ES2843599T3 - Receptor de antígeno quimérico - Google Patents

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Abstract

Un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende un dominio de unión a CD22 que comprende a) una región variable de cadena pesada (VH) que tiene 5 regiones determinantes de complementariedad (CDR) con las siguientes secuencias: CDR1 - NYWIH (SEQ ID No. 1); CDR2 - GINPGNNYATYRRKFQG (SEQ ID No. 2) CDR3 - EGYGNYGAWFAY (SEQ ID No. 3); y b) una región variable de cadena ligera (VL) que tiene CDR con las siguientes secuencias: CDR1 - RSSQSLANSYGNTFLS (SEQ ID No. 4); CDR2 - GISNRFS (SEQ ID No. 5) CDR3 - LQGTHQPYT (SEQ ID No. 6).

Description

DESCRIPCIÓN
Receptor de antígeno quimérico
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un receptor de antígeno quimérico (CAR) que se une específicamente al antígeno CD22 humano.
Antecedentes de la invención
Receptores de antígeno quimérico (CAR)
Los receptores de antígeno quimérico son proteínas que injertan la especificidad de, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal (mAb) para la función efectora de un linfocito T. Su forma habitual es la de una proteína de dominio transmembrana de tipo I con un extremo amino terminal que reconoce el antígeno, un espaciador, un dominio transmembrana, todo ello conectado a un endodominio compuesto que transmite señales de supervivencia y activación de linfocitos T (véase la figura 1A).
La forma más habitual de estas moléculas son fusiones de fragmentos variables monocatenarios (scFv) derivados de anticuerpos monoclonales que reconocen un antígeno diana, fusionados mediante un espaciador y un dominio transmembrana a un endodominio de señalización. Dichas moléculas dan como resultado la activación de los linfocitos T en respuesta al reconocimiento por el scFv de su diana. Cuando los linfocitos T expresan dicho CAR, reconocen y destruyen las células diana que expresan el antígeno diana. Se han desarrollado varios CAR contra antígenos asociados al tumor, y las estrategias de transferencia adoptiva usando dichos linfocitos T que expresan CAR están actualmente en ensayo clínico para el tratamiento de diversos cánceres.
CD22
El antígeno CD22 humano es una molécula que pertenece a la familia de lectinas SIGLEC. Se encuentra en la superficie de los linfocitos B maduros y en algunos linfocitos B inmaduros, y se expresa en el 60-70 % de los linfocitos B neoplásicos.
CD22 es una proteína transmembrana de unión a azúcar, que se une específicamente al ácido siálico con un dominio de inmunoglobulina (Ig) ubicado en su extremo N-terminal. CD22 funciona como un receptor inhibidor de la señalización del receptor de linfocitos B (BCR).
Al igual que CD19, CD22 se considera ampliamente un antígeno pan-B, aunque se ha descrito la expresión en algunos tejidos no linfoides. El direccionamiento de CD22 con anticuerpos monoclonales terapéuticos e inmunoconjugados ha entrado en pruebas clínicas.
También ha habido varios informes de receptores de antígeno quimérico (CAR) dirigidos a CD22. Haso et al. (Blood; 2013; 121(7)) describen CAR anti-CD22 con dominios de unión a antígeno derivados de scFv m971, HA22 y BL22. CD-22 tiene siete dominios extracelulares de tipo IgG, que se identifican comúnmente como dominio 1 de Ig a dominio 7 de Ig, siendo el dominio 7 de Ig el más próximo a la membrana del linfocito B y siendo el dominio 7 de Ig el más distal de la membrana celular de Ig (véase la figura 2 y Haso et al. 2013 como anteriormente, la figura 2B).
El gran dominio extracelular de CD22 se considera un desafío para el direccionamiento de CAR. Se sabe que la activación de las cadenas canónicas de TCR depende críticamente del tamaño del ligando MHC que se reconoce, y la señalización se atenúa drásticamente cuando el tamaño del par TCR:ligando péptido-MHC excede las dimensiones de tipo silvestre (Choudhuri et al. (2005) Nature 436:578-582). El mecanismo subyacente a este fenómeno se ha explicado con referencia al modelo de segregación cinética de la activación de linfocitos T. Se cree que las interacciones de linfocitos T:célula diana de longitud extendida son incapaces o ineficaces para excluir las fosfatasas CD45 y CD148 de la sinapsis, lo que conduce a una fosforilación ineficaz del complejo TCR y una señalización ineficaz (Davis y van der Merwe (2006) Nat Immunol. 7: 803-809). También se ha demostrado que los CAR exhiben una eficacia de señalización disminuida a medida que aumenta la distancia del epítopo de la membrana de la célula diana (Hombach et al. (2007) J. Immunol. 178:4650-4657).
Los siete dominios de tipo de CD22 proporcionan una serie de epítopos a diferentes distancias de la membrana que pueden ser dirigidos usando distintos mAb. En estudios que investigan el impacto de la proximidad de la membrana del epítopo de CD22 en la activación de linfocitos T con c Ar y la lisis de las células diana, se ha informado que existe una relación inversa entre el potencial lítico máximo y la distancia del epítopo de CD22 de la membrana de la célula diana (James et al. (2008) J. Immunol. 7028-7038). Esto está en completa correlación con el modelo mencionado anteriormente.
En el estudio de James et al. (2008) se encontró que, incluso cuando se dirigían a un epítopo proximal a la membrana, los linfocitos T con CAR específicos de CD22 exhibían niveles más bajos de lisis máxima y menor sensibilidad al antígeno que los linfocitos T con CAR que se dirigen a CD20, que tiene un dominio extracelular más corto que CD22. Esta sensibilidad disminuida se restauró por direccionamiento a un ligando que expresaba el mismo epítopo, pero construido como una molécula de CD22 truncada para aproximarse a la longitud de un complejo TCR:péptido-MHC. Haso et al. (2013, como anteriormente) fabricaron y probaron CAR con dominios de unión basadosen los anticuerpos anti-CD22 Ha 22, BL22 y m971. Los scFv HA22 y BL22 se unen al dominio 3 de Ig de CD22, mientras que m971 se une dentro del dominio 5-7 de Ig de CD22 que está próximo a la membrana (véase la figura 1 y Haso et al. (2013), figura 2B). Se informó que el CAR derivado de m971 mostró una actividad de destrucción de células diana superior que el CAR derivado de HA22 y el CAR derivado de BL22, hallazgo que se atribuye a la importancia del epítopo de CD22 dirigido por el CAR. Se concluye que el direccionamiento a un dominio proximal a la membrana de c D22 es "el elemento clave" en el desarrollo de un CAR anti-CD22 altamente activo (Análisis, último párrafo).
El CAR derivado de m971 se encuentra actualmente en ensayo clínico para el tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda de linfocitos B (B-ALL).
Orentas, R. J. et al. (2013) realizaron estudios clínicos utilizando linfocitos T manipulados para expresar un CAR específico para el antígeno CD19 o CD22 en pacientes pediátricos con leucemia linfoblástica aguda (ALL) recidivante. Descripción de las figuras
Figura 1: Diagrama esquemático que ilustra un CAR clásico. (b) a (d): Diferentes generaciones y permutaciones de endodominios de CAR: (b) los diseños iniciales transmitían señales ITAM en solitario a través del endodominio FceR1-y o CD3Z, mientras que los diseños posteriores transmitían (c) una o (d) dos señales coestimuladoras adicionales en el mismo endodominio del compuesto.
Figura 2: Diagrama esquemático que ilustra los 7 dominios de tipo Ig de CD22 y la posición de unión de diversos anticuerpos anti-CD22. CD19, en comparación, tiene un dominio extracelular mucho más pequeño, más flexible, que comprende dos dominios de tipo Ig.
Figura 3: Diagrama esquemático que ilustra los siete CAR anti-CD22 diferentes probados en los Ejemplos. Los CAR eran idénticos excepto por los dominios de unión a antígeno, teniendo cada uno un espaciador bisagra de IgG1 y un endodominio de segunda generación que comprende CD3 zeta y un dominio coestimulador de 41BB. Figura 4: Ensayo de citotoxicidad
Se comparó un panel de CAR CD22 que tenían diferentes dominios de unión a antígeno para determinar su actividad de destrucción in vitro contra células Raji en una relación E:T de 4:1 y 1:1.
Figura 5: Ensayo de liberación de IFNy
El panel de CAR CD22 que tenían diferentes dominios de unión a antígeno se comparó para determinar la secreción de IFNy después de 72 h de cultivo conjunto con células diana Raji en una relación E:T de 4:1 y 1:1. Sumario de aspectos de la invención
Los presentes inventores han desarrollado un nuevo CAR anti-CD22 que sorprendentemente supera a otros CAR anti-CD22, dirigidos a diferentes epítopos de CD22, en la destrucción de células diana.
Por lo tanto, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende un dominio de unión a CD22 que comprende
a) una región variable de cadena pesada (VH) que tiene regiones determinantes de complementariedad (CDR) con las siguientes secuencias:
CDR1 - NYWIH (SEQ ID No. 1);
CDR2 - GINPGNNYATYRRKFQG (SEQ ID No. 2)
CDR3 - EGYGNYGAWFAY (SEQ ID No. 3); y
b) una región variable de cadena ligera (VL) que tiene CDR con las siguientes secuencias:
CDR1 - RSSQSLANSYGNTFLS (SEQ ID No. 4);
CDR2 - GISNRFS (SEQ ID No. 5)
CDR3 - LQGTHQPYT (SEQ ID No. 6).
El dominio de unión a CD22 puede comprender un dominio VH que tiene la secuencia mostrada como SEQ ID No. 7; o un dominio VL que tiene la secuencia mostrada como SEQ ID No 8 o una variante de la misma, que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia que conserva la capacidad de unirse a CD22.
El CAR puede comprender un dominio espaciador seleccionado entre los siguientes: un dominio Fc de IgG1 humana; una bisagra de IgG1; una bisagra de IgG1-pedúnculo de CD8 ; un pedúnculo de CD8; o un dominio espaciador en superhélice. En particular, el CAR puede comprender un espaciador en superhélice, que produce un CAR multimérico en la superficie celular cuando se expresa en una célula.
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR de acuerdo con el primer aspecto de la invención.
En un tercer aspecto, se proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende una primera secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el segundo aspecto de la invención y una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica otro CAR o un gen suicida.
En un cuarto aspecto, se proporciona un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el segundo aspecto de la invención o una construcción de ácido nucleico de acuerdo con el tercer aspecto de la invención.
En un quinto aspecto, se proporciona una célula que expresa un CAR de acuerdo con el primer aspecto de la invención. En un sexto aspecto, se proporciona un método para fabricar una célula de acuerdo con el quinto aspecto de la invención, que comprende la etapa de introducir una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el segundo aspecto de la invención, o una construcción de ácido nucleico de acuerdo con el tercer aspecto de la invención en una célula ex vivo.
En un séptimo aspecto, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de células de acuerdo con el quinto aspecto de la invención.
En un octavo aspecto, se proporciona una composición farmacéutica de acuerdo con el séptimo aspecto de la invención para su uso en un método para tratar una enfermedad en un sujeto.
La enfermedad puede ser un cáncer, tal como una neoplasia de linfocitos B.
Descripción detallada
RECEPTORES DE ANTÍGENO QUIMÉRICO (CAR)
Los CAR, que se muestran esquemáticamente en la figura 1, son proteínas transmembrana quiméricas de tipo I que conectan un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular (ligante) con un dominio de señalización intracelular (endodominio). El ligante es típicamente un fragmento variable monocatenario (scFv) derivado de un anticuerpo monoclonal (mAb), pero puede basarse en otros formatos que comprenden un sitio de unión a antígeno de tipo anticuerpo. Normalmente, es necesario un dominio espaciador para aislar el ligante de la membrana y permitir una orientación adecuada. Un dominio espaciador común utilizado es el Fc de IgG1. Los espaciadores más compactos pueden ser suficientes, por ejemplo, el pedúnculo de CD8a e incluso solo la bisagra de IgGl en solitario, dependiendo del antígeno. Un dominio transmembrana ancla la proteína en la membrana celular y conecta el espaciador al endodominio.
Los primeros diseños de CAR tenían endodominios derivados de las partes intracelulares de la cadena y de FceRI o CD3Z. En consecuencia, estos receptores de primera generación transmitieron la señal inmunológica 1, que fue suficiente para desencadenar la destrucción de linfocitos T de las células diana relacionadas, pero no pudo activar completamente al linfocito T para proliferar y sobrevivir. Para superar esta limitación, se han construido endodominios compuestos: la fusión de la parte intracelular de una molécula coestimuladora de linfocitos T con la de CD3Z da como resultado receptores de segunda generación que pueden transmitir una señal activadora y coestimuladora simultáneamente después del reconocimiento de antígeno. El dominio coestimulador más utilizado es el de CD28. Este suministra la señal coestimuladora más potente, es decir, la señal inmunológica 2, que desencadena la proliferación de linfocitos T. También se han descrito algunos receptores que incluyen los endodominios de la familia de receptores de TNF, tales como OX40 y 41BB estrechamente relacionados que transmiten señales de supervivencia. Incluso se han descrito CAR más potentes de tercera generación que tienen endodominios capaces de transmitir señales de activación, proliferación y supervivencia.
Los ácidos nucleicos que codifican CAR pueden transferirse a linfocitos T usando, por ejemplo, vectores retrovirales. Se pueden emplear vectores lentivirales. De esta manera, puede generarse una gran cantidad de linfocitos T específicos del cáncer para transferencia celular adoptiva. Cuando el CAR se une al antígeno diana, esto da como resultado la transmisión de una señal de activación al linfocito T en el que se expresa. Por lo tanto, el CAR dirige la especificidad y la citotoxicidad del linfocito T hacia las células tumorales que expresan el antígeno diana.
DOMINIO DE UNIÓN A ANTÍGENO
El dominio de unión a antígeno es la porción del CAR que reconoce el antígeno. Se conocen numerosos dominios de unión a antígeno en la técnica, incluidos los basados en el sitio de unión a antígeno de un anticuerpo, miméticos de anticuerpos, y receptores de linfocitos T. Por ejemplo, el dominio de unión a antígeno puede comprender: un fragmento variable monocatenario (scFv) derivado de un anticuerpo monoclonal; un ligando natural del antígeno diana; un péptido con suficiente afinidad por la diana; un anticuerpo de dominio único; un ligante artificial único tal como Darpin (proteína repetida de anquirina diseñada); o una cadena sencilla derivada de un receptor de linfocitos T.
El dominio de unión a antígeno del CAR de la presente invención se deriva de inotuzumab, que tiene las siguientes regiones determinantes de complementariedad (CDR):
Cadena pesada:
CDR1 - NYWIH (SEQ ID No. 1);
CDR2 - GINPGNNYATYRRKFQG (SEQ ID No. 2)
CDR3 - EGYGNYGAWFAY (SEQ ID No. 3); y
Cadena ligera:
CDR1 - RSSQSLANSYGNTFLS (SEQ ID No. 4);
CDR2 - GISNRFS (SEQ ID No. 5)
CDR3 - LQGTHQPYT (SEQ ID No. 6).
El CAR de la presente divulgación puede tener una o más mutaciones (sustituciones, adiciones o deleciones) en una o más de las CDR siempre que la molécula resultante conserve la capacidad de unirse a CD22. Por ejemplo, todas o cada CDR pueden comprender una, dos o tres mutaciones en comparación con las secuencias dadas anteriormente. Las mutaciones pueden estar en CDR1 o 2, o las CDR de cadena ligera, que a menudo son menos importantes para la unión a antígeno.
El CAR de la presente invención puede comprender el VH y/o VL de Inotuzumab, que se dan a continuación como las SEQ ID Nos. 7 y 8 , respectivamente. Las secuencias de c Dr están en negrita y subrayadas y se basan en el sistema de delineación de Kabat.
SEQ ID No. 7: Secuencia VH
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYRFTNYWIHWVRQAPGQGLEWIGGINPGN
NYATYRRKFQGRVTMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTREGYGNYGAWFAY
WGQGTLVTVSS
SEQ ID No. 8 : Secuencia VL
DVQVTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLANSYGNTFLSWYLHKPGKAPQLLIYGIS
NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQGTHQPYTFGQGTKVEIK
El CAR de la invención puede comprender una variante de la secuencia mostrada como SEQ ID No. 7 y/u 8, que tiene al menos un 80, 85, 90, 95, 98 o un 99 % de identidad de secuencia, siempre que la secuencia variante conserve la capacidad de unirse a CD22 (cuando se combina con un dominio VL o VH complementario, si es apropiado).
El porcentaje de identidad entre dos secuencias polipeptídicas puede determinarse fácilmente por programas tales como BLAST que está libremente disponible en http://blast.ncbi.nlm.nih.gov.
El dominio de unión a antígeno del CAR de la presente invención puede comprender un scFv, que puede estar en una orientación VH-VL o una orientación VL-VH.
La CD22 humana es una proteína transmembrana de tipo I de paso único que tiene 847 aminoácidos, de los cuales los residuos 20-687 constituyen el dominio extracelular N-terminal, los residuos 688-706 constituyen el dominio transmembrana, y los residuos 707-847 constituyen el dominio citoplásmico C-terminal.
El dominio extracelular está formado por siete dominios extracelulares de tipo IgG, que se identifican comúnmente como dominio 1 de Ig a dominio 7 de Ig, siendo el dominio 7 de Ig el más próximo a la membrana del linfocito B y siendo el dominio 7 de Ig el más distal de la membrana celular de Ig (véase Haso et al. 2013 como anteriormente, figura 2B).
Las posiciones de los dominios de Ig en términos de la secuencia de aminoácidos de CD22 (http://www.uniprot.org/uniprot/P20273) se resumen en la siguiente tabla:
Figure imgf000006_0001
El dominio de unión a antígeno del CAR de la presente invención se une a un epítopo en el dominio 1 de Ig de CD22. PÉPTIDO SEÑAL
Los CAR de la célula de la presente invención pueden comprender un péptido señal de modo que, cuando el CAR se exprese dentro de una célula, tal como un linfocito T, la proteína naciente se dirija al retículo endoplásmico y posteriormente a la superficie celular, donde se expresa.
El núcleo del péptido señal puede contener un largo tramo de aminoácidos hidrófobos que tiene tendencia a formar una única hélice alfa. El péptido señal puede empezar con un tramo corto de aminoácidos cargados positivamente, que ayuda a reforzar la topología adecuada del polipéptido durante la translocación. Al final del péptido señal típicamente hay un tramo de aminoácidos que reconoce y escinde la peptidasa señal. La peptidasa señal puede escindir durante o después de completarse la translocación, para generar un péptido señal libre y una proteína madura. A continuación, los péptidos señal libres se digieren por proteasas específicas.
El péptido señal puede estar en el extremo amino de la molécula.
El péptido señal puede comprender la SEQ ID No. 9, 10 u 11 o una variante de la misma que tiene 5, 4, 3, 2 o 1 mutaciones de aminoácidos (inserciones, sustituciones o adiciones) con la condición de que el péptido señal aún funcione causando la expresión del CAR en la superficie celular.
SEQ ID No. 9: MGTSLLCWMALCLLGADHADG
El péptido señal de la SEQ ID No. 9 es compacto y altamente eficaz. Se predice que proporcione aproximadamente un 95 % de escisión después de la glicina terminal, dando una eliminación eficaz por la peptidasa señal.
SEQ ID No. 10: MSLPVTALLLPLALLLHAARP
El péptido señal de la SEQ ID No. 10 procede de la IgG1.
SEQ ID No. 11: MAVPTQVLGLLLLWLTDARC
El péptido señal de la SEQ ID No. 11 procede de la CD8.
DOMINIO ESPACIADOR
los CAR puedan comprender una secuencia espaciadora para conectar el dominio de unión a antígeno con el dominio transmembrana y separar espacialmente el dominio de unión a antígeno de la membrana celular. Un espaciador flexible permite que el dominio de unión a antígeno se oriente en diferentes direcciones para posibilitar la unión. El CAR de la presente invención puede comprender, por ejemplo, un espaciador derivado de una región Fc de IgG1, una bisagra de IgG1 o el pedúnculo de CD8 humana o de ratón. Un espaciador de IgG1 humana puede alterarse para eliminar los motivos de unión a Fc.
Las secuencias de aminoácidos para estos espaciadores se dan a continuación:
SEQ ID No. 12 (bisagra-CH2CH3 de lgG1 humana)
AEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPE
VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA
LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN
GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK
SLSLSPGKKD
SEQ ID No. 13 (pedúnculo de CD8 humana):
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDI SEQ ID NO: 14 (bisagra de IgG1 humana):
AEPKSPDKTHTCPPCPKDPK
Como alternativa, el CAR de la presente invención puede comprender un dominio espaciador en superhélice.
Una superhélice es un motivo estructural en el que de dos a siete hélices alfa se envuelven juntas como los hilos de una cuerda. Muchas proteínas endógenas incorporan dominios en superhélice. El dominio en superhélice puede estar implicado en el plegamiento de proteínas (por ejemplo, interactúa con varios motivos en hélice alfa dentro de la misma cadena proteica) o ser responsable de la interacción proteína-proteína. En el último caso, la superhélice puede iniciar estructuras homo o hetero oligoméricas.
El uso de un dominio espaciador en superhélice hace que el CAR se multimerice en la superficie celular, aumentando eficazmente la concentración local de dominios de unión a antígeno. Esto es particularmente útil para dirigirse a antígenos de baja densidad. CD22 está presente en una densidad relativamente baja en los linfocitos B, y se detecta en un número de copias de aproximadamente 30.000 moléculas/célula en comparación con 100.000-150.000 moléculas/célula de CD20.
El uso de un espaciador en superhélice genera un CAR hipersensible a medida que aumenta la valencia del CAR. El uso de un dominio espaciador en superhélice aumenta el número de ITAM presentes y la avidez del complejo CAR oligomérico.
La estructura de los dominios en superhélice es bien conocida en la técnica. Por ejemplo, como describe por Lupas y Gruber (Advances in Protein Chemistry; 2007; 70; 37-38).
Las superhélices habitualmente contienen un patrón repetido, hxxhcxc, de residuos de aminoácidos hidrófobos (h) y cargados (c), denominados una repetición en héptada. Las posiciones en la repetición en héptada habitualmente se etiquetan como abcdefg, donde a y d son las posiciones hidrófobas, a menudo ocupadas por isoleucina, leucina o valina. Plegar una secuencia con este patrón de repetición en una estructura secundaria en hélice alfa hace que los residuos hidrófobos se presenten como una "franja" que se enrolla suavemente alrededor de la hélice de manera levógira, formando una estructura anfipática. La forma más favorable para que dos de tales hélices se dispongan en el citoplasma es que las hebras hidrófobas se envuelvan una contra otra, dispuestas entre los aminoácidos hidrófilos. Por lo tanto, es el entierro de las superficies hidrófobas lo que proporciona la fuerza motriz termodinámica para la oligomerización. El empaquetamiento en una interfaz en superhélice es excepcionalmente apretado, con contacto de van der Waals casi completo entre las cadenas laterales de los residuos a y d.
Las hélices a pueden ser paralelas o antiparalelas, y habitualmente adoptan una superhélice levógira. Aunque menos probables, también se han observado en la naturaleza y en proteínas diseñadas algunas superhélices dextrógiras. El dominio en superhélice es capaz de formar un multímero en superhélice de manera que se forme un complejo CAR multimérico.
La relación entre la secuencia y la estructura plegada final de un dominio en superhélice se entiende bien en la técnica (Mahrenholz et al.; Molecular & Cellular Proteomics; 2011; 10(5):M110.004994). Como tal, el dominio en superhélice puede ser un dominio en superhélice generado de forma sintética.
Los ejemplos de proteínas que contienen un dominio en superhélice incluyen, pero sin limitación, proteína motora kinesina, antígeno delta de hepatitis D, proteína nuclear de la RNPp de caja C/D de arqueas, proteína oligomérica de la matriz del cartílago (POMC), proteína de unión a manosa A, proteína rica en serina en superhélice 1, factor de liberación de polipéptido 2, SNAP-25, SNARE, represor Lac o apolipoproteína E.
A continuación, se muestra la secuencia de diversos dominios en superhélice:
Proteína motora kinesina: homodímero paralelo (SEQ ID No. 15)
MHAALSTEVVHLRQRTEELLRCNEQQAAELETCKEQLFQSNMERKELHNTVMDLR
GN
Antígeno delta de hepatitis D: homodímero paralelo (SEQ ID No. 16) GREDILEQWVSGRKKLEELERDLRKLKKKIKKLEEDNPWLGNIKGIIGKY
Proteína nuclear de la RNPp de caja C/D de arqueas: heterodímero antiparalelo (SEQ ID No. 17)
RYVVALVKALEEIDESINMLNEKLEDIRAVKESEITEKFEKKIRELRELRRDVEREIEEV
M
Proteína de unión a manosa A: homotrímero paralelo (SEQ ID No. 18) AIEVKLANMEAEINTLKSKLELTNKLHAFSM
Proteína rica en serina en superhélice 1: homotrímero paralelo (SEQ ID No. 19) EWEALEKKLAALESKLQALEKKLEALEHG
Factor de liberación de polipéptido 2: heterotrímero antiparalelo
Cadena A: INPVNNRIQDLTERSDVLRGYLDY (SEQ ID No. 20)
Cadena B: VVDTLDQMKQGLEDVSGLLELAVEADDEETFNEAVAELDALEEKLAQLEFR (SEQ ID No. 21) SNAP-25 y SNARE: heterotetrámero paralelo
Cadena A: IETRHSEIIKLENSIRELHDMFMDMAMLVESQGEMIDRIEYNVEHAVDYVE (SEQ ID No. 22) Cadena B:
ALSEIETRHSEIIKLENSIRELHDMFMDMAMLVESQGEMIDRIEYNVEHAVDYVERA VSDTKKAVKY (SEQ ID No. 23)
Cadena C:
ELEEMQRRADQLADESLESTRRMLQLVEESKDAGIRTLVMLDEQGEQLERIEE GMDQINKDMKEAEKNL
(SEQ ID No.24)
Cadena D: IETRHSEIIKLENSIRELHDMFMDMAMLVESQGEMIDRIEYNVEHAVDYVE (SEQ ID No. 25) Represor lac: homotetrámero paralelo
SPRALADSLMQLARQVSRLE (SEQ ID No. 26)
Apolipoproteína E: heterotetrámero antiparalelo SGQRWELALGRFWDYLRWVQTLSEQVQEELLSSQVTQELRALMDETMKELKAYKS ELEEQLTARLSKELQAAQARLGADMEDVCGRLVQYRGEVQAMLGQSTEELRVRLA SHLRKLRKRLLRDADDLQKRLAVYQA (SEQ ID No. 27)
El dominio en superhélice es capaz de multimerizarse. Dependiendo de la secuencia seleccionada, el dominio en superhélice puede ser capaz de formar, por ejemplo, un trímero, un tetrámero, un pentámero, un hexámero o un heptámero.
El dominio en superhélice puede ser el dominio en superhélice de COMP.
COMP es uno de los complejos proteicos más estables en la naturaleza (estable de 0 °C-100 °C y un amplio intervalo de pH) y solo se puede desnaturalizar con clorhidrato de guanidina 4-6 M. El dominio en superhélice de COMP es capaz de formar un pentámero. COMP también es una proteína que se expresa de forma endógena que se expresa de manera natural en el espacio extracelular. Esto reduce el riesgo de inmunogenicidad en comparación con los espaciadores sintéticos. Además, se ha resuelto la estructura cristalina del motivo en superhélice de COMP, lo que proporciona una estimación precisa de la longitud del separador. La estructura de COMP tiene una longitud de ~5,6 nm (en comparación con los dominios bisagra y CH2CH3 de la IgG humana, que son de ~ 8,1 nm).
El dominio en superhélice puede consistir en o comprender la secuencia mostrada como SEQ ID No. 28 o un fragmento de la misma. SEQ ID No. 28
DLGPQMLRELQETNAALQDVRELLRQQVREITFLKNTVMECDACG
Es posible truncar el dominio en superhélice de COMP en el extremo N-terminal y mantener la expresión superficial. Por lo tanto, el dominio en superhélice puede comprender o consistir en una versión truncada de la SEQ ID No. 28, que está truncada en el extremo N-terminal. La COMP truncada puede comprender los 5 aminoácidos C-terminales de la SEQ ID No. 28, es decir, la secuencia CDACG (SEQ ID No. 35). La COMP truncada puede comprender de 5 a 44 aminoácidos, por ejemplo, al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 o 40 aminoácidos. La COMP truncada puede corresponder al extremo C-terminal de la SEQ ID No. 28. Por ejemplo, una COMP truncada que comprende 20 aminoácidos puede comprender las secuencias QQVREITFLKNTVMECDACG (SEQ ID No. 36). La COm P truncada puede conservar el resto (o restos) de cisteína implicados en la multimerización. La COMP truncada puede conservar la capacidad de formar multímeros.
Se conocen diversos dominios en superhélice que forman hexámeros, tales como gp41 procedente del VIH, y una proteína artificial designada superhélice hexamérica descrita por N. Zaccai et al. (2011) Nature Chem. Bio., (7) 935­ 941). Una forma mutante de la cremallera de leucina de GCN4-p1 forma una estructura en superhélice heptamérica (J. Liu. et al., (2006) PNAS (103) 15457-15462).
El dominio en superhélice puede comprender una variante de uno de los dominios en superhélice descritos anteriormente, siempre que la secuencia variante conserve la capacidad de formar un oligómero en superhélice. Por ejemplo, el dominio en superhélice puede comprender una variante de la secuencia mostrada como SEQ ID No. 15 a 28, que tiene al menos un 80, 85, 90, 95, 98 o un 99 % de identidad de secuencia, siempre que la secuencia variante conserve la capacidad de formar un oligómero en superhélice.
DOMINIO TRANSMEMBRANA
El dominio transmembrana es la secuencia del CAR que se extiende por la membrana.
Un dominio transmembrana puede ser cualquier estructura de proteína que sea termodinámicamente estable en una membrana. Esto es típicamente una hélice alfa que comprende varios residuos hidrófobos. El dominio transmembrana de cualquier proteína transmembrana se puede usar para suministrar la porción transmembrana de la invención. Los expertos en la técnica pueden determinar la presencia y la extensión de un dominio transmembrana de una proteína utilizando el algoritmo TMHMM http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/). Además, dado que el dominio transmembrana de una proteína es una estructura relativamente sencilla, es decir, una secuencia de polipéptidos prevista para formar una hélice alfa hidrófoba de longitud suficiente para abarcar la membrana, también se puede usar un dominio TM diseñado artificialmente (el documento US 7052906 B1 describe componentes transmembrana sintéticos).
El dominio transmembrana puede obtenerse de CD28, que da una buena estabilidad de receptor.
El dominio transmembrana puede obtenerse de Tyrp-1 humana. La secuencia de transmembrana de tyrp-1 se muestra como la SEQ ID No. 29.
SEQ ID No. 29
IIAIAVVGALLLVALIFGTASYLI ENDODOMINIO
El CAR de la invención puede comprender o asociarse con un endodominio de activación, la porción de transmisión de señal del CAR. Después del reconocimiento del antígeno, el grupo de receptores, CD45 y CD148 nativos se excluyen de la sinapsis y se transmite una señal a la célula. El componente de endodominio más habitualmente usado es el de CD3-zeta que contiene 3 ITAM. Este transmite una señal de activación al linfocito T después de que se una al antígeno. CD3-zeta puede no proporcionar una señal de activación completamente competente y puede necesitarse una señalización coestimuladora adicional. Por ejemplo, se pueden usar CD28 y OX40 quiméricos con CD3-Zeta para transmitir una señal proliferativa/de supervivencia, o se pueden usar los tres juntos.
El endodominio puede comprender:
(i) un endodominio que contiene ITAM, tal como el endodominio de CD3 zeta; y/o
ii) un dominio coestimulador, tal como el endodominio de CD28; y/o
(iii) un dominio que transmite una señal de supervivencia, por ejemplo, un endodominio de la familia de receptores de TNF, tal como OX-40 o 4-1BB.
Un endodominio que contenga un motivo ITAM puede actuar como un endodominio activador en la presente invención. Se sabe que varias proteínas contienen endodominios con uno o más motivos ITAM. Ejemplos de dichas proteínas incluyen la cadena épsilon de CD3, la cadena gamma de CD3 y la cadena delta de c D3, por nombrar algunas. El motivo ITAM puede reconocerse fácilmente como una tirosina separada de una leucina o isoleucina por otros dos aminoácidos, dando la firma YxxL/I. Típicamente, pero no siempre, dos de estos motivos están separados por entre 6 y 8 aminoácidos en la cola de la molécula (YxxL/lx(6-8)YxxL/I). Por lo tanto, un experto en la técnica puede encontrar fácilmente proteínas existentes que contienen uno o más ITAM para transmitir una señal de activación. Además, dado que el motivo es sencillo y no se requiere una estructura secundaria compleja, un experto en la técnica pueden diseñar polipéptidos que contengan ITAM artificiales para transmitir la señal de activación (véase el documento WO 2000/063372, que se refiere a moléculas de señalización sintéticas).
Las secuencias de algunos endodominios y dominios coestimuladores se proporcionan a continuación.
SEQ ID No. 30 (endodominio coestimulador de CD28) SKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS SEQ ID No. 31 (endodominio de OX40)
RDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI SEQ ID No. 32 (endodominio de 4-1BB)
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL SEQ ID No. 33 (endodominio de CD3zeta)
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNP
QEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQAL
PPR
El CAR de la invención puede comprender una variante de cualquiera de las secuencias mostradas como SEQ ID No. 30-33, que tiene al menos un 80, 85, 90, 95, 98 o un 99 % de identidad de secuencia, siempre que la secuencia variante conserve la capacidad de inducir la señalización de linfocitos T tras el reconocimiento del antígeno, es decir, proporcionar la señal de activación/proliferación o supervivencia relevante a los linfocitos T.
SECUENCIA DE ÁCIDO NUCLEICO
El segundo aspecto de la invención se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR como se define en el primer aspecto de la invención.
La secuencia de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, un ARN, un ADN o una secuencia de ADNc.
La secuencia de ácido nucleico puede tener la siguiente estructura:
AgB-espaciador-TM o
AgB-espaciador-TM-endo
en la que
AgB es una secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio de unión a antígeno;
espaciador es una secuencia de ácido nucleico que codifica el espaciador; y
TM es una secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio transmembrana.
CONSTRUCCIÓN DE ÁCIDO NUCLEICO
La presente invención también proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende al menos dos secuencias de ácido nucleico: una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR de la invención; y una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica, por ejemplo, un segundo CAR o un gen suicida.
El segundo CAR puede unirse a CD19.
El ácido nucleico puede producir un polipéptido que comprende las dos moléculas CAR (o CAR y un gen suicida) unidas por un sitio de escisión. El sitio de escisión puede ser autoescindible, de modo que cuando se produce el polipéptido, se escinde inmediatamente en el primer y segundo CAR sin necesidad de ninguna actividad de escisión externa.
Se conocen diversos sitios de autoescisión, incluido el péptido 2A del virus de la fiebre aftosa (FMDV) y una secuencia similar (Donnelly et al., Journal of General Virology (2001), 82, 1027-1041), por ejemplo como la secuencia de tipo 2A del virus Thosea asigna que tiene la secuencia que se muestra como SEQ ID No. 34:
SEQ ID No. 34
RAEGRGSLLTCGDVEENPGP.
La secuencia de coexpresión puede ser una secuencia de entrada interna al ribosoma (IRES). La secuencia de coexpresión puede ser un promotor interno.
Cuando la construcción de ácido nucleico codifica dos CAR, puede tener la siguiente estructura:
AgB1-espaciador1-TM1-coexpr-AbB2-espaciador2-TM2
en la que
AgB1 es una secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio de unión a antígeno de un primer CAR; espaciador 1 es una secuencia de ácido nucleico que codifica el espaciador de un primer CAR;
TM1 es una secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio transmembrana de un primer CAR; coexpr es una secuencia de ácido nucleico que permite la coexpresión de ambos CAR
AgB2 es una secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio de unión a antígeno de un segundo CAR; espaciador 2 es una secuencia de ácido nucleico que codifica el espaciador de un segundo CAR;
t M2 es una secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio transmembrana de un segundo CAR; cuya secuencia de ácido nucleico, cuando se expresa en una célula, codifica un polipéptido que se escinde en el sitio de escisión de manera que el primer y segundo CAR se coexpresan en la superficie celular.
Uno o ambos CAR también pueden comprender un endodominio. Cuando ambos CAR comprenden un endodominio, la construcción de ácido nucleico puede tener la estructura:
AgB1-espaciador1-TM1-endo1-coexpr-AbB2-espaciador2-TM2-endo2
Se pueden usar codones alternativos en regiones de secuencia que codifican secuencias de aminoácidos iguales o similares, para evitar la recombinación homóloga.
Los genes suicidas codifican polipéptidos que son capaces de provocar la apoptosis de la célula en la que se expresan en determinadas condiciones. Por ejemplo, el gen tipo suicida RQR8 descrito en el documento WO2013/153391 provoca la apoptosis de la célula en presencia de rituximab.
VECTOR
La presente invención también proporciona un vector, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica CAR. Tal vector puede usarse para introducir la secuencia de ácido nucleico en una célula huésped de modo que exprese el CAR de la invención.
El vector puede ser, por ejemplo, un plásmido o un vector viral, tal como un vector retroviral o un vector lentiviral, o un vector basado en transposón o ARNm sintético.
El vector puede tener la capacidad de transfectar o transducir una célula, tal como un linfocito T.
CÉLULA
La presente invención se refiere a una celda que comprende un CAR de la presente invención.
La célula puede ser cualquier célula eucariota capaz de expresar un CAR en la superficie celular, tal como una célula inmunológica.
En particular, la célula puede ser una célula efectora inmune tal como un linfocito T o un linfocito citolítico natural (NK). Los linfocitos T son un tipo de linfocitos que desempeñan un papel central en la inmunidad mediada por células. Se pueden distinguir de otros linfocitos, tales como los linfocitos B y los linfocitos citolíticos naturales (linfocitos NK), por la presencia de un receptor de linfocitos T (TCR) en la superficie celular. Hay diversos tipos de linfocitos T, tal como se resume a continuación.
Los linfocitos T auxiliares (linfocitos TH) ayudan a otros glóbulos blancos en los procesos inmunológicos, incluyendo la maduración de linfocitos B en células plasmáticas y linfocitos B de memoria, y la activación de linfocitos T citotóxicos y macrófagos. Los linfocitos TH expresan CD4 en su superficie. Los linfocitos TH se activan cuando las moléculas MHC de clase II les presentan antígenos peptídicos en la superficie de las células presentadoras de antígenos (APC). Estas células pueden diferenciarse en uno de varios subtipos, incluyendo TH1, TH2, TH3, TH17, Th9 o TFH, que secretan diferentes citocinas para facilitar diferentes tipos de respuestas inmunitarias.
Los linfocitos T citotóxicos (linfocitos TC o CTL) destruyen las células infectadas por virus y las células tumorales, y también están implicadas en el rechazo de trasplantes. Los CTL expresan el CD8 en su superficie. Estas células reconocen sus dianas al unirse al antígeno asociado con MHC clase I, que está presente en la superficie de todas las células nucleadas. A través de la IL-10, la adenosina y otras moléculas secretadas por los linfocitos T reguladores, las células CD8+ pueden inactivarse a un estado anérgico, que previene enfermedades autoinmunitarias tales como la encefalomielitis autoinmunitaria experimental.
Los linfocitos T de memoria son un subconjunto de linfocitos T específicos de antígeno que persisten a largo plazo después de que se resuelve una infección. Se expanden rápidamente a un gran número de linfocitos T efectores tras la reexposición a su antígeno relacionado, proporcionando así al sistema inmune "memoria" contra infecciones pasadas. Los linfocitos T de memoria comprenden tres subtipos: linfocitos T de memoria central (linfocitos TCM) y dos tipos de linfocitos T efectores de memoria (linfocitos TEM y linfocitos TEMRA). Los linfocitos de memoria pueden ser CD4+ o CD8+. Los linfocitos T de memoria típicamente expresan la proteína de la superficie celular CD45RO.
Los linfocitos T reguladores (linfocitos Treg), anteriormente conocido como linfocitos T supresores, son cruciales para el mantenimiento de la tolerancia inmunológica. Su función principal es detener la inmunidad mediada por linfocitos T hacia el final de una reacción inmunitaria y suprimir linfocitos T autorreactivos que escaparon al proceso de selección negativa en el timo.
Se han descrito dos clases principales de linfocitos Treg CD4+: los linfocitos Treg naturales y los linfocitos Treg adaptativos.
Los linfocitos Treg de origen natural (también conocidos como linfocitos Treg CD4+CD25+FoxP3+) surgen en el timo y se han relacionado con interacciones entre los linfocitos T en desarrollo con células dendríticas mieloides (CD11c+) y plasmacitoides (CD123+) que se han activado con TSLP. Los linfocitos Treg de origen natural se pueden distinguir de otros linfocitos T por la presencia de una molécula intracelular llamada FoxP3. Las mutaciones del gen FOXP3 pueden prevenir el desarrollo de linfocitos T reguladores, causando la enfermedad autoinmunitaria letal IPEX.
Los linfocitos Treg adaptativos (también conocidos como linfocitos Tr1 o linfocitos Th3) pueden originarse durante una respuesta inmunitaria normal.
La célula de la invención puede ser cualquiera de los tipos de linfocitos T mencionados anteriormente, en particular un CTL.
Los linfocitos citolíticos naturales (NK) son un tipo de célula citolítica que forma parte del sistema inmunitario innato. Los linfocitos NK proporcionan respuestas rápidas a las señales innatas de las células infectadas por virus de manera independiente del MHC
Los linfocitos NK (que pertenecen al grupo de las células linfoides innatas) se definen como linfocitos granulares grandes (LGL) y constituyen el tercer tipo de células diferenciadas del progenitor linfoide común que genera linfocitos B y T.
Se sabe que los linfocitos NK se diferencian y maduran en la médula ósea, ganglio linfático, bazo, las amígdalas y el timo, donde luego entran en la circulación.
Las células con CAR de la invención pueden ser cualquiera de los tipos de células mencionados anteriormente. Las células que expresan CAR, tales como los linfocitos T o NK que expresan CAR pueden ser creadas ex vivo ya sea de la propia sangre periférica del paciente (1a parte), o en el contexto de un trasplante de células madre hematopoyéticas de sangre periférica del donante (2a parte), o de sangre periférica de un donante no relacionado (3a parte).
La presente invención también proporciona una composición celular que comprende células que expresan CAR de acuerdo con la presente invención. La composición celular puede hacerse transduciendo una muestra de sangre ex vivo con un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención.
Como alternativa, las células que expresan CAR pueden derivarse de la diferenciación ex vivo de células progenitoras inducibles o células progenitoras embrionarias al tipo de célula relevante, tales como linfocitos T. Como alternativa, se puede usar una línea celular inmortalizada tal como una línea de linfocitos T que conserva su función lítica y podría actuar como un agente terapéutico.
En todas estas realizaciones, las células con CAR se generan mediante la introducción de ADN o ARN que codifica los CAR por uno de los muchos medios, incluida la transducción con un vector viral, la transfección con ADN o ARN. Un linfocito T con CAR de la invención puede ser un linfocito T ex vivo de un sujeto. El linfocito T puede ser de una muestra de células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Los linfocitos T pueden activarse y/o expandirse antes de ser transducidos con ácido nucleico que codifica CAR, por ejemplo, mediante tratamiento con un anticuerpo monoclonal anti-CD3.
Un linfocito T con CAR de la invención puede hacerse mediante:
(i) aislamiento de una muestra que contiene linfocitos T de un sujeto u otras fuentes enumeradas anteriormente; y (ii) transducción o transfección de los linfocitos T con una o más secuencias de ácido nucleico que codifican el primer y el segundo CAR.
Después, los linfocitos T pueden purificarse, por ejemplo, seleccionarse en base de la coexpresión del primer y segundo CAR.
COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA
La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que contiene una pluralidad de células que expresan CAR, tales como linfocitos T o linfocitos NK de acuerdo con la invención. La composición farmacéutica puede comprender adicionalmente un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede comprender opcionalmente uno o más polipéptidos y/o compuestos farmacéuticamente activos adicionales. Dicha formulación puede estar, por ejemplo, en una forma adecuada para infusión intravenosa.
MÉTODO DE TRATAMIENTO
Las células de la presente invención son capaces de destruir células cancerosas, tales como células de linfoma de linfocitos B. Las células que expresan CAR, tales como linfocitos T, pueden ser creadas ex vivo ya sea de la propia sangre periférica del paciente (1a parte), o en el contexto de un trasplante de células madre hematopoyéticas de sangre periférica del donante (2a parte), o de sangre periférica de un donante no relacionado (3a parte). Como alternativa, los linfocitos T con CAR pueden derivarse de la diferenciación ex vivo de células progenitoras inducibles o células progenitoras embrionarias con respecto a linfocitos T. En estos casos, los linfocitos T con CAR se generan mediante la introducción de ADN o ARN que codifica el CAR por uno de muchos medios, incluyendo la transducción con un vector viral, la transfección con ADN o ARN.
Las células de la presente invención pueden ser capaces de destruir células diana, tales como células cancerosas. La célula diana es reconocible por la expresión de CD22.
Tabla 4 - Expresión de antígenos linfoides en leucemias linfoides
CD19 CD22 CD10 CD7 CD5 CD3 clg p slg p
pre-B tempranos 100 >95 95 5 0 0 0 0
Pre-B 100 100 >95 0 0 0 100 0
pre-B de transición 100 100 50 0 0 0 100 0
B 100 100 50 0 0 0 >95 >95
T <5 0 0 100 95 100 0 0
Tomado de Campana et al. (Immunophenotyping of leukemia. J. Immunol. Methods 243, 59-75 (2000)). clg p - cadena pesada de inmunoglobulina citoplásmica; slg p - cadena pesada de inmunoglobulina de superficie.
La expresión de antígenos linfoides comúnmente estudiados en diferentes tipos de leucemias de linfocitos B refleja fielmente la de la ontogenia de linfocitos B (véase la figura 2).
Las células de la presente invención pueden usarse para tratar un cáncer, en particular, neoplasias de linfocitos B. Ejemplos de cánceres que expresan CD22 son linfomas de linfocitos B, incluyendo linfoma de Hodgkin y linfoma no Hodgkin; y leucemias de linfocitos B.
Por ejemplo, el linfoma de linfocitos B puede ser linfoma difuso de linfocitos B grandes (DLBCL), linfoma folicular, linfoma de la zona marginal (MZL) o linfoma de tejido linfático asociado a mucosas (MALT), linfoma linfocítico de células pequeñas (se superpone con leucemia linfocítica crónica), linfoma de células del manto (MCL), linfoma de Burkitt, linfoma de linfocitos B grandes mediastinales (tímicos) primario, linfoma linfoplasmocítico (puede manifestarse como macroglobulinemia de Waldenstrom), linfoma nodal de zona marginal de linfocitos B (NMZL), linfoma esplénico de zona marginal (SMZL), linfoma de linfocitos B grandes intravascular, linfoma de derrame primario, granulomatosis linfomatoide, linfoma de linfocitos B grandes rico en linfocitos T/histiocitos o linfoma primario del sistema nervioso central.
La leucemia de linfocitos B puede ser leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica de linfocitos B, leucemia prolinfocítica de linfocitos B, leucemia linfoblástica precursora B o leucemia de células pilosas.
La leucemia de linfocitos B puede ser leucemia linfoblástica aguda.
El tratamiento con las células de la invención puede ayudar a prevenir el escape o la liberación de células tumorales que a menudo ocurre con estrategias convencionales.
La invención se describirá adicionalmente a continuación por medio de los Ejemplos, que pretenden servir para ayudar a un experto en la materia a poner en práctica la invención y que de ninguna manera pretenden limitar el alcance de la invención.
Ejemplos
Ejemplo 1 - Ensayos funcionales comparativos con CAR anti-CD22
Se creó un panel de CAR que comprendía dominios de unión derivados de diversos anticuerpos anti-CD22 diferentes, y se comparó su función.
El CAR que comprende un scFv basado en M971 puede considerarse como el estándar de oro, ya que este CAR está en desarrollo clínico.
Los CAR se construyeron y se expresaron basándose en los mAb RFB4, m971, m972, g5/44, hLL2, LT22 y LT22 murino. Su estructura se muestra en la figura 3. Los CAR se diferenciaron únicamente en su dominio de unión a antígeno. En todas las construcciones, los dominios de unión se unieron a la membrana con un espaciador bisagra de IgG1 y contenían motivos activadores intracelulares de 41BB y CD3-zeta.
Los retrovirus se produjeron mediante transfección transitoria de células 293T con plásmidos que codificaban los CAR, gag/pol y la proteína de envoltura RD114. Después de 3 días, los sobrenadantes se recogieron y se usaron para transducir PBMC activadas con PHA/IL2 con títulos iguales de retrovirus en placas recubiertas con retronectina. Seis días después de la transducción, la expresión de CAR se confirmó mediante citometría de flujo y las PBMC se cultivaron conjuntamente en una relación E:T de 1:1 y 4:1 con células diana Raji. La destrucción de las células diana se ensayó después de 72 horas de cultivo conjunto. Se eliminaron los sobrenadantes y los niveles de interferón-Y se ensayaron mediante ELISA.
Los resultados se muestran en las figuras 4 y 5.
El CAR que tenía un dominio de unión g5/44 mostró la mejor actividad de destrucción en una relación E:T de 4:1 y 1:1 (figura 4). El CAR que tenía un dominio de unión g5/44 también mostró una liberación máxima de interferón gamma después de 72 horas de cultivo conjunto en una relación E:T de 4:1 y 1:1 (figura 5).
Como se ha analizado en la sección de Antecedentes anterior, existe un entendimiento ampliamente aceptado en el campo de que a) la activación de linfocitos T depende críticamente de la longitud combinada del TCR/CAR y el antígeno en la sinapsis de linfocitos T-células diana; b) CD22 es intrínsecamente difícil de dirigir con un CAR porque tiene tal dominio extracelular largo, y c) es fundamental dirigirse a un epítopo proximal a la membrana de CD22 para obtener una actividad de destrucción satisfactoria (Haso et al. (2013, como anteriormente); James et al. (2008 como anteriormente); y Long et al. (2013, Oncolmmunology 2:4 e23621).
James et al. (2008, como anteriormente) describen un estudio en el que se comparan dos CAR anti-CD22: uno que tiene un dominio de unión a antígeno basado en HD39, que une el dominio 1 de Ig más distal de membrana de CD22, y uno que tiene un dominio de unión a antígeno basado en RFB4 que se une al dominio 3 de Ig más proximal a la membrana de CD22 (James et al. 2008, figura 1B). Se encontró que el CAR basado en RBF4 producía un nivel más alto de lisis máxima que el CAR basado en HD39, lo que se atribuyó a las diferencias en la distancia entre los epítopos del antígeno diana.
Haso et al. (2013, como anteriormente) describen un estudio en el que se comparan tres CAR anti-CD22: uno que tiene un dominio de unión a antígeno basado en HA22, que se une al dominio 3 de Ig de CD22; uno que tiene un dominio de unión a antígeno basado en BL22, que también se une al dominio 3 de Ig de CD22; y uno que tiene un dominio de unión a antígeno basado en m971, que se une al dominio 5-7 de Ig más proximal a la membrana de CD22. El CAR derivado de m971 mostró una actividad de destrucción de células diana superior a cualquiera de los CAR que se unen al dominio 3 de Ig de CD22. Este hallazgo coincidió con los resultados anteriores de James et al. y aparentemente confirmó que el direccionamiento a un dominio proximal a la membrana de CD22 es fundamental para desarrollar un CAR anti-CD22 eficaz.
Los resultados mostrados aquí en las figuras 4 y 5 son, por lo tanto, particularmente sorprendentes, ya que g5/44 se une al dominio 1 de Ig N-terminal extremo de CD22 que es el epítopo más distal a la membrana de CD22 para todos los CAR ensayados. Como se muestra en la figura 2, hLL2, LT22 y RFB4 se unen todos al dominio 3 de Ig y m971 y m972 se unen a los dominios 5-7 de Ig de CD22. Se espera de los hallazgos de James et al. (2008, como anteriormente), Haso et al. (2013, como anteriormente) y el mecanismo molecular subyacente previamente aceptado, que los CAR que se unen a los dominios 5-7 de Ig proporcionen la mejor actividad de destrucción, seguido de los CAR que se unen al dominio 3 de Ig, y que el CAR que se une al dominio 1 de Ig proporcione la peor actividad de destrucción. Por el contrario, el CAR basado en g5/44 superó a todos los CAR que se unen a epítopos más proximales a la membrana.

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende un dominio de unión a CD22 que comprende a) una región variable de cadena pesada (VH) que tiene regiones determinantes de complementariedad (CDR) con las siguientes secuencias:
CDR1 - NYWIH (SEQ ID No. 1);
CDR2 - GINPGNNYATYRRKFQG (SEQ ID No. 2)
CDR3 - EGYGNYGAWFAY (SEQ ID No. 3); y
b) una región variable de cadena ligera (VL) que tiene CDR con las siguientes secuencias:
CDR1 - RSSQSLANSYGNTFLS (SEQ ID No. 4);
CDR2 - GISNRFS (SEQ ID No. 5)
CDR3 - LQGTHQPYT (SEQ ID No. 6).
2. Un CAR de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el dominio de unión a CD22 comprende un dominio VH que tiene la secuencia mostrada como la SEQ ID No. 7; o un dominio VL que tiene la secuencia mostrada como SEQ ID No 8 o una variante de la misma, que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia que conserva la capacidad de unirse a CD22.
3. Un CAR de acuerdo con cualquier reivindicación anterior que comprende un dominio espaciador seleccionado de los siguientes: un dominio Fc de IgG1 humana; una bisagra de IgG1; una bisagra de IgG1-pedúnculo de CD8; un pedúnculo de CD8; o un dominio espaciador en superhélice.
4. Una secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR de acuerdo con cualquier reivindicación anterior.
5. Una construcción de ácido nucleico que comprende una primera secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4 y una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica otro CAR o un gen suicida.
6. Un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4 o una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5.
7. Una célula que expresa un CAR se acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
8. Un método para fabricar una célula de acuerdo con la reivindicación 7, que comprende la etapa de introducir una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4, o una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5 en una célula ex vivo.
9. Una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de células de acuerdo con la reivindicación 7.
10. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 9 para su uso en un método para tratar una enfermedad en un sujeto.
11. Una composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 10, en la que la enfermedad es una neoplasia de linfocitos B.
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