ES2843099T3 - Nanoporos biológicos para la detección y la secuenciación de biopolímeros basados en la actinoporina FraC - Google Patents

Abstract

Un sistema que comprende un nanoporo proteico en forma de embudo que comprende una toxina formadora de poros α helicoidales que es un miembro de la familia de las proteínas actinoporinas, en donde la toxina formadora de poros α helicoidales es una Fragaceatoxina C mutante (FraC) que comprende una mutación en la posición 10 en un residuo de aminoácido cargado positivamente o neutro.

Description

DESCRIPCIÓN

Nanoporos biológicos para la detección y la secuenciación de biopolímeros basados en la actinoporina FraC

La descripción se refiere generalmente al campo de los nanoporos y sus usos en varias aplicaciones, tales como el análisis de biopolímeros y macromoléculas, típicamente mediante la modalidad de medidas eléctricas durante la translocación a través de los nanoporos.

Los nanoporos representan una forma atractiva de analizar biopolímeros, por ejemplo, para determinar la identidad de un polipéptido o polinucleótido, o para estimar la identidad de los bloques de construcción individuales en el polímero con fines de secuenciación. Esto se debe a que el método no tiene etiquetas, proporciona mediciones que dependen de números pequeños o incluso de moléculas individuales, y genera una señal eléctrica que es altamente escalable.

En un sistema de medición que utiliza un nanoporo, alguna propiedad del sistema depende de los nucleótidos en el nanoporo, y se toman mediciones eléctricas de esa propiedad. Por ejemplo, se creará un sistema de medición mediante la colocación de un nanoporo en una membrana aislante y la medición del flujo de iones controlado por la tensión a través del nanoporo en presencia de los nucleótidos del polinucleótido.

Los nanoporos han surgido como un enfoque poderoso para el monitoreo de reacciones químicas y enzimáticas de una sola molécula, la detección de proteínas y la secuenciación de ácidos nucleicos. [1], [2]. Se ha demostrado que Phi29 [3] así como también ClyA [4] permiten la translocación del ADN de doble hebra. Recientemente, se usó la aerolisina para discriminar los homopolímeros que consisten de adenina pero que difieren en longitud. [5] Hasta la fecha, solo se ha demostrado que aHL y MspA discriminan los ácidos nucleicos. Ambos nanoporos tienen láminas p en su región transmembrana. Cuando el ADN pasa a través de MspA, los niveles de bloqueo de corriente se afectan por cuatro o más nucleótidos [6], mientras que aHL tiene tres zonas de detección en su estructura en forma de barril, que aloja aproximadamente 20 nucleobases. [7]

La presente descripción proporciona nuevos nanoporos con diferentes estructuras y sitios de reconocimiento que ofrecen mejoras en la precisión de la secuenciación y/o proporcionan diferentes perfiles de error. En la presente descripción, describimos la purificación y preoligomerización de la Fragaceatoxina C (FraC), una toxina formadora de poros a helicoidales que es un miembro de la familia de las proteínas actinoporinas, en complejo con la esfingomielina y la reconstitución en bicapas lipídicas planas compuestas por 1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPhPC). Los presentes inventores además diseñaron un mutante FraC (por ejemplo, ReFraC) que permitió la captura y la translocación del ADNmc y los homopolímeros discriminados de adenina, timina y citosina inmovilizados con neutravidina (NA). Sorprendentemente, el ADNbc podría translocarse a través de FraC, muy probablemente a través de la constricción a helicoidal deformada elásticamente del nanoporo.

En particular, se encontró que el nanoporo de FraC tiene una forma ideal para la secuenciación de proteínas y el análisis de proteínas plegadas. Más abajo en la presente descripción, se muestra que el flujo electroosmótico es la fuerza dominante que induce la entrada de proteínas y polipéptidos dentro del nanoporo. Al ajustar la superficie interna del nanoporo, ya sea mediante la ingeniería precisa de la constricción del nanoporo o al cambiar el pH de la solución, podría observarse la translocación de los polipéptidos cargados tanto positiva como negativamente. Esto es notable, porque muestra que es posible inducir un flujo electroosmótico que es lo suficientemente fuerte como para transportar residuos tanto positivos como negativos a un potencial aplicado fijo. Se encontró notablemente que una serie de proteínas (desplegadas) de diferentes tamaños, por ejemplo, que varían de 1,2 a 25 kDa, pueden distinguirse sobre la base de los bloqueos individuales. Mediante el uso de un polipéptido modelo de 20 aminoácidos, se demuestra que incluso las diferencias en un solo residuo de aminoácido pueden observarse mediante los registros de los nanoporos, lo que indica que los nanoporos de FraC permiten la identificación de las características de secuencia específicas en polipéptidos translocantes.

Además, los inventores idearon un método para reconstituir los nanoporos de FraC preoligomerizados en las bicapas lipídicas planas sin esfingomielina. El nanoporo de ReFraC fue modificado para permitir la captura de ADN electroforético y mostró discriminación entre los homopolímeros del ADNmc. Los nanoporos basados en aHL o MspA, se han usado previamente para secuenciar el ADN. La patente WO2010/034018 A2 describe un sistema que comprende un nanoporo de Msp, típicamente MspA, y sus mutantes, en donde el nanoporo se ubica entre un primer y un segundo líquido. Este sistema se usa para secuenciar y detectar los analitos tales como los ácidos nucleicos, péptidos o polímeros.

Por el contrario a otros nanoporos usados para secuenciar el ADN (por ejemplo, aHL y MspA), FraC tiene una región transmembrana a helicoidal en forma de V. Ver, por ejemplo, Tanaka y otros [8] (Nature Communications 2015, 6, 6337), que describe estructuras cristalinas para los monómeros de FraC solubles en agua y unidos a lípidos. Tanaka también describe la preparación de los mutantes FraC Trp112Arg, Trp116Phe, Val8Cys, Lys69CysOX, Trp149Ala y Val60Glu, y su ensamble en un nanoporo.

Morante y otros. (J. Biol. Chem. 2015, 290, 10850-10861) describen mutantes de FraC en donde Phe16 está mutado en Pro, Ala o Gly, y destaca la importancia del residuo nativo Phe16 para la formación de los poros de FraC en las membranas ricas en colesterol.

La región transmembrana a helicoidal en forma de V del poro de FraC es ventajosa para ajustar la discriminación de la nucleobase. Esto se debe a que las sustituciones de aminoácidos en diferentes posiciones dentro de las hélices a transmembrana pueden modular tanto el tamaño como la composición química de la constricción.

También se muestra en la presente descripción que ReFraC induce la descompresión de los dúplex de ADN a potenciales bajos aplicados, o permite su translocación a un potencial alto aplicado. La descompresión de las horquillas de ADN o las estructuras de ADN de orden superior se ha investigado mediante el uso del nanoporo de aHL. [20], [2 l] Sin embargo, el vestíbulo cis de ReFraC (5,5 nm) es más ancho que el de aHL (2,6 nm) [13] o MspA (4,8 nm) [22], lo que indica que FraC puede emplearse ventajosamente para estudiar las estructuras más grandes del ADNbc de orden superior, tales como los G-cuádruples, o las estructuras de ARN plegadas tales como los ARNt.

En consecuencia, la descripción se refiere a un sistema que comprende un nanoporo proteico en forma de embudo que comprende una toxina formadora de poros a helicoidales que es un miembro de la familia de las proteínas actinoporinas. Más específicamente, la toxina formadora de poros a helicoidales es una Fragaceatoxina C mutante (FraC). La FraC puede fusionarse, preferentemente en su extremo terminal C, a un marcador de afinidad con las proteínas, como un marcador His o un marcador Strep.

Por ejemplo, la FraC mutante comprende al menos una sustitución de un residuo de aminoácido cargado negativamente en la parte estrecha del poro en un residuo de aminoácido neutro o cargado positivamente, y/o al menos una sustitución de un residuo de aminoácido neutro en la parte estrecha del poro en un residuo de aminoácido cargado positivamente.

En consecuencia, la invención proporciona un sistema que comprende un nanoporo proteico en forma de embudo que comprende una toxina formadora de poros a helicoidales que es un miembro de la familia de las proteínas actinoporinas, en donde, la toxina formadora de poros a helicoidales es una Fragaceatoxina C mutante (FraC) que comprende una mutación en la posición 10 (numeración de residuos como en la estructura cristalina PDB ID 4TSY) en un residuo de aminoácido neutro o cargado positivamente. Preferentemente, la FraC mutante comprende la mutación Asp 10Arg o Asp 10Lys. La FraC mutante puede comprender, además, una o más mutación (es) compensatorias para recuperar la actividad hemolítica de FraC, preferentemente en donde dicha mutación compensatoria está presente en la posición 2, 9, 34, 52, 112, 150, 153 y/o 159, y/o preferentemente en la posición 159. Por ejemplo, dicha mutación compensatoria se selecciona del grupo que consiste en A2S, I9T, A34V, F52Y, W112L, T150I, G153D, K159E, I171T y cualquiera de sus combinaciones. En un aspecto específico, la FraC mutante (además) comprende una mutación en la posición 159, preferentemente Lys159Glu. Por ejemplo, se usa la FraC doble mutante D10R/K159E.

El nanoporo puede colocarse entre un primer medio líquido y un segundo medio líquido, en donde al menos un medio líquido comprende un analito, y en donde el sistema es operativo para detectar una propiedad del analito.

En una modalidad, el sistema es operativo para translocar el analito a través del túnel. En otra modalidad, el sistema es operativo para detectar una propiedad del analito que comprende someter el nanoporo a un campo eléctrico de manera que el analito interactúe con el nanoporo. El potencial aplicado (que crea el campo eléctrico) es necesario para tener una corriente. La corriente es la señal de salida. Por ejemplo, el sistema es operativo para detectar una propiedad del analito que comprende someter el nanoporo a un campo eléctrico de manera que el analito se transloque electroforéticamente y/o electroosmóticamente a través del nanoporo y/o se quede atrapado en él. La propiedad puede ser una propiedad eléctrica, química o física del analito.

Preferentemente, el nanoporo se comprende en una bicapa lipídica (plana). En un aspecto específico, la bicapa lipídica comprende o consiste en fosfatidilcolina (PC), preferentemente 1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfocolina.

En un segundo aspecto, la descripción proporciona un método para proporcionar un sistema de acuerdo con la invención, que comprende las etapas de

- proporcionar los monómeros recombinantes de dicha FraC mutante;

- poner en contacto dichos monómeros con los liposomas para ensamblarlos en oligómeros;

- recuperar los oligómeros de los liposomas; y

- poner en contacto los oligómeros con una bicapa lipídica, que puede contener esfingomielina, para permitir la formación de los nanoporos.

En un tercer aspecto, la descripción proporciona un método que comprende aplicar un campo eléctrico a un sistema como se describe en la presente descripción, en donde el nanoporo en forma de embudo que comprende la FraC mutante se coloca entre un primer medio líquido conductor y un segundo medio líquido conductor. Al menos uno de los medios líquidos conductores puede comprender un analito. El método puede comprender, además, la etapa de detectar el analito en un método que comprende medir una corriente iónica cuando el analito interactúa con el nanoporo para proporcionar un patrón de corriente, en donde la aparición de un bloqueo en el patrón de corriente indica la presencia del analito. El método puede comprender además identificar el analito, por ejemplo al comparar el patrón de corriente con un patrón de corriente conocido obtenido mediante el uso de un analito conocido en las mismas condiciones. El analito puede ser un nucleótido, un ácido nucleico, un aminoácido, un péptido, una proteína, un polímero, un fármaco, un ion, un contaminante, un objeto nanoscópico, o un agente de guerra biológica.

En una modalidad, el analito es un polímero, tal como una proteína, un péptido, o un ácido nucleico. Preferentemente, el analito es un ácido nucleico, como el ADNmc, el ADNbc, el ARN, o sus combinaciones. En otro aspecto preferido, el analito es una proteína, un polipéptido o un oligopéptido, por ejemplo, que tiene un tamaño de aproximadamente 1 a aproximadamente 40 kDa, preferentemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 30 kDa. En una modalidad, el analito es un oligopéptido (~de 10 o menos aminoácidos), un polipéptido (> 10 aminoácidos) o una proteína plegada (> 50 aminoácidos).

En un método de la invención, el nanoporo de FraC es un nanoporo de FraC mutante, que comprende una mutación en la posición 10 en un aminoácido positivo o neutro. La conductancia a través del túnel del nanoporo de FraC mutante es típicamente más alta que la conductancia a través de su nanoporo de FraC de tipo salvaje correspondiente.

Otro aspecto más se refiere a un nanoporo de Fragaceatoxina C (FraC) mutante que comprende al menos un primer monómero de FraC mutante que comprende una sustitución en ambas posiciones 3 y 10. En una modalidad preferida, la FraC mutante comprende la mutación Asp10Arg o Asp10Lys (numeración de residuos como en la estructura cristalina PDB ID 4TSY). La FraC mutante puede comprender, además, una o más mutación (es) compensatorias para recuperar la actividad hemolítica de FraC, preferentemente en donde dicha mutación compensatoria está presente en la posición 2, 9, 34, 52, 112, 150, 153 y/o 159, y/o preferentemente en la posición 159. Por ejemplo, dicha mutación compensatoria se selecciona del grupo que consiste en A2S, I9T, A34V, F52Y, W112L, T150I, G153D, K159E, I171T y cualquiera de sus combinaciones. En un aspecto específico, la FraC mutante comprende además una mutación en la posición 159, preferentemente Lys159Glu. Pueden obtenerse muy buenos resultados con la FraC doble mutante D10R/K159E. Los mutantes específicamente preferidos incluyen los de la Tabla 3 en la presente descripción más abajo.

El nanoporo de FraC mutante puede comprender, además, al menos un segundo monómero seleccionado del grupo que consiste en un monómero de FraC de tipo salvaje, un segundo monómero de FraC mutante, un monómero parálogo u homólogo de FraC de tipo salvaje, y un monómero parálogo u homólogo de FraC mutante, en donde el segundo monómero de FraC mutante puede ser el mismo o diferente al primer monómero de FraC mutante. Por ejemplo, el segundo monómero es un monómero homólogo o parálogo de FraC de tipo salvaje. En una modalidad, el primer monómero de FraC mutante del nanoporo de FraC mutante comprende la mutación D10R, preferentemente en donde el mutante se selecciona de los representados en la Tabla 3.

El nanoporo de FraC mutante preferentemente tiene una conductancia a través del túnel que es más alta que la conductancia a través del túnel de su nanoporo de FraC de tipo salvaje correspondiente.

El nanoporo de FraC mutante puede comprender además un motor molecular, en donde el motor molecular es capaz de mover un analito hacia o a través del nanoporo con una velocidad de translocación promedio que es menor que la velocidad de translocación promedio a la que el analito se transloca hacia o a través del nanoporo en la ausencia del motor molecular. Por ejemplo, el motor molecular es una enzima, como una polimerasa, una exonucleasa, o un fragmento de Klenow.

Para el análisis de las proteínas, se prefiere tener un flujo electroosmótico (EOF), desde el compartimiento cis hasta el trans, que se induce por una constricción cargada. La translocación de los aminoácidos de la misma carga que la constricción puede obtenerse mediante la manipulación del pH de la solución del analito. Es ventajoso usar uno o más aminoácidos no naturales que mantengan una carga negativa a valores de pH bajos (<~4,5), por ejemplo los restos de sulfato (SO^42-) o fosfato (PO^42-) son grupos adecuados de la cadena lateral de los aminoácidos. Por lo tanto, también se proporciona un nanoporo que se modifica para tener un fuerte flujo electroosmótico desde el compartimiento cis hasta el trans bajo el potencial negativo aplicado (pH 4,5 o inferior).

La descripción también proporciona el uso de un sistema como se describe en la presente descripción, o un nanoporo de FraC mutante de acuerdo con la invención, para la detección de biopolímeros y/o la secuenciación de biopolímeros. Por ejemplo, dicho biopolímero es una proteína, un péptido o un ácido nucleico. Preferentemente, se proporciona el uso de un sistema como se describe en la presente descripción, o un nanoporo de FraC mutante de acuerdo con la invención, para detectar y/o secuenciar un ácido nucleico, como el ADNmc, ADNbc, ARN, o una proteína o un polipéptido, o sus combinaciones.

Por ejemplo, un nanoporo de FraC mutante se usa ventajosamente para reconocer biomarcadores de proteínas, polipéptidos y oligopéptidos. Una vez dentro de los nanoporos, las proteínas y los polipéptidos de diferentes tamaños pueden distinguirse por corrientes iónicas. Aunque los aminoácidos individuales no pudieron identificarse sobre la marcha durante la translocación, demostramos que dos oligopéptidos pequeños (desplegados), endotelina 1 y endotelina 2 (2,5 kDa), que se diferencian por un solo residuo de triptófano, podrían diferenciarse por los registros de la corriente iónica. Por lo tanto, si la translocación de un polipéptido puede controlarse, por ejemplo, mediante el uso de enzimas, los nanoporos de FraC permiten la identificación de las características específicas de la secuencia en la translocación de los polipéptidos.

En una modalidad, un nanoporo de FraC mutante que comprende una mutación en la posición 10 en un aminoácido neutro o cargado positivamente, se usa como un sensor en el análisis proteómico de una sola molécula. En la implementación más simple de la proteómica de nanoporos, las proteínas se reconocen aminoácido por aminoácido a medida que se traslocan linealmente a través de un nanoporo. Dado que la secuencia de proteínas y oligopéptidos en un organismo se conoce a partir del análisis genómico, las proteínas podrían reconocerse simplemente al comparar un bloqueo proteico específico durante la translocación desplegada a través de un nanoporo con una base de datos de bloqueos proteicos conocidos. Alternativamente, las proteínas plegadas podrían reconocerse a medida que se alojan dentro del vestíbulo del nanoporo con o sin la translocación en el nanoporo.

Leyenda de las figuras

Figura 1. Nanoporos de FraC de tipo salvaje (WtFraC) y FraC D10R-K159E (ReFraC). (A) Sección transversal a través de WtFraC octamérico que muestra la coloración de la superficie coulómbica (rojo = cargas negativas, azul = cargas positivas). Se indica el residuo de aspartato 10, que se ubica en la zona de constricción de WtFraC. (B) Vista superior de WtFraC (parte superior) y ReFraC (parte inferior). (C) Histograma de conductancia de un solo canal para WtFraC (azul) y ReFraC (rojo) a 50 mV en 1 M de NaCl, 15 mM de Tris-HCl, pH 7,5. (D) Traza sin procesar de WtFraC (parte superior) y ReFraC (parte inferior) a 100 mV en tampón de 3 M de NaCl, 15 mM de Tris-HCl, pH 7,5 obtenido con las configuraciones de adquisición idénticas (filtro de Bessel de paso bajo de 2 kHz y velocidad de muestreo de 10 kHz).

Figura 2. Discriminación de ADN con ReFraC. (A) Bloqueos representativos de una hebra de ADN homopolimérico en un complejo con NA mediante el uso de ReFraC. La animación muestra la interpretación de los bloqueos de corriente. (B) Distribuciones representativas de las corrientes residuales obtenidas para las hebras homopoliméricas de A²⁰, C²⁰, T²⁰ con los nanoporos de ReFraC. (C) Bloqueos de corriente de una traza continua inducida por los nucleótidos homopoliméricos C²⁰ y A²⁰ al mismo poro de ReFraC. Las trazas mostradas se filtraron digitalmente con un corte de 100 Hz. (D) Distribución de las corrientes residuales impuestas por las mezclas de las hebras homopoliméricas de C²⁰ y A²⁰. (E) Traza continua de un experimento para resolver las mezclas de los nucleótidos homopoliméricos C²⁰ y T²⁰. (F) Distribución de las corrientes residuales impuestas por las mezclas de las hebras homopoliméricas de C²⁰ y T²⁰. Las trazas se registraron en 3 M de NaCl, 15 mM de Tris-HCl, pH 7,5, mediante el uso de un filtro de Bessel de paso bajo de 2 kHz y una velocidad de muestreo de 10 kHz. Las trazas C y E se sometieron a un filtrado digital gaussiano adicional de 100 Hz.

Figura 3. Descompresión/translocación del ADNbc por ReFraC. (A) Traza representativa de ReFraC que captura un complejo NA: A(ADNbc)C a 50 mV. La corriente del poro abierto se indica como "1" y, para comparar, se indica después de la captura del complejo. Se pueden observar dos niveles en el bloque: en primer lugar, un nivel inferior ("2"), probablemente correspondiente a la citosina homopolimérica, que se convierte a través de un nivel intermedio (descompresión, paréntesis) en un nivel superior ("3"), que lo más probable es que corresponda a la adenina homopolimérica. Tras la inversión del potencial ("4"), el bloque se libera inmediatamente, lo que indica que la región bicatenaria del complejo NA: A(ADNbc)C se despegó. (B) A 100 mV, en más de la mitad de los casos (recuadro) se observa un solo bloque ("2") después de que se empuja la parte de ADNbc (deformación, paréntesis) y al aplicar - 30 mV el bloque no puede liberarse inmediatamente ("3"). A potenciales negativos más altos, el bloque puede liberarse, lo que indica que se formó un rotaxano (más ejemplos en la Figura 8). Las trazas se registraron en 3 M de NaCl, 15 mM de Tris-HCl, pH 7,5, mediante el uso de un filtro de Bessel de paso bajo de 2 kHz y una velocidad de muestreo de 10 kHz.

Figura 4. Distribución de la conductancia del canal unitario y dependencia de la corriente de tensión determinada para los nanoporos de WtFraC y ReFraC. A: Distribución de la conductancia del canal unitario medida para los poros preoligomerizados de WtFraC (parte superior) y ReFraC (parte inferior) reconstituidos en las bicapas lipídicas planas. La conductancia se midió a un potencial aplicado de - 50 mV. La orientación de cada canal individual se verificó de acuerdo con la asimetría en la conductancia. B: Dependencia de la corriente de tensión medida para los nanoporos de WtFraC y ReFraC. Los experimentos se repitieron 3 veces, y las barras de error indican las desviaciones estándar entre los valores experimentales. Los registros se llevaron a cabo en 15 mM de Tris-HCl, pH 7,5 y 1 M de NaCl.

Figura 5. Actividad hemolítica de WtFraC, FraC D10R y ReFraC. La velocidad de hemólisis se calculó como el inverso del tiempo transcurrido hasta la disminución del 50 % de la turbidez (medida como la densidad óptica a una longitud de onda de 650 nm) observada en el 1 % de la suspensión de eritrocitos de caballo en 15 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM de NaCl. Las proteínas se añadieron en una concentración de 200 nM, las velocidades de hemólisis se presentan como el porcentaje de WtFraC. El experimento se repitió 3 veces, y las barras de error indican la desviación estándar entre los valores experimentales.

Figura 6. Translocación e inmovilización del sustrato de ADN A(ADNbc)C registrado con el nanoporo de ReFraC.

Se preparó el sustrato A(ADNbc)C (representado sobre la traza) por hibridación del oligonucleótido I (5' biotinilado AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGTGCTACGAC TCTCTGTGTGCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC) y el oligonucleótido II (CACACA GAGAGTCGTAGCAC). A: Bloqueos provocados en el nanoporo de ReFraC por 1 pM de A(ADNbc)C solo (izquierda) y en complejo con 0,25 pM de neutravidina (derecha), se añadieron los sustratos en cis por debajo de 50 mV de potencial aplicado. B: Bloqueos provocados en el nanoporo de ReFraC por 1 pM de A(ADNbc)C solo (izquierda) y en complejo con 0,25 pM de neutravidina (derecha), se añadieron los sustratos en cis por debajo de 70 mV. Dos niveles de corriente residual detectados para los bloqueos de A(ADNbc)C libres indicados con una línea discontinua de color violeta pálido. Los niveles de corriente correspondientes a los poros bloqueados y abiertos se muestran como líneas discontinuas de color violeta pálido y gris, respectivamente. Los protocolos de escalonamiento de la tensión se muestran con líneas rojas debajo de las trazas. Los registros se llevaron a cabo en 15 mM de Tris-HCl, pH 7,5 y 3 M de NaCl, la frecuencia de muestreo fue de 10 kHz y los datos se suavizaron mediante el filtro de Bessel de paso bajo de 2 kHz tras la adquisición.

Figura 7. Trazas representativas que muestran los potenciamientos escalonados de la corriente residual dentro de los bloqueos de A(ADNbc)C-neutravidina provocados en el nanoporo de ReFraC. Estaban presentes 1 pM de A(ADNbc)C y 0,25 pM de neutravidina en cis a 50 mV. Dentro de los bloqueos, la corriente residual ha cambiado de 8,8 ± 0,7 % (nivel inicial) a 12,5 ± 0,7 % (nivel final). El protocolo de escalonamiento de la tensión se muestra con líneas rojas en la parte inferior. Los registros se llevaron a cabo en 15 mM de Tris-HCl, pH 7,5 y 3 M de NaCl, la frecuencia de muestreo fue de 10 kHz y los datos se suavizaron mediante el filtro de Bessel de paso bajo de 2 kHz tras la adquisición.

Figura 8. Ejemplos adicionales de las trazas que muestran la formación del rotaxano por el complejo A(ADNbc)C-neutravidina controlada en los nanoporos de ReFraC a un potencial aplicado de 100 mV. Se añadieron 1 pM de A(ADNbc)C y 0,25 pM de neutravidina en cis. Los protocolos de escalonamiento de la tensión se muestran con líneas rojas en la parte inferior. Los rotaxanos se desmantelaron al cambiar el potencial aplicado a - 40 mV. Los registros se llevaron a cabo en 15 mM de Tris-HCl, pH 7,5 y 3 M de NaCl, la frecuencia de muestreo fue de 10 kHz y los datos se suavizaron mediante el filtro de Bessel de paso bajo de 2 kHz tras la adquisición.

Figura 9: Trazas representativas que muestran la formación de pseudorrotaxano y rotaxano por el complejo oligonucleótido I-neutravidina inmovilizado dentro del nanoporo de ReFraC. A: Formación de pseudorrotaxano provocada por 1 pM de oligonucleótido I y 0,25 pM de neutravidina presente en cis. B: Formación de rotaxano por 1 pM de oligonucleótido I y 0,25 pM de neutravidina presente en cis, mientras que se añadió 1 pM de oligonucleótido II en trans. Los rotaxanos se desmantelaron al cambiar el potencial aplicado a - 40 mV (la flecha roja sobre la traza indica el desmantelamiento del rotaxano). El estado transitorio que describe la descompresión del ADNbc se muestra entre paréntesis. El protocolo de escalonamiento de la tensión se muestra con líneas rojas en la parte inferior. Los registros se llevaron a cabo en 15 mM de Tris-HCl, pH 7,5 y 3 M de NaCl, la frecuencia de muestreo fue de 10 kHz y los datos se suavizaron mediante el filtro de Bessel de paso bajo de 2 kHz tras la adquisición.

Figura 10. Captura de un oligopéptido (Endotelina 1) y una proteína (Quimotripsina) con dos variantes de FraC en dos condiciones de pH diferentes. a) Secciones transversales de FraC de tipo salvaje (WtFraC, PDB: 4TSY) y FraC D10R-K159E (ReFraC). b y c) Trazas representativas inducidas por 1 pM de endotelina 1 (b) y 200 nM de quimotripsina (c) para WtFraC (izquierda) y ReFraC (derecha). La quimotripsina (PDB: 5CHA) y la endotelina 1 humana (PDB: 1EDN) se muestran como representaciones de superficie. La endotelina 1 y la quimotripsina ingresan a WtFraC bajo potenciales negativos aplicados, mientras que ingresan a ReFraC bajo potenciales positivos aplicados. También se observaron los bloqueos de quimotripsina a WtFraC por debajo de - 50 mV a pH 7,5 y 4,5, sin embargo, el potencial aplicado aumentó a - 100 mV para obtener un número suficiente de bloqueos. A pH 7,5, los bloqueos a ReFraC por la quimotripsina bajo presión positiva aplicada, requerían un potencial más alto que a WtFraC bajo presión negativa aplicada. El tampón a pH 7,5 incluía 1 M de KCl, 15 mM de Tris, y el tampón a pH 4,5 contenía 1 M de KCl, 0,1 M de ácido cítrico, 180 mM de Tris Base. Se añadieron endotelina 1 y quimotripsina al compartimiento cis. Todas las trazas se registraron mediante el uso de una velocidad de muestreo de 50 kHz y un filtro de Bessel de paso bajo de 10 kHz. La coloración representa el potencial electrostático de la superficie molecular como se calcula por APBS (13) (pH 7,5 en 1 M de KCl) con rojo y azul correspondientes a los potenciales negativos y positivos (intervalo de - 4 a 4 kbT/ec), respectivamente. Las estructuras se renderizaron mediante el uso de PyMOL.

Figura 11. Distribución electrostática y selectividad iónica de WtFraC y ReFraC. a) Los potenciales electrostáticos simulados promediados por monómeros revelan las constricciones cargadas negativamente y positivamente de WtFraC y ReFrac, respectivamente. Mientras que para ReFrac, la reducción del pH de 7,5 a 4,5 solo tuvo un pequeño efecto sobre el potencial electrostático, para WtFraC el valor pico en el centro de la constricción disminuyó ~el 41 %. Todas las simulaciones se realizaron mediante el uso de ApBS (13) a 1 M de KCl, con la carga parcial de cada residuo titulable ajustada de acuerdo con sus estados de protonación promedio con una versión modificada del software PDB2PQR. (14) Los valores de pKa residuales se estimaron mediante el uso de PROPKA. (33, 34) b) La determinación del potencial de inversión muestra que WtFraC y ReFrac son selectivos de cationes y aniones respectivamente, como se espera de los potenciales electrostáticos en sus constricciones. La reducción del pH de 7,5 a 4,5, redujo la selectividad iónica de WtFraC

(P_(KA+)/P_(^CI^A-)) por ~el 43 %, de acuerdo con la magnitud reducida del potencial electrostático simulado. Por el contrario, - la s simulaciones no predijeron el aumento del 37 % en la selectividad iónica de ReFraC a pH 4,5. Todos los potenciales de inversión se midieron en condiciones asimétricas de sal (467 mM de KCl en trans y 1960 mM de KCl en cis) y se determinó la selectividad iónica mediante el uso de la ecuación de Goldman-Hodgkin-Katz. Las envolventes detrás de cada curva de corriente-tensión representan sus respectivas desviaciones estándar.

Figura 12. Caracterización de biomarcadores con WtFraC a pH 4,5. a) Desde la parte superior hasta la parte inferior: representación de la superficie con la superficie molecular y las representaciones animadas (Pymol) de quimotripsina (25 kD, PDB: 5CHA), una traza representativa obtenida bajo un potencial de - 150 mV aplicado, un diagrama de calor que representa la distribución del tiempo de permanencia frente al % de Ires a -150 mV, la dependencia de la tensión del % de Ires, la dependencia de la tensión de los tiempos de permanencia, y la frecuencia de captura. b), c), d), e) muestran la misma información para la microglobulina p2 (11,6 kD, pDB: 1LDS), el EGF humano (6,2 kD, PDB: 1JL9), la endotelina 1 (2,5 kD, PDB: 1EDN) y la angiotensina I (1,3 kD), respectivamente. La angiotensina I se representa como una estructura aleatoria dibujada con Pymol. Las concentraciones de los biomarcadores fueron: de 200 nM para la quimotripsina, 200 nM para la microglobina p2, 2 pM para el EGF humano, 1 pM para la endotelina 1, y 2 pM para la angiotensina I, respectivamente. Los puntos isoeléctricos de los biomarcadores se obtienen de la literatura o con la herramienta de cálculo en línea Pepcalc. Las barras de error representan la desviación estándar obtenida de al menos 3 repeticiones y de al menos 300 eventos para cada repetición. Los datos se ajustaron mediante el uso de una función B-spline (Origin 8.1). Todos los registros se recopilaron con una velocidad de muestreo de 50 kHz y un filtro de Bessel de paso bajo de 10 kHz.

Figura 13. Discriminación de la endotelina 1 y 2 con WtFraC a pH 4,5. a) Representación de la superficie molecular de la endotelina 1 y la endotelina 2 mediante el uso del colorante electrostático (PyMOL). b) Arriba: secuencias de aminoácidos de la endotelina 1 y 2. Las líneas azules indican los puentes disulfuro en cada oligopéptido. Abajo: % de Ires y tiempo de permanencia para los bloqueos de la endotelina 1 y la endotelina 2 a - 50 mV en tampón de pH 4,5 (1 M de KCl, 0,1 M de ácido cítrico, 180 mM de Tris Base). c) Bloqueos representativos de la endotelina 1 y la endotelina 2 al mismo nanoporo de FraC bajo un potencial de - 50 mV aplicado. d) Histograma (izquierda) de las corrientes residuales provocadas por 2 pM de la endotelina 1 y el diagrama de calor correspondiente que representa la desviación estándar de la amplitud de la corriente versus el % de Ires (derecha). e) Igual que en (d) pero después de la adición de 8 pM de endotelina 2 al mismo poro, que revela una segunda población. Los gráficos se crearon con scripts R personalizados. Todos los registros se realizaron con una velocidad de muestreo de 50 kHz y un filtro de Bessel de paso bajo de 10 kHz.

Sección experimental

Sección A

Materiales y métodos

A menos que se especifique de cualquier otra manera, todos los productos químicos se compraron a Sigma-Aldrich. El ADN se adquirió de Integrated DNA Technologies (IDT). Las enzimas se adquirieron de Fermentas y los lípidos de Avanti Polar Lipids. Todos los errores en este trabajo se dan como desviaciones estándar.

Clonación de FraC

Para permitir la clonación, se introdujo un sitio de restricción Nco I (CCATGG) al comienzo de la secuencia de ADN (extremo 5') correspondiente a la WtFraC madura de A. fragacea. Para mantener el marco de lectura, se insertaron dos bases adicionales después del sitio Nco I, lo que dio como resultado un residuo de alanina adicional después de la metionina de partida. Para fines de purificación, en el extremo terminal C de FraC, se unió un marcador de afinidad con la His9 a través de un enlazador flexible de glicina-serina-alanina y el marco de lectura abierto se terminó con dos codones de terminación consecutivos, seguido de un sitio de restricción Hind III (extremo 3'). Sirvieron como plantilla 50 ng del gen sintético con composición de codones optimizada (IDT) para la siguiente reacción de PCR: el gen se amplificó mediante la ADN polimerasa Phire Hot Start II (Finnzymes) mediante el uso de 6 pM de cebadores Frf y Frr (Tabla 2) en un volumen de 300 pL. El protocolo de PCR fue el siguiente: una etapa de preincubación a 98 °C durante 30 s se siguió de 30 ciclos de desnaturalización a 98 °C durante 5 s y extensión a 72 °C durante 1 min. El producto resultante de la PCR que contenía el gen de WtFraC marcado con Hi9 se purificó con el kit de purificación de PCR QIAquick (Qiagen) y se digirió con Nco I y Hind III (FastDigest, Fermentas). El inserto purificado en gel (QIAquickGel Extraction Kit, Qiagen) se clonó bajo el control del promotor T7 en el plásmido de expresión pT7-SC1 mediante el uso de ligadura de extremo adhesivo (ligasa T4, Fermentas) a través de los sitios Nco I (5') y Hind III (3'). De la mezcla de ligadura, 0,6 pl se transformaron en 50 pl de células E. cloni® 10G (Lucigen) mediante la electroporación. Las bacterias transformadas se cultivaron durante la noche a 37 °C en placas de agar LB con ampicilina (100 pg/ml). La identidad de los clones se confirmó mediante secuenciación.

Construcción de FraC 10R

Del plásmido pT7-SC1 que contenía el gen de WtFraC, 100 ng sirvieron como plantilla para la reacción de PCR: el gen se amplificó mediante la ADN polimerasa Phire Hot Start II (Finnzymes) mediante el uso de 6 pM de cebadores 10Rf (que codifican para D10R) y terminador T7 (tabla 2) en un volumen de 300 pL. El protocolo de los ciclos de reacción de la p Cr fue el siguiente: una etapa de preincubación a 98 °C durante 30 s se siguió de 30 ciclos de desnaturalización a 98 °C durante 5 s y extensión a 72 °C durante 1 min. El producto de la PCR se purificó en gel (QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen) y se clonó en un plásmido de expresión pT7 (pT7-SC1) mediante el procedimiento MEGAWHOP[1]: se mezclaron aproximadamente 500 ng del producto de la PCR purificado con aproximadamente 300 ng del plásmido pT7-SC1 que contenía el gen de WtFraC y la amplificación se llevó a cabo con la ADN polimerasa Phire Hot Start II (Finnzymes) en 50 pL de volumen final (preincubación a 98 °C durante 30 s, luego 30 ciclos de: desnaturalización a 98 °C durante 5 s, extensión a 72 °C durante 1,5 min). La plantilla circular se eliminó mediante la incubación con Dpn I (1 FDU) durante 2 horas a 37 °C. De la mezcla resultante, 0,6 pl se transformaron en células E. cloni® 10G (Lucigen) mediante la electroporación. Las bacterias transformadas se cultivaron durante la noche a 37 °C en placas de agar LB que contenían ampicilina (100 pg/ml). La identidad de los clones se confirmó mediante secuenciación.

Construcción de las bibliotecas de FraC 10R mediante PCR propensa a errores.

Las bibliotecas se construyeron mediante la amplificación del gen de FraC D10R a partir del ADN plasmídico mediante el uso del promotor T7 y los cebadores del terminador T7 (Tabla 2).

Tabla 2. Oligonucleótidos empleados en este estudio. "5Biosg" significa grupo biotina conjugado con el extremo 5' del ADN a través del enlazador C6 Id T.

En la primera ronda de mutagénesis usamos un plásmido que contiene el gen sintético que codifica para FraC 10R como una plantilla. En la segunda ronda de mutagénesis usamos el conjunto de plásmidos de ADN de los clones con la actividad más alta identificados en la primera ronda de detección. La amplificación del ADN se realizó mediante PCR propensa a errores: Se dividió 400 gL de mezcla de PCR (200 gl de REDTaq ReadyMix, 6 gM de promotor T7 y cebadores del terminador T7, ~400 ng de plantilla de plásmido) en 8 volúmenes de reacción que contenían de 0 a 0,2 mM de MnCh y se ciclaron 27 veces (preincubación a 95 °C durante 3 min, luego ciclado: desnaturalización a 95 °C durante 15 s, hibridación a 55 °C durante 15 s, extensión a 72 °C durante 3 min). Estas condiciones produjeron típicamente de 1-4 mutaciones por gen en la biblioteca final. Los productos de PCR se agruparon, se purificaron en gel (QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen) y se clonaron en un plásmido de expresión pT7 (pT7-SC1) mediante el procedimiento MEGAWHOP: ~Se mezclaron 500 ng del producto de PCR purificado con ~300 ng de plásmido pT7-SC1 que contenía el gen de FraC 10R y la amplificación se con la ADN polimerasa Phire Hot Start II (Finnzymes) en 50 gL de volumen final (preincubación a 98 °C durante 30 s seguido de 30 ciclos: desnaturalización a 98 °C durante 5 s, extensión a 72 °C durante 1,5 min). La plantilla circularse eliminó mediante la incubación con Dpn I (1 FDU) durante 2 horas a 37 °C. De la mezcla resultante, 0,6 gl se transformaron en células E. cloni® 10G (Lucigen) mediante la electroporación. Las bacterias transformadas se cultivaron durante la noche a 37 °C en placas de agar LB con ampicilina (100 gg/ml), lo que típicamente dio como resultado > 105 colonias que se recolectaron para la preparación de la biblioteca de ADN plasmídico.

Detección de la actividad hemolítica en los lisados crudos después de la sobreexpresión de FraC

Se inocularon cultivos iniciadores durante la noche de 600 clones (ver arriba) en 450 gL de medio fresco en placas nuevas de 96 pocillos profundos y los cultivos se cultivaron a 37 °C hasta un DO600 de~0,8. Luego, se añadió IPTG (0,5 mM) para inducir la sobreexpresión y la temperatura se redujo a 25 °C para una incubación durante la noche. Las bacterias se recolectaron al día siguiente mediante centrifugación a 3000 x g durante 15 min a 4 °C. El sobrenadante se descartó y los sedimentos se congelaron a -80 °C durante dos horas para facilitar la rotura celular. Luego se resuspendieron los sedimentos celulares en 0,4 ml de tampón de lisis (15 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM de MgCl2, 10 gg/ml de lisozima, 0,2 unidades/mL de DNAsa I) y se lisaron mediante la agitación a 1300 Rp M durante 30 min a 37 °C. Luego, se añadieron de 0,5-5 gl del lisado crudo a 100 gl de ~la suspensión de eritrocitos de caballo al 1 %. Este último se preparó mediante la centrifugación de sangre de caballo (bioMérieux Benelux) a 6000 x g durante 5 min a 4 °C y resuspensión del sedimento en 15 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM de NaCl. Si el sobrenadante tenía un color rojo, la solución se centrifugó nuevamente y el sedimento se resuspendió en el mismo tampón. La actividad hemolítica se controló mediante la disminución de la DO a 650 nm a lo largo del tiempo (espectrofotómetro de microplacas Multiskan GO, Thermo Scientific).

Detección de las mutaciones que compensan los efectos deletéreos de la sustitución de aminoácidos D10R en FraC

La sustitución de aminoácidos D10R dio como resultado una ~disminución de 5 veces en la actividad hemolítica de FraC (Figura 5). Aunque FraC D10R todavía podría oligomerizarse y reconstituirse en bicapas planas hechas de 1,2-difitanoilsn-glicero-3-fosfocolina (DPhPC) buscamos mutaciones compensatorias que recuperaran la actividad hemolítica de FraC D10R de nuevo al nivel de WtFraC. Mantener la actividad hemolítica de FraC es importante por dos razones: en primer lugar, refleja la capacidad de ensamblarse en poros oligoméricos en bicapas lipídicas específicas y, por lo tanto, puede traducirse en una preparación más eficiente de nanoporos oligoméricos. Por otro lado, la actividad hemolítica ofrece una forma conveniente de detectar la funcionalidad de variantes con cambios arbitrarios en las secuencias de aminoácidos y, por lo tanto, facilitará los esfuerzos de ingeniería futuros en el nanoporo de FraC. Para identificar las mutaciones compensatorias, construimos una biblioteca de mutagénesis aleatoria basada en el gen de FraC D10R, la transformamos en E. coliB121 DE3 y se detectaron variantes individuales para actividad hemolítica contra los eritrocitos de caballo en lisados crudos después de la sobreexpresión, mediante el uso de WtFraC como referencia. En la primera ronda, detectamos 600 variantes y seleccionamos 12 clones como plantilla para la segunda ronda de mutagénesis aleatoria combinada con la detección de la actividad hemolítica. Luego, se seleccionaron 7 clones con el nivel más alto de actividad hemolítica para una caracterización adicional. Los cambios de secuencia que ocurrieron en los genes correspondientes se resumen en la Tabla 3.

Tabla 3. Cambios de secuencia ue com ensan los efectos deletéreos de la mutación D10R en FraC.

Las variantes purificadas se oligomerizaron en los liposomas de esfingomielina: DPhPC (1:1) y se solubilizaron en LDAO al 0,6 %. Después de cambiar el detergente a DDM al 0,02 % mediante cromatografía de Ni-NTA, se probó la actividad formadora de poros de las proteínas oligoméricas en las bicapas lipídicas planas compuestas de DPhPC. Inicialmente, identificamos las variantes denominadas 3, 4 y ReFraC (Tabla 3) como las formadoras de poros más prometedoras. Sin embargo, los nanoporos fabricados por la variante 3 eran heterogéneos (menos del 50 % produjo poros octaméricos), mientras que la actividad formadora de poros de la variante 4 decaía en unos días cuando se almacenó a 4 °C. La ReFraC oligomérica ha mantenido la actividad de formadora de poros durante meses cuando se almacena a 4 °C y ha formado nanoporos casi tan uniformes como una WtFraC a la vez que es capaz de capturar el ADNmc. Por lo tanto, elegimos a ReFraC para un análisis de ADN adicional en este estudio. Además, reemplazamos el aspartato 10 con la asparagina en ReFraC lo que produjo una variante D10N K159E, pero no pudimos detectar la entrada del ADNmc.

WtFraC (secuencia de proteínas)

MASAD VAGAVIDGAGLGFDVLKTVLEALGNVKRKIAYGIDNESGKTWTA

MNTYFRSGTSDIVLPHKVAHGKALLYNGQKNRGPVATGWGVIAYSMS

DGNTLAVLFSVPYDYNWYSNWWNVRVYKGQKRADQRMYEELYYHRSP

FRGDNGWHSRGLGYGLKSRGFMNSSGHAILEIHVTKAGSAHHHHHH**

WtFraC (secuencia de ADN)

ATGGCGAGCGCCGATGTCGCGGGTGCGGTAATCGACGGTGCGGGTCTG

GGCTTTGACGTACTGAAAACCGTGCTGGAGGCCCTGGGCAACGTTAAA

CGCAAAATTGCGGTAGGGATTGATAACGAATCGGGCAAGACCTGGACA

GCGATGAATACCTATTTCCGTTCTGGTACGAGTGATATTGTGCTCCCAC

ATAAGGTGGCGCATGGTAAGGCGCTGCTGTATAACGGTCAAAAAAATC

GCGGTCCTGTCGCGACCGGCGTAGTGGGTGTGATTGCCTATAGTATGT

CTGATGGGAACACACTGGCGGTACTGTTCTCCGTGCCGTACGATTATAA

TTGGTATAGCAATTGGTGGAACGTGCGTGTCTACAAAGGCCAGAAGCG

TGCCGATCAGCGCATGTACGAGGAGCTGTACTATCATCGCTCGCCGTTT

CGCGGCGACAACGGTTGGCATTCCCGGGGCTTAGGTTATGGACTCAAA

AGTCGCGGCTTTATGAATAGTTCGGGCCACGCAATCCTGGAGATTCAC

GTTACCAAAGCAGGCTCTGCGCATCATCACCACCATCACTGATAAGCTT

Sobreexpresión y purificación de FraC

Las células E. cloni® EXPRESS BL21 (DE3) se transformaron con el plásmido pT7-SC1 que contenía el gen de FraC. Los transformantes se seleccionaron después del cultivo durante la noche a 37 °C en placas de agar LB suplementadas con 100 mg/L de ampicilina. Las colonias resultantes se inocularon en el medio 2xYT (Sigma) que contenía 100 mg/L de ampicilina. El cultivo creció a 37 °C, con agitación a 200 rpm, hasta que alcanzó una DO600 de ~ 0,8. Luego, se indujo la expresión de FraC mediante la adición de 0,5 mM de IPTG y se continuó el crecimiento a 25 °C. Al día siguiente, las bacterias se recolectaron por centrifugación a 6000 x g durante 25 min y los sedimentos se almacenaron a - 80 °C. Los sedimentos (derivados de 50-100 ml de cultivo bacteriano) que contenían FraC monomérica se descongelaron y se resuspendieron en 40 ml de 15 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM de MgCl2 y 0,05 unidades/ml de DNasa I (Fermentas). Luego, para iniciar la ruptura celular, la suspensión de bacterias se complementó con 0,2 mg/ml de lisozima y 2 M de urea (para prevenir la formación de restos) y se sometió a agitación vigorosa a temperatura ambiente durante 40 min. Las bacterias restantes se rompieron mediante sonicación con sonda. Los lisados crudos se clarificaron por centrifugación a 6000 x g durante 20 min y el sobrenadante se mezcló con 200 pL (volumen de perlas) de resina Ni-NTA (Qiagen) que se preequilibró con tampón de lavado (10 mM de imidazol, 150 mM de NaCl, 15 mM de Tris-HCl, pH 7,5). Después de 1 hora de mezcla suave a temperatura ambiente, la resina se cargó en una columna (Micro Bio Spin, Bio-Rad) y se lavó con ~5 ml de tampón de lavado. La FraC se eluyó con aproximadamente ~0,5 ml de tampón de lavado que contenía 300 mM de imidazol. La concentración de proteínas se determinó mediante el ensayo de Bradford. Los monómeros de FraC se almacenaron a 4 °C hasta su uso posterior.

Ensayo de actividad hemolítica

Se lavó la sangre de caballo desfibrinada (bioMérieux Benelux) con 150 mM de NaCl, 15 mM de Tris-HCl, pH 7,5 hasta que el sobrenadante fue transparente. Los eritrocitos se resuspendieron luego con el mismo tampón para ~la concentración al 1 % (DO 650 nm de 0,6 a 0,8). La suspensión se mezcló luego con 200 nM de FraC. La actividad hemolítica se midió mediante el control de la disminución de la DO650 mediante el uso de un espectrofotómetro de microplacas MultiskanTM GO (Thermoscientific). La velocidad de hemólisis se determinó como uno durante el tiempo transcurrido hasta una disminución del 50 % de la turbidez.

Preparación de Esfingomielina: liposomas DPhPC

Se disolvieron 20 mg de la mezcla de esfingomielina (Brain, Porcine, Avanti Polar lipids) y DPhPC (1:1) en 4 ml de pentano complementado con etanol al 0,5 % (para ayudar a disolver la esfingomielina) y se colocaron en un matraz de fondo redondo. El solvente se evaporó mientras se giraba lentamente el matraz para depositar una película lipídica en las paredes. Después de la deposición de la película lipídica, el matraz se mantuvo abierto durante 30 min para permitir la evaporación completa del solvente. La película lipídica se resuspendió luego en 150 mM de NaCl, 15 mM de Tris-HCl, pH 7,5 (concentración final del lípido total 10 mg/ml) mediante el uso de un baño de sonicación (de 5-10 minutos a temperatura ambiente). Los liposomas obtenidos se almacenaron a - 20 °C.

Oligomerización de FraC

Se mezcló la FraC monomérica con liposomas (relación de masa lípido/proteína 10:1) en tampón de 150 mM de NaCl, 15 mM de Tris-HCl, pH 7,5. La mezcla se sonicó brevemente (baño de sonicación) y se incubó durante 30 min a 37 °C. Luego, los proteoliposomas se solubilizaron con LDAO al 0,6 % y se incubaron durante 5 min y la mezcla se diluyó 20 veces con tampón de lavado que contenía DDM (DDM al 0,02 %, 150 mM de NaCl, 15 mM de Tris-HCl, pH 7,5) y se mezcló con ~ 100 pl (volumen de perlas) de resina de agarosa Ni-NTA (Qiagen) que se preequilibró con tampón de lavado que contenía DDM. Después de mezclar suavemente durante 1 hora, la resina se cargó en una columna (Micro Bio Spin, Bio-Rad) y se lavó con ~ 2 ml de tampón de lavado que contenía DDM. La FraC se eluyó de la columna con 50 pl de tampón de elución (200 mM de EDTA, DDM al 0,02 %, pH 8; alternativamente, podríamos usar 1 M de imidazol, d Dm al 0,02 %; sin embargo, el EDTA probó ser más eficiente). Los oligómeros de FraC purificados se almacenaron a 4 °C.

Alternativamente, los oligómeros de FraC se pueden formar al mezclar los monómeros de FraC con los liposomas formados por esfingomielina sola (1 hora a 37 °C y luego 4 °C durante la noche). Al día siguiente, se añade 5 mM de EDTA y DDM al 1 % (final) a los proteoliposomas y se incuban durante 15 minutos a temperatura ambiente. La solución se diluye luego hasta un volumen de 1 ml que contiene 5 mM de EDTA, DDM al 0,05 %, 15 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM de NaCl. Luego, la solución se concentra ~100 uL con el dispositivo de ultrafiltración de corte de 100 kDa.

Registros eléctricos en las bicapas lipídicas planas

El potencial aplicado se refiere al potencial del electrodo trans. Se insertaron los nanoporos de FraC en las bicapas lipídicas del compartimiento cis, que se conectó al electrodo de tierra. Los dos compartimientos se separaron por una película de politetrafluoroetileno de 25 pm de espesor (Goodfellow Cambridge Limited) que contenía un orificio de ~100 pm de diámetro. La apertura se pretrató con ~5 pl de hexadecano al 10 % en pentano y se formó una bicapa mediante la adición de ~10 pL de 1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPhPC) en pentano (10 mg/mL) a ambas cámaras de electrofisiología. Típicamente, la adición de 0,01-10 ng de FraC oligomérica al compartimiento cis (0,5 mL) fue suficiente para obtener un solo canal. Los nanoporos de WtFraC mostraron una corriente de poro abierto más alta a potenciales positivos aplicados que a negativos, lo que proporcionó una herramienta útil para determinar la orientación del poro. Los registros eléctricos se llevaron a cabo en 1M (caracterización inicial de los nanoporos de FraC) y en 3 M de NaCl (para análisis de polinucleótidos para aumentar amplitudes), 15 mM de Tris-HCl, pH 7,5.

Registro y análisis de datos

Las señales eléctricas de los registros de las bicapas planas se amplificaron mediante el uso de un amplificador de pinza de conexión Axopatch 200B (Axon Instruments) y se digitalizaron con un convertidor Digidata 1440 A/D (Axon Instruments). Los datos se registraron mediante el uso del software Clampex 10.4 (Molecular Devices) y el análisis posterior se llevó a cabo con el software Clampfit (Molecular Devices). Los registros eléctricos se adquirieron al aplicar un filtro de Bessel de paso bajo de 2 kHz y una velocidad de muestreo de 10 kHz. Las transiciones corriente del nivel 0 al nivel 1 se analizaron con la función de "búsqueda de un solo canal" en Clampfit. Los valores de la corriente residual ^{( l res)}

I

se calcularon a partir de los valores de corriente de poros bloqueados (Ib) y valores de corriente de poro abierto ( ^') como

^{l r e s =} 100 ^{** I b} /I o.

I^b e I^o se determinaron a partir de los ajustes gaussianos a histogramas de amplitud de eventos. En el caso de los eventos que muestran potenciamientos de corriente escalonados, los niveles de corriente residual se calcularon a partir de los ajustes gaussianos a histogramas de corriente de punto completo. Para determinar la duración del evento, los tiempos de permanencia del evento (tapagado) se agruparon como distribuciones acumulativas y se ajustaron a una sola exponencial. La frecuencia de los eventos que muestran potenciamientos de corriente escalonados (Figura 3A) y los bloqueos de formación de rotaxano se calcularon manualmente. Los gráficos se realizaron con Origin (OriginLab Corporation) o el software Clampfit (Molecular Devices).

Representación gráfica del nanoporo de FraC

Los gráficos moleculares se realizaron con Quimera (http://www.cgl.ucsf.edu/chimera).

Ejemplo 1: Reconstitución de poros de FraC de tipo salvaje en bicapas lipídicas planas.

Los monómeros de la proteína FraC recombinante de tipo salvaje (WtFraC, Figura 1A; 1B, arriba), fusionados genéticamente a un marcador de Hi9 en el extremo terminal C, se expresaron en una cepa de E. coli BL21 (DE3). Trabajos previos establecieron que el ensamble poroso de actinoporinas se desencadena por la presencia de SM en las bicapas lipídicas. [9], [10], [11], [8] En concordancia, los monómeros solubles en agua de WtFraC purificados por cromatografía de Ni-NTA no formaron poros en las bicapas lipídicas planas DPhPC. Por lo tanto, se preoligomerizaron monómeros con liposomas DPhPC:SM (1:1). Después de la solubilización de los liposomas en N-óxido de N,N-dimetildodecilamina (LDAO) al 0,6 %, para evitar la disociación de los oligómeros, se cambió [12] LDAO a 0,02 % de p-dodecil maltósido (DDM) mediante una segunda ronda de cromatografía de Ni-NTA (SI). La adición de cantidades de submicrogramos purificados de WtFraC oligomérico en DDM al 0,02 % al lado cis de la bicapa lipídica plana de DPhPC produjo poros fácilmente. La distribución de la conductancia del canal unitario para los poros de WtFraC en tampón de 1 M de NaCl, 15 mM de Tris-HCl a pH, 7,5, reveló principalmente un tipo de conductancia única (Figuras 1C; 4A, arriba), presumiblemente correspondiente al octámero observado en la estructura cristalina recientemente determinada. [8] Al igual que otros nanoporos biológicos, los canales de WtFraC mostraron una relación asimétrica corriente-tensión (IV) (Figura 4B) que permite la determinación de la orientación del poro. Un ejemplo de traza, obtenido en el tampón de 3 M de NaCl, 15 mM de Tris-HCl a pH 7,5, se muestra en la Figura 1^d , en la parte superior.

Ejemplo 2: Ingeniería de WtFraC para el análisis de los ácidos nucleicos

La estructura cristalina de la WtFraC octamérica sugiere que este nanoporo es lo suficientemente grande como para permitir el enhebrado de ADNmc (diámetro de constricción de 1,2 nm). [8] Sin embargo, en nuestros experimentos iniciales no pudimos observar bloqueos de ADNmc, muy probablemente debido a que la región de constricción cargada negativamente del poro WtFraC impidió la translocación del ADN. [13], [14] Para inducir el enhebrado de ADNmc a través de FraC, sustituimos el aspartato 10 con arginina, lo que produjo un nanoporo con una constricción cargada positivamente (Figura 1B, abajo). Debido a que FraC D10R mostró una baja actividad formadora de poros (Figura 5), realizamos una mutagénesis aleatoria en el fondo del gen de FraC D10R y analizamos la actividad hemolítica de las variantes obtenidas. Como resultado, identificamos la mutación compensatoria lisina 159 al ácido glutámico (K159E) que se encuentra en el borde exterior del amplio vestíbulo (Figura 1A). El doble mutante D10R, K159E de FraC (ReFraC) mostró niveles cercanos al tipo salvaje de actividad hemolítica (Figura 5) y produjo poros uniformes (Figura 1C), aunque con relación de I a V alterada en comparación con WtFraC (Figura 4B y Figura 1D, parte inferior). La menor conductancia de los poros de ReFraC a ± 50 mV en 1 M de NaCl, 15 mM de Tris-HCl a pH 7,5 puede atribuirse a una constricción más estrecha ya que la arginina tiene una cadena lateral más voluminosa que el aspartato (Figura 1B).

Ejemplo 3: Discriminación de polinucleótidos con ReFraC

Seguimos los enfoques establecidos con aHL [7], [15], [16], [17] y MspA [14], [18] para inmovilizar el ADN con neutravidina (NA). Complementamos los homopolímeros del ADNmc A20/C20/T20 biotinilados en el extremo 5' con NA tetramérico para evaluar la capacidad de ReFraC para translocar y discriminar cadenas de ADN. Agregamos ADN premezclado (1 pM) y NA (0,25 pM) al compartimiento cis de la configuración de la bicapa lipídica plana y realizamos experimentos de discriminación de ADN en tampón de 3 M de NaCl, 15 mM de Tris-HCl, pH 7,5 y 70 mV de potencial aplicado (refiriéndose al electrodo trans). Observamos bloqueos de corriente permanentes, que son provocados por pseudorrotaxanos donde el ADNmc se enhebra de manera estable a través del poro hasta que se invierte el potencial aplicado (Figuras 2A, 9A). Las corrientes residuales, Ires, que son las relaciones porcentuales de las amplitudes de las corrientes de poro bloqueado y abierto multiplicadas por 100 ((IB/IO) * 100) fueron: 13,1 ± 0,4 % para NA: A20 (N = 5, n = 364, donde N es un número de experimentos independientes de poro único y n los bloqueos analizados), 10,8 ± 0,3 % (N = 4, n = 920) para NA: C20 y 14,0 ± 0,3 % (N = 5, n = 780) para NA: T20 (Figura 2B). Para excluir los efectos de la variación de poro a poro, también resolvimos las mezclas de homopolímeros (Figura 2C-F). Las corrientes residuales relativamente bajas sugieren un cierre estrecho del poro alrededor del ADNmc roscado.

Ejemplo 4: Descompresión del ADN y translocación del ADN de doble hebra por los nanoporos de ReFraC

La constricción de ReFraC (1,2 nm) es más pequeña que la forma B del ADN bicatenario (ADNbc, ~2 nm). Por lo tanto, para evaluar el ADNbc como tapón para el análisis de ADN, diseñamos dos oligonucleótidos: oligo I con un grupo biotina unido en el extremo 5' con la secuencia bio-5'-A20-GTGCTACGACTCTCTGTGTG-C20-3' y un oligo II corto con secuencia de complemento inversa a la parte subrayada del oligo I. La hibridación produjo un sustrato A(ADNbc)C: un segmento central de 20 pares de bases de ADNbc, flanqueado por segmentos de ADNmc A20 y C20. La adición de 1 pM de A(ADNbc)C al compartimiento cis a 50 mV provocó bloqueos transitorios en el poro de ReFraC (duración del bloqueo 2 ± 5 s , Ires = 10,0 ± 0,2 %, N = 3, n = 290, Figura 6A, izquierda). El aumento del potencial aplicado a 70 mV acortó la vida útil de los bloqueos a 2,9 ± 0,4 ms (tenga en cuenta que las corrientes residuales mostraron dos niveles de corriente: 12,8 ± 0,6 % y 3,5 ± 0,5 % N = 3 n = 2700 Figura 6B, izquierda). La disminución de la vida útil del bloqueo con el potencial sugiere la translocación de A(ADNbc)C a través de ReFraC. Para probar la translocación del ADN, agregamos NA a la cámara cis. NA: los bloqueos A(ADNbc)C se volvieron permanentes tanto a 50 mV, (Figura 6A, derecha) como a 70 mV (Figura 6B, derecha), lo que sugiere que los bloqueos transitorios en ausencia de NA no podrían ser provocados por la retracción de A(ADNbc)C al compartimiento cis. Curiosamente, a 50 mV, 31 ± 4 % de los bloqueos NA: A(ADNbc)C (N = 3, n = 468) mostraron una mejora escalonada de la corriente residual desde un nivel transitorio (Figura 3A, estado "2", Ires = 8,8 ± 0,7 %) a un nivel estable (Figura 3A, estado "3", con Ires = 12,5 ± 0,7 %, N = 4, n = 46; más ejemplos en la Figura 7). El nivel de corriente del estado "2" fue ligeramente más bajo que el de NA: C20 (Ires = 10,5 ± 0,7; N = 3, n = 206 a 50 mV). El nivel de corriente del estado "3" coincidió con el de NA: A20. Una explicación probable para los potenciamientos de corriente anteriores es que a 50 mV el segmento C20 de NA: A(ADNbc)C habita en la constricción del nanoporo (Figura 3A, estado "2"), con el segmento dúplex lo que impide la translocación adicional. Sin embargo, después de descomprimir el dúplex, A20 ocupa la constricción de ReFraC, y NA detiene la translocación (Figura 3A, estado "3"). De acuerdo, a 50 mV, los bloqueos NA: A(ADNbc)C se aliviaron inmediatamente cuando el potencial se invirtió a - 30 mV, lo que indica que a 50 mV, la translocación de A(ADNbc)C se media por la descompresión (Figura 3A, paréntesis).

En contraste, a 70 mV, una fracción significativa de los bloqueos no se liberó inmediatamente a - 30 mV (Figura 3B, recuadro), lo que indica la formación de un estado entrelazado (Figura 3B, estados "2" y "3"). Además, estos estados entrelazados se generaron con mayor frecuencia al aumentar el potencial (por ejemplo, de 7 ± 4 % de todos los bloqueos a 70 mV a 54 ± 14 % a 100 mV, N = 3, n = 739; Figura 3B, recuadro). Al considerar que los bloqueos de oligo I solo en el complejo con NA se liberaron inmediatamente a - 30 mV (Figura 9A), atribuimos tal estado entrelazado a un rotaxano donde NA y el segmento de ADN dúplex de A(ADNbc)C sirven como tapones cis y trans, respectivamente (Figura 3B, derecha). Como era de esperar, tales rotaxanos también podrían formarse a partir de bloqueos NA: oligo I cis añadiendo oligo II en trans (Figura 9B). El cambio de potencial a - 40 mV desmanteló los rotaxanos rápidamente, presumiblemente mediante la apertura del cierre del tapón de ADNbc en trans (Figura 8 y 9B). La formación de un rotaxano a partir de NA: A(ADNbc)C presente en cis requiere la deformación del poro ReFraC para permitir la translocación del segmento dúplex del sustrato A(ADNbc)C (Figura 3B, paréntesis).

Esta flexibilidad estructural puede ser una característica general de los poros a helicoidales. Previamente, observamos que los bloqueos de trombina humana (~4,2 nm de diámetro) a nanoporos ClyA-CS de tipo I (~3,3 nm de diámetro de constricción) fueron seguidos por un aumento transitorio en la corriente de poro abierto. [19] Este fenómeno se interpretó como una translocación de la proteína a través de la constricción deformada de ClyA.

Referencias a la sección A

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[22] M. Faller, M. Niederweis, GE Schulz, Science 2004, 303, 1189-1192.

Sección B

La sección A en la presente descripción anterior muestra que una toxina formadora de poros a helicoidales de una familia de proteínas actinoporinas Fragaceatoxina C (FraC) se usa ventajosamente para el análisis de polinucleótidos.

La sección B demuestra que los nanoporos de FraC también son adecuados para reconocer proteínas, por ejemplo, biomarcadores, en forma de oligopéptidos (~10 o menos aminoácidos), polipéptidos (> 10 aminoácidos) y proteínas plegadas (> 50 aminoácidos).

Materiales

Quimotripsina (de páncreas bovino, > 85 %, C4129), microglobulina p2 (de orina humana, > 98 %, M4890), endotelina 1 (> 97 %, E7764), endotelina 2 (> 97 %, E9012), angiotensina I (> 90 %, A9650), pentano (> 99 %, 236705) y hexadecano (99 %, H6703), clorhidrato de Trizma® (número de lote SLBG8541V) y base de Trizma® (número de lote SLBK4455V), N,N-dimetildodecilamina N-óxido (LADO, > 99 %, 40234) y N-Dodecil p-D-maltósido (DDM, > 98 %, D4641) se obtuvieron de Sigma-Aldrich. Se obtuvo e Gf humano (> 98 %, CYT-217) de PROSPEC. t,2-diftanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPhPC, 850356P) y la esfingomielina (Brain, Porcine, 860062) se adquirieron de Avanti Polar lipids. El cloruro de potasio (> 99 %, número de lote BCBL9989V) se compró a Fluka. Se obtuvo ácido cítrico (> 99 %, # de lote A0365028) de ACROS. Todos los biomarcadores polipeptídicos y productos químicos se usaron directamente sin purificación adicional.

Nota: El tampón 15 mM de Tris, pH 7,5 usado más abajo se preparó con la fórmula del protocolo Trizma®: 1,902 g de HCl Trizma® y 0,354 g de Base Trizma® Base disueltos en 1 litro de H²O para hacer 15 mM de Tris, pH 7,5.

Métodos

Expresión y purificación del monómero de FraC

Se clonó un gen que codifica FraC con un marcador de His6 terminal C en un plásmido de expresión pT7-SC1¹ mediante el uso de los sitios de digestión y de restricción NcoI y HindlIl. Para la expresión, el plásmido se transfirió a la célula competente E.cloni® EXPRESS BL21 (DE3) por electroporación. Los transformantes se recopilaron de la placa de agar LB que contenía 100 mg/l de ampicilina después de una incubación durante la noche a 37°C, y se inocularon en 200 ml de medio 2-YT líquido fresco con 100 mg/l de ampicilina. El cultivo celular creció a 37°C, con agitación a 220 rpm hasta una densidad óptica a 600 nm de 0,8, luego se añadió 0,5 mM de IPTG al cultivo celular. La temperatura se redujo a 25 °C para inducir la expresión de la proteína FraC durante 12 horas. Las células se recuperaron mediante centrifugación a 4000 RPM durante 30 minutos a 4 °C y los sedimentos celulares se mantuvieron a - 80 °C. Se descongelaron de 50-100 ml de sedimento de cultivo celular a temperatura ambiente, se resuspendieron con 30 ml de tampón de lisis (15 mM de Tris, pH 7,5, 1 mM de MgCl,²,4 M de Urea, 0,2 mg/ml de lisozima y 0,05 unidades/ml de DNasa) y se mezcló vigorosamente con un agitador de vértices durante 1 hora. Para romper completamente las células, la suspensión se sonicó durante 2 minutos (ciclo de trabajo 10 %, control de salida 3 de un Branson Sonifier 450). Luego, se centrifugó el lisado bruto a 6500 rpm, durante 20 minutos a 4°C. El sobrenadante (que contiene monómeros de FraC) se transfirió a un tubo Falcon de 50 ml que contenía 100 j l de resina Ni-NTA (Qiagen, almacenada a 4 °C y suspendida antes de pipetear 100 jl), que se prelavó con 3 mL de tampón de lavado (10 mM de imidazol, 150 mM de NaCl, 15 mM de Tris, pH 7,5), y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora con mezcla suave. La resina se centrifugó a 4000 rpm durante 5 minutos a 4°C. La mayor parte del sobrenadante se descartó y el sedimento que contenía la resina Ni-NTA dentro de ~5 ml de tampón se transfirió a una columna Micro Bio Spin (Bio-Rad) a TA. Las perlas de Ni-NTA se lavaron con 10 ml de tampón de lavado y la proteína se eluyó con 500 j l de 300 mM de imidazol. La concentración de proteínas se determinó con NanoDrop 2000 (Thermo Scientific). Los monómeros se almacenaron a 4 °C.

Preparación de los liposomas de esfingomielina-DPhPC

Se mezclaron 20 mg de esfingomielina (Brain, Porcine, Avanti Polar lipids) con 20 mg de 1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPhPC, Avanti Polar lipids) y se disolvió en 4 ml de pentano (Sigma) que contenía etanol al 0,5 % v/v. Esta mezcla de lípidos se colocó en un matraz redondo y se hizo girar lentamente cerca de un secador de pelo para dispersar bien el lípido alrededor de la pared para evaporar el solvente. El matraz se mantuvo abierto a temperatura ambiente durante otros 30 minutos para dejar que el solvente se evaporara completamente. Luego, se añadieron 4 ml de tampón (150 mM de NaCl, 15 mM de Tris, pH 7,5) a los lípidos secos y el matraz se añadió a un baño de sonicación durante 5 minutos. La solución de liposomas se mantuvo a - 20 °C.

Oligomerización de FraC

Los liposomas congelados se sonicaron después de descongelarlos y se mezclaron con FraC monomérica en una proporción de masa 1:1. La mezcla de FraC y liposomas se sonicó en un baño de agua durante ~30 segundos y luego se mantuvo a 37 °C durante 30 minutos. El proteoliposoma se solubilizó con LADO al 0,6 % (N,N-N-óxido de dimetildodecilamina, solución madre al 5 % p/v en agua), luego se transfirió a un tubo Falcon de 50 ml y se diluyó 20 veces con tampón (150 mM de NaCl, 15 mM de Tris, pH 7,5, DDM al 0,02 %). Se añadieron 100 pl de resina Ni-NTA prelavada (Qiagen) a la mezcla de proteína/liposoma diluida. Después de la incubación con agitación suave durante 1 hora, las perlas se cargaron en la columna (Micro Bio Spin, Bio-Rad) y se lavaron con 10 ml de tampón (150 mM de NaCl, 15 mM de Tris, pH 7,5). Los oligómeros FraC se eluyeron con 300 pl de tampón de elución (200 mM de EDTA, 75 mM de NaCl, 7,5 mM de Tris, pH 8, DDM al 0,02 %). Los oligómeros pueden ser estables durante varias semanas a 4 °C.

Registro eléctrico en bicapas lipídicas planas

Los registros eléctricos se realizaron como se describió anteriormente.2. En resumen, dos cámaras fueron separadas por una película de politetrafluoroetileno de 25 pm (Goodfellow Cambridge Limited) que contenía una abertura con un diámetro de alrededor de 100 pm. Se sumergieron dos electrodos de plata/cloruro de plata en cada compartimiento de la cámara de electrofisiología, que se llenó con 0,5 ml de tampón. El electrodo de tierra estaba conectado al compartimiento cis, el electrodo de trabajo para el lado trans. Para formar una bicapa lipídica, se añadieron ~5 pl de solución de hexadecano (10 % v/v de hexadecano en pentano) a la película de politetrafluoroetileno. Después de ~2 minutos, se añadió 10 pl de una solución de 10 mg/ml de 1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPhPC) en pentano directamente al tampón en ambos compartimientos. Luego, se formó espontáneamente una bicapa lipídica al reducir el tampón por encima y por debajo de la abertura en la película de teflón. Se añadieron oligómeros de FraC al lado cis. Bajo un potencial aplicado, la corriente iónica de FraC es asimétrica, lo que ayuda a evaluar la orientación de los nanoporos de FraC en la bicapa lipídica. Los nanoporos de FraC mostraron la orientación como se muestra en la Figura 10 cuando se midió una conductancia más alta a un potencial negativo aplicado. Luego se añadieron analitos a la cámara cis. Se usaron dos tipos de soluciones tampón para el registro de electrofisiología en este estudio, en dependencia del pH. A pH 7,5 se realizaron registros mediante el uso de 1 M de KCl y 15 mM de Tris. Cuando se varió el pH de 7,5 a 4,5, el tampón usado contenía 1 M de KCl, 0,1 M de ácido cítrico y 180 mM de Tris Base. Los oligómeros de FraC y ReFraC podrían insertarse en la bicapa lipídica desde un pH de 4,5 a 7,5.

Registro y análisis de datos

Los registros de la bicapa plana se recopilaron mediante el uso de un amplificador de pinza de parche (Axopatch 200B, Axon Instruments) y los datos se digitalizaron con un convertidor Digidata 1440 A/D (Axon Instruments). Los datos se adquirieron mediante el uso del software Clampex 10.4 (Molecular Devices) y el análisis posterior se realizó con el software Clampfit (Molecular Devices). La duración de los eventos (tiempo de permanencia), el tiempo entre dos eventos (tiempo entre eventos), los niveles de corriente bloqueados y los niveles de poros abiertos se detectaron mediante la función de "búsqueda de un solo canal". Los niveles de corriente de bloqueos se denominaron I^b, mientras que la corriente de poro abierto se denominó I^o. El % de Ires, definido como (I^b/I^o) * 100, se usó para describir el grado de bloqueo causado por diferentes biomarcadores. Los tiempos promedio entre eventos se calcularon al agrupar los tiempos entre eventos y al aplicar un único ajuste exponencial a las distribuciones acumulativas.

Medición de la selectividad iónica

Relación de permeabilidad iónica (K+/ Cl-) se calculó mediante el uso de la ecuación de Goldman-Hodgkin-Katz (Ecuación (1) en la presente descripción más abajo), que usa el potencial inverso (Vr) como entrada variable. La Vr se midió a partir de la extrapolación de las curvas de I a V mediante el uso de la condición de concentración de sal asimétrica de la siguiente manera: Los nanoporos de FraC individuales se reconstituyeron mediante el uso del mismo tampón en ambas cámaras (condiciones simétricas, 840 mM de KCl, 15 mM de Tris, pH 7,5, 500 pl) para evaluar la orientación del nanoporo. Se añadieron lentamente 400 pl de solución que contenía 3,36 M de KCl, 15 mM de Tris, pH 7,5 a la cámara cis y se añadieron 400 pl de una solución tamponada que no contenía KCl (15 mM de Tris, pH 7,5) a la solución trans (trans.cis, 467 mM de KCl: 1960 mM de KCl). Las soluciones se mezclaron y se recopilaron las curvas de I-V de -30 mV a 30 mV con etapas de 1 mV. Los experimentos a pH 4,5 se llevaron a cabo mediante el uso del mismo método pero mediante el uso de soluciones tamponadas de 0,1 M de ácido cítrico. Inicialmente, se añadieron 500 pl de tampón de 840 mM de KCl, 0,1 M de ácido cítrico, 180 mM de Tris Base en ambas cámaras y se obtuvo un único canal de FraC. Luego, se añadieron lentamente 400 pl de una solución de pH 4,5 que contenía 3,36 M de KCl, 0,1 M de ácido cítrico, 180 mM de Tris Base a la cámara cis y 400 pl de una solución tamponada que no contenía KCl (0,1 M de ácido cítrico, 180 mM de Tris Base, pH 4,5) a la solución trans (lo que produce, por lo tanto, una relación trans:cis de 467 mM de KCl:1960 mM de KCl). Las soluciones se mezclaron y se recopilaron las curvas de I-V de -30 mV a 30 mV con etapas de 1 mV. La direccionalidad de la selectividad iónica también se probó mediante el uso de una alta concentración de KCl en la cámara trans y baja concentración de KCl en la cámara cis. Los electrodos de Ag/AgCl se rodearon con puentes de agarosa al 2,5 % que contenían 2,5 M de NaCl.

Ejemplo 5: Captura de polipéptidos y proteínas con nanoporos de FraC

Para evaluar los nanoporos de FraC como un sensor de biomarcadores de oligopéptidos, inicialmente seleccionamos endotelina 1, un oligopéptido de 2,5 kD de 21 aminoácidos y a-II-quimotripsina (en adelante quimotripsina), una proteína globular de 25 kD de 245 aminoácidos (Figura 10). Los analitos se agregaron al lado cis de los nanoporos de FraC de tipo salvaje (WtFraC) (Figura 10A) mediante el uso de soluciones de 1 M de KCl, 15 mM de Tris, pH 7,5 y se aplicó un potencial externo al electrodo de "trabajo" ubicado en el compartimiento trans. Debido a que WtFraC muestra la compuerta superior a ~+ 50 mV, pero es estable a potenciales tan altos como - 300 mV, aplicamos potenciales entre esos límites. La adición de 1 |jM de endotelina 1 al compartimiento cis no provocó bloqueos a ± 50 mV (Figura 10B) y hasta - 300 mV. Dado que la constricción de ClyA está revestida con residuos de ácido aspártico (Figura 10A), razonamos que la protonación de estos residuos en condiciones más ácidas debería disminuir la barrera de energía para la translocación de endotelina 1 (que lleva una carga neta de -2) a través de la constricción WtFraC. Simultáneamente, una endotelina 1 menos negativa también migraría más fácilmente hacia el electrodo trans bajo potenciales negativos aplicados. Los bloqueos de endotelina 1 comenzaron a aparecer a pH 6,4, y su frecuencia de captura aumentaba linealmente al disminuir el pH (de 0,6 ± 0,2 eventos s^{-1 j} M '1 a pH 6,4 a 10,8 ± 2,3 eventos s^{-1 j} M '1 a pH 4,4). A pH 4,5 (1 M de KCl, 0,1 M de ácido cítrico, 180 mM de Tris Base), se observaron bloqueos de endotelina 1 a WtFraC a - 50 mV (% de Ires: 9,1 ± 0,1 %, tiempo de permanencia: 5,6 ± 2,0 ms, tiempo entre eventos: 5,8 ± 0,7 ms), pero no a 50 mV (Figura 10B).

Alentados por el efecto de una constricción más positiva en condiciones ácidas, luego investigamos la captura de endotelina 1 con el nanoporo de FraC D10R, K159E (ReFraC), un poro con residuos de arginina en la constricción diseñado en la Sección A en la presente descripción anterior para fines de análisis de ADN. A la inversa de WtFraC, ReFraC es estable bajo potenciales positivos aplicados, pero muestra una compuerta en potenciales de — 50 mV. Por lo tanto, solo se aplicaron tensiones entre - 50 mV y 200 mV a ReFraC. La adición de 1 ^j M de endotelina 1 al compartimiento cis provocó bloqueos a pH 7,5 a 50 mV (tiempo de permanencia: 3,3 ± 2,2 ms, tiempo entre eventos: 1413 ± 223 ms) pero no a - 50 mV (Figura 10 B). La disminución a pH 4,5 (1 M de KCl, 0,1 M de ácido cítrico, 180 mM de Tris Base) condujo a un aumento en la frecuencia de captura a 50 mV (Figura 10B, tiempo de permanencia: 8,5 ± 1,8 ms, tiempo entre eventos: 402 79 ms), a pesar de la reducida movilidad electroforética hacia el electrodo trans.

A continuación, se ensayó la proteína quimotripsina (pI 8,75, Sigma) como un ejemplo de un analito proteico relativamente grande. Se observaron bloqueos de proteínas a - 50 mV en buffer de pH 7,5 (1 M de KCl, 15 mM de Tris), aunque se volvieron homogéneos cuando aumentamos el potencial a -100 mV (45,2 ±19,1 eventos s^{-1 j} M '1, tiempo de permanencia: 12,0 ± 5,7 ms), mientras que no se observó captura a potenciales positivos aplicados (Figura 10C). Al contrario de lo observado con la endotelina 1, la frecuencia de captura de quimotripsina se mantuvo constante entre pH 7,5 y 5,5 (45,2 ± 19,1 eventos s^{-1 j} M '1 a pH 7,5, 50,5 ± 22,6 eventos s^{-1 j} M '1 a pH 6,4, 45,2 ± 20,6 eventos s^{-1 j} M '1 a pH 5,5,), y disminuyó cuando el pH se redujo a 4,4 (20,8 ± 5,3 eventos s^{-1 j} M '1 a pH 4,4). Mediante el uso de ReFraC a pH 7,5, observamos solo unos pocos bloqueos a potenciales positivos aplicados altos (tiempo de permanencia: 0,2 ± 0,1 ms, tiempo entre eventos: 174,3 ± 22,9 ms a 200 mV) pero no a - 50 mV (Figura 10 C). La disminución del pH a 4,5 condujo a un aumento en la frecuencia de captura (tiempo de permanencia: 1,3 ± 0,7 ms, 112,5 ± 9,5 eventos s^{-1 j} M '1, Figura 9B). En particular, ReFraC mostró eventos de compuerta a menudo poco profundos a potenciales negativos aplicados bajo condiciones ácidas como se muestra en la Figura 10C en la parte inferior a la derecha. Tomados en conjunto, ambos nanoporos pueden capturar analitos que difieren 10 veces en peso molecular (2,5 kD frente a 25 kDa).

Ejemplo 6: Selectividad iónica y potencial electrostático de los nanoporos de FraC.

Para obtener una mejor comprensión de la influencia del pH en el entorno electrostático y el flujo electroosmótico en la entrada de polipéptidos dentro de los nanoporos de FraC, usamos Adaptive Poission-Boltzmann Solver (APBS (13) y una versión modificada del software PDB2PQR (14) para estimar el potencial electrostático dentro de los modelos de homología de WtFraC y ReFraC a pH 7,5 y 4,5 en 1 M de KCl. Las simulaciones mostraron que las regiones de constricción de WtFraC y ReFraC en el centro del nanoporo exhibían potenciales altamente negativos y positivos, respectivamente (Figura 11A). Curiosamente, mientras que para WtFraC la reducción del pH de 7,5 a 4,5 provocó un potencial de reducción en el centro de la constricción de - 1,2 a - 0,7 k^eT/e^c (1 k^eT/e^c = 25,6 mV a 298 K) respectivamente, no se observó tal efecto para ReFraC.

La contribución del flujo electroosmótico a la captura de analitos con poros de WtFraC y ReFraC se estimó al medir la selectividad iónica de ambos poros mediante el uso de concentraciones asimétricas de KCl a cada lado del nanoporo (1960 mM y 467 mM). El potencial de inversión (V^r), es decir el potencial al que la corriente es cero (Figura 11B), se usó luego, junto con la ecuación de Goldman-Hodgkin-Katz, para calcular la selectividad iónica (P^k+/P^ci-) de ambos nanoporos:

dónde [ax] comp es la actividad del ion X en los compartimientos cis/trans, R es la constante del gas, T la temperatura y F la constante de Faraday. Descubrimos que la selectividad iónica de los nanoporos de FraC se domina por la carga en la constricción, siendo WtFrac fuertemente selectiva a los cationes (P^k+ /P^ci- = 3,55 ± 0,30, pH 7,5) y selectivo de aniones ReFraC (P^k+/P^ci- = 0,57 ± 0,04, pH 7,5). La reducción del pH a 4,5 disminuyó la selectividad catiónica de WtFraC (P^k+/P^ci-= 2,02 ± 0,15, pH 7,5) mientras que aumentó la selectividad aniónica de ReFraC (P^k+/P^ci- = 0,36 ± 0,08, pH 4,5, Figura 11B).

Ejemplo 7: Detección de biomarcadores con el nanoporo de WtFraC.

Después de evaluar la captura de la quimotripsina (25 kD, 245 aminoácidos) y endotelina 1 (12,5 kD, 21 aminoácidos), que son biomarcadores proteicos para quistes pancreáticos (15) y bronquiolitis obliterante (16), respectivamente, se usaron los nanoporos de WtFraC para detectar una gama más amplia de biomarcadores de proteínas, incluida la microglobulina p2, un biomarcadorde 11,6 kDa (99 aminoácidos) para la enfermedad arterial periférica (17), EGF humano, un biomarcadorde 6,2 kDa (53 aminoácidos) para la enfermedad renal crónica (18), y la angiotensina I, un biomarcador de 1,3 kD (10 aminoácidos) para la crisis hipertensiva (19).

Todos los biomarcadores se evaluaron con potenciales negativos aplicados y, con la excepción de la quimotripsina, a un pH de 4,5. La frecuencia de captura de todos los biomarcadores aumentó con el potencial aplicado. Todos los demás parámetros probados mostraron una dependencia de la tensión no uniforme. El tiempo de residencia de los biomarcadores dentro de WtFraC aumentó (quimotripsina), disminuyó (microglobulina p2 y angiotensina 1) o mostró un comportamiento bifásico con el potencial aplicado (EGF y endotelina 1). Ver la Figura 12. La dependencia de la tensión del porcentaje de corriente residual (% de Ires) de la quimotripsina disminuyó con el potencial, el % de Ires de la endotelina 1 aumentó con el potencial, mientras que el % de Ires de la microglobulina p2, el EGF y la angiotensina 1 permaneció constante. A pesar de la compleja dependencia de la tensión de los bloqueos de corriente, nuestros resultados mostraron que el nanoporo de WtFraC es capaz de distinguir biomarcadores de oligopéptidos y proteínas de diferentes tamaños en virtud del % de Ires de solo sus bloqueos de corriente (Figura 12).

Ejemplo 8: Discriminación de oligopéptidos casi isoformas.

Para desafiar nuestro sistema experimental, buscamos identificar analitos muy similares. Elegimos endotelina 1 (ET-1) y endotelina 2 (ET-2), oligopéptidos casi isoméricos que se diferencian solo en uno de los veintiún aminoácidos (Figura 13A y 13B). A - 50 mV, observamos bloqueos distinguibles con % de Ires y tiempo de permanencia únicos (Figura 12B) para ET-1 (% de Ires 8,9 ± 0,1 %, tiempo de permanencia 5,6 ± 2,0 ms, N = 3, n = 600) y ET- 2 (6,1 ± 1,4 %, tiempo de permanencia 19,0 ± 5,3 ms, N = 3, n = 384). Esto permitió ya su identificación a nivel de bloqueo individual (Figura 13C).

Sorprendentemente, cuando añadimos consecutivamente los primeros 2 de ET-1 (Figura 13D) seguido de 8 de ET-2 al mismo poro (Figura 13E), también pudimos separar una mezcla de ambas poblaciones distintas trazando la desviación estándar de la amplitud de eventos sobre su correspondiente % de Ires. Esta observación indica que pueden discriminarse (oligo) péptidos u otros analitos muy similares con un nanoporo de FraC.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un sistema que comprende un nanoporo proteico en forma de embudo que comprende una toxina formadora de poros a helicoidales que es un miembro de la familia de las proteínas actinoporinas, en donde la toxina formadora de poros a helicoidales es una Fragaceatoxina C mutante (FraC) que comprende una mutación en la posición 10 en un residuo de aminoácido cargado positivamente o neutro.

2. Sistema de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la FraC mutante comprende la mutación AsplOArg o Asp10Lys.

3. Sistema de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la FraC mutante comprende además una o más mutaciones compensatorias para recuperar la actividad hemolítica de FraC, preferentemente en donde dicha mutación compensatoria está presente en la posición 2, 9, 34, 52, 112, 150, 153 y/o 159, preferentemente en la posición 159.

4. Sistema de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la FraC mutante es el mutante doble Asp10Arg/Lys159Glu.

5. Un método para proporcionar un sistema de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende las etapas de

-proporcionar monómeros recombinantes de dicha toxina formadora de poros a helicoidales FraC mutante; - poner en contacto dichos monómeros con liposomas para ensamblarlos en oligómeros;

- recuperar los oligómeros de los liposomas; y

- poner en contacto los oligómeros con una bicapa lipídica, que puede contener esfingomielina, para permitir la formación de los nanoporos.

6. Un método que comprende aplicar un campo eléctrico a un sistema de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el nanoporo en forma de embudo que comprende una toxina formadora de poros a helicoidales se coloca entre un primer medio líquido conductor y un segundo medio líquido conductor, preferentemente en donde al menos uno de los medios líquidos conductores comprende un analito, con la máxima preferencia que comprende además detectar el analito en un método que comprende medir una corriente iónica cuando el analito interactúa con el nanoporo para proporcionar un patrón de corriente, en donde la aparición de un bloqueo en el patrón de corriente indica la presencia del analito.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el analito es un nucleótido, un ácido nucleico, un aminoácido, un péptido, un oligopéptido, una proteína, un polímero, un fármaco, un ion, un contaminante, un objeto nanoscópico o un agente de guerra biológica.

8. El método de la reivindicación 7, en donde el polímero se selecciona del grupo que consiste en una proteína, un polipéptido, un oligopéptido, un péptido desplegado, un oligopéptido desplegado y una proteína desplegada.

9. El método de la reivindicación 7, en donde el polímero es un ácido nucleico, preferentemente en donde el ácido nucleico es ADNmc, ADNbc, ARN o una de sus combinaciones.

10. Un nanoporo de Fragaceatoxina C (FraC) mutante que comprende al menos un primer monómero de FraC mutante que comprende una mutación en la posición 10 en un residuo de aminoácido cargado positivamente, que comprende preferentemente la mutación AsplOArg o Asp10Lys.

11. El mutante de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la FraC mutante comprende la mutación AsplOArg, preferentemente AsplOArg y Lys159Glu.

12. El uso de un sistema de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o un nanoporo de FraC mutante de acuerdo con la reivindicación 10 u 11 para la detección de biopolímeros y/o la secuenciación de biopolímeros, preferentemente en donde dicho biopolímero es una proteína, un péptido o un ácido nucleico.

13. El uso de la reivindicación 12, en donde el biopolímero es un ácido nucleico, preferentemente en donde el ácido nucleico es ADNmc, ADNbc, ARN o una de sus combinaciones.

14. El uso de la reivindicación 12, en donde dicho biopolímero es una proteína, un polipéptido, un oligopéptido, un péptido desplegado, un oligopéptido desplegado o una proteína desplegada.