ES2848385T3 - Métodos de uso de gelsolina para tratar o prevenir septicemia bacteriana - Google Patents

Abstract

Gelsolina, o fragmento peptídico funcionalmente equivalente de la misma, para su uso como un medicamento en un método de prevención, neutralización o reducción de endotoxemia o choque séptico inducido por endotoxinas en un paciente in vivo, en donde el paciente se somete o es susceptible a infección por bacterias Gram-negativas.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos de uso de gelsolina para tratar o prevenir septicemia bacteriana

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a tratar, prevenir o neutralizar el choque séptico en mamíferos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El choque séptico de las endotoxinas bacterianas, provocado por la liberación de moléculas de lipopolisacárido (LPS) de la pared externa de bacterias Gram-negativas, es una causa importante de muerte en el ser humano para la que previamente no ha habido tratamiento eficaz una vez se han activado las vías inflamatorias complejas. La administración de LPS de líquidos externos a la membrana celular, y por último lugar a los receptores de LPS, es complejo, que implica a varias proteínas externas y otros factores (Erridge et al., Microbes Infect. 4:837-851 (2002); Bosshart et al., f EeS Lett. 553:135-140 (2003); Thomas et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 307:133-138 (2003); Rustici et al., (1993) Science 259, 361 -365 (1993)). Un factor crítico en la toxicidad de LPS es el estado de agregación de esta molécula anfipática, por ejemplo, cuando los LPS se empaquetan en fases laminares, la toxicidad es baja, pero alta cuando están presentes en fases no laminares (Brandenburg et al., Carbohydr. Res. 338:2477-2489 (2003)). Como resultado, las estrategias para contrarrestar los LPS en suero o líquido cefalorraquídeo han involucrado a varios tipos de moléculas pequeñas y proteínas, que incluyen anticuerpos anti-LPS, tales como transferrina, alfa 2-macroglobulina, globulina Gc (Berger et al., Clin. Chim. Acta 163:289-299 (1987); Berer et al., Eur. J. Clin. Invest.

20:66-71 (1990)) y MD-2 (Shimazu et al., J. Exp. Med. 189:1777-1782 (1999)).

Las partículas de lipoproteína, tales como proteína de unión a LPS (LBP), también son ligandos para LPS (Wright et al., J. Exp. Med. 170:1231-1241 (1989)), en cuyo caso un aumento en los niveles de lípido plasmático durante la septicemia puede ser una respuesta protectora puesto que el LPS unido a otras moléculas parece perder su efecto estimulante en células (Casas et al., J. Surg. Res. 59:544-552 (1995); Bannerman et al., J. Daily Sci. 86:3128-3137 (2003)) y promueve la tolerancia a las citocinas en hepatocitos (Harris et al., J. Endotoxin Res. 9:45-50 (2003)). Tanto LBP como CD14 promueven el reparto de LPS en complejos de lipoproteína (Vreugdenhil et al., J. Immunol. 170:1399-1405 (2003); Wurfel et al., J. Exp. Med. 181:1743-1754 (1995)) y MD. Lo que es más importante, se ha mostrado que bajas concentraciones de LBP potencian la activación inducida por LPS de células mononucleares, mientras que elevadas concentraciones de LBP inhiben la estimulación de células inducida por LPS (Gutsmann et al., Infect. Immun.

69:6942-6950 (2001)). LBP también suministra LPS a sus receptores en la membrana celular. Este efecto doble de la proteína sobre la función de LPS refuerza la importancia del estado de agregación de los lípidos, y confirma que la toxicidad no resulta de la concentración de masa solo. Relacionado con este efecto pueden ser el hallazgo de que bajas dosis de agentes antimicrobianos pueden conducir al agravamiento de la toxicidad asociada a LPS (Tauber et al., J. Infect. Dis. 156:456-462 (1987); Mertsola et al., Pediatr. Infect. Dis. J. 8:904-906 (1986)).

La gelsolina es una proteína sérica normal, pero a diferencia de otras proteínas de mamífero, la gelsolina tiene tanto isoformas citoplásmicas como secretadas derivadas por corte y empalme alternativo del mensajero de un único gen (Sun et al., J. Biol. Chem. 274:33179-33182 (1999)). Aunque se identificó originalmente como una proteína celular, la gelsolina citoplásmica también existe como una isoforma secretada abundante de estructura casi idéntica y es un producto del mismo gen (Kwiatkowski et al., Nature 323:455-458 (1986)). Tiene una estructura repetida de secuencia séxtuple que está altamente conservada entre gelsolinas de especies de vertebrados, y que es característica de una gran familia de proteínas relacionadas con la gelsolina (Kwiatkowski, Curr. Opin. Cell Biol. 11: 103-108 (1999)).

La gelsolina secretora, ahora denominada "gelsolina plasmática", circula en la sangre humana y de roedor a concentraciones de 250 ±50 pg/L (Lind et al., Am. Rev. Respir. Dis. 138:429-434 (1988)). La gelsolina plasmática tiene una secuencia señal procesada, pero por lo demás es idéntica a la forma celular, con la excepción de un tramo de 23 aminoácidos en el extremo amino de la molécula, designada la "extensión plasmática". Por tanto, la forma plasmática de la gelsolina es ligeramente más grande (84 kDa) que la variante celular (82 kDa). La gelsolina humana recombinante (GSNhr) (Biogen IDEC, Inc., Cambridge, MA) se produce en E. coli, y aunque tiene la misma estructura primaria que la proteína nativa, en condiciones de purificación habituales, se diferencia de la gelsolina plasmática humana natural por un enlace disulfuro que está presente en la proteína natural. Por tanto, la proteína recombinante se oxida apropiadamente después de la purificación, y su estructura y funciones son indistinguibles de la gelsolina plasmática humana purificada (véase, Wen et al., Biochemistry 35:9700-9709 (1996)).

Aunque es secretada por muchos tejidos, la principal fuente de la gelsolina plasmática humana es el músculo estriado (Kwiatkowski et al., J. Biol. Chem. 263:8239-8243 (1988)). Parece que esta forma de gelsolina está distribuida en todos los líquidos extracelulares y tiene un tiempo de residencia típico en plasma (Lind et al., J. Clin. Invest. 78:736-742 (1986)). No se modifica postraduccionalmente por glucosilación u otras reacciones, ni es un reactante de la fase aguda. En realidad, existe poca información referente a su función o a la regulación de su producción. Sin embargo, se conoce que los niveles de gelsolina disminuyen en la práctica clínica cuando ocurre la inflamación o septicemia, es decir, la lesión tisular asociada a la rotura de las barreras de membrana y la exposición de actina al entorno extracelular da como resultado reducciones en los niveles de gelsolina plasmática (Lee et al., N. Engl J. Med 326:1335-1341 (1992)).

Como resultado, la disminución de gelsolina plasmática precede y predice las complicaciones de la intensa lesión, tal como el fallo respiratorio y la muerte en animales que incluyen seres humanos (Mounzer et al., Am J. Respir. Crit. Care 111 ed. 160:1673-1681 (1999); DiNubile et al., Blood 100:4367-4371 (2002)). Por ejemplo, una disminución en los niveles de gelsolina plasmática de hasta <50 % normalmente es un fuerte factor pronóstico de desenlaces clínicos adversos asociados a una enorme inflamación, aunque no se ha identificado ni una función causante ni un tratamiento basándose en este resultado (Dahl et al., Shock 12:102-104 (1999); Dahl et al., Crit. Care Aled; 31:152-156 (2003); Lind et al., 1988, 20 arriba; Smith et al., Blood 72:214-218 (1988); Suhler et al., Crit. Care Med. 25:594-598 (1997)). Sin embargo, la sustitución de los reducidos niveles de gelsolina plasmática ha atenuado las secuelas patológicas de las intensas lesiones primarias en modelos animales (Christofidou-Solomidou et al., J. Investig. Med. 50: 54-60 (2002); Rothenbach et al., J. Appl. Physiol. 96:25-31 (enero de 2004)), que respalda los resultados de la presente invención.

En respuesta al traumatismo y/o la infección aguda, la abundante G-actina, pero normalmente intracelular (actina monomérica) se libera en los espacios extracelulares de células y tejidos dañados o moribundos y circula en líquido y sangre. Una vez liberada, la G-actina tiene una fuerte tendencia a polimerizar dando F-actina. La persistencia de los filamentos de F-actina en la microvasculatura de los mamíferos puede dar como resultado la obstrucción venosa, microtrombos pulmonares y/o lesión endotelial, e induce o potencia la aglutinación de plaquetas en la sangre, provocando así el desarrollo de trombos (Scarborough et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 100:1314-1319 (1981)). En combinación, estos efectos alteran las características del flujo vascular normal en mamíferos y, a su vez, puede dar como resultado los trastornos de toxicidad por actina y contribuir a la patogénesis de la lesión de órganos en sitios distantes de la lesión primaria (Dahl et al., Crit. Care Med. 26:285-289 (1998); Lee et al., 1992, arriba; Mounzer et al., 1999, arriba, véase también la patente de Ee . UU. N° 5.593.964).

Sin embargo, diversas proteínas reguladoras de actina contribuyen a la conversión reversible de filamentos ("gel") y monómeros ("sol" líquido), y ocurren cambios dependiendo de los estímulos extracelulares (véase la patente de EE. UU. N° 6.271.353). La gelsolina plasmática y la globulina Gc secretada actúan de un modo coordinado, que representa un "sistema depurador de actina", para despolimerizar y retirar los filamentos de actina liberados de las células dañadas. La gelsolina se une a tanto la actina monomérica como a la filamentosa (Yin et al., Nature 281:583-586 (1979)), aunque después de la lesión, la gelsolina se une preferentemente a los filamentos de actina y los corta para promover la rápida despolimerización (Sun et al, 1999, arriba), mientras que la globulina Gc se une a los monómeros de actina para desplazar el equilibrio monómero/polímero de actina de nuevo hacia las despolimerizaciones y prevenir la repolimerización (Goldschmidt-Clermont et al., J. Clin. Invest. 81:1519-1527 (1988)).

La unión requiere la presencia de concentraciones micromolares de calcio (Ca2+), que puede incluir calcio añadido o Ca2+ endógenamente disponible en el paciente. Además, la unión es muy fuerte, que tiene una constante de disociación en el intervalo nanomolar. En realidad, cuando la gelsolina se une a filamentos de actina en presencia de calcio, rompe o corta los filamentos en el sitio de unión, rompiendo los enlaces no covalentes que mantienen juntos los monómeros de actina dentro del polímero (Janmey et al., Biochemistry 24:3714-3723 (1985)). Después de la reacción de corte de la actina, la gelsolina sigue fuertemente unida a un extremo del filamento de actina polarizado, el extremo convencionalmente definido como "barbado". Este también es el extremo que intercambia rápidamente monómeros.

La retirada del calcio por quelación no disocia la gelsolina de los extremos barbados de los filamentos de actina. En su lugar, las fosfoinositidas (también denominadas los fosfolípidos de inositol fosforilados, o "PPI"), que son productos intermedios importantes de la transducción de señales, efectúan esta separación en la membrana plasmática. La gelsolina se une con alta afinidad y selectividad a PPI y a ácido lisofosfatídico (LPA) (Janmey et al., J. Biol. Chem.

262:12228-12236 (1987); Meerschaert et al., Embo J. 17:5923-32 (1998)). Los PPI regulan, por tanto, la función de unión a actina intracelular de la gelsolina, que conduce a la hipótesis de que una relación recíproca, entre los transitorios de calcio y la síntesis y la degradación de la fosfoinositida de la membrana, regula la gelsolina y las respuestas de remodelación de actina celular (Stossel, J. Biol. Chem. 264, 18261-18264 (1989)). La gelsolina que se une a LPA modula sus efectos biológicos mediados por receptor, que conduce a la creencia de que puede actuar de vehículo de LPA para algunos receptores celulares, y amortigua mediadores de lípidos inflamatorios bioactivos (Goetzl et al., J. Biol. Chem. 275:14573-14578 (2000).

El calcio y las fosfoinositidas también controlan las funciones de unión a actina de la gelsolina plasmática in vitro (Janmey et al., Chem. Biol. 5:R81-85 (1998)). El sitio de gelsolina regulador de PPI reside dentro de una secuencia lineal de 20 restos que conecta el primer y el segundo dominios plegados de la proteína. Estudios bioquímicos y mutacionales han implicado a 10 aminoácidos básicos e hidrófobos estratégicamente organizados (160-169, SEQ ID NO: 1 QRLFQVKGRR) en la molécula de gelsolina plasmática de 684 restos que acomodan una fuerte unión con los fosfomonoésteres negativamente cargados y las cadenas de acilo hidrófobas de fosfolípidos aniónicos (Janmey et al., J. Biol Chem 267:11818-11823 (1992). Los péptidos sintéticos de esta secuencia tienen una afinidad de unión a PPI similar a la de la gelsolina intacta (ídem).

Los métodos usados para medir la función de la gelsolina han aprovechado la función de corte del filamento de actina dependiente del calcio por gelsolina, o actividades de nucleación de monómeros de actina, o la masa real de gelsolina, usando ensayos de transferencia Western o de inmunoquímica (normalmente ELISA). Los ensayos usados para cuantificar la gelsolina tienen ventajas y desventajas relativas. Por ejemplo, los ensayos solo miden la actividad de corte que es directamente medible fluorimétricamente (Janmey et al., Blood 70:524-530 (1987)) y los ensayos son específicos de la gelsolina libre, pero la actina y el lípido que se unen a la gelsolina inhiben esta función. La actividad de nucleación y los ensayos estructurales no diferencian la gelsolina libre de la complejada. Sin embargo, diferentes ensayos han dado hasta la fecha resultados muy similares de los niveles de gelsolina plasmática en muestras de control y, en general, grados de diminución coherentes en plasmas de animales o seres humanos lesionados, con la excepción de que la actividad de corte es inferior a la esperada. Sin embargo, también existen datos inexplicables de estudios que muestran actividad de corte de gelsolina reducida, pero no total, en muestras de suero sin indicios de actina, que sugiere que otro ligando se puede haber unido a la gelsolina.

Aunque no existe relación aparente entre la función o el metabolismo de LPS y o LPA o PIP2 (fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato), estos lípidos comparten dos características estructurales poco usuales y esenciales, y como lípidos ácidos, se parecen superficialmente a LPS en que todos tienen fosfomonoésteres yuxtapuestos a una interfase hidrófoba (Erridge et al., 2002, arriba). El sitio activo de cada molécula contiene un fosfomonoéster que emana de una base de hidrato de carbono, glicerol en el caso de LPA y un anillo de azúcar para LPS y PIP2. Estos restos, que están presentes en algunos otros lípidos, presentan posibilidades de interacciones electrostáticas y de unión a hidrógeno que estabilizan tanto los complejos de lípido-proteína como de lípido-lípido ((Liepina et al., Biopolymers 71:49-70 (2003)). Por tanto, ninguno de estos lípidos forma fases laminares por sí mismos (por ejemplo, Flanagan et al., Biophys. J.

73:1440-1447 (1997)), la unión de LPA y PIP2 a gelsolina parece ser más fuerte cuando el lípido está en micelas o agrupaciones de lípidos putativos dentro de vesículas bicapa (Meerschaert et al., Embo J. 17:5923-5932 (1998); Tuominen et al., Eur. J. Biochem. 263:85-92 (1999); Janmey et al., J. Biol. Chem. 262:12228-12236 (1987)).

La reducción de gelsolina plasmática contribuye a la fisiopatología de la disfunción microvascular pulmonar resultante de una inflamación primaria inducida por quemaduras o bacterianamente, y lesión pulmonar inducida por inflamación (Rothenbach et al., 2004, arriba). Un claro ejemplo clínico de la lesión de tejido secundario asociada a, y resultante de, una reducción de gelsolina es el síndrome de dificultad respiratoria aguda - de disfunción multiorgánica (SDRA/SDMO) (Ware et al., N. Engl. J. Med. 342:1334 (2000)). Los niveles de gelsolina plasmática han disminuido hasta según parece, en promedio, el 30 % de los valores normales en casos de SDRA establecidos (Yin et al, 1979, arriba). Un historial poco convincente de intervenciones farmacológicas en SDRA establecido sugiere que una vez ocurre el SDRA en estado avanzado, ya no puede ser posible inhibir el amplio espectro de mediadores inflamatorios activados que participan.

El documento de patente WO 91/15770 desvela un método de tratamiento de trastornos relacionados con la actina disminuyendo la concentración de actina libre en el plasma de un animal administrando proteínas de unión a actina nativas y modificadas, tales como regiones de unión a actina de la gelsolina.

Por consiguiente, actualmente no existe agente para neutralizar clínicamente las endotoxinas, o prevenir o evitar la septicemia bacteriana resultante, y frecuentemente la muerte. Hasta la presente invención existía la necesidad, por tanto, de entender mejor las proteínas de unión a PPI y los ligandos lipídicos de estas proteínas, cómo afectan la función de la gelsolina, cómo el alterar los niveles de PPI en el cuerpo sirve para reorganizar el citoesqueleto de actina y la función de estos lípidos y proteínas de unión a lípido, tales como la gelsolina, en la inflamación, particularmente con respecto al desarrollo de métodos de tratamiento, alivio, o incluso prevención, de la aparición y la patología de endotoxemia causada por bacterias, septicemia, disfunción microvascular pulmonar inducida por la inflamación después de quemaduras intensas o infarto de miocardio, SDRA o fibrosis quística.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La reducción de gelsolina contribuye a la fisiopatología de la disfunción microvascular durante la inflamación en pacientes con traumatismo y con quemaduras, así como en choque séptico resultante de endotoxinas bacterianas, provocados por la liberación de moléculas de lipopolisacárido (LPS) de bacterias Gram-negativas infectantes. Como resultado, la presente divulgación proporciona métodos para contrarrestar la disminución de los niveles de gelsolina plasmática en un momento de tiempo suficientemente pronto en la lesión inducida por inflamación por la infusión de gelsolina, de forma que se evite la disfunción microvascular. En realidad, según aspectos preferidos de la divulgación, se previene completamente la infusión intravenosa de gelsolina humana recombinante sintética (terapia de sustitución recombinante), el daño tisular irreversible y la elevada permeabilidad microvascular de otro modo asociada a la producción de endotoxinas bacterianas, y la muerte. Así, la divulgación proporciona una evidencia importante y nueva para respaldar el hallazgo de que la gelsolina circulante tiene una importante función protectora contra la fisiopatología de la inflamación sistémica. Es un objeto de la presente invención proporcionar gelsolina, o un fragmento peptídico funcionalmente equivalente de la misma, para su uso como un medicamento en un método de prevención, neutralización o reducción de la endotoxemia o choque séptico inducido por endotoxinas en un paciente in vivo, en donde el paciente se somete o es susceptible a la infección por bacterias Gram-negativas. Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar una composición farmacéutica que comprende gelsolina para su uso como se ha establecido anteriormente, comprendiendo dicha composición farmacéutica: (1) gelsolina, o fragmento peptídico funcionalmente equivalente de la misma, en donde dicha gelsolina o dicho fragmento está sustancialmente libre de contaminantes naturales; y (2) un vehículo farmacéuticamente aceptable; y (3) una cantidad suficiente de Ca2+ para activar la capacidad de unión de gelsolina exógenamente administrada, para su uso en un método de prevención, neutralización o reducción de la endotoxemia o choque séptico inducido por endotoxinas en un paciente. Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar un uso de gelsolina, o fragmento peptídico funcionalmente equivalente de la misma, en la fabricación de un medicamento para prevenir, neutralizar o reducir la endotoxemia o choque séptico inducido por endotoxinas en un paciente. Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar gelsolina para su uso en un método de predicción del desenlace clínico asociado a una enorme inflamación en un paciente susceptible a choque inflamatorio o septicemia inducida por endotoxinas, comprendiendo dicho método medir la concentración de gelsolina circulante en el paciente, en donde una disminución < 30 % de los niveles de gelsolina normal pre-traumatismo o pre-infección predice dicho desenlace adverso y predice la necesidad de terapia con gelsolina.

Es un objeto de la presente divulgación proporcionar un método de aumento de la concentración de gelsolina o fragmento peptídico funcionalmente equivalente de la misma, en sangre o líquido extracelular de un paciente in vitro o in vivo, en donde se necesita dicha elevada concentración de gelsolina, comprendiendo dicho método administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de gelsolina, o fragmento peptídico funcionalmente equivalente de la misma.

Es un objeto adicional proporcionar métodos de disminución de la concentración de LPS bacteriano en sangre o líquido extracelular de un paciente, previniendo, neutralizando o reduciendo así la endotoxemia o el choque séptico inducido por endotoxinas en un paciente in vitro o in vivo, en donde el paciente se somete o es susceptible a la infección por bacterias Gram-negativas, comprendiendo dicho método administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de gelsolina, o fragmento peptídico funcionalmente equivalente de la misma, para reducir la concentración de LPS bacteriano y proteger al paciente de la endotoxemia o septicemia inducida por endotoxinas. Por consiguiente, el método bloquea, reduce o mejora más la alteración inducida por LPS bacteriano de las respuestas celulares de mamíferos o la formación de estructuras tóxicas in vitro o in vivo. También bloquea, reduce o mejora la inhibición de la fibrinólisis por exceso de actina libre extracelular en sangre o líquido extracelular de un paciente in vitro o in vivo. Además, restaura o mantiene la agregación normal de plaquetas en un paciente, en donde el paciente se somete o es susceptible a la disfunción de la coagulación generalizada inducida por LPS.

Es un objeto adicional que cada método integrado es útil in vitro o en la propiamente dicha terapia sustitutiva con gelsolina de un paciente.

Cuando dichos métodos se usan in vivo, es un objeto adicional que el método inhiba, mejore o prevenga eficazmente la lesión tisular secundaria en el paciente resultante de una acumulación de exceso de LPS bacteriano, comprendiendo dicho método administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de gelsolina, o fragmento peptídico funcionalmente equivalente de la misma. Además, los métodos son eficaces incluso cuando la lesión tisular secundaria en el paciente está remota del sitio de infección primaria o traumatismo.

Es aún otro objeto más proporcionar un método de predicción del desenlace clínico adverso asociado a una enorme inflamación en un paciente susceptible a choque inflamatorio o septicemia inducida por endotoxinas, comprendiendo dicho método medir la concentración de gelsolina circulante en el paciente, en donde una disminución < 30 % de los niveles de gelsolina normales pre-traumatismo o pre-infección predice dicho desenlace adverso y predice una necesidad de terapia con gelsolina. También se proporcionan composiciones de gelsolina o fragmento activo de las mismas como se usa en los métodos anteriores.

Los objetos, ventajas y características novedosas adicionales de la divulgación se expondrán en parte en la descripción, ejemplos y figuras que siguen, todos los cuales pretenden ser para fines ilustrativos solo. La invención se define en las reivindicaciones. Los aspectos, realizaciones y ejemplos de la presente divulgación que no entran dentro del alcance de las reivindicaciones no forman parte de la invención y se proporcionan simplemente para fines ilustrativos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

El sumario anterior, así como la siguiente descripción detallada de la invención, se entenderá mejor cuando se lea junto con los dibujos adjuntos. Se debe entender, sin embargo, que la invención no se limita a las disposiciones e instrumentalidades precisas mostradas.

Las FIG. 1A-1D representan gráficamente la interacción de PBP10 y gelsolina con LPS. La FIG. 1A muestra la unión de LPS marcado con 3H a péptidos PBP10 ± LPS frío (PBP10 mostrado por círculos abiertos; PBP10 LPS mostrado por cuadrados abiertos; fragmento QRL marcado con rodamina-B (RhB) ± LPS mostrado por círculos rellenos). La FIG. 1B muestra la densidad óptica (DO) de gelsolina en disoluciones que contienen cantidades variables de LPS (círculos abiertos) o LPA (triángulos abiertos) o PS (triángulos rellenos). La FIG. 1C muestra cambios fluorescentes de rodamina-B del péptido PBP10 en presencia de diferentes lípidos o controles (PS, círculos abiertos; PIP2, cuadrados cerrados; LPS, círculos abiertos; LPS PIP2, círculos cerrados; LPA, triángulos abiertos). La FIG. 1D muestra los espectros de emisión de fluorescencia de pireno-SEQ ID NO: 1 (círculos abiertos) en presencia de LPS de E.coli (péptido LPS; triángulos abiertos), PIP2 (péptido PIP2; triángulos invertidos rellenos) y LPA (péptido LPA; triángulos rellenos). Los datos mostrados en las FIG 1A, 1B y 1C son medias ± DE de 2-4 experimentos; los datos de la FIG. 1D son representativos de tres experimentos independientes.

La FIG. 2 muestra gráficamente un gráfico de dispersión de neutrones de la estructura molecular de LPS gelsolina SEQ ID NO: 1.

Las FIG. 3A y 3B muestran gráficamente que la gelsolina compite con e inhibe la unión de proteína de unión a LPS, LBP, de la unión a LPS. La FIG. 3A muestra que 125I-LBP no se une a pocillos recubiertos de LPS que se habían incubado previamente con gelsolina; sino que la gelsolina no interacciona directamente con LBP (FIG. 3B). Los datos mostrados son media ± DE de 4 experimentos.

Las FIG. 4A y 4B muestran gráficamente el efecto de LPA (cuadrados), PIP2 (círculos) y LPS de E. coli (triángulos) sobre la actividad de corte del filamento de actina de la gelsolina humana recombinante (GLShr) (FIG. 4A), o plasma sanguíneo humano (FIG. 4B). Se determinó la actividad de corte a partir de la tasa de disminución de fluorescencia durante la despolimerización después de la adición de GLShr o plasma sanguíneo a una disolución de F-actina polimerizada con 50 % de G-actina marcada con pireno. Los datos mostrados son media ± DE de 4 a 6 experimentos.

Las FIG. 5A-5N representan fotográficamente que la interrupción inducida por LPS de respuestas celulares se inhibe preincubando LPS con gelsolina plasmática. Se usó la inmunotinción para F-actina con faloidina (FIG. 5A-5F) para demostrar la prevención por gelsolina plasmática del desensamblaje del citoesqueleto de actina inducido por LPS. Se trataron células endoteliales (FIG. 5A-5C) y astrocitos (FIG. 5D-5F) con LPS (FIG. 5B y 5E), o con una combinación de LPS y gelsolina (FIG. 5C y 5F). También se muestran células de control en las FIG. 5A y 5D. Se bloqueó la translocación de NF-kB inducida por LPS al núcleo por gelsolina plasmática en las FIG. 5G-4N), como se muestra por inmunotinción para NF-KB con un anticuerpo anti-NF-KB (FIG. 5G-5J) y núcleos celulares con diclorhidrato de 4',6-diamidino-4-fenilindol (FIG. 5L-5M). En astrocitos, la adición de TNF-a (FIG. 5H y 5L), o LPS 4 pM (FIG. 5I y 5M) causó la translocación de NF-kB al núcleo, en comparación con las células de control (FIG. 5G y 5K). La preincubación con gelsolina, sin embargo, bloqueó la translocación inducida por LPS (FIG. 5J y 5N).

La FIG. 6 representa gráficamente el efecto protector de gelsolina SEQ ID NO: 1 sobre la alteración mediada por LPS de la función plaquetaria, es decir, la agregación de plaquetas después de la estimulación por colágeno, el efecto de la inhibición de LPS y la inversión de la inhibición por gelsolina. Colágeno ± péptido 25 pM (cuadrados abiertos); LPS péptido 25 pM colágeno (diamantes abiertos); LPS péptido 12 pM colágeno (círculos abiertos); LPS colágeno (triángulos abiertos); péptido 25 pM (línea inferior de los círculos abiertos).

La FIG. 7 representa gráficamente ratones endotoxémicos rescatados por gelsolina plasmática exógena. Los ratones que recibieron una dosis letal de LPS i.p. se trataron con gelsolina (GSN) (cuadrado relleno), albúmina (BSA) (círculos abiertos) o solución salina (triángulos abiertos). Como se muestra, todos los ratones que recibieron solución salina o BSA murieron en el plazo de 6 días desde el tratamiento con LPS; todos los ratones que recibieron tratamiento con GSN sobrevivieron y parecieron sanos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE CIERTAS REALIZACIONES DE LA INVENCIÓN

La presente divulgación proporciona métodos para usar eficazmente gelsolina plasmática, o fragmentos activos, homólogos o análogos de la misma, para tratar, neutralizar, prevenir o controlar de otro modo el choque séptico en un paciente, resultante de endotoxinas, activado por la liberación de moléculas de lipopolisacárido (LPS) de bacterias Gram-negativas infecciosas. Como resultado, se proporcionan métodos para contrarrestar o prevenir la septicemia, la inflamación intensa u otras afecciones, tales como disfunción microvascular pulmonar inducida por inflamación, asociada a una notable disminución en los niveles de gelsolina plasmática en el paciente modulando LPS. La evidencia in vitro e in vivo, que incluye ensayos de unión en fase sólida, fluorescencia, mediciones de absorbancia y ensayos funcionales de efectos despolimerizantes de la actina, demuestran una clara interacción entre LPS y gelsolina, y muestran que la gelsolina se une más fuertemente a LPS que a sus otros ligandos peptídicos conocidos, por ejemplo, fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2) y ácido lisofosfatídico (LPA).

La unión fuerte y selectiva de la gelsolina a LPS tiene varias implicaciones para la función de la gelsolina plasmática, y la invención, por tanto, ofrece métodos para contrarrestar los efectos tóxicos de LPS. A pesar de una fuerte correlación clínica entre niveles de gelsolina notablemente reducidos y la susceptibilidad a choque inflamatorio, hasta la presente invención no ha existido demostración o explicación de una utilidad terapéutica de la interacción entre la gelsolina plasmática humana y el LPS bacteriano que inactive tanto la función depuradora de la actina de gelsolina como el efecto citotóxico de LPS. Los presentes resultados indican que el LPS, además de LPA y actina, puede ser el agente perjudicial responsable de las patologías tras el traumatismo, quemaduras o infección por bacterias Gramnegativas que conduce a la reducción de gelsolina.

La estructura molecular del LPS es heterogénea, incluso de una única bacteria, y frecuentemente es ampliamente variable entre diferentes bacterias. Sigue sin resolverse por qué algunas formas de LPS son más tóxicas que otras, pero como se demuestra en los ejemplos que siguen, no solo es importante la estructura covalente del compuesto, sino que parece que la forma de agregado de LPS es un determinante igual de relevante de la toxicidad. La fuerte unión de la gelsolina a LPS, así como a LPA y PIP2, apunta hacia la importancia del empaquetamiento de agregados en tanto la función bioquímica como biológica de las interacciones proteína-lípido. LPS, LPA y PIP2 son similares, pero no idénticos. Sin embargo, son, en realidad, suficientemente diferentes tal que las interacciones de de unión entre la cerradura y la llave altamente específicas no puedan explicar estos efectos.

Uno de los mecanismos propuestos de desactivación de LPS en sangre es la incorporación mediada por LBP de moléculas de LPS en lipoproteínas de la sangre (Yu et al., J. Clin. Invest. 99:315-324 (1997)). Un estudio cinético previo sugiere que la proteína de unión a LPS (LBP), un vehículo de alta afinidad por LPS, es uno de los primeros componentes del plasma en interaccionar con el lípido A (Tobias et al., Infect. And Immun. 50:73-76 (1985)), influyendo así en las interacciones de LPS con lipoproteína y dianas celulares y sirviendo de fase reactante aguda. Aumenta durante el traumatismo o la infección, que da como resultado la elevada capacidad de opsonización del plasma (Tobias et al., J Exp. Med. 164:777-793 (1986); Mathison et al., J. Immunol. 149:200-206 (1992)). Por tanto, los presentes resultados son significativos, que muestra que la gelsolina compite con LBP, alterando más la aparición de la septicemia. Por consiguiente, la presente divulgación proporciona métodos de complejación de LPS circulantes por proteínas o lípidos de unión a LPS, previniendo así la formación de las estructuras tóxicas.

Volviendo a las figuras, que se describirán en mayor detalle en los ejemplos que siguen, en un ensayo de unión en fase sólida, 3H-LPS se unió en un modo saturable a superficies que se recubrieron con el péptido de unión a PIP2 de SEQ ID NO: 1 (QRLFQVKGRR; también denominada en el presente documento "PBP10"), pero no a superficies recubiertas con un péptido truncado, QRL, que no se une a PIP2. La adición de un exceso sustancial (5 veces) de LPS no marcado redujo esa unión a PBP10 en aproximadamente 50 %, pero no tuvo efecto sobre la pequeña cantidad de unión no específica a la superficie tratada con péptido de control. Véase la FIG. 1A. El hallazgo de que un pequeño fragmento activo de péptido de gelsolina, tal como PBP10, fue tan eficaz como la gelsolina completa para la unión de estos lípidos mientras que, por ejemplo, solo la proteína correctamente plegada se puede unir a actina, apunta hacia una unión general desvelada de LPS mediante su dominio de unión a lípido. En ciertas condiciones, un fragmento peptídico funcionalmente equivalente se puede unir mejor a LPS que la gelsolina intacta, quizás en ámbitos donde las limitaciones estéricas previenen que la proteína completa encuentre el sitio de unión en LPS, mientras que permite que sí lo haga el péptido más pequeño.

Cuando el término "gelsolina" se usa en el presente documento, es para significar en el presente documento gelsolina completa o intacta o una forma de secuencia abreviada biológicamente activa de la gelsolina, y sus análogos biológicamente activos (que incluyen muteínas) que tienen secuencias sustituidas, delecionadas, alargadas, sustituidas o de otro modo modificadas que poseen bioactividad de unión a LPS que es sustancialmente similar a la de la gelsolina nativa, así como secuencias de aminoácidos biológicamente activas sustancialmente similares a la gelsolina. Como se usa en el presente documento, "análogos de péptidos equivalentes biológicamente activos" se refiere a "fragmentos de péptido funcionalmente equivalentes", que incluyen homólogos de gelsolina, preferentemente SEQ ID NO:1, que contienen sustituciones de aminoácidos conservativas, a condición de que los análogos de péptido que contienen las sustituciones conservativas se unan a una PPI (fosfoinositida) que regula la función de unión de la actina intracelular de gelsolina, y tienen actividad que media en el transporte, como se determina, por ejemplo, en un ensayo de cribado in vitro. Como se usa en el presente documento, "sustitución de aminoácidos conservativa" se refiere a una sustitución de aminoácidos, que no altera las características de carga relativa o tamaño del péptido en el que se hace la sustitución de aminoácidos. Además, como se usa en el presente documento, el término "gelsolina" pretende incluir gelsolina aislada que existe de forma natural o recombinante o sintéticamente producida o fragmentos funcionalmente equivalentes de péptido de la misma. Todos están incluidos dentro de la presente invención.

La unión de LPS a gelsolina intacta fue evidente por un cambio en la absorbancia de UV (FIG. 1B) de al menos 10 %, más preferentemente 20 %, más preferentemente 30 %, con una disminución máxima observada de ~35 %, aunque podría ser mayor. Dicha disminución en la fluorescencia de tirosina y triptófano, debida a la reducida absorbancia, se ha documentado como un ensayo de la unión de PIP2 a gelsolina (Lind et al., 1997, arriba). LPA también redujo la ^{absorbancia de gelsolina, pero} Ps ^{no tuvo efecto. Además, la unión de PPI y LPA a gelsolina inhibió fuertemente la} función de corte del filamento de actina de la gelsolina.

La fluorescencia de SEQ ID NO: 1 marcada con rodamina-B (QRLFQVKGRR) también cambia por LPS, como se muestra en la FIG. 1C. LPS y PIP2, pero no la fosfatidilserina (PS), indujeron una idéntica extinción de la fluorescencia dependiente de la concentración de PBP10. LPS y PIP2 también causaron cambios congruentes en el espectro fluorescente de SEQ ID NO: 1 derivada de pireno (QRLFQVKGRR), en el que la unión a estos lípidos, pero no a PS, induce la agrupación del péptido con fluorescencia de excímero resultante del grupo pireno. Esto se puso de manifiesto como un gran aumento en la emisión de fluorescencia a 480 nm (datos no mostrados).

Después de una disminución inicial en la fluorescencia a bajas relaciones entre LPS y péptido, la fluorescencia del péptido aumenta fuertemente, que sugiere además la inserción de la rodamina-B unida al péptido en un entorno más hidrófobo. El lípido A (el derivado de LPS que carece de polisacárido) provoca inhibición más débil, pero detectable; aunque los lípidos aniónicos, como PS, no tienen efecto inhibidor (datos no mostrados). Así, LPS es un inhibidor más potente que cualquiera de LPA o PIP2, aún ciertas similitudes estructurales entre PIP2, LPA y LPS sugieren que LPS se une a gelsolina en el mismo sitio que PIP2 y LPA. Cuando se prueban, los mismos tipos de ensayos que han documentado la unión de PPI y LPA a gelsolina, todos muestran que la gelsolina se une a LPS al menos tan fuertemente, y en algunos contextos con mayor afinidad, que se une a PIP2, y el sitio de unión está situado, en realidad, aparentemente en la misma región en donde la gelsolina se une a PIP2 y LPA.

La FIG. 1D confirma los estudios de rodamina, usando un péptido de gelsolina derivatizado con pireno, aunque se necesitan cantidades más grandes, en comparación con la actividad de la gelsolina pura en disolución acuosa. La unión a LPS indujo el agrupamiento del péptido con una fluorescencia de excímero resultante del grupo pireno, que fue evidente como un gran aumento en la emisión de fluorescencia a 480 nm. LPS, LPA y PIP2 tuvieron capacidades similares para inducir la formación de excímeros, mientras que PS no tuvo efecto (datos no mostrados).

La estructura molecular de LPS y sus complejos con proteínas, tales como la gelsolina, se puede definir más representando la intensidad de dispersión de neutrones. Por ejemplo, la intensidad de dispersión de neutrones de LPS SEQ ID NO: 1 (restos de péptido de gelsolina 160-169) se muestra en la FIG. 2. La linealidad del gráfico sugiere que LPS forma una estructura cilíndrica, pero que la adición de gelsolina altera el diámetro de LPS, confirmando que los datos de dispersión de neutrones permite el análisis estructural de la capacidad de unión de LPS.

La consecuencia de la unión de LPS sobre la capacidad de corte de la actina de la gelsolina se muestra en la FIG. 3. Cuando se añade a gelsolina humana purificada, LPS inhibió el 50 % de la actividad de corte de la gelsolina y es un inhibidor más potente de cualquier LPA (ácido lisofosfatídico, que es un potente agonista extracelular) o PIP2. El lípido A, el derivado de LPS que carece de polisacárido, tiene un efecto inhibidor más débil, pero significativo, y lípidos aniónicos no específicos como PS no tienen efecto. Cuando se añaden a suero humano completo, LPS y PIP2 también son capaces de inhibir la actividad de la gelsolina, aunque se necesitan cantidades más grandes en comparación con la inhibición de la gelsolina pura en disolución acuosa. LPA parece ser mucho menos eficaz en suero que en disolución pura, posiblemente debido a que la mayor labilidad del lisolípido permite su reparto más rápido en partículas de lipoproteína o agregados mediados por Ca2+ que son incapaces de unirse a gelsolina. La gelsolina compite con LBP (proteína de unión a LPS) por el LPS. Usando un ensayo de unión en fase sólida, se mostro que concentraciones nanomolares de gelsolina inhibían la unión de 125I-LBP a pocillos recubiertos de LPS por 69 ± 6 % (FIG. 3A). Sin embargo, la inhibición de la unión de LBP-LPS no es debida a dirigir la unión de LBP a gelsolina puesto que 125I-LBP no se une a superficies recubiertas de gelsolina (FIG. 3B). Puesto que el plasma contiene niveles más altos de gelsolina (150-300 pg/mL) de lo que se encuentra en LBP (3-10 pg/mL) {Lind et al., 1988, arriba; Mathison, 1992, arriba}, estos datos, que muestran afinidad de LPS comparable por gelsolina y por LBP, indican que la gelsolina puede desempeñar una función en el amortiguamiento o la presentación de LPS.

Un resultado de la unión gelsolina-LPS es la inhibición de la actividad de unión a actina de la gelsolina, así como la actividad despolimerizante de la actina del suero sanguíneo. Se mostró que la inhibición por LPS de la actividad despolimerizante de la actina en suero era debida a su efecto sobre la gelsolina, debido a la actividad secuestrante de la actina de globulina Gc (o proteína de unión a vitamina D), que es el otro componente del sistema secuestrante de actina plasmática, no se afectó por LPS a concentraciones de al menos hasta 100 pM (datos no mostrados). Un exceso molar de 10 veces de LPS de E. coli (serotipo 026:B6), Salmonella enteritidis (cepa ATCC13076) o Pseudomonas aeruginosa (serotipo 10) (datos no mostrados) inhibió eficazmente el ~50 % de la capacidad de corte del filamento de actina de la gelsolina. Cuando se añade a gelsolina humana purificada, el LPS inhibe la actividad de corte de la gelsolina a una tasa que aumenta al aumentar la concentración de LPS presente (FIG. 4A). Cuando se añade a suero humano completo, LPS y PIP2 también fueron capaces de inhibir la actividad de la gelsolina, aunque se necesitaron cantidades más grandes en comparación con la actividad de la gelsolina pura en disolución acuosa (FIG. 4B).

La medición de los efectos sobre la función de corte del suero sanguíneo mostro que la eficiencia inhibidora variaba con la especie bacteriana de la que se liberó el LPS. Por ejemplo, cuando se probaron varias especies de LPS diferentes, se encontró que el efecto inhibidor era Klebsiella pneumoniae (cepa ATCC 15380, Sigma) <Salmonella enteritidis (cepa ATCC 13076, Sigma) <Escherichia coli (datos no mostrados). En una base molar, el LPS ha demostrado ser un inhibidor más potente de la capacidad de corte de actina de la gelsolina que cualquiera de LPA o PIP2. El lípido A tuvo un efecto inhibidor más débil, pero aún significativo, y lípidos aniónicos no específicos como PS no tuvieron efecto (datos no mostrados).

Por tanto, se puede deducir, además, por tanto, evidencia química como física, que la gelsolina se une a LPS mediante su dominio de unión a lípido, y que la unión de polifosfoinositidas y LPA a gelsolina inhibe fuertemente la función de corte del filamento de actina de la gelsolina. Las mediciones de dispersión de neutrones sugieren que LPS añadido a tampones in vitro forma micelas, y su interacción con gelsolina y otras proteínas puede ser diferente cuando está en otras formas complejas. Pareció que LPA carecía de su efecto en suero, en comparación con la disolución pura, posiblemente debido a que la mayor labilidad del lisolípido permite su reparto más rápido en partículas de lipoproteína o agregados mediados por Ca2+ que son incapaces de unirse a la gelsolina.

La gelsolina puede prevenir los efectos celulares inducidos por LPS in vitro. Los efectos de LPS sobre las funciones celulares, que incluyen la remodelación de actina citoesquelética y la activación de plaquetas inducida por colágeno por vías independientes de receptores de tipo toll (TLR), se neutralizan por la gelsolina y por un péptido basado en los restos de gelsolina 160-169 (SEQ ID NO: 1) que comprende parte del sitio de unión a fosfoinositida de la gelsolina. Cuando se añade a cualquier célula endotelial aórtica humana (HAEC) cultivada o astrocitos primarios de rata, el LPS a concentraciones relativamente altas indujo rápidamente el desensamblaje del citoesqueleto de actina (véase la tinción con faloidina interrumpida y difusa en las FIG. 5B y 5E). Por comparación, sin embargo, se observan abundantes haces de actina en los controles (FIG. 5A y 5D). Sin embargo, cuando el LPS se incubó por primera vez con un exceso de gelsolina plasmática, el LPS así unido no tuvo efecto perceptible sobre los citoesqueletos de actina de ninguna de las células endoteliales o los astrocitos.

Parece que la translocación de NF-kB dependiente de TLR en fibroblastos no se bloquea por la gelsolina (véase el Ejemplo 3), mientras que los efectos de LPS sobre las funciones celulares, que incluyen la remodelación de la actina citoesquelética por vías independientes de los receptores de tipo toll (TLR), se neutralizan por gelsolina y por un péptido basado en gelsolina SEQ ID NO: 1. En astrocitos de control no tratados, NF-kB se localizó en el citoplasma (Figura 5G K) y la activación por LPS produjo su translocación al nucleoplasma (FIG. 5I y 5M) similar a la inducida por TNF-a (FIG. 5H y 5L). Sin embargo, la translocación inducida por LPS de NF-kB (FIG. 5I y 5M) se bloqueó por la pre-incubación con gelsolina (FIG. 5J y 4N). Estos resultados muestran un fuerte efecto de LPS sobre la función de la gelsolina plasmática y, lo que es más importante, indica que al menos algunos efectos de la endotoxina in vivo son mediados o inhibidos por la gelsolina plasmática.

La disfunción generalizada de la coagulación representa una complicación común del síndrome de choque séptico inducido por LPS. El efecto de LPS sobre la función de las plaquetas ha dependido supuestamente de la concentración de LPS usada para afectar la función plaquetaria. Se ha encontrado que LPS a baja concentración causó la sensibilización de la activación plaquetaria (Salat et al., Leuk. Lymphoma 33(1-2):25-32 (1999)), pero LPS a 100-300 pg/mL inhibe la agregación de plaquetas estimulada por colágeno (Sheu et al., Br. J. Haematol. 103(1):29-38 (1998)). Sin embargo, este efecto de LPS sobre la activación de plaquetas inducida por colágeno por vías independientes de receptores de tipo toll se neutraliza por gelsolina. Por ejemplo, cuando se añadió LPS solo, el LPS inhibió fuertemente la agregación y la secreción de plaquetas inducida por colágeno (compárense los triángulos con los símbolos de cuadrados en la FIG. 6). Por comparación, la adición de gelsolina SEQ ID NO: 1 a LPS antes de añadirse a las plaquetas restauró, en un modo dependiente de la concentración de péptidos, la activación inducida por colágeno normal y la agregación de las plaquetas. Sin embargo, el péptido de gelsolina (SEQ ID NO: 1) solo, a diferencia de con LPS, no tuvo efecto sobre las funciones plaquetarias mediadas por colágeno.

Por tanto, la FIG. 6 muestra el efecto protector del péptido de gelsolina SEQ ID NO: 1 (QRLFQVKGRR) (GLS 160­ 169) sobre la alteración mediada por LPS de la función plaquetaria. Estos resultados muestran un fuerte efecto de LPS sobre la función plasmática de gelsolina e indican que algunos de los efectos patógenos de la endotoxina in vivo pueden estar mediados, inhibidos o incluso prevenidos por la gelsolina plasmática, o un fragmento activo de la misma.

Puesto que los seres humanos con septicemia tienen concentraciones reducidas de gelsolina plasmática (Suhler et al., 1997, arriba), el efecto de la administración de LPS sobre los niveles de gelsolina se puede estudiar en modelos de ratón reconocidos. La administración intraperitoneal de LPS de P. aeruginosa (serotipo 10) causó una reducción dependiente de la dosis en los niveles de gelsolina plasmática después de 24 horas. Los cambios en las concentraciones de gelsolina en respuesta a LPS parecen ser específicos, debido a que los niveles de albúmina plasmática no cambiaron. La modesta reducción en el nivel de gelsolina plasmática estuvo de acuerdo con la mortalidad relativamente baja (35 % en 7 días después de tratamiento) de ratones que recibieron 40 mg/kg de LPS de P. aeruginosa. A diferencia, los ratones expuestos a LPS de E. coli (serotipo 055:B5) a 25 mg/kg disminuyeron sus valores de gelsolina plasmática un 50 % en 24 horas después de la exposición, y tuvieron un 100 % de tasa de mortalidad en 7 días (datos no mostrados).

Los ratones se administraron con gelsolina (GSN) plasmática recombinante humana por vía subcutánea, inmediatamente después de la exposición a LPS de E. coli, y diariamente a partir de aquí durante tres dosis adicionales. Entonces se comparó la tasa de mortalidad con los tratados con solución salina sola, o con albúmina de suero bovino (BSA). Las cantidades de gelsolina administradas por esta vía restauraron los niveles en plasma en animales tratados con LPS hasta 200 pg/mL, que es ligeramente superior a las concentraciones basales (datos no mostrados). Sin embargo, los ratones tratados con gelsolina plasmática han mejorado notablemente la supervivencia en comparación con los controles de solución salina o BSA (FIG. 7). En el día 7, pareció que todos los ratones supervivientes (todos en el grupo de GSN) se habían recuperado completamente y no presentaban signos de molestia.

La unión fuerte y selectiva de la gelsolina a LPS tiene varias implicaciones para la función de la gelsolina plasmática y puede sugerir métodos para contrarrestar los efectos tóxicos de LPS. La amplia distribución de una proteína gelsolina extracelular en especies eucariotas, que incluye a los seres humanos, y su unión a una variedad de endotoxinas de lipopolisacárido, sugiere que es un componente del sistema inmunitario innato (Beutler et al., Crit. Care Med. 29 (suplemento) S2-S7 (2001)). Los hallazgos presentados en la presente divulgación respaldan el concepto de que una fuerte correlación clínica entre los niveles reducidos de gelsolina debidos a la lesión primaria y la susceptibilidad a complicaciones secundarias puede resultar de una pérdida de amortiguación de los mediadores inflamatorios de lípidos. La ausencia de anticuerpos humanos informados dirigidos contra gelsolina indica que este constituyente normal del plasma tiene un alto grado de conservación estructural entre individuos. Por tanto, es una realización preferida de la presente invención proporcionar gelsolina o un fragmento funcionalmente equivalente de la misma, para su uso como un medicamento en un método de prevención, neutralización o reducción de endotoxemia o choque séptico inducido por endotoxinas en un paciente in vivo, en donde el paciente se somete o es susceptible a infección por bacterias Gram-negativas.

Se pueden generar construcciones transgénicas que comprenden un ácido nucleico aislado que comprende la secuencia nucleica o de aminoácidos de gelsolina o un fragmento activo de la misma. Vectores adecuados incluyen, pero no se limitan a, plásmidos que contienen una cadena codificante o no codificante puesta bajo el control del promotor constitutivo fuerte o bajo el control de un promotor inducible. Los métodos para la generación de dichas construcciones se conocen bien en la técnica una vez se conoce la secuencia del gen deseado. Un vector adecuado y combinaciones génicas serán rápidamente evidentes para los expertos en la técnica.

Un "vector" es una composición de materia que comprende un ácido nucleico aislado y que se puede usar para administrar el ácido nucleico aislado al interior de una célula. Se conocen en la técnica numerosos vectores que incluyen, pero no se limitan a, polinucleótidos lineales, polinucleótidos asociados a compuestos iónicos o anfifílicos, plásmidos y virus. Así, el término "vector" incluye un plásmido que se replica autónomamente o un virus. También se debe interpretar que el término incluye compuestos no plasmídicos y no virales, que facilitan la transferencia de ácido nucleico en células, tales como, por ejemplo, compuestos de polilisina, liposomas y similares. "Vector de expresión" se refiere a un vector que comprende un polinucleótido recombinante que comprende secuencias de control de la expresión operativamente unidas a una secuencia de nucleótidos a expresar. Un vector de expresión comprende elementos que actúan en cis suficientes para la expresión; otros elementos para la expresión se pueden suministrar por la célula hospedadora o en un sistema de expresión in vitro. Los vectores de expresión incluyen todos los conocidos en la técnica, tales como cósmidos, plásmidos (por ejemplo, desnudos o contenidos en liposomas) y virus que incorporan el polinucleótido recombinante.

Se puede duplicar el ácido nucleico que codifica el péptido de gelsolina usando un sistema de hospedador-vector y técnicas de clonación tradicionales con vectores de replicación apropiados. Un "sistema de hospedador-vector" se refiere a células hospedadoras, que se han transfectado con vectores apropiados usando técnicas de ADN recombinante. Los vectores y los métodos desvelados en el presente documento son adecuados para su uso en células hospedadoras en una amplia variedad de organismos eucariotas. La presente divulgación también engloba células transformadas con los vectores de replicación y de expresión, usando métodos conocidos en la técnica. De hecho, un gen que codifica el ácido nucleico modulador, tal como la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la gelsolina, se puede duplicar en muchos vectores de replicación, y aislar usando métodos descritos, por ejemplo, en Sambrook et al., 1989.

El gen seleccionado, preparado y aislado usando los métodos anteriores se puede insertar directamente en un vector de expresión, tal como pcDNA3 (Invitrogen), e insertar en una célula animal o de mamífero adecuada. El gen o fragmento de gen, tal como la molécula de ácido nucleico purificada que codifica, por ejemplo, gelsolina, se puede introducir y expresar en la célula. Está disponible una variedad de diferentes enfoques de transferencia génica para suministrar el gen o fragmento génico que codifica el ácido nucleico modulador en una célula diana, células o tejidos.

Como se usa en el presente documento, "recombinante" pretende significar que una secuencia de ADN particular es el producto de diversas etapas de combinación de clonación, restricción y ligación que dan como resultado una construcción que tiene una secuencia sintética que es indistinguible de secuencias homólogas encontradas en sistemas naturales. Las secuencias recombinantes se pueden ensamblar a partir de fragmentos clonados y conectores de oligonucleótidos cortos, o a partir de una serie de oligonucleótidos. Como se observa anteriormente, un medio para introducir el ácido nucleico en la célula de interés es el uso de un vector de expresión recombinante. "Vector de expresión recombinante" pretende incluir vectores, capaces de expresar secuencias de ADN contenidas en su interior, donde dichas secuencias están operativamente unidas a otras secuencias capaces de efectuar su expresión. Implica, aunque no siempre se establece explícitamente, que estos vectores de expresión deben ser replicables en los organismos hospedadores, ya sea como episomas o como una parte integral del ADN cromosómico. Los vectores de expresión adecuados incluyen vectores virales, por ejemplo, adenovirus, virus adeno-asociados, retrovirus, cósmidos y otros, normalmente en una forma atenuada o no replicativa. Los vectores adenovirales son un medio particularmente eficaz para introducir genes en tejidos in vivo debido a su alto nivel de expresión y eficiente transformación de células, tanto in vitro como in vivo.

Por consiguiente, cuando se hace referencia en el presente documento a "administrar" gelsolina o un fragmento peptídico funcionalmente equivalente de la misma a un paciente, se pretende que dichos métodos incluyan no solo la administración de una composición exógena al paciente, sino también métodos de aumento de los niveles de expresión de la gelsolina dentro del paciente. Los niveles de expresión del gen o la secuencia de nucleótidos dentro de una célula diana son capaces de proporcionar la expresión génica durante la duración y en una cantidad de forma que el producto de nucleótido en su cantidad sea capaz de proporcionar una cantidad terapéuticamente eficaz de producto génico o en dicha cantidad como para proporcionar un efecto biológico funcional en la célula diana. Por "administración génica" se indica el transporte de una composición o formulación en contacto con una célula diana de manera que la composición o formulación sea capaz de ser captada por medio de un proceso citótico en el lado interior o citoplásmico de la membrana celular más externa de la célula diana, donde posteriormente se transportará dentro del núcleo de la célula en dicha condición funcional que es capaz de lograr la expresión génica.

Por "expresión génica" se indica el proceso, después de la administración en una célula diana, por el que una secuencia de nucleótidos experimenta transcripción y traducción satisfactoria de forma que niveles detectables de la secuencia de nucleótidos suministrada se expresen en una cantidad y durante un periodo de tiempo tal que se logre un efecto biológico funcional. "Terapia génica" engloba los términos administración génica y expresión génica. Además, el tratamiento por cualquier enfoque de terapia génica se puede combinar con otras terapias más tradicionales.

Por "paciente" o "sujeto" se indica cualquier vertebrado o animal, preferentemente un mamífero, lo más preferentemente un humano, que está afectado por o es susceptible a septicemia inducida por endotoxinas o disfunción microvascular pulmonar inducida por inflamación. Así, dentro de la presente invención se incluyen pacientes o sujetos animales, aviares, reptiles o veterinarios, cuyo significado previsto es obvio. La presente divulgación puede ser útil en dicho paciente para el tratamiento o la prevención de lo siguiente, sin limitación: choque séptico, patogénesis relacionada con quemadura intensa, infarto de miocardio, fallo hepático agudo, mionecrosis, lesión pulmonar aguda y síndrome de dificultad respiratoria aguda - de disfunción multiorgánica (SDRA/SDMO).

La gelsolina o el fragmento activo de la gelsolina (SEQ ID NO: 1) se puede diseñar por miméticos para la producción sintética. El diseño de miméticos para un compuesto farmacéuticamente activo es un enfoque conocido para el desarrollo de productos farmacéuticos basado en un compuesto "cabeza de serie". Esto podría ser conveniente donde el compuesto activo sea difícil o caro de sintetizar o donde sea inadecuado para un método de administración particular. El diseño, la síntesis y la prueba de miméticos se usan, en general, para evitar el cribado aleatorio de un gran número de moléculas para una propiedad diana, véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. N° 5.071.773; 5.750.353; 5.925.529; 5.744.303; 5.569.588; y 5.407.821.

La divulgación proporciona además un ensayo para determinar agentes, que se unen a, neutralizan o inhiben lipopolisacáridos, proteínas de unión a LPS u otros factores en una secuencia de acontecimientos que conduce a la aparición de septicemia endotoxémica o disfunción microvascular pulmonar inducida por inflamación, reduciéndose, modulando o previniéndose así dichas patologías. Dicho ensayo comprende administrar un agente en ensayo a las células o modelos animales, tales como los descritos en el presente documento a baja densidad celular, y monitorizar la aparición o la intensidad de la septicemia o disfunción microvascular. Un ensayo adicional según la divulgación comprende administrar el agente en ensayo a células fotorreceptoras a alta densidad celular, y monitorizar la aparición o la intensidad de la septicemia o disfunción microvascular. Así, se pueden seleccionar agentes que reducen, inhiben, neutralizan o previenen eficazmente la septicemia, disfunción microvascular, SDRA o similares. Los agentes así seleccionados también pretenden ser una parte de la presente divulgación.

En otro aspecto más de la divulgación, la sensibilidad de los niveles de gelsolina in vivo se usa como un biomarcador para medir la intensidad de la enfermedad en septicemia o inflamación, o para determinar niveles de endotoxinas bacterianas.

Según la presente divulgación, la gelsolina, o fragmento de la misma, prevista para unirse a, neutralizar o inhibir los lipopolisacáridos, proteínas de unión a LPS, proteínas de unión a actina u otros factores en una secuencia de acontecimientos que conduce a la aparición de septicemia endotoxémica, reduciendo, modulando o previniendo así dicha septicemia o respuesta inflamatoria, como se ha descrito anteriormente, cuando se usa en terapia, por ejemplo en el tratamiento de un paciente endotoxémico o uno infectado con una bacteria Gram-negativa, se puede administrar a dicho paciente bien sola o como parte de una composición farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente con un conservante, diluyente y similares. Se pueden administrar además en forma de una composición en combinación con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, y que puede comprender además sales farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos de dichos vehículos incluyen tanto vehículos líquidos como sólidos, tales como agua o solución salina, diversas disoluciones de tampón, ciclodextrinas y otros vehículos o complejos protectores, glicerol y formulaciones de profármaco. Las combinaciones pueden incluir otros agentes farmacéuticos.

El término "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a sales fisiológicamente y farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la invención: es decir, sales que retienen la actividad biológica deseada del compuesto parental y no confieren efectos toxicológicos no deseados a las mismas.

Se pueden usar diversos métodos de "administración" del agente terapéutico o preventivo, siguiendo las formulaciones y procedimientos conocidos. Aunque la administración parental se describe en el presente documento y, en general, se prefiere, también se puede emplear administración sistémica o dirigida en circunstancias adecuadas. Los compuestos o las composiciones adecuadas para inyección parenteral pueden comprender disoluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas estériles fisiológicamente aceptables, y polvos estériles para reconstitución en disoluciones o dispersiones inyectables estériles. Los ejemplos de excipientes, diluyentes, disolventes o vehículos acuosos y no acuosos adecuados incluyen agua, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, etanol, glicerol, polioles y similares, y mezclas adecuadas de los mismos. Se puede mantener la fluidez apropiada, por ejemplo, usando un recubrimiento, tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de dispersiones y usando tensioactivos. Estas composiciones también pueden contener adyuvantes, tales como conservantes, humectantes, emulsionantes y dispersantes. La esterilidad se puede garantizar mediante la adición de diversos antibacterianos y antifúngicos. También se puede desear incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, cloruro sódico y similares. La absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable se puede provocar usando agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Los expertos pueden determinar fácilmente dosis óptimas, metodologías de administración y tasas de repetición. Las tasas de repetición para la administración se pueden estimar fácilmente basándose en los tiempos de residencia medidos y las concentraciones del fármaco en líquidos o tejidos corporales. Las cantidades y las pautas de tratamiento para la administración de gelsolina o compuestos de unión a actina relacionados se pueden determinar fácilmente por los expertos en el arte clínico para tratar trastornos relacionados con actina, lesión tisular e inflamación. En general, la administración de la gelsolina o el tratamiento con compuestos relacionados con actina variará dependiendo de consideraciones tales como: edad; salud; afecciones que están tratándose; tipo de tratamiento simultáneo, si lo hay, frecuencia de tratamiento y la naturaleza del efecto deseado; grado del daño tisular; sexo; duración de los síntomas; y contraindicaciones, si las hay, y otras variables a ajustar por el médico individual. La dosis se puede administrar en una o más aplicaciones para obtener los resultados deseados (véanse, por ejemplo, las dosis propuestas para terapia humana por Rothenbach et al., 2004, arriba).

La dosis se puede calcular del siguiente modo. Si la concentración de gelsolina en sangre normal es 2,4 pM (2,4 pmol/L), y la concentración de DBP en sangre normal es 5 pM (5 pmol/L). Así, la capacidad de unión a actina (CUA) en sangre total es aproximadamente 7,5 pmol/L. El volumen de sangre es 6 % del peso corporal, por tanto, una persona de 70 kg tiene aproximadamente 4,2 litros de sangre y como resultado, 4,2 1 x 7,5 pmol/L = 31,5 pmoles de CUA. Puesto que la gelsolina se distribuye en todo el espacio extracelular (que es ~10 % de peso corporal), el cuerpo contiene 7,5 x 7 = 52,5 pmoles de CUA de gelsolina.

Se puede desear administrar entre 32 y 53 pmoles de gelsolina (o 0,46 pmol/kg de peso corporal) para cubrir la complejación total o la reducción de gelsolina endógena u otros compuestos de unión a actina. La concentración plasmática de gelsolina endógena en seres humanos normales no lesionados es 211 pg/mL, y en conejos 368 pg/mL (Lind et al., 1986, arriba). Puesto que 0,425 mg de actina es igual a 1 pmol, y puesto que existen 4,86 mg de actina por gramo de músculo esquelético, cada gramo de músculo contiene aproximadamente 11,3 pmoles de actina. Así, 4,6 g de destrucción muscular podrían neutralizar la gelsolina corporal total u otros compuestos de unión a actina. Sin embargo, debido a que los efectos tóxicos de la actina son supuestamente locales (por ejemplo, inhibición de la lisis de coágulos), aislados o se determinan cinéticamente (por ejemplo, la actina permea a un órgano más rápido que las proteínas de unión lo neutralizan), es probable que se tenga que ajustar de forma ascendente una dosis teóricamente mínima para lograr efectos terapéuticos cinéticamente favorables. El efecto cinético puede ser importante, puesto que existe perfectamente un equilibrado evidentemente lento entre los compartimentos extravasculares y sanguíneos (Smith et al., 1988, arriba). En cambio, solo se puede lograr un estado terapéuticamente eficaz, capaz de romper depósitos locales de actina, por un impulso transitorio de una alta concentración de gelsolina o moléculas de unión a actina.

En lugar de administrar la gelsolina o los péptidos de gelsolina u otros compuestos de unión directamente, también se pueden producir en las células diana por la expresión de un gen codificante introducido en las células, por ejemplo, en un vector viral. El vector se podría dirigir a las células específicas que se van a tratar, o podría contener elementos reguladores, que son encendidos más o menos selectivamente por las células diana.

Por "terapéuticamente eficaz", como se usa en el presente documento, se indica la cantidad de composición que es de calidad y cantidad suficientes para neutralizar, mejorar, modular o reducir la causa o el efecto de la septicemia o inflamación causada por endotoxinas. Debido a que la actividad de unión al péptido de gelsolina está mediada por Ca2+, se supone con el término "terapéuticamente eficaz", con respecto a la administración de gelsolina o el fragmento peptídico funcionalmente equivalente de la misma, que el Ca2+ u otro ion divalente necesario está presente a los niveles necesarios para activar la molécula de gelsolina. Por "mejorar", "modular" o "reducir" se indica una disminución o reducción o prevención profiláctica del efecto perjudicial del trastorno en el paciente que recibe la terapia, dando, así como resultado la "protección" del paciente. Una "cantidad suficiente" o "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" de una composición administrada es el volumen o la concentración que provoca o produce un cambio medible desde el estado de pre-administración en la célula o paciente. El sujeto es preferentemente un paciente humano, sin embargo, se puede prever que cualquier animal con endotoxemia o septicemia se pueda tratar usando la presente invención. Como se usa en el presente documento, los términos "tratar" y "tratamiento" pretenden incluir los términos "prevenir" y "prevención". Una realización de la presente invención incluye el uso de gelsolina, o fragmento peptídico funcionalmente equivalente de la misma, en la fabricación de un medicamento para prevenir, neutralizar o reducir el choque séptico inducido por endotoxemia o endotoxina en un paciente.

Los siguientes ejemplos específicos, pero no limitantes, describen con detalle la preparación de composiciones inyectables a modo de ejemplo y métodos que las usan para la ingeniería de tejidos. Se hace referencia a libros de textos habituales de la biología molecular que contienen definiciones y métodos y medios para llevar a cabo técnicas básicas, englobadas por la presente invención. Véase, por ejemplo, Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982) y Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989) y las diversas referencias citadas en su interior. Será evidente para los expertos en la técnica que se pueden poner en práctica muchas modificaciones, tanto a materiales como a métodos.

EJEMPLOS

Ejemplo 1 - Capacidades de unión y de corte de gelsolina

Actividad de unión - Para proporcionar evidencia química y funcional de que la gelsolina se une a LPS mediante su dominio de unión a lípidos, se realizó un ensayo en fase sólida en el que se añadió LPS radiomarcado a pocillos recubiertos con diferentes cantidades de SEQ ID NO: 1 marcada con rodamina-B (rodamina-B-QRLFQVKGRR, derivado del sitio de unión a PIP2 de la gelsolina y denominado "PBP10"), o a un péptido truncado (rodamina-B-QRL), en ausencia o presencia de LPS sin marcar, respectivamente.

Se prepararon los restos 160-169 de gelsolina de SEQ ID NO: 1 (QRLFQVKGRR), y péptidos QRL, por síntesis de péptidos en fase sólida en resina de alcohol p-benciloxibencílico/poliestireno usando química de protección de alfaFmoc y acoplamiento de carbodiimida/N-hidroxibenzotriazol como se enseña por Cunningham et al., J Biol Chem 276:43390-9 (2001)). Las cadenas laterales se protegieron del siguiente modo: Arg (Pmc), Gln (Trt), Lys (Boc). Para acoplar fluoróforos en estos péptidos, se crearon derivados de éster de cada fluoróforo y se unieron directamente al extremo N de los péptidos sobre el soporte de fase sólida. Después del acoplamiento, los péptidos se escindieron del soporte sólido con ácido trifluoroacético y fenol (95:5, v/p). Todos los péptidos se purificaron por HPLC de fase inversa sobre una columna C-18 de sílice usando un gradiente de 20-60 % de acetonitrilo en 0,1 % de ácido trifluoroacético y se secaron (Cunningham et al., 2001, arriba).

Para determinar la interacción de LPS con gelsolina y los péptidos de fluorescencia derivados del sitio de unión PIP2 de gelsolina, se midió la fluorescencia de rodamina B-péptido SEQ ID NO: 1 o espectros de emisión de pireno-péptido ^{SEQ ID NO: 1 (QRLFQVKGRR) (}A^{em 590 nm,} A^{ex 560 nm, o} A^{em 365-550 nm,} A^{ex 343 nm, respectivamente) quince} minutos después de la adición de diversas concentraciones de LPS (serotipo O26:B6 de Escherichia coli, Sigma), PIP2, LPA o PS añadido a disoluciones 2 pM de los péptidos en tampón A (TRIS 10 mM, MES (ácido 2-morfolinoetanosulfónico) 10 mM, pH 7,0. Puesto que la concentración superficial de los péptidos unidos a los lípidos será mucho mayor a su concentración a granel, se demostró la unión a péptido por cambios de o fluorescencia de rodamina-B o la formación de pireno-excímeros, con un desplazamiento de la emisión de fluorescencia desde la longitud de onda del monómero a 378 nm hasta la emisión del excímero a 473 nm. Por tanto, para determinar cambios de la DO de gelsolina a 280 nm, se añadieron diferentes cantidades de LPS, LPA y PS a disoluciones de gelsolina humana recombinante (GLShr) y se registraron espectros de emisión de DO usando el espectrofotómetro Genesys 6 (Thermo-Spectronic, e E. UU.).

Ensayo en fase sólida - Se hizo marcado con tritio de LPS por una modificación del procedimiento de Watson y Riblet (Watson et al., J. Immunol 114:1462-8 (1975)). Se oxidó una muestra (2 mg) de LPS de Salmonella minnesota Re595 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) (150 minutos, 20 °C) con peryodato de sodio (3x10-2 M). Después de la destrucción del oxidante con etilenglicol 1,0 M, se redujeron los grupos aldehido (18 horas a 4 °C) con una disolución fría en hielo de NaB [3H]4 (0,46 GBq, 481 GBq/mmol, en donde GBq se refiere a una unidad de radiactividad) (Amersham-Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, Inglaterra) en 200 pL de tampón borato frío en hielo (0,05 M, pH 9,5). El exceso de borohidruro de sodio se destruyó con 5 pL de ácido acético. Después de dos lavados (centrifugación a 100.000 x g durante 15 minutos) en 400 pL de una mezcla de agua fría en hielo-etanol (1:1 por vol.), el [3H]-LPS radiomarcado (9x105 cpm/pg; 2x103 cpm/pmol) se conservó a -20 °C hasta que se usó.

Para medir la unión de LPS marcado con [3H], se recubrieron microplacas de poliestireno de tipo ELISA (96 pocillos) con PBP10 o rodamina-B-QRL (RhB-QRL) por incubación durante 18 horas a 4 °C con una disolución (100 pL, 500 pmol/pocillo) en solución salina. Después de tres lavados con 100 pL de solución salina, los pocillos se incubaron entonces a temperatura ambiente con [3H]-LPS (360.000 c.p.m.), en presencia o ausencia de LPS sin marcar (20 pg/pocillo), en un medio de unión (100 pL) que contenía albúmina de suero bovino (50 pg) en solución salina. Después de 3 horas de incubación, las placas se lavaron tres veces con lavados de 100 pL de solución salina, y se midió la radiactividad unida restante.

Los resultados se muestran en la FIG. 1A del ensayo en fase sólida, en donde se añadió LPS radiomarcado a pocillos recubiertos con diferentes cantidades de péptidos PBP10 ± LPS frío. Los resultados en ausencia de LPS sin marcar se muestran como círculos abiertos, mientras que la presencia de LPS sin marcar se muestra como triángulos abiertos: Como se muestra, LPS se unió de forma saturada a PBP10, y produjo una inhibición sustancial de LPS marcado que se une en presencia de exceso de LPS. Por comparación, el péptido truncado (rodamina-B-QRL) no se unió a LPS.

La FIG. 1B, que muestra la densidad óptica (DO) de gelsolina en disoluciones que contienen cantidades variables de LPS o LPA, demuestra la interacción de LPS o PIP2 con gelsolina intacta. Tanto LPS como PIP2 indujeron extinción de la fluorescencia dependiente de la concentración idéntica de PBP10, que indica la inserción de la rodamina unida a péptido en un entorno más hidrófobo. LPA también disminuyó la absorbancia de gelsolina, pero PS no tuvo efecto. LPS y PIP2 también causaron cambios congruentes en el espectro fluorescente de pireno-QRLFQVKGRR (Bucki et al., Biochemistry 40:15752-61 (2001)) en los que la unión a estos lípidos, pero no a PS, indujo la agrupación del péptido con fluorescencia de excímero resultante del grupo pireno, que se manifiesta como una gran aumento en la emisión de fluorescencia a 480 nm (datos no mostrados).

La fluorescencia de rodamina-B-SEQ ID NO: 1 (QRLFQVKGRR) también cambió por LPS como se muestra en la FIG. 1C. Tampoco hubo cambio de fluorescencia después de añadir LPS a un péptido de control con la secuencia rodamina B-QRL (RhB-QRL, datos no mostrados).

Se examinó la interacción de LPS y gelsolina usando rodamina B-SEQ ID NO: 1 marcada con pireno (QRLFQVKGRR). El efecto de LPS sobre la gelsolina se determinó en términos de los cambios fluorescentes de rodamina-B del péptido PBP10 en presencia de diferentes lípidos (FIG. 1C); y los espectros de emisión de fluorescencia de SEQ ID NO: 1 marcada con pireno (2 pM) en presencia de LPS de Escherichia coli (1,2 pM), PIP2 (0,82 pM) y LPA (0,82 pM) (FIG. 1D). Los resultados usando el péptido de gelsolina derivatizado con pireno confirmaron la agrupación inducida por LPS del péptido con fluorescencia de excímero resultante del grupo pireno, que fue evidente como un gran aumento en la emisión de fluorescencia a 480 nm. LPS, LPA y PIP2 tuvieron capacidades similares para inducir la formación de excímeros, mientras que PS no tuvo efecto (datos no mostrados).

También se podrían usar ensayos alternativos para confirmar las características de unión de LPS a gelsolina. Una prueba usa LPS radiomarcado y ensayos para gelsolina por cromatografía de afinidad usando anticuerpo anti-gelsolina inmovilizado (se usó un ensayo similar para detectar la unión de 32PIP2 a gelsolina (Janmey et al., Nature 325:362-364 (1987). Se evaporan a sequedad tubos de vidrio que contenían fosfatidilcolina (PC) (0,3 mg) sola o mezclada con el material a probar (gelsolina, medio mutante de gelsolina que carece del sitio de unión PIP2, péptido PBP10, etc.). Después de la sonicación con una disolución de BSA (60 pL, 1 mg/mL en NaCl 0,15 M), las vesículas se incuban (2 horas, 20 °C) con rotación suave, con [3H]-LPS. Entonces se ajusta la densidad a 1,185 g/mL mediante la adición de 350 pL de una disolución de 1,1 % de NaCl y 46 % de NaBr. Se preparará un gradiente discontinuo por adición secuencial de 23 % de NaCl (700 pL) y la suspensión radiactiva (700 pL), 20,5 % de NaCl (700 pL), 16,5 % de NaCl (700 pL) y 8 % de NaCl (200 pL). Después de la centrifugación (65.000 g, 90 minutos), se mide la radiactividad de fracciones recogidas por centelleo líquido. Se recuperan vesículas con LPS radiomarcado unido en la parte superior (1 mL) del gradiente de densidad, mientras que se encontró [3H]-LPS no unido en el fondo. El índice de unión de LPS de un compuesto se define como la radiactividad recuperada en la parte superior (1 mL) del gradiente de densidad, expresada como un porcentaje de la radiactividad total recuperada.

Medición de complejos por dispersión de neutrones - Se puede medir la estructura molecular de LPS y sus complejos con proteínas a resolución de nm por rayos X y dispersión de neutrones, así como por microscopía electrónica y de fuerza atómica. La FIG. 2 muestra las mediciones preliminares de dispersión de protones de los efectos del péptido de gelsolina SEQ ID NO: 1 sobre la estructura de LPS.

La linealidad del gráfico de ln(QI(Q)) frente a Q2 sugiere que LPS forma una estructura cilíndrica en las condiciones usadas, de acuerdo con un estudio previo de dispersión de neutrones (Hayter et al., J. Biol. Chem. 262:5100-5105 (1987)). El pequeño aumento, pero significativo, en el diámetro calculado de LPS cuando se añade el péptido de gelsolina sugiere una alteración del diámetro. Actualmente, estos datos solo sirven para confirmar que se pueden recopilar datos de dispersión suficientemente buenos para el análisis estructural. Actualmente, el diámetro calculado (36 nm) es mayor que el que se ha informado previamente para micelas puras de LPS, y la diferencia en el tamaño puede reflejar otra característica estructural. En experimentos adicionales con más variaciones en gelsolina/LPS o péptido, las relaciones de LPS revelarán si existen cambios significativos en la estructura de partículas de LPS cuando estos péptidos se unen a LPS.

Se pueden hacer otros estudios de dispersión de neutrones en los Laboratorios Nacionales Argonne donde se tomaron los presentes datos. Cada una de dichas mediciones requiere aproximadamente 4 a 6 horas de tiempo del haz, por lo que los especímenes están limitados a condiciones seleccionadas en las que la DLS o microscopía electrónica sugiere estructuras novedosas formadas por LPS y gelsolina, y donde se inhibe la actividad biológica de LPS. También se hará la microscopía electrónica de transmisión de estos complejos. Si estructuras de tipo cinta laminar, similares a las formadas por PEP2 y gelsolina, los grupos de cabeza se pueden ocluir geométricamente en el interior de la cinta, y si se observan estructuras similares cuando se añade gelsolina a LPS, la retirada de los grupos cargados de LPS de la superficie de la estructura se puede referir a una pérdida de sus efectos celulares.

Ejemplo 2 - La gelsolina compite con la proteína de unión a LPS (LBP) por LPS

Para determinar si la gelsolina puede efectuar una acción similar a la incorporación mediada por LBP de LPS en lipoproteína de sangre, se utiliza un experimento, en el que se mide el reparto entre LPS marcado con Bodipy o 3H y HDL reconstituido (R-HDL) o lipoproteínas plasmáticas. Se prepara R-HDL mezclando apo A-1, PC de huevo, colesterol y colato en la relación molar 1:80:4:80, seguido por la diálisis del colato como se describe previamente por Yu et al., 1997, arriba. Se inactiva la fluorescencia de Bodipy-LPS en micelas, pero se alivia la extinción y la fluorescencia aumenta con el movimiento de los monómeros de Bodipy-LPS fuera de los agregados. Un aumento en la fluorescencia observada cuando tanto la gelsolina como R-HDL se mezclan con Bodipy-LPS proporciona evidencia de la transferencia dependiente de gelsolina de LPS a R-HDL, similar a la observada con LBP. Se añaden LPS puro y diversas cantidades de gelsolina para observar si la gelsolina sola cambia la fluorescencia de Bodipy-LPS, puesto que dicho cambio tendrá que ser restado de la fluorescencia inicial después de añadir lipoproteínas. La tasa y el grado de cambio de la fluorescencia después de la adición de lipoproteína ofrecen un medio para monitorizar el intercambio de LPS en las partículas de lipoproteína. Para sistemas purificados, el tamaño de lipoproteína también se mide por dispersión dinámica de luz. Puesto que los datos de DLS están muy ponderados por las partículas más grandes, el diámetro hidrodinámico promedio será casi igual al de las lipoproteínas solas, y cualquier cambio indica que las partículas se fragmentan o fusionan por gelsolina/LPS.

Puesto que las mediciones de fluorescencia se perturban mucho en plasma o suero, se examina el reparto entre LPS marcado con 3H y las fracciones de lipoproteína plasmática sanguínea en muestras reducidas en gelsolina usando perlas Sepharose 2B recubiertas con anti-gelsolina como se hizo previamente por Janmey et al., 1987, arriba, o en plasma de ratones nulos para gelsolina - después de volver a añadir diversas concentraciones de gelsolina. Debido a las interacciones de otras dos proteínas plasmáticas conocidas: una forma soluble de receptor de CD14 (CD14s) y LBP plasmático (su concentración plasmática es 2-6 pg/mL y 3-10 pg/mL, respectivamente), puede interferir con este ensayo, estas proteínas también se retiran por perlas de Sepharose 2B recubiertas con sus anticuerpos respectivos.

Para determinar la competición entre gelsolina y proteínas de unión a LPS (LPB), un vehículo de alta afinidad por LPS, se saturaron los pocillos recubiertos de LPS (1 nmol/por pocillo de LPS Re-595 de Salmonella minnesota) por incubación (2 horas, 20 °C) con gelsolina 2 mg/mL en RPMI), se lavaron y se preincubaron con diferente cantidad de gelsolina humana recombinante (0-2 ng/pocillo) en gelsolina (0,5 mg/mL) que contenía RPMI. Entonces, se añadieron 10 gL de 125I-LPB (6 x 104 cpm), y las placas se incubaron durante 90 minutos a 37 °C, entonces se lavaron seis veces con RPMI. Después de eso, se midió la radiactividad unida. Similarmente, se usaron pocillos recubiertos de gelsolina para demostrar si GLShr interaccionaba directamente con 125I-LPB.

Se mostró que las concentraciones nanomolares de gelsolina inhibieron la unión de 125I-LBP (proteína de unión a LPS) a pocillos recubiertos de LPS en 69 ± 6 % (FIG. 3A). Además, la inhibición de la unión de LBP-LPS no fue debida a la unión directa de LBP a gelsolina, puesto que 125I-LBP no se unió a superficies recubiertas de gelsolina (FIG. 3B). Debido a que el plasma contiene mayores niveles de gelsolina (150-300 gg/mL) que la gelsolina en LBP (3-10 gg/mL), estos datos, que muestran afinidad comparable de gelsolina y LBP por LPS, demuestran que la gelsolina desempeña una función en la amortiguación o presentación de LPS.

Ejemplo 3 - Actividad de corte de filamentos de actina de la gelsolina y efecto de LPS

Para determinar la actividad de corte de la gelsolina, se evaluaron las tasas de disminución de la fluorescencia durante la despolimerización. Se preparó G-actina monomérica a partir de un polvo de acetona de músculo esquelético de conejo según métodos previamente publicados (Spudich et al., J. Biol. Chem 216:4866-4871 (1975)). La disolución no polimerizante contuvo TRIS 2 mM, CaCl20,2 mM, ATP 0,5 mM (adenosina trifosfato), DTT 0,2 mM (ditiotreitol) a pH 7,4. Se polimerizó actina añadiendo KCl 150 mM y MgCl22mM a las disoluciones de G-actina e incubando durante 1 hora a temperatura ambiente.

Para los ensayos de corte de F-actina, en general, se añade un pequeño volumen (normalmente 5 gL) de la composición de gelsolina a un volumen similar de F-actina marcada con pireno a una concentración ajustada para proporcionar una relación entre actina:gelsolina de aproximadamente 10:1 (normalmente gelsolina 1 gM y actina 10 gM). Esta mezcla se diluye hasta 0,5 gM en un volumen más grande de tampón F-actina, y se calcula la eficiencia de corte del filamento a partir de la pendiente inicial del cambio de la fluorescencia. Esto refleja la tasa de despolimerización que, a su vez, es proporcional al número de cortes hechos por la gelsolina. La relación LPS/gelsolina se puede hacer bajo cualquier condición iónica, y la adición a F-actina requiere la presencia de Ca2+ > gM para activar la gelsolina. Sin embargo, puesto que la reacción de corte solo requiere algunos segundos, y los efectos del Ca2+ sobre el tamaño de los agregados de lípidos es más lento y, al menos para gelsolina/PIP2 no invierte complejos formados en otras condiciones iónicas, es posible, en gran medida, alterar las condiciones iónicas a las que la gelsolina se une a LPS. La reacción de nucleación de actina es similar, excepto que, en el último caso, la mezcla gelsolina/LPS se añade a una disolución más diluida de G-actina (normalmente, 1 o 2 gM) en tampón de baja fuerza iónica, seguido inmediatamente por la adición de KCl 150 mM y MgCl22 mM para iniciar la polimerización.

Cualquier diferencia observada de la unión de LPS a gelsolina o PBP10 por ensayos de fluorescencia en la presente invención también se evalúa por las pruebas de corte y de nucleación de filamentos.

Como se muestra, se midió la actividad de corte de la gelsolina humana recombinante (GLShr) (FIG. 4A) y del suero sanguíneo (FIG. 4B) en muestras de F-actina marcada con pireno 0,4 gM (polimerizadas con 50 % de G-actina marcada con pireno), después de añadir gelsolina (16 nM)/suero (2,5 gL), o su combinación con uno de los siguientes: LPS (de diferentes especies), PIP2 (fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato), LPA (ácido lisofosfatídico), lípido A (el derivado de LPS que carece de polisacárido) o PS (fosfatidilserina). Entonces se monitorizó la intensidad de fluorescencia de F-pireno-actina durante 10 minutos, y se calculó la actividad de corte basándose en la disminución de la fluorescencia. Se determinó la actividad de corte de una disminución en la tasa de fluorescencia durante la despolimerización, y se calculó la tasa de despolimerización a partir de la pendiente de la disminución previa en la fluorescencia.

Cuando se añadió a gelsolina humana purificada, LPS 0,02 gM (100 ng/mL) inhibió el 50 % de la actividad de corte de gelsolina 0,016 gM, y la capacidad de corte se inhibió 90 % en un aumento de 10 veces hasta LPS 0,1 gM (FIG. 4A). En una base molar, se encontró que LPS era un inhibidor más potente que cualquiera de LPA o PIP2. Un exceso molar de 10 veces de LPS de E. coli (serotipo 026:B6) (FIG. 4A), Salmonella enteritidis (cepa ATCC13076) o Pseudomonas aeruginosa (serotipo 10) (datos no mostrados) inhibió eficazmente la capacidad de la gelsolina para cortar los filamentos de actina. El lípido A tuvo un efecto inhibidor más débil, pero aún significativo, y los lípidos aniónicos no específicos como PS no tuvieron efecto (datos no mostrados). Cuando se añadieron a suero humano completo (FIG. 4B), LPS y PIP2 también fueron capaces de inhibir la actividad de la gelsolina, aunque se necesitaron cantidades más grandes en comparación con la actividad de la gelsolina pura en disolución acuosa.

Ejemplo 4 - La gelsolina previene las respuestas celulares inducidas por LPS a LPS in vitro

En vista de los resultados en los ejemplos previos, y usando los materiales preparados anteriormente, se estudió el efecto de la gelsolina que se une por LPS para determinar el efecto sobre respuestas celulares in vitro. Se usaron cultivos celulares de células endoteliales aorticas humanas (HAEC) y astrocitos primarios de rata para evaluar el efecto de LPS sobre actina. Ambos de estos tipos de células tienen CD14m (C14 unido a membrana) y receptores de LPS TLR (Faure, et al., J. Biol. Chem. 275:11058-11063 (2000); Bsibsi, et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol. 61:1013-1021 (2002); Bowman, et al., Glia 43:281 -291 (2003)).

Se obtuvieron astrocitos primarios de rata de ratas prenatales y se mantuvieron durante 14 días en cultivo antes de uso. Se extrajeron embriones (E17-E19) por cesárea de una rata Sprague-Dawley y se extirparon quirúrgicamente los hipocampos. El tejido se digirió en tripsina/DNasa a 37 °C, se centrifugó (1000 g x 5 min) y se filtró para derivar suspensiones de cada cría. Las células se cultivaron en una estufa de incubación a 37 °C y 5 % de CO² en DMEM (medio Eagle modificado por Dulbecco; BioWhittaker/Cambrex BioScience, East Rutherford, NJ), complementado con F12 de Ham (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y 5 % de suero bovino fetal (FBS) (Hyclone, Logan, Utah) durante 7 días, seguido por 7 días adicionales en medio neurobasal (Gibco, Grand Island, NY) también complementado con 5 % de FBS, 1-glutamina 2 mM, 50 pg/mL de estreptomicina y 50 U/mL de penicilina. En cada experimento, el medio se cambió a libre de suero a las 6-12 horas antes de la adición de LPS, TNF-a o gelsolina.

HAEC (células endoteliales aorticas humanas primarias) (ATCC, Rockville, MD o Clonetics, San Diego, CA) crecerán hasta la confluencia a través de los pases 5-9 en medio de crecimiento celular endotelial complementado con 2 % de suero bovino fetal, 10 pg/litro de factor de crecimiento epidérmico recombinante humano, 1 mg/litro de hidrocortisona, 50 pg/mL de gentamicina, 50 ng/mL de anfotecina-B, en una atmósfera humidificada a 37 °C de 95 % de aire:5 % de CO².

Se incubaron HAEC y cultivos de astrocitos durante 10 minutos en medio que contenía 10 pg/mL de LPS solo, o LPS que se había incubado previamente con 0,16 mg/mL de gelsolina humana. Los cultivos se fijaron con metanol frío en hielo y se inmunotiñeron para F-actina con faloidina marcada con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Molecular Probes, Eugene, OR). En cultivos de astrocitos, se manipuló la translocación de NF-kB por una incubación de 2 horas en medio sin suero que contenía uno de los siguientes: 10 ng/mL de TNF-a, 10 pg/mL de LPS solo o LPS que se había incubado previamente con 0,16 mg/mL de gelsolina humana. Se observó la localización del factor de transcripción el factor nuclear-kappa B (NF-kB) usando un anticuerpo monoclonal contra NF-kB (Molecular Probes), y se detectaron núcleos de células por contratinción con diclorhidrato de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Sigma).

La gelsolina que se une a LPS también influyó en las respuestas celulares in vitro a LPS, protegiendo a las plaquetas, células endoteliales aorticas (HAEC), así como a los astrocitos primarios de rata, contra LPS. A concentraciones relativamente altas, el LPS indujo rápidamente el desensamblaje del citoesqueleto de actina como se observa en la tinción con faloidina alterada y difusa en las FIG. 5B y 5E, en comparación con los abundantes haces de actina observados en los controles (FIG. 5A y 5D). Sin embargo, cuando se incubó por primera vez con un exceso de gelsolina plasmática, el LPS no tuvo efecto perceptible sobre los citoesqueletos de actina o de HAEC o astrocitos.

Más específicamente, las FIG. 5A-5M muestran que la alteración de las respuestas celulares inducidas por LPS se inhibió preincubando el LPS con gelsolina plasmática. Brevemente, se usó la inmunotinción para F-actina con faloidina (FIG. 5A-5F) para demostrar que la gelsolina plasmática previno el desensamblaje del citoesqueleto de actina inducido por LPS. Se trataron células endoteliales aorticas humanas cultivadas (FIG. 5A-5C) y astrocitos primarios de rata (FIG.

5D-5F) con LPS 2 pM (FIG. 5B y 5E), o con LPS 2 pM y gelsolina 1,8 pM (FiG. 5C y 5F). Cuando las células endoteliales y los astrocitos se expusieron a LPS (10 pg/mL), el desensamblaje del citoesqueleto de actina se indujo fácilmente como se observó en la tinción con faloidina alterada y difusa en las FIG. 5B y 5E, en comparación con los abundantes haces de actina en los controles (FIG. 5A y 5D). Las células de control se muestran en las FIG. 3A y 5D.

Se conoce que el LPS activa NF-kB, desencadenando la inducción de genes de citocina pro-inflamatoria (véase Saura et al., J. Neurochem, 85:14S5-67 (junio de 2003)). Sin embargo, en los astrocitos, la adición de 10 ng/mL de TNF-a (FIG. 5H y 5L) o LPS 2 pM (FIG. 5I y 5M) causó la translocación de NF-kB al nucleoplasma del núcleo, en comparación con los astrocitos de control, en los que NF-kB se localiza en el citoplasma (FIG. 5G y 5K). Sin embargo, cuando se incubó por primera vez (preincubó) con 1,8 pM de gelsolina plasmática, el LPS no tuvo efecto perceptible sobre los citoesqueletos de actina de ninguna de las células endoteliales o los astrocitos. La adición de gelsolina bloqueó completamente la translocación inducida por LPS de NF-kB (FIG. 5G-4N), como se muestra por la inmunotinción para NF-kB con un anticuerpo contra NF-kB (FIG. 5G-5J), y núcleos celulares con DAPI (FIG. 5L-5M). La preincubación con gelsolina 1,8 pM bloqueó la translocación inducida por LPS (FIG. 5J y 4N).

Efecto protector de QRLFQVKGRR sobre la alteración mediada por LPS de la función plaquetaria

Para aislar plaquetas humanas, se recogió sangre de voluntarios sanos en ácido-citrato-dextrosa. El plasma rico en plaquetas obtenido después de la centrifugación (15 minutos, 110 x g) a temperatura ambiente se complementó con apirasa (0,5 U/mL) (Sigma-Aldrich) para degradar nucleótidos en exceso. Las plaquetas se sedimentaron por centrifugación (10 minutos, 1000 x g), se suspendieron en tampón A (NaCl 139 mM, KCl 2,8 mM, MgCl²0,8 mM, KH² PO⁴0,8 mM, NaHCO³8,9 mM, h Ep ES 10 mM, glucosa 5,6 mM, 0,3 % de albúmina, pH 7,35) y se filtraron sobre una columna de 50 mL de Sepharose 3B para obtener plaquetas filtradas en gel (GFP).

Se inició la agregación plaquetaria añadiendo colágeno (10 pg/mL) (Chrono-Log Corp., Havertown, PA). La agregación plaquetaria se monitorizó usando un lumi-agregómetro Chronolog (Chrono-Log Corp.). Se registraron los cambios en la transmisión de la luz durante 10 minutos, usando un instrumento PowerLab/200 y el programa MacLab Chart versión 3.2. Si se requiere antes de la activación, la suspensión plaquetaria se hizo reaccionar con LPS, o se preincubó con LPS con el péptido de SEQ ID NO: 1 (QRLFQVKGRR).

Como se muestra en la FIG. 6, se estimuló la agregación de LPS por colágeno, pero la agregación se inhibió y se invirtió por el péptido de SEQ ID NO: 1 (QRLFQVKGRR). Cuando se añadió solo, el LPS inhibió fuertemente la agregación y la secreción de plaquetas inducida por colágeno. La adición de gelsolina SEQ ID NO: 1 a LPS antes de su adición a plaquetas restauró, en un modo dependiente de la concentración de péptido, la activación de plaquetas inducida por el colágeno normal. La gelsolina SEQ ID NO: 1 no tuvo por sí misma efecto sobre las funciones plaquetarias mediadas por colágeno.

Ejemplo 5 - Efecto in vivo de la gelsolina plasmática sobre el LPS administrado

Puesto que los seres humanos con septicemia tienen concentraciones plasmáticas de gelsolina reducidas, se examinó el efecto de la administración de LPS sobre los niveles de gelsolina en ratones. Se usaron ratones C57BL/6 naturales macho de 6-7 semanas, que pesaban cada uno 18-20 gramos, comprados de Charles River Laboratories, Wilmington, MA, para todos los estudios en animales. A los animales se les permitió acceso libre a un pienso normal y agua, y todos los procedimientos y estudios descritos aquí han sido autorizados por la comisión permanente del área médica sobre animales de Harvard según las normas que se exponen en The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.

En un ensayo de dosis-respuesta, los animales se inyectaron i.p. (por vía intraperitoneal) con LPS (serotipo 10 de P. aeruginosa, Sigma) a dosis de 0, 10, 20 y 40 mg/kg. Se usaron 3-4 animales en cada grupo. 24 horas después de la administración del LPS, los animales se anestesiaron con avertina i.p. (Fluka Chemie, Suiza) a dosis de 0,015­ 0,017 mg/g. Entonces se recogió la sangre por sangrado retro-orbital en 0,1 volúmenes de anticoagulante de Aster-Jandl y se centrifugó a 1000 x g durante 10 minutos. Se aspiró el plasma y se congeló en nitrógeno líquido y se conservó a -80 °C hasta que se analizó.

Después de sacrificar los animales anestesiados por dislocación cervical, se realizó lavado peritoneal inyectando 3 mL de PBS estéril en la cavidad peritoneal de ratones. Después de masajear suavemente el abdomen, se aspiró el líquido por una jeringa conectada a una aguja de calibre 22 y se centrifugó a 1000 x g durante 10 minutos para retirar los contenidos celulares. Se recogió el líquido del sobrenadante y se congeló en nitrógeno líquido y se conservó a -80 °C hasta que se analizó.

Para estudiar el efecto sobre la mortalidad, los animales se inyectaron i.p. con 25 mg/kg de LPS (E. co li055:B5, Sigma) y cada ratón se seleccionó aleatoriamente para recibir uno de los tres siguientes tratamientos: 1) GSN (que contiene: se disolvió 8 mg de gelsolina plasmática humana recombinante (Biogen-IDEC, Inc) que contiene Ca 1 mM en 400 pL de NaCl 0,15 M (solución salina); o 2) BSA (que contiene: 8 mg de albúmina bovina (Serologicals Proteins, Inc, Kankakee, IL) que contiene Ca 1 mM disuelto en 400 pL de solución salina, o 3) solución salina (que contiene solo 400 pL de solución salina). Se administraron GSN (gelsolina), BSA o soluciones salinas por vía subcutánea en la superficie dorsal de cada animal inmediatamente después de la instilación de LPS, y entonces se repitió a las 24, 48 y 72 horas. Hubo 9 ratones en el grupo de solución salina y 8 ratones cada uno en el grupo de GSN y el grupo de BSA. Los animales se monitorizaron frecuentemente, y se registró la mortalidad y se presentó en un intervalo de días. Se presentan los datos del estudio de la mortalidad de animales como curvas de Kaplan-Meier y se usó la prueba del orden logarítmico para analizar el impacto del tratamiento sobre la mortalidad de los animales. Se consideró significativo un valor de p inferior a 0,05.

Para medir la gelsolina in vivo, se realizó un ensayo de nucleación para gelsolina plasmática del siguiente modo: se diluyó 1:5 el plasma de ratón recogido en tampón B (KCl 0,1 M, MgCl20,2 mM, EGTA 1 mM (ácido etilenglicol-bis(2-aminoetil)-N,N,N',N'-tetraacético), ATP 0,5 mM, p-mercaptoetanol 0,5 mM, tampón Tris-HCl 10 mM, pH 7,4). A partir de la muestra de plasma diluida, se añadieron 5 pL a 280 pL de tampón B complementado con CaCU 1,5 mM y falacidina 0,4 pM en tubos de cultivo de borosilicato de 6 x 50 mm. Se inició la reacción de polimerización de actina añadiendo 15 pL de pireno-actina 20 pM en tampón A (ATP 0,5 mM, p-mercaptoetanol 0,5 mM, CaCl20,2 mM, tampón Tris-HCl 0,2 mM, pH 7,4). La polimerización se monitorizó durante 200 segundos en un espectrofluorímetro a longitudes de onda de excitación y de emisión de 366 y 386 nm, respectivamente. Se estimaron las concentraciones de gelsolina a partir de una curva patrón usando gelsolina plasmática humana recombinante.

Para todas las mediciones de fluorescencia en este ejemplo o los ejemplos anteriores o en ensayos futuros, se harán estudios iniciales con un fluorímetro estándar, para el que se adapta un portamuestras para permitir preferentemente mediciones de muestras tan pequeñas como 200 pL en tubos de vidrio libres de pirógenos desechables. El aspecto libre de pirógenos es irrelevante para la mayoría de los estudios, puesto que se añadirán cantidades relativamente grandes (ng/mL a pg/mL) de LPS. Pero para otros estudios que usan reactivos especializados, el uso de cubetas de fluorímetro estándar es poco práctico puesto que se necesita la minimización del volumen de muestra para reducir el coste de los reactivos especializados. La intensidad de fluorescencia de PBP10 es suficientemente alta para ser leída a niveles de 2 pM, y la intensidad de fluorescencia solo aumentará cuando lo haga la unión de LPS.

Se realizó similarmente la medición de gelsolina de lavado peritoneal, excepto que en su lugar se usaron 50 pL de lavado peritoneal y 30 pL de pireno-actina. El pireno-actina de reserva para estos ensayos, preparado por el método de Kouyama y Mihashi (Kouyama et al., Eur. J. Biochem. 114:33-38 (1981), se conservó a -80 °C en lotes, se descongeló y se diluyó 10x con tampón A, se centrifugó a 250k x g durante 30 minutos después de reposar durante la noche.

Se midió la gelsolina plasmática por el ensayo de nucleación de actina descrito anteriormente, y se repitió (cada ensayo se hizo por duplicado). Todos los valores se presentan como media ± DE. Se usó una prueba no paramétrica, la correlación de rango de Spearman, para analizar las correlaciones en el estudio de dosis-respuesta. Se realizó la prueba de la U de Mann-Whitney cuando se compararon los niveles de gelsolina. Se midieron colorimétricamente los niveles de albúmina plasmática usando un kit comercial (Stanbio Laboratory, Boerne, TX) según las instrucciones de fabricación.

Como se muestra en la FIG. 7, cuando los ratones que recibieron la dosis letal de LPS por vía intraperitoneal se trataron con gelsolina (GSN), albúmina (BSA) o solución salina, respectivamente, la gelsolina plasmática exógena rescató los ratones endotoxémicos. Esto fue una respuesta espectacular al tratamiento con gelsolina, puesto que los ratones que recibieron cualquiera de las terapias de BSA o de solución salina murieron todos en el plazo de 6 días desde el tratamiento con LPS. Véase la FIG. 7. Por comparación, en el día 7, pareció que todos los ratones supervivientes (todos en el grupo de GSN) se habían recuperado completamente, y no presentaron signos de malestar. Las cantidades de gelsolina administradas por esta vía restauraron a 200 pg/mL los niveles en plasma en animales tratados con LPS, que es ligeramente superior a las concentraciones basales (datos no mostrados). Por tanto, se puede llegar a la conclusión de que los animales tratados in vivo con gelsolina plasmática han mejorado notablemente la supervivencia en comparación con los tratados con controles de solución salina o de BSA (FIG. 7) (p< 0,001).

Ejemplo 6 - Función de la gelsolina plasmática in vivo en septicemia

Gelsolina plasmática como un tratamiento para la septicemia - En vista de los datos anteriores en el Ejemplo 5, que sugieren que la administración de gelsolina plasmática exógena puede mejorar la supervivencia en animales endotoxémicos, se exponen ratones nulos para gelsolina y naturales a una exposición endotoxémica similar y se determina si existen diferencias en la supervivencia y en los marcadores de inflamación. Además, aunque aún no se conoce indudablemente a través de qué vía de inflamación ejerce su efecto la gelsolina plasmática de inflamación. Por consiguiente, la administración de gelsolina plasmática exógena mejora la supervivencia de animales sépticos naturales, disminuye el daño a los órganos secundarios y está asociada con mediadores inflamatorios más bajos.

El diseño general del experimento emplea dos modelos diferentes de septicemia: 1) el modelo de endotoxemia inducida por LPS, y 2) el modelo de ratón de ligadura y punción cecal (CLP). El principal motivo para desarrollar el modelo de CLP es que se parece mucho más a la septicemia clínica que LPS (Schultz et al., Ann. Aled. 34:573-581 (2002)). En la práctica, los ratones nulos para gelsolina y naturales genéticamente similares (C57BL/6) se someten a lesión (LPS o CLP). Dos horas después de la lesión, se dividen aleatoriamente los animales naturales en 3 grupos: 1) un grupo experimental administrado con gelsolina plasmática por vía subcutánea y 2 grupos de control: 2) un grupo administrado con PBS; y 3) un grupo de control administrado solo con proteína BSA. Entonces se anestesian seis animales de cada grupo y se sangran en diversos momentos (4 h, 16 h, 28 h, 40 h), de lo que se generará plasma.

Entonces se analizan las muestras de plasma para los niveles de gelsolina plasmática, así como para factores inflamatorios, TNF-a, IL-1 p e IL-6, puesto que se conoce que estos mediadores aumentan durante el desarrollo de septicemia (véase, por ejemplo, Riedemann et al., J. Clin. Invest. 112:460-467 (2003)). Además, también se mide la proteína del grupo B-1 de alta movilidad (HMGB-1), puesto que esta proteína se ha correlacionado con el retraso de la muerte de animales sépticos (Wang et al., Science 285:248-251 (1999)). Para medir el daño a los órganos secundarios, se miden y se comparan las transaminasas plasmáticas (ALT, AST), LDH y creatinina. Además, habrá 10 animales en cada brazo del estudio que se someten a CLP en el estudio de "muerte como punto final". Basándose en los datos anteriores, este número de animales es suficiente para dar lo más probablemente diferencias estadísticamente significativas en la mortalidad entre animales de control y experimentales.

Basándose en los datos previos, al menos del Ejemplo 5 con ratones sépticos por LPS, los animales nulos para gelsolina deben tener mortalidad significativamente más alta, marcadores inflamatorios más altos y daño a los órganos secundarios más intenso que los animales no mutantes. Además, el tratamiento con gelsolina plasmática reducirá significativamente la tasa de mortalidad de los animales naturales sometidos a CLP. Además, se prevé que los animales tratados con gelsolina tengan menos disfunción orgánica reflejada por menores niveles de transaminasas, LDH y creatinina. Los resultados de ratones con CLP, por tanto, prestan más apoyo a la gelsolina como un tratamiento terapéutico prometedor en la septicemia clínica.

El perfil de citocinas se diferencia algo entre los modelos de LPS y de CLP de septicemia, especialmente en la producción de TNF-a (Villa et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2:549-553 (1995)). En el modelo de LPS, TNF-a aumenta intensamente en el plazo de 2 horas desde la exposición (véase Rothenbach et al., 2004, arriba); mientras que, en el modelo de CLP, TNF-a solo aumenta ligeramente. Puesto que los presentes animales se tratan 2 horas después de la lesión, es probable que la vía de TNF-a ya se haya iniciado, y sea poco probable que el tratamiento con gelsolina afecte los niveles de TNF-a. Por otra parte, IL-1 p e IL-6 son elevadas en tanto los modelos de LPS como de CLP, y tienden a permanecer elevados durante muchas horas, que significa que el tratamiento con gelsolina puede afectar estas 2 citocinas en reducir la inflamación. HMGB-1 aparece después en el transcurso de la septicemia, y está asociado con la letalidad (Wang et al., 1999, arriba). Como resultado, el tratamiento con gelsolina puede disminuir los niveles de HMGB-1 en sangre, que refleja el efecto de rescate del tratamiento con gelsolina.

Claims (18)

REIVINDICACIONES

1. Gelsolina, o fragmento peptídico funcionalmente equivalente de la misma, para su uso como un medicamento en un método de prevención, neutralización o reducción de endotoxemia o choque séptico inducido por endotoxinas en un paciente in vivo, en donde el paciente se somete o es susceptible a infección por bacterias Gram-negativas.

2. Gelsolina para su uso según la reivindicación 1, en donde la gelsolina, o fragmento peptídico funcionalmente equivalente de la misma, es para administración parenteral.

3. Gelsolina para su uso según la reivindicación 2, en donde tras la administración de la cantidad terapéuticamente eficaz de gelsolina, o fragmento peptídico funcionalmente equivalente de la misma, la sangre o líquido extracelular del paciente comprende un aumento de la concentración de gelsolina, en comparación con el nivel de gelsolina antes de la administración.

4. Gelsolina para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3, en donde el aumento de la concentración de gelsolina en el paciente protege al paciente de endotoxemia o septicemia inducida por endotoxinas.

5. Gelsolina para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en donde el aumento de la concentración de gelsolina en el paciente disminuye la concentración de LPS bacteriano en el paciente.

6. Gelsolina para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en donde la endotoxemia o septicemia inducida por endotoxinas en el paciente se induce por LPS después de la infección bacteriana o la activación de endotoxinas en el paciente.

7. Gelsolina para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3, en donde el aumento de la concentración de gelsolina en el paciente disminuye, mejora o previene la alteración inducida por LPS bacteriano de las respuestas celulares del paciente o la formación de estructuras tóxicas.

8. Gelsolina para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, el método comprende además potenciar la actividad de LBP endógeno (proteína de unión a LPS), inhibiendo, mejorando o previniendo así la incorporación de LPS en lipoproteínas de la sangre del paciente.

9. Gelsolina para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la gelsolina, o fragmento peptídico funcionalmente equivalente de la misma, comprende gelsolina plasmática.

10. Gelsolina para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la gelsolina, o fragmento peptídico funcionalmente equivalente de la misma, comprende los restos de aminoácidos 160-169 de gelsolina.

11. Gelsolina para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la gelsolina, o fragmento peptídico funcionalmente equivalente de la misma, comprende gelsolina plasmática recombinantemente producida o expresada.

12. Gelsolina para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde la gelsolina, o fragmento peptídico funcionalmente equivalente de la misma, comprende SEQ ID NO: 1.

13. Una composición farmacéutica que comprende gelsolina para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, comprendiendo dicha composición farmacéutica:

(1) gelsolina, o fragmento peptídico funcionalmente equivalente de la misma, en donde dicha gelsolina o dicho fragmento está sustancialmente libre de contaminantes naturales; y

(2) un vehículo farmacéuticamente aceptable.

14. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 13, en donde la composición farmacéutica comprende además una cantidad suficiente de Ca123+ para activar la capacidad de unión de gelsolina exógenamente administrada.

15. Una composición farmacéutica que comprende:

(1) gelsolina, o fragmento peptídico funcionalmente equivalente de la misma, en donde dicha gelsolina o dicho fragmento está sustancialmente libre de contaminantes naturales; y

(2) un vehículo farmacéuticamente aceptable; y

(3) una cantidad suficiente de Ca2+ para activar la capacidad de unión de gelsolina exógenamente administrada, para su uso en un método de prevención, neutralización o reducción de endotoxemia o choque séptico inducido por endotoxinas en un paciente.

16. El uso de gelsolina, o fragmento peptídico funcionalmente equivalente de la misma, en la fabricación de un medicamento para prevenir, neutralizar o reducir la endotoxemia o choque séptico inducido por endotoxinas en un paciente.

17. Gelsolina para su uso en un método de predicción del desenlace clínico asociado a una enorme inflamación en un paciente susceptible a choque inflamatorio o septicemia inducida por endotoxinas, comprendiendo dicho método medir la concentración de gelsolina circulante en el paciente, en donde una disminución <30 % de los niveles de gelsolina normales pre-traumatismo o pre-infección predice dicho resultado adverso y predice una necesidad de terapia con gelsolina.

18. Gelsolina para su uso según la reivindicación 17, que comprende el uso de derivados de fosfolípido de inositol fosforilado fluorescente o el marcado con tritio como método de detección de una endotoxina en una muestra in vitro.