, como las placas "multipocillo", y facilita la integración del análisis de MALDI en las secuencias operativas típicas del campo. La Fig. 3 muestra una fotografía de un portamuestras con múltiples depósitos 13 según esta realización preferida; el portamuestras de la fotografía se fabricó a partir de un soporte de plástico cargado con grafito, pero, por supuesto, los portamuestras con depósitos de múltiples tipos 13 se pueden producir tanto con soportes con la estructura sencilla que se muestra en la Fig. 1a, como con soportes con una cara recubierta del tipo que se muestra en la Fig. 1b.

El portamuestras también puede tener, en la misma cara sobre la que hay depósitos 13, diferentes depósitos, por ejemplo, para el posicionamiento sobre el portamuestras de estándares de calibración internos del análisis. Estos diferentes depósitos pueden estar ubicados en nodos de la retícula anterior (por ejemplo cuadrada), en los puntos donde no se han producido depósitos de tipo 13.

En un segundo aspecto de la misma, la invención se refiere al procedimiento para producir los portamuestras descritos anteriormente.

Los soportes para la producción del portamuestras están disponibles comercialmente o son fáciles de producir; en particular, son de disponibilidad comercial común los soportes hechos de material plástico cargado con grafito o silicio dopado, así como los portaobjetos que tienen un recubrimiento ITO uniforme en una o ambas caras. Este último posiblemente se puede hacer de forma sencilla comenzando a partir de una solución mixta de precursores de indio y estaño (por ejemplo, en un disolvente de alcohol o hidroalcohol) con técnicas bien conocidas, como sol-gel o secado por pulverización.

La formación de los depósitos 13 se puede conseguir mediante diversas técnicas, en particular las conocidas como deposición supersónica en agrupaciones de haces (SCBD) y, entre ellas, en particular la basada en una fuente pulsada de agrupaciones de microplasmas (PMCS).

Estas técnicas son conocidas en la producción de películas delgadas sobre un sustrato. La técnica SCBD basada en PMCS se describe en diversas publicaciones, como el artículo "Cluster beam deposition: a tool for nanoscale science and technology", K. Wegner y col., Journal of Physics D: Applied Physics 39(22):439-459, 2006; solicitud de patente WO 2011/121017 A1; y el capítulo "Pulsed microplasma cluster source technique for synthesis of nanostructured carbon films", P. Milani y col., páginas 561 -564 del libro "New trends in intercalation compounds for energy storage", NATO Science Series, vol. 61,2002.

Con la técnica SCBD se produce un haz de partículas del material de interés, y el haz se dirige, dentro de una cámara de presión reducida, sobre un soporte en general dispuesto ortogonalmente al eje del propio haz.

La forma y tamaño del depósito (o depósitos) 13 se determina con la interposición de una máscara física (típicamente metal) a lo largo de la haz y en las proximidades del soporte; durante la deposición, la máscara se coloca paralela al soporte, en general a una distancia de menos de 1 mm del mismo. Con el fin de llevar a cabo la deposición del material deseado sobre áreas relativamente grandes, como por ejemplo en el caso de portamuestras con depósitos de múltiples tipos 13, o en el caso de la deposición simultánea en múltiples portamuestras, resulta posible realizar una exploración del área del depósito, por ejemplo, moviendo lateralmente el soporte (y la máscara) en el plano perpendicular al eje del haz. Una misma máscara puede tener aberturas que tengan múltiples geometrías y/o dimensiones, con el fin de depositar portamuestras que tengan diferentes configuraciones en una única sesión de deposición.

Después de las deposiciones con las técnicas anteriores, el depósito 13 es en general hidrófobo.

La hidrofilidad requerida para las aplicaciones previstas se transmite al depósito mediante radiación UV en el aire, como se describe anteriormente. Al operar según este modo preferido, el depósito 13 se puede hacer superhidrófilo como sea conveniente, por ejemplo mediante radiación durante al menos media hora por medio de una lámpara UV de 30 W de potencia, mantenida a una distancia de aproximadamente 40 cm del portamuestras de la invención, sin tener ningún efecto sobre la hidrofobidad original del soporte ni afectar a la naturaleza superhidrófila de los depósitos por fotodesorción de compuestos volátiles del soporte. El tratamiento UV del portamuestras se puede realizar fácilmente como sea conveniente por el operador del análisis de MALDI antes de utilizar el portamuestras, utilizando, por ejemplo, una campana de aspiración química equipada con un esterilizador de lámpara UV, comúnmente disponible en cualquier laboratorio de biología.

El portamuestras de la invención presenta una serie de ventajas y rasgos característicos que lo hacen particularmente adecuado y versátil en diversos modos de análisis de MALDI.

Los autores de la invención han observado en primer lugar que el depósito 13 es capaz de unir materiales biológicos muy diferentes, en particular con respecto a su tamaño: desde biomoléculas aisladas individuales (p. ej., péptidos y proteínas en solución), hasta entidades biológicas más complejas y más grandes, como exosomas, microvesículas, bacterias o células. En particular, los autores de la invención han observado inesperadamente que, en el caso de exosomas o microvesículas, cuyo tamaño está en el intervalo de 10-100 nm, la estructura jerárquica de la porosidad, consecuencia de la dinámica balística de crecimiento del depósito, presenta cavidades de un tamaño adecuado a su captura. En general, los autores de la invención creen que la versatilidad del portamuestras de la materia con respecto a la captura de materiales biológicos muy diferentes proviene del efecto combinado de nanoporosidad en las escalas del tamaño de interés y de la bioafinidad entre el óxido de titanio y, en general, de los óxidos de metales del grupo 4 y las biomoléculas presentes en las membranas de estas entidades biológicas (p. ej., proteínas de membrana). Además, tanto el óxido como los materiales de la cara 12 o 12' son químicamente inertes y permiten el tratamiento in situ de la muestra biológica, por ejemplo con ácidos o bases. Los depósitos de óxidos de metales del grupo 4 en los espesores a los que se utilizan son sustancialmente transparentes, lo que permite, cuando se depositan en portaobjetos de vidrio, opcionalmente recubiertos con ITO, el análisis con microscopio óptico antes o después del análisis de MALDI; estos materiales tampoco son autofluorescentes, para no superponer una señal falsa a la de la muestra en los análisis basados en fluorescencia. Finalmente, en el caso común en el que el portamuestras tiene depósitos del tipo 13 adecuadamente largos, estos permiten la adherencia de cortes del tejido biológico; de esta forma se evita el problema, que se produce con algunos portamuestras de la técnica anterior (y que conlleva irremediablemente la imposibilidad de utilizar la muestra en el análisis imagenológico por MALDI), del movimiento o el doblado sobre sí mismo del corte histológico como consecuencia del lavado o tratamientos con reactivos especiales realizados in situ antes del análisis (como, por ejemplo, tratamiento con cloroformo para la deslipidación de un tejido), o incluso posterior a éste (por ejemplo, tratamiento con soluciones de metanol para la eliminación de la matriz). Sorprendentemente, los autores de la invención han observado que la adherencia del tejido al depósito ofrece una ventaja inesperada, particularmente pertinente con respecto al problema, comúnmente conocido en la práctica de MALDI en muestras histológicas (imagenología por MALDI), de la variación de las dimensiones planas de los cortes histológicos como resultado de los tratamientos in situ. Este problema consiste en una ligera expansión o contracción de las dimensiones planas del tejido, lo que dificulta la superposición de las imágenes por MALDI con imágenes ópticas del tejido, obtenidas por ejemplo mediante un escáner óptico, si entre las unas y las otras ha habido, como es habitual, tratamientos de la muestra. Actualmente, los expertos en la materia buscan superar este inconveniente mediante el uso de algoritmos de software aplicados a las imágenes, que actúan alterando las dimensiones de las mismas. Gracias a la adherencia mejorada del tejido, el uso del portamuestras de la presente invención impide la variación de las dimensiones planas de los cortes histológicos posteriores a los tratamientos in situ y hace superfluas las operaciones de procesamiento de imágenes, con ventajas en términos de tiempo de análisis de resultados, así como en cuanto al riesgo de introducir artefactos debido al procesamiento de las imágenes.

La mejora de la adherencia de los cortes histológicos también adquiere especial importancia en el uso de la técnica de MALDI para estudios farmacocinéticos, cuya finalidad es la identificación de la distribución espacial de un fármaco (o su principio activo o uno o más de sus metabolitos, o uno de sus componentes) dentro de un tejido. En esta aplicación de la técnica de MALDI, a diferencia de lo ilustrado anteriormente, no puede realizarse ningún tratamiento químico del tejido: cualquier tratamiento provocaría, de hecho, la elución de los compuestos de prueba y la consecuente pérdida de información sobre su distribución espacial en el tejido. Dado que el uso de reactivos especiales (como el cloroformo) puede provocar el desprendimiento del corte histológico y la consecuente inutilidad de la muestra, también la ausencia total de tratamientos, como el impuesto en los experimentos de farmacocinética MALDI, hace que la muestra sea particularmente frágil: cualquier ensayo posterior al análisis de MALDI realizado en la misma muestra (por ejemplo, tinción inmunohistoquímica) puede conllevar fácilmente el desprendimiento del corte histológico y la consecuente pérdida de la muestra. En cambio, este problema se resuelve con el portamuestras de la presente invención, en el que la adherencia del corte histológico se mejora sustancialmente por la presencia del óxido poroso.

En referencia adicional al uso del portamuestras de la invención, la hidrofilidad de los depósitos 13 y la hidrofobidad de la superficie circundante de la cara 12 o 12' permite atraer y localizar de forma exacta y uniforme sobre los depósitos 13 las gotas de solución acuosa que contienen la especie a analizar, incluso cuando la dispensación del líquido no es muy exacta. Además, gracias a la hidrofilidad de los depósitos 13 y la hidrofobidad del área circundante, las gotas de solución se concentrarán en los depósitos también en el caso de cantidades relativamente altas de líquido, sin necesidad de áreas elevadas u otras estructuras de contención alrededor de los propios depósitos; este efecto se muestra en la Fig. 4, en la que se muestran gotas de solución a base de agua, cuya huella en el portamuestras permanece confinada dentro de los depósitos 13 a pesar del gran volumen de la gota; el mismo volumen, sin el confinamiento dado por la discontinuidad hidrófila-hidrófoba, ocuparía un área mucho mayor. Asimismo, cualquier gota de solución de reactivo también se limita al área de los depósitos 13 para el tratamiento in situ de muestras biológicas depositadas previamente en las mismas áreas. Inesperadamente, se ha observado que el confinamiento dado por la barrera hidrófoba alrededor de la superficie hidrófila es eficaz hasta el punto de permitir acciones mecánicas sobre la propia gota, como la manipulación, mediante pipeta manual o sistemas automatizados de manipulación de líquidos, de un volumen adecuado de agua hacia adelante y hacia atrás decenas de veces, con el fin de llevar a cabo el lavado de la muestra previamente absorbida sobre el óxido poroso e hidrófilo (por ejemplo, para la eliminación de residuos de sal, consecuencia de la preparación de muestras de proteínas).

Finalmente, los autores de la invención han encontrado una ventaja inesperada proporcionada por el portamuestras como consecuencia de la peculiar rugosidad mínima del depósito poroso de óxido y correlacionada con la distribución del tamaño de las nanopartículas utilizadas para producir el depósito: esta rugosidad proporciona una densidad muy alta (por unidad de superficie del depósito) de los centros de nucleación en los que se puede iniciar la cristalización de la matriz empleada en la técnica de MALDI, cuando la solución que contiene la propia matriz, presente en el depósito, comienza a evaporarse. Esto permite obtener una distribución óptima de los cristales de la matriz de MALDI, es decir, una alta densidad superficial de pequeños cristales, distribuidos uniformemente sobre toda el área del depósito 13, lo que elimina el problema de la búsqueda (manual o automática) del cristal más adecuado a irradiar por el pulso de láser (en el argot denominado "punto caliente"). Los materiales de la matriz pueden ser, por ejemplo, ácido a-ciano-4-hidroxicinámico (en general indicado en el campo con la abreviatura CHCA) o ácido sinápico (normalmente abreviado como SA), en soluciones de acetonitrilo y/o ácido trifluoroacético en agua. Resulta posible cuantificar la mínima rugosidad peculiar del depósito poroso de óxido correlacionada con la distribución de tamaño de las nanopartículas utilizadas para producir el depósito mediante mediciones de microscopía de fuerza atómica (AFM) sobre depósitos constituidos por una única monocapa de nanopartículas. El procedimiento se describe en el apartado II.B del artículo de Podesta y col. mencionado anteriormente. En una serie de mediciones llevadas a cabo por los autores de la invención sobre depósitos constituidos por una única monocapa de nanopartículas, se encontró que la rugosidad mínima rms de los depósitos de óxido formados sobre los soportes era de aproximadamente 3-5 nm. También resulta posible estimar el número de centros de nucleación por unidad de superficie, imaginando una monocapa de partículas esféricas de 10 nm de diámetro (por lo tanto, entre 5 y 15 nm) y suponiendo que cada nanopartícula constituye un centro de nucleación. En estos supuestos, se encuentra que el número de centros de nucleación es mayor que 1x1010 por milímetro cuadrado. El desarrollo tridimensional de la película nanoporosa para espesores superiores a la monocapa aumenta aún más el número de centros de nucleación para la unidad de superficie geométrica.

Después de ser activado por exposición a UV de la forma sencilla descrita anteriormente, el portamuestras de la invención puede usarse en la preparación para el análisis de MALDI según diversos protocolos posibles, como por ejemplo los que se ejemplifican a continuación; todas las gotas de soluciones de muestra o de estándares de calibración tienen un volumen del orden de magnitud de microlitros.

Protocolo 1 - Procedimiento básico

1.a) Pipetear una gota de la muestra biológica a analizar en un depósito 13 del portamuestras de la invención;

1.b) esperar a que la gota se seque;

1.c) pipetear una gota de una solución de matriz de MALDI, como SA o CHCA, en la misma zona del punto 1.a;

1.d) esperar el secado de la gota;

1.e) pipetear una gota de solución de un estándar de calibración en un tipo 13 de depósito específico del portamuestras;

1.f) esperar el secado de la gota;

1.g) si la solución del estándar de calibración del punto 1.e no se ha suministrado ya con la matriz de MALDI, pipetear una gota de una solución de matriz de MALDI, como SA o CHCA y esperar el secado de la misma.

Protocolo 2 - Procedimiento con lavado de la muestra

2.a) Pipetear una gota de la muestra biológica a analizar en un depósito 13 del portamuestras de la invención; 2.b) esperar el secado de la gota;

2.c) lavar la muestra (por ejemplo, para eliminar la sal) pipeteando una gota de agua en la misma zona del punto 2.a y moviendo el émbolo de la pipeta hacia adelante y hacia atrás; luego, eliminar la gota de agua;

2.d) repetir la etapa 2.c al menos una vez;

2.e) pipetear una gota de una solución de matriz de MALDI, como SA o CHCA, en la misma zona del punto 2.a; 2.f) esperar el secado de la gota;

2.g) pipetear una gota de solución de un estándar de calibración en un tipo 13 de depósito específico del portamuestras;

2. h) esperar el secado de la gota;

2.1) si la solución del estándar de calibración del punto 2.g no se ha suministrado ya con la matriz de MALDI, pipetear una gota de una solución de matriz de MALDI, como SA o CHCA y esperar el secado de la misma.

Protocolo 3 - Procedimiento con tratamiento químico de la muestra

3. a) Pipetear una gota de la muestra biológica a analizar en un depósito 13 del portamuestras de la invención; 3.b) esperar el secado de la gota;

3.c) tratar químicamente la muestra pipeteando una gota de una solución acuosa de un reactivo adecuado (p. ej., etanol para la deshidratación de la muestra) en la misma área del punto 3.a, y moviendo el émbolo de la pipeta hacia adelante y hacia atrás; luego, desechar la gota de solución acuosa;

3.d) repetir la etapa 3.c al menos una vez;

3.e) pipetear una gota de una solución de matriz de MALDI, como SA o CHCA, en la misma zona del punto 3.a; 3.f) esperar el secado de la gota;

3.g) pipetear una gota de solución de un estándar de calibración en un depósito de tipo 13 específico del portamuestras;

3. h) esperar el secado de la gota;

3.1) si la solución del estándar de calibración del punto 3.g no se ha suministrado ya con la matriz de MALDI, pipetear una gota de una solución de matriz de MALDI, como SA o CHCA y esperar el secado de la misma.

Protocolo 4 - Procedimiento con tratamiento enzimático de la muestra

4. a) Pipetear una gota de la muestra biológica a analizar en un depósito 13 del portamuestras de la invención; 4.b) esperar el secado de la gota;

4.c) realizar la digestión enzimática de la muestra pipeteando una gota del enzima en el tampón de digestión (p. ej., tripsina en bicarbonato de amonio) sobre la misma área del punto 4.a; luego, incubar a una temperatura adecuada y durante un tiempo adecuado (tal como 50 °C durante 30 minutos), preferiblemente en un volumen cerrado con el fin de limitar la evaporación del tampón;

4.d) esperar el secado de la gota;

4.e) pipetear una gota de una solución de matriz de MALDI para péptidos, como CHCA, en la misma zona del punto 4.a;

4.f) esperar el secado de la gota;

4.g) pipetear una gota de solución de un estándar de calibración en un tipo 13 de depósito específico del portamuestras;

4.h) esperar el secado de la gota;

4.1) si la solución del estándar de calibración del punto 4.g no se ha suministrado ya con la matriz de MALDI, pipetear una gota de una solución de matriz de MALDI, como SA o CHCA y esperar el secado de la misma.

Protocolo 5 - Procedimiento para mediciones con pretratamiento y postratamiento enzimático

5.a) Después de realizar cualquiera de los protocolos 1 a 3 y después de recopilar los datos del análisis de MALDI, retirar la matriz de MALDI pipeteando una gota de una solución acuosa de metanol en la misma zona que se está analizando, mover el émbolo de la pipeta hacia adelante y hacia atrás; luego, desechar la gota de solución acuosa; 5.b) realizar la digestión enzimática de la muestra pipeteando una gota del enzima en el tampón de digestión (p. ej., tripsina en bicarbonato de amonio) sobre la misma área del punto 5.a; luego, incubar a una temperatura adecuada y durante un tiempo adecuado (tal como 50 °C durante 30 minutos), preferiblemente en un volumen cerrado con el fin de limitar la evaporación del tampón;

5.c) esperar el secado de la gota;

5.d) pipetear una gota de una matriz de MALDI para péptidos, como CHCA, en la misma zona del punto 5.a; 5. e) esperar el secado de la gota.

Protocolo 6 - Procedimiento de preparación de la muestra para mediciones de histología molecular (imagenología por MALDI) para farmacocinética

6. a) Cortar una sección de tejido crioconservado utilizando un criomicrotomo y colocarla en un portamuestras de la invención, al menos un depósito del tipo 13 de tamaño adecuado;

6.b) montar el tejido mediante descongelación (por ejemplo, mediante el calor de un dedo colocado en la parte posterior del portamuestras) y dejar que se adhiera a la superficie del portamuestras;

6.c) pipetear una gota de solución de un estándar de calibración que no incluya la matriz de MALDI en un tipo 13 de depósito específico del portamuestras;

6.d) esperar el secado de la gota;

6.e) con la ayuda de instrumentación específica (como un instrumento Bruker Immagine Prep), atomizar una solución de matriz de MALDI para proteínas/péptidos, como SA o CHCA, al menos en las áreas definidas en los puntos 6.a y 6.c;

6. f) esperar el secado de la matriz.

Protocolo 7 - Procedimiento de preparación y tratamiento in situ de la muestra para mediciones de histología molecular (imagenología por MALDI) para proteómica

7. a) Cortar una sección de tejido crioconservado utilizando un criomicrotomo y colocarla en un portamuestras de la invención, al menos un depósito del tipo 13 de tamaño adecuado;

7.b) montar el tejido mediante descongelación (por ejemplo, mediante el calor de un dedo colocado en la parte posterior del portamuestras) y dejar que se adhiera a la superficie del portamuestras;

7.c) tratar el corte de tejido con productos químicos adecuados, como puede ser etanol para la deshidratación, acetona para la fijación o cloroformo para la deslipidación;

7.d) pipetear una gota de solución de un estándar de calibración que no incluya la matriz de MALDI en un tipo 13 de depósito específico del portamuestras;

7.e) esperar el secado de la gota;

7.f) con la ayuda de instrumentación específica (como un instrumento Bruker Immagine Prep), atomizar una solución de matriz de MALDI para proteínas/péptidos, como SA o CHCA, al menos en las áreas definidas en los puntos 7.a y 7.d;

7. g) esperar el secado de la matriz.

Protocolo 8 - Procedimiento de análisis secuencial (MALDI e inmunohistoquímica)

8. a) Después de realizar cualquiera de los protocolos 6 o 7, y después de recopilar los datos del análisis de MALDI, retirar la matriz de MALDI, como por ejemplo, mediante sonicación débil en una solución acuosa de metanol;

8.b) esperar el secado de la muestra retirada de esta manera;

8.c) realizar una inmunohistoquímica (IHC) o cualquier ensayo de tinción genérico de la muestra (por ejemplo, hematoxilina).

Como resultará evidente para los expertos en la técnica, también son posibles otros protocolos, por ejemplo derivados de combinaciones de los ocho protocolos descritos anteriormente; los portamuestras MALDI de la invención son adecuados para realizar todos estos protocolos de forma automatizada, con una plataforma robótica para la manipulación de muestras líquidas y soluciones de tratamiento, lo que permite realizar el análisis de un gran número de muestras por unidad de tiempo. Con el fin de emplear procedimientos automatizados, el portamuestras de la invención puede montarse en un adaptador adecuado que permita la inserción estable del mismo en la cámara de muestras de un espectrómetro de masas.

La invención se describirá a continuación en el siguiente apartado de experimentación.

Ejemplo 1

Este ejemplo se refiere a la producción y caracterización de un primer portamuestras para el análisis de MALDI según la invención.

Se utilizó como soporte una placa de polipropileno cargada con grafito, con una resistividad del volumen del orden de 3x102 Q x cm y dimensiones de 75x25x1 (mm).

El soporte se introdujo en la cámara de deposición de un aparato para deposiciones de SCBD. Delante del soporte, a una distancia de 1 mm de este, se colocó una máscara física (placa metálica perforada), que tiene dos series de aberturas circulares de diámetro de 1 mm y 2 mm, cada una con un espaciado de 4.5 mm entre los centros de las respectivas aberturas circulares, y desplazados entre sí por 2,25 mm en dirección vertical y horizontal.

Mediante la técnica SCBD, en las aberturas de la máscara, se obtuvieron depósitos nanoporosos de TiO²sobre el soporte, con un espesor de aproximadamente 200 nm, producidos por deposición de nanopartículas generadas por PMCS. Los principales parámetros de proceso utilizados fueron: Presión de línea de gas de argón (gas de proceso) = 40 bar, tensión de descarga = 900 V, duración de descarga = 60 ps, número de pulsos por unidad de tiempo = 4 (tasa de repetición = 4 Hz), tiempo de apertura nominal de la válvula de pulsos = 220 ps, presión promedio en la cámara de expansión durante el proceso = 2,4x10-3 mbar, distancia fuente-soporte = 50 cm.

El resultado de la prueba de deposición se muestra en la fotografía reproducida en la Fig. 3. Las Figuras 5a y 5b muestran fotografías de la superficie de un depósito de TiO²obtenido por microscopía electrónica de barrido (SEM) a 70000 y 200000 aumentos, respectivamente. Estas microfotografías muestran las nanopartículas que constituyen el depósito y destacan tanto la estructura nanoporosa como la jerarquía de porosidad de la misma.

Ejemplo 2

Se repitió el procedimiento del Ejemplo 1 pero usando en este caso, como soporte, una placa de vidrio de dimensiones de 75x25x1 (mm) con un recubrimiento superficial de ITO, que confiere una resistencia superficial al soporte del orden de 100 Q x cuadrado, y una máscara adecuada con tres aberturas cuadradas de 15 mm de lado y dos aberturas circulares de 2 mm de diámetro. Se obtiene un portamuestras como el que se muestra en la Figura 6. Los depósitos de TiO², analizados por SEM, presentan las mismas características morfológicas (tamaño de partícula de las nanopartículas de TiO²y la distribución de la porosidad) como en el Ejemplo 1.

Ejemplo 3

El portamuestras producido como se describe en el Ejemplo 1 se utilizó para realizar los análisis de MALDI según el Protocolo 5 (procedimiento para mediciones con pretratamiento y postratamiento enzimático), operando sobre uno de los depósitos de 2 mm de diámetro presentes en el portamuestras.

Se pipeteó un volumen de 2pL de BSA (albumina de suero bovino) en solución acuosa sobre uno de los depósitos del portamuestras, esperando la evaporación del disolvente (agua Milli-Q).

Una vez finalizada la evaporación, sobre el mismo depósito se pipeteó un volumen de 1 pl de una solución con concentración saturada de un precursor de la matriz de MALDI para proteínas (ácido sinápico) en acetonitrilo y agua en una proporción de 1:2 (volumen). Se esperó la evaporación del disolvente y la formación de cristales matrizmuestra.

El portamuestras así preparado se introdujo en el espectrómetro de masas MALDI (Bruker UltrafleXtreme) y se adquirió la señal producida por la muestra BSA; el resultado de la prueba se muestra en la Figura 7.

A continuación, se extrajo el portamuestras del espectrómetro y se realizó la eliminación de la matriz de MALDI cristalizada mediante lavado in situ con 2 pl de una solución de metanol al 70% de volumen en agua.

La digestión enzimática de la muestra se llevó a cabo pipeteando un volumen de 5 pl de una solución acuosa de bicarbonato de amonio 40 mM (tampón) a la que se añadió un volumen de 1 pl de solución acuosa de tripsina a una concentración de 0,05 pg/pl. El portamuestras tratado de esta manera se mantuvo durante aproximadamente 30 minutos a una temperatura de 45-50 °C en un volumen cerrado (para limitar la evaporación del tampón).

Después de la incubación, se esperó la evaporación completa del volumen residual de tampón de bicarbonato de amonio en agua.

Después de la evaporación completa, en el mismo depósito se pipeteó un volumen de 1 gl de una solución de concentración saturada de precursor de matriz de MALDI para péptidos (CHCA) en acetonitrilo y agua en proporciones de 1:2 (en volumen). Se esperó la evaporación del disolvente y la formación de cristales matriz-muestra.

El portamuestras así preparado se volvió a introducir en el espectrómetro de masas MALDI y se adquirió la señal producida por los péptidos generados por la digestión enzimática de la muestra de BSA. El resultado de la prueba se muestra en el espectro de la Figura 8.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Portamuestras (10; 10') para su uso en la técnica de MALDI, que comprende:

- un soporte, seleccionado entre:

a) un soporte (11) hecho de un polímero no elastomérico cargado con carbón grafítico (relleno de negro de carbono), que tiene una resistividad del volumen inferior a 1012üx cm y un ángulo de contacto en una medición de la humectabilidad al agua al menos igual a 90°;

o

b) un soporte (11') que tiene al menos una cara cubierta con una capa (14) de un polímero no elastomérico cargado con carbono grafítico (relleno de negro de carbono), que tiene una resistividad de la superficie inferior a 10 kü x cuadrado y un ángulo de contacto en una medición de la humectabilidad al agua al menos igual a 90°;

- en una cara (12) del soporte en el caso a) o en dicha cara cubierta (12') en el caso b), uno o más depósitos (13) de un óxido de un metal del grupo 4 de la tabla periódica de los elementos, que tiene un espesor entre 100 y 400 nm y consiste en nanopartículas de dicho óxido que tienen un tamaño entre 2 y 50 nm, dichos uno o más depósitos rodeados completamente por el polímero del soporte en el caso a) o por el polímero de dicha capa en el caso b);

en el que dichos uno o más depósitos de óxidos se obtienen mediante un crecimiento balístico a partir de dichas nanopartículas y tienen una estructura autoafín, que tiene una jerarquía de porosidad de un nanómetro a cien nanómetros;

y en el que la superficie del portamuestras sobre la que se encuentran dichos uno o más depósitos de óxido se trata con radiación UV de tal manera que los depósitos muestran un ángulo de contacto menor de 5° a una medición de la humectabilidad al agua mientras se realiza el mismo tratamiento con radiación UV no altera la hidrofobidad del soporte en el caso a) o del polímero de dicha capa en el caso b).

2. Portamuestras según la reivindicación 1, en el que dichos depósitos tienen un espesor entre 150 y 300 nm, y la curva de distribución del tamaño de partícula de las nanopartículas de óxido que las forman tiene un máximo en el intervalo entre 5 y 15 nm.

3. Portamuestras según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que dichos uno o más depósitos de un óxido de un metal del grupo 4 de la tabla periódica de los elementos tienen, en una medición con un microscopio de fuerza atómica (AFM), una rugosidad mínima rms entre 3 y 5 nm.

4. Portamuestras según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dichos uno o más depósitos de un óxido de un metal del grupo 4 de la tabla periódica de los elementos tienen una densidad de centros de nucleación superior a 1x1010 por milímetro cuadrado.

5. Portamuestras según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho polímero no elastomérico cargado con carbono grafítico (relleno de negro de carbono) de dicho soporte (11) o de dicha capa (14) se selecciona entre polipropileno, polietileno, poliestireno, poli(metacrilato de metilo) y policarbonato.

6. Portamuestras según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que existe una pluralidad de depósitos de óxido de un metal del grupo 4 en una disposición geométrica ordenada y, preferentemente, centrados en los nodos de una retícula cuadrada con un espaciado correspondiente al estándar adoptado en las placas multipocillo.

7. Portamuestras según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que en la misma cara se encuentran depósitos de óxido de un metal del grupo 4 y depósitos, en general, realizados con el mismo óxido pero de diferente tamaño, para el posicionamiento sobre el portamuestras de estándares de calibración internos del análisis de MALDI.

8. Portamuestras según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que tiene unas dimensiones laterales de 25 x 75 mm y un espesor de 1 mm.

9. Soporte de muestra según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho óxido de un metal del grupo 4 de la tabla periódica de los elementos es el óxido de titanio, TiO².

10. Procedimiento para la producción de un portamuestras según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende las siguientes etapas:

- obtener un soporte (11) constituido por un polímero no elastomérico cargado con carbón grafítico (relleno de negro de carbono), que tiene una resistividad del volumen inferior a 1012üx cm y un ángulo de contacto en una medición de la humectabilidad al agua al menos igual a 90°;

o

obtener un soporte (11') que tiene al menos una cara cubierta con una capa (14) de un polímero no elastomérico cargado con carbono grafítico (relleno de negro de carbono), que tiene una resistividad de la superficie inferior a 10 kü x cuadrado y un ángulo de contacto en una medición de la humectabilidad al agua al menos igual a 90°;

- colocar en las inmediaciones del soporte, entre éste y la fuente del material a depositar sobre el mismo, una máscara física que tenga una o más aberturas que tengan una geometría correspondiente a uno o más depósitos de un óxido de un metal del grupo 4 que se pretenden conformar sobre el soporte, girando hacia dicha fuente la cara cubierta con dicha capa (14) en el caso del soporte (11') con una cara cubierta;

- depositar con la técnica deposición supersónica en agrupaciones de haces (SCBD), en una cara (12) del soporte en el caso a) o en dicha cara cubierta (12') en el caso b), uno o más depósitos (13) de un óxido de un metal del grupo 4 de la tabla periódica de los elementos, constituido por nanopartículas de dicho óxido de dimensiones que oscilan entre 2 y 50 nm y que tienen un espesor entre 100 y 400 nm, completamente rodeado por el polímero del soporte en el caso a) o por el polímero de dicha capa en el caso b), formando una estructura porosa autoafín que tiene una jerarquía de porosidad de un nanómetro a cien nanómetros;

- tratar la superficie del portamuestras sobre la que se encuentran dichos uno o más depósitos por radiación UV, para conferir a dichos depósitos un ángulo de contacto de menos de 5° en una medición de humectabilidad al mismo tiempo que se conservan los rasgos característicos de hidrofobidad del soporte circundante.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que la técnica de deposición supersónica en agrupaciones de haces adoptada se basa en una fuente pulsada de agrupaciones de microplasmas (PMCS).

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11, en el que el depósito de óxido de metal del grupo 4 se hace hidrófilo mediante irradiación durante más de media hora con una lámpara UV de 30 W de potencia, mantenida a una distancia de unos 40 cm de dichos uno o más depósitos.