ES2827194T3 - Moduladores de la concentración de cloruro intracelular para el tratamiento del síndrome del X frágil - Google Patents

Abstract

Una composición para su uso en el tratamiento del síndrome de X frágil en un sujeto que lo necesita, en donde dicha composición comprende un modulador de un transportador de cloruro, en donde dicho modulador es un inhibidor de un transportador implicado en la importación de cloruro en las neuronas, en donde dicho transportador es NKCC1, en donde el inhibidor de NKCC1 se selecciona del grupo que consiste en bumetanida, un análogo de bumetanida, furosemida, ácido etacrínico, torsemida, azosemida, muzolimina, piretanida, y tripamida, y en donde el análogo de bumetanida se selecciona del grupo que consiste en aldehído de bumetanida, dibencilamida de bumetanida, dietilamida de bumetanida, éster morfolinoetílico de bumetanida, éster 3-(dimetilaminopropílico) de bumetanida, éster N,N-dietilglicolamida de bumetanida, éster dimetilglicolamida de bumetanida, éster pivaxetílico de bumetanida, éster metoxi(polietilenoxi)n-1-etílico de bumetanida, sal de benciltrimetil-amonio de bumetanida, sal cetiltrimetilamonio de bumetanida, éster pivaloiloximetílico de bumetanida, éster metílico de bumetanida, éster N,Ndimetilaminoetílico de bumetanida, tioácido [-(C=O)-SH] de bumetanida, tioéster S-metílico de bumetanida, tioéster S cianometílico de bumetanida, tioéster S-etílico de bumetanida, tioéster S-isoamílico de bumetanida, tioéster S-octílico de bumetanida, tioéster S-bencílico de bumetanida, tioéster S-(morfolinoetílico) de bumetanida, tioéster S-[3- (dimetilaminopropílico)] de bumetanida, tioéster S-(N,N-dietilglicolamido) de bumetanida, tioéster S-(N,Ndimetilglicolamido) de bumetanida, tioéster S-pivaxetílico de bumetanida, tioéster S-propaxetílico de bumetanida, tioéster S-(metoxipolietilenoxi)n-1-etílico] de bumetanida, sal de tioácido [-(C=O)-S-] benciltrimetil-amonio de bumetanida y sal de tioácido [-(C=O)-S] cetiltrimetilamonio de bumetanida; tioácido de bumetanida metaestable, tioaldehído de bumetanida, tioéster O-metílico de bumetanida, tioéster O-cianometílico de bumetanida, tioéster Oetílico de bumetanida, tioéster O-isoamílico de bumetanida, tioéster O-octílico de bumetanida, tioéster O-bencílico de bumetanida, tioéster O-(morfolinoetílico) de bumetanida, tioéster O-[3-(dimetilaminopropílico)] de bumetanida, tioéster O-(N,N-dietilglicolamido) de bumetanida, tioéster O-pivaxetílico de bumetanida, tioéster O-propaxetílico de bumetanida, tioéster O-[metoxi(polietilenoxi)n-1 etílico] de bumetanida, sal de tioácido [-(C=S)-O-] benciltrimetil-amonio de bumetanida y sal de tioácido [-(C=S)-O-] cetiltrimetilamonio de bumetanida.

Description

DESCRIPCIÓN

Moduladores de la concentración de cloruro intracelular para el tratamiento del síndrome del X frágil

Campo de la invención

La presente invención se refiere al tratamiento del síndrome del X frágil. Más específicamente, la presente invención se refiere a un método para tratar el síndrome del X frágil en un sujeto que lo necesita, en donde dicho método comprende modular el nivel intracelular de cloruro, tal como, por ejemplo, administrando al sujeto un modulador de un transportador de cloruro.

Antecedentes de la invención

El síndrome del X frágil es la forma hereditaria más común de retraso mental, que afecta aproximadamente a 1 de cada 4.000 niños y aproximadamente 1 de cada 8.000 niñas.

El síndrome del X frágil (FXS) es un trastorno genético causado por la expansión de una repetición del trinucleótido CGG en la región 5' no traducida (5'-UTR) del gen 1 del retraso mental del X frágil (FMR1), que está localizado en el cromosoma X. La mutación da como resultado una expresión reducida o ausente de la proteína de retraso mental del X frágil (FRMP). Aunque no se conoce la función exacta de las FRMP, las evidencias experimentales han mostrado que su expresión normal es necesaria para el desarrollo neuronal normal.

Dependiendo, al menos en parte, de la longitud de la expansión de la repetición CGG, los pacientes con FXS presentarán varios grados de gravedad de los síntomas. Los principales síntomas asociados con el FXS son el retraso mental y las discapacidades de aprendizaje, en particular, retrasos en el aprendizaje de cómo sentarse, caminar y hablar. Como consecuencia, los pacientes con FXS suelen presentar un habla nerviosa o confusa. Además, los pacientes con FXS pueden tener deficiencias en la memoria ejecutiva central, de trabajo, fonológica y/o visualespacial; o dificultad con la codificación facial.

También se pueden encontrar problemas de comportamiento y emocionales, tales como, por ejemplo, hiperactividad, estereotipia, ansiedad, convulsiones, comportamiento social alterado, retraso cognitivo, irritabilidad, agresión o comportamiento autolesivo. Además, el FXS también puede causar problemas oftalmológicos, incluyendo estrabismo y otitis media y sinusitis recurrentes durante la primera infancia.

Debido a la alta prevalencia del síndrome del X frágil, existe una necesidad real de un tratamiento específico.

La solicitud de patente EP 2433635 describe el uso de moduladores de PAK (quinasas activadas por p21) para tratar el síndrome del X frágil.

La solicitud de patente WO2012/019990 describe el uso de antagonistas del receptor de glutamato 5 (mGlu5) para el tratamiento del síndrome del X frágil.

La solicitud de patente AU 2011 236093 describe el uso de un agonista del ácido gamma-aminobutírico, en particular del baclofeno, para el tratamiento del síndrome del X frágil. El fármaco STX209, un derivado del baclofeno, se encuentra actualmente en ensayo clínico para determinar su eficacia, seguridad y tolerabilidad para el tratamiento del aislamiento social en adolescentes y adultos con síndrome del X frágil.

Actualmente, se encuentran en curso otros ensayos clínicos tales como, por ejemplo, con AFQ056 (un antagonista de mGluR5 desarrollado por Novartis), hidrocloruro de minociclina (un antibiótico que puede reducir los niveles de metaloproteinasa de matriz 9 (MMP9)) o Acamprosato (un agonista de un receptor de GABA).

Hall et al. (2012. Psychoneuroendocrinology. 37(4):509-18) enseña sobre el uso de oxitocina, una hormona con efectos prosociales y ansiolíticos, para el tratamiento de sujetos afectados por el síndrome del X frágil.

Torrioli et al. (2010. Am J Med Genet A. 152A(6):1420-7) enseña sobre el uso de ácido valproico, para el tratamiento de sujetos afectados con el síndrome del X frágil.

Sin embargo, según el conocimiento del Solicitante, actualmente no existe ningún tratamiento farmacológico con eficacia probada para el síndrome del X frágil.

El Solicitante mostró sorprendentemente que el nivel de cloruro intracelular se incrementó significativamente en un modelo de ratón de FXS en comparación con la situación de tipo salvaje, lo que condujo a una actividad neuronal anormal (véanse los Ejemplos). Esto fue sorprendente ya que Adusei et al. (2010. Neuropharmacology. 59(3):167-171) describen que los transportadores de cloruro NKCC1 y KCC2 no están implicados en FXS.

Por tanto, la presente invención se refiere al uso de un modulador de los niveles de cloruro intracelular, en particular un inhibidor de NKCC, para tratar FXS en un sujeto que lo necesita.

Resumen

La invención está definida por las reivindicaciones. Cualquier contenido que se encuentre fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona únicamente a título informativo. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, las composiciones farmacéuticas y los medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.

Por tanto, la presente invención se refiere a una composición para tratar el síndrome del X frágil en un sujeto que lo necesita, en donde dicha composición comprende una cantidad efectiva de un modulador de un transportador de cloruro como se define en las reivindicaciones adjuntas.

En una realización, dicho modulador del transportador de cloruro no es ácido valproico, oxitocina, bendroflumetiazida, benztiazida, butiazida, clorotiazida, ciclotiazida, epitiazida, metaltiazida, hidroclorotiazida, hidro-flumetiazida, metilclotiazida, politiazida, triclorometiazida, clortalidona, indapamida, metolazona y quinetazona.

En un aspecto de la descripción, dicho modulador es un inhibidor de un transportador implicado en la importación de cloruro a las neuronas.

En otro aspecto, dicho inhibidor es un inhibidor de la actividad de un transportador implicado en la importación de cloruro a las neuronas. En una realización, dicho transportador implicado en la importación de cloruro a las neuronas es NKCC1.

El inhibidor de NKCC se selecciona del grupo que comprende bumetanida, furosemida, ácido etacrínico, torsemida, azosemida, muzolimina, piretanida y tripamida; análogos de los mismos como se definen en las reivindicaciones adjuntas.

En una realización, la cantidad efectiva varía de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 500 mg.

En una realización, la composición se administra al sujeto que la necesita mediante administración subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraocular, transdérmica, tópica, parenteral, intranasal y oral, o por inyección.

En una realización, el sujeto presenta un número de repeticiones CGG en la 5'-UTR de FMR1 de al menos 55, preferiblemente de al menos 200. En otra realización, el sujeto ha sido diagnosticado con síndrome del X frágil. En otra realización más, el sujeto presenta riesgo de desarrollar el síndrome del X frágil. En una realización, el sujeto es un feto y la composición debe administrarse a su madre.

Definiciones

En la presente invención, los siguientes términos tienen los siguientes significados:

- "Síndrome del X frágil" se refiere a una enfermedad genética asociada con y/o causada por un defecto de la expresión del gen FMR1 y/o de la actividad de la proteína codificada por FMR1, FMRP.

En una realización, el síndrome del X frágil se refiere a una afección en donde el gen FMR1 comprende al menos 55 repeticiones CGG en la 5'-UTR. Preferiblemente, FXS se refiere a una afección en donde el gen FMR1 comprende al menos 200 repeticiones CGG en la 5'-UTR.

La repetición de la expansión en la 5'-UTR de FMR1 provoca una expresión anormal del gen FMR1 y, por consiguiente, una función anormal de la proteína FMRP. Por lo tanto, el experto en la técnica apreciará que el síndrome del X frágil también puede referirse a una afección causada por y/o asociada con uno o más de los siguientes: (1) una mutación en FMR1; (2) expresión de FMR1 defectuosa; (3) expresión de FMRP incrementada y/o disminuida; (4) función de FMRP defectuosa; (5) expresión de los compañeros de unión naturales de FMRP incrementada y/o disminuida; (6) capacidad de FMRP para unirse a sus compañeros de unión naturales incrementada y/o disminuida; (7) metilación de arginina de FMRP disminuida o ausente; (8) aumento de la metilación de repeticiones CpG de FMR1 en la 5' UTR del exón 1; (9) la localización errónea o expresión errónea de FMRP dentro de la célula (preferiblemente en la neurona) o dentro del organismo.

- "Tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas; en donde el objeto es prevenir o ralentizar (reducir) la afección o trastorno patológico diana. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya presentan el trastorno, así como aquellos propensos a tener el trastorno o aquellos en los que se va a evitar el trastorno. Un sujeto es "tratado" con éxito para el síndrome del X frágil si, después de recibir una cantidad efectiva de un modulador según la presente invención, el sujeto muestra una reducción observable y/o mensurable en o ausencia de uno o más de los siguientes: reducción de uno o más de los síntomas asociados con el síndrome del X frágil; y mejora de la calidad de vida. Los parámetros anteriores para evaluar el tratamiento exitoso y la mejora de la enfermedad se pueden medir fácilmente mediante procedimientos de rutina familiares para un médico.

- "Cantidad efectiva" se refiere al nivel o la cantidad de agente que se busca, sin causar efectos secundarios negativos o adversos significativos en la diana, (1) retrasar o prevenir la aparición del síndrome del X frágil; (2) ralentizar o detener la progresión, agravamiento o deterioro de uno o más síntomas del síndrome del X frágil; (3) provocar una mejoría de los síntomas del síndrome del X frágil; (4) reducir la gravedad o la incidencia del síndrome del X frágil; o (5) curar el síndrome del X frágil. Puede administrarse una cantidad efectiva antes de la aparición del síndrome del X frágil, para una acción profiláctica o preventiva. Alternativamente, o adicionalmente, la cantidad efectiva puede administrarse después del inicio del síndrome del X frágil, para una acción terapéutica.

- "Sujeto" se refiere a un mamífero, preferiblemente un ser humano. En una realización de la invención, el sujeto es un hombre. En otra realización de la invención, el sujeto es una mujer.

En una realización, el término "sujeto sano" se refiere a un sujeto que no ha sido diagnosticado con síndrome del X frágil. En otra realización, un sujeto sano no presenta síntomas y/o signos clínicos del síndrome del X frágil, en donde los signos clínicos del síndrome del X frágil incluyen rasgos dismórficos leves, macrocefalia con cara alargada, orejas prominentes, paladar arqueado, cara delgada, hipermovilidad articular, pies gordos y macroorquidismo. En otra realización, un sujeto sano comprende un gen FMR1 con un número de repeticiones CGG en la 5'-UTR que varía de 5 a 54. En otra realización, un sujeto sano comprende un gen FMR1 con un número de repeticiones c Gg en la 5'-UTR que varía de 55 a 200.

- "Modulador" se refiere a un compuesto que modula el nivel de cloruro intracelular. Preferiblemente, un modulador es un compuesto cuya administración conduce a una disminución de la concentración de cloruro intracelular. En una realización, dicho modulador actúa sobre la expresión del gen y/o proteínas y/o sobre la actividad de un transportador de cloruro.

- "Modulador selectivo" se refiere a un inhibidor selectivo y a un activador selectivo.

- "Inhibidor" se refiere a un compuesto natural o sintético que tiene un efecto biológico para inhibir o reducir significativamente o regular a la baja la expresión de un gen y/o una proteína o que tiene un efecto biológico para inhibir o reducir significativamente la actividad biológica de una proteína. Por consiguiente, "un inhibidor de NKCC" se refiere a un compuesto natural o sintético que tiene un efecto biológico para inhibir o reducir significativamente o regular a la baja la expresión del gen que codifica NKCC y/o la expresión de la proteína NKCC y/o la actividad biológica de NKCC.

- "Inhibidor selectivo" se refiere a que la afinidad del inhibidor por el transportador de cloruro, por ejemplo, NKCC, es al menos 10 veces, 25 veces, 50 veces, 75 veces, 80 veces, 90 veces, 95 veces, 100 veces, 125 veces, 150 veces, 200 veces, 250 veces, 300 veces, 350 veces, 400 veces, 450 veces, preferiblemente 500 veces mayor que la afinidad por los otros transportadores de cloruro, en particular KCC2.

- "Aproximadamente" precediendo a una cifra significa más o menos el 10 % del valor de dicha cifra.

- "Análogo" se refiere ampliamente a la modificación o sustitución de uno o más restos químicos en un compuesto parental y puede incluir derivados funcionales, isómeros posicionales, tautómeros, iones híbridos, enantiómeros, diastereómeros, racematos, isósteres o mezclas estereoquímicas de los mismos.

- "Derivado funcional" se refiere a un compuesto que posee la capacidad de modular la concentración de cloruro en las neuronas (inhibe la importación o activa la salida de cloruro).

Descripción detallada

Esta invención se refiere a una composición que comprende un modulador de la concentración de cloruro intracelular para tratar el síndrome del X frágil.

En una realización de la invención, el modulador de la concentración de cloruro intracelular es un modulador de un transportador de cloruro.

En una realización de la invención, el modulador de la concentración de cloruro intracelular es un modulador selectivo de un transportador de cloruro.

En una realización, el modulador de un transportador de cloruro inhibe la importación de cloruro a las neuronas, preferiblemente a través de la inhibición de los transportadores implicados en la importación de cloruro a las neuronas.

En otra realización, el modulador selectivo de un transportador de cloruro inhibe la importación de cloruro a las neuronas, preferiblemente a través de la inhibición de los transportadores implicados en la importación de cloruro a las neuronas.

En una realización de la invención, dicho modulador es un inhibidor del transportador de cloruro implicado en la importación de cloruro a las neuronas.

En otra realización de la invención, dicho modulador es un inhibidor selectivo del transportador de cloruro implicado en la importación de cloruro a las neuronas.

En una realización de la invención, dicho modulador es un inhibidor de la expresión de la proteína y/o gen de un transportador implicado en la importación de cloruro a las neuronas.

En otra realización de la invención, dicho modulador es un inhibidor selectivo de la expresión de la proteína y/o gen de un transportador implicado en la importación de cloruro a las neuronas.

Los ejemplos de transportadores implicados en la importación de cloruro a las neuronas incluyen NKCC (en donde NKCC significa "cotransportador de Na-K-2Cl"), tal como, por ejemplo, NKCC1. En una realización, el modulador de un transportador de cloruro es por tanto un inhibidor de NKCC, preferiblemente de NKCC1. En otra realización, el modulador de un transportador de cloruro es un inhibidor selectivo de NKCC, preferiblemente de NKCC1.

En otra realización, el inhibidor de un transportador de cloruro inhibe la actividad del transportador de cloruro. Los ejemplos de dichos inhibidores incluyen moléculas pequeñas, anticuerpos, minicuerpos, diacuerpos o fragmentos de los mismos, que se unen al transportador de cloruro y antagonistas del transportador de cloruro.

Los ejemplos de dichos inhibidores incluyen inhibidores de NKCC, tales como, por ejemplo, antagonistas de NKCC. En una realización, el modulador es un antagonista de NKCC1. En una realización, dicho inhibidor es un inhibidor selectivo de NKCC, preferiblemente un inhibidor selectivo de NKCC1.

En una realización de la invención, dicho inhibidor selectivo interacciona directamente con el transportador de cloruro.

En una realización, dicho inhibidor selectivo es un antagonista de un transportador de cloruro que importa cloruro a las neuronas.

En una realización de la invención, el inhibidor de un transportador de cloruro es un inhibidor de NKCC1, tal como, por ejemplo, un diurético (tal como, por ejemplo, un diurético de asa); o un antagonista de NKKC1.

En una realización de la invención, el inhibidor selectivo que disminuye la expresión del gen y/o proteína y/o la actividad del cotransportador de cloruro NKCC1, tiene una baja afinidad por KCC2.

En una realización de la invención, el inhibidor selectivo del transportador de cloruro tiene una afinidad por KCC2 inferior a 10-7 M, preferiblemente 10-6 M, más preferiblemente menos de 10-5 M.

En otra realización de la invención, el inhibidor selectivo del transportador de cloruro tiene una afinidad al menos mucho mayor por NKCC1 que por KCC2 (una constante de unión mayor en al menos 2 órdenes de magnitud, preferiblemente en al menos 4 órdenes de magnitud, más preferiblemente en al menos 5 órdenes de magnitud y lo más preferiblemente en al menos 6 órdenes de magnitud (al menos 10-9, preferiblemente más de 10-10).

En otra realización de la invención, el inhibidor selectivo del transportador de cloruro no se une a KCC2 en absoluto.

En una realización de la invención, el inhibidor selectivo del transportador de cloruro se refiere a una molécula que tiene una afinidad por NKCC1 al menos 10 veces, 25 veces, 50 veces, 75 veces, 80 veces, 90 veces , 95 veces, 100 veces, 125 veces, 150 veces, 200 veces, 250 veces, 300 veces, 350 veces, 400 veces, 450 veces, preferiblemente 500 veces mayor que su afinidad por una cualquiera de las demás isoformas de transportadores NKCC que comprenden NKCC2, transportadores KCC que comprenden KCC1, KCC2, KCC3, KCC4, otro transportador de cloruro que incluye en una lista no limitante: transportador de Cl'HCO3\

Los ejemplos de inhibidores de un transportador de cloruro, preferiblemente de NKCC1, incluyen bumetanida, furosemida, ácido etacrínico, torsemida, azosemida, muzolimina, piretanida, tripamida y análogos, derivados funcionales y profármacos de dichos compuestos; tiazida y diuréticos similares a tiazida, tales como bendroflumetiazida, benztiazida, clorotiazida, hidroclorotiazida, hidro-flumetiazida, metilclotiazida, politiazida, triclormetiazida, clortalidona, indapamida, metolazona y quinetazona; y análogos, derivados funcionales y profármacos de dichos compuestos.

Los ejemplos de análogos de bumetanida incluyen, pero no están limitados a: aldehído de bumetanida, dibencilamida de bumetanida, dietilamida de bumetanida, éster morfolinoetílico de bumetanida, éster 3-(dimetilaminopropílico) de bumetanida, éster N,N-dietilglicolamida de bumetanida, éster dimetilglicolamida de bumetanida, éster pivaxetílico de bumetanida, éster metoxi(polietilenoxi)n-1-etílico de bumetanida, sal de benciltrimetil-amonio de bumetanida, sal cetiltrimetilamonio de bumetanida, éster pivaloiloximetílico de bumetanida, éster metílico de bumetanida, éster N,N-dimetilaminoetílico de bumetanida, tioácido [-(C=O)-SH] de bumetanida, tioéster S-metílico de bumetanida, tioéster S-cianometílico de bumetanida, tioéster S-etílico de bumetanida, tioéster S-isoamílico de bumetanida, tioéster S-octílico de bumetanida, tioéster S-bencílico de bumetanida, tioéster S-(morfolinoetílico) de bumetanida, tioéster S-[3-(dimetilaminopropílico)] de bumetanida, tioéster S-(N,N-dietilglicolamido) de bumetanida, tioéster S-(N,N-dimetilglicolamido) de bumetanida, tioéster S-pivaxetílico de bumetanida, tioéster S-propaxetílico de bumetanida, tioéster S-(metoxipolietilenoxi)n-1-etílico] de bumetanida, sal de tioácido [-(C=O)-S'] benciltrimetil-amonio de bumetanida y sal de tioácido [-(C=O)-S] cetiltrimetilamonio de bumetanida; tioácido de bumetanida metaestable, tioaldehído de bumetanida, tioéster O-metílico de bumetanida, tioéster O-cianometílico de bumetanida, tioéster O­ etílico de bumetanida, tioéster O-isoamílico de bumetanida, tioéster O-octílico de bumetanida, tioéster O-bencílico de bumetanida, tioéster O-(morfolinoetílico) de bumetanida, tioéster O-[3-(dimetilaminopropílico)] de bumetanida, tioéster O-(N,N-dietilglicolamido) de bumetanida, tioéster O-pivaxetílico de bumetanida, tioéster O-propaxetílico de bumetanida, tioéster O-[metoxi(polietilenoxi)n-1 etílico] de bumetanida, sal de tioácido [-(C=S)-O'] benciltrimetil-amonio de bumetanida y sal de tioácido [-(C=S)-O'] cetiltrimetilamonio de bumetanida.

Preferiblemente, el modulador del nivel de cloruro intracelular es bumetanida y análogos de la misma.

En una realización de la invención, la composición comprende una cantidad efectiva de un modulador de la concentración de cloruro intracelular.

Según la invención, la cantidad efectiva de un modulador de la concentración de cloruro intracelular se calcula con el fin de alcanzar una concentración de cloruro intracelular deseada.

De hecho, el Solicitante mostró sorprendentemente que la concentración de cloruro intracelular es más elevada en los roedores con síndrome del X frágil que en los no tratados previamente (véanse los Ejemplos).

Por lo tanto, según una realización, la cantidad efectiva de un modulador de la concentración de cloruro intracelular corresponde a la cantidad que se va a administrar a un sujeto que lo necesite para alcanzar la concentración de cloruro intracelular medida en un sujeto sano. Preferiblemente, dicho sujeto sano comparte características con el sujeto con síndrome del X frágil que se va a tratar, tales como, por ejemplo, la misma edad, sexo, dieta, peso. Más preferiblemente, dicho sujeto sano presenta un número de repeticiones en la 5'-UTR del gen FMR1 que varía de 5 a 54.

En una realización de la invención, la cantidad efectiva de un modulador varía de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 500 mg, preferiblemente de aproximadamente 0,05 mg a aproximadamente 100 mg, más preferiblemente de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 10 mg e incluso más preferiblemente de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 1,5 mg.

Según una realización de la invención, la composición de la invención es para el tratamiento de los síntomas comportamentales y/o cognitivos asociados con el síndrome del X frágil. En una realización, la administración a un sujeto que lo necesite de la composición de la invención da como resultado el alivio de los síntomas comportamentales del síndrome del X frágil.

Los ejemplos de síntomas comportamentales y/o cognitivos del síndrome del X frágil incluyen hiperactividad, estereotipia, ansiedad, convulsiones, comportamiento social alterado, retraso cognitivo, hipersensibilidad a los estímulos sensoriales, trastornos del estado de ánimo, alteración de los patrones de sueño, irritabilidad, agresión o comportamiento autolesivo, retraso mental, problemas de aprendizaje (tales como, por ejemplo, retrasos en aprender a sentarse, caminar y hablar), habla nerviosa o confusa, dificultad con la codificación facial y deficiencia en la memoria ejecutiva central, de trabajo, fonológica y/o visual-espacial.

En una realización de la invención, el síntoma comportamental y/o cognitivo asociado con el síndrome del X frágil no es un síntoma autista o un síntoma asociado con un trastorno del espectro autista.

Los métodos para evaluar la eficacia del tratamiento se pueden medir fácilmente mediante procedimientos de rutina familiares para un médico, tales como, por ejemplo, el uso de escalas. Los ejemplos de escalas que pueden usarse para evaluar la eficacia del tratamiento del síndrome del X frágil incluyen la escala ABC, la escala GRAM y la escala CGI.

Según una realización de la invención, la composición de la invención es para aliviar la aparición de síntomas oculares y/o manifestaciones otorrinolaringológicas locales asociadas con síndromes del X frágil. En una realización, la administración a un sujeto que lo necesite de la composición de la invención da como resultado el alivio de los síntomas oculares y de las manifestaciones otorrinolaringológicas locales y/o una reducción de la aparición de dichos síntomas, tal como, por ejemplo, la reducción de la aparición de problemas oftalmológicos que incluyen estrabismo, otitis media y sinusitis.

Según una realización de la invención, la composición de la invención es para tratar síntomas/defectos sinápticos asociados con los síndromes del X frágil. En una realización, la administración a un sujeto que lo necesite de la composición de la invención da como resultado el alivio de los defectos sinápticos asociados con el síndrome del X frágil.

Los ejemplos de síntomas/defectos sinápticos asociados con el síndrome del X frágil incluyen una morfología sináptica defectuosa (tal como, por ejemplo, un número, longitud y/o anchura anormales de las espinas dendríticas) y función sináptica defectuosa (tal como, por ejemplo, aumento de la depresión a largo plazo (LTD) y/o potenciación a largo plazo reducida (LTP)).

En una realización de la invención, el sujeto que se va a tratar presenta un número de repeticiones CGG en la 5'-UTR de FMR1 de al menos 55, preferiblemente de al menos 200.

En una realización de la invención, el sujeto que se va a tratar ha sido diagnosticado con síndrome del X frágil; preferiblemente el/ella presenta un número de repeticiones CGG en la 5'-UTR de FMR1 de al menos 200. En una realización, el sujeto diagnosticado ya presenta síntomas del síndrome del X frágil. En otra realización, el sujeto diagnosticado se trata antes del inicio de los síntomas del síndrome del X frágil.

En otra realización de la invención, el sujeto que se va a tratar presenta riesgo de desarrollar el síndrome del X frágil. En una realización de la invención, dicho riesgo corresponde a la presencia en los parientes consanguíneos de pacientes con síndrome del X frágil. En otra realización de la invención, dicho riesgo corresponde a la presencia, en el gen FMR1 de al menos uno de los padres del sujeto, de un número de repeticiones CGG en la 5'-UTR que varía de 55 a 200 o de más de 200.

En una realización de la invención, el sujeto que se va a tratar no es un paciente autista. Preferiblemente, dicho sujeto no ha sido diagnosticado con autismo u otro trastorno del espectro autista.

El Solicitante mostró sorprendentemente que el parto era un evento clave en el desarrollo del síndrome del X frágil (véanse los Ejemplos). Por lo tanto, en una realización, la composición de la invención se administra a una mujer embarazada. Según la invención, el término "mujer embarazada" se refiere a una mujer desde la fecha de la concepción hasta el final del parto.

Según una realización, la composición se administra a una mujer embarazada cuando su feto ha sido diagnosticado prenatalmente con síndrome del X frágil, preferiblemente cuando el feto presenta un número de repeticiones CGG superior a 200. Según una realización, la composición se administra a una mujer embarazada cuando su feto presenta riesgo de desarrollar el síndrome del X frágil. En una realización de la invención, dicho riesgo corresponde a la presencia en los parientes consanguíneos de pacientes con síndrome del X frágil. En otra realización de la invención, dicho riesgo corresponde a la presencia, en el gen FMR1 de al menos uno de los padres del sujeto, de un número de repeticiones CGG en la 5'-UTR que varía de 55 a 200 o de más de 200.

En una realización de la invención, la composición se administra perinatalmente a un niño. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "perinatalmente" se refiere a unas pocas horas después del nacimiento, preferiblemente 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 hora(s) después del nacimiento. Preferiblemente, esta realización se aplica cuando el niño ha sido diagnosticado prenatalmente con el síndrome del X frágil, preferiblemente cuando el/ella presenta un número de repeticiones CGG superior a 200. Según una realización, la composición también puede administrarse perinatalmente cuando el niño presenta riesgo de desarrollar el síndrome del X frágil. En una realización de la invención, dicho riesgo corresponde a la presencia en los parientes consanguíneos de pacientes con síndrome del X frágil. En otra realización de la invención, dicho riesgo corresponde a la presencia, en el gen FMR1 de al menos uno de los padres del sujeto, de un número de repeticiones CGG en la 5'-UTR que varía de 55 a 200 o de más de 200.

En una realización de la invención, el sujeto es un niño pequeño. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "niño pequeño" se refiere a un niño de 0 a 3 años de edad.

En otra realización de la invención, el sujeto es un niño. En una realización, el término "niño" puede referirse a sujetos de 0 a 12 años, preferiblemente de 3 a 12 años. De manera más general, el término niño se refiere a un sujeto que aún no es un adolescente.

En otra realización de la invención, el sujeto es un adolescente. En una realización, el término "adolescente" puede referirse a sujetos de aproximadamente 12 a 17 años, pero el experto en la técnica apreciará que la duración de la adolescencia puede variar de un individuo a otro.

En otra realización, el sujeto es un adulto. En una realización, el término "adulto" puede referirse a sujetos de más de 17 años. De manera más general, el término adulto se refiere a un sujeto que ya no es un adolescente.

La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica para tratar el síndrome del X frágil en un sujeto que lo necesite, en donde dicha composición farmacéutica comprende una cantidad efectiva de un modulador de la concentración de cloruro intracelular y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "excipiente farmacéuticamente aceptable" se refiere a un excipiente que no produce una reacción adversa, alérgica u otra reacción inapropiada cuando se administra a un animal, preferiblemente un ser humano. Puede incluir cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción. Para la administración a seres humanos, las preparaciones deben cumplir con los estándares de esterilidad, pirogenicidad, seguridad y pureza general que requieren los estándares de la Oficina de productos biológicos de la f Da .

Otro objeto de la invención es un medicamento para tratar el síndrome del X frágil que comprende una cantidad efectiva de un modulador de la concentración de cloruro intracelular.

La composición, composición farmacéutica o medicamento de la invención puede administrarse mediante varias rutas de administración. Los ejemplos de rutas de administración adaptadas incluyen la administración subcutánea, intramuscular, intravenosa, transdérmica, tópica, parenteral, intranasal y oral, o la inyección. El tipo de forma de administración coincidirá con la gravedad del síndrome, así como con la edad, peso sexo del sujeto que se va a tratar.

Según una realización, la composición, composición farmacéutica o medicamento de la invención se encuentra en una forma adaptada para inyección, preferiblemente seleccionada del grupo que comprende disoluciones, tales como, por ejemplo, disolución isotónica, disolución salina, disoluciones acuosas estériles, dispersiones, emulsiones, suspensiones, formas sólidas adecuadas para su uso en la preparación de disoluciones o suspensiones tras la adición de un líquido antes de su uso, tales como, por ejemplo, polvo, composiciones liofilizadas, formas liposomales.

Según una realización, la composición, composición farmacéutica o medicamento de la invención se encuentra en una forma adaptada a la administración oral. Según una primera realización, la forma adaptada a la administración oral es una forma sólida seleccionada del grupo que comprende comprimidos, píldoras, cápsulas, cápsulas de gelatina blanda, píldoras recubiertas de azúcar, comprimidos orodispersables, comprimidos efervescentes u otros sólidos. Según una segunda realización, la forma adaptada a la administración oral es una forma líquida, tal como, por ejemplo, una disolución bebible, una pulverización bucal, formas liposomales.

Según una realización, la composición, composición farmacéutica o medicamento de la invención se encuentra en una forma adaptada para la administración local por las rutas nasal y respiratoria. Los ejemplos de formulaciones adecuadas para administración nasal incluyen disoluciones nasales, pulverizadores, aerosoles e inhalantes.

Según una realización, la composición, composición farmacéutica o medicamento de la invención se encuentra en una forma adaptada a la administración tópica. Los ejemplos de formulaciones adaptadas a la administración tópica incluyen pomada, pasta, gotas oculares, crema, parche, tal como, por ejemplo, parche transdérmico, gel, formas liposomales.

Según una realización, la composición, composición farmacéutica o medicamento de la invención se encuentra en la forma de, o comprende, liposomas y/o nanopartículas.

Según una realización, la composición, composición farmacéutica o medicamento de la invención comprende además algunos excipientes, tales como, por ejemplo, tensioactivos (p. ej., hidroxipropilcelulosa); vehículos adecuados, tales como, por ejemplo, disolventes y medios de dispersión que contienen, por ejemplo, agua, fosfato monosódico o disódico, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio, etanol, poliol (p. ej., glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido), mezclas adecuadas de los mismos, y aceites vegetales, tales como, por ejemplo, aceite de cacahuete y aceite de sésamo; agentes isotónicos, tales como, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio; agentes de recubrimiento, tales como, por ejemplo, lecitina; agentes que retrasan la absorción, tales como, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina; conservantes, tales como, por ejemplo, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, clorobutanol, timerosal; tampones, tales como, por ejemplo, ácido bórico, bicarbonato de sodio y potasio, boratos de sodio y potasio, carbonato de sodio y potasio, acetato de sodio, bifosfato de sodio; agentes de tonicidad, tales como, por ejemplo, dextrano 40, dextrano 70, dextrosa, glicerina, cloruro de potasio, propilenglicol, cloruro de sodio; antioxidantes y estabilizadores, tales como, por ejemplo, bisulfito de sodio, metabisulfito de sodio, tiosulfito de sodio, tiourea; agentes humectantes o clarificantes no iónicos, tales como, por ejemplo, polisorbato 80, polisorbato 20, poloxámero 282 y tiloxapol; agentes modificadores de la viscosidad, tales como, por ejemplo, dextrano 40, dextrano 70, gelatina, glicerina, hidroxietilcelulosa, hidroximetilpropilcelulosa, lanolina, metilcelulosa, vaselina, polietilenglicol, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, carboximetilcelulosa.

En una realización de la invención, la composición, composición farmacéutica o medicamento de la invención se puede usar junto con sistemas de administración que facilitan la administración de los agentes al sistema nervioso central. Por ejemplo, se pueden usar varios potenciadores de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica (BBB) para aumentar de forma transitoria y reversible la permeabilidad de la barrera hematoencefálica a un agente de tratamiento. Dichos potenciadores de la permeabilidad de la BBB incluyen leucotrienos, agonistas de bradiquinina, histamina, disruptores de uniones estrechas (p. ej., zonulina, zot), disoluciones hiperosmóticas (p. ej., manitol), agentes de contracción del citoesqueleto y alquilgliceroles de cadena corta (p. ej., 1-O-pentilglicerol). Las rutas oral, sublingual, parenteral, de implantación, nasal e inhalatoria pueden proporcionar la administración del agente activo en el sistema nervioso central. En algunas realizaciones, los compuestos de la presente invención pueden administrarse en el sistema nervioso central con efectos mínimos sobre el sistema nervioso periférico.

La barrera hematoencefálica (BBB) es una barrera y sistema físico de mecanismos de transporte celular entre los vasos sanguíneos en el sistema nervioso central (SNC) y la mayoría de las áreas del propio SNC. La BBB mantiene la homeostasis al restringir la entrada de sustancias químicas potencialmente dañinas de la sangre y al permitir la entrada de nutrientes esenciales. Sin embargo, la BBB puede representar una barrera formidable para la administración de agentes farmacológicos al SNC para el tratamiento de trastornos o para mantener o mejorar las funciones cerebrales normales y deseables, tales como la cognición, el aprendizaje y la memoria.

Según una realización de la invención, la composición, la composición farmacéutica o el medicamento de la invención se administra al menos una vez al día, preferiblemente dos veces al día, más preferiblemente al menos tres veces al día.

En una realización de la invención, la cantidad diaria de un modulador que se va a administrar a un sujeto varía de aproximadamente 0,01 mg/día a aproximadamente 500 mg/día, preferiblemente de aproximadamente 0,05 mg/día a aproximadamente 100 mg/día, más preferiblemente de aproximadamente 0,1 mg/día a aproximadamente 10 mg/día e incluso más preferiblemente de aproximadamente 0,5 mg/día a aproximadamente 1,5 mg/día.

Según una realización de la invención, la dosis de la administración de la composición farmacéutica la determina el experto en la técnica y se adapta personalmente a cada sujeto.

En una realización de la invención, el modulador se administra en una forma de liberación sostenida. En una realización de la invención, la composición comprende un sistema de administración que controla la liberación del modulador. Los ejemplos de vehículos adecuados para la liberación sostenida o retardada incluyen gelatina; goma arábiga; polímeros de xantano; resinas termoplásticas tales como, por ejemplo, haluros de polivinilo, ésteres de polivinilo, haluros de polivinilideno y poliolefinas halogenadas; elastómeros tales como, por ejemplo, brasiliensis, polidienos y cauchos halogenados naturales y sintéticos; y resinas termoendurecibles flexibles, tales como poliuretanos, resinas epoxi; polímeros biodegradables.

En otra realización de la invención, el modulador de la presente invención se administra en combinación con otras terapias que podrían incluir: terapia del habla, terapia comportamental, terapia ocupacional de integración sensorial, educación especial o planes educativos individualizados y, cuando sea necesario, tratamiento de anomalías físicas.

Otro objeto de la invención es un modulador de un transportador de cloruro para su uso en un método para tratar el síndrome del X frágil en un sujeto que lo necesite, en donde el método comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de un modulador de un transportador de cloruro. En una realización de la invención, dicha cantidad efectiva se calcula con el fin de alcanzar una concentración intracelular deseada de cloruro.

En una realización de la invención, el método de tratamiento comprende administrar al sujeto la composición, la composición farmacéutica o el medicamento de la invención.

En una realización de la invención, el método es para tratar los síntomas comportamentales y/o cognitivos del síndrome del X frágil.

En otra realización de la invención, el método es para tratar los síntomas oculares y/o los síntomas otorrinolaringológicos locales del síndrome del X frágil.

En otra realización, el método de la invención es para tratar los defectos/síntomas sinápticos del síndrome del X frágil.

En una realización de la invención, el sujeto que necesita un tratamiento presenta un número de repeticiones CGG en la 5'-UTR de FMR1 de al menos 55, preferiblemente de al menos 200. En una realización de la invención, el sujeto que se va a tratar ha sido diagnosticado con el síndrome del X frágil y ya presenta o no síntomas del síndrome del X frágil. En otra realización de la invención, el sujeto que necesita un tratamiento presenta riesgo de desarrollar el síndrome del X frágil.

La presente invención también se refiere a un método para tratar el síndrome del X frágil en un feto, y comprende administrar a su madre una cantidad efectiva de un modulador de un transportador de cloruro.

En una realización de la invención, el sujeto es para el tratamiento perinatal de un niño.

En una realización de la invención, el sujeto es un niño pequeño, un niño, un adolescente o un adulto.

En una realización de la invención, el método de la invención comprende la administración subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraocular, transdérmica, tópica, parenteral, intranasal u oral del modulador de la invención, o su inyección.

En una realización de la invención, el método de la invención comprende administrar el modulador de la invención al menos una vez al día, preferiblemente dos veces al día, más preferiblemente al menos tres veces al día. En otra realización de la invención, se administra al sujeto una cantidad diaria de un modulador que varía de aproximadamente 0,01 mg/día a aproximadamente 500 mg/día, preferiblemente de aproximadamente 0,05 mg/día a aproximadamente 100 mg/día, más preferiblemente de aproximadamente 0,1 mg/día a aproximadamente 10 mg/día e incluso más preferiblemente de aproximadamente 0,5 mg/día a aproximadamente 1,5 mg/día.

La presente invención también se refiere a un método para disminuir la concentración intracelular de cloruro en un sujeto con síndrome del X frágil, preferiblemente la concentración intracelular neuronal de cloruro.

Otro objeto de la invención es un método para modular la concentración de cloruro intracelular de un sujeto, en donde el método comprende administrar al sujeto que lo necesita una cantidad efectiva de un modulador de un transportador de cloruro.

La presente invención también se refiere a un método para disminuir la fuerza impulsora de GABA en un sujeto con síndrome del X frágil.

En una realización de la invención, el método comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de un modulador de un transportador de cloruro.

En una realización de la invención, dicha cantidad efectiva se calcula con el fin de alcanzar una concentración intracelular deseada de cloruro.

En una realización de la invención, el método comprende administrar al sujeto que lo necesite la composición, la composición farmacéutica o el medicamento de la invención.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es una combinación de gráficos que muestran una comparación del perfil de desarrollo de la fuerza impulsora de GABA (DFgaba) en cortes de hipocampo de un modelo de ratón transgénico pre y posnatal para el síndrome del X frágil frente a los animales de tipo salvaje: A. Gráfico de DFgaba medido con registros de canales de GABAa individuales (para más detalles, véase Tyzio et al., 2006) de células piramidales del hipocampo CA3 en los estadios prenatal (E20) y posnatal (P0, P7, P14 y P28-37). Obsérvese que DFgaba es significativamente más positivo en X frágil en las edades P0, P14 y P28-37. Además, no hay ningún desplazamiento hiperpolarizante perinatal de DFgaba en el modelo de X frágil (en P0 p<0,005, en p14 p<0,05, en P28-37 p<0,005); B. Relaciones I-V de las corrientes a través de los canales de GABAa en P0 en dos células piramidales CA3 de X frágil antes y después de la aplicación de bumetanida. Su potencial de inversión corresponde a DFgaba; obsérvese el desplazamiento del potencial de inversión de despolarizante a hiperpolarizante. En el recuadro - ejemplos de aberturas de canales GABAa individuales a diferentes potenciales de fijación; C. Acción de oxitocina y bumetanida sobre DFgaba en células piramidales CA3 de recién nacido (P0), X frágil y tipo salvaje. En las células piramidales de tipo salvaje, el DFgaba es inicialmente hiperpolarizante en P0 como resultado de la acción de la oxitocina materna. La aplicación de bumetanida aumenta la hiperpolarización. En cortes de ratón con X frágil, DFgaba es positivo en P0 y tanto la oxitocina como la bumetanida lo desplazan a hiperpolarización en P0 (p<0,005).

La Figura 2 representa en (A) histogramas de valores promedio de DFgaba medidos en neuronas piramidales CA3 del hipocampo en P15. Ratones WT (6,8 ±1,1 mV, n=15), ratones FXS (15,3 ± 1,9 mV, n=24) y ratones FXS pretratados con bumetanida (1,0 ±1,1 mV, n=17, ***P<0,001). (B) muestra los efectos de la isoguvacina (10 |jM) en ratas: Trazas representativas de potenciales de campo extracelular espontáneos registrados en cortes de hipocampo en P15 en ratones control, FXS y ratones FXS pretratados con Bumetanida. Los cursos de tiempo correspondientes de los cambios de frecuencia de las espigas se muestran debajo de cada traza. (C) muestra los histogramas promedio de frecuencia de espigas normalizada en ratones muestra ratones WT (disminución hasta 67,9 ± 6,1 % n=11, ***P<0,001); ratones FXS (aumento hasta 165,8 ±13,5 %, n=11, ***P<0,001); ratones FXS pretratados con bumetanida (disminución hasta 80,8 ± 8,2 %, n=5, **P<0,05). Ensayo de la t de dos colas para todos los conjuntos de datos. Los datos se presentan como medias ± S.E.M.

La Figura 3 representa registros de pinzamiento de voltaje de células completas de corrientes possinápticas excitadoras espontáneas (sEPSC) a -70 mV de neuronas piramidales CA3 del hipocampo individuales en cortes de cerebro agudo de ratones P15 FXS y los respectivos animales de control y pretratados con bumetanida o con SSR. (A) muestra trazas representativas de sEPSC registradas de ratones. (B) muestra valores promedio ± S.E.M de frecuencias de sEPSC en ratones. Ratones WT (n=12) y ratones FXS (n=9, ***p< 9 x10'5) y ratones FXS con pretratamiento materno con bumetanida (n=11, ***P< 2,2 *10'5) y ratones tratados con SSR (n=13, ***p< 4,5 x 10-5). Ensayo ANOVA de una vía con pos-hoc de LSD de Fisher. Los datos se presentan como medias ± S.E.M.

La Figura 4 representa vocalizaciones ultrasónicas inducidas por aislamiento (USV) en ratones P8 WT (n=12), FXS (n=11) y FXS con pretratamiento materno con bumetanida (n=13). Ensayo ANOVA de una vía de Kruskal-Wallis, prueba pos-hoc de comparación múltiple de Dunn *P< 0,05, **P< 0,01.

Ejemplos

La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos.

Materiales y métodos

Ratones con X frágil inactivado (ratones FXS)

Los ratones que carecen de Fmr1 (denominados Fmr1~'~) fueron criados en nuestra instalación de animales. Estos ratones no expresan ninguna proteína Fmr1 y carecen de transcritos de Fmr1 detectables. Para todos los experimentos, se usaron ratones Fmr1~'- con compañeros de camada de tipo salvaje como grupo de control. La descendencia se utilizó para experimentos en E18, P0, P2, P4, P7, P9, P15 y P30. Los experimentos se realizaron en la descendencia de ambos sexos y de forma ciega en E18 y P0.

Preparación de los cortes

Se realizaron experimentos en fetos y ratones neonatales de tipo salvaje y con X frágil desde el día embrionario E20 hasta el día posnatal P38 (a término es E21). Toda la investigación se realizó de acuerdo con las directrices nacionales sobre cuidado humano y uso de animales de laboratorio y fue aprobada por INSERM.

Se prepararon cortes de hipocampo (300-500 pm de grosor) usando una cortadora de tejido Microm (International GmbH, Alemania) como se ha descrito anteriormente (Tyzio et al., 2006, 2008). Los cortes se mantuvieron en fluido cerebroespinal artificial oxigenado (O2 al 95 %/CO2 al 5%) (ACSF) de la siguiente composición (en mM): NaCl 126, KCl 3,5, CaCl22,0, MgCb 1,3, NaHCOa 25, NaH2PO41,2 y glucosa 11 (pH 7,4) a temperatura ambiente (20-22 °C) al menos 1 hora antes de su uso.

Electrofisiología

Para los registros, los cortes se colocaron en una cámara convencional totalmente sumergida superfundida con ACSF a una velocidad de 2-3 mL/min a temperatura ambiente. Se realizaron registros de registro zonal de células piramidales CA3 identificadas visualmente en configuración unida a la célula utilizando un amplificador EPC-10 (HEKA Elektronik Dr. Schulze GmbH, Lambrecht/Pfalz, Alemania). La disolución de la micropipeta para los registros de canales GABAa individuales contenía (en mM): NaCl 120, KCl 5, TEA-Cl 20, 4-aminopiridina 5, CaCb 0,1, MgCb 10, glucosa 10, Hepes-NaOH 10 tamponado a pH 7,2-7,3 y GABA 2 pM. El análisis de las corrientes a través de los canales individuales y las relaciones de corriente-voltaje se realizaron usando Clampfit 9.2 (Axon Instruments, Union City, CA). Los registros se digitalizaron (10 kHz) en línea con la tarjeta de interfaz Digidata-1200 (Axon Instruments, Union City, CA) y se analizaron fuera de línea con el paquete Axon, MiniAnalysis (S (Synaptsoft, Decatur, GA) y Origin (Microcal Software, Northampton, MA).

Registros de células completas

Se realizaron registros estándar de células completas en cortes neocorticales coronales de cerebro de rata o ratón a temperatura ambiente (20-22 °C) del soma de neuronas CA3 del hipocampo usando un amplificador EPC-10 (HEKA Elektronik, Alemania) y se filtraron a 3-10 kHz. La disolución interna contenía (en mM): 130 K-gluconato, 10 Nagluconato, 4 NaCl, 4 MgATP, 4 fosfocreatina, 10 HEPES, y 0,3 GTP (pH 7,3 con KOH). Se añadió biocitina (concentración final 0,3-0,5 %) a la disolución de la pipeta para marcar las neuronas de las que se obtuvieron los registros. Las neuronas se visualizaron usando vídeo microscopía con DIC infrarroja. Las corrientes postsinápticas espontáneas se registraron durante 15 min a los potenciales de inversión para las corrientes GABAérgicas (-70 mV). Debe indicarse específicamente que todos los registros se hicieron en ACSF normal (MgCb 1,3 mM). Los datos almacenados se analizaron utilizando el software Mini Analysis 6.0.3 (Synaptosoft Inc., Chapel1 Hill, NC) y Origin (MicroCal, Northampton, MA). Para minimizar el potencial sesgo de muestreo, se estudiaron las crías de al menos tres partos para cada condición. Los datos se expresan como media ±S.E.M.

Potenciales de campo extracelular y registros de actividad de múltiples unidades (MUA)

Los registros se hicieron en los cortes de hipocampo usando electrodos con alambre de tungsteno (diámetro: 50 pm, California Fine Wire, Grover Beach, CA) y amplificadores con múltiples canales de bajo ruido DAM-8A (WPI, GB; filtro de paso bajo:

0,1 Hz; filtro de paso alto: 3 KHz; ganancia: x1.000). Las señales se digitalizaron usando un convertidor de analógico a digital (Digidata 1440A, Axon Instruments, EE. UU.). Se usaron los programas pCLAMP 10.1, Clampfit 10.1 (Axon Instruments, EE. UU.), MiniAnalysis 6.03 (Synaptosoft, Decatur, CA) y Origin 7.5 (Microcal Software, EE. UU.) para la adquisición y análisis de las actividades sinápticas. El intervalo de muestreo por señal fue de 100 microsegundos (10 kHz).

Vocalización

Para inducir vocalizaciones ultrasónicas, las crías de ratón se aislaron individualmente de su madre el día 8 posnatal y se colocaron en una caja de aislamiento (23*28*18 cm) ubicada dentro de un cubículo de aislamiento con atenuación del sonido (54*57*41 cm; Coulbourn Instruments, Allentown, PA, EE. UU.), y se evaluaron las vocalizaciones ultrasónicas durante un ensayo de tres minutos. Un micrófono de ultrasonido (cápsula de micrófono de condensador Avisoft UltraSoundGate CM16/CMPA, Avisoft Bioacoustics, Berlín, Alemania), colocado en el techo de la caja, era sensible a frecuencias de 10 a 250 kHz. Las vocalizaciones se registraron usando el software Avisoft Recorder (versión 4.2) con una tasa de muestreo de 250 kHz en formato de 16 bits. Para el análisis acústico, los registros se transfirieron a SASLab Pro (versión 5.2; Avisoft Bioacoustics) y se llevó a cabo una transformación rápida de Fourier (512 FFT-longitud, marco 100 %, ventana de Hamming y superposición ventana temporal 75 %). La precisión de la detección de llamadas fue verificada manualmente por un usuario informado. Se calculó un coeficiente de correlación de Pearson para evaluar la relación entre el análisis automático y manual. Hubo 0,99 correlaciones entre las dos variables. En el día posnatal 8, se examinaron los patrones de forma de onda de las llamadas en 45 sonogramas de 4 grupos de ratones (WT, FXS, WT pretratados, FXS pretratados). Cada llamada se identificó como una de 10 categorías distintas, y solo se utilizaron para esta evaluación los sonogramas en los que los ratones emitieron al menos 50 llamadas.

Estadística

Las medidas de grupo se expresan como medias ± SEM; las barras de error también indican SEM. La significancia estadística de las diferencias se evaluó con el ensayo de la t de Student. El nivel de significancia se ajustó en P<0,05.

Farmacología

Todos los fármacos se adquirieron en Sigma.

Resultados

Ejemplo 1: La secuencia de GABA excitador/inhibidor en el desarrollo está suprimida en las neuronas piramidales CA3 del hipocampo en ratones FXS.

El parto se asocia con una reducción mediada por oxitocina del cloruro intracelular ([Cl-]i) que da lugar a un desplazamiento de excitador a inhibidor de la acción de GABA (Tyzio et al., 2006). Este desplazamiento inhibidor transitorio durante el parto ejerce una acción neuroprotectora sobre las neuronas centrales reduciendo las secuelas de los episodios anóxicos. Aquí, analizamos este desplazamiento en el modelo de ratón del síndrome del X frágil (FXS).

Para determinar la fuerza impulsora para [Cl-]i (fuerza impulsora adicional de GABA (DFgaba)), utilizamos registros del canal GABAa individual no invasivos en cortes de hipocampo embrionario y posnatal (E20 a P37) de modelos animales de FXS. En ratones no tratados previamente concordantes en edad y heterocigotos, DFgaba siguió una secuencia descrita en ratas (Tyzio et al., 2006) - pero no en ratones - con un elevado [Cl-]i y DFgaba despolarizante en el útero (E20) seguido de una reducción abrupta transitoria mediada por oxitocina de [Cl-]i y desplazamiento despolarizante a hiperpolarizante de las acciones de GABA restringido a un par de horas antes y después del parto (Figura 1A, B; Tabla 1).

Tabla 1: Cambios en el desarrollo de la fuerza impulsora de GABA en ratones heterocigotos (control) y FXS. Los datos corresponden al gráfico en la Figura 1A.

Posteriormente, el GABA volvió a despolarizar las neuronas hasta P7, seguido de una disminución progresiva que da lugar a la acción de tipo adulto donde DFgaba está cerca del potencial de membrana en reposo (Figura 1; Tabla 1). Por lo tanto, en neuronas de rata y ratón sin tratamiento previo, DFgaba es fuertemente hiperpolarizante inmediatamente después del nacimiento, pero despolarizante antes de y durante la primera semana posnatal.

Por el contrario, en las neuronas FXS de edad concordante, DFgaba permaneció despolarizante de E20 a P28-37 sin diferencias significativas entre varias edades (Figura 1A), lo que indica que la curva se suprime, incluida la reducción transitoria del parto. Más precisamente, en las neuronas FXS, observamos DFgaba despolarizante en neuronas embrionarias y P7 sin tratar previamente y FXS pero significativamente más despolarizante en otras edades (Figura 1A; Tabla 1). Las aplicaciones de oxitocina (1 j M) desplazaron a DFgaba durante el período del parto (P0) en las neuronas FXS, lo que sugiere que los receptores de oxitocina están operativos (Figura 1C, Tabla 2).

Tabla 2: Cambios en la fuerza impulsora de GABA en células piramidales CA3 de cortes de hipocampo de ratones de tipo salvaje y FXS P0 en presencia de bumetanida y oxitocina. Los datos corresponden al gráfico en la Figura 1C.

El antagonista del importador de cloruro NKCC1 bumetanida que reduce [Cl"]¡ bloqueó completamente el DFgaba despolarizante en neuronas FXS en el nacimiento, lo que confirma la desrregulación persistente crónica del transporte del cloruro en el autismo (Figura 1C, Tabla 2).

Los presentes resultados proporcionan la primera demostración de una regulación defectuosa permanente de [Cl-]i en FXS, lo que presta apoyo experimental a las acciones terapéuticas exitosas de bumetanida (ejemplo de la invención) y oxitocina (ejemplo de referencia) que reducen [Cl-]i.

Ejemplo 2: Pretratamiento materno con Bumetanida en ratones FXS in vitro.

Para ensayar si las acciones despolarizantes de GABA estaban asociadas con la excitación neuronal, se ensayó el efecto del agonista del receptor de GABAa isoguvacina. En neuronas sin tratar, el agonista específico de Ga BAaR isoguvacina (2 j M) inhibió o no afectó los registros de potencial de campo en P15 (Fig. 2B y C). Para ensayar si el tratamiento materno con bumetanida antes del parto cambia la acción de GABA de excitador a inhibidor en la descendencia en P15, se trataron hembras preñadas oralmente 1 día antes del parto con bumetanida (2-2,5 mg/kg en el agua de bebida) y las neuronas de la descendencia juvenil se registraron en P15. El pretratamiento materno de FXS con bumetanida restauró los valores de control de DFgaba en la descendencia en P15 (Fig 2A) suprimió las acciones excitadoras del agonista de GABAaR isoguvacina (Fig 2 B y C) y redujo significativamente la actividad en curso y la frecuencia de sEPSC glutamatérgicas registrada en células completas (Fig. 3). Por lo tanto, las acciones excitadoras de GABA durante el parto producen efectos deletéreos a largo plazo sobre los parámetros electrofisiológicos de las neuronas juveniles de FXS. En ratones FXS, las entradas GABAérgicas son excitadoras y contribuyen a la hiperexcitabilidad de la red. La bumetanida disminuye [Cl'J y, por consiguiente, reduce la contribución de las entradas GABAérgicas excitadoras en la actividad general de la red.

Ejemplo 3: El pretratamiento materno con bumetanida restaura el comportamiento de los ratones FXS.

Se indujeron aislamiento y vocalizaciones ultrasónicas en ratones para determinar el efecto comportamental de Bumetanida en un modelo de FXS. Una mayor probabilidad de emitir llamadas descendentes y chevron en crías FXS que en WT con edad concordante (P8). Esto fue rescatado por el pretratamiento materno con bumetanida (Fig. 4, tabla 3). Por lo tanto, los niveles elevados de [Cl'} durante el parto están implicados en la patogenia del síndrome del X frágil.

Tabla 3: el análisis de 10 tipos de llamadas en el modelo de ratón FXS reveló una mayor probabilidad de emitir llamadas descendentes y chevron que las crías WT con edad concordante (P8). Ensayo de ANOVA de una vía Kruskal-Wallis, con ensayo post-hoc de comparación múltiple de Dunn y ensayo de Mann-Whitney.

Ejemplo 4: Estudio clínico.

Este ejemplo es un informe de un caso que presenta el tratamiento con bumetanida de un niño de 10 años con síndrome del X frágil.

El niño era un niño bilingüe nacido en octubre de 2002 de madre ucraniana y padre francés. Fue el primer hijo y tenía una hermana menor. Después de un embarazo normal, el parto de produjo sin dificultades (al nacer, peso: 3,335kg, talla: 50,5cm y circunferencia de la cabeza: 36cm). Fue hospitalizado entre 2 y 8 días posnatal por una hipotonía de reabsorción espontánea, su examen de ultrasonido craneal transfontanelar fue normal. Fue amamantado durante 3 meses, se sentó a los 10 meses, caminó a los 19 meses y adquirió el control de la vejiga a los 29 meses durante el día y a los 36 meses durante la noche. Recibió tratamiento quirúrgico de hernia inguinal (lado derecho) a los 10 meses y pie derecho en pendiente tratado con fisioterapia. Durante la primavera de 2004, el niño presentó un malestar al nadar con su padre con una repentina tensión generalizada seguida de un breve (unos segundos) episodio espontáneo de hipotonía y mirada vacía. Se observó un EEG normal durante la vigilia.

Las primeras preocupaciones de los padres llegaron a los 2 años debido a un retraso en el inicio del habla. El niño se emocionaba con frecuencia, parecía muy ansioso, se rascaba, palpaba y olía objetos y se negaba al contacto físico y a los abrazos. Se notó la ausencia de interacciones con otros niños en la guardería. Posteriormente, ingresó en un servicio diario de psiquiatría infantil y adolescente en mayo de 2005 (3 medios días a la semana) hasta septiembre de 2010. La rehabilitación del habla se inició en mayo de 2007. Admitido en el jardín de infancia a partir de septiembre de 2005, repitió un año en 2008 y luego estuvo acompañado por un asistente de necesidades especiales antes de ser admitido en una institución especializada (estructuras francesas llamadas CLIS e IME).

En febrero de 2008, una consulta pediátrica observó una cara angosta y alargada. Al mismo tiempo, se hizo un diagnóstico de trastorno generalizado del desarrollo. Se notó que usaba de forma intermitente un lenguaje con algunas oraciones correctas, pero con mayor frecuencia seguidas de palabras sin vínculos con el contexto. Otra prueba de EEG en marzo de 2008 no reveló ninguna anomalía durante el día (no fue posible registrar el sueño). Una segunda consulta pediátrica reveló hiperactividad, muchas manipulaciones no constructivas y estereotipias comportamentales (p. ej., buscar un teléfono durante años). Dormía con facilidad, pero despertaba con frecuencia durante la noche. Después de estos repetidos problemas de sueño, el niño recibió un tratamiento con melatonina (2 mg por la noche) que mejoró los ciclos del sueño y redujo los despertares nocturnos. En este momento, la comunicación se volvió esencialmente ecolálica. La exploración genética con cariotipo y la investigación específica del síndrome del X frágil (FXS) se realizó en mayo de 2008. Se encontró una identificación positiva de la mutación FXS.

Se realizó un diagnóstico completo en el Centre de Ressources de Bretagne (CRA) en junio de 2009. El examen psicomotor reveló una hipertonicidad axial que contrastaba con una hipotonía asociada a una hipermovilidad de manos y pies, dificultad para apreciar altura y profundidad, ausencia de lateralización, dificultades en el equilibrio y tonicidad inadecuada. Era obvio que la patología del habla y el lenguaje era más pronunciada para las palabras de más de sílabas, un flujo rápido del habla que impedía la inteligibilidad. Las pruebas semánticas revelaron un retraso de 3 años con importantes problemas de sintaxis. El niño utilizaba palabras esencialmente aisladas y expresiones verbales breves, las oraciones espontáneas eran raras y limitadas a diversas solicitudes. Se realizó la escala de Wechsler (WPPSI III). El CI de desempeño era 50 y el CI verbal era 56. Durante las pruebas, exploró el entorno y los objetos con énfasis en las modalidades sensoriales del olfato y la audición. Hubo claros déficits en las interacciones sociales, por ejemplo, el niño fue incapaz de desarrollar relaciones con sus compañeros y compartir intenciones de placer, presentando grandes dificultades con la reciprocidad socio-emotiva.

Empezando a partir del 5 de enero de 2011, el niño recibió bumetanida dos veces al día (0,5 mg por la mañana y 0,5 mg por la noche) durante tres meses. Se realizaron varios ensayos biológicos en la línea base (D0) y luego después de 7 días (D7), un mes (M1), dos meses (M2) y tres meses (M3) de tratamiento. Se revisó la hipotensión ortostática, alergia, calambres, astenia, diarrea, mialgia, artralgia, vértigo y náuseas. Los análisis de sangre incluyeron yglutamiltransferasa, transaminasas, fosfatasas alcalinas, glucemia, ácido úrico y creatina, además de Na+ y K+ en sangre.

Se realizaron cinco ensayos clínicos en la línea base (D0) y después de tres meses de tratamiento (M3) para determinar la posible eficacia terapéutica, incluyendo:

La eficacia del tratamiento se midió en la línea base (D0) y después de tres meses de tratamiento (M3) utilizando la escala GRAM (Tabla de Regulación Adaptación Modulación) para analizar la desrregulación de la actividad en un niño; la escala ABC (Lista de Verificación de Comportamiento Aberrante) para evaluar los comportamientos problemáticos de niños y adultos con retraso mental; y la escala CGI (Impresión Clínica Global) para evaluar la mejoría clínica en un paciente después de un tratamiento terapéutico.

Después de 90 días de tratamiento, los resultados de ABC se redujeron de 41 a 27. Además, los resultados de GRAM se redujeron de 56 a 31. Finalmente, el resultado de CGI fue 2, revelando una fuerte mejoría del estado clínico del paciente.

No hubo efectos secundarios en la exploración clínica realizada (es decir, hipotensión ortostática, alergia, calambres, astenia, diarrea, mialgia, artralgia, vértigo y náuseas). Los análisis de sangre convencionales tampoco se vieron afectados (es decir, Y-glutamiltransferasa, transaminasas, fosfatasas alcalinas, glucemia, ácido úrico, creatina).

La Tabla 4 muestra que el peso corporal no se alteró y el Na+ sanguíneo se mantuvo estable. El K+ se redujo hasta un valor próximo al límite inferior (3,5 mmoles/l). La natremia no se vio alterada por el tratamiento.

Tabla 4: Peso y iones en sangre durante los 3 meses de tratamiento.

Obsérvese que el tratamiento con bumetanida continuó después de 3 meses. El K+ se redujo al valor del límite inferior, por lo que se añadió jarabe de gluconato de potasio (es decir, una pera por la mañana y por la noche), a partir del 17 de mayo de 2011 (4° mes de tratamiento). Esto dio lugar a una recuperación de K+ normal (3,71 mmoles/l) un mes después (es decir, el 11 de junio de 2011).

Tomados conjuntamente, estos resultados muestran la eficacia de la bumetanida para el tratamiento del síndrome del X frágil.

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Una composición para su uso en el tratamiento del síndrome de X frágil en un sujeto que lo necesita, en donde dicha composición comprende un modulador de un transportador de cloruro,

en donde dicho modulador es un inhibidor de un transportador implicado en la importación de cloruro en las neuronas, en donde dicho transportador es NKCC1,

en donde el inhibidor de NKCC1 se selecciona del grupo que consiste en bumetanida,

un análogo de bumetanida, furosemida, ácido etacrínico, torsemida, azosemida, muzolimina, piretanida, y tripamida, y

en donde el análogo de bumetanida se selecciona del grupo que consiste en aldehído de bumetanida, dibencilamida de bumetanida, dietilamida de bumetanida, éster morfolinoetílico de bumetanida, éster 3-(dimetilaminopropílico) de bumetanida, éster N,N-dietilglicolamida de bumetanida, éster dimetilglicolamida de bumetanida, éster pivaxetílico de bumetanida, éster metoxi(polietilenoxi)n-1-etílico de bumetanida, sal de benciltrimetil-amonio de bumetanida, sal cetiltrimetilamonio de bumetanida, éster pivaloiloximetílico de bumetanida, éster metílico de bumetanida, éster N,N-dimetilaminoetílico de bumetanida, tioácido [-(C=O)-SH] de bumetanida, tioéster S-metílico de bumetanida, tioéster S-cianometílico de bumetanida, tioéster S-etílico de bumetanida, tioéster S-isoamílico de bumetanida, tioéster S-octílico de bumetanida, tioéster S-bencílico de bumetanida, tioéster S-(morfolinoetílico) de bumetanida, tioéster S-[3-(dimetilaminopropílico)] de bumetanida, tioéster S-(N,N-dietilglicolamido) de bumetanida, tioéster S-(N,N-dimetilglicolamido) de bumetanida, tioéster S-pivaxetílico de bumetanida, tioéster S-propaxetílico de bumetanida, tioéster S-(metoxipolietilenoxi)n-1-etílico] de bumetanida, sal de tioácido [-(C=O)-S'] benciltrimetil-amonio de bumetanida y sal de tioácido [-(C=O)-S] cetiltrimetilamonio de bumetanida; tioácido de bumetanida metaestable, tioaldehído de bumetanida, tioéster O-metílico de bumetanida, tioéster O-cianometílico de bumetanida, tioéster O­ etílico de bumetanida, tioéster O-isoamílico de bumetanida, tioéster O-octílico de bumetanida, tioéster O-bencílico de bumetanida, tioéster O-(morfolinoetílico) de bumetanida, tioéster O-[3-(dimetilaminopropílico)] de bumetanida, tioéster O-(N,N-dietilglicolamido) de bumetanida, tioéster O-pivaxetílico de bumetanida, tioéster O-propaxetílico de bumetanida, tioéster O-[metoxi(polietilenoxi)n-1 etílico] de bumetanida, sal de tioácido [-(C=S)-O'] benciltrimetil-amonio de bumetanida y sal de tioácido [-(C=S)-O'] cetiltrimetilamonio de bumetanida.

2. La composición para su uso según la reivindicación 1, en donde el inhibidor de NKCC1 se selecciona del grupo que consiste en bumetanida, furosemida, ácido etacrínico, torsemida, azosemida, muzolimina, piretanida y tripamida.

3. La composición para su uso según la reivindicación 1 o 2, en donde el inhibidor de NKCC1 es bumetanida.

4. La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la cantidad de la composición varía de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 500 mg.

5. La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la composición debe administrarse al sujeto que lo necesite mediante administración subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraocular, transdérmica, tópica, parenteral, intranasal u oral, o por inyección.

6. La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el sujeto que lo necesita presenta un número de repeticiones CGG en la 5'-UTR de FMR1 de al menos 55, preferiblemente de al menos 200.

7. La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el sujeto que lo necesita ha sido diagnosticado con el síndrome del X frágil.

8. La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el sujeto que lo necesita presenta riesgo de desarrollar el síndrome del X frágil.

9. La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el sujeto que lo necesita es un feto y la composición debe administrarse a su madre.