ES2841124T3 - Modelo de barrera hematoencefálica humana derivado de células madre - Google Patents

Abstract

Un método para obtener células endoteliales de tipo cerebral humanas que comprende las siguientes etapas: poner en contacto una población de células aisladas a partir de células madre CD34+ con un medio de diferenciación para obtener células endoteliales en el que dichas células madre se aíslan a partir de sangre de cordón umbilical o sangre periférica; cultivar de manera conjunta dichas células endoteliales con pericitos o con un medio condicionado de pericitos, en el que dichos pericitos expresan al menos uno de los siguientes marcadores: vimentina, PDGF- β, NG-2, α-SMA, P-gp, γ-GT; en el que la población de células endoteliales se cultiva de manera conjunta con pericitos o con el medio condicionado de pericitos durante al menos 4 días.

Description

DESCRIPCIÓN

Modelo de barrera hematoencefálica humana derivado de células madre

Campo técnico

La presente divulgación se refiere a un método para generar una población de células endoteliales que muestran un fenotipo similar a células endoteliales cerebrales.

La presente divulgación se refiere además a una población de células endoteliales, mostrando dichas células fenotipo similar a células endoteliales cerebrales.

La presente divulgación también se refiere a un modelo de barrera hematoencefálica humana estable y reproducible in vitro.

Antecedentes

Los modelos de barrera hematoencefálica (BHE) pueden proporcionar una valiosa herramienta para estudiar aspectos mecanísticos relacionados con el transporte de fármacos en el cerebro, así como procesos biológicos y patológicos relacionados con la BHE (Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development; Nat Rev Drug Discov 6, 650-661 (2007)). Aunque se establecieron varios modelos in vitro usando células murinas y bovinas, el establecimiento de un modelo de BHE humana estable es muy importante para tener en cuenta las diferencias entre especies (Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development; Nat Rev Drug Discov 6, 650-661 (2007)). Se han usado células endoteliales cerebrales humanas primarias (hBEC) y células humanas inmortalizadas como modelos in vitro; sin embargo, varios problemas impiden su uso general, incluyendo restricciones en la obtención de tejido humano, la pérdida del fenotipo de hBEC durante el cultivo celular inmortalizado, o la falta de uniones herméticas importantes y valores bajos de TEER tal como se muestra en líneas celulares humanas (Weksler, B.B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J 19, 1872-1874 (2005); Sano, Y., et al. Establishment of a new conditionally immortalized human brain microvascular endothelial cell line retaining an in vivo blood-brain barrier function. J Cell Physiol 225, 519-528 (2010)). Recientemente, se han diferenciado hBEC a partir de células madre pluripotentes inducidas (IPSC); sin embargo, la baja estabilidad y alta variabilidad en el sistema de BHE formado por diferentes líneas de IPSC podrían impedir su uso general (Lippmann, E.S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol (2012)).

Por ejemplo, el documento WO/2006/056879 A1 se refiere a una línea celular endotelial cerebral humana inmortalizada que es útil como modelo in vitro de la barrera hematoencefálica. El documento describe la generación de una línea celular endotelial cerebral humana inmortalizada (hCMEC/D3). La línea celular se derivó a partir de células endoteliales cerebrales primarias transfectadas con un sistema de vector lentiviral que conduce a la producción de telomerasa y antígeno T grande de SV40. La línea celular conservó características morfológicas de células endoteliales cerebrales primarias y expresó marcadores endoteliales cerebrales específicos y moléculas de adhesión a superficie celular. Además, la línea celular expresó receptores de quimiocina y transportadores de casete de unión a ATP (ABC). Sin embargo, el nivel de expresión de ABCA2, MDR1, MRP4, Bc RP, GUT1, 4F2hc, MCT1 y receptor de insulina es 4 veces menor en la línea celular hCMEC/D3 que en microvasos cerebrales humanos (Ohtsoki et al., Molecular Pharmaceutics 2013, 10(1), 289-296). Además, las células muestran deficiencia en propiedades endoteliales cerebrales típicas e importantes tales como bajo valor de TEER y permeabilidad relativa alta hacia moléculas trazadoras pequeñas indicando fugas paracelulares y formación subóptima de uniones herméticas.

El documento WO/2007/072953 A1 pretende proporcionar un sistema de cribado para un fármaco que pasa la barrera hematoencefálica y actúa sobre el centro, un fármaco que actúa sobre la barrera hematoencefálica por sí mismo o un fármaco que no se espera que actúe en el centro sino que migre hacia el cerebro. Este modelo de BHE in vitro está formado por un cultivo conjunto de células endoteliales cerebrales primarias, pericitos y astrocitos en un dispositivo de cultivo tridimensional. La invención no está relacionada con el uso de células endoteliales cerebrales humanas y por lo tanto no tiene en cuenta las diferencias entre especies en cuanto a metabolismo y fisiología. Además, incluso si pudiera proponerse un modelo de BHE humana, requiere el aislamiento de células endoteliales cerebrales humanas a partir de un tejido de autopsia o muestras cerebrales recién resecadas derivadas de pacientes con tumor cerebral o epilepsia. El problema en este caso es que no están disponibles células endoteliales cerebrales en un número suficiente para este propósito, y no tienen la estabilidad suficiente para actuar como un modelo de BHE in vitro fiable.

El documento US/2012/0015395 A1 describe un método para producir células endoteliales específicas del cerebro, que comprende preferiblemente las etapas de hacer crecer células madre pluripotentes humanas induciendo la diferenciación de las células mediante el cultivo de las células en medio no condicionado, y expandir además las células endoteliales en medio de células endoteliales, en el que las células expandidas son GLUT-1+, PECAM-1+, claudina-5+, ocludina+, ZO-1+ y p-glicoproteína+. La invención también reivindicó un método que comprende la etapa de cultivar de manera conjunta las células con un tipo celular seleccionado del grupo de astrocitos, células progenitoras neuronales y pericitos. Las células endoteliales cerebrales derivadas a partir de células madre pluripotentes humanas produjeron TEER con un valor promedio de 860 ± 260 Q cm2 (Lippmann et al., Nature Biotechnology 2012). Sin embargo, los valores de TEER fluctuaron a lo largo del tiempo. Por ejemplo, los valores de TEER en un cultivo conjunto de células endoteliales cerebrales con astrocitos cambiaron un 200 % durante las primeras 50 h. Además, no está claro la estabilidad del sistema a lo largo del tiempo y su reproducibilidad.

El documento WO/2007/140340 A2 se refería a métodos para proporcionar células CD34+ a partir de cuerpos embrioides y estimular estas células para dar lugar a células de tipo de músculo liso y/o de tipo endotelial. Sin embargo, el objeto de la invención no estaba vinculado a la especificación de las células endoteliales en células endoteliales cerebrales.

Sumario

Definiciones

“Células CD34+” se refiere a células que expresan el antígeno CD34. Este antígeno es una glicoproteína transmembrana de una sola cadena expresada en varias células, incluyendo células progenitoras y madre hematopoyéticas humanas, células endoteliales vasculares, fibroblastos embrionarios y algunas células en el tejido nervioso fetal y adulto.

“Células endoteliales de tipo cerebral” se refiere a células que comparten propiedades (genes, proteínas y funcionales) de células endoteliales cerebrales plenamente funcionales, incluyendo la expresión de al menos uno de los siguientes marcadores, receptor de lipoproteína de baja densidad, receptor de insulina, receptor de leptina, receptor de transferrina, receptor para productos finales de glicación avanzada, proteína de unión a retinol, SLC7A5, SLC2A1, SLC38A5, SLC16A1, ABCB1, ABCG2, ABCC1, ABCC2, ABCC4, ABCC5, claudina 1, claudina 3, ZO-1, ocludina, JAM­ A y claudina-5.

“Células madre hematopoyéticas” se refiere a células cuya progenie o ellas mismas pueden formar colonias mieloides, eritroides y/o de megacariocitos, tal como se describe en Eaves, et al., Atlas of Human Hematopoietic Colonies, 1995, StemCell Technologies, Vancouver; Coutinho, et al, en Hematopoiesis: A Practical Approach, Testa, et al, eds., 1993, Oxford Univ. Press, NY, págs. 75-106, y Kaufman, et al., PNAS, 2001, 98:10716-10721.

“Pericitos” se refiere a células que expresan uno de los siguientes marcadores: vimentina, neuroglial 2 (NG2), receptor beta del factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGFR-P), a-actina de músculo liso (a-SMA), células que expresan uno de los siguientes marcadores: vi et al., Current Neurovascular Research 2011, Modelling the neurovascular unit and the BBB with the unique function of Pericytes).

A la vista de los inconvenientes de la técnica anterior, uno de los problemas fue desarrollar un sistema de BHE humana in vitro que pudiera ser estable durante más de 15 días y ser reproducible para diferentes células madre y que pudiera implementarse en diferentes laboratorios. El sistema descrito es el primer sistema de BHE in vitro humana con alta reproducibilidad, evaluado en tres laboratorios diferentes; y en células madre recogidas de más de 4 donantes diferentes, y estable, más de 20 días. Esto nunca se ha abordado por las tecnologías anteriores descritas en la bibliografía.

Un aspecto de la materia objeto dada a conocer se refiere a células endoteliales de tipo cerebral humanas en las que al menos una parte de las células expresan al menos uno de los siguientes marcadores: ZO-1, ocludina, JAM-A, claudina-5, claudina-3, claudina-1, preferiblemente expresan ZO-1 y claudina-1.

En realizaciones de la divulgación, las células endoteliales de tipo cerebral expresan además al menos uno de los siguientes transportadores o receptores: aminoácido - SLC7A5, SLC16A1, glucosa -SLC2A1.

En realizaciones de la divulgación, las células endoteliales de tipo cerebral expresan además una parte de al menos una de las siguientes moléculas: CD40, VCAM-1.

Otras realizaciones de la divulgación, al menos una parte de las células endoteliales de tipo cerebral expresan al menos una de los siguientes transcritos de transportadores de flujo de salida clave tales como P-glicoproteína, proteína resistente al cáncer de mama y proteína resistente a múltiples fármacos.

En otras realizaciones de la divulgación, al menos una parte de las células endoteliales de tipo cerebral expresan al menos uno de los siguientes genes regulados por incremento: SLC44A5, SLC25A27, las células endoteliales, SLC23A3.

En otras realizaciones de la divulgación, al menos una parte de las células endoteliales de tipo cerebral expresan además al menos uno de los siguientes marcadores: receptor de lipoproteína, receptor de insulina, receptor de leptina, receptor de transferrina, receptor para productos finales de glicación avanzada, proteína de unión a retinol, SLC38A5, ABCB1, ABCG2, ABCC1, ABCC2, ABCC4, ABCC5.

En otras realizaciones de la divulgación, las células endoteliales derivadas a partir de células madre pueden ser preferiblemente a partir de células madre/progenitoras hematopoyéticas (células CD34+) derivadas a partir de sangre de cordón umbilical humana, pero pueden extenderse a células endoteliales derivadas a partir de células madre/progenitoras hematopoyéticas derivadas a partir de sangre periférica humana.

Un aspecto adicional de la divulgación se refiere a un método de inducción de un fenotipo de barrera hematoencefálica en células endoteliales derivadas a partir de células madre, preferiblemente a partir de células madre/progenitoras hematopoyéticas (células CD34+) derivadas a partir de sangre de cordón umbilical humana, pero puede extenderse a células endoteliales derivadas a partir de células madre/progenitoras hematopoyéticas derivadas a partir de sangre periférica humana.

Un aspecto de la materia objeto dada a conocer se refiere a un método para obtener células endoteliales de tipo cerebral humanas in vitro que comprende las siguientes etapas:

- poner en contacto una población de células madre con un medio de diferenciación para formar células endoteliales; - cultivar de manera conjunta dichas células endoteliales con pericitos o con células de la unidad neurovascular o con un medio condicionado de pericitos, para obtener células endoteliales de tipo cerebral, preferiblemente durante al menos 4 días, más preferiblemente durante 5-7 días, en concreto 5, 6, 7 días.

En otras realizaciones del método para obtener células endoteliales de tipo cerebral humanas in vitro en el que dichas células madre pueden ser CD34+ derivadas a partir de sangre de cordón umbilical humana, o células de sangre periférica humana.

Aspectos adicionales de la divulgación se refieren a un método para obtener células endoteliales de tipo cerebral humanas in vitro en el que las células se hacen crecer sobre un soporte sólido, preferiblemente sistemas Transwell o placas de pocillos. En realizaciones preferidas, los pericitos pueden colocarse en la parte inferior de cada placa. En otras realizaciones del método para obtener células endoteliales de tipo cerebral humanas in vitro, el medio de diferenciación puede ser medio EGM-2 con FBS al 20 % (v/v) y 50 ng/ml de VEGF165. En otras realizaciones del método para obtener células endoteliales de tipo cerebral humanas in vitro, los pericitos pueden expresar al menos uno de los siguientes marcadores: vimentina, PDGF-p, NG-2, a-SMA; y-GT.

Aspectos adicionales de la divulgación se refieren a un método para obtener células endoteliales de tipo cerebral humanas in vitro, los pericitos pueden sembrarse a una densidad de 40x103-50x103, preferiblemente 45x103 células. En otras realizaciones del método, los pericitos podrían reemplazarse por una línea celular que segrega Wnt3a o Wnt7a.

En otras realizaciones del método para obtener células endoteliales de tipo cerebral humanas in vitro, el medio condicionado de pericitos (obtenido a partir de 45 x103 células de pericitos cultivados durante 6 días en un pocillo de una placa de 12 pocillos) puede reemplazarse diariamente.

Un aspecto adicional de la materia objeto dada a conocer se refiere a un método para evaluar la permeabilidad por la barrera hematoencefálica de una sustancia, célula o proteína que comprende exponer dicha sustancia, célula o proteína de prueba a las células endoteliales in vitro, dicha sustancia puede ser cualquier compuesto sintético o natural. Aspectos adicionales de la divulgación se refieren a un método para evaluar la permeabilidad por la barrera hematoencefálica de una sustancia, célula o proteína mediante la medición del transporte de flujo de salida, preferiblemente en presencia o ausencia de inhibidores de las bombas de flujo de salida. Preferiblemente, los inhibidores pueden ser al menos uno de los siguientes: ciclosporina-A, PSC-833, MK-571, KO-143, verapamilo o elacridar.

Un aspecto adicional del aspecto de la materia objeto dada a conocer se refiere a un método para evaluar el metabolismo de la barrera hematoencefálica de una sustancia, célula o proteína de prueba que comprende las siguientes etapas:

- poner en contacto una sustancia, célula o proteína de prueba con las células endoteliales cerebrales descritas anteriormente;

- analizar la degradación metabólica de dicha sustancia, célula o proteína de prueba.

Aspectos adicionales de la divulgación se refieren al método para evaluar la toxicidad de la barrera hematoencefálica de una sustancia de prueba que comprende el cultivo de dichas células endoteliales cerebrales en presencia de dicha sustancia de prueba.

La viabilidad puede determinarse mediante un ensayo vivo/muerto, preferiblemente usando calceína y yoduro de propidio como reactivos, producción de ATP, daño de la membrana celular por la liberación de lactato deshidrogenasa, replicación celular por un ensayo de BrdU. Cualquier cambio en la funcionalidad de la BHE (por ejemplo: permeabilidad a un marcador no permeable) in vitro podría usarse como criterio de valoración toxicológico alternativo.

Un aspecto adicional de la divulgación se refiere al método para evaluar el metabolismo de la barrera hematoencefálica de una sustancia de prueba que comprende el cultivo de dichas células endoteliales cerebrales en presencia de dicha sustancia de prueba.

Un aspecto adicional de la divulgación se refiere a un kit para medir la permeabilidad por la barrera hematoencefálica de una sustancia, que comprende las células endoteliales humanas in vitro descritas anteriormente.

En diversas realizaciones, los pericitos se derivan preferiblemente a partir de bovinos, pero pueden aislarse a partir de cualquier otra especie. Se caracterizan por un conjunto de diferentes marcadores incluyendo PDGF-p en otras especies. Se caracterizan por un conjunto de diferentes marcadores incluyendo PDGF-p aislado a partir de un cultivo de células endoteliales, a-actina de músculo liso (a-SMA), y-glutamil-transpeptidasa y P-glicoproteína (P-gp) y otros que identificará un experto en la técnica. Hasta ahora, no hay ningún marcador individual que diferencie a los pericitos de otras células. En una realización, los pericitos se colocan en la parte inferior de la placa, pero también pueden aplicarse en uno de los lados del filtro Transwell. En una realización preferible, los pericitos se siembran a una densidad de 45x103 células en cada pocillo de placas de 12 pocillos. Las células se cultivan en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 20 % (v/v), L-glutamina 2 mM, gentamicina 50 |ig/ml y factor de crecimiento de fibroblastos básico 1 ng/ml.

En una realización preferida, los pericitos se cultivan en presencia de las células endoteliales para inducir las propiedades de BHE. El medio condicionado obtenido a partir de los pericitos podría tener el mismo efecto inductor sobre las células endoteliales si se reemplazase el medio diariamente, y a concentraciones adecuadas.

En una realización, las propiedades de BHE de células endoteliales pueden lograrse suplementando el medio de cultivo con Wnt3a, Wnt7a o una mezcla de Wnt3a y Wnt7a. En una realización preferible, la concentración de Wnt3a y Wnt7a es de 6,25 ng/ml.

Breve descripción de los dibujos

Sin intención de limitar la divulgación en el presente documento, esta solicitud presenta dibujos adjuntos de representaciones ilustradas para un entendimiento más fácil.

Figura 1: Expresión de marcadores de BHE, estabilidad y propiedades funcionales de una monocapa de BLEC humanas;

(A) se obtuvieron BLEC mediante el cultivo conjunto de EC derivadas de CD34+ con pericitos durante 6 días en un sistema Transwell™.

(B-D) permeabilidad paracelular a amarillo lucifer de monocapas de EC cultivadas o bien solas o bien con pericitos. Los resultados son la media ± EEM (n>4);

(E) expresión marcadores de BHE y endoteliales en las BLEC tal como se obtiene por inmunofluorescencia;

(F) micrografías electrónicas de EC cultivadas solas (2, 3) o con pericitos (1);

(1) en la hendidura intercelular, WGA-HRP penetra desde el compartimento luminal (asteriscos) hasta la unión hermética, lo que ocluye la hendidura (flechas). A partir de este punto, el espacio intercelular está libre del producto de reacción electrodenso;

(2) cuando las EC se cultivan solas, no hay oclusión del espacio intercelular entre las EC en el 84 % de los casos, y el trazador penetra desde el compartimento luminal (asteriscos) a través de toda la hendidura intercelular y se deposita en la matriz subyacente (puntas de flecha);

(G) expresión génica de BLEC de uniones herméticas y transportadores de flujo de entrada. Los resultados son la media ± EEM (n=3);

(H) expresión génica de BLEC de transportadores de flujo de salida y receptores de moléculas grandes;

(I) expresión de P-gp y RAGE tal como se evalúa por inmunofluorescencia. En E e I, la barra corresponde a 50 |im. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001.

Figura 2: Propiedades funcionales de las BLEC y mecanismo para la inducción de propiedades de BHE en EC derivadas de CD34+;

(A) efecto de la inhibición de la proteína P-gp sobre el transporte activo de fármacos;

(B) razón de flujo de salida de moléculas pequeñas (sacarosa) y grandes (HSA e IgG). En A y B: resultados ± EEM (n=3-7);

(C) razones de concentración en cerebro con respecto a plasma o en CSF con respecto a plasma para seres humanos y ratas;

(D) Expresión de marcadores de BHE tal como se evalúa por microalineamientos de genoma completo de monocultivos o cultivos conjuntos de EC derivadas de CD34+ con pericitos el día 3 y 6;

(E) efecto de Wnt3a, Wnt7a y BIO en la expresión de p-catenina (después de 1 día) así como en la permeabilidad paracelular (los días 1 y 5) de monocultivos de EC derivadas de CD34+. Los resultados son la media ± EEM (n=3-6). La línea discontinua representa la permeabilidad paracelular de EC en cultivo conjunto con pericitos durante 6 días. Para resultados de permeabilidad, las concentraciones de Wnt3a, Wnt7a y BIO fueron de 6,25 ng/ml, 6,25 ng/ml y 0,5 |iM;

(F) expresión y localización de claudina-1 (el día 6) y p-catenina total (día 3) en monocultivo de EC derivadas de CD34+ cultivadas en medio suplementado con BIO (0,5 |iM) o Wnt3a (6,25 ng/ml). Las puntas de flecha indican la acumulación nuclear de p-catenina. La barra corresponde a 50 |im. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001.

Figura 3: Diferenciación de células CD34+ de cordón umbilical humano en EC y evaluación de su permeabilidad paracelular;

(A) representación esquemática de la diferenciación de células madre hematopoyéticas (CD34+CD45+CD31+KDR-vWFCD14-) en EC (2-3 semanas de diferenciación) y evaluación de su permeabilidad paracelular (Pe) usando un sistema Transwell™;

(B) Las EC, inmediatamente después de su diferenciación (antes del cultivo en el sistema Transwell™), expresan marcadores de EC típicos, incluyendo CD31, VE-cadherina (VECAD), vWF y son capaces de incorporar AcLDL; (C) Las EC después del cultivo en el sistema Transwell™ tienen morfología típica de adoquín, expresan vWF y marcadores asociados a hBEC, tales como claudina-5, ZO-1 y ocludina; sin embargo, la expresión de todos estos marcadores es discontinua y las células no expresan claudina-1 en los contactos célula-célula. La barra corresponde a 50 |im;

(D) permeabilidad paracelular de EC humanas en monocultivos y EC bovinas en cultivo conjunto con astrocitos durante 12 días.

Figura 4: (A) Permeabilidad paracelular de EC derivadas de CD34+ después del cultivo conjunto con diferentes tipos de células en EGM-2 suplementados con suero bovino fetal al 2 % (FCS). Los resultados son la media ± EEM (n=6); (B) caracterización de pericitos bovinos por contraste de fase e inmunocitoquímica para la expresión de vimentina, neuroglial 2 (NG2), receptor beta de factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGFR-P) y a-actina de músculo liso (a-SMA). La barra de escala corresponde a 50 |im. CM significa medios condicionados; (C) la inducción de propiedades de BHE en EC derivadas de CD34+ requiere la presencia de pericitos en el sistema de cultivo conjunto dado que el medio condicionado de pericitos no tiene las mismas propiedades inductoras de BHE.

Figura 5:

(A) Inmunotinción doble para anticuerpo anti-receptor humano para productos finales de glicación avanzada (RAGE) y anti-transportador de carnitina/cationes orgánicos humano (OCTN2; también conocido como SLC22A5) en monocultivo (A.1) o en cultivo conjunto de EC derivadas de CD34+ con pericitos (A.2) el día 6. En el sistema de cultivo conjunto, está presente RAGE esencialmente en el lado luminal de las células endoteliales y OCTN2 en el lado abluminal, mientras que en monocultivo, ambos marcadores parecen estar ubicados en el mismo plano. La barra corresponde a 10 |im;

(B) permeabilidad paracelular en un cultivo conjunto de EC derivadas de CD34+ con pericitos el día 6 obtenidos de diferentes donantes. Los resultados son la media ± EEM (n=4);

(C) reproducibilidad entre laboratorios. La BHE se generó en dos laboratorios diferentes. La permeabilidad paracelular al amarillo lucifer no fue estadísticamente significativa. Los resultados son la media ± EEM (n>4);

(D) estabilidad de las propiedades de BHE después de la retirada de los pericitos. Las EC derivadas de CD34+ estuvieron en cultivo conjunto con pericitos durante 14 días (1) o en cultivo conjunto durante 6 días y luego 8 días en monocultivo (2).

Figura 6: (A) Resistencia eléctrica transendotelial (TEER) de monocultivos de EC derivadas de CD34+ o cultivos conjuntos de EC con pericitos durante 6 días. La TEER del cultivo conjunto de EC se comparó con el patrón de referencia de células endoteliales microvasculares de cerebro bovino cultivadas de manera conjunta con astrocitos bovinos durante 12 días sobre filtros de inserción de 30 mm de diámetro. Los valores son la media ± EEM, n=4. *** P<0,001; ns significa P>0,05;

(B) expresión de moléculas de adhesión por EC en cultivo conjunto con pericitos. La expresión de las moléculas de adhesión se evaluó mediante análisis de citometría de flujo en EC no tratadas y tratadas por TNFa (10 ng/ml) durante 24 h.

Figura 7: (A-C) Inmunotransferencia de tipo Western para la expresión de Shh (A), Wnt7a (B), Wnt3a (C) y p-catenina total (D) en EC derivadas de CD34+ en monocultivo (1) o en cultivo conjunto con pericitos (2), o pericitos en monocultivo (3) o pericitos en cultivo conjunto con EC (4), durante 6 días. Se usaron como control positivo Wnt3a, Wnt7a y Shh recombinantes humanos. Los datos mostrados son representativos de n=2. En D: resultados ± EEM, n=2.

Figura 8: Resultados de qRT-PCR que muestran cambios en los genes de señalización de Wnt (A-C), uniones herméticas (D) y transportadores de BHE (E) en EC derivadas de CD34+ cultivadas de manera conjunta con pericitos durante 1, 3 y 6 días. Los valores son la media ± EEM, n=4. Los resultados muestran que el transcrito de Wnt3a aumentó significativamente el día 1 seguido de una disminución el día 6 hasta los niveles iniciales. Los genes de ligandos de Wnt canónicos Wnt7a y Wnt7b, que se ha notificado que están implicados en el desarrollo de BHE, aumentaron ligeramente el día 1 y luego disminuyeron el día 3 hasta los niveles iniciales. La expresión de genes que codifican para el receptor de Wnt Frizzled 4 (FZD4) y Frizzled 6 (FZD6) no se vio afectada por el sistema de cultivo conjunto; sin embargo, el receptor de Wnt Frizzled 7 (FZD7) estaba significativamente regulado por incremento hasta 6 días. La expresión de LEF1, el factor de transcripción asociado a p-catenina, alcanzó su punto máximo el día 1 coincidiendo con el perfil observado para Wnt3a y FZD7. La expresión de APCDD1, un antagonista de la señalización Wnt y altamente expresado en células endoteliales de cerebro adulto, alcanzó su punto máximo el día 3, en el momento en el que Wnt3a disminuye significativamente. Finalmente, genes relacionados con uniones herméticas tales como claudina 1 y ZO-1 y los transportadores SLC7A5 y SLC16A1 están regulados por incremento a lo largo del tiempo.

Figura 9: La modulación de la señalización Wnt activa las propiedades de barrera de las EC en monocultivo;

(A) representación esquemática de la metodología usada para evaluar la modulación de la señalización de Wnt. Se sembraron EC derivadas de CD34+ en un inserto Transwell™ recubierto con Matrigel a una densidad de 80.000 células. Se añadieron ligandos de Wnt en el medio de cultivo en el lado basolateral;

(B) resultados de qRT-PCR que muestran diferencias en la expresión de genes de claudina-1 y Lef1 en EC derivadas de CD34+ cultivadas con o sin Wnt3a. Los valores son la media ± EEM, n=4;

(C-D) Permeabilidad paracelular de EC no tratadas o EC tratadas con diferentes concentraciones de proteína recombinante humana Wnt3a (C) o Wnt7a (D) durante 5 días. Los resultados son la media ± EEM (n=4).

Figura 10: La anulación de la señalización de Wnt en EC durante el cultivo conjunto con pericitos afecta a su permeabilidad paracelular;

(A) representación esquemática de la metodología usada para evaluar el efecto de la anulación de la señalización de Wnt. Se sembraron EC derivadas de CD34+ en un inserto Transwell™ recubierto con Matrigel a una densidad de 80.000 células y se cultivaron en medio suplementado con XAV 939 (0,1 y 1 |iM). En la parte inferior del Transwell™, se sembraron 45.000 pericitos bovinos. Después de 4 días de cultivo conjunto, se evaluaron la permeabilidad paracelular y la organización celular;

(B) imágenes de microscopía de fluorescencia que muestran la expresión de ZO-1 en EC no tratadas o EC tratadas con XAV 939 (1 |iM) durante 4 días;

(C) permeabilidad paracelular de EC no tratadas o EC tratadas con XAV9390,1 o 1 |iM durante 4 días. Los resultados son la media ± EEM (n=4).

Descripción detallada

En la presente divulgación se describe un método para generar un modelo de barrera hematoencefálica humana usando células madre hematopoyéticas derivadas de sangre de cordón umbilical. Las células se diferenciaron inicialmente en células endoteliales seguido de la inducción de propiedades de barrera hematoencefálica (BHE) mediante cultivo conjunto con pericitos. Las células endoteliales de tipo cerebral (BLEC) expresan uniones herméticas y transportadores normalmente observados en el endotelio cerebral y mantienen la expresión de la mayoría de las propiedades de BHE in vivo durante al menos 20 días.

Para diferenciar células madre en células endoteliales, se cultivaron inicialmente células CD34+CD45+CD31+KDR-vWF-CD14- aisladas a partir de sangre de cordón umbilical durante 15-20 días en medio EGM-2 con FBS al 20 % (v/v) y 50 ng/ml de VEGF165 (figura 1A complementaria). En esta fase, las células tienen una morfología similar a y expresan altos niveles de marcadores de células endoteliales, incluyendo CD31, VE-cadherina y vWF (figura 1B complementaria). Cuando estas células se hicieron crecer hasta la confluencia sobre filtros durante 6 días, muestran expresión discontinua de ZO-1, ocludina y claudina-5, no expresan claudina-1 en contactos célula-célula y tienen alta permeabilidad a amarillo lucifer (2,0 x 10'3 cm/min) en comparación con las BEC bovinas (figuras 1C y 1D complementarias).

Para inducir propiedades de BHE en células endoteliales derivadas de CD34+, se sembraron células en un sistema Transwell™ y se cultivaron de manera conjunta con pericitos (figura 1A). Los pericitos se seleccionaron después de un cribado de diferentes tipos celulares a partir de la unidad neurovascular (figuras 2A y 2B complementarias) y por su papel en la estabilización/maduración de BHE (Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature 468, 557-561 (2010); Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A.A. & Barres, B.A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature 468, 562-566 (2010)). En estas condiciones, la permeabilidad de las células endoteliales disminuye durante los primeros 3 días hasta alcanzar una fase estacionaria el día 4 (figura 1B), manteniendo su estabilidad hasta 20 días (figura 1C). El día 6, las células presentaron valores bajos de permeabilidad (0,61 x 10'3 cm/min) similares a los valores encontrados en otros modelos de BHE (Deli, M.A., et al. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cell Mol Neurobiol 25, 59-127 (2005)) (figura 1D), mostraron una expresión continua de ZO-1, ocludina, JAM-A y claudina-5 en contactos célulacélula (figura 1E) y fueron capaces de bloquear el paso de aglutinina de germen de trigo (WGA)-peroxidasa de rábano picante (HRP) en contraste con monocapas de células endoteliales derivadas de CD34+ donde WGA-HRP alcanzó la matriz subyacente (figura 1F). Es importante destacar que la inducción de propiedades de BHE en células endoteliales derivadas de CD34+ es altamente reproducible dado que se obtuvieron resultados de permeabilidad similares para células derivadas a partir de múltiples donantes humanos (figura 3B complementaria) y en 3 laboratorios diferentes (figura 3C complementaria). Además, las propiedades de BHE de células endoteliales derivadas de CD34+ se pierden si los pericitos se retiran del sistema de cultivo conjunto (figura 3D complementaria) mostrando que la interferencia entre las dos células es importante para mantener las propiedades de BHE. Las células cultivadas de manera conjunta con pericitos durante 6 días expresan transcritos que codifican para uniones herméticas tales como ZO-1 y claudina-1 en mayor medida que en células endoteliales en monocultivo, mientras que la expresión de claudina-3 y ocludina fue similar (figura 1G). Es importante destacar que la expresión de transportadores de flujo de entrada, específicamente la expresión de los transportadores y receptores de aminoácidos (SLC7A5, SLC16A1) y glucosa (SLC2A1) (por ejemplo, receptor de transferrina; TFRC) aumentó cuando las células se cultivaron de manera conjunta con pericitos con respecto a células cultivadas solas. Además, las células endoteliales cultivadas de manera conjunta con pericitos durante 6 días expresan transcritos de transportadores de flujo de salida clave tales como P-glicoproteína (P-gp), proteína de resistencia a cáncer de mama (BCRP) y proteína de resistencia a múltiples fármacos (MRP; subfamilia de la familia de transportadores de casetes de unión a ATP (ABC)) (figura 1H). Al igual que en hBEC, el receptor para productos finales de glicación avanzada (RAGE) y la proteína P-gp se expresaron tal como se confirmó por inmunofluorescencia (figura 1I), estando ubicado RAGe en el lado luminal de las células (figura 3A complementaria). En general, las células endoteliales cultivadas de manera conjunta con pericitos durante 6 días tienen propiedades de BHE a niveles de genes, proteínas y permeabilidad, y a partir de ahora se denominan células endoteliales de tipo cerebral (BLEC).

Las BLEC tienen la capacidad de actuar como una barrera activa. La inhibición de la proteína P-gp por verapamilo o elacridar, y el bloqueo concomitante del transporte activo de fármacos hacia fuera de la célula, conduce a un aumento significativo en la acumulación del fármaco antitumoral vincristina (figura 2A). Este resultado demuestra que P-gp es funcionalmente activa en BLEC. La mayor razón de flujo de salida de IgG en comparación con la albúmina sérica humana muestra el transporte mediado por receptor de macromoléculas a través de la monocapa polarizada (figura 2B). Además, las BLEC tienen la capacidad de formar una monocapa que tiene una resistencia eléctrica transendotelial (TEER) similar a monocapas de BEC bovinas (figura 4A complementaria) y mayor que monocapas de la línea celular humana hCMEC/D3 (<40 Q cm2) (Weksler, B.B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. Fa SEB J 19, 1872-1874 (2005)). Además, las BLEC expresan constitutivamente la molécula de adhesión ICAM-2, encontrada normalmente en hBEC (Bo, L., et al. Distribution of immunoglobulin superfamily members ICAM-1, -2, -3, and the beta 2 integrin LFA-1 in multiple sclerosis lesions. J Neuropathol Exp Neurol 55, 1060-1072 (1996)), y muestran una regulación por incremento en la expresión de ICAM-1, ICAM-2, CD40 y VECAM-1 después de la estimulación con TNF-a 10 ng/ml durante 24 h, como las hBEC (Weksler, B.B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J 19, 1872-1874 (2005) (figura 4B complementaria). Finalmente, la razón in vitro de concentraciones de fármaco no unido en cerebro y plasma para atenolol, bupropión, rifampicina y verapamilo fue más cercana a la razón in vivo de concentraciones de fármacos no unidos en líquido cefalorraquídeo (LCR) y plasma notificada en humanos que en ratas (Friden, M., Gupta, A., Antonsson, M., Bredberg, U. & Hammarlund-Udenaes, M. In vitro methods for estimating unbound drug concentrations in the brain interstitial and intracellular fluids. Drug Metab Dispos 35, 1711-1719 (2007)) (figura 2C). En conjunto, estos resultados indican que pueden usarse células endoteliales de tipo cerebral para predecir de manera precisa en humanos el transporte in vivo de fármacos con diferentes propiedades.

Para estudiar la inducción de propiedades de BHE en células endoteliales derivadas de CD34+, estas células cultivadas solas o con pericitos durante 3 o 6 días se caracterizaron por microalineamientos de genoma completo. Los análisis de expresión génica a los 6 días muestran que los genes 84 y 2 están regulados por incremento y por disminución en células endoteliales derivadas de CD34+ en cultivo conjunto, respectivamente, en relación con células endoteliales derivadas de CD34+ en monocultivo (tablas complementarias 3 y 4). A partir de los genes regulados por incremento en general, se relacionaron 3 genes con transportadores de flujo de entrada incluyendo SLC44A5, SLC25A27 y SLC23A3, y se relacionaron 2 genes con la señalización Wnt (factor inhibitorio 1 de Wnt y activador asociado de morfogénesis desordenado (Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development. Nat Rev Drug Discov 6, 650-661 (2007)) (Daam 1)) (figura 2D). Sin embargo, la expresión de la mayoría de los marcadores asociados a BHE (uniones herméticas y transportadores) no fue significativamente diferente en células endoteliales derivadas de CD34+ en monocultivo y cultivo conjunto, lo que indica que los pericitos ejercen una influencia discreta sobre genes endoteliales específicos de BHE. La expresión génica en células endoteliales derivadas de CD34+ en cultivo conjunto el día 6 y 3 fue significativamente diferente con respecto a marcadores de BHE, específicamente para transportadores de flujo de salida incluyendo miembros de la familia de portadores de solutos SLC2A3, SLC6A6 y SLC47A1 (regulados por disminución el día 6), y miembros SLC30A3, s Lc 26A10, SLC13A3 y SLC44A5 (regulados por incremento el día 6) y marcadores distintos de BHE tales como canales y matriz extracelular (tablas 3 y 4 complementarias). En conjunto, estos resultados muestran que el proceso de inducción es un proceso dinámico que afecta a la expresión de transportadores, canales y componentes de la matriz extracelular.

Dos rutas principales que regulan la formación de BHE son la ruta de Wnt/wingless canónica que actúa a través de la estabilización de la p-catenina y la ruta de Sonic hedgehog (Shh) (Liebner, S., et al. Wnt/beta-catenin signaling controls development of the blood-brain barrier. J Cell Biol 183, 409-417 (2008); Alvarez, J.I., et al. The Hedgehog pathway promotes blood-brain barrier integrity and CNS immune quiescence. Science 334, 1727-1731 (2011); Daneman, R., et al. Wnt/betacatenin signaling is required for CNS, but not non-CNS, angiogenesis. Proc Natl Acad Sci USA 106, 641­ 646 (2009). Los análisis de proteínas muestran que los pericitos no expresan Shh pero sí expresan ligandos de Wnt tales como Wnt3a y Wnt7a (figura 5 complementaria). Por otro lado, las células endoteliales expresan a nivel génico receptores de Wnt tales como los receptores de Frizzled 4, 6 y 7 (FZD4, FZD6 y FZD7), y en cultivo conjunto con pericitos, muestran una regulación por incremento en la expresión de receptor de Wnt3a y FZD7 durante el primer día seguido de una disminución en los siguientes 5 días (figura 6 complementaria). Esto iba acompañado por un aumento del APCDD1, un antagonista de la señalización Wnt, que alcanzó su punto máximo el día 3, y un aumento de las uniones herméticas ZO-1 y claudina-1 (figura 6 complementaria). Para determinar si la activación de Wnt se requiere para la inducción de propiedades de barrera en células endoteliales derivadas de CD34+, estas células se cultivaron solas durante 5 días y luego se expusieron a ligandos/agonistas de Wnt. Las células endoteliales responden rápidamente a BIO, un inhibidor farmacológico específico de glucógeno sintasa cinasa-3 (GSK-3) y por tanto un activador de la señalización de Wnt, o Wnt3a aumentando la expresión de p-catenina activa (figura 2E). La permeabilidad paracelular de células endoteliales tratadas con Wnt3A a amarillo lucifer fue estadísticamente menor (P<0,01, n=4) a corto plazo (1 día) y a largo plazo (5 días) en comparación con células no tratadas (figura 2E y figura 7 complementaria). El efecto de Wnt7a y BIO solo se observó el día 5. Durante el proceso de inducción por Wnt 3a o BIO, hay un aumento en la expresión y localización nuclear de la p-catenina total (figura 2F y figura 5 complementaria) y la localización de claudina-1 en los contactos célula-célula (figura 2F). La localización de claudina-1 en la periferia de las células podría explicar la permeabilidad restrictiva de células endoteliales en cultivo conjunto con pericitos. En general, los resultados indican que la ruta de Wnt contribuye, al menos en parte, a la inducción de propiedades de BHE en células endoteliales derivadas de CD34+.

Para confirmar además el papel de la ruta de Wnt en la inducción de propiedades de BHE, se anuló la señalización de Wnt en células endoteliales cultivadas de manera conjunta con pericitos. Se sembraron células endoteliales en un inserto transwell™ recubierto con Matrigel mientras que se sembraron pericitos en la parte inferior del Transwell (figura 8 complementaria). Se trataron células endoteliales con el antagonista de Wnt XAV-939 durante 4 días añadiendo el inhibidor en el lado luminal del inserto. La anulación de la ruta de Wnt, en condiciones que no afectaron a la viabilidad celular, aumentó la permeabilidad paracelular de la monocapa endotelial a amarillo lucifer. Estos resultados indican de nuevo que se requiere la señalización de Wnt para las propiedades de BHE en células endoteliales derivadas de CD34+ cultivadas de manera conjunta con pericitos.

En resumen, se generó un modelo de BHE in vitro humana a partir de células endoteliales derivadas a partir de células madre hematopoyéticas de sangre de cordón umbilical que es altamente reproducible y estable durante al menos 20 días después de su derivación. Se proporciona evidencia in vitro del papel de los pericitos en la inducción de la formación de BHE a través de la ruta de Wnt canónica. Debido al relativo fácil acceso a células madre de sangre de cordón umbilical, este modelo puede adoptarse por la comunidad investigadora para mejorar el suministro de agentes terapéuticos al compartimento nervioso central para el tratamiento de accidente cardiovascular, esclerosis múltiple y tumores cerebrales.

En una realización de la presente divulgación, puede usarse como método para medir la permeabilidad de la BHE a una sustancia de prueba. La sustancia de prueba puede ser cualquier compuesto sintético o natural, con peso molecular y razón de hidrofilicidad/hidrofobicidad variables. El método de la divulgación puede medir la difusión pasiva 0 el transporte activo, tal como aprecian los expertos en la técnica. Puede medirse el transporte de flujo de salida en el que la medición de los valores de permeabilidad se realiza en presencia o ausencia de inhibidores de las bombas de flujo de salida tales como, pero sin limitarse a, ciclosporina-A, PSC-833, MK-571, KO-143. Los métodos de la presente divulgación también pueden usarse para medir el metabolismo de la barrera hematoencefálica de una sustancia midiendo los valores de permeabilidad y obteniendo el perfil de la degradación metabólica de compuestos de interés en función del tiempo usando técnicas analíticas cuantitativas tales como cromatografía de líquidos de alta presión y espectrometría de masas. Las sustancias de prueba que demuestran superar el modelo de BHE in vitro pueden analizarse además para determinar su perfil farmacológico.

En otra realización, el modelo de BHE in vitro de la presente divulgación puede ser útil como método para determinar la toxicidad de una sustancia de prueba o vector hacia la BHE. En este caso, el método comprende el cultivo de las células endoteliales de tipo cerebral en presencia de la sustancia de prueba y la evaluación de su viabilidad después de un determinado tiempo. Para determinar la CI50, puede usarse un intervalo de concentraciones de la sustancia de prueba. La viabilidad celular puede determinarse mediante un ensayo vivo/muerto usando calceína y yoduro de propidio como reactivos, producción de ATP, daño de la membrana celular por la liberación de lactato deshidrogenasa, replicación celular mediante un ensayo de BrdU.

En otra realización, el modelo de BHE in vitro puede usarse para diseñar vectores más eficaces para dirigir o suministrar fármacos al cerebro. Esto podría ser útil para el tratamiento de la disfunción vascular en pacientes con Alzheimer. La neudegeneración es probablemente una consecuencia del transporte de fármacos alterado a través de la BHE y del flujo de sangre cerebral anómalo debido a la deposición de péptidos amiloides. El modelo de BHE in vitro puede ser muy útil para someter a prueba candidatos a fármacos para el tratamiento del Alzheimer.

Aislamiento y diferenciación de células CD34+ a partir de UCB

En una realización preferida, pueden aislarse células CD34+ de sangre de cordón umbilical humana y diferenciarse en células endoteliales según un protocolo previamente notificado por los inventores (Pedroso, D.C., et al. Improved survival, vascular differentiation and wound healing potential of stem cells co-cultured with endothelial cells. PLoS One 6, e16114 (2011)) Brevemente, se cultivaron células CD34+ aisladas en medio EGM-2 (preferiblemente Lonza) suplementado con suero bovino fetal al 20 % (v/v) (preferiblemente FBS; Life Technologies) y 50 ng/ml de VEGF165 (preferiblemente PeproTech Inc.), sobre placas de 24 pocillos recubiertas de gelatina al 1 % (2x105 células/pocillo). Después de 15-20 días, se observan células endoteliales en la placa de cultivo. Para cada experimento, las células se expandieron en placas de Petri de 100 mm recubiertas con gelatina al 1 % (p/v) (preferiblemente BD Falcon) en medio e GM-2 (con todos los suplementos excepto FBS y gentamicina/anfotericina) suplementado con FBS al 2 % (v/v), gentamicina 50 |ig/ml (preferiblemente Biochrom AG) y bFGF 1 ng/ml de fabricación propia.

Diferenciación de células endoteliales derivadas de CD34+ en células endoteliales de tipo cerebral por pericitos

Aislamiento de pericitos

En una realización preferida, pueden extraerse pericitos de capilares cerebrales bovinos recién recogidos. Los capilares cerebrales se recogieron en un tamiz de nailon de 60 |im (preferiblemente Blutex®, Saati, Francia) tal como se describe por Méresse et al. (1989) y se suspendieron en disolución salina equilibrada de Hank (preferiblemente HBSS, Sigma-Aldrich) que contenía HEPES 10 mm y BSA al 0,1 %. Esta suspensión se centrifugó a 1000 g durante 7 min a temperatura ambiente. Entones se digirió el sedimento con colagenasa-dispasa 2 mg/ml (preferiblemente Roche Diagnostics), DNasa I 10 |j/ml (preferiblemente Roche Diagnostics) y TLCK 0,147 |j/ml (preferiblemente Sigma-Aldrich), durante 30 minutos a 37°C en un baño de agua con agitación. Después de los lavados, los capilares digeridos se sembraron sobre placas recubiertas con Matrigel con factor de crecimiento reducido (preferiblemente BD Biosciences) (preferiblemente Corning) que contenían medio de cultivo de crecimiento de pericitos: DMEM (preferiblemente Life Technologies) suplementado con suero fetal de ternero al 20 % (preferiblemente Integro), L-glutamina 2 mM (preferiblemente Merck Chemicals), gentamicina 50 |j/ml (preferiblemente Biochrom AG) y bFGF 1 ng/ml (preferiblemente Sigma-Aldrich). El medio se cambió cada dos días. Los pericitos y las células endoteliales migraron de las paredes de los vasos. Los pericitos crecieron rápidamente a partir de los capilares e invadieron toda la superficie de las placas. Los cultivos confluentes consistentes casi exclusivamente en pericitos, se disociaron usando disolución salina de tripsina/EDTA (preferiblemente al 0,05 %/0,02 % de Biochrom AG), y las células se congelaron en nitrógeno líquido. Para los experimentos, cada vial de pericitos se descongeló rápidamente y se sembró en placas de Petri de 60 mm recubiertas con gelatina (preferiblemente Sigma-Aldrich) que contenían medio de cultivo de pericitos. Después de la descongelación, no quedaron células endoteliales en los cultivos. Los pericitos se subcultivaron en una razón de división 1/3, y se usaron en los pases <3.

Cultivo conjunto de células endoteliales derivadas de CD34+ con pericitos.

En una realización preferida para experimentos de cultivo conjunto, los pericitos pueden sembrarse inicialmente en placas de Petri de 60 mm recubiertas con gelatina y cultivarse en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (preferiblemente Life Technologies) suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 20 % (v/v) (preferiblemente Life Technologies), L-glutamina 2 mM, gentamicina 50 |j/ml y factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) 1 ng/ml. Las células alcanzaron la confluencia después de 2 días. Se sembraron 45x103 células en cada pocillo de placas de 12 pocillos (preferiblemente Costar). Se tripsinizaron las células endoteliales CD34+ que crecen sobre placas de Petri de 100 mm recubiertas con gelatina en e GM-2 (con todos los suplementos excepto FBS y gentamicina/anfotericina) suplementado con FBS al 2 % (v/v), gentamicina 50 |ig/ml (preferiblemente Biochrom AG) y bFGF 1 ng/ml de fabricación propia y las células se sembraron a una densidad de 8x104/inserto sobre insertos Transwell™ (preferiblemente Costar) recubiertos con Matrigel (preferiblemente BD Biosciences). Después de 6 días en cultivo conjunto, se llevaron a cabo los experimentos.

Análisis de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (QRT-PCR) y transcripción inversa. Las células endoteliales CD34+ cultivadas en diferentes condiciones se homogeneizaron en el reactivo Trizol (preferiblemente Life Technologies) y el ARN total se extrajo usando el kit RNEasy Mini (preferiblemente Qiagen), según las instrucciones del fabricante. En todos los casos, se preparó ADNc a partir de 1 |ig de ARN total usando reactivos de transcripción inversa Taqman (preferiblemente Applied Biosystems). Se realizó RT-PCR no cuantitativa usando las condiciones descritas en Sano et al. (2010) y el ADN hizo migrar sobre una electroforesis en gel de agarosa (1,5 %) con un marcador de peso molecular de ADN de intervalo bajo (preferiblemente Euromedex) para visualizar los tamaños. Los geles se tiñeron entonces con tinción de gel de ácido nucleico rojo de gel (preferiblemente Interchim) y se visualizaron en un transiluminador de luz UV (preferiblemente Bio-Rad). Se realizó PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) usando mezcla maestra de PCR Power SYBR Green (preferiblemente Applied Biosystems) y la detección se realizó en un sistema de PCR en tiempo real rápido 7500 (preferiblemente Applied Biosystems). La cuantificación de genes diana se realizó en relación con el gen GAPDH de referencia: expresión relativa = 2[-(Ct de muestra-Ct de GADPH)]. Las secuencias de cebadores se facilitan como información de apoyo (tabla S2).

Ensayo de acumulación de resistencia a múltiples fármacos

En una realización preferida, las monocapas celulares pueden lavarse con una disolución de Ringer tamponada con HEPES (RH) precalentada (NaCl 150 mM, KCl 5,2 mM, CaCl2 2,2 mM, MgCl2 0,2 mM, NaHCO3 6 mM, glucosa 2.8 mM, HEPES 5 mM, agua para inyección). Las células se incubaron con disolución de HR que contenía sulfato de [3H]-vincristina a una concentración final de 66,5 nM con o sin inhibidor de P-gp (25 |iM de verapamilo (preferiblemente Sigma) o 0,5 |iM de elacridar). Después de 2 h, el filtro Transwell™ con células de monocapa se colocó sobre hielo y las células se lavaron cinco veces con disolución de Ringer tamponada con HEPES helado. Las células se lisaron entonces con Tritón X-100 al 1 % (v/v) en disolución de HR durante 5 min a 37°C y se transfirieron a viales de centelleo. Las muestras (100 |il) se diluyeron en cóctel de centelleo líquido Ultima Gold M.V (preferiblemente 4 ml, Perkin Elmer) y se analizaron mediante un analizador de centelleo líquido, TRI-CARB 2100 TR (preferiblemente Perkin Elmer).

Caracterización de células endoteliales de tipo cerebral derivadas de CD34+

Análisis ultraestructural de monocapas celulares mediante microscopio electrónica de transmisión (MET)

En una realización preferida, se usó peroxidasa de rábano picante conjugada con aglutinina de germen de trigo (WGAHRP) (preferiblemente Sigma-Aldrich) para el análisis ultraestructural de monocapas de células endoteliales. Se transfirieron insertos de filtro con células endoteliales a placas que contenían 1,5 ml de disolución de Ringer tamponada con HEPES (NaCl 150 mM, KCl 5,2 mm, CaCl22,2 mM, MgCl2-6H2O 0,2 mM, NaHCO36 mM, HEPES 5 mM, glucosa 2.8 mM, pH 7,4) (compartimento inferior), y se aplicaron 0,5 ml de disolución de Ringer tamponada con HEPES suplementada WGA-HRp al 0,1 mg/ml al compartimento superior. Después de 10 min de incubación a 37°C en una atmósfera del 5 % de CO2/el 95 % de aire, se retiró la disolución WGA-HRP y las muestras se lavaron dos veces con disolución de Ringer tamponada con HEPES y se fijaron durante 1 h a temperatura ambiente con glutaraldehído al 2,5 % y paraformaldehído al 1 % en cacodilato de sodio 0,1 M (pH 7,4). Después del lavado con cacodilato de sodio 0,1 M, las monocapas de células endoteliales fijadas se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente con el sustrato de HRP tetraclorhidrato de 3,3'-diaminobencidina (preferiblemente 1,5 mg/ml; Sigma-Aldrich) y H2O2 al 0,02 % (v/v) en un tampón Tris-imidazol (imidazol 0,1 M, Tris/HCl 0,05 M, pH 7,0). Después del lavado con cacodilato de sodio 0,1 M, las células se fijaron de nuevo durante 1 h a TA con glutaraldehído al 2,5 % y paraformaldehído al 1 % en tampón cacodilato. Las muestras se lavaron dos veces con tampón cacodilato de sodio 0,1 M, se fijaron posteriormente con OsO4 al 1 % en tampón cacodilato 0,1 M. Después de la deshidratación en etanol graduado, las muestras se incrustaron en Epon 812. Se cortaron secciones ultrafinas en Ultracut UCT (preferiblemente Leica), se contrastaron con acetato de uranilo y citrato de plomo, y se examinaron con un MET Jeol 1011 a un voltaje de aceleración de 100 Kv.

Estudios de microalineamiento

En una realización preferida, se cultivaron células endoteliales CD34+ en monocultivo o en cultivo conjunto con pericitos durante 3 días y 6 días en las mismas condiciones de cultivo descritas en la sección de experimentos de cultivo conjunto de células endoteliales CD34+. Los días 3 y 6, las células endoteliales CD34+ se homogeneizaron en el reactivo Trizol (preferiblemente Life Technologies) y se extrajo la cantidad total de ARN con el kit RNeasy Mini (preferiblemente Qiagen), según las instrucciones del fabricante. Se evaluó la calidad del ARN preferiblemente por un bioanalizador Agilent 2100 (G2943CA), usando preferiblemente un kit Agilent RNA 6000 Nano (5067-1511). Se evaluó la expresión génica mediante un microalineamiento de genoma humano completo (4x44K) (preferiblemente G4112F de Agilent Technologies). Los microalineamientos se escanearon preferiblemente mediante un escáner Agilent B (G2565BA). Los datos en bruto se analizaron usando preferiblemente BRB-ArrayTools v3.4.0 desarrollado por el Dr. Richard Simon y el equipo de desarrollo de BRB-ArrayTools (Simon et al., 2007). Este análisis generó una mediana de conjunto de datos normalizados que se sometió a un agrupamiento y estudio estadístico usando preferiblemente el software MeV (Saeed et al., 2006). Los genes expresados de manera diferencial obtenidos a partir de MeV se usaron para calcular el valor M y la variación de cambio en veces. Se consideró como gen expresado de manera diferencial una variación igual o superior a 2X entre las diferentes condiciones.

Experimentos de señalización de Wnt

En una realización preferida para los experimentos de señalización de Wnt, se usaron sistemas de monocultivo y de cultivo conjunto. En monocultivo, se sembraron 8x104 células endoteliales CD34+ sobre el inserto Transwell™ recubierto con Matrigel. Las células se incubaron entonces con agonistas/ligandos (Wnt3A 6,25 ng/ml-100 ng/ml (R&D Systems), Wnt7A 6,25 ng/ml-250 ng/ml (preferiblemente Peprotech) o BIO 0,5-5 |iM (Sigma)) durante 1 o 5 días. Los cultivo conjuntos se prepararon tal como se describió anteriormente. Las células endoteliales derivadas de CD34+ cultivadas de manera conjunta con pericitos durante 1 o 6 días se usaron en los experimentos de señalización. Se añadió agonista (preferiblemente BIO 0,5-5 |iM) en el compartimento basolateral mientras que se añadió antagonista (XAV9390,1-3 |iM (preferiblemente Selleckbio)) en la parte apical del sistema Transwell™.

Análisis de FACS

En una realización preferible, las células se disociaron de la placa de cultivo por exposición al tampón de disociación celular (preferiblemente Life Technologies) durante 3-5 minutos y pipeteo suave, se centrifugaron y finalmente se resuspendieron en PBS suplementado con FBS al 5 % (v/v). Se tomaron alícuotas de las suspensiones de células individuales (2,0'105 células por condición), se fijaron con paraformaldehído al 4 % (v/v) (PFA; EMS) o metanol absoluto helado y se permeabilizaron con Tritón X-100 al 0,1 % (p/v) (preferiblemente Fluka) cuando fuera necesario. Las células se tiñeron con anticuerpos primarios específicos de antígeno (las razones de dilución y la lista de anticuerpos se facilitan en la tabla S1): anti-p-catenina humana, ZO-1 y claudina-1. Después de la incubación con anticuerpos primarios, las células se incubaron con los anticuerpos secundarios anti-conejo conjugado con ficoeritrina (PE) (preferiblemente R&D Systems) y anti-ratón conjugado con PE (preferiblemente Santa Cruz). Para la adquisición y análisis de los datos, se usaron FACS Calibur (preferiblemente BD Biosciences) y el software BD Cell Quest (preferiblemente BD Biosciences).

Caracterización del modelo de BHE humana in vitro derivado de CD34+

Mediciones de permeabilidad endotelial (Pe)

En una realización preferida previa a los experimentos, se añadió disolución de HR (en algunos casos medio EBM-2) a pocillos vacíos de una placa de 12 pocillos (preferiblemente Costar). Los insertos de filtro, que contenían monocapas confluentes de células endoteliales CD34+, se colocaron posteriormente en la placa de 12 pocillos, se rellenó con disolución de compuesto que contenía el marcador de integridad fluorescente amarillo lucifer (preferiblemente 20 |iM; Life Technologies), y luego se colocó en un agitador orbital. Después de 1 h, se retiraron los insertos de filtro del compartimento receptor. Se tomaron alícuotas de la disolución donadora al inicio y al final de los experimentos y se cuantificó la fluorescencia. Se sometieron a prueba al menos tres insertos con células y tres sin células en cada medición de permeabilidad. La detección de fluorescencia se llevó a cabo en un lector de múltiples placas Synergy H1 (preferiblemente Biotek) usando los siguientes ajustes de longitud de onda excitación/emisión (nm): 432/538; 490/516; 542/570 para amarillo lucifer, fluoresceína Na y Cy3-albúmina sérica humana e - IgG humana, respectivamente.

Para obtener un parámetro de transporte independiente de la concentración, se usó el principio de aclaramiento. El incremento en el volumen aclarado se calculó dividiendo la cantidad de compuesto en el compartimento receptor entre la concentración del fármaco en el compartimiento donador (preferiblemente Siflinger-Birnboim et al., 1987). El volumen aclarado se representó gráficamente frente al tiempo y la pendiente se estimó mediante análisis de regresión lineal. La pendiente de la curva de aclaramiento con insertos solos e insertos con células es igual a PSf y PSt, respectivamente, donde PS (microlitros/minuto) es el producto de permeabilidad por área de superficie (centímetro cuadrado). Se calculó el valor de PS para la monocapa endotelial (PSe). Para generar el coeficiente de permeabilidad endotelial, Pe (cm/min), el valor de PSe se dividió entre el área de superficie del inserto de filtro (A en cm2) usando la siguiente ecuación: Pe = [1/pst D1/PSF] -1/A. Para evaluar la posible adsorción a plásticos y la unión inespecífica a las células, se calculó el balance de masas (%) a partir de la cantidad de compuesto recuperado en ambos compartimentos al final del experimento dividido entre la cantidad total añadida en el compartimiento donador en el momento cero. Para la determinación de Pe, el valor del balance de masas debe estar entre el 80 % y el 120 %.

Inmunotinción

En una realización preferida, las células pueden fijarse en metanol/acetona fría (50 %/50 % v/v) durante 1 min o paraformaldehído al 4 % (v/v) (preferiblemente Electron Microscopy Sciences, EMS) durante 10 min a temperatura ambiente (véase la tabla complementaria 1). Después de permeabilizar las células con Triton X-100 al 0,1 % (v/v) (preferiblemente Sigma-Aldrich) durante 5-10 min, siempre que sea necesario, y bloquear durante 30 minutos con disolución albúmina sérica bovina (BSA) al 1 % (p/v) (preferiblemente Sigma-Aldrich) o suero de cabra normal (preferiblemente al 10 % (v/v), Sigma-Aldrich), las células se incubaron durante 1 h con los anticuerpos monoclonales primarios enumerados en la tabla complementaria 1, a temperatura ambiente. Después del lavado, las células se tiñeron con un anticuerpo secundario durante 1 h en la oscuridad a temperatura ambiente (véase la tabla complementaria 1). En cada experimento de inmunofluorescencia, se usó un control de IgG de isotipo coincidente. El núcleo de las células se tiñó con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI preferiblemente; Sigma-Aldrich) o reactivo Hoescht (preferiblemente ICN Pharmaceuticals). Las células se montaron usando Mowiol (preferiblemente Sigma-Aldrich) que contenían un agente antidesvanecimiento (preferiblemente Dabco, Sigma-Aldrich) o medio de montaje celular de DAKO. Se examinaron las células con un microscopio de fluorescencia Zeiss, un microscopio confocal Zeiss LSM 50 o con un microscopio de fluorescencia Leica DMR (preferiblemente Leica Microsystems). En el último caso, las imágenes se recogieron usando una cámara Cool SNAP RS Photometrics (preferiblemente Leica Microsystems) y se procesaron usando el software Adobe Photoshop 5.5 (preferiblemente Adobe systems).

Resistencia eléctrica transendotelial (TEER)

En una realización preferida, se midió TEER (Ohm.cm2) de células endoteliales humanas sobre filtros Transwell™ usando el instumento Millicell-ERS (preferiblemente Electrical Resistance System). La resistencia de los insertos recubiertos con Matrigel se sustrajo de la resistencia obtenida en presencia de los cultivos endoteliales según la siguiente ecuación: TEER= [(TEER, células) -(TEER, inserto) xA], donde A es el área del filtro (cm2).

Razones cerebro/plasma libres in vitro

En una realización preferida, atenolol, bupropión, diazepam, rifampicina y verapamilo (preferiblemente AstraZeneca, Local Discovery Research Area CNS & Pain Control, Sodertalje, Suecia) a 10 mM en DMSO.

Preparación de cultivos de células gliales de ratas

En una realización preferida, pueden aislarse cultivos primarios de células gliales de la corteza cerebral de rata recién nacida (preferiblemente Booher y Sensenbrenner, 1972). Después de limpiar las meninges, el tejido cerebral se forzó suavemente a través de un tamiz de nylon. Se usó DMEM suplementado con FBS al 10 % (v/v), glutamina 2 mM y gentamicina 50 |ig/ml para la disociación del tejido cerebral y el desarrollo de células gliales. Las células gliales se sembraron en placa a una concentración de 5,5x104 células en placas de 12 pocillos. El medio se cambió cada dos días. Tres semanas después de la siembra, se estabilizaron los cultivos gliales y se componían de astrocitos (~60 %), oligodendrocitos y células microgliales (Descamps et al., 2003).

En experimentos previos, se enjuagaron células gliales de rata 3 veces con disolución de Ringer tamponada con HEPES. Se añadieron 1,5 ml de disolución de HR a estos compartimentos receptores. Los insertos con células endoteliales de tipo cerebral humano también se enjuagaron y se colocaron en pocillos de células gliales de rata. Se añadieron al compartimento donador 0,5 ml de fármacos sometidos a prueba a 2 |iM en disolución de Ringer tamponada con HEPES con albúmina sérica humana al 0,5 %. Después de 1 h de incubación, se tomaron alícuotas del compartimiento donador y receptor y se analizaron (véase a continuación). Se calcularon las razones cerebro/plasma libres in vitro (Cu, b/Cu, p) usando la concentración de fármaco libre en el compartimento receptor y en el compartimento donador después de 1 h. Estos datos experimentales se calcularon en la calculadora de Cu, donador/CU, receptor in vitro (v0.1) (http://www.blue-norna.com) para generar razones de Cu, Br/Cu, pl in vitro en estado estacionario.

Todas las muestras se analizaron usando espectrometría de masas en tándem. Los instrumentos que se usaron incluían: Espectrómetro de masas, Quattro Premier XE (preferiblemente Waters); inyector automático, administrador de muestras de Acquity; bomba de UPLC, administrador de disolventes Acquity Binary (preferiblemente Waters); robot para la preparación de muestras, Biomek FX (preferiblemente Beckman-Coulter). Se usaron los siguientes productos químicos y reactivos: Acetato de amonio (preferiblemente Merck), grado de gradiente de acetonitrilo (preferiblemente Merck), grado de gradiente de metanol (preferiblemente Merck), agua desionizada de laboratorio, purificada adicionalmente con un sistema de purificación de agua Milli-Q y acetato de amonio 1 mol/l en agua Milli-Q. Las muestras se almacenaron en un congelador (-20°C). Con el fin de minimizar la contaminación de los instrumentos de análisis, se llevó a cabo la precipitación de proteínas en muestras que contenían HSA; las alícuotas de las muestras se transfirieron a una placa de pocillos profundos (1 ml), se precipitaron con acetonitrilo y se centrifugaron (4000 rpm a 4°C durante 20 min). El sobrenadante se transfirió entonces a una nueva placa de pocillos profundos y se añadió un tampón de RH. Para la cromatografía se usó el siguiente sistema: columna analítica, Acquity UPLC BEH C18 1,7 |im 2,1x30 mm (Waters); fase móvil A, acetonitrilo al 2 %, acetato de amonio 10 mM y B, acetonitrilo al 80 % en acetato de amonio 10 mM; gradiente, el 2 % de B durante 0,2 min, el 2-100 % de B en 0,3 min, mantenido al 100 % de B durante 0,2 min y volvió a la condición inicial en una sola etapa; retardo del disolvente de 0,4 min, tiempo entre inyecciones 1,5 min; caudal 0,6 ml/min; ciclo: 10 |il; volumen de inyección: 5-10 |il. Se realizó la cuantificación de muestras desconocidas usando preferiblemente el software QuanLynx. Los factores de respuesta se construyeron representando gráficamente el área del pico del analito frente a la concentración de cada analito usando un factor de respuesta promedio de las inyecciones de muestra del donador (D0/C0). Se usó la función de RF promedio sin ponderación.

Ensayo de transporte bidireccional

En una realización preferida, puede aplicarse fluoresceína de sodio 1 |iM o Cy3-albúmina sérica humana 500 nM o Cy3-inmunoglobulina humana G 100 nM (preferiblemente Jackson ImmunoResearch) en el compartimento apical o basolateral del inserto con células endoteliales. El compartimento opuesto se llenó con disolución de RH. Después de 120 minutos, se cuantificó la fluorescencia en un lector de múltiples capas Synergy H1 (preferiblemente Biotek) a una longitud de onda de excitación/emisión (nm) de 490/516 y 542/570 para fluoresceína de sodio y Cy3-albúmina sérica humana/Cy3-IgG humana, respectivamente. La razón de flujo de salida se calculó usando la ecuación: ER= (Papp, A>B) /Papp, B>A), donde A>B y B>A indica la dirección de transporte en la que se determinó Papp. El coeficiente de permeabilidad aparente (preferiblemente Papp) en cm/s se calculó según la siguiente ecuación: Papp= (Kxvr)/(Ax60), donde k es la velocidad de transporte (min-1) definida como la pendiente obtenida por regresión lineal de la fracción acumulada absorbida (FAcum) en función del tiempo (min), Vr es el volumen en la cámara receptora (cm3) y A es el área del filtro (cm2). Determinación de la fracción acumulada absorbida (cantidad permeada), FAcum, frente al tiempo. FAcum se calculó a partir de la ecuación: FAcum=ZRi/CDi, donde CRi era la concentración del receptor al final del intervalo i y CDi era la concentración del donador al inicio del intervalo i.

Experimentos de TNF-a

En una realización preferida, se determinó la expresión de moléculas de adhesión por las BLEC mediante FACS. Para estos experimentos, se cultivaron EC CD34+ con pericitos durante 6 días. Después del cultivo conjunto, se transfirieron transwell™ con monocapas de BLEC a una nueva placa de 12 pocillos. Las BLEC se trataron con TNF-a 10 ng/ml (preferiblemente Peprotech) durante 24 horas. Se usaron BLEC no tratadas como control. Las células se disociaron de la placa de cultivo por exposición al tampón de disociación celular (preferiblemente Life Technologies) durante 3-5 minutos y pipeteo suave, se centrifugaron y finalmente se resuspendieron en PBS suplementado con FBS al 5 % (v/v). Se tomaron alícuotas de las suspensiones de células individuales (2,0'105 células por condición) y se incubaron con anticuerpos primarios contra Cd 40, ICAM1, ICAM2, VCAM1, PECAM1 humanos (tabla S1). Después de la incubación con anticuerpos primarios, se incubaron las células con anticuerpos secundarios anti-conejo conjugado con ficoeritrina (PE) (preferiblemente R&D Systems) y anti-ratón conjugado con PE (preferiblemente Santa Cruz). Para la adquisición y análisis de los datos, se usaron FACS Calibur (preferiblemente BD Biosciences) y el software BD Cell Quest (preferiblemente BD Biosciences).

Análisis de inmunotransferencia de tipo Western

En una realización preferida, se aisló la proteína total de las EC CD34+ y pericitos en monocultivo o cultivo conjunto preferiblemente con tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación [tampón RIPA; Tris-HCl 50 mM de pH 7,4, NaCl 150 mM, IGEPAL al 1 %, desoxicolato de sodio al 0,5 %, dodecilsulfato sódico (SDS) al 0,1 % y ácido etilendiaminatetraacético (EDTA) 1 mM] suplementado con cóctel inhibidor de proteasas (preferiblemente Sigma-Aldrich), ortovanadato de sodio 1 mM (preferiblemente Sigma), fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 mM, fluoruro de sodio (NaF) 1 mM y ditiotreitol (TDT) 1 mM. Las muestras de proteína se centrifugaron a 14.000 g durante 15 min a 4°C, los sobrenadantes se recogieron en un nuevo tubo eppendorf y se almacenaron a -20°C hasta su uso. Se separaron 50 |ig de proteína total mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico al 8-12,5 % (SDS-PAGE) en condiciones reductoras y se transfirieron a membranas de poli(fluoruro de vinilideno) (PVDF) usando preferiblemente el sistema de transferencia Trans-Blot® Turbo™ (preferiblemente Bio-Rad). Después del bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente con PBS-Tween® 20 al 0,1 % (preferiblemente Sigma)-leche desnatada al 5 %, las membranas se incubaron durante la noche a 4°C con anticuerpos frente a: Wnt3, Wnt7A, Sonic hedgehog (Shh) (preferiblemente todos de Santa Cruz Biotechnology), anti-p-catenina total de conejo (Abcam) o a-tubulina (preferiblemente Sigma) seguido de incubación con anticuerpos secundarios específicos durante 1 h a temperatura ambiente (tabla S1). Las bandas proteicas se revelaron usando reactivo de quimiofluorescencia potenciada [(ECF); preferiblemente GE Healthcare Life Sciences] en el instrumento de obtención de imágenes moleculares Biorad FX (preferiblemente Bio-Rad).

Análisis estadístico

En una realización preferida para el análisis que implica tres o más grupos, se usó ANOVA, seguido de una prueba a posteriori de Bonferroni. Para el análisis de dos grupos, se usó una prueba de la t apareada. Se realizó análisis estadístico usando preferiblemente el software GraphPad Prism (preferiblemente San Diego, CA, EE.UU.). Los resultados se consideraron significativos cuando P<0,05.

Las realizaciones particulares descritas anteriormente son obviamente combinables. Las siguientes reivindicaciones exponen realizaciones particulares de la divulgación.

Tabla complementaria 1 -Anticuerpos usados para inmunofluorescencia, citometría de flujo* e inmunotransferencia de tipo Western0.

Anticuerpo Dilución Referencia Proveedor Fijación Células Anti-ocludina de conejo 1/200" 71-500 Life Technologies PFA al 4 % endoteliales

Anti-ZO1 de conejo 1/200°

61-7300 Life Technologies PFA al 4 % Anti-claudina 5 de conejo 1/100° 34-1600 Life Technologies Metanol/ acetona Anti-claudina 1,3 de 1/10" 71-7800 Life Technologies PFA al 4 % conejo

Anti-claudina 1 de conejo 1/25° Ab15098 Abcam PFA al 4 % Anti-JAM1 de ratón 1/100°

552147 Becton Dickinson Metanol/ acetona Anti-Pgp de ratón 1/10° GTX23364 GeneTex PFA al 4 % Anti-RAGE de cabra 1/100" Sc-8230 Santa Cruz PFA al 4 %

Biotechnology

Anti-Wnt3 de conejo 1/5000 Sc-28824 Santa Cruz N/D Biotechnology

Anti-Wnt7A de cabra 1/2500 Sc-26361 Santa Cruz N/D Biotechnology

Anti-Shh de cabra 1/2500 Sc-1194 Santa Cruz N/D Biotechnology

Anti-AHNAK de conejo 1/50° Sc-98373 Santa Cruz PFA al 4 %

Biotechnology

Anti-PECAMI de ratón 1 /50*° M0823 DAKO PFA al 4 % Anti-VE-cadherina de 1/50° Sc-9989 Santa Cruz PFA al 4 % ratón Biotechnology

Anti-factor de von 1/50" M0616 DAKO PFA al 4 % Willebrand de ratón

Anti-CD106 (VCAM-1) de 1/50* 551146 BD Biosciences N/D ratón con FITC

Anti-CD40 de ratón 1/50* Sc-65264 Santa Cruz N/D Biotechnology

Anti-ICAMI de ratón 1/50* Sc-107 Santa Cruz N/D Biotechnology

Anti-ICAM2 de ratón 1/50* Sc-23935 Santa Cruz N/D Biotechnology

Anti-beta catenina activa 1/300* 05-665 Millipore PFA al 4 % de ratón

Anti-beta catenina total

Ab6302 Abcam PFA al 4 % de conejo

Anti-OCTN2 de conejo 1/50° Anticuerpo Lo suministró PFA al 4 %

de amablemente el

fabricación Dr. Nalecz KA,

propia Instituto Nencki de

Biología

Experimental,

Varsovia, Polonia.

Anti-RAGE de cabra 1/100 Sc-8230 Santa Cruz PFA al 4 %

Biotechnology

Anti-alfa tubulina de ratón 1/10000 T6199 Sigma N/D Pericitos Anti-PDGFR-beta de 1/100° Ab51092 Abcam PFA al 4 %

conejo

Anti-alfa SMA de conejo 1/200" M0851 DAKO PFA al 4 % Anti-NG2 de conejo 1/200" Ab5320 Millipore PFA al 4 % Anticuerpos Anti-conejo Alexa Fluor 1/200° A11034 Molecular Probes PFA al 4 % secundarios 488

Anti-conejo Alexa Fluor 1/200" A11036 Molecular Probes PFA al 4 % 568

Anti-ratón Alexa Fluor 1/200° A11031 Molecular Probes PFA al 4 % 568

Anti-cabra Alexa Fluor 1/200" A11057 Molecular Probes PFA al 4 % 568_______________________________________________________________________________ Anti-ratón Cy3___________ 1/100" C2181 Sigma_____________ PFA al 4 % Anti-conejo con 1/20* F0110 R&D Systems PFA al 4 %, ficoeritrina_________________________________________________________ metanol_________ Anti-conejo Cy3 1/100° 111-165- Jackson PFA al 4% ____________________________________ 144________ Immunoresearch____________________ Anti-ratón con ficoeritrina 1/100* Sc-358926 Santa Cruz N/D Biotechnology

Anti-ratón con fosfatasa 1/5000° RPN5781 GE Healthcare N/D alcalina

Anti-conejo con fosfatasa 1/5000° RPN5783 GE Healthcare N/D alcalina

Anti-cabra con

1/3000° 705-055­ Jackson N/D

alcalina 003 Immunoresearch

Otros Hoechst33258 4 mg/ml° 190304 ICN PFA al 4 % reactivos

DAPI 2 |ig/ml" D9542 Sigma PFA al 4 %

Tabla complementaria 2- Cebadores usados para PCR cuantitativa en tiempo real y PCR no cuantitativa*.

Tabla complementaria 3- Genes regulados por disminución en el microalineamiento.

Tabla complementaria 4- Genes regulados por incremento en el microalineamiento.

Bibliografía

1. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development. Nat Rev Drug Discov6, 650-661 (2007).

2. Weksler, B.B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J 19, 1872-1874 (2005).

3. Sano, Y., et al. Establishment of a new conditionally immortalized human brain microvascular endothelial cell line retaining an in vivo blood-brain barrier function. J Cell Physiol 225, 519-528 (2010).

4. Lippmann, E.S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol (2012).

5. Pedroso, D.C., et al. Improved survival, vascular differentiation and wound healing potential of stem cells co-cultured with endothelial cells. PLoS One 6, e16114 (2011).

6. Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature 468, 557-561 (2010).

7. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A.A. & Barres, B.A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature 468, 562-566 (2010).

8. Vandenhaute, E., et al. Brain pericytes from stress-susceptible pigs increase blood-brain barrier permeability in vitro. Fluids Barriers CNS 9, 11 (2012).

9. Liebner, S., et al. Wnt/beta-catenin signaling controls development of the blood-brain barrier. J Cell Biol 183, 409­ 417 (2008).

10. Tatsuta, T., Naito, M., Oh-hara, T., Sugawara, I. & Tsuruo, T. Functional involvement of P-glycoprotein in bloodbrain barrier. J Biol Chem 267, 20383-20391 (1992).

11. Bo, L., et al. Distribution of immunoglobulin superfamily members ICAM-1, -2, -3, and the beta 2 integrin LFA-1 in multiple sclerosis lesions. J Neuropathol Exp Neurol 55, 1060-1072 (1996).

12. Friden, M., Gupta, A., Antonsson, M., Bredberg, U. & Hammarlund-Udenaes, M. In vitro methods for estimating unbound drug concentrations in the brain interstitial and intracellular fluids. Drug Metab Dispos 35, 1711-1719 (2007).

13. Alvarez, J.I., et al. The Hedgehog pathway promotes blood-brain barrier integrity and CNS immune quiescence. Science 334, 1727-1731 (2011).

14. Daneman, R., et al. Wnt/beta-catenin signaling is required for CNS, but not non-CNS, angiogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 641-646 (2009).

15. Booher J, Sensenbrenner M. Growth and cultivation of dissociated neurons and glial cells from embryonic chick, rat and human brain in flask cultures. Neurobiology. 1972;2(3):97-105.

16. Descamps L, Coisne C, Dehouck B, Cecchelli R, Torpier G. Protective effect of glial cells against lipopolysaccharide- mediated blood-brain barrier injury. Glia. 2003 Apr 1;42(1):46-58.

17. Meresse S, Dehouck MP, Delorme P, Bensaid M, Tauber JP, Delbart C, Fruchart JC, Cecchelli R. Bovine brain endothelial cells express tight junctions and monoamine oxidase activity in long-term culture. J Neurochem 53(5):1363-1371.1989.

18. Saeed AI, Bhagabati NK, Braisted JC, Liang W, Sharov V, Howe EA, Li J, Thiagarajan M, White JA, Qackenbush J. TM4 microarray suite software. Methods Enzymol. 2006(411): 134-193.

19. Sano Y, Shimizu F, Abe M, Maeda T, Kashiwamura Y, Ohtsuki S, Terasaki T, Obinata M, Kajiwara K, Fujii M, Suzuki M, Kanda T. Establisment of a new conditionally immortalized human brain microvascular endothelial cell line retaining an in vivo blood-brain barrier function. J Cell Physiol. 2010 (225): 519-528.

20. Siflinger-Birnboim A, Del Vecchio PJ, Cooper JA, Blumenstock FA, Shepard JM, Malik AB. Molecular sieving characteristics of the cultured endothelial monolayer. J Cell Physiol. 1987; 132(1):111-117.

21. Simon R, Lam A, Li MC, Ngan M, Menenzes S, Zhao Y. Analysis of gene expression data using BRB-array tools.

Claims (3)

1. REIVINDICACIONES

   i . Un método para obtener células endoteliales de tipo cerebral humanas que comprende las siguientes etapas:

   poner en contacto una población de células aisladas a partir de células madre CD34+ con un medio de diferenciación para obtener células endoteliales en el que dichas células madre se aíslan a partir de sangre de cordón umbilical o sangre periférica;

   cultivar de manera conjunta dichas células endoteliales con pericitos o con un medio condicionado de pericitos, en el que dichos pericitos expresan al menos uno de los siguientes marcadores: vimentina, PDGF-P, NG-2, a-SMA, P-gp, y-GT;

   en el que la población de células endoteliales se cultiva de manera conjunta con pericitos o con el medio condicionado de pericitos durante al menos 4 días.
2. 2. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho medio de diferenciación es medio EGM-2 con FBS al 20 % (v/v) y 50 ng/ml de VEGF165.
3. 3. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la población de células endoteliales se cultiva de manera conjunta con pericitos durante 5-6 días.