ES2842201T3

ES2842201T3 - Inhibidor de HER3 para modulación de radiosensibilidad

Info

Publication number: ES2842201T3
Application number: ES13705987T
Authority: ES
Inventors: Deric L Wheeler; Thore Hettmann
Original assignee: Daiichi Sankyo Europe GmbH
Current assignee: Daiichi Sankyo Europe GmbH
Priority date: 2012-02-23
Filing date: 2013-02-22
Publication date: 2021-07-13
Anticipated expiration: 2033-02-22
Also published as: KR102051505B1; JP2015509944A; EP2817340A1; US20150017096A1; US20190388540A1; CN104136464A; US10357566B2; HK1199044A1; JP6207531B2; US11351259B2; JP6368811B2; WO2013124419A1; IN2014KN01772A; CA2865256A1; EP2817340B1; JP2017165711A; BR112014020666A2; KR20140123544A; CN108404129A; CA2865256C

Abstract

Un inhibidor de HER-3 para su uso en el tratamiento de cáncer en combinación con tratamiento con radiación seleccionado de radioterapia de haces externos y braquiterapia, en el que el inhibidor es un anticuerpo anti- HER3 o un fragmento de unión a antígeno del mismo en el que el anticuerpo se dirige contra el dominio extracelular de HER-3 y comprende una CDRH1 tal como se muestra en SEQ ID NO. 562, una CDRH2 tal como se muestra en SEQ ID NO. 563, una CDRH3 tal como se muestra en SEQ ID NO. 564, una CDRL1 tal como se muestra en SEQ ID NO. 565, una CDRL2 tal como se muestra en SEQ ID NO. 566 y una CDRL3 tal como se muestra en SEQ ID NO. 567, y en el que el inhibidor se administra antes de tratamiento con radiación.

Description

DESCRIPCIÓN

Inhibidor de HER3 para modulación de radiosensibilidad

La presente invención se refiere a un inhibidor de HER-3 para su uso en el tratamiento del cáncer en combinación con tratamiento con radiación.

El receptor del factor de crecimiento epidérmico humano 3 (HER-3, también conocido como ErbB3) es una proteína receptora tirosina cinasa y pertenece a la subfamilia de receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR) de la proteína receptora tirosina cinasa, que también incluye HER-1 (también conocido como EGFR), HER-2 y HER-4 (Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87 (1990), 4905-4909; Kraus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (1989), 9193-9197; y Kraus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (1993), 2900-2904). Al igual que el receptor prototípico de factor de crecimiento epidérmico, el receptor transmembrana HER-3 consiste en un dominio de unión a ligando extracelular (ECD), un dominio de dimerización dentro del ECD, un dominio transmembrana, un dominio intracelular de proteína tirosina cinasa (TKD) y un dominio de fosforilación de extremo C-terminal.

El ligando heregulina (HRG) se une al dominio extracelular de HER-3 y activa la ruta de señalización mediada por receptor promoviendo la dimerización con otros miembros de la familia del receptor de factor de crecimiento epidérmico humano (HER) y la transfosforilación de su dominio intracelular. La formación de dímeros entre miembros de la familia HER expande el potencial de señalización de HER-3 y es un medio no solo para la diversificación de señales sino también para la amplificación de señal. Por ejemplo, el heterodímero HER-2/HER-3 induce una de las señales mitogénicas más importantes entre los miembros de la familia HER.

Se ha encontrado que HER-3 está sobreexpresado en varios tipos de cáncer, tales como cánceres de mama, gastrointestinales y de páncreas. Curiosamente se ha demostrado una correlación entre la expresión de HER-2/HER-3 y la progresión de un estadio no invasivo a otro invasivo (Alimandi et al., Oncogene 10,1813-1821; deFazio et al., Cancer 87, 487-498; Naidu et al., Br. J. Cancer 78, 1385-1390). Por consiguiente, son deseables agentes que interfieren con la señalización mediada por HER-3. Se han notificado anticuerpos de HER-3 murinos o quiméricos, tal como en los documentos US5968511, US5480968 y WO03013602.

Además, el documento WO 2011/060206 da a conocer el anticuerpo anti-HER-3 monoclonal U1-59 y su uso en combinación con un segundo agente activo que se une e inhibe la actividad de otro miembro de la familia HER.

El documento EP 2 138511 da a conocer inhibición de HER-3 por ARNip para el tratamiento de melanoma.

Harari et al. (Int. J. Radiation, 2011, 81(2) Suppl.S77) da a conocer un anticuerpo específico dual dirigido a EGFR y HER3, MEHD7945A (MEHD), que potencia la radiosensibilidad y supera la resistencia adquirida a inhibidores de EGFR en líneas celulares de HNSCC in vitro.

Además, Contessa et al. (Breast Cancer Res. Treat. 2006, 95, 17-27) da a conocer que la señalización ErbB3/c-Src es radioprotectora y que su eliminación potencia la apoptosis inducida por radiación, dependiente del estado de fosforilación de ErbB3 (= HER-3).

El objeto de la presente invención fue proporcionar un tratamiento de cáncer, basado en la inhibición de1HER-3 que es más eficaz que la conocida a partir de la técnica anterior. Este objeto se resuelve mediante la provisión de un inhibidor de HER-3 para el uso en el tratamiento de cáncer en combinación con tratamiento con radiación.

La invención se define por las reivindicaciones y cualquier otro aspecto o realización expuesto en el presente documento que no esté dentro del alcance de las reivindicaciones son únicamente informativos.

Según un primer aspecto la presente invención se refiere a un inhibidor de HER-3 tal como se define en las reivindicaciones para el uso en el tratamiento de cáncer en combinación con tratamiento con radiación.

El tratamiento de una combinación de un inhibidor de HER-3 y radioterapia conduce a efectos sinérgicos que superan las ventajas de un tratamiento o bien con un inhibidor de HER-3 o bien solo radioterapia.

Un inhibidor de HER-3 para su uso según la presente divulgación puede actuar sobre el nivel proteico o sobre el nivel de ácido nucleico. Ejemplos de inhibidores que actúan sobre el nivel de ácido nucleico son conocidos por el experto en la técnica y comprenden moléculas antisentido, moléculas de iARN y/o ribozimas.

Ejemplos de un inhibidor que actúa sobre el nivel proteico es un anticuerpo anti-HER-3 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, así como las proteínas de armazón. El inhibidor que es un anticuerpo anti-HER-3 o un fragmento del mismo, en particular un fragmento de unión a antígeno del mismo, representa una realización preferida de la presente invención. Según el término de la invención “fragmento de anticuerpo” comprende cualquier parte de los anticuerpos mencionados anteriormente, preferiblemente su unión a antígeno o regiones variables.

Tal como se usa en el presente documento, “proteína de armazón” representa una proteína que tiene una actividad de unión similar a anticuerpo o un anticuerpo, es decir, un anticuerpo anti-HER-3. Dentro del contexto de la presente invención, el término “proteína de armazón”, tal como se usa en el presente documento, significa un polipéptido o proteína con áreas superficiales expuestas en las que las inserciones, sustituciones o deleciones de aminoácidos son altamente tolerables. Ejemplos de proteínas de armazón que pueden usarse según la presente divulgación son la proteína A de Staphylococcus aureus, la proteína de unión a bilina de Pieris brassicae u otras lipocalinas, proteínas de repetición de anquirina y fibronectina humana (revisado en Binz y Pluckthun, Curr Opin Biotechnol, 16, 459-69). Además, una proteína de armazón que tiene una actividad de unión similar a anticuerpo puede derivarse de un polipéptido aceptor que contiene el dominio de armazón, que puede injertarse con dominios de unión de un polipéptido donante para conferir la especificidad de unión del polipéptido donante en el dominio de armazón que contiene el polipéptido aceptor.

El anticuerpo anti-HER-3 para su uso según la invención puede ser un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico o un fragmento de unión a antígeno del mismo. El uso de un anticuerpo monoclonal se prefiere especialmente. Un experto en la técnica sabe cómo producir tales anticuerpos. Los anticuerpos monoclonales pueden, por ejemplo, producirse por cualquier método adecuado, tal como el de Kohler y Millstein (Nature, 1975; 256:495-497).

Un fragmento de anticuerpo para su uso según la invención es preferiblemente un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')², un fragmento Fv, un diacuerpo o una molécula de anticuerpo de cadena sencilla. El “fragmento Fab” se diferencia del “fragmento Fab'” por la adición de unos pocos residuos en el extremo terminal carboxilo del dominio CH1 de cadena pesada incluyendo una o más cisteínas de la región de bisagra de anticuerpos. El “fragmento F(ab')²” originalmente se produce como un par de “fragmentos Fab'“ que tienen cisteínas de bisagra entre los mismos. Según la presente invención, el “fragmento de Fv” es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio completo de reconocimiento de y unión a antígeno.

El anticuerpo usado según la invención puede ser preferiblemente del tipo de anticuerpo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.

Formas humanizadas de anticuerpos representan una realización preferida adicional y puede generarse según los métodos conocidos en la técnica tal como la humanización o el injerto de CDR. Métodos alternativos para producir anticuerpos humanizados se conocen mucho en la técnica y se describen, por ejemplo, en los documentos EP 0239 400 y WO 90/07861. Anticuerpos humanos evitan algunos de los problemas asociados con anticuerpos xenogénicos, por ejemplo, anticuerpos que poseen regiones constantes y/o variables murinas o de rata. Anticuerpos anti-HER-3 humanizados monoclonales representan una realización especialmente preferida de la invención.

Según una realización preferida adicional el anticuerpo se dirige contra el dominio extracelular de HER-3. El anticuerpo anti-HER-3 preferiblemente interactúa con al menos un epítopo en la parte extracelular de HER-3. Los epítopos están ubicados preferiblemente en el dominio L1 (AA19-184), que es el dominio de extremo terminal amino, en el dominio S1 (AA185-327) y S2 (AA500-632), que son los dos dominios ricos en cisteína o en el dominio L2 (328-499), que está flanqueado por los dos dominios ricos en cisteína. Los epítopos también pueden estar ubicados en cualquier combinación de dominios como, pero sin limitarse a, un epítopo compuesto por partes de L1 y S2.

El anticuerpo anti-HER-3 usado puede acoplarse a un efector y/o un grupo de etiquetaje. Se conocen por el experto en la técnica técnicas de etiquetaje y/o de acoplamiento correspondientes. Tales grupos de etiquetaje y/o efectores pueden unirse para el direccionamiento de fármacos, aplicaciones de obtención de imágenes y/o aplicaciones de diagnóstico.

Tal como se usa en el presente documento, el término “grupo de etiquetaje” se refiere a un marcador detectable, por ejemplo, un aminoácido radioetiquetado o fracción de biotinilo que puede detectarse mediante avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina unida a un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede detectarse mediante métodos ópticos o colorimétricos). Ejemplos de grupos de etiquetaje adecuados incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), grupos fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos lantánido), grupos enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, pgalactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), grupos quimioluminiscentes, grupos biotinilo o epítopos de polipéptido predeterminados reconocidos por un indicador secundario (por ejemplo, secuencias de pares de cremallera de leucinas, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, marcas de epítopo). En determinados aspectos, puede ser deseable que los grupos de etiquetaje estén unidos por brazos separadores de diversas longitudes para reducir el impedimento estérico potencial.

Alternativamente, un anticuerpo anti-HER-3 usado según la invención puede acoplarse a un grupo efector. Tal como se usa en el presente documento, el término “grupo efector” se refiere a un grupo citotóxico tal como un radioisótopo o radionúclido, una toxina, un grupo terapéutico u otro grupo efector conocido en la técnica. Ejemplos de grupos efectores adecuados son radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), caliqueamicina, análogos de dolastatina tales como auristatinas, y agentes quimioterapéuticos tales como geldanamicina y derivados de maitansina, incluyendo DM1. En determinados aspectos, puede ser deseable que los grupos efectores estén unidos por brazos separadores de diversas longitudes para reducir el impedimento estérico potencial.

Además de la inhibición de HER-3, es posible según una realización preferida adicional llevar a cabo o soportar el tratamiento con radiación etiquetando el anticuerpo anti-HER-3 con un grupo efector correspondiente, tales como radioisótopos o radionúclidos descritos anteriormente.

Además, el inhibidor de HER-3 usado, y en particular el anticuerpo anti-HER-3 usado, puede caracterizarse además porque su unión a HER-3 reduce la transducción de señal mediada por HER-3. Según la presente invención, una reducción de la transducción de señal mediada por HER-3 puede provocarse, por ejemplo, por una regulación por disminución del HER-3 que da como resultado una desaparición al menos parcial de moléculas de HER-3 de la superficie celular o por una estabilización de HER-3 en la superficie celular en una forma sustancialmente inactiva, es decir, forma que muestra una transducción de señal más baja en comparación con la forma no estabilizada. Alternativamente, una reducción de transducción de señal mediada por HER-3 también puede provocarse influyendo, por ejemplo, disminuyendo o inhibiendo, la unión de un ligando u otro miembro de la familia h Er a HER-3, de GRB2 a HER-2 o de GRB2 a SHC, inhibiendo la fosforilación de receptor de tirosina, la fosforilación AKT, la fosforilación de tirosina PYK2 o fosforilación ERK2, o disminuyendo la invasividad tumoral. Alternativamente, una reducción de la transducción de señal mediada por HER-3 también puede provocarse influyendo, por ejemplo, disminuyendo o inhibiendo, la formación de dímeros que contienen HER-3 con otros miembros de la familia HER. Un ejemplo entre otros puede ser la disminución o inhibición de la formación del complejo proteico HER3-EGFR.

Anticuerpos anti-HER-3 preferidos se describen en el documento WO 2007/077028.

Según una realización especialmente preferida el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que comprende al menos una de las CDR seleccionadas del grupo que consiste en (a) CDRH1 tal como se muestra en SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 y 230; (b) CDRH2 tal como se muestra en SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 y 230; y (c) CDH3 tal como se muestra en SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 y 230 o una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que muestra al menos un 90 %, 92 %, 94 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de homología con respecto a una de las CDR según de (a) a (c).

Según una realización preferida adicional el anticuerpo comprende en el que el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que comprende al menos una de las CDR seleccionadas del grupo que consiste en: (d) CDRL1 tal como se muestra en SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 y 232; (e) CDRL2 tal como se muestra en SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 y 232; y (f) CDRL3 tal como se muestra en SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 y 232 o una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que muestra al menos un 90 %, 92 %, 94 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de homología con respecto a una de las CDR según de (d) a (f).

En otra realización más el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que comprende al menos una de las CDR seleccionadas del grupo que consiste en

(a) CDRH1 tal como se muestra en SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 y 230;

(b) CDRH2 tal como se muestra en SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 y 230; y

(c) CDH3 tal como se muestra en SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 y 230,

y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que comprende al menos una de las CDR seleccionadas del grupo que consiste en:

(d) CDRL1 tal como se muestra en SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 y 232;

(e) CDRL2 tal como se muestra en SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 y 232; y

(f) CDRL3 tal como se muestra en SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 y 232.

Según una realización preferida adicional, el anticuerpo comprende una CDRH1, una CDRH2, una CDRH3, una CDRL1, una CDRL2 y una CDRL3.

Según una realización preferida adicional, un anticuerpo anti-HER-3 comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 y 230.

Una realización preferida adicional se refiere al uso de un anticuerpo anti-HER-3 que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 y 232.

Según otra realización preferida más, un anticuerpo anti-HER-3 comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 y 230; y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 y 232.

Realizaciones especialmente preferidas se refieren a anticuerpos anti-HER-3 que comprenden la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO:42 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID NO:44, o que comprenden la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO:54 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID NO:56, o que comprenden la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO:70 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID NO:72.

En particular, el anticuerpo anti-HER-3 se selecciona del grupo que consiste en anticuerpo U1-1, anticuerpo U1-2, anticuerpo U1-3, anticuerpo U1-4, anticuerpo U1-5, anticuerpo U1-6, anticuerpo U1-7, anticuerpo U1-8, anticuerpo U1-9, anticuerpo U1-10, anticuerpo U1-11, anticuerpo U1-12, anticuerpo U1-13, anticuerpo U1-14, anticuerpo U1-15, anticuerpo U1-16, anticuerpo U1-17, anticuerpo U1-18, anticuerpo U1-19, anticuerpo U1-20, anticuerpo U1-21, anticuerpo U1-22, anticuerpo U1-23, anticuerpo U1-24, anticuerpo U1-25, anticuerpo U1-26, anticuerpo U1-27, anticuerpo U1-28, anticuerpo U1-29, anticuerpo U1-30, anticuerpo U1-31, anticuerpo U1-32, anticuerpo U1-33, anticuerpo U1-34, anticuerpo U1-35, anticuerpo U1-36, anticuerpo U1-37, anticuerpo U1-38, anticuerpo U1-39, anticuerpo U1-40, anticuerpo U1-41, anticuerpo U1-42, anticuerpo U1-43, anticuerpo U1-44, anticuerpo U1-45, anticuerpo U1-46, anticuerpo U1-47, anticuerpo U1-48, anticuerpo U1-49, anticuerpo U1-50, anticuerpo U1-51, anticuerpo U1-52, anticuerpo U1-53, anticuerpo U1-55.1, anticuerpo U1-55, anticuerpo U1-57.1, anticuerpo U1-57, anticuerpo U1-58, anticuerpo U1-59, anticuerpo U1-61.1, anticuerpo U1-61, anticuerpo U1-62 o un anticuerpo que tiene al menos una cadena pesada o ligera de uno de dichos anticuerpos. Los anticuerpos U1-49 se prefieren especialmente (SEQ ID NO: 42/44), U1-53 (SEQ ID NO: 54/56) y U1-59 (SEQ ID NO: 70/72) o un anticuerpo que tiene al menos una cadena pesada o ligera de uno de dichos anticuerpos. Se prefiere particularmente el anticuerpo U1-59.

La afección a tratar según la presente invención es cáncer, en particular, carcinoma de células escamosas.

Ejemplos de cáncer que se tratan preferiblemente según la presente invención se seleccionan del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer gastrointestinal, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de estómago, cáncer de endometrio, cáncer de glándula salival, cáncer de pulmón, cáncer de riñón, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de tiroides, cáncer de vejiga, glioma, melanoma, cáncer de testículo, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de cabeza y cuello, otros cánceres que expresan o sobreexpresan HER-3 y formación de metástasis tumorales.

Según una realización especialmente preferida el cáncer es carcinoma de células escamosas de pulmón, de la cabeza y/o el cuello.

Se selecciona tratamiento con radiación según la presente invención de radioterapia de haces externos y braquiterapia. El experto en la técnica puede determinar qué tipo de tratamiento con radiación y, en particular, qué tipo de fuente de radiación va a usarse para un paciente concreto a tratar.

La radioterapia de haces externos es la forma más común de radioterapia. A diferencia de la radioterapia interna (braquiterapia), la radioterapia de haces externos dirige la radiación hacia el tumor desde el exterior del cuerpo. El voltaje que debe usarse puede determinarse por el experto en la técnica y depende, entre otras cosas, del tipo de tumor a tratar. Por ejemplo, pueden usarse rayos X de kilovoltaje para tratar un cáncer de piel y estructuras superficiales, mientras que pueden usarse rayos X de megavoltaje para tratar tumores profundamente arraigados (por ejemplo, próstata, pulmón o cerebro). Mientras que los haces de rayos X y electrones son con mucha diferencia las fuentes más ampliamente usadas para radioterapia de haces externos, también pueden usarse haces de partículas más pesadas, tales como haces de protones.

Tal como ya se describió anteriormente, la braquiterapia también se conoce como radioterapia interna. Es una forma de radioterapia, donde una fuente de radiación se coloca dentro o cerca del área que requiere tratamiento. En la braquiterapia, se colocan de manera precisa fuentes de radiación directamente en el lado del tumor canceroso. Esto significa que la radiación solo afecta a un área local limitada, lo que proporciona ventajas sobre la radioterapia de haces de rayos X. Por ejemplo, el tumor puede tratarse con dosis muy altas de radiación localizada, reduciendo al mismo tiempo la probabilidad de daños innecesarios a tejidos sanos circundantes. Ejemplos de fuentes de radiación usadas para braquiterapia comprenden 125I/103Pd, 90Y, así como radioterapia interna selectiva (SIRT). La SIRT comprende el uso de microesferas, que podrían, por ejemplo, inyectarse. Tales microesferas pueden hacerse de resina o vidrio. Dentro de la microesfera puede colocarse la fuente de radiación tal como el itrio-90. Ejemplos de microesferas que ya se usan son las esferas TherSphere y SIR-Spheres, que difieren en su radiactividad por esfera y efecto embólico. Naturalmente, también se contempla el uso de cualquier portador adecuado adicional acoplado a una fuente de radiación. Ejemplos adicionales de medicamentos usados en braquiterapia comprenden SAVI, MammoSite, Contura, Proxcelan e I-Seed.

El tratamiento con radiación usado según la invención puede basarse en una dosis única o una dosificación fraccionada de radiación. Naturalmente, también es posible variar la duración de la radioterapia. La duración puede depender de la ubicación de los tumores que van a tratarse, del tamaño del tumor que va a tratarse y de la condición física del paciente.

La combinación de un inhibidor de HER-3 y radioterapia y/o tratamiento con radiación para su uso según la presente divulgación contempla el tratamiento simultáneo con un inhibidor de HER-3 y radioterapia, así como una combinación cambiada de manera oportuna. Según una realización preferida, las células tumorales que van a tratarse se radiosensibilizan por el inhibidor de HER-3 antes de tratamiento con radiación, es decir, el inhibidor de HER-3 se administra antes de tratamiento con radiación/radioterapia.

La presente invención puede usarse en combinación con un compuesto activo adicional como un compuesto quimioterapéutico adicional tal como agentes citotóxicos, tal como doxorrubicina, cisplatino o carboplatino, citocinas o agentes antineopláticos.

Otro aspecto de la presente divulgación se refiere al uso de un inhibidor de HER-3 para la modulación de la radiosensibilidad de células.

Breve descripción de las figuras

Figura 1.

(A) Perfil de HER3 en múltiples líneas celulares de carcinoma.

Se cultivaron cinco líneas celulares de carcinoma pulmonar humano (NCI-H226, H292, H358, H520 y A549), cinco líneas celulares de carcinoma colorrectal (Caco2, SW48, LS180, Lovo y HCT116) y cinco líneas celulares de carcinoma de cabeza y cuello (SCC1, SCC6, SCC11A, SCC38 y SCC1483) en medios relevantes. El lisado de células completas se obtuvo con tampón de lisis. La proteína se cuantificó usando el método Bradford, se separó por gel SDS y seguido de inmunotransferencia con los anticuerpos indicados.

(B) La actividad basal de HER3 está bloqueada por U1-59.

Se trataron cuatro líneas celulares de carcinoma de cabeza y cuello (SCC6, SCC11A, SCC38, SCC1483) con alto p-HER3 y dos líneas celulares de cáncer de pulmón (H226 y a 549) con dosis de U1-59 durante 24h. Se aislaron lisados de células completas y seguido de inmunotransferencia con anticuerpos indicados. U1-59 inhibió la actividad de HER3 y su señal en dirección 3' de una manera dependiente de la dosis en esas células.

Figura 2:

La activación inducida por radiación de HER3 está bloqueada por U1-59. (A, D) Se activó HER3 transitoriamente por radiación durante el tiempo indicado y se bloqueó por U1-59. Se incubaron células SCC6 y H226 con/sin U1-59 (20 ug/ml) durante 24h antes de la radiación. Después de la exposición a la radiación 4Gy, se aislaron lisados de células completas en los tiempos indicados, seguido de inmunotransferencia con anticuerpos p-HER, p-AKT y p-MAPK. (B, E) U1-59 siguió bloqueando las activaciones de AKT y MAPK 24h y 48h después de la radiación. (C, F) Se activó por radiación la inmunoflurescencia que muestra HER3 y se bloqueó por U1-59 en células SCC6 y H226 (30 minutos después de la radiación).

Figura 3.

(A, F) U1-59 inhibió la proliferación celular de una manera dependiente de la dosis. Se sembraron células SCC6 y H226 en placas de 96 pocillos y se incubaron con dosis de U1-59 durante 72h. Se detectó proliferación celular usando CCK872h. (B, G) Efecto de sensibilización de U1-59 sobre células SCC6 en respuesta a la radiación. Se incubaron SCC6 y H226 con U1-59 durante 4 h, y se irradiaron con dosis indicadas. Se realizaron ensayos clonogénicos tal como se describe. Se expusieron curvas de control a radiación sin tratamiento con U1-59.

(C, H) Impacto de U1-59 en el ciclo celular.

Se incubaron células SCC6 y H226 con U1-59 (20 ug/ml) durante 48h, seguido de exposición a radiación de 6 Gy. 24h después de la radiación, se detectó el ciclo celular (teñido con PI) usando un citómetro de flujo y se analizó por FlowJo. U1-59 provocó la detención de G1 y la radiación provocó la detención de G2. La combinación de U1-59 y células redistribuidas por radiación dentro del ciclo celular indujo la acumulación de células en G1 y G2, y redujo la población de células en la fase S.

(D, I) Impacto de U1-59 en apoptosis celular.

Se detectó apoptosis (teñida con anexina V/PI) usando citómetro de flujo y se analizó por FlowJo. La combinación de U1-59 con radiación aumentó el porcentaje de células apoptóticas.

(E, J) U1-59 contribuyen a la formación de foco de y-H2AX.

Se incubaron SCC6 y H226 con U1-59 durante 24h antes de la radiación de 4 Gy. 4h después de la radiación, se fijaron células y se realizó tinción de inmunoflurescencia. En comparación con fármaco o radiación sola, se detectó un aumento en número de focos de y-H2AX en la célula tratada con XRT combinada con U1-59, daño de ADN potenciado demostrado por U1-59

Figura 4.

Efecto antitumoral de U1-59 combinado con radiación sobre tumores de xenoinjerto en ratones atímicos. Se realizaron xenoinjertos SCC6, SCC1483 y H226 tal como se describe en “Materiales y métodos”. (A) Se trataron ratones con dosis única de IgG, radiación (10 Gy o 16 Gy), U1-59 (8 mg/kg) o combinación de ambos. Se expresaron puntos de datos como tamaño de tumor medio ± DE. Se representaron gráficamente los resultados con la curva de crecimiento tumoral y la curva de supervivencia de Kaplan Meir. (B) Se trataron ratones con dosis fraccionadas de IgG, radiación, U1-59 (100 ug/ratón) o combinación de ambos dos veces por semana tal como se muestra. Se representaron gráficamente los resultados con la curva de crecimiento tumoral y la curva de supervivencia de Kaplan Meir.

Figura 5.

U1-59 inhibe la activación basal e inducida por radiación de HER3 en tumores de xenoinjerto. Se recolectaron tumores de xenoinjerto SCC6, SCC1483 y H226 24 horas después de la radiación o de la última radiación en grupos de tratamiento fraccionados. Se aisló la proteína de los tumores y se analizó p-HER3 por inmunotransferencia de tipo Western. Se encontró p-HER3 aumentado en los tumores radiados y se encontró p-HER3 reducido en tumores con U1-59 o tratamiento combinado.

Figura 6.

U1-59 inhibe las señales de supervivencia celular y potencia el daño de ADN en combinación con radiación en tumores de xenoinjerto en ratones atímicos. Tumores de xenoinjerto SCC6 con tratamiento de dosis única de radiación (16 Gy), U1-59 (8 mg/kg) o combinación de ambos. Se cosecharon tumores 24 horas después del tratamiento. Se realizó tinción de IHC tal como se describe en “Materiales y métodos”. Se detectaron en tumores con U1-59 o tratamiento combinado una tinción de p-MAPK, p-S6 y PCNA reducida, células positivas para PCNA disminuidas y células positivas para y-H2AX aumentada.

Ejemplos

Materiales y métodos

Cultivo celular y fármaco

Cinco líneas celulares de carcinoma de pulmón humanas (NCI-H226, H292, H358, H520 y A549) y cinco líneas celulares de carcinoma colorrectal (Caco2, SW48, LS180, Lovo y HCT116) se adquirieron de ATCC (Manassas, VA, EE. UU.) y se mantuvieron en suero fetal bovino (FBS) al 10 % en RPMI1640 o Dm EM (Mediatech Inc., Manassas, VA, EE.UU.) con penicilina al 1 % y estreptomicina. Se obtuvieron cinco líneas celulares de carcinoma de cabeza y cuello (células UM-SCC1, UM-SCC4, UM-SCC6, UM-SCC11A y UMSCC1483) de la Universidad de Michigan y se mantuvieron en FBS al 10 % (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) en DMED suplementado con hidrocortisona al 1 %.

Se usó anticuerpo anti-HER-3 U1-59.

Ensayo de proliferación celular

Se sembraron células en placa de 96 pocillos y expuestas a dosis de U1-59 durante 72h. La proliferación celular se sometió a prueba mediante el kit de conteo celular Kit-8 (Dojindo Molecular Technologies, Gaithersbury, MD, EE.UU.).

Ensayo clonogénico

Se sembraron un número especificado de células en cada pocillo de placas de cultivo de tejidos de seis pocillos. Después de dar tiempo a células para unirse (6 horas), se añadió U1-59 o el control de vehículo (PBS) a concentraciones especificadas. Las placas se irradiaron 4 horas más tarde a las dosis de 2, 4, 6, 8 Gy. De 10 a 14 días después de la siembra, se tiñeron colonias con violeta de cristal, se determinó el número de colonias que contenían al menos 50 células y se calcularon las fracciones supervivientes. Se generaron las curvas de supervivencia después de normalizar la citotoxicidad generada por U1-59 solo. Los datos presentados son la media ± DE de al menos tres experimentos independientes.

Análisis de ciclo celular

Se incubaron células con U1-59 (20 ug/ml) durante 48h, seguido de radiación 6 Gy. Después de 24h, se tripsinizaron células y se lavaron con PBS, se fijaron en etanol al 90 % y se almacenaron a 4°C durante la noche. Después de la retirada del etanol por centrifugación, se tiñeron células con tampón de tinción PI (PI 50 ug/ml, Rnasa A 100 ug/ml, Tritón X-100 al 0,1 %). Se clasificaron células por citómetro de flujo FACSCalibur (BD Biosciences, San José, CA, EE. UU.). El análisis de histograma se realizó con el software FlowJo (Tree Star Inc., Ashland, OR, EE. UU.).

Apoptosis

Se detectaron apoptosis usando kit de anexina V/PI. Tras el tratamiento, se incubó una suspensión celular que contenía 1 * 105 células en un tampón de tinción de 100 |il con 5 pl de anexina V y PI. Se clasificaron células por citómetro de flujo FACSCalibur (BD Biosciences, San José, CA, EE. UU.). El análisis poblacional se realizó con el software FlowJo.

Análisis de inmunotransferencia

Tras el tratamiento, las células se lisaron con tampón (HEPES 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, Tween-20 al 0,1 %, glicerol al 10%, EGTA 2,5 mM, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, PMSF 1 mM y 10 |ig/ml de leupeptina y aprotinina). La proteína se cuantificó usando un ensayo de absorbancia de Bradford estándar. Se fraccionaron cantidades iguales de proteína por SDS-PAGE. Después de eso, se transfirieron proteínas a membrana PVDF y se analizaron por incubación con el anticuerpo primario apropiado. Se detectaron proteínas mediante incubación con anticuerpos secundarios conjugados con HRP y sistema de detección de quimioluminiscencia ECL. El programa ImageJ NIH se usó para medir densitometría de las bandas de tipo Western. Los anticuerpos usados en este estudio fueron de los siguientes: HER3, AKT, MAPK, IgG anti-conejo de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante e IgG anti-ratón de cabra se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, EE. UU.). se obtuvieron p-HER3 (Tyr1289), p-AKT y p-MAPK de Cell Signaling Technology (Beverly, MA, EE. UU.). a-tubulina era de Calbiochem (San Diego, CA, EE. UU.).

Ensayo de inmunofluorescencia

Se sembraron aproximadamente 2 * 103 células en un portaobjetos de cámara cristal de cuatro pocillos (Nalgene Nunc, Naperville, IL, EE. UU.). Cuarenta y ocho horas después, las células se lavaron 3 veces con PBS y se fijaron con formaldehído al 2 % durante 15 minutos a temperatura ambiente. Las células se incubaron en metanol al 100 % helado durante 10 min a -20°C y se bloquearon con suero normal al 5 % en PBS con disolución Triton X100 al 0,3 % durante 1 h a temperatura ambiente y se incubaron con anticuerpo p-HER3 o X-H2AX durante la noche a 4°C. A continuación, las células se incubaron con anticuerpo secundario apropiado conjugado con FITC en PBS que contiene Tritón X100 al 0,3% y BSA al 1 % durante 2 h. Los portaobjetos se montaron usando ProLong gold con DAPI (Invitrogen). Se tomaron fotografías por microscopía confocal o microscopía de fluorescencia.

Modelo de xenoinjerto de ratón

Ratones atímicos desnudos (de 4 a 6 semanas de edad; macho) se obtuvieron de los Laboratorios Harían (Indianápolis, IN, EE. UU.). Todos los procedimientos y mantenimiento de animales se llevaron a cabo de conformidad con las directrices institucionales de la Universidad de Wisconsin. Se inyectaron células bilateralmente en los flancos dorsales de los ratones en el día 0 (2 * 106 células). Una vez que los tumores alcanzaron los volúmenes esperados, los ratones se trataron con dosis única o dosis fraccionada con 1) IgG, 2) U1-59, 3) radiación o 4) la combinación. Se evaluaron las mediciones por compases calibradores digitales y se calcularon mediante la fórmula (rc)/6 x (diámetro grande) x (diámetro pequeño).

Inmunohistoquímica

Los tumores de xenoinjerto se fijaron en formol neutro y se incluyen en parafina.

La tinción inmunohistoquímica se realizó para PCNA, p-MAPK, p-AKT, p-S6 y y-H2AX. En resumen, el espécimen se desparafinó y se rehidrató de manera rutinaria, a continuación de la recuperación de antígeno mediante tampón de citrato durante 15 minutos a 98 °C en baño de agua, incubación en peróxido de hidrógeno al 3 % durante 10 minutos, bloqueo con BSA al 3 % durante 30 min. Se realizaron tinciones de la siguiente manera: incubación en anticuerpo primario diluido en diluyentes de anticuerpos recomendados a 4 °C durante la noche, incubación en anticuerpo secundario biotinilado durante 30 minutos a temperatura ambiente, visualización de peroxidasa usando DAB líquido de Dakocytomation sistema cromógeno de sustrato (del inglés, Dakocytomation Liquid DAB+Substracte Chromogen System), contratinción en hematoxilina, deshidratación de rutina y limpieza, montaje con cubreportaobjetos.

Análisis estadístico

Los crecimientos tumorales de xenoinjerto se representaron gráficamente y se analizaron usando GraphPad Prism 5 (GraphPad, San Diego, CA).

Resultados

HER3 se expresa en múltiples líneas celulares de tumor sólido

El receptor 3 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER3) es un socio clave de dimerización para la familia HER y activa rutas de señalización oncogénica. Su sobreexpresión en muchos tumores sólidos se ha relacionado con un mal pronóstico. En la figura 1A se caracterizaron 15 líneas celulares derivadas de carcinoma pulmonar de células no pequeñas (H226, H292, H358, H520 y A549), carcinoma colorrectal (Caco2, SW48, LS180, Lovo y HCT116) y carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (SCC1, SCC6, SCC11A, SCC38 y SCC1483) para la expresión tanto de HER3 como de p-HER3. Ambas líneas celulares de HNSCC y NSCLC contienen HER3 activado, lo que sugiere que HER3 puede estar potenciando su fenotipo tumoral.

U1-59 puede inhibir la actividad basal de HER3 y la activación inducida por radiación de HER3

HER3 carece de actividad intrínseca de tirosina cinasa. Sin embargo, tras unirse a múltiples ligandos, tal como la heregulina (neuregulina-1), HER3 puede formar heterodímeros con otros receptores de miembros de la familia HER para iniciar la activación de múltiples rutas de señalización que influyen fuertemente en la proliferación celular y la supervivencia. U1-59 es un anticuerpo monoclonal totalmente humanizado que se une a e inactiva las rutas de señalización oncogénica HER3. En la figura 1B, se demostró que el tratamiento de múltiples líneas celulares de HNSCC y NSCLC con dosis escaladas de U1-59 puede inhibir exitosamente la activación tanto de HER3 como de AKT (figura 1B). Además, al usar ensayos de inmunotransferencia e inmunofluorescencia, se encuentra que el tratamiento con radiación de la línea celular SCC6 de HNSCC y la línea celular H226 de NSCLC aumentaron formas activadas de HER3 (figura 2A, 2C, 2D y 2F). La activación transitoria de HER3 después del tratamiento con radiación también estuvo acompañada de un aumento en la activación tanto de ERK como de AKT en ambas líneas celulares SCC6 y H226 (figura 2A y 2D). En las figuras 2B y 2E se demostró que la radiación puede conducir a la activación continua de HER3, AKT y ERK en ambas líneas celulares SCC6 y H226, tanto 24 como 48 horas después del tratamiento con radiación. Posteriormente se demostró que la incubación previa de líneas celulares o bien SCC6 o bien H226 con U1-59 durante 24 horas antes del tratamiento con radiación podría impedir la activación inducida por radiación de HER3, ERK y AKT (figura 2A, 2C, 2D y 2F). Adicionalmente, U1-59 podría conducir a la inhibición continuado de la activación de HER3, ERK y AKT tanto 24 como 48 horas después del tratamiento con radiación (figura 2B y 2E). Colectivamente, estos datos sugieren que la incubación previa de células con U1-59 antes del tratamiento con radiación puede impedir la activación inducida por radiación de las rutas de supervivencia y proliferación celular.

U1-59 puede radiosensibilizar líneas celulares de HNSCC y NSCLC in vitro

En la figura 2 se demostró que U1-59 podría impedir la activación inducida por radiación de HER3 y efectores en dirección 3' posteriores ERK y AKT, por tanto se formuló la hipótesis de que U1-59 podría mejorar la radiosensibilidad de ambas líneas celulares de HNSCC y NSCLC. En primer lugar, se demostró en la figura 3A y 3F que U1-59 puede inhibir el crecimiento de ambas líneas celulares SCC6 y H226 de una manera dependiente de la dosis. Para evaluar el efecto in vitro de la combinación de U1-59 con radiación, se realizaron ensayos clonogénicos tal como se describe en “materiales y métodos”. Se incubaron previamente tanto células SCC6 como H226 con U1-59 durante 4 horas, y posteriormente se sometieron las células a radiación con las dosis indicadas. Tal como se muestra en las figuras 3B y 3G, U1-59 aumentó la pendiente de las curvas de radiación, demostrando un efecto sensibilizador de U1-59 en células tanto SCC6 como H226 en respuesta a la radiación. Se expusieron curvas de control a radiación sin tratamiento con U1-59.

U1-59 puede promover la detención del ciclo celular y la apoptosis en combinación con tratamiento con radiación in vitro

Además se formuló la hipótesis de que U1-59 también puede potenciar las líneas celulares de HNSCC y NSCLC para detener el ciclo celular inducido por radiación y apoptosis. Para estudiar esto se incubaron previamente tanto células SCC6 como H226 con U1-59 durante 48h seguido de exposición a radiación de 6 Gy. 24h después de radiación se analizó la distribución de la fase del ciclo celular y los niveles apoptóticos mediante tinción de anexina V y PI. Tal como se muestra en la figura 3C y 3H, células tratadas previamente con U1-59 demostraron una detención de fase G1, mientras que las células tratadas con radiación demostraron una detención de fase G2 en comparación con las células de control. Se observó una disminución en la fase S con cualquiera de los dos tratamientos. Se conoce bien que las células en la fase G1 son más sensibles a tratamiento con radiación, mientras que las células de la fase S son más resistentes. Por tanto, se demostró a través de tinción con anexina V que la apoptosis, de hecho, se potencia en células tratadas con radiación incubadas previamente con U1-59 (figura 3d y 3I), lo que sugiere que la detención de fase G1 inducida por U1-59 puede haber promovido la radiosentitividad tanto de SCC6 como de H226. Además, se mostró adicionalmente un nivel potenciado de rupturas de doble hebra de ADN mediante tinción de y-H2AX en células SCC6 y H226 tratadas previamente con U1-59 antes de la radiación (figura 3E y 3J). En general, estos datos demuestran el efecto antitumoral potenciado de U1-59 en combinación con radiación.

U1-59 en combinación con radiación puede tener efectos antitumorales en xenoinjertos de tumor de ratón de HNSCC y NSCLC

Para evaluar además la eficiencia de la radioterapia combinada con U1-59, se inocularon las líneas celulares SCC6, SCC1483 y H226 en ratones atímicos. Una vez que los tumores alcanzaron los tumores de 100-200 mm3 se dividieron para dosis de radiación tanto única como fraccionadas. En el grupo tratado con dosis única, se administraron ratones con xenoinjerto con IgG, U1-59 (8 mg/kg), radiación (XRT16Gy o XRT10Gy) o una combinación de ambos (figura 4A). En el grupo tratado fraccionado, se administraron ratones con xenoinjerto con IgG, U1-59 (100 ug/ratón), radiación (dos veces por semana a dosis indicadas) o combinación (figura 4B). Los tres modelos de xenoinjertos demostraron una reducción marcada del volumen tumoral cuando se trataron tanto con U1-59 en combinación con o bien una dosis única o bien una dosis fraccionada de radiación en comparación con ratones tratados con terapia única o ratones tratados de control con IgG. Adicionalmente, los xenoinjertos tratados tanto con U1-59 como con una dosis o bien única o bien fraccionada de radiación demuestran una clara ventaja de supervivencia, tal como se muestra mediante el análisis de curva de supervivencia de Kaplan Meir.

Para validar que U1-59 podría inhibir de manera efectiva la activación de HER3 in vivo, se asilaron proteínas de diversos tumores de cada grupo de tratamiento y se realizó análisis de inmunotransferencia de tipo Western para tanto las formas total como activada de HER3. En la figura 5A se demostró que tumores aislados de ratones tratados con U1-59 solo o U1-59 en combinación con una dosis única de radiación tienen niveles más bajos de activación de HER3. En modelos de xenoinjerto SCC1483 y H226, los tumores tratados con U1-59 también contenían cantidades totales menores de proteína HER3 (figura 5A), algo que no se observó en estas líneas celulares tratadas con U1-59 in vitro. Adicionalmente, al menos uno de los dos tumores aislados de cada modelo de xenoinjerto en la figura 5A demostró una clara activación de HER3 en una dosis única de radiación, la cual se bloqueó en los tumores tratados con U1-59. En la figura 5B, se demostró además que los tumores tratados con U1-59 en combinación con dosis fraccionadas de radiación también contenían niveles reducidos de niveles activados y totales de HER3; la activación de HER3 por dosis de radiación fraccionadas también se bloqueó por U1-59. Colectivamente, los tumores xenoinjertos tratados con U1-59 en combinación o bien con dosis única o bien dosis fraccionadas de radiación demuestran un claro retraso en el crecimiento con una reducción marcada de volúmenes tumorales en comparación con los controles o cualquiera de los tratamientos solos, lo que sugiere que la pérdida de niveles tanto activados como totales de expresión de HER3 pueden radiosensibilizar los tumores de HNSCc y NSCLC.

U1-59 en combinación con radiación puede impedir la activación de señales de supervivencia celular y potenciar el daño en el ADN in vivo

Para analizar adicionalmente los efectos inhibitorios de crecimiento delU1-59 en combinación con tratamiento con radiación, se analizó la activación de ERK, AKT, S6 cinasa y y-H2AX en tumores tratados con SCC6 a través de inmunohistoquímica (figura 6). Se demostró que las células SCC6 tratadas tanto con U1-59 como una dosis única de radiación pueden tener niveles de activación más bajos de las moléculas efectoras en dirección 3' ERK, AKT y S6 cinasa. Además, los tumores tratados con U1-59 demostraron una disminución del nivel de células positivas para PCNA. Finalmente, se encontraron niveles elevados de y-H2AX en tumores SCC6 tratados con U1-59 y radiación. En general, estos datos indican que U1-59 en combinación con radiación puede inhibir eficientemente la supervivencia celular y rutas de proliferación, además de potenciar daño al ADN. Estos datos proporcionan evidencia farmacodinámica para el efecto antitumoral potenciado de U1-59 combinado con radiación in vivo.

Los resultados de estos experimentos indican que la combinación de U1-59 y radiación tuvo un fuerte impacto en el crecimiento tumoral en estudios usando dosis única o dosificación fraccionada de radiación. El análisis tumoral indicó que el tratamiento con radiación activó HER3 in vivo y U1-59 podría anular esta activación. Colectivamente, nuestros hallazgos in vitro e in vivo indican que U1-59 en combinación con radiación tiene un impacto en el crecimiento celular y tumoral retrasando la progresión del ciclo celular, aumentando la apoptosis y aumentando el daño al ADN. Estos hallazgos indican que h ER3 puede desempeñar un papel importante en la respuesta a la radioterapia y el bloqueo de su actividad puede ser de gran beneficio terapéutico en tumores humanos.

Tabla de secuencias de CDR

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un inhibidor de HER-3 para su uso en el tratamiento de cáncer en combinación con tratamiento con radiación seleccionado de radioterapia de haces externos y braquiterapia, en el que el inhibidor es un anticuerpo anti-HER3 o un fragmento de unión a antígeno del mismo en el que el anticuerpo se dirige contra el dominio extracelular de HER-3 y comprende una CDRH1 tal como se muestra en SEQ ID NO. 562, una CDRH2 tal como se muestra en s Eq ID NO. 563, una CDRH3 tal como se muestra en SEQ ID NO. 564, una CDRL1 tal como se muestra en SEQ ID NO. 565, una CDRL2 tal como se muestra en SEQ ID NO. 566 y una CDRL3 tal como se muestra en SEQ ID NO. 567,

y en el que el inhibidor se administra antes de tratamiento con radiación.

2. El inhibidor de HER3 para su uso según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

3. El inhibidor de HER3 para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho fragmento de anticuerpo es un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')², un fragmento Fv, un diacuerpo, o una molécula de anticuerpo de cadena sencilla.

4. El inhibidor de HER3 para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho anticuerpo se acopla a un grupo efector y/o grupo de etiquetaje, en el que dicho grupo efector es preferiblemente un radioisótopo, un radionúclido, una toxina, un grupo terapéutico, y/o un grupo quimioterapéutico o en el que dicho grupo de etiquetaje es preferiblemente un radioisótopo o radionúclido, un grupo fluorescente, un grupo enzimático, un grupo quimioluminiscente, un grupo biotinilo o un epítopo de polipéptido predeterminado.

5. El inhibidor de HER3 para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se selecciona el cáncer del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer gastrointestinal, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de estómago, cáncer de endometrio, cáncer de glándula salival, cáncer de pulmón, cáncer de riñón, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de tiroides, cáncer de vejiga, glioma, melanoma, cáncer de testículo, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de cabeza y cuello y formación de metástasis tumorales, en particular carcinoma de células escamosas, en el que el carcinoma de células escamosas es preferiblemente carcinoma de células escamosas del pulmón, de la cabeza y/o del cuello.

6. El inhibidor de HER3 para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el tratamiento con radiación se basa en una dosis única o dosificación fraccionada de radiación.

7. El inhibidor de HER3 para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en combinación con un compuesto activo adicional tal como un compuesto quimioterapéutico, tales como agentes citotóxicos, tales como doxorrubicina, cisplatino o carboplatino, citocinas o agentes antineoplásicos.

8. El inhibidor de HER3 para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO:70 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID NO:72