ES2836128T3 - Método para determinar variantes del receptor de andrógenos en cáncer de próstata - Google Patents

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Abstract

Un método in vitro de diagnóstico de cáncer de próstata resistente a hormonas basándose en un biomarcador que es una proteína o un polinucleótido que tiene una alteración en el nivel de expresión o actividad que está asociado con cáncer de próstata resistente a hormonas, comprendiendo el método: (i) determinar el nivel de expresión de un ácido nucleico que tiene una secuencia que es o es complementaria a una variante del gen del receptor de andrógenos (AR) que tiene la SEQ ID NO: 1 (AR-V7) o una secuencia que es al menos un 90 %, 95 % o 99 % idéntica a la misma en una muestra tomada de un sujeto, o; (ii) determinar el nivel de expresión de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por una variante del gen del receptor de andrógenos (AR) que tiene la SEQ ID NO: 8 (AR-V7) p una secuencia que es al menos un 90 %, 95 % o 99 % idéntica a la misma, en una muestra tomada de un sujeto, en el que un nivel aumentado de expresión con respecto a una referencia seleccionada entre una muestra del sujeto de control o una muestra del sujeto obtenida de un punto temporal anterior es indicativo de cáncer de próstata resistente a hormonas.

Description

DESCRIPCIÓN
Método para determinar variantes del receptor de andrógenos en cáncer de próstata
Antecedentes de la invención
El cáncer de próstata (PCa) depende de señalización androgénica para su crecimiento y supervivencia. Los andrógenos ejercen sus efectos celulares y fisiológicos a través de la unión al receptor de andrógenos (AR), un miembro de la familia de receptores de hormonas esteroideas de factores de transcripción. El gen AR humano está localizado en el cromosoma Xq 11-12 y abarca aproximadamente 180 kb de ADN con ocho exones conocidos. La proteína AR prototipo contiene varios dominios funcionales. El dominio NH2-terminal (NTD), codificado por el exón 1, constituye aproximadamente el 60 % de la proteína de longitud completa de 110 kDa y es la región reguladora de la transcripción de la proteína. El dominio de unión a ADN (DBD) central, está codificado por los exones 2 y 3, mientras que los exones 4 a 8 codifican el dominio de unión a ligando (LBD) COOH-terminal. La unión de andrógenos al LBD de AR permite la entrada del receptor unido a ligando al núcleo y posterior regulación transcripcional de genes sensibles a andrógenos.
Se ha usado hormonoterapia desde 1941 para el tratamiento de cáncer de próstata metastásico. Las terapias de privación de hormonas que emplean castración quirúrgica y/o médica, así como su combinación con antiandrógenos se han convertido en el pilar del tratamiento sistémico para cáncer de próstata avanzado. Las hormonoterapias para PCa avanzado están dirigidas a las funciones mediadas por AR mediante la supresión de la producción de andrógenos y/o unión de andrógenos al LBD de AR. Aunque estas terapias a menudo provocan un período de regresión clínica, no son curativas debido a la progresión de PCa refractario a hormonas (HRPC) para lo cual las opciones terapéuticas eficaces están limitadas. En un entorno clínico contemporáneo, la longitud de remisión clínica, a menudo evaluada por mediciones de antígeno específico de próstata (PSA) en suero, varía sustancialmente debido a un amplio espectro de fenotipos clínicos entre los pacientes tratados. De forma casi invariable, sin embargo, el cáncer de próstata desarrolla fenotipo resistente a castración y progresa a una fase potencialmente mortal, a pesar de las hormonoterapias. El uso extendido de terapias de privación de hormonas se manifiesta en la observación de que casi todos los pacientes que mueren de cáncer de próstata han recibido terapias de privación de hormonas y estas han resultado fallidas.
Unas pocas líneas de evidencia han establecido que, a diferencia del cáncer de mama humano, la progresión del cáncer de próstata tras hormonoterapia no se debe a pérdida de dependencia en la señalización hormonal, sino que, en su lugar, se caracteriza por señalización androgénica sostenida que supera la necesidad de niveles fisiológicos de andrógenos. En primer lugar, con solo ciertas excepciones, los pacientes con cáncer de próstata que mueren de cáncer de próstata resistente a castración tienen niveles muy elevados de PSA en suero, cuya producción está dirigida por la señalización androgénica. En segundo lugar, los cánceres de próstata resistentes a castración tienen niveles elevados de expresión del mediador clave de la señalización androgénica, el AR, y esta es una característica molecular muy constante en tejidos derivados de pacientes con cáncer de próstata resistente a castración. En tercer lugar, un subconjunto de cánceres de próstata que sufren recidiva después de hormonoterapia sigue respondiendo a hormonoterapias de segunda línea diseñadas para alterar el eje de señalización de AR lo que sugiere que la señalización androgénica mediada por AR aún está funcionando entre estos tumores. Aunque es posible que las células cancerosas de próstata AR negativas puedan dar lugar a carcinoma de próstata independiente de andrógenos, los tumores de próstata compuestos principalmente de células maligna AR negativas (es decir, células pequeñas y células neuroendocrinas) son raros.
Las funciones mediadas por AR no se anulan completamente por las hormonoterapias existentes. HRPC sigue dependiendo de funciones mediadas por AR, pero supera la necesidad de niveles fisiológicos y andrógenos. Alteraciones moleculares que implican el propio AR, tales como sobreexpresión de AR y mutaciones del LBD de AR de ganancia de función, son habituales en HRPC y permiten funciones genómicas continuadas mediadas por AR en presencia de ligandos reducidos o alterados. A pesar de la relevancia clínica establecida de estas alteraciones bien caracterizadas de AR en HRPC, solamente unos pocos estudios previos han sugerido un mecanismo alternativo para HRPC e investigaron el papel putativo de variantes de AR que carecen del LBD de AR.
Por consiguiente, sigue existiendo una necesidad de composiciones más eficaces y métodos para el tratamiento de cáncer de próstata.
Jocelyn Céraline ET AL.: "Constitutive activation of the androgen receptor by a point mutation in the hinge region: A new mechanism for androgen-independent growth in prostate cancer", International Journal of Cancer, vol. 108, n.° 1, 1 de enero de 2004 (01-01-2004), páginas 152-157, divulga que mutaciones en el receptor de andrógenos (AR) que modifican tanto la unión al ligando como las capacidades de transactivación del AR representan uno de los mecanismos implicados en la transición de cáncer de próstata de crecimiento dependiente de andrógenos en crecimiento independiente de andrógenos. Se informa de la detección de dos AR mutantes diferentes dentro de la misma muestra de tumor metastásico recogida de un paciente con cáncer de próstata avanzado que evadido la privación de andrógenos.
Clifford Tepper ET AL: "Characterization of a novel androgen receptor mutation in a relapsed CWR22 prostate cáncer xenograft and cell line.", Cancer research, vol. 62, n.° 22, 1 de noviembre de 2002 (01-11-2002), páginas 6606-6614, divulga receptores de andrógenos que carecen del dominio de unión a ligando debido a la presencia de una duplicación del exón 3.
W D Tilley ET AL: "Mutations in the Androgen Receptor Gene Are Associated with Progression of Human Prostate Cancer to Androgen Independence", Clin Cancer Res, vol. 2, 1 de enero de 1996 (01-01-1996), páginas 277-285, divulga un análisis de polimorfismos conformacionales monocatenarios y secuenciación de ADN de la región codificante del gen de AR completo en 25 tumores primarios de próstata muestreados antes del inicio de hormonoterapia. La presencia de sustituciones aminoacídicas en los andrógenos se asoció con tinción inmunohistoquímica disminuida para AR en células tumorales y el rápido fracaso de las posteriores hormonoterapias.
HAAPALA K ET AL: "Androgen receptor alterations in prostate cancer relapsed during a combined androgen blockade by orchiectomy and bicalutamide", LABORATORY INVESTIGATION, NATURE PUBLISHING GROUP, THE UNITED STA TES AND CANADIAN ACADEMY OF PATHOLOGY, INC, vol. 81, n.° 12, 1 de diciembre de 2001 (01-12-2001), páginas 1647-1651, divulga que diferentes variantes de AR se desarrollan y seleccionan durante diversos tipos de tratamientos hormonales y, también, que el loqueo combinado de andrógenos conseguido por orquiectomía y bicalutamida no actúa como fuerza selectiva para la amplificación de AR.
JEN STER G ET AL: "DOMAINS OF THE HUMAN ANDROGEN R EC EPTO R INVOLVED IN STERO ID BINDING TRANSCRIPTIONAL ACTIVATION AND SU BCELLU LAR LOCALIZATION", MOLECULAR ENDOCRINOLOGY, vol.
5, n.° 10, 1991, páginas 1396-1404, y JEN STER G ET AL: "Functional domains of the human androgen receptor", JOURNAL OF STERO ID BIOCHEM ISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, E LSEV IER SC IEN CE LTD., OXFORD, GB, vol. 41, n.° 3-8, 1 de marzo de 1992 (01-03-1992), páginas 671-675, divulga un polipéptido del receptor de andrógenos que carece del LBD.
Marika J Linja ET AL: "Amplification and Overexpression of Androgen Receptor Gene in Hormone-Refractory Prostate Cancer 1", CANCER RESEARC H , 1 de marzo de 2001 (01-03-2001), páginas 3550-3555, muestra niveles de alta expresión de AR en cáncer de próstata resistente a hormonas.
Sumario de la invención
Se describen varias variantes nuevas de AR. Estas nuevas variantes de AR están codificadas por transcritos con corte y empalme y no tienen los dominios proteicos necesarios para unirse a andrógenos, pero son constitutivamente activas y dirigen la señalización de AR en ausencia completa de andrógenos. Los presentes inventores han realizado un análisis completo de secuencia in silico y análisis de microserie de expresión completa del locus genómico de AR humano y descubrieron múltiples variantes nuevas ARDLBD que codifican potencialmente NTD de AR y DBD de AR completos. Los presentes inventores han demostrado que un anticuerpo generado contra una de las variantes de AR detecta proteína variante de AR frecuentemente en muestras de HRPC. Por consiguiente, el patrón de expresión y la función independiente de andrógenos validada de estas variantes de AR recién identificadas contribuyen a una nueva comprensión respecto al mecanismo molecular de HRPC que afectará al tratamiento global de pacientes con PCa avanzado.
La presente invención se refiere a lo siguiente:
1. Un método in vitro de diagnóstico de cáncer de próstata resistente a hormonas basándose en un biomarcador que es una proteína o un polinucleótido que tiene una alteración en el nivel de expresión o actividad que está asociado con cáncer de próstata resistente a hormonas, comprendiendo el método:
(i) determinar el nivel de expresión de un ácido nucleico que tiene una secuencia que es o es complementaria a una variante del gen del receptor de andrógenos (AR) que tiene la SEQ ID NO: 1 (AR-V7) o una secuencia que es al menos un 90 %, 95 % o 99 % idéntica a la misma en una muestra tomada de un sujeto, o;
(ii) determinar el nivel de expresión de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por una variante del gen del receptor de andrógenos (AR) que tiene la SEQ ID NO: 8 (AR-V7) o una secuencia que es al menos un 90 %, 95 % o 99 % idéntica a la misma en una muestra tomada de un sujeto,
donde el nivel aumentado de expresión con respecto a una referencia seleccionada entre una muestra de un sujeto de control o una muestra de un sujeto obtenida en un pinto temporal anterior es indicativo de cáncer de próstata resistente a hormonas.
2. El método del punto 1, donde la expresión de una molécula de ácido nucleico de variante del receptor de andrógenos se detecta usando reacción de hibridación que comprende hibridar la muestra a uno o más conjuntos de cebadores.
3. El método del punto 2, donde el conjunto de cebadores incluye cebadores de suficiente longitud y secuencia apropiada para que pueda iniciar la síntesis de un producto de extensión de cebador.
4. El método del punto 3, donde la reacción de hibridación es una reacción en cadena de la polimerasa.
5. El método del punto 4, donde la reacción en cadena de la polimerasa es o comprende una reacción de RT-PCR.
6. El método del punto 4, donde la reacción en cadena de la polimerasa es o comprende una reacción que implica acoplar una molécula de tinte flu orogénico y un resto inactivador al mismo o a diferentes sustratos oligonucleotídicos.
7. El método del punto 4, donde la reacción en cadena de la polimerasa es o comprende una reacción que implicar la unión de un tinte fluorogénico que emite una señal fluorescente tras la unión.
8. El método del punto 2, donde los cebadores del conjunto de cebadores comprenden más de 8 desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos.
9. El método del punto 8, donde cada uno del uno o más conjuntos de cebadores comprende un cebador directo y un cebador inverso, donde el cebador directo es complementario a una secuencia de ácido nucleico correspondiente a la SEQ ID NO: 1 o fragmentos de la misma y el cebador inverso es complementario a una secuencia de ácido nucleico correspondiente a la SEQ ID NO: 1.
10. El método del punto 2, donde cada cebador del conjunto es o es complementario a al menos 8 restos de la SEQ ID NO: 1.
11. El método del punto 10, donde el conjunto de cebadores es específico de variante del recetor de andrógenos. 12. El método del punto 2, donde el conjunto de cebadores usado para detectar AR-V7 es TGTCACTATGGAGCTCTCACATGTGG (SEQ ID NO: 19) y
CTGTGGATCAGCTACTACCTTCAG (SEQ ID NO: 20); o
G TTG C TCCCG CAAG TTTC CTTCTC T (SEQ ID NO: 23) y
TTTGAATGAGGCAAGTCAGCCTTTCT (SEQ ID NO: 24) o
CCATCTTGTCGTCTTCGGAAATGTTATGAAGC (SEQ ID NO: 27) y
TTTGAATGAGGCAAGTCAGCCTTTCT (SEQ ID NO: 28).
13. El método del punto 1, donde la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste en: biopsia de tejido de cáncer de próstata, muestras quirúrgicas o de autopsia, una muestra de líquido biológico, sangre, plasma sanguíneo, suero y orina o combinaciones de las mismas.
14. Un kit de diagnóstico para la detección de una variante de AR que es AR-V7 que tiene la SEQ ID NO: 1 o una secuencia que es al menos un 90 %, 95 % o 99 % idéntica a la misma, comprendiendo dicho kit un conjunto de cebadores que amplifica la variante de AR.
15. El kit de diagnóstico del punto 14, donde el conjunto de cebadores se usa para detectar AR-V7 y es TGTCACTATGGAGCTCTCACATGTGG (SEQ ID NO: 19) y CTGTGGATCAGCTACTACCTTCAG (SEQ ID NO: 20); o G TTG CTCCCG CAAG TTTCCTTCTCT (SEQ ID NO: 23) y TTTGAATGAGGCAAGTCAGCCTTTCT (SEQ ID NO: 24) o CCAT CTT G TCG TCTTCG G AAATGTT ATGAAG C (SEQ ID NO: 27) y TTTGAATGAGGCAAGTCAGCCTTTCT (SEQ ID NO: 28).
16. Un kit de diagnóstico para la detección de una variante de AR que es AR-V7 que tiene la SEQ ID NO: 8 o una secuencia que es al menos un 90 %, 95 % o 99 % idéntica a la misma, comprendiendo dicho kit un anticuerpo anti-AR-V7 humano que se une específicamente al epítopo CKHLKMRP correspondiente a la SEQ ID NO: 33.
En otra realización de uno cualquiera de los aspectos anteriores, la referencia es una muestra del sujeto de control. En otra realización de uno cualquiera de los aspectos anteriores, la referencia es una muestra del sujeto obtenida en un punto temporal anterior.
En otra realización más de uno cualquiera de los aspectos anteriores, la referencia es una muestra del sujeto obtenida antes de tratamiento quirúrgico.
En otra realización, la referencia es el nivel de polipéptido o molécula de ácido nucleico de la variante del receptor de andrógenos presentes en una muestra de control obtenida de sujetos con una enfermedad de menor gravedad. En una realización relacionada, la enfermedad de menor gravedad es un cáncer de próstata no agresivo en estadio inicial. En otra realización de uno cualquiera de los aspectos anteriores, el método usa adicionalmente una muestra biológica obtenida del sujeto.
En otra realización de uno cualquiera de los aspectos anteriores, la expresión de una molécula de ácido nucleico de variante del receptor de andrógenos detectada usando una reacción de hibridación comprende hibridar la muestra a uno o más conjuntos de cebadores.
En una realización, la reacción de hibridación es una reacción en cadena de la polimerasa.
En otra realización, cada conjunto de cebadores comprende un cebador directo y un cebador inverso, donde el cebador directo es complementario a una secuencia de ácido nucleico correspondiente a una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre la SEQ ID NO: 1 o fragmentos de la misma, y el cebador inverso es complementario inverso a una secuencia de ácido nucleico correspondiente a una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre la SEQ ID NO: 1. En una realización relacionada, el conjunto de cebadores se selecciona entre el grupo que consiste en: (P1):
TGTCACTATGGAGCTCTCACATGTGG (SEQ ID NO: 19) y
CTG TG GATCAG CTACTACCTTCAG CTC (SEQ ID NO: 20); (P4)
G TTG CTCCCG CAAG TTTCCTTCTC (SEQ ID NO: 23) y
TTTGAATGAGGCAAGTCAGCCTTTCT (SEQ ID NO: 24); (P6) CCATCTTGTCGTCTTCGGAAATGTTATGAAGC (SEQ ID NO: 27) y
TTTGAATGAGGCAAGTCAGCCTTTCT (SEQ ID NO: 28); (P8)
Se describe un anticuerpo contra la variante del receptor de andrógenos que se une específicamente a una proteína variante del receptor de andrógenos (AR-V) o fragmento de la misma.
En una variante, el anticuerpo se une específicamente a una proteína variante 7 del receptor de andrógenos (AR-V7). En una variante, el anticuerpo se une específicamente a una proteína de variante-8 del receptor de andrógeno (AR-V8).
En otra variante, el anticuerpo se une específicamente a una proteína de variante-1 del receptor de andrógenos (AR-V1).
En otra variante adicional más, el anticuerpo se une a un epítopo CKHLKMRP de un polipéptido AR-V, correspondiente a la SEQ ID NO: 33.
En otra variante de uno cualquiera de los aspectos anteriores, el anticuerpo es monoclonal.
Se describe un polipéptido que comprende una proteína aislada del receptor de andrógenos variante, o fragmento de la misma, que tiene identidad sustancial con la variante 7 del receptor de andrógenos (AR-V7), donde la variante está regulada positivamente en cáncer de próstata.
En un aspecto, la variante de la proteína del receptor de andrógenos es al menos un 85 % idéntica a la variante 7 del receptor de andrógenos.
En otra realización, la variante de la proteína del receptor de andrógenos comprende al menos el dominio NH2 terminal (NTD) y el dominio de unión a ADN (DBD) del receptor de andrógenos.
En otra realización relacionada, el polipéptido está unido a una secuencia detectable de aminoácidos.
En otra realización relacionada más, el polipéptido está unido a una marca de afinidad.
En otra realización de los aspectos anteriores, la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido de uno cualquiera de los anteriores.
Se describe adicionalmente un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de uno cualquiera de los aspectos anteriores.
Se describe adicionalmente una molécula de ácido nucleico inhibidora de la variante del receptor de andrógenos aislada, donde la molécula de ácido nucleico inhibidora se une específicamente a al menos un fragmento de una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína variante del receptor de andrógenos.
En una variante, el vector comprende una molécula de ácido nucleico que codifica la molécula de ácido nucleico de los aspectos anteriores.
En otra variante, el vector es un vector de expresión.
En otra variante más, la molécula de ácido nucleico está unida de forma funcional a un promotor.
En otra variante más, el promotor es adecuado para expresión en una célula de mamífero.
En otra variante, la invención destaca una célula hospedadora que comprende una molécula de ácido nucleico de uno cualquiera de los aspectos anteriores.
En una variante, la célula expresa una proteína variante del receptor de andrógenos.
En otra variante, la célula está in vitro. En otra realización la célula está in vivo.
En otra variante más, la célula es una célula de mamífero. En otra realización más, la célula es una célula humana. Se describe adicionalmente un ARN bicatenario correspondiente a al menos una parte de una molécula de ácido nucleico de variante del receptor de andrógenos que codifica una proteína variante del receptor de andrógenos, donde el ARN bicatenario es capaz de alterar el nivel de proteína codificada por la molécula de ácido nucleico de la variante del receptor de andrógenos.
En una variante, el ARN es ARNip.
Se describe adicionalmente una molécula de ácido nucleico antisentido, donde la molécula de ácido nucleico antisentido es complementaria a una molécula de ácido nucleico de la variante del receptor de andrógenos que codifica una proteína variante del receptor de andrógenos, y donde el antisentido es capaz de alterar la expresión a partir de la molécula de ácido nucleico a la cual es complementaria.
En otro aspecto, la invención destaca un cebador capaz de unirse a una molécula de ácido nucleico de la variante del receptor de andrógenos que codifica una variante de la proteína variante del receptor de andrógenos.
En una realización, el cebador es capaz de unirse a una molécula de ácido nucleico de la variante del receptor de andrógenos, donde el cebador se selecciona entre el grupo que consiste en: (SEQ ID NO: 19), (SEQ ID NO: 20), (SEQ ID NO: 23), (SEQ ID NO: 24), (SEQ ID NO: 27) y (SEQ ID NO: 28).
Se describe adicionalmente un biomarcador del receptor de andrógenos purificado en un biochip.
Se describe adicionalmente una microserie que comprende al menos dos moléculas de ácido nucleico, o fragmentos de las mismas, fijadas a un soporte sólido, donde al menos una de las moléculas de ácidos nucleico es una molécula de ácido nucleico de la variante del receptor de andrógenos.
Se describe adicionalmente una microserie que comprende al menos dos polipéptidos, o fragmentos de los mismos, unidos a un soporte sólido, donde al menos uno de los polipéptidos en el soporte es un polipéptido variante del receptor de andrógenos.
En otro aspecto, la invención destaca un kit de diagnóstico para la detección de una variante de AR que es AR-V7 que tiene la SEQ ID NO: 1 o una secuencia que es al menos un 90 %, 95 % o 99 % idéntica a la misma, comprendiendo dicho kit un conjunto de cebadores que amplifica la variante de AR.
Se describe adicionalmente un método para alterar la expresión de una molécula de ácido nucleico de la variante del receptor de andrógenos en una célula, comprendiendo el método poner en contacto la célula con una cantidad eficaz de un compuesto capaz de alterar la expresión de la molécula de ácido nucleico de la variante del receptor de andrógenos.
En una variante, el compuesto es una molécula de ácido nucleico antisentido, un ARN interferente pequeño (ARNip), o un ARN bicatenario (ARNbc) que inhibe la expresión de una molécula de ácido nucleico de la variante del receptor de andrógenos.
Se describe adicionalmente un método para alterar la expresión de la proteína variante del receptor de andrógenos en una célula, comprendiendo el método poner en contacto la célula con un compuesto capaz de alterar la expresión de un polipéptido variante del receptor de andrógenos.
Se describe adicionalmente un método para tratar o prevenir el cáncer de próstata, comprendiendo el método administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que altera la expresión de un polipéptido variante del receptor de andrógenos.
Se describe adicionalmente un método para identificar un compuesto que inhibe el cáncer de próstata, comprendiendo el método poner en contacto una célula que expresa una molécula de ácido nucleico de la variante del receptor de andrógenos con un compuesto candidato, y comparar el nivel de expresión de la molécula de ácido nucleico en la célula en contacto por el compuesto candidato con el nivel de expresión en una célula de control no en contacto por el compuesto candidato, donde una alteración en la expresión de la molécula de ácido nucleico de la variante del receptor de andrógenos identifica el compuesto candidato como un compuesto que inhibe el cáncer de próstata. En una variante, la alteración en la expresión es una disminución en la transcripción.
En otra variante, la alteración en la expresión es una disminución en la traducción.
Se describe adicionalmente un método para identificar un compuesto que inhibe el cáncer de próstata, comprendiendo el método poner en contacto una célula que expresa un polipéptido variante del receptor de andrógenos con un compuesto candidato, y comparar el nivel de expresión del polipéptido en la célula en contacto por el compuesto candidato con el nivel de expresión de polipéptido en una célula de control no en contacto por el compuesto candidato, donde una alteración en la expresión del polipéptido variante del receptor de andrógenos identifica el compuesto candidato como un compuesto que inhibe el cáncer de próstata.
Se describe adicionalmente un método para identificar un compuesto que inhibe el cáncer de próstata, comprendiendo el método poner en contacto una célula que expresa un polipéptido variante del receptor de andrógenos con un compuesto candidato, y comparar la actividad biológica del polipéptido en la célula en contacto por el compuesto candidato con el nivel de actividad biológica en una célula de control no en contacto por el compuesto candidato, donde una alteración en la actividad biológica del polipéptido variante del receptor de andrógenos identifica el compuesto candidato como un compuesto candidato que inhibe el cáncer de próstata.
En una variante de los aspectos anteriores, la célula es una célula humana. En otra realización de los aspectos anteriores, la célula es una célula neoplásica.
En otra variante de los aspectos anteriores, la célula está in vitro. En otra realización de los aspectos anteriores, la célula está in vivo.
En otra variante más de los aspectos anteriores, la alteración en la expresión se ensaya usando un ensayo inmunológico, un ensayo enzimático, o un radioinmunoensayo.
Se describe un polipéptido variante del receptor de andrógenos que comprende una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO: 8 o fragmentos de la misma.
En un aspecto de uno cualquiera de los aspectos anteriores, el polipéptido variante del receptor de andrógenos comprende la SEQ ID NO: 8 o un fragmento de la misma.
De acuerdo con la invención, el ácido nucleico de la variante del receptor de andrógenos comprende una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1 o fragmentos de la misma.
De acuerdo con la invención, el ácido nucleico de la variante del receptor de andrógenos comprende la SEQ ID NO: 1 o un fragmento de la misma.
Las SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 39 pueden corresponder a una secuencia de ácido nucleico, o fragmento de la misma, y las SEQ ID NO: 8 - SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 40 pueden corresponder a una secuencia de aminoácidos, o fragmento de la misma, del siguiente modo:
SEQ ID NO: 1
TGTCACTATGGAGCTCTCACATGTGGAAGCTGCAAGGTCTTCTTCAAAAGAGCCG CTGA AGGGA AAC AG AAGT ACCT GTGCGCC AGC AG A A AT G ATT GC ACT ATT GAT A AATTCCGAAGGAAAAATTGTCCATCTTGTCGTCTTCGGAAATGTTATGAAGCAGG
g a t g a c t c t g g g a I a a a a a t t c c g g g t t g g c a a t t g c a a g c a t c t c a a a a t g a c CAGACCCTGAAGAAAGGCTGACTTGCCTCATTCAAAATGAGGGCTCTAGAGGGC TCTAGTGGATAGTCTGGAGAAACCTGGCGTCTGAGGCTTAGGAGCTTAGGTTTTT GCTCCTCAACACAGACTTTGACGTTGGGGTTGGGGGCTACTCTCTTGATTGCTGA CTCCCTCC AGCGGG ACC A AT AGT GTTTTCCT ACCT C AC AGGGAT GTT GT G AGG AC GGGCT GT AGA AGT A AT AGT GGTT ACC ACT C AT GT AGTT GT G AGT ATC ATG ATT AT T GTTTCCT GT AAT GT GGCTTGGC ATT GGC A A AGT GCTTTTT G ATT GTT CTTG ATC A C AT AT GAT GGGGGC C AGGC ACT G ACTC AGGCGGAT GC AGTGA AGCT CT GGCTC A GTCGCTT GCTTTTCGT GGTGTGCTGCC AGGA AG AA ACTTT GCTG AT GGG ACTC A A GGT GTC ACCTTGG AC AAG AAGC A ACTGT GT CT GT CT G AGGTTCCTGT GGCC ATCT TTATTTGTGTATTAGGCAATTCGTATTTCCCCCTTAGGTTCTAGCCTTCTGGATCC CAGCCAGTGACCTAGATCTTAGCCTCAGGCCCTGTCACTGAGCTGAAGGTAGTAG CTGATCC AC AGAAGTT C AGT A A AC A AGG ACC AG ATTT CT GCTTCTCC AGG AGA A GAAGCCAGCCAACCCCTCTCTTCAAACACACTGAGAGACTACAGTCCGACTTTCC CTCTTACATCTAGCCTT ACTGTAGCCACACTCCTTGATTGCTCTCTCACATCACAT GCTTCTCTTCATCAGTTGTAAGCCTCTCATTCTTCTCCCAAGCCAGACTCAAATAT TGTATTGATGTCAAAGAAGAATCACTTAGAGTTTGGAATATCTTGTTCTCTCTCTG CTCCATAGCTTCCATATTGACACCAGTTTCTTTCTAGTGGAGAAGTGGAGTCTGT GAAGCCAGGGAAACACACATGTGAGAGTCAGAAGGACTCTCCC SEQ ID NO: 2 (referencia)
TGTCACTATGGAGCTCTCACATGTGGAAGCTGCAAGGTCTTCTTCAAAAGAGCCG CTGAAGGGAAACAGAAGTACCTGTGCGCCAGCAGAAATGATTGCACTATTGATA AATTCCGAAGGAAAAATTGTCCATCTTGTCGTCTTCGGAAATGTTATGAAGCAGG GATGACTCTGGGAÜCTGTTGTTGTTTCTGAAAGAATCTTGAGGGTGTTTGGAGTC TCAGAATGGCTTCCTTAAAGACTACCTTCAGACTCTCAGCTGCTCATCCACAACA GAGATCAGCCTTTCTTTGTAGATGATTCATTCCTGGCTGCATTTGAAAACCACAT ATTGTT A ATT GCTT G ACG AATTT A AAT CCCTT G ACT ACTTTTC ATTT CAGA A AAC A CTT AC A AA AAAAGTCC AA AT G AGGACCTTCCCTCC AGT GA ATT AGCTGTGGCTTT CTCACAGTCCATAGTTAGGATAAATGTAAAGCCATTTCTCATTTTTCTCCGCACTT TCCAAGGGTACACTCCTTGTTTCCAAGATGGAATGAGAAATAAAGAAGTGCCCTT CCTGCCATCTTCTCCCCTGACCCTTTCCTCCTTCCCACTTTCCTCCTATTCCTCCCC AA AC AT GATTT ATTTCTGCGTTTTGC AACTCTT G AGTT CTC AGC ATTT AGT A A ATG GT GTT GGTCCCT GTT G ATTCCTTCCTCTCCT GG ACC AT GGA AGGT AGT AGGCCTTT CAGAAATTTCAGGTAGCAGCCAAACCCCAGAAGAAGAGAAGGAACACAGAGAC CTAGACCATGTGAGAACCTGAGGTGTGCAGCATTTACTTCACAGATTCGTCTAGC AT ATTT G AG AGGT G
SEQ ID NO: 3 (referencia)
TGTCACTATGGAGCTCTCACATGTGGAAGCTGCAAGGTCTTCTTCAAAAGAGCCG CTGAAGGGAAACAGAAGTACCTGTGCGCCAGCAGAAATGATTGCACTATTGATA AATTCCGAAGGAAAAATTGTCCATCTTGTCGTCTTCGGAAATGTTATGAAGCAGG GATGACTCTGGGAGGGAAACAGAAGTACCTGTGCGCCAGCAGAAATGATTGCAC T ATT G AT A A ATT CCG AAGG A A A AATTGTCC ATCTT GT CGTCTTCGG A A AT GTT AT G A AGC AGGG AT GACTCT GGG A ^C T GTT GTT GTTTCTG A A AG A AT CTT G AGGGTGT TTGGAGTCTCAGAATGGCTTCCTTAAAGACTACCTTCAGACTCTCAGCTGCTCAT CCACAACAGAGATCAGCCTTTCTTTGTAGATGATTCATTCCTGGCTGCATTTGAA AACCACATATTGTTAATTGCTTGACGAATTTAAATCCCTTGACTACTTTTCATTTC AGAAAACACTTACAAAAAAAGTCCAAATGAGGACCTTCCCTCCAGTGAATTAGC TGTGGCTTTCTCACAGTCCATAGTTAGGATAAATGTAAAGCCATTTCTCATTTTTC TCCGC ACTTTCC AAGGGT AC ACTCCTT GTTTCC AAGATGGA ATG AG AA AT A A AG A AGTGCCCTTCCTGCCATCTTCTCCCCTGACCCTTTCCTCCTTCCCACTTTCCTCCTA TTCCTCCCCAAACATGATTTATTTCTGCGTTTTGCAACTCTTGAGTTCTCAGCATT TAGTAAATGGTGTTGGTCCCTGTTGATffiCCTTCCTCTCCTGGACCATGGAAGGTA GTAGGCCTTTCAGAAATTTCAGGTAGCAGCCAAACCCCAGAAGAAGAGAAGGAA CACAGAGACCTAGACCATGTGAGAACCTGAGGTGTGCAGCATTTACTTCACAGA TTCGTCTAGCATATTTGAGAGGTG
SEQ ID NO: 4 (referencia)
TGTCACTATGGAGCTCTCACATGTGGAAGCTGCAAGGTCTTCTTCAAAAGAGCCG CTG AAf|G ATTTTT C AG A AT G AAC AA ATT A A A AG A AT C AT C AG AC ACT AACCCC A AGCCATACTGCATGGCAGCACCAATGGGACTGACAGAAAACAACAGAAATAGG AAGAAATCCTACAGAGAAACAAACTTGAAAGCTGTCTCATGGCCTTTGAATCAT
a c t t a a g t t t t a t g a t G g a a g g a t a c g a c t a t g a a g a a a g a c a c a g a g c a a c a t CAGACAGTCAAGAATTTCAGAGCCAGCTGGCATGCAGTGGACCTCATGCCAGCC C ATTTT ATG ACT ATTT AG GG A AAC AG A AGT ACCTGTGCGCC AGC AG AAATG ATTG CACTATTGATAAATTCCGAAGGAAAAATTGTCCATCTTGTCGTCTTCGGAAATGT TATGAAGCAGGGATGACTCTGGGAGCAGCTGTTGTTGTTTCTGAAAGAATCTTGA GGGTGTTTGGAGTCTCAGAATGGCTTCCTTAAAGACTACCTTCAGACTCTCAGCT GCTCATCCACAACAGAGATCAGCCTTTCTTTGTAGATGATTCATTCCTGGCTGCAT TTGAAAACCACATATTGTTAATTGCTTGACGAATTTAAATCCCTTGACTACTTTTC ATTTC AG AA AAC ACTT ACAAAAAAAGTCC AAATG AGGACCTTCCCTCC AGT GAA TTAGCTGTGGCTTTCTCACAGTCCATAGTTAGGATAAATGTAAAGCCATTTCTCAT TTTTCTCCGCACTTTCCAAGGGTACACTCCTTGTTTCCAAGATGGAATGAGAAAT AAAGAAGTGCCCTTCCTGCCATCTTCTCCCCTGACCCTTTCCTCCTTCCCACTTTC CTCCTATTCCTCCCCAAACATGATTTATTTCTGCGTTTTGCAACTCTTGAGTTCTC AGCATTTAGTAAATGGTGTTGGTCCCTGTTGATTCCTTCCTCTCCTGGACCATGGA AGGTAGTAGGCCTTTCAGAAATTTCAGGTAGCAGCCAAACCCCAGAAGAAGAGA AGGAACACAGAGACCTAGACCATGTGAGAACCTGAGGTGTGCAGCATTTACTTC ACAGATTCGTCTAGCATATTTGAGAGGTG
SEQ ID NO: 5 (referencia)
TGTCACTATGGAGCTCTCACATGTGGAAGCTGCAAGGTCTTCTTGAAAAGAGCCG CTGAAGGGAAACAGAAGTACCTGTGCGCCAGCAGAAATGATTGCACTATTGATA AATTCCGAAGGAAAAATTGTCCATCTTGTCGTCTTCGGAAATGTTATGAAGCAGG GATGACTCTGGGAÍGATTTTTCAGAATGAACAAATTAAAAGAATCATCAGACAC TAACCCCAAGCCATACTGCÁTGGCAGCACCAATGGGACTGACAGAAAACAACAG AAATAGGAAGAAATCCTACAGAGAAACAAACTTGAAAGCTGTCTCATGGCCTTT G AAT C AT ACTTAAGTTTT ATG ATGG AAGG AT ACG ACTATG AAG AAAG AC AC AGÁ GCAACATCAGACAGTCAAGAATTTCAGAGCCAGCTGGCATGCAGTGGACCTCAT GCCAGCCCATTTTATGACTATTTAGGGAAACAGAAGTACCTGTGCGCCAGCAGA AATGATTGCACTATTGATAAATTCCGAAGGAAAAATTGTCCATCTTGTCGTCTTC GGAAATGTTATGAAGCAGGGATGACTCTGGGAGCAGCTGTTGTTGTTTCTGAAAG AATCTTGAGGGTGTTTGGAGTCTCAGAATGGCTTCCTTAAAGACTACCTTCAGAC TGTCAGCTGCTCATCCACAACAGAGATCAGCCTTTCTTTGTAGATGATTCATTCCT GGCTGCATTTGAAAACCACATATTGTTAATTGCTTGACGAATTTAAATCCCTTGA CTACTTTTCATTTCAGAAAACACTTACAAAAAAAGTCCAAATGAGGACCTTCCCT CCAGTGAATTAGCTGTGGCTTTCTCACAGTCCATAGTTAGGATAAATGTAAAGCC ATTTCTCATTTTTCTCCGCACTTTCCAAGGGTACACTCCTTGTTTCCAAGATGGAA TGAGAAATAAAGAAGTGCCCTTCCTGCCATCTTCTCCCCTGACCCTTTCCTCCTTC CCACTTTCCTCCTATTCCTCCCCAAACATGATTTATTTCTGCGTTTTGCAACTCTTG AGTTCTCAGCATTTAGTAAATGGTGtTGGTCCCTGTTGATlCCTTCCTCTCCTGGA CCATGGAAGGTAGTAGGCCTTTCAGAAATTTCAGGTAGCAGCCAAACCCCAGAA GAAGAGAAGGAACACAGAGACCTAGACCATGTGAGAACCTGAGGTGTGCAGCA TTTACTTCACAGATTCGTCTAGCATATTTGAGAGGTG
SEQ ID NO: 6 (referencia)
GGAAACAGAAGTACCTGTGCGCCAGCAGAAATGATTGCACTATTGATAAATTCC GAAGGAAAAATTGTCCATCTTGTCGTCTTCGGAAATGTTATGAAGCAGGGATGAC TCTGGGA|gACTAGAATTCCAAAGACCCTCAGGCTGGTGATGCAAGTGGGAAGTC TCATTTCTGAGAAGTGCTGCTTCCTACCCACAATTCTTTGATAGCTGAGTGCTTTA GCTGATCTGCATAACTGAGGTGTGCACCAAGGAGCAGAATTACTCTATAAATTTT GGCATCAACATGTGCAACTTGTGACTCAGCACTTTGAAACTCTGGGGATTTTTTT GTTTGGTTGGTTTTTGTTTTAAGATGTCCTGTGGTATAGTGGAAATAGTACAATAG ACTCAGATACAGAGAGGCCTTGTTTCTAGTCTTGGTTCTGTCACTTACTATCTTGA TGTCCTTGCACAAATCACCAGACCTCTCTGAGCCTCAGTTTCTCCAACCACACTGT GGGAATAATAAAATCTTTTTTACGGCATTGTTGTAAGTATGCAGAGAAACTGGTA CACAGTAGCCACACAATCAATGTCAGCGTACCCTTCAGCCCTTCTTTTGTGGATG AAAAATGGTCTTTGTGCTCCCAGTCACCACTGGGGTCTGTTCTCTCTCTCTCTGCT GTTACAGTGTGGCTTTGGTTCTTGTTTCTTTGTTCTTTGGTCTGTAAATTACCCTTG AAACAACCCTTGAAATTTCCACTCCATGACCTAAATCGTCATCCCTAAATTGGTT ACATACATATTTGGTGACACTTTGGAGGGGAAAAGCTTTATGTCTCTCTAACGTG TAGTTCTTAAGGGAATTTGCATATGGAAAAAACAGAGACTGCGTCTCTTAATTCC TCC
SEQ ID NO: 7 (referencia)
GGAAACAGAAGTACCTGTGCGCCAGCAGAAATGATTGCACTATTGATAAATTCC GAAGGAAAAATTGTCCATCTTGTCGTCTTCGGAAATGTTATGAAGCAGGGATGAC
t c t g g g a í c a g g c a g c a g a g t g t c a t a a a g a a t t a a c a a c g t g g a a c t c a g t t a CTGGGATTTCTTCCATTCTCCTTTGATTCTCTAGACTAGAATTCCAAAGACCCTCA GGCTGGTGATGCAAGTGGGAAGTCTCATTTCTGAGAAGTGCTGCTTCCTACCCAC AATTCTTTGATAGCTGAGTGCTTTAGCTGATCTGCATAACTGAGGTGTGCACCAA GGAGCAGAATTACTCTATAAATTTTGGCATCAACATGTGCAACTTGTGACTCAGC ACTTTGAAACTCTGGGGATTTTTTTGTTTGGTTGGTTTTTGTTTTAAGATGTCCTGT GGTATAGTGGAAATAGTACAATAGACTCAGATACAGAGAGGCCTTGTTTCTAGTC TTGGTTCTGTCACTTACTATCTTGATGTCCTTGCACAAATCACCAGACCTCTCTGA GCCTCAGTTTCTCCAACCACACTGTGGGAATAATAAAATCTTTTTTACGGCATTGT TGTAAGTATGCAGAGAAACTGGTACACAGTAGCCACACAATCAATGTCACCGTA CCCTTCAGCCCTTCTTTTGTGGATGAAAAATGGTCTTTGTGCTCCCAGTCACCACT GGGGTCTGTTCTCTCTCTCTCTGCTGTTACAGTGTGGCTTTGGTTCTTGTTTCTTTG TTCTTTGGTCTGTAAATTACCCTTGAAACAACCCTTGAAATTTCCACTCCATGACC TAAATCGTCATCCCTAAATTGGTTACATACATATTTGGTGACACTTTGGAGGGGA AAAGCTTTATGTCTCTCTAACGTGTAGTTCTTAAGGGAATTTGCATATGGAAAAA ACAGAGACTGCGTCTCTTAATTCCTCC
SEQ ID NO: 39 (referencia)
TGTCACTATGGAGCTCTCACATGTGGAAGCTGCAAGGTCTTCTTCAAAAGAGCCG CTGAAGGGAAACAGAAGTACCTGTGCGCCAGCAGAAATGATTGCACTATTGATA AATTCCGAAGGAAAAATTGTCCATCTTGTCGTCTTCGGAAATGTTATGAAGCAGG GATGACTCTGGGAlACAACTTACCTGAGCAAGCTGCTTTTTGGAGACATTTGCÁC ATCTTTT GGG ATC ACGTT GTT AAG AAGT AG AACTAAGGG AAAAAC ACGC AGCC A CCCAGAAATCGGTAGAGCCTTCAGCTCATCTGTTATTAATATTTCTGTGACAACA GATATCTAGGAAGTAAACAGGAAATTGCATCGCTATCCTGCATCACCTTTTTTGG AATCAGGTTCCATTCTTCTCAGTCCAGTTCAACCTTGTGATACTTTTTAGATCTCA ACCAAGGCATAGAAATATATTTTCCCTTGCTTAATACCCCATGGAACCAATGCCC CTGTGGTTGAAGTAAAAATTGATTGTTGAGGGACATTTCAGCCCTCTAGCAGTCA ACAATTAAAAACATGTAAGCACCGAGCACCTGCAGAAAACTTGGACTGGCATTT GGATCTAAGAAGAAAATCTGCATCTTGACCAAGATGAAAAGTCACCAGCCCAAG CTTGTGCAGTGAAGTGTCATGTTGGCCACAATGAAACTGAAAGAGACTGATGAC TCTCCTCAGGGTGGAAAATGAGGCATGGAAGCTTTGATTAGTGAGCTGTTAGGCA CACAGACATTAATTTCAAAGCATTCTCATCTCCAGTCTGAGTAATAATGCTTATA GTATTATGCAATTGTTTGGCTGCTGCAAGAAATTCAGCAGACTCCAACAAGTAGT CTTTCTTGGTCTCTGAGTGACTGTAACTTAAATTCTACCTCCCTTCTCTTCTCCTAC ATCTTCTCACTCCCCACCCCACCCCCACATACACACAATTCTTGTCCACTATGTTC AGAGAGATGCACGCACACATATATATGTATATATATAGTATATTTGTCAATAAAG CAGAAAAGAAGAAAAAACTCCAAGTAAACAATTTTCCATTTCCCCATCTCACTTC TGTCTTACAAGTGGATAGGAAAAGAAAAACCCCCAGTAAAAAATGGCAACCGCC CACCTCCCCAACTTTACATGCTGCTTCCTATGTTAGAGGATCTGTCTTAGGCATCT GATTATGGAGCCTGCTAGATACAAGCCCGTATTTAGACTGCTACAGTCAACAATG TCTCTCTTTCATACTAGAAAAATTCC
SEQ ID NO: 8
C H Y G A L T C G S C K V F F K R A A E G K O K Y L C A S R N D C T I D K F R R
K N C P S C R L R K C Y E A G M T L G F / C f / ? V G N C K H L K M T R P parada SEQ ID NO: 9 (referencia)
C H Y G A L T C G S C K V F F K R A A E ü K O K Y L C A S R N D C T I D K F R R
K N C P S C R L R K C Y E A G M T L G ^ V V V S E R 1 L R V F G V S E W L F parada
SEQ ID NO: 10 (referencia)
C H Y C A L T C G S C K V F F K R A A E G K O K Y L C A S R N D C T I D K F R R K N C P S C R L R K C Y E A G M T L G G K O K Y L C A S R N D C T I D K F R R K N
C P S C R L R K C Y E A G M T L G /Í V V V S E R J L R V F G V S E W L P parada
SEQ ID NO: 11 (referencia)
C H Y G A L T C G S C K V F F K R A A E G F F R M N K L K E S S D T N P K P Y C M A A P M G L T E N N R N R K K S Y R E T N L K A V S W P L N H T parada
SEQ ID NO: 12 (referencia)
C H Y G A L T C G S C K V F F K R A A E G K O K Y L C A S R N D C T I D K F R R K N C P S C R L R K C Y E A G M T L G G F F R M N K L K E S S D T N P K P Y C MA A P M G L T E N N R N R K K S Y R E T N L K A V S W P L N H T parada
SEQ ID NO: 13 (referencia)
G K O K Y L C A S R N D C T I D K F R R K N C P S C R L R K C Y E A G M T L G D parada .
SEQ ID NO: 14 (referencia)
G K O K Y L C A S R N D C T I D K F R R K N C P S C R L R K . C Y E A G M T L G /1 G S R V S parada
SEQ ID NO: 40 (referencia)
C H Y G A L T C G S C K V F F K R A A E G K O K Y L C A S R N D C T I D K F R R K N C P S C R L R K C Y E A G M T L G D N L P E O A A F W R H L H I F W D H V V K
K parada
Otros aspectos de la invención se describen en o son obvios a partir de la siguiente descripción, y están dentro del ámbito de la invención.
Breve descripción de los dibujos
La siguiente descripción detallada, dada a modo de ejemplo, pero no pretendida para limitar la invención a las realizaciones específicas descritas, puede entenderse junto con los dibujos adjuntos, incorporados en este documento por referencia. Ahora se describirán diversas características y realizaciones preferidas de la presente invención mediante ejemplo no limitante y con referencia a los dibujos adjuntos en los que:
La figura 1 muestra la clonación de nuevas variantes de AR. A, nuevas variantes de AR que carecen del LBD generado por corte y empalme de cuatro exones crípticos. Los ocho exones canónicos del gen AR se representaron por recuadros abiertos numerados y se mostraron (no a escala) en relación a las posiciones genómicas de los cuatro exones crípticos (CE1 a CE4) en recuadros sombreados. El cebador directo idéntico, P1/P2/P3(F), en el exón 2 se emparejó con tres cebadores inversos (P1R, P2R, y P3R; véase la Tabla 2) diseñados en base a entradas de Genbank para los tres fragmentos genómicos transcritos en el intrón 3 (véase la Tabla 1). La secuenciación de los amplicones (a partir de células CWR22Rv1) definió las uniones 5' de CE1, CE2, y CE3, y las uniones 5' y 3' de CE4, marcadas por líneas verticales con las correspondientes coordenadas genómicas (Human Genome Assembly marzo de 2006, HG18). Obsérvese que había cuatro variantes que contenían CE1 (AR-V1, AR-V2, AR-V3, y AR-V4) y que las dos variantes que contenían CE2 (AR-V5 y AR-V6) diferían en una extensión 5' de 80 pb contiguas en CE2. Los codones de parada se marcaron con las cabezas de flecha en los transcritos ilustrados esquemáticamente. Las siete secuencias proteicas traducidas correspondientes a los siete transcritos se mostraron, a partir de los últimos cuatro aminoácidos codificados por el exón 3 (AR-V1, AR-V2, AR-V4, AR-V5, AR-V6, y AR-V7) o el exón 2 (AR-V3), y seguido por las longitudes variables de las secuencias específicas de variante en gris claro que coincidía con los exones crípticos. B, detección de los transcritos de la variante de AR por RT-PCR semicuantitativa en muestras clínicas de próstata usando los mismos conjuntos de cebadores P1, P2, y P3. HRPC (autopsia), muestras de HRPC metastásicas de autopsias; HRPC (TURP), muestras de HRPC de TURP; PCa (RRP), PCa virgen a tratamiento hormonal de muestras RRP. C, amplificación de la región codificante de longitud completa para AR-V1 y AR-V7 usando los conjuntos de cebadores P4 y P5 (Tabla 2) a partir de una muestra de autopsia HRPC, una muestra TURP, y la línea celular CW R22Rv1. Los cebadores directos idénticos, P4(F) y P5(F) localizados cadena arriba del codón de inicio de la traducción en el exón 1, se emparejaron con cebadores inversos P4(R) y P5(R), localizados cadena abajo del codón de parada en el exón críptico 1 y el exón críptico 3.
La figura 2 muestra la cuantificación de los transcritos de la variante de AR en muestras clínicas. A, imágenes representativas de gel de transcritos de variante de AR amplificados detectados usando conjuntos de cebadores diseñados para ensayos de RT-PCR a tiempo real. Un cebador directo idéntico, P6/P7/P8(F), en el exón 3 se emparejó con diferentes cebadores inversos, P6(R), P7(R), y P8(R) (Tabla 2), para amplificar los transcritos AR-V1, AR-V7, y AR prototipo, respectivamente. Se usó SF3A3 como transcrito génico de referencia (materiales y métodos). Normal (RRP), tejidos normales de próstata de muestras RRP ; PCa (RRP), PCa virgen a tratamiento hormonal de muestras RRP ; HRPC (TRUP), muestras HRPC de TURP; HRPC (autopsia), muestras HRPC metastásicas de autopsias (Tabla 3). B, resultados cuantitativos de AR-V7 en 124 muestras clínicas de próstata por PCR a tiempo real. Los valores de expresión normalizados (en escala log2) para AR-V7 obtenidos de análisis de umbral comparativo se mostraron en cuatro grupos de muestras clínicas. Normal (n = 17), tejidos normales de próstata de muestras RRP ; PCa virgen a tratamiento hormonal (n = 82), muestras de PCa de muestras RRP ; HRPC (TURP) (n = 4), muestras HRPC de TURP; HRPC (autopsia) (n = 21), muestras HRPC metastásicas de autopsias (Tabla 3). C, diagrama de Kaplan-Meier que compara la supervivencia sin progresión en pacientes con menos de la media de la expresión de AR-V7 (n = 38) con aquellos con más de la media de la expresión de AR-V7 (n = 28). Las curvas de supervivencia se compararon usando el ensayo de rango log. Los años de seguimiento se marcaron en el eje X. Los sujetos censurados se marcaron con marcas verticales en azul. Obsérvese que el estado de recidiva de PSA se anotó en años, no en meses.
La figura 3 muestra la detección de la proteína AR-V7 y el análisis usando un anticuerpo específico de variante. A, detección del producto proteico AR-V7 en líneas celulares que expresan altos niveles de transcrito de AR-V7 (véase la figura 5). Después de análisis de inmunotransferencia para AR-V7 (parte superior), la misma membrana se separó y se sometió a análisis de inmunotransferencia con anticuerpo anti-AR(N20) (centro) para detectar el AR prototipo. Parte inferior, la carga de proteína total se controló por tinción con Ponceau S de la membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF). B, detección de proteína AR-V7 después de enriquecimiento de todas las proteínas AR que contienen NTD por IP usando el anticuerpo anti-AR(441). Obsérvese que después del enriquecimiento, se detectó AR-V7 en líneas celulares que expresaban los niveles más altos de ARNm de AR-V7, células VCaP y CWR22Rv1, pero no en células LNCaP, que expresan bajos niveles de AR-V7 (véase la figura 5). Control, IgG de ratón; anticuerpo monoclonal anti-AR, anti-AR(441). C, detección de proteína AR-V7 en HRPC. Se realizó análisis de transferencia de Western para detectar AR-V7 en lisados de tejido completo y extractos de proteína AR enriquecida derivados de cuatro tejidos PCa humanos vírgenes a tratamiento hormonal (RRP5, RRP6, RRP7, y RRP8) y dos tejidos PCa humanos refractarios a hormonas (TURP1 y TURP2). Centro, se controló la carga de proteína por tinción con Ponceau S de la membrana PVDF; parte inferior, se realizó IP con el anticuerpo anti-AR(441) para enriquecer las proteínas AR y se inmunotransfirieron (IB) con anti-AR(N20) para detectar el AR prototipo, y AR-V7 por el anticuerpo anti-AR-V7. D, análisis bioquímico de la localización celular de la proteína AR-V7. Se cultivaron células VCaP y CWR22Rv1 en RPMI 1640 sin rojo fenol que contenía C SS con o sin 10 nmol/l de R1 881. La fracción citosólica (C) y la fracción nuclear (N) de los lisados con cantidades equivalentes de células se aislaron y sometieron a análisis de inmunotransferencia de AR-V7, AR prototipo por anticuerpo anti-AR(N20), y h-actina.
La figura 4 muestra la función constitutiva de AR-V7. A, localización nuclear constitutiva de AR-V7 transfectado en ausencia de andrógenos. Se transfectaron células PC-3 con pEGFP-AR y pEGFP-AR-V7 para expresar el AR prototipo o AR-V7 y se examinaron para la localización de proteínas AR marcadas con G FP en presencia o ausencia de 5 nmol/l de R1 881. B, AR-V7 activa de forma constitutiva un indicador de luciferasa de AR. Se transfectaron células PC-3 con control de vector (EG FP), un mutante de AR truncado en LBD (EGFP-Q640X), AR-V7 (EGFP-AR-V7), y AR prototipo (EGFP-AR) y se sometieron a ensayos de luciferasa y análisis de transferencia de Western después de cultivar en presencia o ausencia de R1 881. C, inducción independiente de andrógenos de genes sensibles a AR por AR-V7 en células LNCaP. Se transfectaron células LNCaP con pcDNA-AR-V7 para expresar la proteína AR-V7 sin marcar o el vector pcDNA de control y se cultivaron con o sin 10 nmol/l de R1 881 antes de recogerse para análisis de transferencia de Western o extracción de ARN para análisis de microserie de expresión. Los genes mostrados eran los primeros 20 genes clasificados por inducción de plegamiento después de tratamiento con R1 881 en células LNCaP transfectadas con vector vacío pcDNA. Se representaron las relaciones de expresión de la muestra de ensayo frente a la referencia común (LNCaP transfectadas con vector vacío pcDNA sin R1 881) por los colores rojo (>1) y verde (<1).
La figura 5 muestra el análisis de RT-PCR a tiempo real de las variantes de AR, V1, y V7 en líneas celulares de cáncer de próstata humano. Los valores de expresión normalizados (en escala log2) para AR-V1 (azul) y AR-V7 (rojo) obtenidos del análisis de umbral comparativo se mostraron en 9 líneas celulares de cáncer de próstata humano. LNCaP 95 es una línea celular independiente de andrógenos derivada de cultivo continuo a largo plazo de células LNCaP en condiciones reducidas de andrógenos, proporcionada por el Dr. Alan K. Meeker (Johns Hopkins University, Baltimore, MD). Las células de cáncer de próstata VCaP y E006AA se proporcionaron por el Dr. John T. Isaacs (Johns Hopkins University, Baltimore, MD). Otras líneas celulares de cáncer de próstata humano se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Rockville, MD).
La figura 6 muestra los resultados de RT-PCR a tiempo real cuantitativa de AR prototipo (A) y AR-V1 (B) en 124 muestras clínicas de próstata. Los valores de expresión normalizados (en escala log2) del análisis de umbral comparativo se centraron con la media de los valores medibles en 82 casos de RRP establecidos a cero. Normal (n = 17): tejido normal de próstata de muestras de prostatectomía retro púbica radical (RRP); PCa virgen a tratamiento hormonal (n = 82): muestras PCa de muestras RRP ; HRPC (TURP) (n = 4): muestras HRPc de resección transuretral de próstata (TURP); HRPC (autopsia) (n = 21): muestras HRPC metastásicas de autopsias (véase la Tabla 3).
La figura 7 muestra la detección de transcritos de AR-V7 usando el ARN citoplasmático o nuclear extraído de células LNCaP (A) y células CWR22Rv1 (B). Los electroferogramas por Agilent Bioanalyzer se mostraron a la izquierda y las diferencias en el factor de expresión respecto al valor promedio de ARN nuclear (a partir del análisis de ciclo umbral) se mostraron a la derecha. Las tres muestras de cada línea celular corresponden a ARN nuclear y citoplasmático aislado de cantidades iguales de células, y ARN nuclear de un exceso de factor 6 de células (ARN nuclear 6X) para igualar la cantidad de ARN nuclear introducida con el ARN citoplasmático, ya que el rendimiento de ARN por célula es ~6 veces mayor en el citoplasma que en el núcleo. Obsérvese que el ARN nuclear está enriquecido para ARNr precursor (banda por encima de ARNr 28S). Obsérvese también que el ARNr maduro, pero no el ARNm, debe esperarse que esté presente en el nucleolo.
La figura 8 muestra el diagrama de Kaplan-Meier que compara la supervivencia sin progresión en 66 pacientes con expresión inferior a la media y superior a la media de la expresión de AR prototipo (AR-pt) (A) o la relación de AR-V7/AR-pt (B). El valor medio se identificó en base a todos los casos RRP (n = 82) con datos puntuales medibles que son coherentes con todos los análisis similares incluyendo datos presentados en la figura 6B. Las curvas de supervivencia se compararon usando el ensayo de rango Log. Y se proporcionaron los valores p de los ensayos. Los años de seguimiento se marcaron en el eje X. Los sujetos censurados se marcaron con marcas verticales en azul. Obsérvese que el estado de recidiva de PSA se anotó en años, no en meses.
La figura 9 muestra el análisis de expresión de proteínas (A) y ARNm (B) en 9 casos RRP vírgenes a tratamiento hormonal y 14 xenoinjertos de cáncer de próstata humano LuCaP. La detección de AR-V7 y la proteína AR prototipo se realizó usando inmunotransferencias de Western convencionales (IB) después de enriquecimiento de las proteínas AR por inmunoprecipitación (IP) usando el anticuerpo anti-AR(441), mientras se realizaba detección de la proteína pactina de control usando lisado de proteína normal coincidente en cantidad al lisado introducido para IP. Obsérvese que los datos de diferentes transferencias de proteínas no eran comparables de forma cruzada ya que las variables experimentales eran diferentes mientras que los datos de ARNm deben ser comparables entre todas las muestras ya que los niveles de expresión de ARNm de AR-V7 se normalizaron (en escala log2) y se centralizaron a la media de los 82 casos RRP presentados en la figura 2B. Las muestras de xenoinjertos que acaban con AI (n = 3) eran derivados independientes de andrógenos del xenoinjerto original después de ablación de andrógenos en el animal hospedador. Todos los xenoinjertos originados de pacientes HRPC excepto LuCaP 58 y LuCaP 115, que eran de metástasis de ganglio linfático virgen a tratamiento hormonal.
La figura 10 muestra la reducción de la banda de la proteína de 80 KD después de la supresión del transcrito de AR-V7 o reducción de la proteína AR-V7 usando anticuerpo anti-AR-V7. A. Supresión específica de transcrito de AR prototipo (secuencia diana: UCAAGGAACUCGAUCGUAU; SEQ ID n O; 34) y AR-V7 (secuencia diana: GUAGUUGUGAGUAUCAUGA; SEQ ID NO: 1). B. Análisis de inmunotransferencia convencional con anticuerpos anti-AR(N20), anti-AR-V7 y anti-p-actina después de supresión génica. C. Análisis de inmunotransferencia (IB) convencional con anti-AR(N20), anti-AR-V7 en lisado celular completo CWR22Rv1 después de reducción de AR-V7 usando anticuerpo anti-AR-V7. Se incubó el lisado celular CWR22Rv1 con resina de proteína G acoplada a anticuerpo anti-AR-V7 para reducir AR-V7 (anti-AR-V7 reducido) o resina de proteína G en solitario como control (sin reducción).
La figura 11 muestra la relación de AR-V7 frente a AR prototipo (AR-pt) en 24 muestras HRPC (rojo) y 81 casos RRP vírgenes a tratamiento hormonal (azul). Los casos fueron idénticos a los presentados en la figura 2B, excepto que se excluyeron 2 casos debido a relaciones incalculables. A pesar de una tendencia de mayor AR-V7 frente a AR prototipo (AR-pt) en un subconjunto de muestras HRPC, la diferencia global entre las muestras RRP (relación media 1:389) y HRPC (relación media 1:238) no es significativa (p = 0,0841, ensayo de Mann-Whitney). Los valores de relación absoluta se calcularon en base a los valores de expresión en RT-PCR a tiempo real extrapolados a curvas patrón de diluciones en serie que abarcan 9 órdenes de magnitud de cantidades conocidas de los amplicones diana (plásmidos que albergan AR-V7 o AR prototipo).
La figura 12 muestra el desarrollo de anticuerpo de ratón policlonal anti-AR-V7 humano. Los paneles muestran el ensayo de extracciones iniciales de sangre de 6 ratones inmunizados con secuencias peptídicas específicas para AR-V7 (CKHLKMRP; SEQ ID NO: 1). Paneles superiores: resultados de ELISA (placa y hoja de registro) usando dos preparaciones diferentes de antígenos peptídicos de recubrimiento. El antígeno JHU014 (mitad superior de la placa) fue el mismo que el inmunógeno, mientras que el antígeno JHU016 (mitad inferior de la placa) tiene secuencia idéntica, pero se preparó por separado. Panel inferior: transferencia de Western para ensayar el anticuerpo. Se usaron lisados celulares completos CW R22Rv1. El suero se diluyó 1:1000. El peso molecular del antígeno AR-V7 se espera que sea ~75-80 KD. La posición del marcador de proteína de 75 kDa se indicó por una flecha. Se detectaron señales positivas relativamente específicas en el ratón n.° 2, 4, y 5.
La figura 13 muestra el análisis de transferencia de Western de posteriores extracciones de sangre (después del refuerzo) del ratón n.° 1 y n.° 2 (Ab usado a dilución 1:1000). Se realizó detección específica de antígeno AR-V7 usando células 293T transfectadas con vector de control (293T sin transfección) o vector que sobreexpresa AR-V7 (293T AR-V7), así como PC-3 (control negativo) y lisados de células completas CwR22Rv1 (WCL) (control positivo). En base al resultado, se eligió el ratón JHU019 n.° 2 para fusión y posterior generación de hibridoma.
La figura 14 muestra los resultados iniciales de detección de hibridoma mostrados en imagen escaneada de las placas ELISA y una hoja de registro. Se detectaron señales positivas fuertes en el pocillo 4E4 y 2D12. El control positivo es suero policlonal a dilución 1:1000, en la placa 4 en el pocillo H5 (4H5).
La figura 15 muestra resultados ELISA confirmatorios de clones seleccionados en hoja de registro escaneada e imagen de placa. Las ID del clon correspondientes a la placa original y las designaciones de pocillos se mostraron en la hoja de registro para indicar su posición en esta placa ensayada. La mitad superior de la placa se usó para detectar IgG mientras que la mitad inferior se designó para detectar IgM. Se confirmó 2D12 como un clon IgG positivo fuerte. Otros clones candidatos también se expandieron para análisis corriente abajo. Estos incluyeron 2B6 (IgM), 4F7 (IgM), 4E4 (IgM), y 1A1 (IgG). PC: control positivo que era suero a dilución 1:1000.
La figura 16 muestra selección de los hibridomas monoclonales positivos anti-AR-V7. Confirmación adicional de 5 clones seleccionados de la figura 4. Se resolvieron lisados de células completas recogidos de células 293T transfectadas con plásmidos de sobreexpresión de AR-V7 en gel SDS-PAGE y se transfirieron a membrana de PDVF. Los cortes de membrana (1 cm x 1 cm) correspondientes a la localización de las bandas de 75 kDa se sometieron a inmunotransferencia con cada sobrenadante de hibridoma individual diluido 1:2. Se usó suero policlonal (JHU019) del ratón n.° 2 como control positivo. En base a este resultado, se seleccionó el clon 2D12 para expansión mientras que se desechó el resto.
La figura 17 muestra confirmación de la especificidad de anticuerpo para el clon 2D12. Se transfectaron células CWR22Rv1 con ARNip de control o ARNip de AR-V7 para supresión de la expresión endógena de AR-V7. Después de 96 horas, se recogieron los lisados de células completas y se sometieron a inmunotransferencia con sobrenadante 2D12 dilución 1:2.
La figura 18 muestra tinción in vivo de AR-V7 en células CWR22Rv1 (A y B) y muestras clínicas de cáncer de próstata (C, D). El panel B muestra la detección inmunofluorescente de AR-V7 predominantemente en los núcleos de células CWR22Rv1 (B). El panel A es tinción DAPI para mostrar los núcleos en las mismas células. El panel C es una sección teñida con H y E de muestra de cáncer de próstata virgen a tratamiento hormonal de un paciente que posteriormente recibió hormonoterapia y esta resultó fallida. Esta muestra es positiva para expresión de proteína AR-V7 detectada por inmunotransferencias (datos suplementarios de la figura 5A de Hu et al. Cancer Research 69 (l):16-22, 2009). Se muestra en el panel D la tinción predominantemente nuclear de AR-V7 y la tinción negativa en los tejidos estromáticos normales adyacentes. El panel C y D son cortes adyacentes del mismo bloque tisular.
La figura 19 muestra que AR-V7 promueve el crecimiento independiente de andrógenos de células LNCaP. Se transfectaron células LNCaP por AR-V7 y el vector de control. Se controló el crecimiento celular en medio suplementado con suero separado con carbón (CSS) en ausencia o presencia de R1881 0,5 nM por ensayo MTS. Se confirmó la expresión ectópica de AR-V7 en células LNCaP por análisis de transferencia de Western (panel inferior). Como se muestra, las tasas de crecimiento de células que expresan AR-V7 sobrepasaron las de células precursoras cultivadas en presencia de andrógeno sintético R1 881.
La figura 20 muestra los resultados de serie completa visualizados por el Affymetrix Integrated Genome Browser. Los exones canónicos y los límites de los intrones se muestran en relación a las coordenadas genómicas (HG18, publicación de marzo de 2006) en la franja superior y los datos de las células CWR22Rv1 (amarillo) y una muestra de cáncer de próstata refractario a hormonas (TURP2) (azul) mostrados con las intensidades de señal (eje Y) entre las coordenadas genómicas (eje X) del gen AR humano. Obsérvese la señal intensa para secuencias específicas de la variante AR-V7 (la posición de inicio de la secuencia específica de la variante AR-V7 está marcada por una flecha), y la señal intensa de las secuencias específicas de AR-V8 (la posición de inicio de la secuencia específica de la variante AR-V8 está marcada por una fecha) inmediatamente cadena arriba de AR-V7. El cebador usado para amplificar AR-V8 es el siguiente: 5'-Tgtcactatggagctctcacatgtgg-3' y 5'-Cattgtggccaacatgacacttca-3'.
Descripción detallada de la invención
I. Definiciones
Salvo que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el significado habitualmente comprendido por un experto en la materia a la cual pertenece esta invención. Las siguientes referencias proporcionan a los expertos una definición general de muchos de los términos usados en esta invención: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2.a ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5.a Ed., R. Rieger et al. (eds.). Springer Verlag (1991); y Hale y Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). Como se usa en este documento, los siguientes términos tienen los significados atribuidos a ellos salvo que se especifique de otro modo.
Por "anticuerpo" se entiende cualquier polipéptido de inmunoglobulina, o fragmento del mismo, que tenga capacidad de unión a inmunógeno.
Por "receptor de andrógenos" (AR) se entiende un miembro de la familia de moléculas del receptor de hormonas esteroideas. AR media los efectos fisiológicos de los andrógenos por unión a secuencias de ADN que influyen en la transcripción o genes sensibles a andrógenos. La secuencia de referencia de ARNm de AR de tipo silvestre corresponde al n.° de acceso en la base de datos GenBank NM 000044 (correspondiente a la SEQ ID NO: 34).
Por "polipéptido receptor de andrógenos" se entiende una proteína o variante de proteína, o fragmento de la misma, que es sustancialmente idéntica a al menos un parte del n.° de acceso a GenBank NP 000035 (correspondiente a la SEQ ID NO: 35) y que tiene una actividad biológica del receptor de andrógenos.
Por "molécula de ácido nucleico del receptor de andrógenos" se entiende un polinucleótido que codifica un polipéptido o variante del receptor de andrógenos, o fragmento del mismo.
Por "enfermedad o trastorno relacionado con andrógenos" se entiende que se hace referencia a cualquier enfermedad o trastorno que resulta de un desequilibrio de andrógenos en el organismo. Ejemplos de enfermedades o trastornos relacionados con andrógenos incluyen cáncer de próstata, alopecia androgénica, infertilidad, períodos menstruales irregulares, excesivo crecimiento de cabello, acné, obesidad y resistencia a insulina, y síndrome del ovario poliquístico.
El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos de origen natural y sintético, así como análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan de un modo similar a los aminoácidos de origen natural. Los aminoácidos de origen natural son aquellos codificados por el código genético, así como aquellos aminoácidos que se modifican posteriormente, por ejemplo, hidroxiprolina, gamma-carboxiglutamato, y O-fosfoserina, fosfotreonina.
Por "biomarcador" se entiende cualquier proteína o polinucleótido que tenga una alteración en el nivel de expresión o actividad que está asociado con una enfermedad o trastorno, por ejemplo, una enfermedad o trastorno relacionado con andrógenos.
Por "secuencia detectable de aminoácidos" o "resto detectable" se entiende una composición que cuando se une con el ácido nucleico o molécula proteica de interés vuelve a la última detectable, mediante cualquier medio, incluyendo medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, o químicos. Por ejemplo, los marcadores útiles incluyen isótopos radiactivos, perlas magnéticas, perlas metálicas, partículas coloidales, colorantes fluorescentes, reactivos electrodensos, enzimas (por ejemplo, como las usadas habitualmente en un ELISA), biotina, digoxigenina, o haptenos.
Un "ácido nucleico marcado o sonda oligonucleotídica" es una que se une, de forma covalente, a través de un enlazador o un enlace químico, o de forma no covalente a través de enlaces iónicos, fuerzas de van der Waals, atracciones electrostáticas, interacciones hidrófobas, o enlaces de hidrógeno, a un marcador de modo que puede detectarse la presencia del ácido nucleico o sonda detectando la presencia del marcador unido al ácido nucleico o sonda.
Un "vector de expresión" es una construcción de ácido nucleico, generada de forma recombinante o sintética, que alberga una serie de elementos de ácido nucleico especificados que posibilitan la transcripción de un gen particular en una célula hospedadora. Típicamente, la expresión génica se coloca bajo el control de ciertos elementos reguladores, incluyendo promotores constitutivos o inducibles, elementos reguladores preferidos de tejido, y potenciadores.
Por "fragmento" se entiende una parte (por ejemplo, al menos 10, 25, 50, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400, o 500 aminoácidos o ácidos nucleicos) de una proteína o molécula de ácido nucleico que es sustancialmente idéntica a una proteína o ácido nucleico de referencia y retiene la actividad biológica de la referencia. En algunos aspectos, la parte retiene al menos el 50 %, 75 %, u 80 %, o más preferiblemente el 90 %, 95 %, o incluso el 99 % de la actividad biológica de la proteína o ácido nucleico de referencia descrito en este documento.
Una "célula hospedadora" es cualquier célula procariota o eucariota que contiene un vector de clonación o un vector de expresión. Esta expresión también incluye aquellas células procariotas o eucariotas que se han modificado por ingeniería genética para que contengan el gen o genes clonados en el cromosoma o genoma de la célula hospedadora.
Por "ácido nucleico inhibidor" se entiende un ARN bicatenario, ARNip (ARN interferente corto) ARNhc (ARN de horquilla corta), o ARN antisentido, o una parte de los mismos, o un mimético de los mismos, que cuando se administra a una célula de mamífero provoca una disminución (por ejemplo, en un 10 %, 25 %, 50 %, 75 %, o incluso un 90-100 %) en la expresión de un gen diana. Típicamente, un inhibidor de ácido nucleico comprende al menos una parte de una molécula de ácido nucleico diana, o un ortólogo de la misma, o comprende al menos una parte de la hebra complementaria de una molécula de ácido nucleico diana.
Los términos "aislado", "purificado", o "biológicamente puro" se refieren a material que está libre en grados variables de componentes que normalmente lo acompañan según se encuentra en su estado nativo. Pueden aplicarse diversos niveles de pureza según lo necesario de acuerdo con esta invención en las diferentes metodologías expuestas en este documento; pueden usarse normas de pureza habituales conocidas en la técnica si no se especifica de otro modo ninguna norma.
Por "molécula de ácido nucleico aislada" se entiende un ácido nucleico (por ejemplo, un ADN, ARN, o análogo de los mismos) que está libre de los genes que, en el genoma de origen natural del organismo del cual se obtiene la molécula de ácido nucleico de la invención, flanquean el gen. La expresión, por lo tanto, incluye, por ejemplo, un ADN recombinante que se incorpora en un vector; en un plásmido o virus de replicación autónoma; o en el ADN genómico de un procariota o eucariota; o que existe como molécula separada (por ejemplo, un ADNc o un fragmento genómico o de ADNc producido por PCR o digestión con endonucleasa de restricción) independiente de otras secuencias. Además, la expresión incluye una molécula de ARN que se transcribe a partir de una molécula de ADN, así como un ADN recombinante que es parte de un gen híbrido que codifica una secuencia polipeptídica adicional.
"Microserie" se entiende que hace referencia a un conjunto de moléculas de ácido nucleico o polipéptidos de uno o más organismos dispuestos sobre un soporte sólido (por ejemplo, un chip, placa, o perla).
Por "ácido nucleico" se entiende un oligómero o polímero de ácido ribonucleico o ácido desoxirribonucleico, o análogo de los mismos. Esta expresión incluye oligómeros que consisten en bases de origen natural, azúcares, y enlaces interglucídicos (estructura), así como oligómeros que tienen partes de origen no natural que funcionan de forma similar. Dichos oligonucleótidos modificados o sustituidos a menudo se prefieren sobre las formas nativas a causa de propiedades tales como, por ejemplo, estabilidad potenciada en presencia de nucleasas.
"Secuencias complementarias de ácido nucleico" se refiere a secuencias contiguas de ADN o ARN que tienen nucleótidos compartibles (por ejemplo, A/T, G/C) en posiciones correspondientes, de modo que suceda apareamiento de bases entre las secuencias. Por ejemplo, las hebras con sentido y antisentido de una hélice de ADN bicatenario se sabe en la técnica que son complementarias.
Por "proteína" se entiende cualquier cadena de aminoácidos, o análogos de los mismos, independientemente de la longitud o modificación postranscripcional.
Por "referencia" se entiende una condición normal o de control.
Por "ARNip" se entiende un ARN bicatenario. De forma óptima un ARNip es de 18, 19, 20, 21 ,22, 23 o 24 nucleótidos de longitud y tiene un saliente de 2 bases en su extremo 3'. Estos ARNbc pueden introducirse en una célula individual o en un animal completo; por ejemplo, pueden introducirse de forma sistémica mediante el torrente sanguíneo. Dichos ARNip se usan para regular negativamente los niveles de ARNm o promover actividad.
Por "se une específicamente" se entiende una molécula (por ejemplo, péptido, polinucleótido) que reconoce y se une a una proteína o molécula de ácido nucleico de la invención. Pero que no reconoce sustancialmente y se une a otras moléculas en una muestra, por ejemplo, una muestra biológica que incluye de forma natural una proteína de la invención.
Por "sustancialmente idéntica" se entiende una proteína o molécula de ácido nucleico que muestra al menos un 50 % de identidad con una secuencia de aminoácidos de referencia (por ejemplo, una cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas en este documento) o secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, una cualquiera de las secuencias de ácido nucleico descritas en este documento). Preferiblemente, dicha secuencia es al menos un 60 %, más preferiblemente un 80 % u 85 %, y mucho más preferiblemente un 90 %, 95 % o incluso 99 % idéntica a nivel de aminoácidos o ácido nucleico con la secuencia usada para comparación.
La identidad de secuencia se mide típicamente usando un software de análisis de secuencia (por ejemplo, Sequence Analysis Software Package del Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705, programas BLAST, BESTF IT , GAP, o PILEUP/PREt T y BOX). Dicho software hace coincidir secuencias idénticas o similares asignando grados de homología a diversas sustituciones, deleciones, y/u otras modificaciones. Las sustituciones conservativas típicamente incluyen sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina. En un enfoque ejemplar para determinar el grado de identidad, puede usarse un programa BLAST, con un valor de probabilidad entre e-3 y e-100 que indica una secuencia muy relacionada.
Otras definiciones aparecen en el contexto en toda la descripción.
Métodos de la invención
La invención destaca kits de diagnóstico y métodos útiles para el diagnóstico y pronóstico de cáncer de próstata resistente a hormonas. La invención destaca kits de diagnóstico y métodos útiles para detectar, tratar o prevenir el cáncer de próstata resistente a hormonas. Estos métodos y kits se basan, en parte, en el descubrimiento de que la expresión de ciertas variantes del receptor de andrógenos está elevada en ciertos cánceres de próstata. Se describen métodos y composiciones para alterar la expresión de la variante del receptor de andrógenos, y pueden ser útiles, por ejemplo, para el tratamiento de enfermedades relacionadas con andrógenos, tales como cáncer de próstata.
En particular, la invención se basa en el hallazgo de que variantes particulares del receptor de andrógenos que carecen del dominio de unión a ligando (LBD), pero que retienen intacto el potencial codificante para el dominio NH2-terminal (NTD) y el dominio de unión a ADN (DBD) del receptor de andrógenos completo, se sobreexpresaban en cáncer de próstata refractario a hormonas. Una de las variantes, AR-V7, se expresaba a niveles elevados en un subconjunto de cánceres de próstata vírgenes a tratamiento hormonal que sufría recidiva después de tratamiento quirúrgico.
Variantes del receptor de andrógenos
El receptor de andrógenos (AR) es un miembro de la familia de moléculas del receptor de hormonas esteroideas. El AR es responsable principalmente de mediar los efectos fisiológicos de los andrógenos por unión a secuencias específicas de ADN que influyen en la transcripción o genes sensibles a andrógenos. El gen AR humano está localizado en el cromosoma Xq 11-12 y abarca aproximadamente 180 kb de ADN que contiene ocho exones que codifican una fase de lectura abierta de aproximadamente 2.757 pares de bases dentro de un ARNm de 10,6 kb (Gelmann 2002). Esta estructura génica está evolutivamente conservada entre los seis receptores de hormonas esteroideas. El producto proteico de AR es de aproximadamente 919 aminoácidos de longitud y tiene varios dominios funcionales. El primer exón codifica el dominio N-terminal (NTD), que es la región reguladora de la trascripción de la proteína, los exones 2 y 3 codifican el dominio central de unión a ADN (DBD), la primera parte del exón 4 codifica una región de bisagra y los exones 4-8 codifican el dominio de unión a ligando (LBD) C-terminal. Puede verse un diagrama esquemático del gen y proteína AR en la figura 1A. La secuencia genómica para el gen AR humano se obtuvo del ensamblaje del genoma humano de 2006 del NCBI (HG18). La secuencia abarca los nucleótidos 66680599-66860844 en el cromosoma X. La secuencia de referencia del ARNm de AR de tipo silvestre corresponde al n.° de acceso a la base de datos GenBank NM_000044.2, mostrada a continuación, y correspondiente a la SEQ ID NO: 34.
SEQ ID NO: 34
1 cgagatcccg gggagccagc ttgctgggag agcgggacgg tccggagcaa gcccagaggc
61 agaggaggcg acagagggaa aaagggccga gctagccgct ccagtgctgt acaggagccg
121 aagggacgca ccacgccagc cccagcccgg ctccagcgac agccaacgcc tcttgcagcg
181 cggcggcttc gaagccgccg cccggagctg ccctttcctc ttcggtgaag tttttaaaag
241 ctgctaaaga ctcggaggaa gcaaggaaag tgcctggtag gactgacggc tgcctttgtc
301 ctcctcctct ccaccccgcc tccccccacc ctgccttccc cccctccccc gtcttctctc
361 ccgcagctgc ctcagtcggc tactctcagc caacccccct caccaccctt ctccccaccc
421 gcccccccgc ccccgtcggc ccagcgctgc cagcccgagt ttgcagagag gtaactccct
481 ttggctgcga gcgggcgagc tagctgcaca ttgcaaagaa ggctcttagg agccaggcga
541 ctggggagcg gcttcagcac tgcagccacg acccgcctgg ttaggctgca cgcggagaga
601 accctctgtt ttcccccact ctctctccac ctcctcctgc cttccccacc ccgagtgcgg
661 agccagagat caaaagatga aaaggcagtc aggtcttcag tagccaaaaa acaaaacaaa
721 caaaaacaaa aaagccgaaa taaaagaaaa agataataac tcagttctta tttgcaccta
781 cttcagtgga cactgaattt ggaaggtgga ggattttgtt tttttctttt aagatctggg
841 catcttttga atctaccctt caagtattaa gagacagact gtgagcctag cagggcagat 901 cttgtccacc gtgtgtcttc tlctgcacga gactttgagg ctgtcagagc gctttttgcg 961 tggttgclcc cgcaagtttc cttctctgga gcttcccgca ggtgggcagc tagctgcagc 1021 gactaccgca tcatcacagc ctgttgaact cttctgagca agagaagggg aggcggggta 1081 agggaagtag gtggaagatt cagccaagct caaggatgga agtgcagtta gggctgggaa 1141 gggtctaccc tcggccgccg tccaagacct accgaggagc tttccagaat ctgttccaga 1201 gcgtgcgcga agtgatccag aacccgggcc ccaggcaccc agaggccgcg agcgcagcac 1261 ctcccggcgc cagtttgctg ctgctgcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc 1321 agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcaagagac tagccccagg cagcagcagc 1381 agcagcaggg tgaggatggt tctccccaag cccatcgtag aggccccaca ggctacctgg 1441 tcctggatga ggaacagcaa ccttcacagc cgcagtcggc cctggagtgc caccccgaga 1501 gaggttgcgt cccagagcct ggagccgccg tggccgccag caaggggctg ccgcagcagc 1561 tgccagcacc tccggacgag gatgactcag ctgccccatc cacgttgtcc ctgctgggcc 1621 ccactttccc cggcttaagc agctgctccg ctgaccttaa agacatcctg agcgaggcca 1681 gcaccatgca actccttcag caacagcagc aggaagcagt atccgaaggc agcagcagcg 1741 ggagagcgag ggaggcctcg ggggctccca cttcctccaa ggacaattac ttagggggca 1801 cttcgaccat ttctgacaac gccaaggagt tgtgtaaggc agtgtcggtg tccatgggcc 1861 tgggtgtgga ggcgttggag catctgagtc caggggaaca gcttcggggg gattgcatgt 1921 acgccccact tttgggagtt ccacccgctg tgcgtcccac tccttgtgcc ccattggccg 1981 aatgcaaagg ttctctgcta gacgacagcg caggcaagag cactgaagat actgctgagt 2041 attccccttt caagggaggt tacaccaaag ggctagaagg cgagagccta ggctgctctg 2101 gcagcgctgc agcagggagc tccgggacac ttgaactgcc gtctaccctg tctctctaca 2161 agtccggagc actggacgag gcagctgcgt accagagtcg cgactactac aactttccac 2221 tggctctggc cggaccgccg ccccctccgc cgcctcccca tccccacgct cgcatcaagc 2281 tggagaaccc gctggactac ggcagcgcct gggcggctgc ggcggcgcag tgccgctatg 2341 gggacctggc gagcctgcat ggcgcgggtg cagcgggacc cggttctggg tcaccctcag 2401 ccgccgcttc ctcatcctgg cacactctct tcacagccga agaaggccag ttgtatggac 2461 cgtgtggtgg tggtgggggt ggtggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg 2521 gcggcggcgg cggcgaggcg ggagctgtag ccccctacgg ctacactcgg ccccctcagg 2581 ggctggcggg ccaggaaagc gacttcaccg cacctgatgt gtggtaccct ggcggcatgg 2641 tgagcagagt gccctatccc agtcccactt gtgtcaaaag cgaaatgggc ccctggatgg 2701 atagctactc cggaccttac ggggacatgc gtttggagac tgccagggac catgttttgc 2761 ccattgacta ttactttcca ccccagaaga cctgcctgat ctgtggagat gaagcttctg 2821 ggtgtcacta tggagctctc acatgtggaa gctgcaaggt cttcttcaaa agagccgctg 2881 aagggaaaca gaagtacctg tgcgccagca gaaatgattg cactattgat aaattccgaa 2941 ggaaaaattg tccatcttgt cgtcttcgga aatgttatga agcagggatg actctgggag
3001 cccggaagct gaagaaactt ggtaatctga aactacagga ggaaggagag gcttccagca
3061 ccaccagccc cactgaggag acaacccaga agctgacagt gtcacacatt gaaggctatg
3121 aatgtcagcc catctttctg aatgtcctgg aagccattga gccaggtgta gtgtgtgctg
3181 gacacgacaa caaccagccc gactcctttg cagccttgct ctctagcctc aatgaactgg
3241 gagagagaca gcttgtacac gtggtcaagt gggccaaggc cttgcctggc ttccgcaact
3301 tacacgtgga cgaccagatg gctgtcattc agtactcctg gatggggctc atggtgtttg
3361 ccatgggctg gcgatccttc accaatgtca actccaggat gctctacttc gcccctgatc
3421 tggttttcaa tgagtaccgc atgcacaagt cccggatgta cagccagtgt gtccgaatga
3481 ggcacctctc tcaagagttt ggatggctcc aaatcacccc ccaggaattc ctgtgcatga
3541 aagcactgct actcttcagc attattccag tggatgggct gaaaaatcaa aaattctttg
3601 atgaacttcg aatgaactac atcaaggaac tcgatcgtat cattgcatgc aaaagaaaaa
3661 atcccacatc ctgctcaaga cgcttctacc agctcaccaa gctcctggac tccgtgcagc
3721 ctattgcgag agagctgcat cagttcactt ttgacctgct aatcaagtca cacatggtga
3781 gcgtggactt tccggaaatg atggcagaga tcatctctgt gcaagtgccc aagatccttt
3841 ctgggaaagt caagcccatc tatttccaca cccagtgaag cattggaaac cctatttccc
3901 caccccagct catgccccct ttcagatgtc ttctgcctgt tataactctg cactactcct
3961 ctgcagtgcc ttggggaatt tcctctattg atgtacagtc tgtcatgaac atgttcctga
4021 attctatttg ctgggctttt tttttctctt tctctccttt ctttttcttc ttccctccct
4081 atctaaccct cccatggcac cttcagactt tgcttcccat tgtggctcct atctgtgttt
4141 tgaatggtgt tgtatgcctt taaatctgtg atgatcctca tatggcccag tgtcaagttg
4201 tgcttgttta cagcactact ctgtgccagc cacacaaacg tttacttatc ttatgccacg
4261 ggaagtttag agagctaaga ttatctgggg aaatcaaaac aaaaacaagc aaac
La secuencia de referencia de la proteína AR de tipo silvestre corresponde al n.° de acceso en la base de datos GenBanck NP 000035, mostrada a continuación, y correspondiente a la SEQ ID NO: 35.
SEQ ID NO: 35
1 mevqlglgrv yprppsktyr gafqnlfqsv reviqnpgpr hpcaasaapp gasllllqqq
61 qqqqqqqqqq qqqqqqqqqq etsprqqqqq qgedgspqah rrgptgylvl deeqqpsqpq
121 salechperg cvpcpgaava askglpqqlp appdeddsaa pstbllgpt fpglsscsad
181 Ikdilscast mqllqqqqqc avsegsssgr areasgapts skdnylggts tisdnakelc
241 kavsvsmglg vealehlspg eqlrgdcmya pllgvppavr ptpcaplaec kgsllddsag
301 kstedtaeys pfkggytkgl egeslgcsgs aaagssgtle lpstlslyks galdeaaayq
361 srdyynipla lagppppppp phpharikle npldygsawa aaaaqcrygd laslhgagaa
421 gpgsgspsaa assswhtlft aeegqlygpc gggggggggg gggggggggg gggeagavap
481 ygytrppqgl agqesdftap dvwypggmvs rvpypsptcv ksemgpwmds ysgpygdmrl
541 etardhvlpi dyyfppqktc licgdeasgc hygaltcgsc kvffkraaeg kqkylcasm
601 dctidkírrk ncpscrlrkc yeagmtlgar klkklgnlkl qcegeasstt spteettqkl
661 tvshiegyec qpiflnvlea iepgwcagh dnnqpdsfaa llsslnelge rqlvhwkwa
721 kalpgfralh vddqmaviqy swmglmvfam gwrsftnvns rmlyfapdlv fneyrmhksr
781 mysqcvnnrh lsqefgwlqi tpqeflcmka lllfsiipvd glknqkffde lmmyikeld
841 riiackrknp tscsrrfyql tklldsvqpi arelhqftfd llikshmvsv dfpenimaeii
901 svqvpkilsg kvkpiyfhtq
La presente invención describe nuevas variantes del receptor de andrógenos que carecen del dominio de unión a ligando (LBD) del receptor de andrógenos. La presente invención describe múltiples variantes nuevas del transcrito LBD del receptor de andrógenos con potencial codificante intacto para el NTD del receptor de andrógenos completo y el DBD del receptor de andrógenos, pero potencial codificante alterado para el LBD del receptor de andrógenos. Cada una de las variantes puede identificarse de forma exclusiva por su secuencia específica de variante. Es un hallazgo de la presente invención que esos nuevos transcritos de AR se sobreexpresaban en cáncer de próstata refractario a hormonas (HPRC) y una de las variantes más abundantes, AR-V7, se expresaba a niveles elevados en un subconjunto de PCa virgen a tratamiento hormonal que sufría recidiva después de tratamiento quirúrgico.
Por consiguiente, se describen polipéptidos que comprenden una variante de la proteína del receptor de andrógenos aislada, o fragmento de la misma, que tiene identidad sustancial con la variante del receptor de andrógenos 1,2 , 3, 4, 5, 6, 7 u 8 (AR-V1 - AR-V8), donde la variante está regulada positivamente en una enfermedad o trastorno relacionado con andrógenos. En ejemplos particulares, el polipéptido que comprende una variante aislada de la proteína del receptor de andrógenos, o fragmento de la misma, que tiene identidad sustancial con la variante del receptor de andrógenos 1,2 , 3, 4, 5, 6, 7 u 8 (AR-V1 - AR-V8) está regulada positivamente en cáncer de próstata. La invención se refiere a AR-V7.
Una variante de la proteína del receptor de andrógenos puede ser al menos un 85 % idéntica a la variante del receptor de andrógenos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8.
Como se describe en este documento, la variante de la proteína del receptor de andrógenos comprende el dominio NH2-terminal (NTD), el dominio de unión a ADN (DBD) del receptor de andrógenos, y la secuencia peptídica específica de variante c-terminal que identifica de forma única cada variante.
En ciertos ejemplos preferidos, el ácido nucleico de la variante del receptor de andrógenos comprende una secuencia seleccionada entre una cualquiera o más de las SEQ ID NO: 1 (invención), SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO; 4, SEQ iD NO; 5, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7 o fragmentos de las mismas.
SEQ ID NO: 1 (invención)
La SEQ ID NO: 1 corresponde a la secuencia de nucleótidos del transcrito AR-V7. La mayoría de la secuencia cadena arriba común a todos los receptores de andrógenos, correspondiente al nucleótido 1-2822 de la SEQ ID NO: 34, no está incluida. El primer nucleótido de las secuencias específicas de variante está sombreado.
T G TC A C TA TG G A G C T C TC A C A TG TG G A A G C TG C A A G G TC TTC TT C A A A A G A G C C G C TG A A G G G A A A C A G A A G TA C C TG T G C G C C A G C A G A A A TG A TTG C A C TA TTG A TA A A TTC C G A A G G A A A A A TT G TC C A TC TTG T C G TC TTC G G A A A TG TTA TG A A G C A G G
g a t g a c t c t g g g a | | a a a a a t t c c g g g t t g g c a a t t g c a a g c a t c t c a a a a t g a c
C A G A C C C TG A A G A A A G G C TG A C TTG C C TC A TTC A A A A TG A G G G C TC TA G A G G G C T C TA G TG G A TA G TC TG G A G A A A C C TG G C G TC TG A G G C TTA G G A G C TTA G G TTT TT G C TC C T C A A C A C A G A C TT TG A C G TTG G G G TT G G G G G C TA C TC TC TTG A TTG C TG A C TC C C TC C A G C G G G A C C A A TA G TG TTTTC C TA C C TC A C A G G G A TG TTG T G A G G A C G G G CTG TA G A A G T A A TA G TG G TTA C C A C TC A T G T A G TT G TG A G T A TC A TG A T T A T T G T T T C C T G T A A T G T G G C T T G G C A T T G G C A A A G T G C T T T T T G A T T G T T C T T G A T C A C A TA TG A TG G G G G C C A G G C A C TG A C TC A G G C G G A TG C A G TG A A G C TC TG G C TC A G T C G C TTG C TTTTC G TG G TG TG C TG C C A G G A A G A A A C TTTG C TG A TG G G A C T C A A G G T G TC A C C TT G G A C A A G A A G C A A C TG TG TC TG TC TG A G G TTC C TG TG G C C A TC T TTA TTTG T G T A T T A G G C A A T T C G T A T T T C C C C C T T A G G T T C T A G C C T T C T G G A T C C C A G C C A G TG A C C TA G A TC T TA G C C TC A G G C C C TG TC A C TG A G C TG A A G G TA G TA G C TG A TC C A C A G A A G TTC A G TA A A C A A G G A C C A G A TTTC TG C TTC TC C A G G A G A A G A A G C C A G C C A A C C C C TC T C TTC A A A C A C A C TG A G A G A C TA C A G TC C G A C TTTC C
C T C T T A C A T C T A G C C T TA C T G TA G C C A C A C TC C TT G A TTG C TC TC T C A C A TC A C A T
G C T T C T C T T C A TC A G TTG TA A G C C TC TC A TTC TTC TC C C A A G C C A G A C TC A A A TA T TG TA TT G A TG TC A A A G A A G A A TC A C TTA G A G TTTG G A A TA TC TT G TTC TC TC TC TG CTC C A T A G C TTC C A T ATTG AC ACC A G T T T C T T T C T A G TG G AG A A G T GG A G TC TG T G A A G C C A G G G A A A C A C A C A TG TG A G A G TC A G A A G G A C TC TC C C
SEQ ID NO: 2 (referencia)
La SEQ ID NO: 2 corresponde a la secuencia de nucleótidos del transcrito AR-V1. La mayoría de la secuencia cadena arriba común a todos los receptores de andrógenos, correspondiente al nucleótido 1-2822 de la SEQ ID NO: 34, no está incluida. El primer nucleótido de las secuencias específicas de variante está sombreado.
TG TC A C TA TG G A G C T C TC A C A TG TG G A A G C TG C A A G G TC TTC TTC A A A A G A G C C G C TG A A G G G A A A C A G A A G TA C C TG TG C G C C A G C A G A A A TG A TTG C A C TA TTG A TA A A TTC C G A A G G A A A A A TT G TC C A TC TTG T C G TC TTC G G A A A TG TTA TG A A G C A G G G A TG A C TC TG G G A E jC TG TTG TTG T TTC TG A A A G A A T C TTG A G G G TG TTTG G A G TC
T C A G A A TG G C T TC C TTA A A G A C TA C C TTC A G A C TC TC A G C TG C TC A TC C A C A A C A G A G A TC A G C C TTTC TTTG TA G A TG A TTC A TTC C TG G C TG C A TTTG A A A A C C A C A T A T T G T T A A T T G C T T G A C G A A T T T A A A T C C C T T G A C T A C T T T T C A T T T C A G A A A A C A C T T A C A A A A A A A G T C C A A A TG A G G A C C TTC C C TC C A G TG A A TTA G C TG TG G C T TT C TC A C A G T C C A T A G T T A G G A T A A A T G T A A A G C C A T T T C T C A T T T T T C T C C G C A C T T TC C A A G G G TA C A C TC C TTG TTTC C A A G A TG G A A TG A G A A A TA A A G A A G TG C C C TT C C T G C C A TC TTC TC C C C TG A C C C TTTC C TC C TTC C C A C TTT C C TC C TA TTC C TC C C C A A A C A T G A T T T A T T T C T G C G T T T T G C A A C T C T T G A G T T C T C A G C A T T T A G T A A A T G G TG TTG G TC C C TG TTG A TTC C TTC C TC TC C TG G A C C A TG G A A G G TA G TA G G C C TTT C A G A A A TTTC A G G TA G C A G C C A A A C C C C A G A A G A A G A G A A G G A A C A C A G A G A C C TA G A C C A TG TG A G A A C C TG A G G T G TG C A G C A TTT A C TT C A C A G A TTC G TC TA G C A TA TTTG A G A G G TG
SEQ ID NO: 3 (referencia)
La SEQ ID NO: 3 corresponde a la secuencia de nucleótidos del transcrito AR-V2. La mayoría de la secuencia cadena arriba común a todos los receptores de andrógenos, correspondiente al nucleótido 1-2822 de la SEQ ID NO: 34, no está incluida. El primer nucleótido de las secuencias específicas de variante está sombreado.
TG TC A C TA TG G A O C TC TC A C A TO TG O A A G C TO C A A G G TC TTC TTC A A A A O A O C C G C TG A A G G G A A A C A G A A G TA C C TG TG C G C C A G C A G A A A TG A TTG C A C TA TTG A TA A A TTC C G A A G G A A A A A TTG TC C A TC TTG TC G TC TTC G G A A A TG TTA TG A A G C A G G G A TG A C TC TG G G A G G G A A A C A G A A G TA C C TG TG C G C C A G C A G A A A TG A TTG C A C T A TTG A TA A A TTC C G A A G G A A A A A TTG TC C A TC TTG TC G TC TTC G G A A A TG TTA T G A A G C A G G G A TG A C TC TG G G A g C TG TTG TTG TTTC TG A A A G A A TC TTG A G G G TG T
TTG G A G TC TC A G A A TG G C T TC C TTA A A G A C TA C C TTC A G A C TC TC A G C TG C TC A T C C A C A A C A G A G A TC A G C C TTTC TTTG TA G A TG A TTC A TTC C TG G C TG C A TTTG A A A A C C A C A T A T T G T T A A T T G C T T G A C G A A T T T A A A T C C C T T G A C T A C T T T T C A T T T C A G A A A A C A C TTA C A A A A A A A G TC C A A A TG A G G A C C TTC C C T C C A G TG A A TTA G C TG TG G C TTTC TC A C A G TC C A TA G TT AGG A T A A A TG TA A AG CC A T T T C T C A T T T T T C TC C G C A C TTT C C A A G G G TA C A C TC C TTG T TTC C A A G A TG G A A TG A G A A A TA A A G A A G TG C C C TTC C TG C C A TC TTC TC C C C TG A C C C TTTC C TC C TT C C C A C TTTC C TC C TA T T C C TC C C C A A A C A TG A TTTA TTTC TG C G TTTTG C A A C TC TTG A G TTC TC A G C A TT T A G T A A A TG G TG TT G G TC C C TG TTG A T lC C T TC C TC TC C TG G A C C A TG G A A G G TA
g t a g g c c t t t c a g a a a t t t c a g g t a g c a g c c a a a c c c c a g a a g a a g a g a a g g a a
C A C A G A G A C C TA G A C C A TG TG A G A A C C TG A G G TG TG C A G C A TTTA C TTC A CA G A TTC G TC TA G C A TA TTTG A G A G G TG
SEQ ID NO: 4 (referencia)
La SEQ ID NO: 4 corresponde a la secuencia de nucleótidos del transcrito AR-V3. La mayoría de la secuencia cadena arriba común a todos los receptores de andrógenos, correspondiente al nucleótido 1-2822 de la SEQ ID NO: 34, no está incluida. El primer nucleótido de las secuencias específicas de variante está sombreado.
TG TC A C TA TG G A G C T C TC A C A TG TG G A A G C TG C A A G G TC TTC TTC A A A A O A G C C G
C T G A A g G A T T T T T C A G A A T G A A C A A A T T A A A A G A A T C A T C A G A C A C T A A C C C C A
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SEQ ID NO: 5 (referencia)
La SEQ ID NO: 5 corresponde a la secuencia de nucleótidos del transcrito AR-V4. La mayoría de la secuencia cadena arriba común a todos los receptores de andrógenos, correspondiente al nucleótido 1-2822 de la SEQ ID NO: 34, no está incluida. El primer nucleótido de las secuencias específicas de variante está sombreado.
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SEQ ID NO: 6 (referencia)
La SEQ ID NO: 6 corresponde a la secuencia de nucleótidos del transcrito AR-V5. La mayoría de la secuencia cadena arriba común a todos los receptores de andrógenos, correspondiente al nucleótido 1-2883 de la SEQ ID NO: 34, no está incluida. El primer nucleótido de las secuencias específicas de variante está sombreado.
GG A A A C A G A A G T A C C TG TG C G C C A G C AG A A A TG A T T G C A C T A TTG A TA A A TTC C
G A A G G A A A A A T TG TC C A T C TTG TC G T C TTC G G A A A TG TTA TG A A G C A G G G A TG A C TC TG G G A g A C TA G A A TTC C A A A G A C C C TC A G G C TG G TG A TG C A A G TG G G A A G TC
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SEQ ID NO: 7 (referencia)
La SEQ ID NO: 7 corresponde a la secuencia de nucleótidos del transcrito AR-V6. La mayoría de la secuencia cadena arriba común a todos los receptores de andrógenos, correspondiente al nucleótido 1-2883 de la SEQ ID NO: 34, no está incluida. El primer nucleótido de las secuencias específicas de variante está sombreado.
G G A A AC A G A A G TA C C TG TG C G C C A G C A G A A A TG A TTG C A C TA TTG A TA A A TTC C G A A G G A A A A A T TG TC C A T C TTG TC G T C TTC G G A A A TG TTA TG A A G C A G G G A TG A C TC TG G G A ^ C A G G C A G C A G A G TG TC A TA A A G A A TTA A C A A C G TG G A A C TC A G TTA
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SEQ ID NO: 39 (referencia)
La SEQ ID NO: 39 corresponde a la secuencia de nucleótidos del transcrito AR-V8. La mayoría de la secuencia cadena arriba común a todos los receptores de andrógenos, correspondiente al nucleótido 1-2822 de la SEQ ID NO: 34, no está incluida. El primer nucleótido de las secuencias específicas de variante está sombreado.
TG TC A C TA TG G A G C TC TC A C A TG TG G A A G C TG C A A G G TC TTC TTC A A A A G A G C C G C TG A A G G G A A A C A G A A G TA C C TG TG C G C C A G C A G A A A TG A TTG C A C TA TTG A TA A A TTC C G A A G G A A A A A TT G TC C A TC TTG T C G TC TTC G G A A A TG TTA TG A A G C A G G G A TG A CTCTG G G A A AC A A C TTA C C TG AGCAAG CTG C TTTT TG G AG A C A TTTG C A C A TC TTTTG G G A TC A C G TTG TT A A G A A G TA G A A C TA A G G G A A A A A C A C G C A G C C A C C C A G A A A T C G G TA G A G C C TTC A G C TC A TC TG TTA TT A A TA TTTC TG TG A C A A C A
A A T C A G G TTC C A TTC TTC TC A G TC C A G TTC A A C C TTG TG A TA C TTT TTA G A TC TC A A C C A A G G C A TA G A A A TA TA TT TTC C C TT G C TT A A TA C C C C A TG G A A C C A A TG C C C C TG TG G TTG A A G TA A A A A TTG A TTG T TG A G G G A C A TTT C A G C C C TC TA G C A G TC A A C A A TTA A A A A C A TG TA A G C A C C G A G C A C C TG C A G A A A A C TTG G A C TG G C A TTT GGATCTAAGAAGAAAATCTGCATCTTGACCAAGATGAAAAGTCACCAGCCCAAG CTTGTGCAGTGAAGTGTCATGTTGGCCACAATGAAACTGAAAGAGACTGATGAC TCTCCTCAGGGTGGAAAATGAGGCATGGAAGCTTTGATTAGTGAGCTGTTAGGCA CACAGACATTAATTTCAAAGCATTCTCATCTCCAGTCTGAGTAATAATGCTTATA GTATTATGCAATTGTTTGGCTGCTGCAAGAAATTCAGCAGACTCCAACAAGTAGT CTTTCTTGGTCTCTGAGTGACTGTAACTTAAATTCTACCTCCCTTCTCTTCTCCTAC ATCTTCTCACTCCCCACCCCACCCCCACATACACACAATTCTTGTCCACTATGTTC AGAG AG ATGC ACGC AC AC AT AT AT ATGTAT AT AT AT AGT AT ATTTGTCAATAAAG CÁGAAAAGAAGAAAAAACTCCAAGTAAACAATTTTCCATTTCCCCATCTCACTTC TGTCTTACAAGTGGATAGGAAAAGAAAAACCCCCAGTAAAAAATGGCAACCGCC CACCTCCCC AACTTT AC ATGCTGCTTCCT ATGTT AG AGG ATCTGTCTTAGGCATCT GATTATGGAGCCTGCTAGATACAAGCCCGTATTTAGACTGCTACAGTCAACAATG TCTCTCTTTCAT ACTAG AAAAATTCC
En ciertos ejemplos, el ácido nucleico de la variante del receptor de andrógenos comprende la SEQ ID NO: 1, o fragmentos de la misma. En otros ejemplos, el ácido nucleico de la variante del receptor de andrógenos comprende la SEQ ID NO: 39. En otros ejemplos, el ácido nucleico de la variante del receptor de andrógenos comprende la SEQ ID NO: 2.
En ciertos ejemplos, el polipéptido de la variante del receptor de andrógenos comprende una secuencia seleccionada entre una o más de las SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO; 11, SEQ ID NO; 12, SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14 o fragmentos de las mismas. Las secuencias se muestran a continuación:
SEQ ID NO: 8 (invención)
La SEQ ID NO: 8 corresponde a la secuencia proteica de AR-V7. En la SEQ ID NO: 8, la mayoría de las secuencias NTD de AR n-terminal y DBD de AR comunes a todas las proteínas AR (aminoácido 1-569 de la SEQ ID NO: 35) no están incluidas. La secuencia en negrita corresponde a los aminoácidos codificados por el exón 2, la secuencia subrayada corresponde a los aminoácidos codificados por el exón 3, seguida por la secuencia específica de variante en cursiva.
C H Y G A L T C G S C K V F F K R A A E G K O K Y L C A S R N D C T I D K F R R
K N C P S C R L R K C Y E A G M T L G EÁTF'/? V G N C K H L K M T R P parada
SEQ ID NO: 9 (referencia)
La SEQ ID NO: 9 corresponde a la secuencia proteica de AR-V1. En la SEQ ID NO: 9, la mayoría de las secuencias NTD de AR n-terminal y DBD de AR comunes a todas las proteínas AR (aminoácido 1-569 de la SEQ ID NO: 35) no están incluidas. La secuencia en negrita corresponde a los aminoácidos codificados por el exón 2, la secuencia subrayada corresponde a los aminoácidos codificados por el exón 3, seguida por la secuencia específica de variante en cursiva.
C H Y G A L T C G S C K V F F K R A A E G K O K Y L C A S R N D C T I D K F R R
K N C P S C R L R K C Y E A G M T L G ^ V V V S E R I L R V F G V S E W L P parada
SEQ ID NO: 10 (referencia)
La SEQ ID NO: 10 corresponde a la secuencia proteica de AR-V2. En la SEQ ID NO: 10, la mayoría de las secuencias NTD de AR n-terminal y DBD de AR comunes a todas las proteínas AR (aminoácido 1-569 de la SEQ ID NO: 35) no están incluidas. La secuencia en negrita corresponde a los aminoácidos codificados por el exón 2, la secuencia subrayada corresponde a los aminoácidos codificados por el exón 3, seguida por la secuencia específica de variante en cursiva. Las secuencias peptídicas codificadas por el exón 3 están duplicadas.
C H Y G A L T C G S C K V F F K R A A E G K O K Y L C A S R N D C T I D K F R R
K N C P S C R L R K C Y E A G M T L G G K O K Y L C A S R N D C T I D K F R R K N
C P S C R L R K C Y E A G M T L G 4^ F F KS f /? / ¿ /? F F G E S E FEZ P parada
SEQ ID NO: 11 (referencia)
La SEQ ID NO: 11 corresponde a la secuencia proteica de AR-V3. En la SEQ ID NO: 11, la mayoría de las secuencias NTD de AR n-terminal y DBD de AR comunes a todas las proteínas AR (aminoácido 1-569 de la SEQ ID NO: 35) no están incluidas. El primer aminoácido de la secuencia específica de variante está sombreado. La secuencia en negrita corresponde a los aminoácidos codificados por el exón 2, seguida por la secuencia específica de variante en cursiva.
C H Y G A L T C G S C K V F F K R A A E G F F R M N K L K E S S D T N P K P Y C M
A A P M G L T E N N R N R K K S Y R E T N L K A V S W P L N H T parada
SEQ ID NO: 12 (referencia)
La SEQ ID NO: 12 corresponde a la secuencia proteica de AR-V4. En la SEQ ID NO: 12, la mayoría de las secuencias NTD de AR n-terminal y DBD de AR comunes a todas las proteínas AR (aminoácido 1-569 de la SEQ ID NO: 35) no están incluidas. La secuencia en negrita corresponde a los aminoácidos codificados por el exón 2, la secuencia subrayada corresponde a los aminoácidos codificados por el exón 3, seguida por la secuencia específica de variante en cursiva.
C H V G A L T C G S C K V F F K R A A E G K O K Y L C A S R N D C T I D K F R R K N C P S C R L R K C YE A G M T L GGFF/ ? M N K L K E S S D T N P K P Y C M A
A P M G L T E N N R N R K K S Y R E T N L K A V S W P L N H T parada
SEQ ID NO: 13 (referencia)
La SEQ ID NO: 13 corresponde a la secuencia proteica de AR-V5. En la SEQ ID NO: 13, la mayoría de las secuencias NTD de AR n-terminal y DBD de AR comunes a todas las proteínas AR (aminoácido 1-589 de la SEQ ID NO: 35) no están incluidas. La secuencia subrayada corresponde a los aminoácidos codificados por el exón 3, seguida por la secuencia específica de variante en cursiva.
G K O K Y L C A S R N D C T I D K F R R K N C P S C R L R K C Y E A G M T L C i D
parada
SEQ ID NO: 14 (referencia)
La SEQ ID NO: 14 corresponde a la secuencia proteica de AR-V6. En la SEQ ID NO: 14, la mayoría de las secuencias NTD de AR n-terminal y DBD de AR comunes a todas las proteínas AR (aminoácido 1-589 de la SEQ ID NO: 35) no están incluidas. La secuencia subrayada corresponde a los aminoácidos codificados por el exón 3, seguida por la secuencia específica de variante en cursiva.
G K O K Y L C A S R N D C T I D K F R R K N C P S C R L R K C Y E A G M T L G /4 G
S R V S parada
SEQ ID NO: 40 (referencia)
La SEQ ID NO: 40 corresponde a la secuencia proteica de AR-V8. En la SEQ ID NO: 40, la mayoría de las secuencias NTD de AR n-terminal y DBD de AR comunes a todas las proteínas AR (aminoácido 1-569 de la SEQ ID NO: 35) no están incluidas. La secuencia en negrita corresponde a los aminoácidos codificados por el exón 2, la secuencia subrayada corresponde a los aminoácidos codificados por el exón 3, seguida por la secuencia específica de variante en cursiva.
C H Y G A L T C G S C K V F F K R A A E G K O K Y L C A S R N D C T I D K F R R K N C P S C R L R K C YE A G M T L G D N L P E O A A F W R H L H Í F W D H V V K
K parada
Diagnóstico y pronóstico
El cáncer de próstata depende de la señalización androgénica para su crecimiento y supervivencia. Los andrógenos ejercen sus efectos celulares y fisiológicos a través de la unión al receptor de andrógenos. Un hallazgo de la presente invención es que ciertas células de cáncer de próstata expresan niveles mayores de variantes del receptor de andrógenos, en particular AR-V1 - AR-V7 que los tejidos normales correspondientes. Por consiguiente, los niveles de expresión de una molécula de ácido nucleico de variante del receptor de andrógenos o polipéptido están correlacionados con una patología relacionada con andrógenos particular (por ejemplo, cáncer de próstata), y por tanto son útiles en diagnóstico. Por consiguiente, la presente descripción proporciona varios ensayos de diagnóstico que son útiles para la identificación o caracterización de una enfermedad o trastorno relacionado con andrógenos, por ejemplo, cáncer de próstata.
En aspectos de la descripción, un paciente que tiene una enfermedad o trastorno relacionado con andrógenos, por ejemplo, cáncer de próstata, mostrará un aumento en la expresión de una molécula de ácido nucleico de la variante del receptor de andrógenos. Las alteraciones en la expresión génica se detectan usando métodos conocidos para los expertos en la materia y descritos en este documento. Dicha información puede usarse para diagnosticar una enfermedad o trastorno relacionado con andrógenos, por ejemplo, cáncer de próstata. En otro aspecto, una alteración en la expresión de la molécula de ácido nucleico de la variante del receptor de andrógenos se detecta usando reacción en cadena de la polimerasa (PCR), por ejemplo, PCR a tiempo real o PCR a tiempo real semicuantitativa para detectar cambios en la expresión génica.
Los cebadores usados para la amplificación de una molécula de ácido nucleico de la variante del receptor de andrógenos, incluyendo, aunque sin limitación, aquellas secuencias cebadoras descritas en este documento, son útiles en los métodos de diagnóstico de la descripción. Los cebadores de la descripción abarcan oligonucleótidos de suficiente longitud y secuencia apropiada para proporcionar inicio específico de polimerización en una cantidad significativa de ácidos nucleicos. Específicamente, el término "cebador" como se usa en este documento, se refiere a una secuencia que comprende dos o más desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, preferiblemente más de tres, y mucho más preferiblemente más de 8, cuya secuencia es capaz de iniciar la síntesis de un producto de extensión de cebador, que es sustancialmente complementario a una hebra del locus. El cebador debe ser suficientemente largo para cebar la síntesis de productos de extensión en presencia del agente inductor para polimerización. La longitud exacta del cebador dependerá de muchos factores, incluyendo temperatura, tampón, y composición de nucleótidos. Los cebadores de la descripción se diseñan para que sean "sustancialmente" complementarios a cada hebra del locus genómico a amplificar e incluyen los nucleótidos G o C apropiados como se ha analizado anteriormente. Esto significa que los cebadores deben ser suficientemente complementarios para hibridar con sus hebras respectivas en condiciones que permitan que el agente funcione para la polimerización. En otras palabras, los cebadores deben tener suficiente complementariedad con las secuencias flanqueantes 5' y 3' para hibridar con las mismas y permitir la amplificación del locus genómico. Aunque se proporcionan cebadores ejemplares en este documento, se entiende que es útil cualquier cebador que hibride con las secuencias diana de la descripción en el método de la descripción para detectar moléculas de ácido nucleico de la variante del receptor de andrógenos.
Conjuntos ejemplares de cebadores útiles en la descripción se muestran a continuación:
(P1): TGTCACTATGGAGCTCTCACATGTGG (SEQ ID NO: 15) y
CACCTCTCAAATATGCTAGACGAATCTGT (SEQ ID NO: 16); (referencia)
(P2) TGTCACTATGGAGCTCTCACATGTGG (SEQ ID NO: 17) y
GTACTCATTCAAGTATCAGATATGCGGTATCAT (SEQ ID NO: 18); (referencia)
(P3) TGTCACTATGGAGCTCTCACATGTGG (SEQ ID NO: 19) y
CTG TG GATCAG CTACTACCTTCAG CTC (SEQ ID NO: 20);
(P4) G TTG CTCCCG CAAG TTTCCTTCTC (SEQ ID NO: 21) y
CTGTTGTGGATGAGCAGCTGAGAGTCT (SEQ ID NO: 22); (referencia)
(P5) G TTG CTCCCG CAAG TTTCCTTCTC (SEQ ID NO: 23) y
TTTGAATGAGGCAAGTCAGCCTTTCT (SEQ ID NO: 24);
(P6) CCATCTTGTCGTCTTCG GAAATG T TATGAAGC (SEQ ID NO: 25) y
CTGTTGTGGATGAGCAGCTGAGAGTCT (SEQ ID NO: 26); (referencia)
(P7) CCATCTTGTCGTCTTCG GAAATG TT ATGAAGC (SEQ ID NO: 27) y
TTTGAATGAGGCAAGTCAGCCTTTCT (SEQ ID NO: 28);
(P8) CCATCTTGTCGTCTTCGGAAATG TTATGAAGC (SEQ ID NO: 29) y
AG CTTCTG G G TTG TCTCCTCAG TG G (SEQ ID NO: 30); (referencia) y (P9)
Tgtcactatggagctctcacatgtgg (SEQ ID NO: 37) y Cattgtggccaacatgacacttca (SEQ ID NO: 38). (referencia)
En un aspecto, los cebadores específicos de variante del receptor de andrógenos amplifican una diana genómica deseada usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), en particular RT-PCR semicuantitativa. El producto amplificado después se detecta usando métodos convencionales conocidos en la técnica. En un aspecto, se detecta un producto de PCR (es decir, amplicón) o producto de PCR a tiempo real por unión de sonda. En un aspecto, la unión de sonda genera una señal fluorescente, por ejemplo, por acoplamiento de una molécula de colorante fluorogénico y un resto inactivador a los mismos o diferentes sustratos oligonucleotídicos (por ejemplo, TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), Molecular Beacons (véase, por ejemplo, Tyagi et al., Nature Biotechnology 14(3):303-8, 1996), Scorpions® (Molecular Probes Inc., Eugene, OR, EE.UU .)). En otro ejemplo, se detecta un producto de PCR por la unión de un colorante fluorogénico que emite una señal fluorescente tras la unión (por ejemplo, SYBR® Green (Molecular Probes)). Dichos métodos de detección son útiles para la detección de un producto de PCR de la variante del receptor de andrógenos.
En otro aspecto, la hibridación con sondas de PCR que son capaces de detectar una molécula de ácido nucleico de la variante del receptor de andrógenos, incluyendo secuencias genómicas, o moléculas muy relacionas, puede usarse para hibridar con una secuencia de ácido nucleico obtenida de un paciente que tiene una enfermedad o trastorno relacionado con andrógenos, por ejemplo, cáncer de próstata. La especificidad de la sonda determina si la sonda hibrida con una secuencia de origen natural, variantes alélicas, u otras secuencias relacionadas. Pueden usarse técnicas de hibridación para identificar mutaciones indicativas de una enfermedad o trastorno relacionado con andrógenos, por ejemplo, cáncer de próstata, o puede usarse para controlar los niveles de expresión de estos genes (por ejemplo, por análisis de Northern (Ausubel et al., supra)).
Se describen métodos para determinar si un sujeto responderá a terapia de andrógenos, comprendiendo el método determinar el nivel de expresión o actividad biológica de un polipéptido variante del receptor de andrógenos en una muestra del sujeto donde una alteración en el nivel de expresión o actividad biológica respecto a la expresión o actividad biológica en una referencia indica que el sujeto responderá a terapia de andrógenos.
Se describen métodos para determinar si un sujeto responderá a terapia de andrógenos, comprendiendo el método determinar el nivel de expresión o actividad biológica de un ácido nucleico de la variante del receptor de andrógenos en una muestra del sujeto donde una alteración en el nivel de expresión respecto a la expresión en una referencia indica que el sujeto responderá a terapia de andrógenos.
E l sujeto tiene cáncer de próstata.
Se describen métodos de diagnóstico. Por ejemplo, puede diagnosticarse a un sujeto, por ejemplo, un paciente, para una propensión a desarrollar una enfermedad o trastorno relacionado con andrógenos, por ejemplo, cáncer de próstata, por análisis directo de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de la variante del receptor de andrógenos. La secuencia de una molécula de ácido nucleico de la variante del receptor de andrógenos obtenida de un sujeto se compara con una secuencia de referencia. Una alteración en la secuencia de la molécula de ácido nucleico de la variante del receptor de andrógenos respecto a la referencia indica que el paciente tiene, o tiene una propensión a desarrollar, una enfermedad o trastorno relacionado con andrógenos, por ejemplo, cáncer de próstata.
En otro enfoque, se usan métodos de diagnóstico de la descripción para ensayar la expresión de un polipéptido variante del receptor de andrógenos en una muestra biológica respecto a una referencia (por ejemplo, el nivel de polipéptido variante del receptor de andrógenos presente en una muestra de control correspondiente, o en una muestra tomada antes de un tratamiento, tal como tratamiento quirúrgico).En un aspecto, el nivel de un polipéptido variante del receptor de andrógenos se detecta usando un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido variante del receptor de andrógenos. Anticuerpos ejemplares que se unen específicamente a un polipéptido variante del receptor de andrógenos se describen en este documento. Dichos anticuerpos son útiles para el diagnóstico de una enfermedad o trastorno relacionado con andrógenos. Los métodos para medir un complejo anticuerpo-variante del receptor de andrógenos incluyen, por ejemplo, detección de fluorescencia, luminiscencia, quimioluminiscencia, absorbancia, reflectancia, transmitancia, birrefringencia o índice refractario. Los métodos ópticos incluyen microscopía (tanto confocal como no confocal), métodos de imágenes y métodos no de imágenes. Los métodos para realizar estos ensayos son fácilmente conocidos en la técnica. Ensayos útiles incluyen, por ejemplo, un inmunoensayo enzimático (EIA) tal como ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA), un ensayo de transferencia de Western, o un ensayo slot blot. Estos métodos también se describen en, por ejemplo, Methods in Cell Biology; Antibodies in Cell Biology, volumen 37 (Asai, ed. 1993); Basic and Clinical Immunology (Stites y Terr, eds., 7.a ed. 1991); y Harlow y Lane, supra. Los inmunoensayos pueden usarse para determinar la cantidad de variante del receptor de andrógenos en una muestra, donde un aumento en el nivel del polipéptido variante del receptor de andrógenos es diagnóstico de un paciente que tiene una enfermedad o trastorno relacionado con andrógenos, por ejemplo, cáncer de próstata.
En general, la medición de un polipéptido o molécula de ácido nucleico de la variante del receptor de andrógenos en una muestra del sujeto se compara con una cantidad diagnóstica presente en una referencia. Una cantidad diagnóstica distingue entre un tejido enfermo o, por ejemplo, un tejido neoplásico, y un tejido de control. Los expertos en la materia aprecian que la cantidad diagnóstica particular usada puede ajustarse para aumentar la sensibilidad o especificidad del ensayo de diagnóstico dependiendo de la preferencia del especialista en diagnóstico. En general, puede usarse cualquier aumento significativo (por ejemplo, al menos aproximadamente 10 %, 15 %, 30 %, 50 %, 60 %, 75 %, 80 %, o 90 %) en el nivel de un polipéptido o molécula de ácido nucleico de la variante del receptor de andrógenos en la muestra del sujeto respecto a una referencia para diagnosticar una enfermedad o trastorno relacionado con andrógenos, por ejemplo, cáncer de próstata. En un aspecto, la referencia es el nivel de polipéptido o molécula de ácido nucleico de la variante del receptor de andrógenos presente en una muestra de control obtenida de un paciente que no tiene una enfermedad o trastorno relacionado con andrógenos, por ejemplo, cáncer de próstata. En otro aspecto, la referencia es el nivel de polipéptido o molécula de ácido nucleico de la variante del receptor de andrógenos presente en una muestra de control obtenida de sujetos con una enfermedad de menos gravedad, por ejemplo, cáncer de próstata no agresivo en fase prematura. En otro aspecto, la referencia es un nivel basal de variante del receptor de andrógenos presente en una muestra biológica obtenida de un paciente antes de, durante, o después de tratamiento para una enfermedad o trastorno relacionado con andrógenos, por ejemplo, cáncer de próstata. En otro aspecto más, la referencia es una curva normalizada.
Tipos de muestras biológicas
El nivel de un polipéptido o molécula de ácido nucleico de la variante del receptor de andrógenos puede medirse en diferentes tipos de muestras biológicas. En un aspecto, la muestra biológica es una muestra tisular que incluye células de un tejido u órgano. Dicho tejido se obtiene, por ejemplo, de una biopsia. En otro aspecto, la muestra biológica es una muestra de fluido biológico (por ejemplo, sangre, plasma sanguíneo, suero, orina, fluidos seminales, fluido ascítico, o fluido cefalorraquídeo).
En ciertos aspectos ejemplares, la muestra es de próstata.
En otros ciertos aspectos ejemplares, la muestra es de un sujeto que está experimentando tratamiento para cáncer de próstata.
Control de pacientes
La patología o tratamiento de un paciente que tiene cáncer de próstata resistente a hormonas puede controlarse usando los métodos y kits de la descripción. En un aspecto, se usa una microserie para ensayar el perfil de expresión de la molécula de ácido nucleico de la variante del receptor de andrógenos. Dicho control puede ser útil, por ejemplo, en evaluar la respuesta de un paciente a terapia de andrógenos, en evaluar el estado de remisión de un paciente, o en evaluar la respuesta de un fármaco particular en un paciente.
Los agentes terapéuticos que alteran la expresión de una molécula de ácido nucleico de la variante del receptor de andrógenos o polipéptido variante del receptor de andrógenos (por ejemplo, una variante del receptor de andrógenos, por ejemplo, AR-V1, AR-V2, AR-V3, AR-V4, AR-V5, AR-V6, AR-V7, A r -V8, o fragmentos de los mismos), pueden ser útiles.
Kits
La descripción también proporciona kits para el diagnóstico de cáncer de próstata resistente a hormonas, en una muestra biológica obtenida de un sujeto. En un aspecto, el kit detecta un aumento en la expresión de una molécula de ácido nucleico o polipéptido variante del receptor de andrógenos respecto a un nivel de referencia de expresión. En otro aspecto, el kit detecta una alteración en la secuencia de una molécula de ácido nucleico de la variante del receptor de andrógenos obtenida de un sujeto respecto a una secuencia de referencia. En aspectos relacionados, el kit incluye reactivos para controlar la expresión de una molécula de ácido nucleico de la variante del receptor de andrógenos, tal como cebadores o sondas que hibridan con una molécula de ácido nucleico de la variante del receptor de andrógenos. En otros aspectos, el kit incluye un anticuerpo que se une a un polipéptido variante del receptor de andrógenos.
Opcionalmente, el kit incluye instrucciones para controlar los niveles de una molécula de ácido nucleico o polipéptido variante del receptor de andrógenos en una muestra biológica obtenida de un sujeto. En otros aspectos, el kit comprende un recipiente estéril que contiene el cebador, sonda, anticuerpo, u otros reactivos de detección; dichos recipientes pueden ser cajas, ampollas, frascos, viales, tubos, paquetes, bolsas, envases blíster, u otra forma de recipiente adecuada conocida en la técnica. Dichos recipientes pueden estar hechos de plástico, vidrio, papel laminado, lámina de metal, u otros materiales adecuados para alojar ácidos nucleicos. Las instrucciones generalmente incluirán información acerca del uso de los cebadores o sondas descritos en este documento y su uso en el diagnóstico de una enfermedad o trastorno relacionado con andrógenos, por ejemplo, cáncer de próstata. Preferiblemente, el kit comprende adicionalmente uno cualquiera o más de los reactivos descritos en los ensayos de diagnóstico descritos en este documento. En otros aspectos, las instrucciones incluyen al menos uno de los siguientes: descripción del cebador o sonda; métodos para usar los materiales adjuntos para el diagnóstico de una enfermedad o trastorno relacionado con andrógenos, por ejemplo, cáncer de próstata; precauciones; advertencias; indicaciones; estudios clínicos o de investigación; y/o referencias. Las instrucciones pueden imprimirse directamente sobre el recipiente (cuando está presente), o como una etiqueta aplicada al recipiente, o como una hoja, folleto, tarjeta o pliego separado suministrado en o con el recipiente.
Anticuerpos contra variantes del receptor de andrógenos
Los anticuerpos son bien conocidos para los expertos en la materia en la ciencia de inmunología. Como se usa en este documento, el término "anticuerpo" significa no solamente moléculas intactas de anticuerpo, sino también fragmentos de moléculas de anticuerpo que retienen capacidad de unión a inmunógeno. Dichos fragmentos también son bien conocidos en la técnica y se emplean de forma regular tanto in vitro como in vivo. Por consiguiente, como se usa en este documento, el término "anticuerpo" significa no solamente moléculas intactas de inmunoglobulina sino también los fragmentos activos bien conocidos F(ab')2, y Fab. Los fragmentos F(ab')2 y Fab que carecen del fragmento Fc del anticuerpo intacto, se eliminan más rápidamente de la circulación, y pueden tener menos unión tisular no específica de un anticuerpo intacto (Wahl et al., J. Nucí. Med. 24:316-325 (1983)). Los anticuerpos comprenden anticuerpos nativos completos, anticuerpos biespecíficos; anticuerpos quiméricos; fragmentos Fab, Fab', de región V de cadena sencilla (scFv) y polipéptidos de fusión.
En una variante, un anticuerpo que se une a un polipéptido variante del receptor de andrógenos (por ejemplo, una variante del receptor de andrógenos, por ejemplo, AR-V1, AR-V2, AR-V3, AR-V4, AR-V5, AR-V6, AR-V7, AR-V8 o fragmentos de los mismos) es monoclonal. Como alternativa, el anticuerpo antivariante del receptor de andrógenos es un anticuerpo policlonal. La preparación y uso de anticuerpos policlonales también son conocidos por los expertos en la materia. La descripción también abarca anticuerpos híbridos, en que un par de cadenas ligera y pesada se obtiene de un primer anticuerpo, mientras que el otro par de cadenas pesada y ligera se obtiene de un segundo anticuerpo diferente. Dichos híbridos también pueden formarse usando cadenas pesadas y ligeras humanizadas. Dichos anticuerpos a menudo se mencionan como anticuerpos "quiméricos".
En general, se dice que los anticuerpos intactos contienen regiones "Fc" y "Fab". Las regiones Fc están implicadas en la activación del complemento y no están implicadas en la unión a antígeno. Un anticuerpo del cual se ha escindido enzimáticamente la región Fc', o que se ha producido sin la región Fc', denominado un fragmento "F(ab')2" retiene ambos sitios de unión a antígeno del anticuerpo intacto. Asimismo, un anticuerpo del cual se ha escindido enzimáticamente la región Fc, o que se ha producido sin la región Fc, denominado un fragmento "Fab'", retiene uno de los sitios de unión a antígeno del anticuerpo intacto. Los fragmentos Fb' consisten en una cadena ligera de anticuerpo unida covalentemente y una parte de la cadena pesada de anticuerpo, indicada "Fd". Los fragmentos Fd son los determinantes principales de la especificidad de los anticuerpos (un único fragmento Fd puede estar asociado con hasta diez diferentes cadenas ligeras sin alterar la especificidad del anticuerpo). Los fragmentos Fd aislados retienen la capacidad de unirse específicamente a epítopos inmunogénicos.
Los anticuerpos pueden prepararse por cualquiera de los métodos conocidos en la técnica utilizando polipéptidos variantes del receptor de andrógenos únicos para cada una de las variantes (por ejemplo, una variante del receptor de andrógenos, por ejemplo, AR-V1, AR-V2, AR-V3, AR-V4, AR-V5, AR-V6, AR-V7, a R-V8, o fragmentos de los mismos), o fragmentos inmunogénicos de los mismos, como inmunógeno. Un método para obtener anticuerpos es inmunizar animales hospedadores adecuados con un inmunógeno y seguir procedimientos convencionales para la producción de anticuerpos policlonales o monoclonales. El inmunógeno facilitará la presentación del inmunógeno sobre la superficie celular. La inmunización de un hospedador adecuado puede realizarse de varios modos. Las secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido variante del receptor de andrógenos (por ejemplo, una variante del receptor de andrógenos, por ejemplo, AR-V1, AR-V2, AR-V3, AR-V4, AR-V5, AR-V6, AR-V7, o fragmentos de los mismos), o fragmentos inmunogénicos de los mismos, pueden proporcionarse al hospedador en un vehículo de suministro que se capta por células inmunes del hospedador. Las células a su vez expresarán el receptor sobre la superficie celular generando una respuesta inmunogénica en el hospedador. Como alternativa, las secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido variante del receptor de andrógenos (por ejemplo, una variante de receptor de andrógenos, por ejemplo, AR-V1, AR-V2, AR-V3, AR-V4, AR-V5, AR-V6, AR-V7, A r -V-8 o fragmentos de los mismos), o fragmentos inmunogénicos de los mismos, pueden expresarse en células in vitro, seguido por aislamiento del receptor y administración del receptor a un hospedador adecuado en que se crean anticuerpos.
Usando cualquier enfoque, después pueden purificarse los anticuerpos del hospedador. Los métodos de purificación de anticuerpos pueden incluir precipitación en sal (por ejemplo, con sulfato de amonio), cromatografía de intercambio iónico (por ejemplo, en una columna de intercambio catiónico o aniónico ejecutada preferiblemente a pH neutro y eluida con gradientes por etapas de fuerza iónica creciente), cromatografía de filtración en gel (incluyendo HPLC de filtración en gel), y cromatografía en resinas de afinidad tales como proteína A, proteína G, hidroxiapatita y antiinmunoglobulina.
Los anticuerpos pueden producirse convenientemente a partir de células de hibridoma modificadas por ingeniería para que expresen el anticuerpo. Los métodos para preparar hibridomas son bien conocidos en la técnica. Las células de hibridoma pueden cultivarse en un medio adecuado, y puede usarse el medio empleado como fuente de anticuerpos. Los polinucleótidos que codifican el anticuerpo de interés pueden, a su vez, obtenerse del hibridoma que produce el anticuerpo, y después el anticuerpo puede producirse de forma sintética o recombinante a partir de estas secuencias de ADN. Para la producción de grandes cantidades de anticuerpo, generalmente es más conveniente obtener fluido ascítico. El método para crear fluido ascítico generalmente comprende inyectar células de hibridoma en un mamífero histocompatible o inmunotolerante inmunológicamente virgen, especialmente un ratón. El mamífero puede prepararse para producción de fluido ascítico por administración previa de una composición adecuada; por ejemplo, Pristano.
Los anticuerpos monoclonales (Mab) producidos por métodos de la descripción pueden "humanizarse" por métodos conocidos en la técnica. Los anticuerpos "humanizados" son anticuerpos en que al menos parte de la secuencia se ha alterado a partir de su forma inicial para volverlos más parecidos a inmunoglobulinas humanas. Las técnicas para humanizar anticuerpos son particularmente útiles cuando se generan anticuerpos animales no humanos (por ejemplo, murino). Ejemplos de métodos para humanizar un anticuerpo murino se proporcionan en las patentes de EE.UU. n.° 4.816.567, 5.530.101,5.225.539, 5.585.089, 5.693.762 y 5.859.205.
En ciertas variantes preferidas, el anticuerpo se une específicamente a una proteína variante del receptor de andrógenos-7 (AR-V7). En otras variantes, el anticuerpo se une específicamente a una proteína variante del receptor de andrógenos-1 (AR-V1). En otras ciertas variantes preferidas, el anticuerpo se une específicamente a una proteína variante del receptor de andrógenos-8 (AR-V8).
Preferiblemente, el anticuerpo se une a un epítopo CKHLKMRP de un polipéptido AR-V7, correspondiente a la SEQ ID NO: 33.
Expresión del polipéptido variante del receptor de andrógenos
En general, los polipéptidos variantes del receptor de andrógenos, variantes, y fragmentos de los mismos como se definen anteriormente pueden producirse por transformación de una célula hospedadora con todo o parte de una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido o fragmento de la misma en un vehículo de expresión adecuado.
Los expertos en el campo de biología molecular comprenderán que puede usarse cualquiera de una amplia diversidad de sistemas de expresión para proporcionar la proteína recombinante. La célula hospedadora precisa usada no es crítica para la descripción. Un polipéptido de la descripción puede producirse en un hospedador procariota (por ejemplo, E. coli) o en un hospedador eucariota (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, células de insecto, por ejemplo, células Sf21, o células de mamífero, por ejemplo, células NIH 3T3, HeLa, o preferiblemente COS). Dichas células están disponibles a partir de una amplia gama de fuentes (por ejemplo, la American Type Culture Collection, Rockland, Md.; también, véase, por ejemplo, Ausubel et al., supra). El método de transformación o transfección y la elección del vehículo de expresión dependerán del sistema hospedador seleccionado. Los métodos de transformación y transfección se describen, por ejemplo, en Ausubel et al. (supra); los vehículos de expresión pueden elegirse a partir de los proporcionados, por ejemplo, en Cloning Vectors: A Laboratory Manual (P. H. Pouwels et al., 1985, supl. 1987).
Existe una diversidad de sistemas de expresión para la producción de los polipéptidos de la descripción. Los vectores de expresión útiles para producir dichos polipéptidos incluyen, sin limitación, vectores cromosómicos, episómicos, y derivados de virus, por ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, de bacteriófagos, de transposones, de episomas de levadura, de elementos de inserción, de elementos cromosómicos de levadura, de virus tales como baculovirus, papovavirus, tales como SV40, virus vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar, virus de la pseudorrabia y retrovirus, y vectores derivados de combinaciones de los mismos.
Por ejemplo, un sistema de expresión bacteriano particular para la producción de polipéptidos es el sistema de expresión pET de E. co li(Novagen, Inc., Madison, Wis). De acuerdo con este sistema de expresión, se inserta el ADN que codifica a un polipéptido en un vector pET en una orientación diseñada para permitir la expresión. Como el gen que codifica dicho polipéptido está bajo el control de señales reguladores T7, la expresión del polipéptido se consigue induciendo la expresión de la ARN polimerasa T7 en la célula hospedadora. Esto se consigue típicamente usando cepas hospedadoras que expresan ARN polimerasa T7 en respuesta a inducción por IPTG. Una vez producido, el polipéptido recombinante después se aísla de acuerdo con métodos convencionales conocidos en la técnica, por ejemplo, los descritos en ese documento.
Otro sistema de expresión bacteriano para la producción de polipéptidos es el sistema de expresión pGEX (Pharmacia). Este sistema emplea un sistema de fusión génica G ST que está diseñado para una expresión de alto nivel de genes o fragmentos génicos, como proteínas de fusión con rápida purificación y recuperación de productos génicos funcionales. La proteína de interés se fusiona al extremo carboxilo de la proteína glutatión S-transferasa de Schistosoma japonicum y se purifica fácilmente de lisados bacterianos por cromatografía de afinidad usando Glutatión Seharose 4B. Las proteínas de fusión pueden recuperarse en condiciones suaves por elución con glutatión. La escisión del dominio glutatión S-transferasa de la proteína de fusión se facilita por la presencia de sitios de reconocimiento para proteasas específicas de sitio cadena arriba de este domino. Por ejemplo, las proteínas expresadas en plásmidos pGEX-2T pueden escindirse con trombina; las expresadas en pGEX-3X pueden escindirse con factor Xa.
Una vez expresado el polipéptido recombinante de la descripción, se aísla, por ejemplo, usando cromatografía de afinidad. En un ejemplo, un anticuerpo (por ejemplo, producido como se describe en este documento) creado contra un polipéptido de la descripción puede unirse a una columna y usarse para aislar el polipéptido recombinante. La lisis y fraccionamiento de las células que albergan polipéptido antes de cromatografía de afinidad puede realizarse por métodos convencionales (véase, por ejemplo, Ausubel et al., supra).
Una vez aislada, la proteína recombinante puede, si se desea, purificarse adicionalmente, por ejemplo, por cromatografía líquida de alto rendimiento (véase, por ejemplo, Fisher, Laboratory Techniques In Biochemistry and Molecular Biology, eds., Work y Burdon, Elsevier, 1980). Los polipéptidos de la descripción, particularmente fragmentos peptídicos cortos, también pueden producirse por síntesis química (por ejemplo, por los métodos descritos en Solid Phase Peptide Synthesis, 2.a ed., 1984 The Pierce Chemical Co., Rockford, III.). Estas técnicas generales de expresión y purificación de polipéptidos también pueden usarse para producir y aislar fragmentos peptídicos o análogos útiles (descritos en este documento).
Polipéptidos variantes del receptor de andrógenos y análogos
También se incluyen en la descripción polipéptidos variantes del receptor de andrógenos, variantes, o fragmentos de los mismos como se ha definido anteriormente que contienen al menos una alteración respecto a una secuencia de referencia. Dichas alteraciones incluyen ciertas variaciones polimórficas, mutaciones, deleciones, inserciones, o modificaciones postraduccionales. La descripción incluye adicionalmente análogos de cualquier polipéptido de origen natural usado de acuerdo con la invención y como se define anteriormente. Los análogos pueden diferir de los polipéptidos de origen natural de la invención por diferencias en la secuencia de aminoácidos, por modificaciones postraduccionales, o por ambas. Los análogos de la invención generalmente mostraron al menos un 90 %, y mucho más preferiblemente un 95 % o incluso un 99 % de identidad con todo o parte de una secuencia de aminoácidos de origen natural de la invención. La longitud de comparación de secuencia es de al menos 10, 13, 15 restos de aminoácido, referiblemente al menos 25 restos de aminoácido, y más preferiblemente más de 35 restos de aminoácido. De nuevo, en un enfoque ejemplar para determinar el grado de identidad, puede usarse un programa BLAST, con un valor de probabilidad entre e-3 y e-100 indicando una secuencia muy relacionada. Las modificaciones incluyen derivatización química in vivo e in vitro de polipéptidos, por ejemplo, acetilación, carboxilación, fosforilación, o glucosilación; dichas modificaciones pueden suceder durante la síntesis o procesamiento del polipéptido o después de tratamiento con enzimas modificadoras aisladas. Los análogos también pueden diferir de polipéptidos de origen natural de la invención por alteraciones en la secuencia primaria. Estas incluyen variantes genéticas, tanto naturales como inducidas (por ejemplo, resultantes de mutagénesis aleatoria por irradiación o exposición a etanometilsulfato o por mutagénesis específica de sitio como se describe en Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2.a ed.), CSH Press, 1989, o Ausubel et al., supra). También se incluyen péptidos ciclados, moléculas, y análogos que contienen restos diferentes a L-aminoácidos, por ejemplo, D-aminoácidos o aminoácidos de origen no natural o sintéticos.
Además de polipéptidos de longitud completa, la invención también incluye fragmentos de uno cualquiera de los polipéptidos de la invención. Como se usa en este documento, el término "un fragmento" significa al menos 5, 10, 13, o 15 aminoácidos. En otras realizaciones, un fragmento es de al menos 20 aminoácidos contiguos, al menos 30 aminoácidos contiguos, o al menos 50 aminoácidos contiguos y en otras realizaciones, al menos 60 a 80 o más aminoácidos contiguos. Los fragmentos de la invención pueden generarse por métodos conocidos para los expertos en la materia o pueden resultar del procesamiento normal de las proteínas (por ejemplo, retirada de aminoácidos del polipéptido naciente que no son necesarios para la actividad biológica o retirada de aminoácidos por corte y empalme alternativo del ARNm o eventos alternativos de procesamiento de proteínas).
Polinucleótidos variantes del receptor de andrógenos
Se describen secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido variante del receptor de andrógenos como se ha definido anteriormente (por ejemplo, variante del receptor de andrógenos, por ejemplo, AR-V1, AR-V2, AR-V3, AR-V4, AR-V5, AR-V6, AR-V7, AR-V8 o fragmentos de los mismos). También se incluye en los métodos de la descripción cualquier molécula de ácido nucleico que contenga al menos una hebra que hibride con dicha secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ácido nucleico inhibidora, tal como un ARNbc, ARNip, ARNhc, o molécula antisentido). Una molécula aislada de ácido nucleico puede manipularse usando técnica de ADN recombinante bien conocidas en la técnica. Por tanto, una secuencia de nucleótidos contenida en un vector en que se conocen los sitios de restricción 5' y 3', o para la cual se han descrito secuencias cebadoras de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se considera aislada, pero una secuencia de ácido nucleico que existe en su estado nativo en su hospedador natural no. Un ácido nucleico aislado puede purificarse sustancialmente, pero no lo necesita. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que está aislada dentro de un vector de clonación o expresión puede comprender solamente un porcentaje mínimo del material en la célula en que reside. Dicho ácido nucleico está aislado, sin embargo, según se usa el término en este documento, porque puede manipularse usando técnicas convencionales conocidas para los expertos en la materia.
Terapia de polinucleótido variante del receptor de andrógenos
La terapia de polinucleótido que destaca un polinucleótido que codifica una proteína variante del receptor de andrógenos, variante, o fragmento de la misma es otro enfoque terapéutico para tratar una enfermedad o trastorno relacionado con andrógenos, por ejemplo, cáncer de próstata. Dichas moléculas de ácido nucleico pueden suministrarse a células de un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno relacionado con andrógenos, por ejemplo, cáncer de próstata. Las moléculas de ácido nucleico deben suministrase a las células de un sujeto en una forma en que pueden captarse de modo que puedan producirse niveles terapéuticamente eficaces de una proteína variante del receptor de andrógenos (por ejemplo, variante del receptor de andrógenos, por ejemplo, AR-V1, AR-V2, AR-V3, AR-V4, AR-V5, AR-V6, AR-V7, AR-V8 o fragmentos de los mismos) o un fragmento de la misma.
Puede usarse transducción de vectores víricos (por ejemplo, retrovíricos, adenovíricos, y víricos adenoasociados) para genoterapia de células somáticas, especialmente a causa de su alta eficacia de infección e integración y expresión estables (véase, por ejemplo, Cayouette et al., Human Gene Therapy 8:423-430, 1997; Kido et al., Current Eye Research 15:833-844, 1996; Bloomer et al., Journal of Virology 71:6641-6649, 1997; Naldini et al., Science 272:263-267, 1996; y Miyoshi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U .S.A. 94:10319, 1997). Por ejemplo, un polinucleótido que codifica una proteína variante del receptor de andrógenos, variante, o fragmento de la misma, puede clonarse en un vector retrovírico y la expresión puede dirigirse a partir de su promotor endógeno, a partir de la repetición terminal larga retrovírica, o a partir de un promotor específico para un tipo de célula diana de interés. Otros vectores víricos que pueden usarse incluyen, por ejemplo, un virus vaccinia, un virus del papiloma bovino, o un herpes virus, tal como virus de Epstein-Barr (véase también, por ejemplo, los vectores de Miller, Human Gene Therapy 15-14, 1990; Friedman, Science 244:1275-1281, 1989; Eglitis et al., BioTechniques 6:608-614, 1988; Tolstoshev et al., Current Opinion in Biotechnology 1:55-61, 1990; Sharp, The Lancet 337:1277-1278, 1991; Cometía et al., Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36:311-322,1987; Anderson, Science 226:401-409,1984; Moen, Blood Cells 17:407-416,1991; Miller et al., Biotechnology 7:980-990,1989; Le Gal La Salle et al., Science 259:988-990, 1993; y Johnson, Chest 107:77S-83S, 1995). Los vectores retrovíricos están particularmente muy desarrollados y se han usado en entornos clínicos (Rosenberg et al., N. Engl. J . Med 323:370, 1990; Anderson et al., patente de Estados Unidos n.° 5.399.346). Más preferiblemente, se usa un vector vírico para administrar un polinucleótido variante del receptor de andrógenos sistémicamente.
También pueden emplearse enfoques no víricos para la introducción de agentes terapéuticos a una célula de un paciente diagnosticado como que tiene una enfermedad o trastorno relacionado con andrógenos, por ejemplo, cáncer de próstata. Por ejemplo, puede introducirse una molécula de ácido nucleico en una célula administrando el ácido nucleico en presencia de lipofección (Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U .S.A. 84:7413, 1987; Ono et al., Neuroscience Letters 17:259, 1990; Brigham et al., Am. J . Med. Sci. 298:278, 1989; Staubinger et al., Methods in Enzymology 101:512, 1983), conjugación con asialo-orosomucoide-polilisina (Wu et al., Journal of Biological Chemistry 263:14621, 1988; Wu et al., Journal of Biological Chemistry 264:16985, 1 <989), o por microinyección en condiciones quirúrgicas (Wolff et al., Science 247:1465, 1990). Preferiblemente, los ácidos nucleicos se administran en combinación con un liposoma o protamina.
La transferencia génica también puede conseguirse usando medios no víricos que implican transfección in vitro. Dichos métodos incluyen el uso de fosfato cálcico, DEAE dextrano, electroporación, y fusión de protoplastos. También pueden ser potencialmente beneficiosos los liposomas para el suministro de ADN en una célula. El trasplante de genes normales en los tejidos afectados de un paciente también puede conseguirse por transferencia de un ácido nucleico normal en un tipo celular cultivable ex vivo (por ejemplo, una célula primaria autóloga o heteróloga o descendencia de la misma), después de lo cual la célula (o sus descendientes) se inyectan en un tejido diana.
La expresión de ADNc para su uso en métodos de terapia de polinucleótido puede estar dirigida a partir de cualquier promotor adecuado (por ejemplo, los promotores de citomegalovirus humano (CMV), virus de simio 40 (SV40), o metalotioneína), y regulado por cualquier elemento regulador de mamífero apropiado. Por ejemplo, si se desea, pueden usarse potenciadores conocidos para dirigir preferentemente la expresión génica en tipos celulares específicos para dirigir la expresión de un ácido nucleico. Los potenciadores usados pueden incluir, sin limitación, los que se caracterizan como potenciadores específicos de tejido o célula. Como alternativa, si un clon genómico se usa como construcción terapéutica, puede mediarse la regulación por las secuencias reguladoras afines o, si se desea, por secuencias reguladoras derivadas de una fuente heteróloga, incluyendo cualquiera de los promotores o elementos reguladores descritos anteriormente.
Otro enfoque terapéutico implica la administración de un agente terapéutico recombinante, tal como una proteína variante del receptor de andrógenos recombinante, variante, o fragmento del mismo, directamente al sitio de un tejido afectado por enfermedad potencial o real o sistémicamente (por ejemplo, por cualquier técnica de administración convencional de proteínas recombinantes). La dosificación de la proteína administrada depende de varios factores, incluyendo el tamaño y salud del paciente individual. Para cualquier sujeto particular, los regímenes específicos de dosificación deben ajustarse en el tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el criterio profesional de la persona que está administrando o supervisando la administración de las composiciones.
Ensayos de detección
Como se presenta en este documento, la expresión de un polipéptido variante del receptor de andrógenos se aumenta en tejidos neoplásicos, y en ejemplos particulares en tejidos neoplásicos de pacientes con enfermedades progresivas. Por consiguiente, los compuestos que modulan la expresión o actividad de un polipéptido variante del receptor de andrógenos, variante, o fragmento del mismo son útiles en los métodos de la descripción para el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno relacionado con andrógenos, tal como cáncer de próstata, o cáncer de próstata avanzado. Están disponibles varios métodos para realizar ensayos de detección para identificar dichos compuestos. En un enfoque, se identifican compuestos candidatos que se unen específicamente a y alteran la actividad de un polipéptido de la descripción (por ejemplo, una actividad de la variante del receptor de andrógenos). Los métodos para ensayar dichas actividades biológicas son conocidos en la técnica y se describen en este documento. La eficacia de dicho compuesto candidato depende de su capacidad de interaccionar con un polipéptido variante del receptor de andrógenos, variante, o fragmento. Dicha interacción puede ensayarse fácilmente usando cualquiera de varias técnicas de unión convencionales y ensayos funcionales (por ejemplo, los descritos en Ausubel et al., supra). Por ejemplo, puede ensayarse un compuesto candidato in vitro para la interacción y unión con un polipéptido de la descripción.
Los métodos convencionales para alterar o reducir la expresión de la variante del receptor de andrógenos incluyen mutar o delecionar una secuencia variante del receptor de andrógenos endógena, impedir la expresión de la variante del receptor de andrógenos usando iARN, o microinyectar una célula que expresa la variante del receptor de andrógenos con un anticuerpo que se une a la variante del receptor de andrógenos e impide su función.
Los agonistas y antagonistas potenciales de un polipéptido variante del receptor de andrógenos incluyen moléculas orgánicas, péptidos, peptidomiméticos, polipéptidos, moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, ARN bicatenarios, ARNip, polinucleótidos antisentido), y anticuerpos que se unen a una secuencia de ácido nucleico o polipéptido de la descripción y de ese modo inhiben o disminuyen su actividad. Los antagonistas potenciales también incluyen moléculas pequeñas que se unen al polipéptido variante del receptor de andrógenos evitando de ese modo la unión a moléculas celulares con las que el polipéptido variante del receptor de andrógenos normalmente interacciona, de modo que se reduzca o inhiba la actividad biológica normal del polipéptido variante del receptor de andrógenos. Las moléculas pequeñas de la descripción tienen preferiblemente un peso molecular por debajo de 2.000 dalton, más preferiblemente entre 300 y 1.000 dalton, y mucho más preferiblemente entre 400 y 700 dalton. Se prefiere que estas moléculas pequeñas sean moléculas orgánicas.
Por ejemplo, un polipéptido recombinante de la descripción puede purificarse por técnicas convencionales a partir de células modificadas por ingeniería para que expresen el polipéptido (por ejemplo, las descritas anteriormente) y pueden inmovilizarse en una columna. Después se pasa una solución de compuestos candidatos a través de la columna, y se identifica una composición específica para el polipéptido variante del receptor de andrógenos en base a su capacidad de unirse al polipéptido variante del receptor de andrógenos e inmovilizarse en la columna. Para aislar el compuesto, la columna se lava para retirar las moléculas unidas de forma no específica, y después se libera el compuesto de interés de la columna y se recoge.
En un ejemplo particular, pueden usarse métodos para aislar un compuesto unido a una microserie de polipéptidos. Los compuestos aislados por este método (o cualquier otro método apropiado) pueden, si se desea, purificarse adicionalmente (por ejemplo, por cromatografía líquida de alto rendimiento). Además, estos compuestos candidatos pueden ensayarse para su capacidad de alterar la actividad biológica de un polipéptido variante del receptor de andrógenos (por ejemplo, variante del receptor de andrógenos, por ejemplo, AR-V1, AR-V2, AR-V3, AR-V4, AR-V5, AR-V6, AR-V7, AR-V8 o fragmentos de los mismos).
Puede utilizarse cualquier sistema de detección de interacción de proteínas in vivo, por ejemplo, cualquier ensayo de doble híbrido para identificar compuestos que interaccionan con un polipéptido variante del receptor de andrógenos. Los compuestos de interacción aislados por este método (o cualquier otro método apropiado) pueden, si se desea, purificarse adicionalmente (por ejemplo, por cromatografía líquida de alto rendimiento). Los compuestos aislados por cualquier enfoque descrito en este documento pueden usarse como agentes terapéuticos para tratar una enfermedad o trastorno relacionado con andrógenos, por ejemplo, cáncer de próstata en un paciente humano.
Además, los compuestos que inhiben la expresión de una molécula de ácido nucleico de la variante del receptor de andrógenos cuya expresión está aumentada en un paciente que tiene una enfermedad o trastorno relacionado con andrógenos, por ejemplo, cáncer de próstata, también son útiles en los métodos reivindicados y descritos. Cualquiera de los varios métodos está disponible para realizar ensayos de detección para identificar nuevos compuestos candidatos que alteren la expresión de una molécula de ácido nucleico de la variante del receptor de andrógenos. En un ejemplo de trabajo, los compuestos candidatos se añaden a concentraciones variables al medio de cultivo de células cultivadas que expresan una de las secuencias de ácido nucleico de la descripción. Después se mide la expresión génica, por ejemplo, por análisis de microserie, análisis de transferencia de Northern (Ausubel et al., supra), o RT-PCR usando cualquier fragmento apropiado preparado a partir de la molécula de ácido nucleico como sonda de hibridación. El nivel de expresión génica en presencia del compuesto candidato se compara con el nivel medido en un medio de cultivo de control que carece de molécula candidata. Un compuesto que promueve una alteración en la expresión del gen variante del receptor de andrógenos, o un equivalente funcional del mismo, se considera útil en la invención si dicha molécula puede usarse, por ejemplo, como agente terapéutico para tratar una enfermedad o trastorno relacionado con andrógenos, por ejemplo, cáncer de próstata en un paciente humano.
En otro enfoque, se mide el efecto del compuesto candidato al nivel de producción de polipéptidos para identificar aquellos que promueven una alteración en un nivel polipeptídico de la variante del receptor de andrógenos. El nivel de polipéptido variante del receptor de andrógenos puede ensayarse usando cualquier método convencional. Las técnicas inmunológicas convencionales incluyen transferencia de Western o inmunoprecipitación con un anticuerpo específico para un polipéptido variante del receptor de andrógenos (por ejemplo, variante del receptor de andrógenos, por ejemplo, AR-V1, AR-V2 , AR-V3, AR-V4, AR-V5, AR-V6, AR-V7, AR-V8 o fragmentos de los mismos). Por ejemplo, pueden usarse inmunoensayos para detectar o controlar la expresión de al menos uno de los polipéptidos de la descripción en un organismo. Pueden usarse anticuerpos policlonales o monoclonales (producidos como se ha descrito anteriormente) que son capaces de unirse a dicho polipéptido en cualquier formato convencional de inmunoensayo (por ejemplo, ELISA, transferencia de Western, o ensayo RIA) para medir el nivel del polipéptido. En algunos aspectos, un compuesto que promueve una disminución en la expresión o actividad biológica del polipéptido se considera particularmente útil. De nuevo, dicha molécula puede usarse, por ejemplo, como agente terapéutico para retardar, mejorar, o tratar una enfermedad o trastorno relacionado con andrógenos, por ejemplo, cáncer de próstata en un paciente humano.
En otro aspecto, un ácido nucleico descrito en este documento (por ejemplo, un ácido nucleico de la variante del receptor de andrógenos) se expresa como fusión transcripcional o traduccional con un indicador detectable, y se expresa en una célula aislada (por ejemplo, célula de mamífero o insecto) bajo el control de un promotor heterólogo, tal como un promotor inducible. La célula que expresa la proteína de fusión después se pone en contacto con un compuesto candidato, y la expresión del indicador detectable en esa célula se compara con la expresión del indicador detectable en una célula de control no tratada. Un compuesto candidato que altera la expresión del indicador detectable es un compuesto que es útil para el tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionado con andrógenos, por ejemplo, cáncer de próstata. En un aspecto, el compuesto disminuye la expresión del indicador.
Cada una de las secuencias de ADN enumeradas en este documento también puede usarse en el descubrimiento y desarrollo de un compuesto terapéutico para el tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionado con andrógenos, por ejemplo, cáncer de próstata. La proteína codificada, tras la expresión, puede usarse como diana para la detección de fármacos. Adicionalmente, las secuencias de ADN que codifican las regiones aminoterminales de la proteína codifica o Shine-Delgarno u otras secuencias que facilitan la traducción del respectivo ARNm pueden usarse para construir secuencias que promueven la expresión de la secuencia codificante de interés. Dichas secuencias pueden aislarse por técnicas convencionales (Ausubel et al., supra).
También se describen nuevos compuestos identificados por los ensayos de detección descritos anteriormente. Opcionalmente, dichos compuestos se caracterizan en uno o más modelos animales apropiados para determinar la eficacia del compuesto para el tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionado con andrógenos, por ejemplo, cáncer de próstata. De forma deseable, la caracterización en un modelo animal también puede usarse para determinar la toxicidad, efectos secundarios, o mecanismo de acción de tratamiento con dicho compuesto. Además, los nuevos compuestos identificados en cualquiera de los ensayos de detección descritos anteriormente pueden usarse para el tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionado con andrógenos, por ejemplo, cáncer de próstata en un sujeto. Dichos compuestos son útiles solos o en combinación con otras terapias convencionales conocidas en la técnica.
Compuestos de ensayo y extractos
En general, los compuestos capaces de inhibir el crecimiento o proliferación de una enfermedad o trastorno relacionado con andrógenos, por ejemplo, cáncer de próstata por alteración de la expresión o actividad biológica de un polipéptido variante del receptor de andrógenos, variante, o fragmento del mismo se identifican a partir de bibliotecas grandes de producto natural o extractos sintéticos (o semisintéticos) o bibliotecas químicas de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. También están disponibles numerosos métodos para generar síntesis aleatoria o dirigida (por ejemplo, semisíntesis o síntesis total) de cualquiera de varios compuestos químicos incluyendo, aunque sin limitación, compuestos basados en sacárido, lípido, péptido, y ácido nucleico. Las bibliotecas de compuestos sintéticos están disponibles en el mercado en Brandon Associates (Merrimack, N.H.) y Aldrich Chemical (Milwaukee, Wis.). Como alternativa, están disponibles en el mercado bibliotecas de compuestos naturales en forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetales y animales en varias fuentes, incluyendo Biotics (Sussex, RU), Xenova (Slough, RU), Harbor Branch Oceangraphics Institute (Ft. Pierce, Fla.), y PharmaMar, EE.UU. (Cambridge, Mass.).
En un aspecto, los compuestos de ensayo de la descripción están presentes en cualquier biblioteca combinatoria conocida en la técnica, incluyendo: bibliotecas biológicas; bibliotecas peptoides (bibliotecas de moléculas que tienen las funcionalidades de péptidos, pero con una nueva estructura no peptídica que es resistente a degradación enzimática pero que no obstante permanece bioactiva; véase, por ejemplo, Zuckermann, R.N. et al., J. Med. Chem.
37:2678-85, 1994); bibliotecas en fase sólida o fase de solución paralelas espacialmente abordables; métodos de biblioteca sintética que requieren deconvolución; el método de biblioteca de "una perla un compuesto"; y métodos de biblioteca sintética usando selección por cromatografía de afinidad. Los enfoques de biblioteca biológica y biblioteca peptoide están limitados a bibliotecas de péptidos, mientras que los otros cuatro enfoques son aplicables a bibliotecas de péptidos, oligómeros no peptídicos o moléculas pequeñas de compuestos (Lam, Anticancer DrugDes. 12:145, 1997).
Ejemplos de métodos para la síntesis de bibliotecas moleculares pueden encontrarse en la técnica, por ejemplo en: DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909, 1993; Erb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37:2678, 1994; Cho et al., Science 261:1303, 1993; Carrell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059, 1994; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061, 1994; y Gallop et al., J. Med. Chem.
37:1233, 1994.
Las bibliotecas se compuestos pueden presentarse en solución (por ejemplo, Houghten, Biotechniques 13:412-421, 1992), o en perlas (Lam, Nature 354:82-84, 1991), chips (Fodor, Nature 364:555-556, 1993), bacterias (Ladner, patente de Estados Unidos n.° 5.223.409), esporas (Ladner patente de Estados Unidos n.°. 5.223.409), plásmidos (Cull et al., Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869, 1992) o en fagos (Scott y Smith, Science 249:386-390, 1990; Devlin, Science 249:404-406, 1990; Cwirlaef et a l, Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382, 1990; Felici, J. Mol. Biol. 222:301-310, 1991; Ladner supra.).
Los expertos en el campo de descubrimiento y desarrollo de fármacos comprenderán que la fuente precisa de un compuesto o extracto de ensayo no es crítica para el procedimiento o procedimientos de detección de la descripción. Por consiguiente, puede detectarse casi cualquier cantidad de extractos químicos o compuestos usando los métodos descritos en este documento. Ejemplos de dichos extractos o compuestos incluyen, aunque sin limitación, extractos basados en plantas, hongos, procariotas o animales, caldos de fermentación, y compuestos sintéticos, así como modificación de compuestos existentes.
Cuando se encuentra que un extracto crudo altera la actividad biológica de un polipéptido variante del receptor de andrógenos, variante, o fragmento del mismo, el fraccionamiento adicional del extracto principal positivo es necesario para aislar constituyentes químicos responsables del efecto observado. Por tanto, el objetivo de la extracción, fraccionamiento y proceso de purificación es la caracterización cuidadosa e identificación de una entidad química dentro del extracto crudo que tiene actividad antineoplásica. Los métodos de fraccionamiento y purificación de dichos extractos heterogéneos son conocidos en la técnica. Si se desea, los compuestos que han demostrado ser agentes útiles para el tratamiento de una neoplasia se modifican químicamente de acuerdo con métodos conocidos en la técnica.
Métodos para ensayar la actividad biológica de la variante del receptor de andrógenos
Los agentes terapéuticos útiles en los métodos descritos incluyen, aunque sin limitación, aquellos que alteran una actividad biológica de la variante del receptor de andrógenos asociada con, por ejemplo, proliferación celular, supervivencia celular, secreción celular, expresión génica. Por ejemplo, en el caso de cáncer de próstata, el crecimiento de células neoplásicas no está sujeto a los mismos mecanismos reguladores que gobiernan el crecimiento o proliferación de células normales y, por consiguiente, compuestos que reduzcan el crecimiento o proliferación del cáncer de próstata son útiles para el tratamiento de cáncer de próstata. Los métodos para ensayar el crecimiento y proliferación celular son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Kittler et al., (Nature. 432 (7020): 1036-40, 2004) y por Miyamoto et al., (Nature 416(6883):865-9, 2002). Los ensayos para la proliferación celular generalmente implican la medición de síntesis de ADN durante la replicación celular. En un aspecto, se detecta la síntesis de ADN usando precursores de ADN marcados, tales como ([3H]-timidina o 5-bromo-2'-desoxiuridina [BrdU], que se añaden a células (o animales) y después se detecta la incorporación de estos precursores en ADN genómico durante la fase S del ciclo celular (replicación) (Ruefli-Brasse et al., Science 302(5650): 1581-4, 2003; Gu et al., Science 302 (5644):445-9, 2003).
Los ensayos para medir la viabilidad celular son conocidos en la técnica, y se describen, por ejemplo, por Crouch et al. (J. Immunol. Meth. 160, 81-8); Kangas et al. (Med. Biol.62, 338- 43, 1984); Lundin et al., (Meth. Enzymol.133, 27­ 42,1986); Petty et al. (Comparison of J . Biolum. Chemilum. 10, 29-34, 1995); y Cree et al. (AntiCancer Drugs 6: 398­ 404, 1995). La viabilidad celular puede ensayarse usando una diversidad de métodos, incluyendo MTT bromuro de (3-(4,5-dimetiltiazolil)-2,5-difeniltetrazolio) (Barltrop, Bioorg. y Med. Chem. Lett.l: 611, 1991; Cory et al., Cancer Comm.
3, 207-12, 1991; Pauli J . Heterocyclic Chem. 25, 911,1988). Los ensayos para la viabilidad celular también están disponibles en el mercado. Estos ensayos incluyen el ensayo de viabilidad celular luminiscente CELLTITER-G LO Luminescent Cell Viability Assay (Promega), que usa tecnología de luciferasa para detectar ATP y cuantificar la salud o cantidad de células en cultivo, y el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo, que es un ensayo de citotoxicidad de lactato deshidrogenasa (LDH).
Los ensayos para medir la apoptosis celular son conocidos para los expertos en la materia. Las células apoptóticas se caracterizan por cambios morfológicos característicos, incluyendo condensación de cromatina, encogimiento celular y formación de ampollas de la membrana, que puede observarse claramente usando microscopia óptica. Las características bioquímicas de apoptosis incluyen fragmentación de ADN, escisión de proteínas en localizaciones específicas, permeabilidad aumentada de la membrana mitocondrial, y la aparición de fosfatidilserina sobre la superficie de membrana celular. Los ensayos para apoptosis son conocidos en la técnica. Ensayos ejemplares incluyen ensayos TUNEL (marcaje en extremo con mella con desoxinucleotidiltransferasa biotina-dUTP terminal), ensayos de actividad caspasa (específicamente caspasa-3), y ensayos para ligando de fas y anexina V. Los productos disponibles en el mercado para detectar apoptosis incluyen, por ejemplo, ensayo de caspasa-3/7 homogénea Apo-ONE®, kit FragEL TUNEL (ONCOGENE RESEARCH PRODUCTS, San Diego, CA), el ensayo de fragmentación de ADN ApoBrdU (BIOVISION, Mountain View, CA), y el kit de detección de escala de a Dn apoptótica Quick (BIOVISION, Mountain View, CA).
Microseries
Los métodos de la descripción también pueden usarse para ensayos basados en microserie que proporcionan el análisis de alto rendimiento de biomarcadores. Las moléculas de ácido nucleico o polipéptidos de la variante del receptor de andrógenos de la descripción son útiles como elementos hibridables de serie en dicha microserie. Los elementos de serie se organizan en un modo ordenado de modo que cada elemento esté presente en una localización especificada sobre el sustrato. Los materiales de sustrato útiles incluyen membranas, compuestos de papel, nylon u otros materiales, filtros, chips, portaobjetos de vidrio, y otros soportes sólidos. La disposición ordenada de los elementos de la serie permite interpretar patrones de hibridación e intensidades como niveles de expresión de genes particulares o proteínas. Los métodos para preparar microseries de ácido nucleico son conocidos para los expertos en la materia y se describen, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos n.° 5.837.832, Lockhart, et al. (Nat. Biotech.
14:1675-1680, 1996), y Schena, et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 93:10614-10619, 1996). Los métodos para preparar microseries de polipéptidos se describen, por ejemplo, por Ge (Nucleic Acids Res. 28:e3.i-e3.vii, 2000), MacBeMh et al., (Science 289:1760-1763, 2000), Zhu et al. (Nature Genet. 26:283-289), y en la patente de Estados Unidos n.° 6.436.665.
Microseries de ácido nucleico
Para producir una microserie de ácido nucleico pueden sintetizase oligonucleótidos o unirse a la superficie de un sustrato usando un procedimiento de acoplamiento químico y un aparato de aplicación de chorro de tinta, como se describe en la solicitud PCT WG95/251116 (Baldeschweiler et al.). Como alternativa, puede usarse una serie reticulada para disponer y vincular fragmentos de ADNc u oligonucleótidos a la superficie de un sustrato usando un sistema de vacío, procedimiento de unión térmica, UV, mecánica o química.
Una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, ARN o ADN) obtenida de una muestra biológica puede usarse para producir una sonda de hibridación como se describe en este documento. Las muestras biológicas generalmente se obtienen de un paciente, preferiblemente en forma de un fluido corporal (tal como sangre, fluido cefalorraquídeo, flema, saliva u orina) o muestra tisular (por ejemplo, una muestra tisular obtenida por biopsia, por ejemplo, tejido de próstata). Para algunas aplicaciones, pueden usarse células cultivadas u otras preparaciones tisulares. El ARNm se aísla de acuerdo con métodos convencionales, y se produce el ADNc y se usa como molde para preparar ARN complementario adecuado para hibridación. Dichos métodos se describen en este documento. El ARN se amplifica en presencia de nucleótidos fluorescentes, y las sondas marcadas después se incuban con la microserie para permitir que la secuencia de la sonda hibride con oligonucleótidos complementarios (por ejemplo, moléculas de ácido nucleico de la variante del receptor de andrógenos) unidos a la microserie.
Las condiciones de incubación se ajustan de modo que, suceda hibridación con coincidencias complementarias precisas y con diversos grados de menor complementariedad dependiendo del grado de rigurosidad empleada. Por ejemplo, la concentración salina rigurosa será habitualmente de menos de NaCl aproximadamente 750 mM y citrato trisódico 75 mM, preferiblemente menos de NaCl aproximadamente 500 mM y citrato trisódico 50 mM y mucho más preferiblemente menos de NaCl aproximadamente 250 mM y citrato trisódico 25 mM. La hibridación de baja rigurosidad puede obtenerse en ausencia de disolvente orgánico, por ejemplo, formamida, mientras que puede obtenerse una hibridación de alta rigurosidad en presencia de al menos formamida aproximadamente al 35 %, y mucho más preferiblemente a al menos formamida al 50 %. Las condiciones rigurosas de temperatura habitualmente incluirán temperaturas de al menos aproximadamente 30 °C, más preferiblemente de al menos aproximadamente 37 °C, y mucho más preferiblemente de al menos aproximadamente 42 °C. Diferentes parámetros adicionales, tales como el tiempo de hibridación, la concentración de detergente, por ejemplo, dodecilsulfato sódico (SDS), y la inclusión o exclusión de ADN vehículo, son bien conocidos para los expertos en la materia. Se consiguen diversos niveles de rigurosidad combinando estas diversas condiciones según lo necesario. En un aspecto, la hibridación sucederá a 30 °C en NaCl 750 mM, citrato trisódico 75 mM, y SDS al 1 %. En otro aspecto, la hibridación sucederá a 37 °C en NaCl 500 mM, citrato trisódico 50 mM, SD S al 1 %, formamida al 35 %, y 100 gg/ml de ADN de esperma de salmón (ADNss) desnaturalizado. En otro aspecto más, la hibridación sucederá a 42 °C en NaCl 250 mM, citrato trisódico 25 mM, SDS al 1%, formamida al 50 %, y 200 gg/ml de ADNss. Variaciones útiles en estas condiciones serán muy evidentes para los expertos en la materia.
La retirada de sondas no hibridadas puede conseguirse, por ejemplo, por lavado. Las etapas de lavado que siguen a la hibridación también pueden variar en rigurosidad. Pueden definirse condiciones rigurosas de lavado por concentración salina y por temperatura. Como anteriormente, puede aumentarse la rigurosidad del lavado disminuyendo la concentración salina o aumentando la temperatura. Por ejemplo, la concentración salina rigurosa para las etapas de lavado preferiblemente será de menos de aproximadamente NaCl 30 mM y citrato trisódico 3 mM, y mucho más preferiblemente menos de aproximadamente NaCl 15 mM y citrato trisódico 1,5 mM. Las condiciones rigurosas de temperatura para las etapas de lavado habitualmente incluirán una temperatura de al menos aproximadamente 25 °C, al menos aproximadamente 42 °C o al menos aproximadamente 68 °C. En un aspecto, las capas de lavado sucederán a 25 °C en NaCl 30 mM, citrato trisódico 3 mM, y SDS al 0,1 %. En otro aspecto, las etapas de lavado sucederán a 42 °C en NaCl 15 mM, citrato trisódico 1,5 mM, y SDS al 0,1 %. En otro aspecto más, las etapas de lavado sucederán a 68 °C en NaCl 15 mM, citrato trisódico 1,5 mM, y SDS al 0,1 %. Variaciones adicionales en estas condiciones serán muy evidentes para los expertos en la materia.
Puede usarse un sistema de detección para medir la ausencia, presencia, y cantidad de hibridación para todas las distintas secuencias simultáneamente (por ejemplo, Heller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94:2150-2155, 1997). Preferiblemente, se usa un escáner para determinar los niveles y patrones de fluorescencia.
Microseries de proteína
Los polipéptidos variantes del receptor de andrógenos (por ejemplo, variante del receptor de andrógenos, por ejemplo, AR-V1, a R-V2, AR-V3, AR-V4, AR-V5, AR-V6, AR-V7, o fragmentos de los mismos), tales como los descritos en este documento, también pueden analizarse usando microseries de proteína. Dichas series son útiles en filtros de bajo coste de alto rendimiento para identificar péptidos o compuestos candidatos que se unan a un polipéptido de la descripción o fragmento del mismo. Típicamente, las microseries de proteína presentan una proteína o fragmento de la misma, unida a un soporte sólido. Los soportes sólidos adecuados incluyen membranas (por ejemplo, membranas compuestas de nitrocelulosa, papel, u otro material), películas basadas en polímero (por ejemplo, poliestireno), perlas, o portaobjetos de vidrio. Para algunas aplicaciones, los polipéptidos variantes del receptor de andrógenos (por ejemplo, variante del receptor de andrógenos, por ejemplo, AR-V1, AR-V2, AR-V3, AR-V4, AR-V5, AR-V6, AR-V7, AR-V8 o fragmentos de los mismos) se aplican puntualmente sobre un sustrato usando cualquier método conveniente conocido para los expertos en la materia (por ejemplo, a mano o por impresora de chorro de tinta). Preferiblemente, dichos métodos retienen la actividad biológica o función de la proteína unida al sustrato (por ejemplo, unión de anticuerpo a la variante del receptor de andrógenos).
La microserie de proteína se hibrida con una sonda detectable. Dichas sondas pueden ser polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo contra la variante del receptor de andrógenos), ácido nucleico, o moléculas pequeñas. Para algunas aplicaciones, las sondas de polipéptido y ácido nucleico se obtienen de una muestra biológica recogida de un paciente, tal como un fluido corporal (tal como sangre, orina, saliva, o flema); una muestra tisular homogeneizada (por ejemplo, una muestra tisular obtenida por biopsia, por ejemplo, de la próstata); o células cultivadas (por ejemplo, linfocitos). Las sondas también pueden incluir anticuerpos, péptidos candidatos, ácidos nucleicos, o compuestos de molécula pequeña derivados de una biblioteca de péptidos, ácidos nucleicos, o química. Las condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, pH, concentración de proteína, y fuerza iónica) se optimizan para promover las interacciones específicas. Dichas condiciones son conocidas para los expertos en la materia y se describe, por ejemplo, en Harlow, E. y Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual. 1998, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratories. Después de la retirada de sondas no específicas, se detectan las sondas unidas específicamente, por ejemplo, por fluorescencia, actividad enzimática (por ejemplo, un ensayo colorimétrico ligado a enzimas), inmunoensayo directo, ensayo radiométrico, o cualquier otro método detectable adecuado conocido para los expertos en la materia.
La detección de un aumento en la cantidad de un polipéptido variante del receptor de andrógenos (por ejemplo, variante del receptor de andrógenos, por ejemplo a R-v 1, AR-V2, AR-V3, AR-V4, AR-V5, AR- V6, AR-V7, AR-V8 o fragmentos de los mismos) o un polinucleótido variante del receptor de andrógenos presente en una muestra de un paciente es útil como diagnóstico para la presencia de una enfermedad o trastorno relacionado con andrógenos, por ejemplo, cáncer de próstata. Opcionalmente, puede combinarse la detección de la variante del receptor de andrógenos con la detección de otros biomarcadores, donde la presencia o nivel del biomarcador se correlaciona con la presencia de una enfermedad o trastorno relacionado con andrógenos, por ejemplo, cáncer de próstata.
Composiciones farmacéuticas
Se describen preparaciones farmacéuticas que comprenden una proteína variante del receptor de andrógenos, un polinucleótido que codifica una proteína variante del receptor de andrógenos, o una molécula de ácido nucleico inhibidora de la variante del receptor de andrógenos (por ejemplo, un polinucleótido que hibrida e impide la expresión de un polinucleótido variante del receptor de andrógenos), junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los polinucleótido de la descripción pueden administrarse como parte de una composición farmacéutica. Las composiciones deben ser estériles y contener una cantidad terapéuticamente eficaz de los polipéptidos o moléculas de ácido nucleico en una unidad de peso o volumen adecuado para administración a un sujeto.
Estas composiciones habitualmente se almacenarán en recipientes unitarios o multidosis, por ejemplo, ampollas selladas o viales, en forma de una solución acuosa o en forma de una formulación liofilizada para reconstitución. Como ejemplo de una formulación liofilizada, se llenan viales de 10 ml con 5 ml de solución de polinucleótido variante del receptor de andrógenos acuosa al 1 % (p/v) filtrada a esterilidad, tal como una solución acuosa de polinucleótido o polipéptido variante del receptor de andrógenos, y la mezcla resultante después puede liofilizarse. La solución de infusión puede prepararse reconstituyendo el material liofilizado usando agua para inyección (WFI) estéril.
El polinucleótido variante del receptor de andrógenos, o polipéptido, o análogos pueden combinarse opcionalmente, con un excipiente farmacéuticamente aceptable. La expresión "excipiente farmacéuticamente aceptable" como se usa en este documento significa uno o más de cargas, diluyentes o sustancias de encapsulación, sólidas o líquidas compatibles que son adecuadas para su administración en un ser humano. El término "vehículo" indica un ingrediente orgánico o inorgánico, natural o sintético, con el que se combina el ingrediente activo para facilitar la administración. Los componentes de las composiciones farmacéuticas también son capaces de comezclarse con las moléculas de la presente descripción y entre s í de un modo que no existe interacción que alteraría sustancialmente la eficacia farmacéutica deseada.
Las composiciones pueden administrarse en cantidades eficaces. La cantidad eficaz dependerá del modo de administración, la afección particular que se esté tratando y el resultado deseado. También puede depender de la fase de la afección, la edad y estado físico del sujeto, la naturaleza de la terapia concurrente, si la hay, y factores similares bien conocidos para el facultativo médico. Para aplicaciones terapéuticas, es esa cantidad suficiente para conseguir un resultado medicamente deseable.
Con respecto a un sujeto que tiene una enfermedad o trastorno relacionado con andrógenos, una cantidad eficaz es suficiente para estabilizar, ralentizar, o reducir la progresión de la enfermedad o trastorno, por ejemplo, la progresión de cáncer de próstata. En general, las dosis de composiciones de polinucleótido activo de la presente descripción serían de aproximadamente 0,01 mg/k por día a aproximadamente 1000 mg/k por día. Se espera que dosis que varían de aproximadamente 50 a aproximadamente 2000 mg/k serán adecuadas. Dosis inferiores resultarán de ciertas formas de administración, tales como administración intravenosa. En el caso de que una respuesta en un sujeto sea insuficiente en las dosis iniciales aplicadas, pueden emplearse dosis mayores (o dosis eficazmente mayores por una vía de suministro diferente, más localizada) en la medida que lo permita la tolerancia del paciente. Se contemplan múltiples dosis por día para conseguir niveles sistémicos apropiados de las composiciones de polinucleótido o polipéptido variante del receptor de andrógenos descrito.
Está disponible una diversidad de vías de administración. Los métodos descritos anteriormente, hablando en líneas generales, pueden ponerse en práctica usando cualquier modo de administración que sea médicamente aceptable, lo que significa cualquier modo que produzca niveles eficaces de los compuestos activos sin causar efectos adversos clínicamente inaceptables. Otros modos de administración incluyen oral, rectal, tópico, intraocular, bucal, intravaginal, intracisternal, intracerebroventricular, intratraqueal, nasal, transdérmico, dentro/sobre implantes, por ejemplo, fibras tales como colágeno, bombas osmóticas, o injertos que comprenden células apropiadamente transformadas, etc., o vías parenterales. Otros enfoques útiles se describen en Otto, D. et al., J . Neurosci. Res. 22: 83-91 y en Otto, D. y Unsicker, K. J . Neurosci. 10: 1912-1921.
Politerapias
Pueden usarse composiciones y métodos descritos en combinación con cualquier terapia convencional conocida en la técnica. En un aspecto, una composición de polinucleótido o polipéptido variante del receptor de andrógenos de la descripción que tiene actividad antineoplásica puede usarse en combinación con cualquier terapia antineoplásica conocida en la técnica. Terapias antineoplásicas ejemplares incluyen, por ejemplo, quimioterapia, crioterapia, hormonoterapia, radioterapia, y cirugía. Una composición del polinucleótido variante del receptor de andrógenos puede incluir, si se desea, uno o más agentes quimioterapéuticos típicamente usados en el tratamiento de una neoplasia, tal como acetato de abiraterona, altretamina, anhidrovinblastina, auristatina, bexaroteno, bicalutamida, BMS184476, sulfonamida de 2,3,4,5,6-pentafluoro-N-(3-fluoro-4-metoxifenill)benceno, bleomicina, N,N-dimetil-L-valil-L-valil-N-metil-L-valil-L-prolil-1 -Lprolina-t-butilamida, caquectina, cemadotina, clorambucilo, ciclofosfamida, 3',4'-dideshidro-4'-desoxi-8'-norvin-caleucoblastina, docetaxol, doxetaxel, ciclofosfamida, carboplatino, carmustina (BCNU),cisplatino, criptoficina, ciclofosfamida, citarabina, dacarbacina (DTIC), dactinomicina, daunorrubicina, dolastatina, doxorrubicina (adriamicina), etopósido, 5-fluorouracilo, finasterida, flutamida, hidroxiurea e hidroxiureataxanos, ifosfamida, liarozol, lonidamina, lomustina (CCNU), mecloretamina (mostaza de nitrógeno), melfalán, isetionato de mivobulina, rizoxina, sertenef, estreptozocina, mitomicina, metotrexato, 5-fluorouracilo, nilutamida, onapristona, paclitaxel, prednimustina, procarbazina, RPR109881, fosfato de estramustina, tamoxifeno, tasonermina, taxol, tretinoína, vinblastina, vincristina, sulfato de vindesina, y vinflunina. Otros ejemplos de agentes quimioterapéuticos pueden encontrarse en Cancer Principles and Practice of Oncology por V.T. Devita y S. Heilman (editores), 6.a edición (15 de febrero de 2001), Lippincott Williams & Wilkins Publishers.
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración, no a modo de limitación, aunque se han proporcionado ejemplos específicos, la descripción anterior es ilustrativa y no restrictiva. Una cualquiera o más de las características de los aspectos descritos previamente pueden combinarse en cualquier modo con una o más características de cualquier otro aspecto en la presente descripción. Además, llegarán a ser evidentes muchas variaciones de la descripción para los expertos en la materia tras la revisión de la memoria descriptiva.
Ejemplos
Los estudios descritos en este documento se centran en parte en AR-V7, una de las variantes con la expresión más abundante y también la mayor actividad. Los estudios presentados aquí muestran que AR-V7 estaba elevado en aproximadamente 20 veces en células de cáncer de próstata resistentes a castración obtenidas de pacientes que murieron de cáncer de próstata metastásico después de fracaso de la hormonoterapia. De forma interesante, también se detectó expresión generalmente inferior pero variada de AR-V7 en cánceres de próstata que no se habían visto influenciados por ablación hormonal, y la mayor expresión de AR-V7 predijo recidiva de PSA después de terapia local en estos pacientes. Estos resultados sugieren que las células de cáncer de próstata resistentes a castración que albergan el marcador distintivo de un AR constitutivamente activo están presentes antes de las hormonoterapias, y estas células pueden propagarse bajo presión selectiva inducida por ausencia de suficientes andrógenos, lo que conduce a cáncer de próstata resistente a castración progresivo.
Los resultados mostrados en este documento son particularmente útiles en métodos para determinar si un sujeto con cáncer de próstata responderá a terapia de andrógenos, donde el nivel de expresión o actividad biológica de un polipéptido variante del receptor de andrógenos o el nivel de expresión de un ácido nucleico de la variante del receptor de andrógenos se determina, y una alteración en el nivel de la expresión o actividad biológica respecto a la expresión o actividad biológica en una referencia indica que el sujeto responderá a terapia de andrógenos. En ciertos casos, el método puede usarse para determinar el pronóstico de un sujeto con cáncer de próstata en remisión clínica.
La decodificación y caracterización de nuevas variantes de AR hace posible detectar y manipular células de cáncer de próstata con señalización de AR constitutivamente activo bajo ablación hormonal completa. Los estudios futuros abordarán la importancia relativa y relevancia clínica de las rutas dependientes de ligando frente a las independientes de ligando hacia el fracaso de la hormonoterapia y se centrarán en el desarrollo de métodos y enfoques para detectar y modificar la ruta de señalización de AR independiente de ligando.
Ejemplo 1. Identificación de exones crípticos de AR.
Se realizaron búsquedas BLAST de las secuencias intrónicas de AR de ~170 kb frente a la base de datos de marcas de secuencias expresadas en seres humanos del National Center for Biotechnology Information. Se encontraron aciertos de alta calidad (99 % de identidad) en el intrón 1 (6 aciertos), intrón 2 (3 aciertos), e intrón 3 (3 aciertos) pero no en el resto de los cuatro exones (véase la Tabla 1, a continuación). La Tabla 1 muestra un resumen de los fragmentos genómicos transcritos dentro de los intrones génicos de AR humano.
Tabla 1
Intrón ID de acceso Tamaño (pb) Identidad Inicio * Final **
1 AA886614 231 99,6 % 66722674 66722904
1 AA577938 293 99,0 % 66723711 66724004
1 AW973726 294 100,0 % 66723711 66724004
1 R89771 382 100,0 % 66725430 66725814
1 AI827337 490 100,0 % 66750976 66751465
1 AW028775 437 99,8 % 66772546 66772983
2 BF327858 202 99,6 % 66791497 66791698
2 BE007634 450 99,6 % 66791497 66791950
2 BE006793 355 100,0 % 66819126 66819482
3 CV379421 270 100,0 % 66826610 66826880
3 CN283227 674 99,3 % 66829412 66830085
3 BF846I56 538 99,7 % 66831722 66832259
4 Ninguno
5 Ninguno
6 Ninguno
7 Ninguno
* Coordenadas de la posición de inicio en el cromosoma X humano de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano de referencia (publicación de marzo de 2006, HG18)
** Coordenadas de la posición de finalización en el cromosoma X humano de acuerdo con el ensamblaje de genoma humano de referencia (publicación de marzo de 2006, HG18)
Estos fragmentos genómicos "intrónicos" transcritos, considerados como exones crípticos putativos, no se cortaron y empalmaron como constan actualmente y, por lo tanto, sus uniones exón-intrón estaban indefinidas. Como un AR funcional muy probablemente retendría el DBD de AR codificado por los exones 2 y 3, tres exones crípticos putativos en el intrón 3 fueron el centro en estos estudios para determinar si se unían y el modo en que se unían (es decir, corte y empalme) con el exón 3 cadena arriba, y su potencial de alterar la fase de lectura abierta de AR (ORF). Se diseñaron cebadores (P1, P2 y P3; Tabla 2, mostrada a continuación) para amplificar y secuenciar transcritos de ARNm que contenían exones que codificaban DBD de AR y los exones crípticos putativos. La Tabla 2 muestra los conjuntos de cebadores usados en el estudio y los correspondientes datos de amplicón.
Tabla 2
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Todos los cebadores, directos e inversos (correspondientes a la hebra complementaria), se muestran en la dirección 5' a 3'.
El conjunto de cebadores 1 (P1) corresponde a TG TCACTATGGAGCTCTCACATGTGG (SEQ ID NO: 15) y CACCTCTCAAATATGCTAGACGAATCTGT (SEQ ID NO: 16).
El conjunto de cebadores 2 (P2) corresponde a TGTCACTATGGAGCTCTCACATGTGG (SEQ ID NO: 17) y GTACTCATTCAAGTATCAGATATGCGGTATCAT (SEQ ID NO: 18).
El conjunto de cebadores 3 (P3) corresponde a TGTCACTATGGAGCTCTCACATGTGG (SEQ ID NO: 19) y CTG TG GATCAG CTACTACCTTCAG CTC (SEQ ID NO: 20).
El conjunto de cebadores 4 (P4) corresponde a G TTG CTCCCG CAAG TTTCCTTCTC (SEQ ID NO: 21) y CTGTTGTGGATGAGCAGCTGAGAGTCT (SEQ ID NO: 22).
El conjunto de cebadores 5 (P5) corresponde a G TTG CTCCCG CAAG TTTCCTTCTC (SEQ ID NO: 23) y TTTGAATGAGGCAAGTCAGCCTTTCT (SEQ ID NO: 24).
El conjunto de cebadores 6 (P6) corresponde a CCATCTTGTCGTCTTCGGAAATGTTATGAAGC (SEQ ID NO: 25) y CTGTTGTGGATGAGCAGCTGAGAGTCT (SEQ ID NO: 26).
El conjunto de cebadores 7 (P7) corresponde a CCATCTTGTCGTCTTCGGAAATGTTATGAAGC (SEQ ID NO: 27) y TTTGAATGAGGCAAGTCAGCCTTTCT (SEQ ID NO: 28).
El conjunto de cebadores 8 (P8) corresponde a CCATCTTGTCGTCTTCGGAAATGTTATGAAGC (SEQ ID NO: 29) y AG CTTCTG G G TTG TCTCCTCAG TG G (SEQ ID NO: 30).
El conjunto de cebadores SF3A3 corresponde a TACGAAAGGAGGAGCTCAATGCAA (SEQ ID NO: 31) y AG ATCTCATTTG G G TG CTTCCG G T (SEQ ID NO: 32).
El conjunto de cebadores 9 (P9) corresponde a TGTCACTATGGAGCTCTCACATGTGG (SEQ ID NO: 37) y CATTGTGGCCAACATGACACTTCA (SEQ ID NO: 38).
La detección y posterior secuenciación de los amplicones derivados de las células CWR22Rv1 confirmaron que lo tres exones crípticos (CE1, CE2, y CE3) se unían con el exón 3 (Fig. 1A). Estos resultados de secuenciación se usaron para construir siete variantes de transcrito de AR, llamados AR-V1 a AR-V7, que contienen, cada uno, uno de los tres exones crípticos originales (Fig. 1A). El análisis de los transcritos que contenían el exón críptico 1 (CE1) también descubrió un exón críptico adicional en el intrón 2, llamado CE4 (Fig. 1A), que se cortó y empalmó tanto en AR-V3 como AR-V4 (Fig. 1A). La posición genómica de CE4 es idéntica al nuevo exón recién publicado por Dehm y colaboradores (9), pero la secuencia específica presentada difería de las secuencias consenso que se detectaron en las dos variantes que contenían CE4 (AR-V3 y AR-V4; Fig. 1A). CWR22Rv1 es una línea celular PCa humana derivada de un xenoinjerto de PCa trasplantado en serie que sufría recidiva después de regresión inducida por castración y se sabe que tiene un exón 3 duplicado único (13). El exón 3 duplicado se reflejaba en los transcritos AR-V2 y AR-V4 (Fig. 1A). AR-V5 y AR-V6 contenían el exón críptico 2 (CE2) y difería por una secuencia de 80 pb contiguas en la unión 5' de CE2 debido a sitios de corte y empalme 5' alternativos espaciados por 80 pb en CE2 (datos no mostrados). De importancia, las siete variantes de AR albergan codones de terminación prematura (PTC) cadena abajo de DBD de AR, que genera proteínas AR truncadas en LBD de AR si se traducen (Fig. 1A).
En ejemplos preferidos, se usa P9 para amplificar AR-V8.
Ejemplo 2. Clonación de las ORF de longitud completa de AR-V1 y AR-V7.
El análisis de RT-PCR semicuantitativo en un conjunto pequeño de muestras clínicas detectó los transcritos variantes prevalentemente en muestras HRPC (Fig. 1B). Las ORF de longitud completa de AR-V1 y AR-V7 después se amplificaron a partir de dos muestras HRPC clínicas y células CWR22Rv1 (Fig. 1C). El análisis de secuencia de los amplicones de longitud completa confirmó la ORF intacta de NTD y DBD de AR y, por tanto, la estructura del transcrito para AR-V1 y AR-V7. Debido a su abundancia inferior relativa (Fig. 1B), AR-V5 y AR-V6 no se prosiguieron adicionalmente para clonación de ORF de longitud completa. AR-V2 y AR-V4 fueron específicos para CWR22Rv1 (datos no mostrados) debido a la presencia de la duplicación del exón 3 y por lo tanto tampoco se prosiguieron adicionalmente. AR-V3 alberga un codón de parada en CE4 y carecería del segundo dedo de zinc de DBD de AR codificado por el exón 3. Dichas variantes no pueden ser funcionales de acuerdo con el estudio previo (14), aunque el estudio de Dehm y colaboradores (9) sugería otra cosa. Además, la ORF de longitud completa para AR-V3 hasta ahora no se ha detectado en clones secuenciados (datos no mostrados). Por estas razones, solamente AR-V1 y AR-V7 se prosiguieron adicionalmente.
Ejemplo 3. Análisis de expresión de AR-V1 y AR-V7.
Muestras HRPC expresaban de forma constante niveles mayores de AR-V1, AR-V7, y el AR prototipo detectado usando conjuntos de cebadores optimizados específicos para cada transcrito diana (Fig. 2A). La expresión del AR prototipo puede detectarse fácilmente en 28 ciclos de PCR, mientras que la detección de las variantes de AR, a niveles de ARNm, respecto al AR prototipo (Fig. 2A). La RT-PCR a tiempo real cuantitativa de AR-V1, AR-V7, y el AR prototipo se realizó en una serie expandida de tejidos de próstata humana (n = 124) y líneas celulares (n = 9; véase la Figura 5). Los niveles de expresión de AR-V1, AR-V7, y AR prototipo fueron significativamente mayores en HRPC (n = 25) que en PCa virgen a tratamiento hormonal (n = 82; P < 0,0001, ensayo de Mann-Whitney). Ajustados para la eficacia de amplificación, los valores de expresión promedio para AR prototipo (véase la Figura 6A), AR-V1 (véase la Figura 6B), y AR-V7 (Fig. 2B) estaban elevados en 11, 22, y 20 veces respectivamente, en comparación con PCa virgen a tratamiento hormonal. Es improbable que los intermedios de corte y empalme nuclear del gen AR prototipo contribuyera a señales de la variante de A r detectada porque el ARN contribuía en < 5 % de la señal en comparación con el ARN citoplasmático en una base celular (véase la Figura 7). Un subconjunto de PCa virgen a tratamiento hormonal expresaba variantes de AR a niveles comparables con aquellos en muestras HRPC (Fig. 2B). Esta expresión elevada de AR-V7 se asoció con peor resultado clínico (rango log P = 0,012), como se define por recidiva del antígeno específico de próstata (PSA) después de tratamiento quirúrgico (Fig. 2C), en 66 casos RRP para los cuales estaban disponibles datos de seguimiento clínico a largo plazo. En este mismo conjunto de muestras (n = 66), niveles mayores de ARNm de AR prototipo no predijeron el fracaso de PSA (véase la Figura 8A). Asimismo, una relación mayor de V7/AR no predijo el fracaso de PSA (véase la Figura 8B), aunque pareció haber una tendencia. La expresión de AR-V1 no estuvo asociada con este resultado clínico (rango log P = 0,498; datos no mostrados). Se desconoce por qué AR-V1 y AR-V7, aunque ambos se sobreexpresaban en muestras HRPC, diferían en su asociación con recidiva de PSA. Cabe señalar que nuestro análisis preliminar predijo que secuencias específicas de variante AR-V1 (Fig. 1A) carecen de los aminoácidos básicos característicos de la secuencia de localización nuclear bipartita (15) y por lo tanto no pueden ser un receptor nuclear completamente funcional (datos no mostrados).
La Tabla 3. Mostrada a continuación, muestra terapias de andrógenos y los sitios metastásicos de los casos HPRC ensayados.
Tabla 3
A n.2 Valor de
Gleason a DX Terapias dirigidas a andrógenos
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Met. ensayadas
2 leuprolida, flutamida Hígado
7 leuprolida, flutamida Subdural
8 goserelina, flutamida Hígado
9 leuprolida, flutamida LN periportal
10 goserelina, flutamida LN perigástrico
16 leuprolida, flutamida Suprarrenal
17 leuprolida, flutamida LN hiliar
19 ** leuprolida, flutamida LN pélvico
19 ** leuprolida, flutamida Hueso (húmero)
21 leuprolida, flutamida Tejido blando de cresta ilíaca
23 goserelina Hígado
24 leuprolida, flutamida Met. pericárdica
26 goserelina, flutamida Hueso (T12)
27 leuprolida, flutamida LN axilar
28 leuprolida, flutamida
orquiectomía LN mediastinal anterior
29 goserelina, flutamida LN inguinal
30 leuprolida, flutamida Hígado
31 goserelina, flutamida Subdural
32 orquiectomía Hueso (costilla)
33
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orquiectomía subdural
34 5 leuprolida, flutamida Hígado
* Se preparó y ensayó un total de 21 lesiones de cáncer de próstata refractario a hormonas, metastásicas, seccionadas, validadas patológica y anatómicamente, obtenidas de 20 casos de autopsias.
** Se ensayaron dos met. distantes del caso número 19.
Ejemplo 4. AR-V7 se traduce y es activo constitutivamente.
Las variantes de transcrito que albergan PTC pueden someterse a descomposición mediado por sin sentido (16). De hecho, aunque se han caracterizado previamente variantes similares de transcrito para otros miembros de la familia del receptor de hormonas esteroides (17), no se ha mostrado de forma fiable producto proteico correspondiente. Usando la secuencia de péptido único codificada por CE3 de AR, se generaron anticuerpos policlonales específicamente contra AR-V7. Los anticuerpos reconocían una única banda del tamaño esperado (80 kDa) en VCaP y células CWR22RV1 (Fig. 3A), que expresaban los mayores niveles de ARNm de AR-V7 (Figura 5). Asimismo, se detectó la proteína AR-V7 en extractos de proteína de estas dos líneas celulares que estaban enriquecidas para proteínas AR por IP con un anticuerpo contra el NTD de AR (Fig. 3B). Además, el anticuerpo detectó el antígeno AR-V7 en dos muestras HRPC clínicas usando tanto lisados de tejido completo como extractos concentrados de IP (Fig. 3C). Además, usando extractos proteicos concentrados por IP, se detectó expresión de la proteína AR-V7 en 10 de 14 xenoinjertos PCa humanos, 12 de los cuales se obtuvieron de pacientes HRPC (18), pero en solamente 1 de las 9 muestras de prostatectomía radical vírgenes a tratamiento hormonal (Figura 9). En CW R22Rv1, la supresión mediada por ARN interferente pequeño de la expresión de AR-V7 o la reducción de AR-V7 usando anti-AR-V7 provocó en ambos casos una reducción significativa de la banda habitualmente observada de proteína de 80 kDa, pero no afectó a la expresión de AR prototipo (Figura 10), lo que sugiere niveles casi equivalentes de AR-V7 y proteína AR prototipo en esta línea celular. Aunque el AR prototipo respondió al tratamiento de andrógenos por localización en el núcleo, una gran fracción de AR-V7 endógeno se localizaba en el núcleo en ausencia de andrógenos y la proporción de AR-V7 nuclear no cambiaba con estimulación de andrógenos (Fig. 3D). El papel funcional putativo de AR-V7 se investigó usando AR-V7 transfectado de forma exógena en células PC-3 AR negativas. AR-V7 se localizaba en el núcleo (Fig. 4A) e inducía expresión del gen indicador PSA de un modo independiente de andrógenos (Fig. 4B). Además, en células LNCaP sensibles a andrógenos AR-V7 inducía genes sensibles a andrógenos canónicos, tales como KLK3, KLK2, NKX3-1, FKBP5, y TM PRSS2, en ausencia de andrógenos, como se muestra por el análisis de expresión génica global después de transfección del ADNc de AR-V7 exógeno en células LNCaP (Fig. 4C).
La hormonoterapia para PCa avanzado se consigue muy habitualmente por orquiectomía, administración sistémica de agonistas de LHRH (por ejemplo, leuprolida), y/o antiandrógenos (por ejemplo, bicalutamida). Existen inconvenientes significativos asociados con todos los enfoques existentes de manipulación de andrógenos. En primer lugar, un período variable de regresión clínica está seguido por progresión a HRPC, una manifestación letal de la enfermedad que es resistente a terapias adicionales (4). En segundo lugar, existen consecuencias debilitantes a partir de estos tratamientos que deben considerarse cuando se decide si se comienza una hormonoterapia y en qué momento (2). Además, siguen estando presentes niveles suficientes de andrógenos locales en pacientes tratados con bloqueo combinado de andrógenos (19). A pesar de estos retos, las hormonoterapias siguen siendo el pilar de tratamiento para pacientes con PCa avanzado principalmente debido a las respuestas clínicas a menudo drásticas. El descubrimiento de múltiples variantes de AR truncadas en LBD que median funciones AR independientes de andrógenos en HRPC y un subconjunto de PCa avanzados pero vírgenes a tratamiento hormonal añade otro nivel de detalle a los mecanismos moleculares complejos subyacentes al desarrollo de HRPC y pueden sugerir nuevos enfoques de diagnóstico y terapéuticos que abordan esta enfermedad letal. De hecho, estos hallazgos refuerzan los argumentos para abordar de forma específica el NTD de AR para conseguir la anulación completa de la señalización de AR (20). Nuestros datos de ARNm cuantitativo sugirieron que AR-V7 es una variante de baja abundancia respecto al AR prototipo en la inmensa mayoría de muestras clínicas, incluyendo HRPC (Figura 11). La contribución relativa del AR prototipo y las variantes de AR menos abundantes, aunque independientes de andrógenos al desarrollo de HRPC es actualmente desconocida y requerirá investigación detallada. No obstante, la detección de dichas variantes en tejidos o células diana apropiados, en el refinamiento adicional de los métodos de detección, puede predecir o controlar la eficacia de la hormonoterapia y podría ayudar potencialmente a guiar el proceso de toma de decisiones acerca del tipo y cronología de terapias dadas a pacientes con PCa avanzado.
Ejemplo 5. Desarrollo y ensayo del anticuerpo monoclonal contra AR-V7.
Se ha demostrado que AR-V7 está elevado en 20 veces después del fracaso de la hormonoterapia, y niveles mayores de AR-V7 predicen recidiva de PSA (Hu et al. Cancer Research 69(1): 16-22, 2009). Sin embargo, estos hallazgos se basaron en niveles de ARNm. En un entorno clínico, la determinación de los niveles de ARNm puede ser difícil. Además, aunque se han generado anticuerpos policlonales (Hu et al. Cancer Research 69(1): 16-22, 2009), los anticuerpos policlonales solamente funcionaban para transferencia de Western e inmunoprecipitación. Los resultados descritos en este documento describen experimentos centrados en la generación de anticuerpos monoclonales contra AR-V7. Los resultados mostrados en las figuras 12-19 demuestran que el clon 2D12 es muy específico para AR-V7, que 2D12 funciona en transferencia de Western, inmunofluorescencia, e inmunohistoquímica. La disponibilidad de 2D12 hace posible detectar el antígeno en un entorno clínicamente relevante. Tienen que desarrollarse y validarse ensayos de diagnóstico y pronóstico usando este anticuerpo en ensayos clínicos futuros.
Ejemplo 6: Descubrimiento de AR-V8 usando microserie de expresión completa.
Los métodos basados in silico descritos anteriormente dependían de secuencias depositadas en el dominio público en la fase de descubrimiento, por lo tanto, no son completos. Es posible que hubiéramos capturado solamente una fracción de las variantes de AR. Este perfil incompleto de variante de AR podría limitar las elecciones para validación de biomarcadores y desarrollo terapéutico. Para abordar estas limitaciones, indagamos el gen completo del receptor de andrógenos humano y las cercanías inmediatas, ~200 kb de longitud, usando series completas genómicas. Este enfoque completo, hasta ahora realizado en dos muestras (CWR22Rv1 y TURP2), confirmó algunas de las variantes de AR previamente caracterizadas, y descubrió una nueva variante de A r , AR-V8, que se expresa abundantemente en base a la intensidad de señal global mostrada en la Figura 20. Las uniones de corte y empalme para AR-V8 se han definido y se ha validado la secuencia de nucleótidos específica de variante (SEQ ID NO: 39) y se dedujo de forma similar la secuencia peptídica específica de variante (SEQ ID NO: 40).
Materiales y Métodos
Los ejemplos descritos en este documento se realizaron usando, aunque sin limitación, los siguientes materiales y métodos.
Muestras de tejido de próstata humana
Se recogieron muestras de tejido de próstata virgen a tratamiento hormonal usadas en este estudio (n = 82) y se congelaron frescas en el momento de prostatectomía retropúbica radical (RRP), desde 1993 hasta 2001, en el Johns Hopkins Hospital. Las muestras de próstata se procesaron como se ha descrito previamente antes de la extracción de ARN (10). Las muestras HRPC se recogieron en el momento de la operación de resección transuretral de la próstata (TURP) en pacientes que obtuvieron hormonoterapias fallidas (n = 4) o tejidos HRPC metastásicos (n = 21) recogidos de 20 pacientes que murieron de PCa, como parte del estudio de autopsias de Johns Hopkins de PCa letal (Tabla suplementaria S1; ref. 11). El uso de muestras quirúrgicas y de autopsia para análisis molecular se aprobó por el consejo de revisión institucional de medicina de Johns Hopkins.
Clonación y secuenciación de variantes de AR
Se realizó síntesis de ADNc de primera hebra usando 500 ng de ARN total, 0,5 Ag de oligo(dT), y 200 unidades de transcriptasa inversa SuperScript II (Invitrogen) en un volumen de 20 Al. Los productos de PCR derivados de los pares de cebadores (Tabla suplementaria S2) se clonaron en el vector TopoTA (Invitrogen) y se sometieron a análisis de secuenciación usando el analizador de ADN Applied Biosystems 3730x1. Para facilitar la amplificación y secuenciación de NTD de AR rico en GC, se añadió DMSO (al 10 %) en la PCR para clonación de la variante de longitud completa y posterior análisis de secuenciación.
Análisis de expresión de ARNm de la variante de AR
Para el análisis de PCR con transcripción inversa (RT-PCR) semicuantitativa, se usó el 2,5 % del producto de ADNc de los 500 ng de ARN total introducido para cada muestra y cada transcrito. Para RT-PCR cuantitativa a tiempo real, se usó el 0,125 % del producto de ADNc en los ensayos iQ SYB R Green Supermix (Bio-Rad). Dada la expresión altamente variable de muchos genes entre las muestras clínicas, analizamos datos de microserie de expresión publicados previamente e identificamos SF3A3, que codifica un factor de corte y empalme, como gen de referencia para normalización debido a sus niveles estables de expresión entre diversas muestras de próstata, incluyendo HRPC, principalmente PCa, muestras de próstata normal, y líneas celulares (12). Se usaron solamente pares de cebadores con especificidad de amplificación validada. (Tabla suplementaria S2). Después de la validación de eficacias de amplificación iguales tanto para los transcritos diana como SF3A3, se usaron números de ciclo umbral promedio (Ct) de reacciones ejecutadas por triplicado para análisis de umbral comparativo. Para propósitos de presentación y para comparación entre diferentes figuras, todos los valores de expresión se transformaron a log2 con valores medibles para los casos RRP centrados en cero.
Análisis de proteína variante de AR
Se prepararon lisados de células completas usando tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (Pierce) de acuerdo con las recomendaciones del proveedor. Se prepararon extractos nucleares y citosólicos usando los reactivos de extracción nuclear y citoplasmática (Pierce). Se resolvieron las muestras proteicas en geles de SDS-PAGE con gradiente del 4 % al 12 % y se sometieron a análisis de inmunotransferencia convencional con anticuerpos anti-ARN(N20) (Santa Cruz Biotechnology), anti-AR-V7, o anti-beta-actina (Sigma-Aldrich). Se reveló el anticuerpo policlonal de ratón anti-AR-V7 usando el péptido COOH-terminal (CKHLKMTRP) específico para la proteína AR-V7 por un proveedor comercial (A&G Pharmaceutical). Para inmunoprecipitación (IP), se precipitó un total de 300 pg de lisados de célula completa introducidos de líneas celulares o tejidos humanos con 4 pg de anticuerpo monoclonal anti-AR(441) (Santa Cruz Biotechnology) o IgG de ratón de control, seguido por la adición de proteína G-agarosa (GE Healthcare), y se sometieron a análisis de inmunotransferencia convencional.
Ensayo indicador de luciferasa
pEGFP-AR y pEGFP-Q640X, que contienen el AR prototipo de longitud completa y el ADNc mutante truncado en LBD Q640X de AR, fueron donaciones amables de la Dra. Jocelyn Céraline (Université Strasbourg, Estrasburgo, Francia). El ADNc que codifica el AR-V7 de longitud completa se insertó en el vector pEGFP-C3 para expresar la proteína de fusión GFP-AR-V7. Cada una de estas construcciones se cotransfectó junto con el plásmido indicador de luciferasa PSAP1 y el plásmido pRL-CMV, un control interno de transfección de luciferasa de Renilla. Las células transfectadas se cultivaron en RPMI 1640 libre de rojo fenol que contenía suero separado con carbón al 10 % (CSS) durante 24 h y se cultivaron durante otras 24 h en presencia o ausencia de R1881 (NEN) antes de recogerse y someterse al ensayo indicador de luciferasa doble (Promega).
Análisis de serie completa
Se diseñaron microseries de expresión completa para cubrir un intervalo de 200 kb del cromosoma X (chrX: 66.680.000-66.880.000) que abarca el gen AR humano completo y las cercanías inmediatas, a espaciado de 50 pb con solapamiento de 10 pb. Se incluyeron sondas tanto para la hebra con sentido como antisentido. Se excluyeron sondas con elementos repetitivos y múltiples aciertos en el genoma humano. Las secuencias genómicas en formato de texto FASTA se cargaron en el servidor Agilent eArray en la pestaña de cobertura simple y se procesaron para la fabricación de esta serie personalizada. El método de marcaje rutinario implica incorporación de aminoalil-dUTP durante la síntesis de ADNc seguido por acoplamiento con NHS-Cye5 monofuncional. Los productos marcados hibridarían frente a sondas correspondientes al ADN de hebra con sentido. Este método requiere al menos 20 gg de ARN introducido y a menudo está limitado por la baja eficacia de marcaje específicamente para transcritos diana con región no traducida 3' larga (UTR). Además, todos los transcritos (no solamente AR) estarían marcados, aumentando la probabilidad de hibridación no específica. El método descrito aprovecha la distancia conocida entre el exón 1 y el inicio de los exones crípticos. Se usó un cebador Eberwine T7 modificado con el promotor T7 central en la síntesis de ADNc de segunda hebra. Después de una ronda adicional de síntesis de ADN cebada con poli T, se generaron moldes de ADN bicatenarios con sitios de unión 5' para amplificación lineal de ARN convencional. Estos ARN con sentido marcados hibridarán con sondas antisentido en la serie completa. Los datos de serie completa se vieron con el Affymetrix Integrated Genome Browser.
Análisis estadístico
Todos los datos se analizaron usando el software de análisis estadístico Stata v10.0 (Stata Corp.). Se usó el ensayo de Mann-Whitney para evaluar las diferencias de distribución entre dos grupos. Se usó regresión de riesgos proporcionales de Cox para identificar factores pronósticos significativos para la predicción de supervivencia sin progresión de PCa. La suposición de riesgos proporcionales se verificó por examen de diagramas residuales y residuales de Schoenfeld. Se usó rango log para ensayar la equidad de las funciones de supervivencia entre dos grupos. La significación estadística en este estudio se estableció a P V 0,05.
Las siguientes referencias específicas se indican anteriormente por el correspondiente número de referencia.
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Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un método in vitro de diagnóstico de cáncer de próstata resistente a hormonas basándose en un biomarcador que es una proteína o un polinucleótido que tiene una alteración en el nivel de expresión o actividad que está asociado con cáncer de próstata resistente a hormonas, comprendiendo el método:
(i) determinar el nivel de expresión de un ácido nucleico que tiene una secuencia que es o es complementaria a una variante del gen del receptor de andrógenos (AR) que tiene la SEQ ID NO: 1 (AR-V7) o una secuencia que es al menos un 90 %, 95 % o 99 % idéntica a la misma en una muestra tomada de un sujeto, o;
(ii) determinar el nivel de expresión de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por una variante del gen del receptor de andrógenos (AR) que tiene la SEQ ID NO: 8 (AR-V7) p una secuencia que es al menos un 90 %, 95 % o 99 % idéntica a la misma, en una muestra tomada de un sujeto,
en el que un nivel aumentado de expresión con respecto a una referencia seleccionada entre una muestra del sujeto de control o una muestra del sujeto obtenida de un punto temporal anterior es indicativo de cáncer de próstata resistente a hormonas.
2. El método de la reivindicación 1, en el que la expresión de una molécula de ácido nucleico de variante del receptor de andrógenos se detecta usando reacción de hibridación, que comprende hibridar la muestra a uno o más conjuntos de cebadores.
3. El método de la reivindicación 2, en el que el conjunto de cebadores incluye cebadores de suficiente longitud y secuencia apropiada para poder iniciar la síntesis de un producto de extensión de cebador.
4. El método de la reivindicación 3, en el que la reacción de hibridación es una reacción en cadena de la polimerasa.
5. El método de la reivindicación 4, en el que la reacción en cadena de la polimerasa es o comprende una reacción de RT-PCR.
6. El método de la reivindicación 4, en el que la reacción en cadena de la polimerasa es o comprende una reacción que implica acoplar una molécula de tinte fluorogénico y un resto inactivador al mismo o a diferentes sustratos oligonucleotídicos.
7. El método de la reivindicación 4, en el que la reacción en cadena de la polimerasa es o comprende una reacción que implica unir un tinte fluorogénico que emite una señal fluorescente tras la unión.
8. El método de la reivindicación 2, en el que los cebadores del conjunto de cebadores comprenden más de 8 desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos.
9. El método de la reivindicación 8 , en el que cada uno del uno o más conjuntos de cebadores comprende un cebador directo y un cebador inverso, en el que el cebador directo es complementario a una secuencia de ácido nucleico correspondiente a la SEQ ID NO: 1 o fragmentos de la misma y el cebador inverso es complementario a una secuencia de ácido nucleico correspondiente a la SEQ ID NO: 1.
10. El método de la reivindicación 2, en el que cada cebador del conjunto es o es complementario a al menos 8 restos de la SEQ ID NO: 1.
11. El método de la reivindicación 10, en el que el conjunto de cebadores es específico de variante del receptor de andrógenos.
12. El método de la reivindicación 2, en el que el conjunto de cebadores usado para detectar AR-V7 es TGTCACTATGGAGCTCTCACATGTGG (SEQ ID NO: 19) y
CTGTGGATCAGCTACTACCTTCAG (SEQ ID NO: 20); o
G TTG CTCCCG CAAG TTTCCTTCTCT (SEQ ID NO: 23) y
TTTGAATGAGGCAAGTCAGCCTTTCT (SEQ ID NO: 24) o
CCATCTTGTCGTCTTCGGAAATGTTATGAAGC (SEQ ID NO: 27) y
TTTGAATGAGGCAAGTCAGCCTTTCT (SEQ ID NO: 28).
13. El método de la reivindicación 1, en el que la muestra biológica se selecciona entre el grupo que consiste en: biopsia de tejido de cáncer de próstata, muestras quirúrgicas o de autopsia, una muestra de líquido biológico, sangre, plasma sanguíneo, suero y orina o combinaciones de las mismas.
14. Un kit diagnóstico para la detección de una variante de AR que es AR-V7 que tiene la SEQ ID NO: 1 o una secuencia que es al menos un 90 %, 95 % o 99 % idéntica a la misma, comprendiendo dicho kit un conjunto de cebadores que amplifica la variante de AR.
15. El kit de diagnóstico de la reivindicación 14, en el que el conjunto de cebadores se usa para detectar AR-V7 y es TGTCACTATGGAGCTCTCACATGTGG (SEQ ID NO: 19) y
CTGTGGATCAGCTACTACCTTCAG (SEQ ID NO: 20); o
G TTG CTCCCG CAAG TTTCCTTCTCT (SEQ ID NO: 23) y
TTTGAATGAGGCAAGTCAGCCTTTCT (SEQ ID NO: 24) o
CCATCTTGTCGTCTTCGGAAATGTTATGAAGC (SEQ ID NO: 27) y
TTTGAATGAGGCAAGTCAGCCTTTCT (SEQ ID NO: 28).
16. Un kit de diagnóstico para la detección de una variante de AR que es AR-V7 que tiene la SEQ ID NO: 8 o una secuencia que es al menos un 90 %, 95 % o 99 % idéntica a la misma, comprendiendo dicho kit un anticuerpo anti-AR-V7 humano que se une específicamente al epítopo CKHLKMRP correspondiente a la SEQ ID NO: 33.
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