ES2851208T3 - Uso de derivados de maleimida para prevenir y tratar el cáncer - Google Patents

Abstract

Un compuesto de fórmula (V) **(Ver fórmula)** una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, un hidrato del mismo, o un solvato del mismo; para su uso en un método para el tratamiento y/o la prevención del cáncer, en donde, R1 se selecciona del grupo que consiste en metilo e hidrógeno; R4 es hidrógeno; R6 es metilo; y R7 es hidrógeno.

Description

DESCRIPCIÓN

Uso de derivados de maleimida para prevenir y tratar el cáncer

La presente invención se refiere a un compuesto químico de fórmula (V) para su uso en el tratamiento del cáncer. La terapia del cáncer es un campo de la ciencia en rápida evolución, que hoy en día crece cada vez más en terapias dirigidas, empleando anticuerpos contra epítopos específicos del cáncer o moléculas pequeñas que interfieren con las rutas específicas del cáncer. Incluso frente a estas grandes progresiones, todavía existe un alto valor clínico y una fuerte necesidad de innovaciones, debido a resistencias mejor entendidas, altas toxicidades y efectos adversos de los fármacos que afectan a los microtúbulos en células eucariotas. Dichos agentes de unión a microtúbulos pueden clasificarse por su afinidad por diferentes sitios de unión en microtúbulos y/o heterodímeros de ap-tubulina. Estos fármacos alteran el equilibrio de la ' ' inestabilidad dinámica '' en los microtúbulos al promover su ensamblaje y estabilidad o al alterar el ensamblaje de los heterodímeros de tubulina, lo que interfiere particularmente con la progresión celular durante la mitosis y, en última instancia, apoya la inducción de apoptosis (Matson y Stukenberg, Spindle poisons and destino celular: una historia de dos vías. Mol.Interv. 11,2011). Se ha descrito que los indoles de fuentes naturales, así como los productos semisintéticos y sintéticos, muestran características antimitóticas debido a la inhibición de la polimerización de la tubulina, la mayoría de ellas al unirse al sitio de la colchicina (Brancale y Silvestri, Indole, a core nucleus for potent inhibitors of tubulin polymerization. Med.Res.Rev. 27, 2007). Especialmente los agentes inhibidores de la tubulina han dado lugar a un conjunto de moléculas pequeñas, entre ellas las combrestatinas como sustancias principales, que interfieren con la vasculatura del cáncer, un objetivo prometedor en la terapia contra el cáncer (Kanthouand Tozer, Microtubule depolymerizing vascular disrupting agents: novel therapeutic agents for oncology and other pathologies. Int.J.Exp.Pathol. 90, 2009). Por tanto, las moléculas pequeñas que contienen un indol como estructura central son de especial interés para emplearse en el tratamiento del cáncer.

Anahit Pews-Davtyan et al, "Efficient palladium-catalysed synthesis of 3-aryl-4-indolylmaleimides", ORGANIC & BIOMOLECULAR CHEMISTRY, vol. 6, no. 6, 01.01.2008, página 992, describe la síntesis del compuesto PDA-66. Heidel Florian et al, "3,4-diarylmaleimides - a novel class of kinase inhibitors- effectively induce apoptosis in FLT3-ITD-dependent cells", ANNALS OF HEMATOLOGY, vol. 91, no. 3, 03.2012, páginas 331-344, describe las 3,4-diarilmaleimidas DHF125 y DHF150 para su uso en el tratamiento de la AML solas o en terapias de combinación. El problema subyacente a la presente invención es la provisión de medios adecuados para el tratamiento del cáncer. Un problema adicional subyacente a la presente invención es la provisión de una composición farmacéutica adecuada para el tratamiento del cáncer. Un problema aún adicional subyacente a la presente invención es la provisión de un método para el tratamiento del cáncer.

El problema subyacente a la presente invención se resuelve mediante la materia objeto de las reivindicaciones independientes adjuntas; realizaciones preferidas pueden tomarse de las reivindicaciones dependientes adjuntas. Más específicamente, el problema subyacente a la presente invención se resuelve en un primer aspecto mediante un compuesto de fórmula (V)

una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, un hidrato del mismo, o un solvato del mismo; para su uso en un método para el tratamiento y/o la prevención del cáncer,

en donde,

R1 se selecciona del grupo que consiste en metilo e hidrógeno;

R4 es hidrógeno;

R5 es metilo;

R6 es metilo; y

R7 es hidrógeno.

En una realización, R1 es metilo.

En una realización alternativa, R1 es hidrógeno.

En una realización, el compuesto es 3-(4-acetilfenil)-1-metil-4-(2-metiMH-indol-3-il)-1H-pirrol-2,5-diona

En una realización alternativa, el compuesto es 3-(4-acetilfenil)-4-(2-metil-1H-indol-3-il)-1H-pirrol-2,5-diona

En una realización, el cáncer se selecciona del grupo que comprende cáncer de mama, cáncer de pulmón, que incluye carcinoma de pulmón de células no pequeñas, cáncer renal, cáncer de colon, síndrome mielodisplásico, cáncer genitourinario, cáncer gastrointestinal, cáncer epidermoide, melanoma, glioma, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, linfoma, mieloma, cáncer de cuello y recto, neuroblastoma, cáncer de cabeza y/o cáncer, cáncer de vejiga, cáncer de cerebro en un sentido más amplio y cáncer gástrico en un sentido más amplio, cualquier metástasis de cualquiera de los mismos.

En una realización, el método para el tratamiento y/o prevención del cáncer comprende la administración de un segundo agente terapéutico, en el que el segundo agente terapéutico es un agente quimioterapéutico.

En una realización, el agente quimioterapéutico se selecciona del grupo que comprende citarabina, etopósido, mitoxantrón, ciclofosfamida, ácido retinoico, daunorrubicina, doxorrubicina, idarrubicina, azacitidina, decitabina, un inhibidor de tirosina-quinasa, un anticuerpo antineoplásico, alcaloides de la vinca y esteroides,

En una realización, el agente quimioterapéutico es un inhibidor de tirosina-quinasa, en donde el inhibidor de tirosinaquinasa se selecciona del grupo que comprende sorafenib, dasatinib, nilotinib, nelarabina y fludarabina.

En una realización, el agente quimioterapéutico es Alemtuzumab (Campath®).

La presente invención se basa en el sorprendente hallazgo de que el compuesto de la invención es capaz de inhibir GSK3p. Más específicamente, la presente invención se basa en el sorprendente hallazgo de que el compuesto de la invención es adecuado para el tratamiento del cáncer. En base a este hallazgo, el compuesto de la invención puede usarse en el tratamiento de una enfermedad que involucra a GSK3p. El cáncer es una enfermedad que involucra a GSK3P, por lo que el cáncer es preferiblemente cualquiera de los siguientes: cáncer de mama, cáncer de pulmón, incluido el carcinoma de pulmón de células no pequeñas, cáncer renal, cáncer de colon, síndrome mielodisplásico, cáncer genitourinario, cáncer gastrointestinal, cáncer epidermoide, melanoma, glioma, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, linfoma, mieloma, cáncer colorrectal, neuroblastoma, cáncer de cabeza y/o cuello, cáncer de vejiga, cáncer de cerebro en un sentido más amplio y cáncer gástrico en un sentido más amplio.

Un compuesto de la invención puede existir en forma libre o en forma de sal y/o en forma de solvato o de la sal del mismo. Una "sal farmacéuticamente aceptable" de un compuesto se refiere a una sal que es farmacéuticamente aceptable y que posee la actividad farmacológica deseada del compuesto original. "Sales fisiológica o farmacéuticamente aceptables" de un compuesto de la invención incluyen, pero no se limitan a sales por adición de ácidos con a) ácidos inorgánicos, tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico o ácido fosfórico y similares, o formadas con b) ácidos orgánicos, que incluyen, pero no se limitan a ácidos carboxílicos, tales como, p. ej., ácido acético, ácido tartárico, ácido láctico, ácido cítrico, ácido maleico, ácido malónico, ácido succínico, ácido ascórbico, ácido fumárico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácido benzoico, ácido glucónico y similares, o c) ácidos sulfónicos, tales como, p. ej., ácido metanosulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido toluenosulfónico, ácido canforsulfónico y similares.

Solvatos fisiológicamente aceptables son preferiblemente hidratos.

Una enfermedad que involucra a GSK3p es una enfermedad en la que las células que expresan GSK3p y los tejidos que expresan GSK3p, respectivamente, son la causa de la enfermedad y/o los síntomas de la enfermedad, o son parte de la patología subyacente de la enfermedad. En la realización de la enfermedad, preferiblemente cuando se usa en relación con el tratamiento, el tratamiento y/o la terapia de la enfermedad, que afecta las células, el tejido y la patología, respectivamente, da como resultado la cura, el tratamiento o la mejora de la enfermedad y/o síntomas de la enfermedad.

Numerosos aspectos y ventajas adicionales de la invención resultarán evidentes para los expertos en la técnica al considerar la siguiente descripción detallada de la invención que describe realizaciones actualmente preferidas de la misma.

Como se usa preferiblemente en este documento, la expresión "excipiente farmacéuticamente aceptable" se refiere a un excipiente que es útil para preparar una composición farmacéutica que es generalmente segura, no tóxica y ni biológica ni de otra manera indeseable, o que afecta adversamente al beneficio terapéutico del compuesto de la invención. Un "excipiente farmacéuticamente aceptable" como se usa preferiblemente en la memoria descriptiva y las reivindicaciones incluye tanto uno como más de uno de dichos excipientes. Un excipiente de este tipo puede ser cualquier sólido, líquido, semi-sólido. Excipientes farmacéuticos sólidos incluyen almidón, celulosa, talco, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, greda, gel de sílice, estearato de magnesio, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo y similares. Excipientes líquidos y semisólidos pueden seleccionarse de glicerol, propilenglicol, agua, etanol y diversos aceites, incluidos los de origen del petróleo, animal, vegetal o sintético, p. ej., aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Como se usa preferiblemente en el presente documento, la expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" significa la cantidad de un compuesto de la fórmula (I) de la invención que, cuando se administra a un mamífero para tratar una enfermedad, es suficiente para efectuar dicho tratamiento para la enfermedad. La "cantidad terapéuticamente eficaz" variará dependiendo del compuesto, la enfermedad y su gravedad y la edad, peso, etc., del mamífero a tratar.

Como se usa preferiblemente en el presente documento, "tratar" o "tratamiento" de una enfermedad incluye: (1) prevenir la enfermedad, es decir, hacer que los síntomas clínicos de la enfermedad no se desarrollen en un mamífero que puede estar expuesto o predispuesto a la enfermedad, pero que aún no experimenta ni muestra síntomas de la enfermedad, (2) inhibir la enfermedad, es decir, detener o reducir el desarrollo de la enfermedad o sus síntomas clínicos, o (3) aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad o sus síntomas clínicos.

El término "tratamiento de la leucemia" incluye la inhibición parcial o total del cáncer en un sujeto, así como la destrucción parcial o total de las células cancerígenas.

Como se usa preferiblemente en este documento, la expresión "prevención del cáncer' incluye prevenir la aparición de cáncer clínicamente evidente, así como prevenir la aparición de una fase preclínica evidente de cáncer en sujetos en riesgo.

En una realización de la invención, el cáncer es un cáncer sólido y metástasis del mismo. En una realización preferida de la invención, el cáncer se selecciona del grupo que comprende cáncer de mama, cáncer de pulmón, que incluye carcinoma de pulmón de células no pequeñas, cáncer renal, cáncer de colon, síndrome mielodisplásico, cáncer genitourinario, cáncer gastrointestinal, cáncer epidermoide, melanoma, glioma, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, linfoma , mieloma, cáncer colorrectal, neuroblastoma, cáncer de cabeza y/o cuello, cáncer de vejiga, cáncer de cerebro en las reivindicaciones, leucemia en un sentido más amplio y cáncer gástrico en un sentido más amplio, incluyendo metástasis de cualquiera de los mismos.

En una realización de la invención, el cáncer es cáncer resistente y, en particular, cáncer resistente a múltiples fármacos, es decir, las células leucémicas exhiben resistencia a quimioterapias convencionales, preferiblemente el fenotipo MDR (resistencia a múltiples fármacos); preferiblemente, dicho cáncer resistente se selecciona del grupo que comprende cáncer de mama, cáncer de pulmón, que incluye carcinoma de pulmón de células no pequeñas, cáncer renal, cáncer de colon, síndrome mielodisplásico, cáncer genitourinario, cáncer gastrointestinal, cáncer epidermoide, melanoma, glioma, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, linfoma, mieloma, cáncer colorrectal, neuroblastoma, cáncer de cabeza y/o cuello, cáncer de vejiga, cáncer de cerebro en un sentido más amplio y cáncer gástrico en un sentido más amplio.

En una realización, el compuesto de la invención es un compuesto, una sal fisiológicamente aceptable del mismo o un solvato fisiológicamente aceptable del mismo, que es capaz de estimular la apoptosis en células cancerígenas. Por tanto, la presente invención también se refiere al uso de un compuesto de la, una sal o solvato fisiológicamente aceptable del mismo, preferiblemente como se define en el presente documento, en combinación con uno o más de un agente quimioterapéutico adicional.

En una realización de la invención, el tratamiento del sujeto comprende, además, la estimulación de la muerte de las células mediante un método convencional o una combinación de métodos convencionales. Los métodos convencionales se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en irradiación, p. ej., irradiación externa o administración de compuestos radiactivos, trasplante de médula ósea y tratamiento con un agente quimioterapéutico que incluye agentes antineoplásicos, agentes de reversión de la resistencia a múltiples fármacos y modificadores de la respuesta biológica, y combinaciones de los mismos.

Por tanto, la presente invención también se refiere al uso de un compuesto de la invención, a una sal fisiológicamente aceptable o a un solvato del mismo, preferiblemente como se define en el presente documento, en combinación con uno o más de un agente quimioterapéutico adicional. Agentes antineoplásicos adecuados pueden seleccionarse del grupo que comprende asparaginasa, bleomicina, busulfán, carmustina, clorambucilo, cladribina, ciclofosfamida, citarabina, dacarbazina, daunorrubicina, doxorrubicina, etopósido, fludarabina, gemcitabina, hidroxiurea, idarrubicina, ifosfamida, lomustina, mecloretamina, melfalan, mercaptopurina, metotrexato, mitomicina, mitoxantrona, pentostatina, procarbazina, 6-tioguanina, topotecán, vinblastina, vincristina, dexametasona, ácido retinoico y prednisona. Ejemplos preferidos de agentes antineoplásicos a utilizar en el tratamiento del cáncer de acuerdo con la presente invención, especialmente en el tratamiento de AML, o ALL, comprenden citarabina, etopósido, mitoxantrón, ciclofosfamida, ácido retinoico, daunorrubicina, doxorrubicina e idarubicina.

Cuando los compuestos de fórmula (I), sales fisiológicamente aceptable o solvatos del mismo se usan como ingredientes activos en los usos, métodos y composiciones de la presente invención, que puede incorporarse en formas de dosificación farmacéuticas estándar, con las que el experto en la técnica está familiarizado. Básicamente, en la invención se puede utilizar cualquier forma de dosificación farmacéutica.

La presente invención por tanto también se refiere a una composición farmacéutica que comprende un agente auxiliar farmacéuticamente aceptable, además de un compuesto de la invención, una sal o solvato fisiológicamente aceptable del mismo como se definió anteriormente. Agentes auxiliares de este tipo son conocidos en la técnica. p. ej., los excipientes, diluyentes y adyuvantes farmacéuticos habituales, p. ej., materiales de soporte inertes orgánicos e inorgánicos, tales como agua, gelatina, lactosa, almidón, estearato de magnesio, talco, aceites vegetales, gomas, polialquilenglicoles, etc. Estas preparaciones farmacéuticas pueden ser empleadas en forma sólida, p. ej., como comprimidos, cápsulas, o pueden administrarse en forma líquida, p. ej., como soluciones, suspensiones o emulsiones.

Excipientes y adyuvantes farmacéuticos adicionales que se pueden añadir a una composición farmacéutica incluyen conservantes, antioxidantes, agentes antimicrobianos y otros estabilizadores; agentes humectantes, emulsionantes y de suspensión y compuestos anti-aglomerantes; aditivos de fragancia y colorantes; composiciones para mejorar la compresibilidad o agentes para crear una liberación retardada, sostenida o controlada del ingrediente activo; y diversas sales para cambiar la presión osmótica de la preparación farmacéutica o para actuar como tampones. Excipientes y adyuvantes de este tipo son conocidos por el experto en la materia.

En cuanto a la síntesis del compuesto de la invención, un experto en la técnica reconocerá lo siguiente. La maleimida disustituida y, en particular, la subunidad bisindolilmaleimida está presente en un cierto número de compuestos biológicamente activos. Entre estos, arciriarubinas (Esquema 1; a) representan los miembros más simples de las 3,4-bisindolilmaleimidas que se producen de forma natural. Están estructuralmente relacionadas con las arciriaflavinas (b) y con el aglicón de la bien conocida estaurosporina (c), rebecamicina (d) y otros metabolitos biológicamente activos.

Esquema 1. Arciriarubinas (a), arciriaflavinas (b), estaurosporina (c) y rebecamicina (d).

Curiosamente, análogos sintéticos poseen amplios espectros de actividades antibacterianas, antivirales, antimicrobianas y antigénicas. Además, los derivados de esta clase de compuestos son agentes prometedores para enfermedades autoinmunes, tales como la diabetes y el cáncer, así como valiosos inhibidores de diferentes proteína quinasas, especialmente PKC, que desempeña un papel importante en muchas vías de transducción de señales, o GSK3p, por lo tanto, puede utilizarse para el tratamiento de enfermedades mediadas por GSK3p. En particular, algunos derivados se evalúan actualmente en ensayos clínicos en seres humanos como fármacos contra el cáncer. Por ejemplo, enzastaurina, que es desarrollada por Eli Lilly and Company, es un derivado sintético de bisindolilmaleimida con actividad antineoplásica potencial y puede usarse para el tratamiento de tumores sólidos (documentos WO02/02094, WO02/02116 e IL165747). En enero de 2009, enzastaurina estaba en la fase III de los ensayos clínicos. Este agente puede disminuir el suministro de sangre al tumor, previniendo su crecimiento. La ruboxistaurina, otra bisindolilmaleimida, es un fármaco en investigación para la retinopatía periférica diabética, también fue desarrollado por Eli Lilly y actualmente se encuentra en un estudio de fase III. La ruboxistaurina es un inhibidor de PKC-beta. Otros ejemplos de agentes de indolilmaleimida se han descrito en los documentos WO2009/071620 y WO 2006/061212. A saber, ciertos derivados de 3-(indolil)- o 3-(azaindolil)-4arilmaleimida actúan como inhibidores de la angiogénesis, por lo que se propuso su uso para controlar la angiogénesis y/o disfunción vascular así como para el tratamiento del cáncer.

Obviamente, es muy importante desarrollar nuevas estrategias para los nuevos derivados de esta clase de compuestos bioactivos que muestren propiedades más mejoradas, tales como una biodisponibilidad potenciada, una estabilidad metabólica incrementada y selectividades mejoradas hacia los objetivos de acción que pueden usarse como fármacos fijados como objetivo.

Como resultado de la importancia farmacéutica de las 3,4-bisindolilmaleimidas, se ha informado en la bibliografía de una diversidad de enfoques para su síntesis. Los métodos más utilizados fueron desarrollados por grupos de W. Steglich (Tetrahedron, 1988, 44, 2887) y M. Faul (JOC, 1998, 63, 6053). Ambos métodos permiten la síntesis de maleimidas disustituidas simétrica y asimétricamente. De acuerdo con el procedimiento de Steglich, el bromuro de indolil magnesio reacciona con 3,4-dibromomaleimida para dar productos mono- o di-sustituidos. El resultado de esta reacción depende en gran medida del disolvente. El procedimiento de Faul et al. implica una condensación en una etapa de (aril o indolil) acetamidas sustituidas con ésteres de (aril o indolil) glioxilo sustituidos en presencia de una base fuerte.

También se pueden preparar varios compuestos de indolilmaleimida de acuerdo con los métodos conocidos, que se describen, por ejemplo, en los documentos WO02/38561, EP328026, WO03/095452 y WO2006/061212.

Los compuestos seleccionados de esta invención se prepararon de acuerdo con la referencia "Org. Biomol. Chem.

2008, 6, 992”. Típicamente, en una secuencia de dos etapas primero se sintetizó el derivado de 3-halo-4-indolil- o azaindolilmaleimida, partiendo de un derivado de indol o azaindol disponible comercialmente y 3,4-dihalomaleimida. En un caso particular, 2-metilindol (1) reaccionó con 3,4-dibromomaleimida (2) para formar 3-bromo-1-metil-4-(2-metil-3-indolil)-maleimida (3) (Esquema 2).

El uso de reactivo de Grignard de acuerdo con el protocolo de Steglich condujo al producto monosustituido deseado con un rendimiento aislado del 68%. Además, se aisló una pequeña cantidad del correspondiente producto disustituido (5%). Sin embargo, aplicando la modificación de Ohkubo (Tetrahedron, 1996, 52, 8099), que significa metalación de indol con hexametildisilazano de litio (LiHMDS) y reacción adicional con un equivalente de compuesto dibromo 2, condujo a 3-bromo-1-metil-4-(2-metil-3-indolil)-maleimida (3) con excelente selectividad y rendimiento casi cuantitativo (98%).

Se introdujeron sustituyentes arilo, heteroarilo o heterociclilo en la posición 4 del resto maleimida usando la reacción de acoplamiento de Suzuki del compuesto 3 con diversos ácidos aril, heteroaril o heterociclil borónicos, sustituidos o no sustituidos. Las reacciones de acoplamiento se realizaron preferiblemente en presencia de 0,05 a 4% en moles de Pd(OAc)2 y ligando de fosfina adecuado. Dependiendo de factores estéricos y electrónicos, se obtuvo un rendimiento de bueno a excelente del producto correspondiente de fórmula (I). Por ejemplo, la reacción de acoplamiento de Suzuki de 3-bromo-1-metil-4-(2-metil-3-indolil)-maleimida (3) con ácido fenilborónico (4) condujo a 1-metil-3-(2-metil-1H-indol-3-il)-4-fenil-1H-pirrol-2,5-diona (5) en rendimiento cuantitativo (Esquema 3).

Todos los productos de acoplamiento son compuestos cristalinos estables y de colores brillantes. Las 3-indolil-4-ar¡l(heteroaril o heterociclil)maleimidas resultantes constituyen nuevos compuestos biológicamente activos. No son necesarias las etapas de protección y desprotección del nitrógeno del indol.

Como resultará evidente para un experto en la técnica, el compuesto de fórmula (I), en donde X es N-R1, se puede convertir en otro compuesto de fórmula (III) (Esquema 4).

Esquema 4

Por ejemplo, el tratamiento de un compuesto de fórmula (I) protegido con un resto de maleimida con una base fuerte, tal como hidróxido de sodio o potasio, condujo a la formación de los correspondientes anhídridos cíclicos de fórmula (II), que se convierten fácilmente en compuestos de fórmula (III) no protegidos por calentamiento con acetato de amonio.

Ambas conversiones proceden de altos a excelentes rendimientos. Además, estos productos son compuestos cristalinos estables y de colores brillantes.

La presente invención se ilustra ahora adicionalmente con referencia a las siguientes figuras y ejemplos de los cuales pueden tomarse ventajas, características y realizaciones adicionales, en las que

la Fig. 1 muestra dos diagramas que indican el número de células a lo largo del tiempo cuando se exponen al compuesto PDA-66 o al control (panel izquierdo) y la viabilidad de las células cuando se les expone al compuesto PDA-66 o al control (panel derecho);

la Fig. 2 es un diagrama de barras que muestran el efecto inhibitorio del compuesto PDA-66 3pM sobre el crecimiento de células SH5Y5, células Jurkat y células B16F10;

la Fig. 3 muestra un panel de diagramas de cuatro barras que indican el porcentaje de células apoptóticas el tiempo de exposición del compuesto PDA-66 siendo las células anexina-/PI+, anexina+/PI+, anexina-/PI- o anexina+/PI-;

la Fig. 4 muestra el porcentaje de células en G2/M al exponerse el compuesto PDA66;

la Fig. 5A es una vista de microfotografía de células no expuestas a PDA-66;

la Fig. 5B es una vista de microfotografía de células expuestas a PDA-66;

la Fig. 5C es un diagrama que muestra densidad óptica al exponerse a varios compuestos, incluyendo PDA-66; la Fig. 6 es un diagrama que indica el número de células progenitoras neuronales humanas (hNPCs), expresada como aumento de veces, como una función de concentración de PDA-66; y

la Fig. 7 es un diagrama de barras que muestra el efecto inhibitorio de PDA-66 3 pM (primera barra de cada experimento) y PDA-66 10 pM en crecimiento de células hNPC, células B16F10, células Jurkat, células MCF-7, células SW480, células A 549 y células HepG2.

EJEMPLOS

Las abreviaturas utilizadas en los procedimientos generales y los ejemplos se definen como sigue: "HCl" para ácido clorhídrico, "KOH" para hidróxido de potasio, "NaHCO³" para hidrocarbonato de sodio, “K2CO3" para carbonato de potasio, “Na²SO⁴" para sulfato de sodio, “CH2Cl2" para cloruro de metileno, "THF" para tetrahidrofurano, "EA" para acetato de etilo, "DMSO" para dimetilsulfóxido, "CDCl³" para cloroformo deuterado, "TLC" para cromatografía en capa fina, “LiHMDS" para hexametildisilazano de litio, "Pd(OAc)2" para acetato de paladio.

Todas las reacciones se llevaron a cabo bajo una atmósfera de argón. Las reacciones se controlaron mediante análisis de TLC (placas de gel de sílice prerrevestidas con indicador fluorescente UV254, 0,2 mm) y se visualizaron con luz UV de 254 nm o yodo. Los productos químicos se adquirieron de Aldrich, Fluka, Acros, AlfaAsar, Strem y, a menos que se indique lo contrario, se utilizaron sin purificación adicional. Todos los compuestos se caracterizaron por espectroscopía de ¹H RMN, ¹³C RMN, GC-MS, HRMS e IR. Los espectros de ¹H se registraron en espectrómetros Bruker AV 300 y AV 400. Los espectros de ¹³C RMN y de ¹⁹F RMN se registraron a 75,5 MHz y 282 MHz, respectivamente. Los desplazamientos químicos se expresan en ppm con respecto al centro de resonancia del disolvente. Los puntos de fusión se determinaron en un SMP3 digital (Stuart). Los espectros de IR se registraron en FT-IR ALPHA (Bruker) con Platinum-ATR (Bruker). Los espectros de masas EI (70 eV) se registraron en MAT 95XP (Thermo ELECTRON CORPORATION). La GC se realizó en un cromatógrafo Agilent 6890 con una columna HP5 de 30 m. La HRMS se realizó en MAT 95XP (EI) y LC/MS Agilent 6210 Tiempo de Vuelo (ESI). La GC-MS se realizó en un detector selectivo de masas cromatógrafo Agilent 5973. Todos los rendimientos reseñados se refieren a rendimientos aislados.

Ejemplo 1: Preparación 1 - Procedimiento general para la condensación de derivado de indol o azaindoles con compuesto de 3,4-dihalomaleimida y compuestos específicos

El derivado de (aza)indol (10 mmol) se disolvió en THF seco (20 ml) y se enfrió bajo argón a -20 °C, antes de que se añadieran lentamente 21 ml de LiHMDS (1 M en THF). Después de agitar durante 2 h a -20 °C, se añadió una solución de derivado de 3,4-dihalomaleimida (10 mmol) en THF (20 ml) a la solución de (aza)indol litiado de una vez mediante una jeringa. Después de agitar 1 h más a -20 °C (control por TLC), la mezcla de reacción se neutralizó cuidadosamente con HCl ac. 2 N y se extrajo con acetato de etilo (3 x). Los componentes orgánicos combinados se lavaron con NaHCO3 sat. ac., salmuera y agua. Después de secar sobre Na²SO⁴ y concentración, el material bruto se cristalizó en éter.

Los ejemplos 1.1 a 1.3 son ejemplos de referencia.

Ejemplo 1.1

3-Bromo-1-metil-4-(2-metil-1H-indol-3-il)-1H-pirrol-2,5-diona

Cristales naranjas; 1H-RMN (CDCb) 52,48 (s, 3H), 3,19 (s, 3H), 7,18 (ddd, 1H), 7,20 (ddd, 1H), 7,31 (ddd, 1H), 7,48 (m, 1H), 8,48 (s ancho, 1H); 13C RMN (CDCh) 5 14,3, 24,9, 102,0, 110,8, 120,5, 120,7, 120,8, 122,4, 126,4, 135,5, 137,6, 139,3, 166,4, 169,1; GC-MS (EI, 70 eV): m/z (%) 318 (100) [M+], 320 (96) [M+]; HRMS (EI): Calc. para C14HnO2N2Br: 317,99984. encontrado: 317,99979; IR (ATR, cm‘1): 3361, 3066, 1771, 1703, 1623, 1422, 1379, 990, 806, 749, 733, 656.

Ejemplo 1.2

3-Bromo-1 -metil-4-(1 H-pirrolo[2,3-b]piridin-3-il) - 1H-pirrol-2,5-diona

La preparación se realizó utilizando reactivo de Grignard. Cristales naranjas; 1H RMN (DMSO-d6) 52,99 (s, 3H), 7,21 (ddd, 1H, J -3,83, 5,31, 7,36 Hz), 8,20 (s, 1H), 8,31 (dd, 1H, J = 1,53, 3,52 Hz), 8,33 (s, 1H), 12,68 (s ancho, 1H); 13C RMN (DMSO-d6) 524,6, 102,7, 114,8, 116,9, 117,0, 130,8, 131,2, 136,8, 144,0, 148,7, 166,4, 168,9; GC-MS (EI, 70 eV): m/z (%) 305 (58) [M+], 307 (57) [M+]; HRMS pos. (ESI): Calc. para [M+H]+, C12HgBrN3O2: 305.98727 y 307.98532; encontrado: 305,98737 y 307,98544; IR (ATR, cm'1): 3079, 2742, 1764, 1707, 1584, 1488, 1440, 1419, 1384, 1287, 1167, 1141, 1101,801,778, 733, 628.

Ejemplo 1.3

1 -Metil-3,4-bis-(2-metil- 1H-indol-3-il)-1H-pirrol-2,5-diona

Cristales rojos; ¹H RMN (DMSO-da) 5 1,97 (s, 3H), 1,98 (s, 3H), 3,05 (s, 3H), 6,75 (t ancho, 2H, J = 7,41 Hz), 6,95 (ddd, 2H, J - 3,83, 5,31,7,36 Hz), 7,03 (d ancho, 2H, J = 7,90 Hz), 7,23 (d ancho, 2H, J = 8,09 Hz), 11,29 (s ancho, 2H); ¹³C RMN (DMSO-d⁶) 5 13,0, 23,9, 103,3, 110,7, 119,2, 119,4, 120,8, 126,6, 131,2, 135,5 (2C), 137,3, 170,4, 171,3; GC-MS (EI, 70 eV): m/z (%) 369 (100) [M+]; HRMS (EI): Calc. para C23H19O2N3 : 369,14718; encontrado 369,14705; IR (ATR, cm^-1): 3383, 3307, 1755, 1692, 1456, 1435, 1377, 1239, 1049, 1022, 1003, 747, 737, 693. Ejemplo 2: Preparación 2 - Procedimiento general para el acoplamiento de Suzuki y compuestos específicos Los ejemplos 2.4 - 2.5 y 2.7 - 2.17 son ejemplos de referencia.

En un tubo de presión Ace en una solución de derivado de (aza)indolilmaleimida (1 mmol) y el ácido borónico correspondiente (1,5 mmol) en dimetoxietano (3 ml) se añadieron K2CO3 (1M en agua, 3 ml), Pd(OAc)2 (2 % en moles) y ligando (2,5% en moles) bajo atmósfera de argón. El tubo de presión se equipó con una tapa de teflón y se calentó a 100 °C (control por TLC). La mezcla se enfrió a temperatura ambiente y se diluyó con acetato de etilo. La capa orgánica se lavó con solución ac. sat. de cloruro de amonio (2 x 30 mL) y agua. Después de secar sobre Na2SO4 y eliminación del disolvente al vacío, el producto de acoplamiento se aisló mediante cromatografía en columna en heptano/acetato de etilo.

Ejemplo 2.4

1 -Metil-3-(2-metil- 1H-indol-3-il)-4-(4-vinilfenil)-1H-pirrol-2,5-diona

Cristales rojo anaranjado; ¹H RMN (CDCls) 52,14 (s, 3H), 3,17 (s, 3H), 5,25 (dd, 1 H, J = 0,66, 10,89 Hz), 5,72 (dd, 1H, J = 0,70, 17,61 Hz), 6,63 (dd, 1H, J = 10,88, 17,62 Hz), 6,96 (m, 1H), 7,09 (m, 2H), 7,23 (m, 1H), 7,27 (m, 2H), 7,53 (m, 2H), 8,32 (s ancho, 1H); ¹³C RMN (CDCls) 5 13,7, 24,2, 103,0, 110,5, 115,0, 120,3, 120,5, 122,0, 126,1 (2C), 126,5, 129,5 (2C), 129,6, 132,7, 133,7, 135,7, 136,2, 136,8, 138,1, 171,2, 171,6; GC-MS (EI, 70 eV): m/z (%) 342 (100) [M+]; HRMS (EI): Calc. para C22H18O2N2: 342,13628; encontrado: 342,13618; IR (ATR, cm^-1): 3380, 3053, 2920, 1745, 1689, 1456, 1428, 1383, 1235, 990, 903., 847, 814, 741,656.

Ejemplo 2.5

1 -Metil-3-(2-metil- 1H-indol-3-il)-4-fenil- 1H-pirrol-2,5-diona

Cristales rojos; 1H RMN (CDCb) 52,14 (s, 3H), 3,20 (s, 3H), 6,97 (ddd, 1H), 7,11 (m, 2H), 7,22 (ddd, 1H), 7,27 (m, 3H), 7,55 (m, 2H), 8,33 (s ancho, 1H); 13C RMN (CDCb) 513,6, 24,2, 102,8, 110,5, 120,3, 120,5, 122,0, 126,5, 128,4 (2C), 129,1, 129,3 (2C), 130,2, 133,2, 134,1, 135,7, 136,8, 171,2, 171,5; GC-MS (EI, 70 eV): m/z (%) 316 (100) [M+]; HRMS (EI): Calc. para C20H16O2N2: 316,12063; encontrado: 316,12091; IR (ATR, cm-1): 3426, 3381, 3052, 1759, 1690, 1618, 1435, 1422, 1382, 1234, 1002, 989, 938, 786, 752, 736, 693.

Ejemplo 2.6

3-(4-Acetilfenil)-1-metil-4-(2-metil-1H-indol-3-il)-1H-pirrol-2,5-diona (PDA-66)

Cristales rojos; ¹H RMN (CDCI3) 52,18 (s, 3H), 2,57 (s, 3H), 3,21 (s, 3H), 6,94 (ddd, 1 H, J - 0,99, 7,05, 8,00 Hz), 7,03 (ddd, 1H), 7,11 (ddd, 1H, J - 1,15, 7,05, 8,11 Hz), 7,25 (dd, 1H, J - 0,41, 8,11 Hz), 7,67 (ddd, 2H, J - 1,72, 3,63, 8,61 Hz), 7,84 (ddd, 2H, J - 1,85, 3,70, 8,61 Hz), 8,57 (s ancho, 1H); ¹³C RMN (CDCb) 5 13,8, 24,3, 26,6, 102,5, 110,7, 120,1, 120,6, 122,2, 126,2, 128,2 (2C), 129,5 (2C), 131,9, 134,9, 135,0, 135,8, 136,6, 137,6, 170,8, 171,1, 197,8; GC-MS (EI, 70 eV): m/z (%) 358 (100) [M+]; HRMS (EI): Calc. para C22H18O3N2 : 358,13119; encontrado: 358,131088; IR (ATR, cm^-1): 3339, 3058, 2923, 1762, 1692, 1678, 1427, 1407, 1383, 1358, 1265, 1234, 990, 846, 817, 742.

Ejemplo 2.7

3-(2,6-Dimetilfenil -1-metil-4-(2-metil-1H-indol-3-il)-1H-pirrol-2,5-diona

Cristales naranjas; ¹H RMN (CDCls) 51,97 (d, 3H, J = 0,88), 2,08 (s, 6H), 3,22 (s, 3H), 7,00 (ddd, 1H), 7,01 (d, 2H), 7,10 (ddd, 1H), 7,12 (ddd, 1H), 7,19 (ddd, 1H), 7,25 (ddd, 1H), 8,21 (s ancho, 1H); ¹³C RMN (CDCls) 5 13,2, 20,7 (2C), 24,4, 103,6, 110,3, 119,9, 120,6, 122,1, 126,8, 128,0 (2C), 128,8, 129,5, 135,4, 136,1, 136,9, 137,0 (2C), 137,1, 171,0, 171,2; GC-MS (EI, 70 eV): m/z (%) 344 (100) [M+]; HRMS (EI): Calc. para C22H20O2N2 : 344.15193; encontrado: 344,15175; IR (ATR, cm^-1): 3342, 2951, 1763, 1689, 1433, 1381, 1229, 987, 739, 665.

Ejemplo 2.8

3-(3-Clorofenil)-1-metil-4-(2-metil-1H-indol-3-il)-1H-pirrol-2,5-diona

Cristales rojos; ¹H RMN (CDCb) 52,20 (s, 3H), 3,20 (s, 3H), 6,98 (ddd, 1H, J - 1,03, 7,0, 8,03 Hz), 7,05 (d ancho, 1H, J - 7,52 Hz), 7,13 (ddd, 1H, J - 1,23, 7,0, 8,14 Hz), 7,18 (d ancho, 1H, J = 7,91 Hz), 7,25 (m, 2 H), 7,40 (ddd, 1H, J - 1,26, 2,72, 7,84 Hz), 7,62 (t ancho, 1H, J = 1,80 Hz), 8,36 (ancho, 1H); ¹³C RMN (CDCb) 513,8, 24,3, 102,6, 110,6, 120,3, 120,7, 122,2, 126,2, 127,5, 129,1, 129,2, 129,6, 131,9, 132,1, 134,2, 134,3, 135,85, 137,2, 170,8, 171,1; GC-MS (IE, 70 eV): m/z (%) 350 (100) [M+]; HRMS (EI): Calc. para C²⁰H¹⁵O² N²Cl: 350,08166; encontrado: 350,08115; IR (ATR, cm^-1): 3350, 3068, 2909, 1764, 1689, 1433, 1383, 1235, 991,743, 735, 715, 683.

Ejemplo 2.9

3-(2,4-Diclorofenil)-1-metil-4-(2-metil-1H-indol-3-il)-1H-pirrol-2,5-diona

Cristales naranjas; 1H RMN (CDCb) 52,11 (s, 3H), 3,21 (s, 3H), 6,99 (ddd, 1H, J - 1,03, 7,0, 8,03 Hz), 7,10 (ddd, 1H, J - 0,93, 7,09, 8,23 Hz), 7,18 (m, 2H), 7,19 (d, 2H, J - 1,20 Hz), 7,40 (ancho, 1H, J = 1,15 Hz), 8,41 (s ancho, 1H); 13C RMN (CDCb) 5 13,5, 24,4, 103,1, 110,6, 119,7, 120,8, 122,2, 126,7, 127,3, 128,5, 130,1, 132,1, 132,4, 134,7, 135,5, 137,5, 137,6, 170,1, 170,6; GC-MS (EI, 70 eV): m/z (%) 384 (100) [M+]; HRMS (EI): Calc. para C20H14O2N2CI2: 384,04268; encontrado: 384,04261; IR (ATR, cm^-1): 3358, 3064, 2949, 1756, 1687, 1436, 1386, 1228, 992, 857, 810, 778, 741,673, 666.

Ejemplo 2.10

1-Metil-3-(2-metil-1H-indol-3-il)-4-(tiofen-3-il)-1H-pirrol-2,5-diona

Cristales rojos; ¹H RMN (CDCI3) 52,27 (s, 3H), 3,18 (s, 3H), 7,01 (ddd, 1H, J -1,07, 7,07, 8,05 Hz), 7,12 (ddd, 1H), 7,137 (dd, 1H, J - 3,02, 5,15 Hz), 7,14 (ddd, 1H), 7,19 (dd, 1H, J = 1,22, 5,17 Hz), 7,25 (dt, 1H, J = 0,91, 8,06 Hz), 8,11 (dd, 1H, J = 1,24, 2,95 Hz), 8,42 (s ancho, 1H); ¹³C RMN (CDCI3) 5 13,5, 24,2, 102,9, 110,6, 120,1, 120,5, 122,0, 125,1, 126,7, 127,5, 129,2, 130,0, 130,2. 130,5, 135,7, 136,7, 171,5, 171,6; GC-MS (EI, 70 eV): m/z (%) 322 (100) [M+]; HRMS (EI): Calc. para C18H14O2N2S: 322,07705; encontrado: 322,07631; IR (ATR, cm^-1): 3391, 3102, 1756, 1689, 1624, 1438, 1410, 1382, 1334, 1228, 1071, 1003, 989, 820, 804, 790, 752, 737, 653.

Ejemplo 2.11

1 -Metil-3-(2-metil- 1H-indol-3-il)-4-(piridin-4-il)- 1H-pirrol-2,5-diona

Cristales rojos; ¹H RMN (CDCI3) 52,28 (s, 3H), 3,21 (s, 3H), 6,97 (m, 2H), 7,14 (ddd, 1H, J - 3,58, 4,69, 8,23 Hz), 7,30 (dt, 1H, J -0,7, 8,15 Hz), 7,46 (2dd, 2H, J - 1,59, 4,57 Hz), 8,53 (2dd, 2H, J - 1,57, 4,62 Hz), 8,71 (s ancho, 1H); ¹³C RMN (CDCI3) 514,1,24,4, 102,5, 110,8, 120,3, 120,9, 122,5, 123,3 (2C), 125,9, 139,9, 135,9, 136,5, 137,9, 138,1, 149,8 (2C), 170,3, 170,6; GC-MS (EI, 70 eV): m/z (%) 317 (100) [M+]; HRMS (EI): CaIc. para C19H15O2N3: 317,11588; encontrado: 317,11635; IR (ATR, cm^-1): 3342, 2923, 1765, 1694, 1456, 1428, 1383, 1237, 990, 813, 742, 656.

Ejemplo 2.12

1 -Metil-3-(2-metil- 1H-indol-3-il)-4-(na ftalen-2-il)- 1H-pirrol-2,5-diona

CristaIes rojos; ¹H RMN (CDCI3) 52,09 (s, 3H), 3,24 (s, 3H), 6,95 (ddd, 1H, J -1,04, 7,14, 8,12 Hz), 7,11 (ddd, 1H, J -1,11, 7,13, 8,18 Hz), 7,20 (dd, 1H, J -0 ,5 , 8,12 Hz), 7,25 (dd, 1H, J -<0,5, 8,07 Hz), 7,44 (dd, 1H, J -1,68, 8,58 Hz), 7,48 (m, 2H), 7,59 (d ancho, 1H, J - 8,71 Hz), 7,74 (m, 1H), 7,83 (m, 1H), 8,33 (s ancho, 2H); ¹³C RMN (CDCI3) 5 13,7, 24,3, 103,1, 110,5, 120,4, 120,6, 122,1, 125,8, 126,3, 126,8, 127,1, 127,6, 127,7, 127,8, 128,9, 130,0, 133,0, 133,18, 133,22, 133,8, 135,7, 136,9, 171,2, 171,6; GC-MS (EI, 70 eV): m/z (%) 366 (100) [M+]; HRMS (EI): CaIc. para C24H18O2N2: 366,13628; encontrado: 366,13581; IR (ATR, cm^-1): 3345, 3055, 2946, 1759, 1689, 1425, 1381, 1226, 989, 816, 737, 660.

Ejemplo 2.13

3-(2,5-Dimetoxifenil)-1-metil-4-(2-metil-1H-indol-3-il)-1H-pirrol-2,5-diona

Cristales de color naranja intenso; ¹H RMN (CDCI3) 52,05 (s, 3H), 3,19 (s, 3H), 3,36 (s, 3H), 3,66 (s, 3H), 6,75 (ancho d, 1H, J -8 ,79 Hz), 6,81 (ancho, 1H, J -2 ,57 Hz), 6,84 (dd, 1H, J -3,05, 8,80 Hz), 6,94 (ddd, 1H, J -1,13, 7,08, 8,02 Hz), 7,05 (ddd, 1H, J - 1,07, 7,15, 8,02 Hz), 7,14 (d ancho, 1H, J -8,11 Hz), 7,18 (d ancho, 1H, J = 7,94 Hz), 8,38 (s ancho, 1H); ¹³C RMN (CDCls) 5 13,3, 24,2, 55,78, 55,84, 104,0, 110,2, 112,7, 115,9, 116,2, 119,9, 120,3, 120,6, 121,8, 127,0, 133,3, 135,5, 135,6, 136,6, 151,9 (2C), 153,4 (2C), 171,0, 171,3; GC-MS (EI, 70 eV): m/z (%) 376 (100) [M+]; HRMS (EI): Calc. para C22H20O4N2: 376,14176; encontrado: 376,14113; IR (ATR, cm^-1): 3338, 2924, 1750, 1689, 1427, 1383, 1273, 1237, 1212, 1049, 1018, 997, 823, 760, 746, 724, 667.

Ejemplo 2.14

1 -Metil-3-(2-metil- 1H-indol-3-il)-4-(2-(trifluorometil)fenil)-1H-pirrol-2,5-diona

Cristales naranjas; ¹H RMN (acetona-d⁶) 52,20 (s, 3H), 3,11 (s, 3H), 6,86 (ddd, 1H, J - 1,06, 7,13, 8,07 Hz), 7,00 (ddd, 1H, J - 1,16, 7,16, 8,13 Hz), 7,19 (ancho, 1H, J - 7,95 Hz), 7,27 (ddd, 1H), 7,37 (m, 1H), 7,55 (m, 2H), 7,76 (m, 1H), 10,55 (s anchos, 1H); ¹³C RMN (acetona^) 5 13,1, 24,1, 102,3 (d, J = 4,55 Hz), 111,2 (d, J = 5,13 Hz), 120,0, 120,2, 121,9, 124,9 (q, J = 272,93 Hz), 127,7 (q, J = 4,42 Hz), 127,9 (d, J = 3,68 Hz), 129,6 (q, J = 30,37 Hz), 129,9 (d, J = 1,79 Hz), 130,0, 132,5 (2C), 135,4, 136,5 (d, J= 15,20 Hz), 137,5, 138,4 (d, J = 14,52 Hz), 170,87, 170,93; ¹⁹F RMN (CDCls) 5 -57,57 (s); GC-MS (EI, 70 eV): m/z (%) 384 (100) [M+]; HRMS (EI): Calc. para C21H15O2N2F3: 384.10801; encontrado: 384,10765; IR (ATR, cm^-1): 3365, 3080, 1768, 1694, 1445, 1385, 1315, 1163, 1118,1036,991,764,742,657.

Ejemplo 2.15

3-(4-Fluorofenil)-1-metil-4-(2-metil-1H-indol-3-il)-1H-pirrol-2,5-diona

Cristales naranjas; ¹H RMN (CDCb) 52,21 (s, 3H), 3,20 (3, 3H), 6,96 (m, 3H), 7,03 (dd, 1 H, J - 0,35, 7,75 Hz), 7,12 (ddd, 1H, J - 1,24, 6,93, 8,13 Hz), 7,25 (ddd, 1H), 7,59 (ddt, 2H, J - 2.90, 5.50, 8.48 Hz), 8,35 (s ancho, 1H); ¹³C RMN (CDCb) 5 13,7, 24,2, 102,6, 110,6, 115,4, 115,7, 120,2, 120,6, 122,1, 126,22 (d, J - 3,60 Hz), 126,3, 131,4, 131,5, 132,87 (d, J - 1,07 Hz), 132,0, 135,8, 136,9, 162,89 (d, J = 251,81 Hz), 171,1, 171,5; ¹⁹F RMN (CDCb) 5 -109,8 (s); HRMS (EI): Calc. para C20H15O2N2F: 334,11121; encontrado: 334,11137; IR (ATR, cm^-1): 3380, 3042, 1755, 1700, 1600, 1508, 1458, 1427, 1379, 1232, 1159, 996, 841,813, 750, 731,657.

Ejemplo 2.16

3-(5-Acetil-2-fluorofenil)-1-metil-4-(2-metil-1H-indol-3-il)-1H-pirrol-2,5-diona

Cristales de color rojo oscuro; ¹H RMN (acetona-d⁶) 52,29 (s, 3H), 2,49 (s, 3H), 3,12 (s, 3H), 6,80 (ddd, 1 H, J -1,06, 7,15, 8,37 Hz), 7,00 (m, 2H), 7,16 (dd, 1H, J = 8,69, 9,51 Hz), 7,30 (dd, 1H, J = 0,82, 8,69 Hz), 8,01 (ddd, 1H, J = 2,34, 4,90, 8,57 Hz), 8,17 (dd, 1H, J = 2,23, 6,79 Hz), 10,65 (s ancho, 1H); ¹³C RMN (acetona-d⁶) 5 13,4, 24,1, 26,3, 103,5, 111,4, 116,6 (d, J = 22,4 Hz), 119,9, 120,1 (d, J = 16,2 Hz), 120,4, 122,0, 127,4, 128,7 (d, J = 2,5 Hz), 131,8 (d, J = 9,6 Hz), 133,0 (d, J = 4,6 Hz), 134,2 (d, J = 3,4 Hz), 136,7, 138,4, 138,9, 163,4 (d, J = 259,4 Hz), 170,6, 170,8, 195,9; ¹⁹F RMN (acetona^) 5 -102,9 (m); GC-MS (EI, 70 eV): m/z (%) 376 (100) [M+]; HRMS pos. (ESI): Calc. para [M+H]+, C22H18FN2O3: 377.1296; encontrado: 377,1302; HRMS pos. (ESI): Calc. para [M+Na]+, C²²H¹⁷FN²NaO³ : 399,11154; encontrado: 399,11152; IR (ATR, cm^-1): 3351, 1689, 1645, 1602, 1439, 1386, 1353, 1250, 1223, 828, 778, 742, 630, 568, 436, 408.

Ejemplo 2.17

N-(4-(1-Metil-4-(2-metil-1H-indol-3-il)-2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-3-il)fenil)acetamida

Cristales naranjas; ¹H RMN (acetona-da) 52,05 (s, 3 H), 2,27 (s, 3 H), 3,07 (s, 3 H), 6,83 (ddd, 1 H, J - 0,98, 6,93, 8,06 Hz), 7,00 (d, 1 H, J = 7,60 Hz), 7,02 (ddd, 1H), 7,32 (ddd, 1H, J - 1,00, 2,09, 7,76 Hz), 7,53 (m, 4H), 9,27 (s ancho, 1H), 10,59 (s ancho, 1H); ¹³C RMN (acetona-d⁶) 5 13,3, 23,8, 24,0, 103,0, 111,3, 118,8 (2C), 120,1, 120,5, 121,8, 125,9, 127,2, 130,6 (2C), 132,6, 133,8, 136,9, 137,9, 140,7, 168,8, 171,4, 171,9; GC-MS (EI, 70 eV): m/z (%) 373 (100) [M+]; HRMS pos. (ESI): Calc. para [M+H]+, C22H20N3O3: 374,14992; encontrado: 374,15012; HRMS pos. (ESI): Calc. para [M+Na]+, C²²H¹gN³NaO³ : 396,13186; encontrado: 396,13226; IR (ATR, cm^-1): 3379, 1675, 1582, 1505, 1424, 1403, 1386, 1365, 1310, 1237, 1179, 851, 815, 750, 653, 585, 567, 556, 532, 434, 379.

Ejemplo 3: Preparación 3 - Procedimiento general para la preparación de compuestos de fórmula (II) y (III) y compuestos específicos

Etapa 1. La mezcla de compuesto de fórmula (I) (1 mmol), en donde X es N-R¹ y 100 ml de KOH ac. al 10% se calentaron a 140 °C hasta que la mezcla se volvió homogénea (10 a 30 min, control por TLC). Luego, la solución se enfrió y se acidificó con HCl ac. 2 N, hasta que se formó un precipitado, el cual se recogió, se secó y se recristalizó para dar anhídrido casi cuantitativamente cíclico de fórmula (II).

Etapa 2. Se calentó el compuesto de fórmula (II) (1 mmol) con acetato de amonio (100 mmol) a 140 °C hasta que la mezcla se volvió homogénea (control por TLC). La mezcla se enfrió, se añadió agua y la mezcla se extrajo con acetato de etilo. Los componentes orgánicos combinados se lavaron con agua, se secaron sobre Na²SO⁴ y se concentraron. El material bruto se cristalizó en éter. El producto de fórmula (III) se aisló mediante cromatografía en columna en heptano/acetato de etilo.

Los ejemplos 3.18 - 3.22 y 3.24 - 3.25 son ejemplos de referencia.

Ejemplo 3.18

3-(2-Metil-1H-indol-3-il)-4-fenilfuran-2,5-diona

Cristales rojos; ¹H RMN (acetona-d⁶) 52,31 (s, 3H), 6,86 (ddd, 1H, J - 1,03, 7,06, 8,08 Hz), 7,02 (ddd, 1H), 7,07 (ddd, 1H, J - 1,14, 7,17, 8,21 Hz), 7,36 (m, 4H), 7,60 (m, 2H), 10,83 (s ancho, 1H); ¹³C RMN (acetona-d⁶) 513,4, 102,2, 111,6, 120,6 (2C), 122,4, 126,7, 128,9 (2C), 129,9 (2C), 130,2, 130,4, 134,9, 136,1, 136,9, 139,7, 166,1, 166,3; GC-MS (EI, 70 eV): m/z (%) 303 (52) [M+]; HRMS (EI): Calc. para C19H13O3N: 303,08899; encontrado: 303.08861; IR (ATR, cm^-1): 3350, 2921, 2852, 1825, 1749, 1618, 1456, 1423, 1252, 902, 741, 726, 693, 671, 635, 622, 564,531.

Ejemplo 3.19

3-(2-Metil-1H-indol-3-il)-4-fenil-1H-pirrol-2,5-diona

Cristales rojos; ¹H RMN (acetona-d⁶) 52,24 (s, 3H), 6,83 (ddd, 1H, J - 1,01, 7,08, 8,01 Hz), 7,02 (ddd, 1H), 7,03 (d, 1H, J = 7,58 Hz), 7,27 (m, 3H), 7,31 (ddd, 1H), 7,54 (m, 2H), 9,83 (s ancho, 1H), 10,56 (s ancho, 1H); ¹³C RMN (acetona-d⁶) 5 13,2, 102,8, 111,2, 120,1, 120,5, 121,8, 127,3, 128,6 (2C), 129,3, 130,0 (2C), 131,3, 134,8, 134,9, 136,8, 138,0, 171,7, 172,2; GC-MS (EI, 70 eV): m/z (%) 302 (100) [M+]; HRMS (EI): Calc. para C19H14O2N2: 302.10498; encontrado: 302,105426; IR (ATR, cm-1): 3379, 3205, 3065, 2917, 2764, 1764, 1704, 1598, 1451, 1423, 1335, 1289, 1278, 1227, 1013, 993, 770, 754, 729, 719, 690.

Ejemplo 3.20

3-(2-Metil-1H-indol-3-il)-4-(naftalen-2-il)furan-2,5-diona

Cristales naranjas; ¹H RMN (CDCis) 52,30 (s, 3H), 6,81 (ddd, 1H), 7,05 (ddd, 2H), 7,37 (ddd, 1H), 7,53 (m, 3H), 7,75 (d, 1H, J - 8,62 Hz), 7,87 (m, 2H), 8,36 (s, 1H), 10,86 (s, 1H); ¹³C RMN (CDCis) 513,3, 102,5, 111,6, 120,6, 120,7, 122,4, 126,0, 126,9, 127,2, 127,7, 128,16, 128,24, 128,4, 129,3, 130,7, 133,5, 134,1, 134,7, 136,1, 136,9, 139,9, 166,1, 166,4; EM (EI): miz (%) 353 (650) [M+]; HRMS pos. (ESI): Calc. para [M H]+, C23H16NO3: 354,11247; encontrado: 354,11221; HRMS pos. (ESI): Calc. para [M+Na]+, C²³H¹⁵NNaO³ : 376.09441; encontrado: 376,09419; IR (ATR, cm^-1): 3366, 2926, 1757, 1460, 1428, 1259, 1242, 1222, 1158, 910, 784, 766, 737, 590, 554, 475.

Ejemplo 3.21

3- (2-Metil-1H-indol-3-il) -4- (naftalen-2-il) -1H-pirrol-2,5-diona

Cristales naranjas; ¹H RMN (acetona-d⁶) 52,24 (s, 3H), 6,77 (ddd, 1H, J - 1,04, 7,12, 8,07 Hz), 7,00 (ddd, 1H, J -1,15, 7,10, 8,07 Hz), 7,08 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 7,33 (ddd, 1H, J - 0,85, 8,08), 7,48 (m, 3H), 7,66 (d, 1H, J = 8,8 Hz), 7,80 (m, 1H), 7,84 (m, 1H), 8,30 (d, 1H, J = 0,72 Hz), 9,90 (s ancho, 1H), 10,60 (s ancho, 1H); ¹³C RMN (acetona-d⁶) 5 13,3, 103,1, 111,3, 120,2, 120,5, 121,9, 126,6, 126,9, 127,5 (2C), 128,0, 128,1, 128,9, 129,1, 130,4, 133,6, 133,7, 134,5, 135,0, 136,8, 138,3, 171. 7, 172,3 ; EM (EI): miz (%) 352 (100) [M+]; HRMS (EI): Calc. para C23H16O2N2: 352,12063; encontrado: 352,120553; IR (ATR, cm^-1): 3379, 3209, 3062, 2959, 2925, 2738, 1762, 1702, 1621, 1457, 1426, 1329, 1290, 1222, 1034, 993, 858, 826, 786, 754, 742, 715, 670, 662.

Ejemplo 3.22

3-(4-Acetilfenil)-4-(2-metil-1H-indol-3-il)furan-2,5-diona

Cristales rojo anaranjado; ¹H RMN (CDCh) 52,33 (s, 3H), 2,56 (s, 3H), 6,86 (ddd, 1H, J - 1,0, 7,04, 8,08 Hz), 6,99 (d ancho, 1H, J - 8,0 Hz), 7,07 (ddd, 1H, J - 1,22, 7,02, 8,12 Hz), 7,34 (ddd, 1H, J - 0,80, 0,84, 8,10), 7,72 (ddd, 2H), 7,94 (ddd, 2H), 10,98 (s ancho, 1H); ¹³C RMN (CDCh) 5 13,5, 26,4, 102,3, 111,7, 120,6, 120,8, 122,5, 126,5, 128,6 (2C), 130,1 (2C), 133,3, 134,5, 136,9, 137,5, 138,0, 140,4, 165,9, 166,0, 197,2; GC-MS (EI, 70 eV): miz (%) 345 (87) [M+]; HRMS (EI): Calc. para C21H15O4N: 345,09956; encontrado: 345,09942; IR (ATR, cm^-1): 3233, 2921, 2852, 1759, 1671, 1460, 1252, 1186, 1112, 924, 831,747, 731,628, 591,578, 516, 456, 434, 416.

Ejemplo 3.23

3-(4-Acetilfenil)-4-(2-metil-1H-indol-3-il)-1H-pirrol-2,5-diona

Cristales naranjas; ¹H RMN (acetona-da) 52,28 (s, 3H), 2,53 (s, 3H), 6,82 (ddd, 1H, J - 1,03, 7,07, 8,03 Hz), 6,99 (d ancho, 1H, J -7 ,40 Hz), 7,02 (ddd, 1H, J -1,12, 7,07, 8,11 Hz), 7,33 (ddd, 1H, J -0,81, 0,95, 8,08), 7,66 (ddd, 2H), 7,87 (ddd, 2H), 9,93 (s ancho, 1H), 10,67 (s ancho, 1H); ¹³C RMN (acetona-d⁶) 5 13,4, 26,4, 102,8, 111,4, 120,3, 120,5, 122,0, 127,1, 128,4 (2C), 130,2 (2C), 133,3, 135,9, 136,3, 136,9, 137,2, 138,7, 171,4, 171,8, 197,2; GC-MS (EI, 70 eV): m/z (%) 344 (100) [M+]; HRMS (EI): Calc. para C21H16O3N2: 344,11554; encontrado: 344,11495; IR (ATR, cm^-1): 3343, 3296, 3057, 1757, 1699, 1676, 1428, 1343, 1262, 1230, 740, 666, 638, 595, 460, 409.

Ejemplo 3.24

3-(4-Acetilfenil)-4-(1,2-dimetil-1H-indol-3-il)-1-metil-1H-pirrol-2,5-diona

Cristales de color rojo oscuro; ¹H RMN (DMSO-d⁶) 52,18 (s, 3H), 2,52 (s, 3H), 3,03 (s, 3H), 3,71 (s, 3H), 6,84 (ddd, 1H), 6,93 (d ancho, 1H, J - 7,54 Hz), 7,08 (ddd, 1H, J - 1,06, 7,08, 8,14 Hz), 7,45 (ancho, 1H, J - 8,25 Hz), 7,56 (ancho, 2H, J - 8,50 Hz), 7,86 (ancho, 2H, J - 8,50 Hz); ¹³C RMN (DMSO-d⁶) 512,3, 24,2, 26,8, 29,9, 101,3, 109,9, 119,7, 119,9, 121,3, 125,1, 128,1 (2C), 129,3 (2C), 131,6, 134,6, 135,1, 136,2, 137,1, 139,6, 170,4, 170,7, 197,5; GC-MS (EI, 70 eV): m/z (%) 372 (100) [M+]; HRMS pos. (ESI): Calc. para [M+H]+, C23H21N2O3: 373,15467; encontrado: 373,15473; IR (ATR, cm^-1): 3433, 2915, 1759, 1680, 1599, 1433, 1404, 1382, 1359, 1265, 1240, 957, 849, 829, 749, 738, 726, 595, 546, 439.

Ejemplo 3.25

3-(4-Acetilfenil)-1-metil-4-(1H-pirrolo [2,3-b] piridin-3-il)-1H-pirrol-2,5-diona

Cristales amarillos; ¹H RMN (DMSO-d⁶) 52,57 (s, 3H), 3,04 (s, 3H), 6,66 (dd, 1H, J -0,89, 8,00 Hz), 6,80 (dd, 1H, J - 4,74, 7,96 Hz), 7,55 (ancho, 2H, J - 8,27 Hz), 7,93 (ancho, 2H, J - 8,20 Hz), 8,11 (s, 1H), 8,18 (ancho, 2H, J -3,70 Hz), 12,55 (ancho s, 1H); ¹³C RMN (DMSO-d⁶) 524,1, 26,8, 102,8, 116,28, 116,34, 128,0 (2C), 128,4, 129,1, 129,9 (2C), 131,8, 132,5, 134,8, 136,5, 143,7, 149,0, 170,6, 170,8, 197,5; GC-MS (EI, 70 eV): m/z (%) 345 (100) [M+]; HRMS pos. (ESI): Calc. para [M+H]+, C29H16N3O3: 346,11862; encontrado: 346,11828; IR (ATR, cm^-1): 3025, 2873, 2817, 1756, 1695, 1677, 1440, 1421, 1385, 1289, 1269, 1229, 1090, 814, 776, 750, 645, 596, 514.

Ejemplo 4: Métodos biológicos

Se cultivaron células progenitoras neurales humanas ReNcell VM (Millipore, Schwalbach, Alemania) en recipientes de cultivo recubiertos con laminina. El medio de cultivo consistió en DMEM/F12 suplementado con suplemento de medio B27, GlutaMax™, sal sódica de gentamicina y heparina y factores de crecimiento EGF (factor de crecimiento epidérmico) y bFGF (factor de crecimiento de fibroblastos básico). La línea celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y se obtuvo del Centro Alemán de Recursos para Material Biológico DSMZ (Braunschweig, Alemania). Las células se cultivaron en DMEM, complementado con FBS al 10%, penicilina-estreptomicina al 1%, L-glutamina 4 mM. La línea de células de leucemia de células T humanas Jurkat se obtuvo del Centro Alemán de Recursos para Material Biológico DSMZ (Braunschweig, Alemania). Las células se cultivaron en medio RPMI 1640, suplementado con FBS al 10%, Penicilina-Estreptomicina al 1%. La línea celular de melanoma murino B16F10 se obtuvo de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, EE. UU.). Las células se cultivaron en medio DMEM/GM suplementado con FBS al 10%, Penicilina-Estreptomicina al 1%. La línea celular de glándula mamaria/carcinoma de mama MCF-7 se obtuvo de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, EE. UU.) Y se cultivó de acuerdo con los procedimientos estándar en Eagle's Mínimo Esencial Medio (EMEM). La línea celular de carcinoma de colon SW480 se obtuvo de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, EE. UU.) Y se cultivó de acuerdo con procedimientos estándar en medio L15 de Leibovitz. La línea celular de carcinoma de pulmón A549 se obtuvo de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, EE. UU.) Y se cultivó de acuerdo con procedimientos estándar en medio F-12K (Modificación de Kaighn del medio F-12 de Ham). La línea celular de carcinoma de hígado Hep G2 se obtuvo de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, EE. UU.) Y se cultivó de acuerdo con procedimientos estándar en Eagle's Mínimo Esencial Medio (EMEM).

Ensayo de vitalidad y proliferación celular

La proliferación celular y la vitalidad se midieron con un CASY Model TT (Roche, Mannheim, Alemania) mediante el método de exclusión de corriente eléctrica. Las células se sembraron en números definidos en placas de 48 pocillos y proliferaron durante 24 h. Posteriormente se aplicó medio fresco que contenía compuestos o DMSO, en lo sucesivo referido como control.

Microscopía VEC-DIC de polimerización de tubulina

Para evaluar la interferencia con la polimerización de tubulina se utilizó tubulina neuronal bovina diluida en tampón BRB80 (PIPES 80 mM, pH 6,8; MgCl2 ImM; EGTA ImM) a una concentración de 2 mg /ml. Después de la adición de GTP 0,5 mM y DMSO al 10%, iniciando la polimerización de tubulina, las muestras de solución se incubaron a 37 ° C en presencia del compuesto del ejemplo 6 (PDA-66). Después de 1 hora, las muestras se analizaron utilizando microscopía de contraste de interferencia diferencial de contraste mejorado con video (VEC-DIC).

Ensayo de turbidez de polimerización de tubulina

Se usó tubulina de cerebro bovino purificada para medir la polimerización de tubulina determinando la turbidez en muestras de tubulina incubadas con el compuesto del ejemplo 6 (PDA-66), paclitaxel o nocodazol (todos 1 pM) y DMSO al 0,6% en agua como control negativo. La densidad óptica (DO) se midió después de la iniciación del ensamblaje de tubulina a una longitud de onda de 340 nm de forma continua durante 60 minutos en intervalos de 1 minuto a una temperatura de 37 °C en un lector de placas (Tecan, Mainz, Alemania).

Detección de apoptosis anexinaV/PI

Para determinar la cantidad de células apoptóticas y necróticas se usó un kit I de detección de apoptosis FITC AnnexinV. Para el análisis FACS, las células se tripsinizaron y centrifugaron a 100 x ga TA durante 5 min y se lavaron con PBS sin Ca2+ y Mg2+. Se añadieron anexina V y yoduro de propidio (PI) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de 15 min de incubación a temperatura ambiente en un agitador en la oscuridad, la medición se realizó utilizando FACSCalibur (Becton Dickinson, San José, EE. UU.) En combinación con el software Cell Quest Pro.

Los productos químicos mencionados en "Métodos biológicos" se obtuvieron de:

Sigma-Aldrich (Hamburgo, Alemania): DMSO, PIPES, MgCl2, EGTA, GTP, paclitaxel, nocodazol, PDL, PFA, TritonX-100, anticuerpo primario para a-tubulina. Invitrogen (Karlsruhe, Alemania): GlutaMax™, gentamicina, sal sódica de heparina DMEM/F12, suplemento de medio B27. Roche (Mannheim, Alemania): EGF (factor de crecimiento epidérmico), bFGF (factor básico de crecimiento de fibroblastos. GIBCO (Berlín, Alemania): DMEM, L-Glutamina. PAA (Colbe, Alemania): FBS. Biochrome (Berlín, Alemania): Penicilina-estreptomicina. Citoesqueleto (Denver, EE. UU.): Tubulina neuronal bovina BK006P. AMS Biotechnology (Frankfurt, Alemania): laminina. Sondas moleculares (Darmstadt, Alemania): Alexa Fluor 568. BD Bioscience (Heidelberg, Alemania): FITC AnnexinV Apoptosis Detection Kit I.

Ejemplo 5: Datos biológicos

5.1 Se evaluaron los efectos citotóxicos usando células fetales humanas inmortalizadas por transfección con el oncógeno v-myc (Donato et al., Differential development of neuronal physiological responsiveness in two human neural stem cell lines. BMC Neurosci.; 8, 2007), también denominadas en el presente documento células progenitoras neuronales humanas, hNPC o ReNcell VM, que proporcionan un sistema de detección sensible y células cancerosas, a saber, células SH5Y5, Jurkat y B16F10. Los efectos citotóxicos se midieron comparando el número de células de las células tratadas con DMSO (control) y el número de células de las células tratadas con el compuesto del ejemplo 2.6 mencionado anteriormente (PDA66). La proliferación y vitalidad celular se midió con un CASY Model TT (Roche, Mannheim, Alemania) mediante el método de exclusión de corriente eléctrica. Las células se sembraron en números definidos en placas de 48 pocillos y proliferaron durante 24 h. Posteriormente, se aplicó medio fresco que contenía el compuesto del ejemplo 6 (3 pM) (PDA-66) o DMSO, en lo que sigue se denomina control. Se midió el número de células y la vitalidad celular después de 72 h.

Los resultados se muestran en la Fig. 1. Los números de células se midieron mediante el método de exclusión actual en el que se evaluaron simultáneamente el número de células y las células de vitalidad. Las células no tratadas mostraron un crecimiento exponencial con el tiempo (Fig. 1A, puntos negros) donde la vitalidad se mantuvo estable en el tiempo (puntos negros B). Las células tratadas con el compuesto del ejemplo 2.6 (PDA-66) no proliferaron (cuadros negros A) y mostraron una vitalidad decreciente (Fig. 1B, cuadros negros) demostrando el efecto antiproliferativo del compuesto del ejemplo 2.6 (PDA-66).

El compuesto del ejemplo 6 (PDA-66) demostró un fuerte efecto antiproliferativo significativo sobre las células inmortalizadas (Fig 1). En comparación con el control, las células tratadas con el compuesto del ejemplo 2.6 (PDA-66) no mostraron proliferación (Fig. 1, panel izquierdo). Después de 72 h de tratamiento, el número de células fue incluso menor que el número de células sembradas. Además, el número de células vitales, medido en paralelo mediante el método de exclusión actual, fue significativamente menor en las células tratadas con el compuesto del ejemplo 2.6 (PDA-66) (Fig. 1, panel derecho).

Las células inmortalizadas también se probaron para determinar si existe un efecto dependiente de la dosis del compuesto del ejemplo 2.6 (PDA-66) sobre la proliferación de dichas células inmortalizadas. Los resultados se muestran en la Fig. 6. Como puede tomarse de la Fig. 6, existe un efecto dependiente de la dosis del compuesto del ejemplo 2.6 (PDA-66) sobre la proliferación de dichas células inmortalizadas.

5.2 Además, se trataron células cancerosas con el compuesto del ejemplo 2.6 (PDA-66) con una concentración de 3 pM durante 72 h y se evaluó el número de células usando el método de exclusión actual como se describe anteriormente. El número de células de células de neuroblastoma humano (SH5Y5), leucemia de células T humanas (Jurkat) y células de melanoma murino (B16F10) se redujo o atenuó significativamente mediante el tratamiento con el compuesto del ejemplo 2.6 (PDA-66) que demuestra el efecto antiproliferativo (Fig. 2).

En un experimento adicional, se trataron más células cancerosas con el compuesto del ejemplo 2.6 (PDA-66) con una concentración de 3 pM o 10 pM durante 72 h y se evaluó el número de células usando el método de exclusión actual como se describe anteriormente. Número de células de células progenitoras neuronales humanas inmortalizadas (hNPC; proliferación relativa al control a 3 pM: 3,6 ± 1,2%; y a 10 pM: 0,9 ± 0,2%), leucemia de células T humanas (Jurkat; proliferación relativa al control a 3 pM: 18,2 ± 2,2%; y a 10 pM: 31,9 ± 5,9%), células de melanoma murino (B16F10; proliferación relativa al control a 3 pM: 7,2 ± 1,3%; y a 10 pM: 8,3 ± 2,6%), células de carcinoma madre ( MCF-1; proliferación relativa al control a 3 pM: 43,0 ± 2,8%; y a 10 pM: 38,3 ± 11,8%), células de carcinoma de colon (SW480; proliferación relativa al control a 3 pM: 61,3 ± 0,6%; y a 10 pM: 56,6 ± 6,6%), células de carcinoma de pulmón (A 549; proliferación relativa al control a 3 pM: 57,1 ± 9,2%; y a 10 pM: 65,7 ± 8,0%) y células de carcinoma de hígado (HepG2; proliferación relativa al control en 3 pM: 74,8 ± 6,3%; y a 10 pM: 47,2 ± 3,8%) fueron evidentemente reducidas o atenuadas significativamente después de 72 h por el tratamiento con el compuesto del ejemplo 2.6 (PDA-66) que demuestra el efecto anti-proliferativo (Fig. 7).

El valor de CI50 para el compuesto del ejemplo 2.6 (PDA-66), expresado como nM, fue 532,3 en el caso de hNPC, 1073,0 en el caso de células B16F10 y 8981,0 en el caso de células A549.

5.3 Se reveló que el efecto citotóxico se basaba muy probablemente en la inducción de apoptosis como un aumento de células apoptóticas demostrado por el aumento de células AnexinaV+VPI' y AnexinaV+/PI+ tras el tratamiento de las células con compuesto de Se observó el ejemplo 2.6 (PDA-66), como se puede tomar de la Fig. 3, panel superior e inferior derecho.

5.4 La inducción de apoptosis en células proliferativas, como células cancerosas o células inmortalizadas, puede basarse en una detención de las células dentro del ciclo celular. Tal detención mitótica puede desencadenar cascadas apoptóticas ya que las células, por ejemplo, no pasan los puntos de control mitóticos.

Se demostró una detención mitótica de células en la fase G2/M del ciclo celular para células inmortalizadas humanas tratadas con el compuesto del ejemplo 2.6 (PDA-66) (Fig. 4) donde se encontró la mayor cantidad de células después de 16 h (68,9 ± 10,3% frente al control 17,4 ± 2,3%). Como medida se utilizó el aumento de células con doble contenido de ADN, donde en todos los momentos la cantidad de células tratadas fue mayor en comparación con las células no tratadas.

5.5 Se describe que la detención mitótica se basa en una alteración del ensamblaje de microtúbulos, donde se conoce el potencial despolimerizante de los indoles (Brancale y Silvestri, a core nucleus for potent inhibitors of tubulin polymerization. Med.Res.Rev., 27 de 2007).

La capacidad del compuesto del ejemplo 2.6 (PDA-66) para dificultar la polimerización de tubulina se demostró mediante ensayos que emplean tubulina purificada (Fig. 5A, B). La tubulina se trató con el compuesto del ejemplo 2.6 y mediante el uso de microscopía de contraste de interferencia diferencial mejorada por vídeo (VEC-DIC) se demostró la influencia del compuesto del ejemplo 6 (PDA-66) en la polimerización de microtúbulos. La tubulina no tratada fue capaz de acumular MT (Figura 5a ), es decir polimerizar, mientras que en comparación el compuesto del ejemplo 2.6 (PDA-66) obstaculizó la polimerización MT y no se observaron haces o estructuras en forma de haz (figura 5B).

El efecto del compuesto del ejemplo 2.6 (PDA-66) también se demostró en un ensayo de polimerización con tubulina purificada usando una medición de densidad fotométrica (Fig. 5C). Se usó tubulina sin tratar como control, donde la medición a lo largo del tiempo dio como resultado una curva de forma sigmoidea. La curva obtenida para paclitaxel poseía una forma comparable pero con una pendiente más pronunciada, típica de los agentes estabilizadores de microtúbulos. Por el contrario, la aplicación de nocodazol, un agente desestabilizador de microtúbulos, resultó en una curva casi lineal, lo que indica que la polimerización de tubulina se vio obstaculizada. Se obtuvo un resultado comparable con tubulina tratada con el compuesto del ejemplo 2.6 (PDA-66), lo que sugiere una acción desestabilizadora del compuesto del ejemplo 2.6 (PDA-66) sobre la tubulina. En consecuencia, la DO máxima después de 60 min fue más alta para la tubulina tratada con paclitaxel (1,18 unidades rel.) Y más baja para nocodazol (1,01 unidades rel.) Y PDA-66 (1,04 unidades rel.). Por consiguiente, el compuesto del ejemplo 2.6 (PDA66) desestabilizó la tubulina de una manera comparable al nocodazol, un conocido agente desestabilizador de microtúbulos.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto de fórmula (V)

una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, un hidrato del mismo, o un solvato del mismo;

para su uso en un método para el tratamiento y/o la prevención del cáncer, en donde,

R1 se selecciona del grupo que consiste en metilo e hidrógeno;

R4 es hidrógeno;

R6 es metilo; y

R7 es hidrógeno.

2. El compuesto para su uso de la reivindicación 1, en donde R1 es metilo.

3. El compuesto para su uso de la reivindicación 1, en donde R1 es hidrógeno.

4. El compuesto para su uso de la reivindicación 1, en donde el compuesto es 3-(4-acetilfenil)-1-metil-4-(2-metil-1H-indol-3-il)-1 H-pirrol-2,5-diona

5. El compuesto para su uso de la reivindicación 1, en donde el compuesto es 3-(4-acetilfenil)-4-(2-metil-1H-indol-3-il)-1H-pirrol-2,5-diona

6. El compuesto para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el cáncer se selecciona del grupo que comprende cáncer de mama, cáncer de pulmón, incluido el carcinoma de pulmón de células no pequeñas, cáncer renal, cáncer de colon, síndrome mielodisplásico, cáncer genitourinario, cáncer gastrointestinal, cáncer epidermoide, melanoma, glioma, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, linfoma, mieloma, cáncer colorrectal, neuroblastoma , cáncer de cabeza y /o cuello, cáncer de vejiga, cáncer de cerebro en un sentido más amplio y cáncer gástrico en un sentido más amplio, cualquier metástasis de cualquiera de los mismos.

7. El compuesto para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el método comprende la administración de un segundo agente terapéutico, en donde el segundo agente terapéutico es un agente quimioterapéutico.

8. El compuesto para uso de la reivindicación 7, en donde el agente quimioterapéutica se selecciona del grupo que comprende citarabina, etopósido, mitoxantrón, ciclofosfamida, ácido retinoico, daunorrubicina, doxorrubicina, idarrubicina, azacitidina, decitabina, un inhibidor de tirosina-quinasa, un anticuerpo antineoplásico, alcaloides de la vinca y esteroides,

9. El compuesto para uso de la reivindicación 8, en donde más preferiblemente, el agente quimioterapéutico es un inhibidor de tirosina-quinasa, en donde el inhibidor de tirosina-quinasa se selecciona del grupo que comprende sorafenib, dasatinib, nilotinib, nelarabina y fludarabina.

10. El compuesto para uso de la reivindicación 8, en donde el agente quimioterapéutico es Alemtuzumab (Campath®).