ES2827149A1 - Peptidos que contienen d-alanina (d-ala) o aminoalcoholes relacionados - Google Patents

Peptidos que contienen d-alanina (d-ala) o aminoalcoholes relacionados Download PDF

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Del Portillo Francisco Garcia
Perez Gadea Rico
Marques Estel Ramos
Garcia Ana San-Felix
Diaz Sonsoles Velazquez
La Puente Secades Sofia De
Doyagüez Elisa Garcia
Castro De La Osa Sonia De
Morrone Maria Graciela Pucciarelli
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Abstract

Péptidos que contienen D-Alanina (D-Ala) o aminoalcoholes relacionados. La invención se refiere a péptidos de fórmula general I, donde el extremo carboxilo terminal (D-Alanina, D-Ala) es reemplazado por un aminoalcohol análogo. La invención también se refiere a su procedimiento de síntesis y al uso de los péptidos mencionados para el tratamiento de enfermedades inflamatorias.

Description

DESCRIPCIÓN
PÉPTIDOS QUE CONTIENEN D-ALANINA (D-ALA) O AMINOALCOHOLES
RELACIONADOS
La invención se refiere a péptidos de fórmula general I, donde el extremo carboxilo terminal (D-Alanina, D-Ala) se ha sustituido por un aminoalcohol análogo. La invención también se refiere a su procedimiento de síntesis y al uso de los péptidos mencionados para el tratamiento de enfermedades inflamatorias.
ESTADO DE LA TÉCNICA
El peptidoglicano es un componente esencial de la pared celular de la mayoría de las bacterias. En células de mamífero, la inmunidad innata controla infecciones bacterianas intracelulares mediante el reconocimiento de los fragmentos de peptidoglicano por receptores citosólicos denominados proteína 1 y 2 del dominio de oligomerización de unión a nucleótidos (NOD1 y NOD2). Ambos receptores tienen un patrón de reconocimiento diferente. La unión de los fragmentos de peptidoglicano a estos receptores culmina en la activación del regulador de la respuesta inflamatoria, NFkB (Caruso et al., 2014; Keestra-Gounder et al., 2016; Keestra-Gounder y Tsolis, 2017).
El receptor NOD1 es expresado por todos los tipos de células, incluyendo células inmunitarias y no inmunitarias, tales como epiteliales y fibroblastos (Caruso et al., 2014). El fragmento mínimo de peptidoglicano reconocido por NOD1 es el dipéptido ácido D-glutámico-meso-ácido diaminopimélico (D-Glu-meso-DAP) (Girardin et al., 2003).
La bacteria Gram-negativa Salmonella enterica (S. enterica) causa infecciones intracelulares que producen patologías gastrointestinales tras el consumo de alimentos o agua contaminados (Monack, 2012; Rivera-Chavez y Baumler, 2015; Thiennimitr et al., 2012). Este patógeno también puede causar infecciones asintomáticas crónicas y persistentes en seres humanos y en ganado (Monack, 2012).
Usando un modelo in vitro de infección basado en el uso de fibroblastos, se ha demostrado que S. enterica "persiste" dentro de estas células sin ser destruida por los sistemas de defensa. Durante esta infección persistente, se aisló una pequeña cantidad de peptidoglicano de bacterias intracelulares. La masa molecular (m/z) de un fragmento del peptidoglicano no convencional aislado era de 928,42 Da. Esta masa molecular corresponde con una sustitución del aminoácido terminal D-alanina [D-Ala: -NHCH(CH3)COOH], presente en el tetrapéptido convencional 1 (PGN-1) por un aminoalcohol similar. Por lo tanto, la masa molecular podría corresponder con una molécula de [N-acetil-glucosamina-N-acetil-muramil]-D-alanina(D-Ala)-D-ácido glutámico(D-Glu)-meso-DAP-X, en la que X podría ser D-alanilol (NHCH(CH3)CH20H), presente en el tetrapéptido 2 (PGN-2); o 1-amino-2-propanol (NHCH2CH(OH)CH3), presente en el tetrapéptido 3 (PGN-3). El resto X estaña unido al resto de la molécula a través de su grupo NH2. Este tipo de modificación, que se detecta "exclusivamente" cuando el patógeno está dentro de la célula eucariota, podría tener consecuencias en el reconocimiento del péptido no convencional resultante por NOD1. La defensa atenuada observada en fibroblastos infectados por Salmonella podría deberse a la falta de reconocimiento del péptido modificado por NOD1 o, como alternativa, podría deberse a la inactivación del receptor de NOD1 por el péptido modificado. En cualquiera de los dos escenarios, NFkB de los fibroblastos infectados por Salmonella muestra un bajo grado de activación. Este tipo de alteración ha sido observada previamente por nuestro grupo de investigación (Ramos-Marqués, et al. “Virulence”, 2017, 8, 719-740).
Para demostrar si la modificación con aminoalcohol del tetrapéptido convencional PGN-1 altera su reconocimiento por NOD1 se requieren cantidades de los tetrapéptidos no convencionales mencionados anteriormente mucho mayores a las obtenidas a partir de bacterias intracelulares.
Por lo tanto, sería deseable tener un método de síntesis para obtener grandes cantidades de estos tetrapéptidos no convencionales para probarlos como moduladores de los estados de inflamación, en especial, como inhibidores de NOD1. Estos compuestos podrían considerarse una alternativa a los antiinflamatorios de tipo esteroideo, muchos de los cuales presentan bastantes efectos secundarios.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Un primer aspecto de la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula general I:
Figure imgf000004_0001
donde:
Ri es hidrógeno, metilo, isopropilo, isobutilo, fenilmetileno, hidroxifenilmetileno o fenilindolilmetileno;
R2 es C1-4 alquilo, -OR3 o -COOR3, donde C1-4 alquilo está opcionalmente sustituido por un grupo -OR3 en cualquier posición disponible; y
cada R3 es independientemente hidrógeno o C1-4 alquilo,
con la condición de que el compuesto PGN-1 se excluye de la definición de fórmula general I:
Figure imgf000004_0002
En otra realización, la invención se refiere al compuesto de fórmula general I, donde R1 es metilo.
En otra realización, la invención se refiere al compuesto de fórmula general I, donde R2 es C1-4 alquilo o -OR3, y C1-4 alquilo está opcionalmente sustituido por un grupo -OR3 en cualquier posición disponible.
En otra realización, la invención se refiere al compuesto de fórmula general I, donde R3 es hidrógeno.
En otra realización, la invención se refiere al compuesto de fórmula general I, seleccionado entre:
Figure imgf000005_0001
PGN-3
Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula general I.
Un tercer aspecto de la invención se refiere a un proceso de obtención de un compuesto de fórmula general I:
Figure imgf000005_0002
donde:
Ri es hidrógeno, metilo, isopropilo, isobutilo, fenilmetileno, hidroxifenilmetileno o fenilindolilmetileno;
R2 es C1-4 alquilo, -OR3 o -COOR3, donde C1-4 alquilo está opcionalmente sustituido por un grupo -OR3 en cualquier posición disponible; y
cada R3 es independientemente hidrógeno o C1-4 alquilo,
que comprende la reacción entre un compuesto de fórmula II y un compuesto de fórmula III en presencia de una base, preferentemente DIPEA, y un reactivo de acoplamiento, preferentemente seleccionado entre HBTU y HATU:
Figure imgf000006_0001
donde Ri y R2 tienen el significado descrito anteriormente para un compuesto de fórmula I, y PG1 y PG2 representan respectivamente grupos protectores de amina y ácido carboxílico, seguida de la eliminación de los grupos protectores PG1 y PG2.
En otra realización, la invención se refiere al proceso de obtención de un compuesto de fórmula general I, donde el compuesto de fórmula general I se seleccionaentre:
Figure imgf000006_0002
Figure imgf000007_0001
PGN-3
Un cuarto aspecto de la invención se refiere a un compuesto de fórmula general I o a una composición farmacéutica del mismo:
Figure imgf000007_0002
donde:
Ri es hidrógeno, metilo, isopropilo, isobutilo, fenilmetileno, hidroxifenilmetileno o fenilindolilmetileno;
R2 es C1-4 alquilo, -OR3 o -COOR3, donde C1-4 alquilo está opcionalmente sustituido por un grupo -OR3 en cualquier posición disponible; y
cada R3 es independientemente hidrógeno o C1-4 alquilo,
para su uso en el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad que cursa con inflamación.
En otra realización, la invención se refiere al compuesto de fórmula general I para su uso en el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad inflamatoria, donde el compuesto se selecciona entre:
Figure imgf000008_0001
PGN-3
En otra realización, la invención se refiere al compuesto de fórmula general I para su uso en el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad cursada con inflamación, donde la inflamación se selecciona entre infecciones microbianas y reacciones alérgicas a formulaciones derivadas de la pared celular microbiana que contienen peptidoglicano, y trastornos inmunitarios y autoinmunitarios.
En otra realización, la invención se refiere al compuesto de fórmula general I para su uso en el tratamiento y/o la prevención de infecciones microbianas y, preferentemente, para su uso en el tratamiento y/o la prevención de infecciones microbianas con patología inflamatoria asociada donde el agente etiológico se selecciona entre bacterias, virus, hongos y protozoos.
En otra realización, la invención se refiere al compuesto de fórmula general I para su uso en el tratamiento y/o la prevención de infecciones bacterianas seleccionadas entre salmonelosis, listeriosis y enfermedades causadas por patógenos bacterianos intracelulares que producen un peptidoglicano que contiene meso-DAP reconocido por NOD1.
En otra realización, la invención se refiere al compuesto de fórmula general I para su uso en el tratamiento y/o la prevención de trastornos inmunitarios y autoinmunitarios seleccionados entre enfermedades inflamatorias del intestino y artropatías.
En la presente invención, el término “C1-4 alquilo”, como un grupo o parte de un grupo, significa una cadena de alquilo lineal o ramificada que contiene de 1 a 4 átomos de carbono e incluye los grupos metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo y ferc-butilo.
El grupo protector “PG1” se refiere a un grupo protector amino. Los ejemplos incluyen, entre otros, grupos protectores terc-butilooxicarbonilo (BOC) o carboxibencilo (Cbz).
El grupo protector ácido carboxílico “PG2” incluye, entre otros, ferc-butilo, metilo, etilo y bencilo.
El reactivo de acoplamiento incluye, entre otros, HATU (hexafluorofosfato de 1-[bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio-3-óxido o Hexafluorofosfato Azabenzotriazol Tetrametil Uronio), HBTU ((hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio o hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxitripirrolidinofosfonio (PyBOP).
Como se ha mencionado anteriormente, la síntesis de los tetrapéptidos de fórmula general I plantea un gran reto sintético, ya que todos ellos tienen en su estructura un resto de ácido meso-diaminopimélico (meso-DAP), un aminoácido inusual con dos centros estereogénicos que tienen diferente estereoquímica y se sustituyen de manera diferente. Además de una vía sintética alternativa, la presente invención incluye la caracterización inequívoca, mediante RMN y espectrometría de masas, de los compuestos sintetizados.
Los tetrapéptidos PGN-1, PGN-2 y PGN-3 se sintetizaron como se indica en el Esquema 3 para ser ensayados como agonistas/antagonistas de la proteína 1 del dominio de oligomerización de unión a nucleótidos (Nod 1) que está implicada en las respuestas inflamatorias contra los patógenos microbianos. Esta síntesis se ve obstaculizada por la dificultad que supone la obtención del fragmento de ácido meso-2,6-diaminopimélico (DAP), presente en las estructuras de estos compuestos. DAP es un aminoácido inusual con dos centros quirales con diferente estereoquímica, dos grupos amina y dos carboxilo. La síntesis de derivados de DAP supone un gran reto sintético ya que implica una selección cuidadosa de los grupos protectores (ortogonalmente) de los dos grupos carboxílico y amina presentes en su estructura para introducir selectivamente las modificaciones deseadas. Además, es fundamental el uso de condiciones de reacción adecuadas para evitar la racemización y controlar la quiralidad de los compuestos diana.
El fragmento DAP se preparó mediante una reacción de metátesis cruzada de olefinas entre derivados de alilglicina y vinilglicina adecuadamente protegidos usando un catalizador Grubb de segunda generación, seguida de la reducción del doble enlace del producto de acoplamiento cruzado resultante.
La síntesis comenzó cuando el compuesto Boc-(D)-alilglicina-OtBu 2, obtenido por tratamiento de (D)-alilglicina con Boc-anhídrido y terc-butil-2,2,2-tricloroacetimidato (Deborah et al., 2003), se hizo reaccionar durante la noche con un pequeño exceso (2,7 eq) del reactivo comercial Cbz-vinilglicina-OMe 3 en presencia del catalizador de Grubbs de segunda generación, proporcionando el producto de acoplamiento cruzado 4 con un rendimiento aceptable (50 %) (Esquema 1) (Ziga et al., 2013). La hidrogenación catalítica de 4, en presencia de Pd/C en acetato de etilo, dio lugar a la reducción del doble enlace con la eliminación simultánea del grupo protector W-benciloxicarbonilo (Cbz), obteniéndose el derivado de DAP 5 (% cuant.). Dicho compuesto es un intermedio de reacción clave porque posee un grupo amino libre, ideal para su funcionalización. El acoplamiento de 5 con Fmoc-D-Glu-OtBu en presencia de hexafluorofosfato de 1-[bis(dimetilamino)metileno]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-6]piridinio-3-óxido (HATU) como reactivo de acoplamiento y W,W-di-isopropiletilamina (DIPEA) como base condujo al dipéptido 6 (67 %) (Esquema 2). El tratamiento de 6 con piperidina en DMF (20 %), para eliminar el grupo protector Fmoc, condujo a un intermedio con un grupo amino libre que se hizo reaccionar de inmediato, sin purificación, con Fmoc-D-Glu-0*Bu en presencia de HATU y DIPEA, para dar el tripéptido 7. El tratamiento de 7 con LiOH/H20, seguido de acidificación a pH = 2, condujo con rendimiento cuantitativo al compuesto 8 (Esquema 2), con un grupo ácido carboxílico libre, que es el producto intermedio clave de las etapas sintéticas posteriores. A continuación, el intermedio 8 se hizo reaccionar respectivamente con H-D-Ala-OtBu, terc-butil-D-alaninol y terc-butil-1-amino-2-propanol en presencia de HATU/DIPEA, obteniéndose los tetrapéptidos correspondientes 9 (68 %), 10 (60 %) y 11 (65%) (Esquema 3). El posterior tratamiento con TFA en diclorometano (20%), para eliminar simultáneamente los grupos protectores Boc y terc-butilo, proporcionó los PGN-1, PGN-2 y PGN-3 con rendimiento cuantitativo (Esquema 3). Las sales de cloruro se obtuvieron mediante el tratamiento de una solución del péptido correspondiente en agua con varias gotas de ácido clorhídrico (37 %) y posterior liofilización.
La caracterización de estos compuestos se realizó mediante espectroscopia de RMNde1H y 13CyHRMS.
Con los tetrapéptidos obtenidos, se llevarán a cabo estudios de actividad biológica tanto en modelos de cultivo celular como en modelos de ratones transgénicos deficientes en este receptor que poseen indicadores para medir la actividad NFkB.
Salvo que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto habitual en la técnica a la que pertenece la presente invención. En la práctica de la presente invención pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones, la palabra "comprender" y sus variaciones no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o etapas. Objetos adicionales, ventajas y características de la invención resultarán evidentes para los expertos en la materia tras examinar la descripción o pueden aprenderse mediante la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración y no pretenden ser limitantes de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
FIG. 1. Efecto de los péptidos PGN-1, PGN-2 y PGN-3 en la estimulación de la cascada de señalización de NOD1/NF-kB. Se microinyectaron los péptidos en fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) de ratones transgénicos que expresaban GFP-p65. La translocación nuclear de la subunidad p65 de NF-kB se controló mediante microscopía de fluorescencia. Los péptidos se microinyectaron en una solución que contenía dextrano rojo Texas (70 kDa), que sirvió como indicador para identificar las células microinyectadas.
EJEMPLOS
Materiales v métodos
Síntesis de péptidos. A menos que se indique lo contrario, se usaron reactivos y disolventes comerciales tal y como se recibieron de los proveedores sin purificación adicional. Los disolventes usados en algunas reacciones se secaron antes de su uso. La DMF seca estaba disponible en el mercado (Aldrich).
La cromatografía analítica de capa fina (TLC) se realizó en placas de aluminio previamente recubiertas con gel de sílice 60 (F254, 0,25 mm). Los productos se visualizaron usando una lámpara ultravioleta (254 y 365 nm) o calentando en una placa caliente (aprox. 2000C), directamente o después del tratamiento con una solución al 5 % de ácido fosfomolíbdico, ninhidrina o vanillina en etanol.
Los compuestos se purificaron mediante: a) cromatografía en columna flash sobre gel de sílice (230-400 mesh, Merck 60); b) cromatografía circular centrífuga en capa fina (CCTLC) en cromatotrón (chromatotron®), empleando placas de 1 mm de espesor (Kiesegel 60 PF254 gipshaltig, Merck) y velocidad de flujo 2-4 ml/min.
Los análisis de HPLC, se realizaron en un cromatógrafo Agilent (CL 1120 Compact de Agilent Technologie) con una columna de fase reversa ACE 5 C18-300 (4,6 mm x 150mm, 3,5pm) dotado de un detector de PDA (matriz de diodos fotoeléctricos) Waters 2996. Como fase móvil se empleó acetonitrilo (fase móvil A), y agua con 0,05% de TFA (fase móvil B), velocidad de flujo 1 mi • min-1. Todos los tiempos de retención se indican en minutos, y los gradientes se especifican para cada compuesto en los datos experimentales.
Para la espectrometría de masas de alta resolución (HRMS), se usó un equipo QTOF Accurate Mass Agilent 6520 (tiempo de vuelo de cuadrúpolo) acoplado con CL/EM usando una interfaz de electronebulización (ESI) funcionando en modo positivo (ESI+) y negativo (ESI-).
Los espectros de RMN (RMN de 1H, 13C) se registraron en los espectrómetros UNIT INOVA-300 de Varían (300 MHz), AVANCE 300 de Bruker (300 y 75 MHz), INOVA-400 de Varían (400 y 100 MHz), MERCURY-400 de Varían (400 y 100 MHz) y Varian-500 (500 y 125 MHz), usando (CD3)2SO y CDCI3 como disolventes. Los valores de desplazamiento químico (ó) se presentan en partes por millón (ppm) en relación con el tetrametilsilano (TMS) en 1H y CDCI3 (5 = 77,0) en RMN de 13C. La constante de acoplamiento (valores de J) se presenta en hercios (Hz), y las multiplicidades de señales se indican mediante el siguiente símbolo: s (singlete), d (doblete), t (triplete), c (cuadruplete), m (multiplete) y sa (singlete ancho). Se realizaron espectros bidimensionales (COSY, HSQC y HMBC) para identificar la estructura de los compuestos finales.
Los compuestos finales se liofilizaron usando un sistema Telstar 6-80.
Boc-(R)-Alilglicina-OH (1)
Figure imgf000013_0001
Se disolvió (R)-2-alilglicina (1 g, 8,69 mmol, 1 equiv.) en una mezcla de NaOH 1 M (20ml) y dioxano (10ml). Se añadió anhídrido de Boc (3,79 g, 17,38mmol, 2 equiv.) mientras se enfría con hielo. La mezcla de reacción se dejó que alcanzara la temperatura ambiente, y se continuó la agitación durante 18h. Una vez finalizada la reacción, se concentró la mezcla a presión reducida, y se lavó la fase acuosa con éter dietílico para retirar el exceso de anhídrido de Boc. Se ajustó el pH hasta 2,5 con HCI y se extrajo la mezcla con EtOAc (3 x 20 mi). La fase orgánica se secó sobre MgSÜ4 y se concentró a presión reducida. El compuesto deseado (1) se obtuvo en forma de un aceite incoloro (1,68 g, 89 %).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-da) 57,02 (d, J = 8,1 Hz, 1H, NH), 5,85 - 5,69 (m, 1H, CH=CH2), 5,17-4,96 (m, 2H, CH=CH2), 3,93 (m, 1H, Ha), 2,36 (m, 2H, CH2), 1,38 (s, 9H, OtBu).
Este compuesto ha sido descrito previamente por Kilian et al., 2016.
Boc-(R)-Alilglicina-OtBu (2)
Figure imgf000014_0001
Se disolvió Boc-(R)-AlilGli-OH 1 (935,4 mg, 4,35 mmol, 1 equiv.) en 8 mi de una mezcla de diclorometano anhidro: tetrahidrofurano (4:1). A la disolución, se le añadió mientras se agitaba terc-butil-2,2,2-tricloroacetimidato (3,08 mi, 17,38 mmol, 4 equiv.). La reacción se agitó bajo atmósfera de argón a temperatura ambiente durante una noche y posteriormente se concentró a presión reducida. El residuo se lavó con NaHC03 (3 x 100 mi) y salmuera (3 x 100 mi). La fase orgánica se secó (MgSÜ4), filtró y evaporó. El bruto de reacción se purificó mediante cromatografía de columna flash empleando (Hex:AcOEt, 1:1) como eluyente para obtener, 845 mg (71 %) de 2 en forma de un aceite incoloro. HPLC [gradiente: A:B, 50-100% de A en 10min]: 5,11 min.
1H-RMN (400 MHz, Cloroformo-d) 55,76 - 5,64 (m, 1H, CH=CH2), 5,15 - 5,07 (m, 2H, CH=CH2), 5,04 (d, J= 8,1 Hz, 1H, NH), 4,25 (m, 1H, Ha), 2,48 (m, 7,1 Hz, 2H, CH2), 1,45 (s, OtBu).
Este compuesto ha sido descrito previamente por Deborah et al., 2003.
1-Metil-7-ferc-butil-(2S,6R)-2-(benciloxicarbonilamino)-6-[(fercbutoxicarbonil)amino]-hept-3-enedioato (4)
Figure imgf000015_0001
Sobre una disolución del derivado de alilglicina 2 (366 mg, 1,35 mmol) y Cbz-(S)-vinilglicina-OMe 3 (674mg, 2,70mmol) en diclorometano (10ml) se burbujeó Ar durante 5 min. A continuación se añadió el catalizador de Grubbs de segunda generación (Gil) (115mg, 10% molar) y la mezcla de reacción se agitó a 30 °C durante una noche y posteriormente se concentró a vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía de columna flash empleando (Hex:EtOAc, 5:1) como eluyente, obteniéndose 336 mg (50 %) de 4 en forma de un aceite marrón amarillento. HPLC [gradiente: A:B, 10-100 % deAen 10 min]: 9,7 min.
1H-RMN (400 MHz, Cloroformo-d) 5 7,26 (m, 5H, Cbz), 5,72 - 5,39 (m, 3H, CH=CH y NH), 5,03 (m, 3H, CH2 y NH), 4,80 (m, 1H, Ha), 4,17 (m, 1H, Ha), 3,67 (s, 3H, CH3), 2,52-2,27 (m, 2H, CH2), 1,36 (s, OtBu y Boc). MS (ES+): m/z 493,3 (M+H)+.
Este compuesto ha sido descrito previamente por Ziga et al., 2013.
1-Metil-7-ferc-butil-(2S,6R)-W€-(íerc-butoxicarbonil)-2,6-diaminopimelato (5)
Figure imgf000015_0002
Una disolución del compuesto insaturado 4 (336 mg, 0,68 mmol) en acetato de etilo se calienta a 30 °C y se somete durante 4-6 h a hidrogenación a presión atmosférica en presencia de Pd/C al 10 % (10 % en peso). Para ello se empléo un globo lleno de gas hidrógeno y un matraz de vidrio como recipiente de reacción. Se filtró el Pd/C a través de papel de filtro Whatman® 42 y se evaporó el disolvente a presión reducida, obteniéndose 234 mg (cuant.) del compuesto deseado en forma de un sólido blanco amorfo. 1H-RMN (400 MHz, Cloroformo-d) 57,95 (s, 1H, NH), 5,01 (d, J= 8,4 Hz, 1H, NH), 4,09 (m, 1H, Ha), 3,65 (s, 3H, CH3), 3,38 (dd, J= 7,3; 5,4 Hz, 1H, Ha), 1,82 - 1,62 (m, 5H, CH2), 1,60 - 1,44 (m, 1H, CH2), 1,38 (s, OtBu y Boc). MS (ES+): m/z 361,23 (M+H)+.
1-Metil-7-ferc-butil-(2S,6R)-Wa-(W-fluoren-9-ilmetoxicarbonil-D-glutamil-a-fercbutiléster)-W€-(íerc-butoxicarbonil)-2,6-diaminopimelato (6)
Figure imgf000016_0001
A una disolución del intermedio 5 (meso-DAP) convenientemente protegido (132mg, 0,36mmol) en DMF (10 mi), se le añadieron Fmoc-(R)-Glu-OtBu (187 mg, 0,43 mmol), HATU (182 mg, 0,43 mmol) y DIPEA (142 pl, 0,81 mmol). La mezcla de reacción se agitó a 30 °C durante una noche y después se evaporó a sequedad. El residuo se disolvió en diclorometano (20 mi) y se lavó sucesivamente con disoluciones acuosas de ácido cítrico (10 %) (3 x 20 mi), solución saturada de NaHC03 (3 x 20 mi), y salmuera (3 x 20 mi). La fase orgánica se secó (Na2S04 anhidro), filtró y evaporó a sequedad. El residuo se purificó mediante cromatografía circular centrífuga empleando Hex:EtOAc (6:4 a 1:1) como eluyente, obteniéndose 191 mg (67 %) del compuesto 6 en forma de un jarabe incoloro. HPLC [gradiente: A:B, 50-100% de A en 10min]: 7,7 min. 1H-RMN (400 MHz, Cloroformo-d) 57,70 (d, J=7 ,6 Hz, 2H, FMOC), 7,54 (d, J = 7,5 Hz, 2H, FMOC), 7,33 (t, 2H, FMOC), 7,25 (t, 2H, FMOC), 6,62 (d, J= 7,8 Hz, 1H, NH), 5,56 (d, J= 8,1 Hz, 1H, NH), 4,99 (d, J = 8,2 Hz, 1H, NH), 4,49 (m, 1H, Ha), 4,34 (m, 3H, Ha y CH2FMOC), 4,15 (s, 1H, Ha), 4,06 (s, 1H, Ha), 3,65 (s, 3H, OMe), 2,22 (m, 3H, CH2), 1,80 (m, 2H, CH2), 1,67 (m, 2H, CH2), 1,55 (m, 3H, CH2), 1,37 (s, 27H, Boc y OtBu). MS (ES+): m/z 761,40 (M+H)+.
1-Metil-7-ferc-butil-(2S,6R)-Wa-[W-(W-ferc-butoxicarbonil-L-alanil)-D-glutamil-aferc-butiléster]-W€-(íerc-butoxicarbonil)-2,6-diaminopimelato (7)
Figure imgf000017_0001
El intermedio 6 (191 mg, 0,24mmol) se disolvió en una disolución de piperidina:DMF (20 %). La reacción se agitó durante 4 horas a temperatura ambiente. Se evaporó el disolvente a presión reducida, obteniéndose 135mg (cuant.) de la correspondiente amina libre, que se empleó directamente para la siguiente etapa de reacción.
Una disolución de la amina anterior (135 mg, 0,24 mmol) en DMF (10 mi) se trató con Boc-L-Ala-OH (56,1 mg, 0,29 mmol), HATU (122,8 mg, 0,29 mmol) y DIPEA (95 pl, 0,54 mmol). La mezcla de reacción se agitó a 30 °C durante una noche y después se evaporó a sequedad. El residuo se disolvió en diclorometano (20 mi) y se lavó sucesivamente con soluciones acuosas de ácido cítrico (10%) (3 x 20ml), solución saturada de NaHC03 (3 x 20 mi), y salmuera (3 x 20 mi). La fase orgánica se secó (Na2S04 anhidro), filtró y evaporó a sequedad. El residuo se purificó mediante cromatografía circular centrífuga empleando diclorometano:MeOH (100 a 10:1) como eluyente, obteniéndose 120mg (67%) de compuesto 7 en forma de una espuma amarilla. 1H-RMN (400 MHz, Cloroformo-d) 67,00 (s, 1H, NH), 5,03 (d, J= 8,2 Hz, 1H, (d, J =7,1 Hz, 3H, CH3). MS (ES+): m/z 718,42 (M+H)+.
1-Carboxi-7-ferc-butil-(2S,6R)-Wa-[W-(W-ferc-butoxicarbonil-L-alanil)-D-glutamil-aferc-butiléster]-W€-^feA'c-butoxicarbonil)-2,6-diaminopimelato (8)
Figure imgf000018_0001
A una disolución a0°C del metiléster 7 (84 mg, 0,11 mmol) en THF (10 mi), se añadió una segunda disolución de LiOHH20 (4,95 mg, 0,11 mmol) en agua (2,5 mi). La disolución resultante se agitó a temperatura ambiente durante una noche. A continuación, se añadió una disolución acuosa de ácido clorhídrico (1 N) hasta alcanzar un pH = 3-4, y la mezcla se evaporó a sequedad. El residuo se disolvió en isobutanol (20 mi) y se lavó con H2O (3 x 20 mi). La fase orgánica se secó sobre Na2S04 anhidro, se filtró y se evaporó a sequedad, obteniéndose 56,8 mg (68 %) de 8 en forma de un jarabe amarillo. HPLC [gradiente: A:B, 50-100% de A en 10min]: 6,55 min. 1H-RMN (400 MHz, DMSO-cfe) 58,08 (d, J = 7,8 Hz, 1H, NH), 8,02 (d, J = 7,9 Hz, 1H, NH), 7,05 (d, J= 7,7 Hz, 1H, NH), 6,81 (d, J= 7,8 Hz, 1H, NH), 4,26-3,86 (m, 3H, Ha), 3,74 (m, 1H, Ha), 2,17 (dd, J = 13,3; 5,5 Hz, 2H, CH2), 1,98 - 1,71 (m, 3H), 1,66-1,36 (m y s,41H, Boc, OtBuyCH2), 1,18 (d, J =7,1 Hz, 3H, CH3). MS (ES+): m/z 703,41 (M+H)+.
1-(D-alanil terc -buti\éster)-7-terc-buti\-( 2S,6R)-Na-[N-(N-terc- butoxicarboni\-L- alanil)-D-glutamil-a-ferc-butiléster]-Ne-(ferc-butoxicarbonil)-2,6-diaminopimelato
(9)
Figure imgf000019_0001
A una disolución del intermedio ácido 8 (68,5 mg, 0,097 mmol) en DMF (10 mi), se añadieron H-D-Ala-OtBu (21,2 mg, 0,12mmol), HATU (40,3mg, 0,09mmol) y DIPEA (39 pl, 0,19 mmol). La mezcla de reacción se agitó a 30 °C durante una noche y después se evaporó a sequedad. El residuo se disolvió en diclorometano (20 mi) y se lavó sucesivamente con soluciones acuosas de ácido cítrico (10%) (3 x 20 mi), solución saturada de NaHC03 (3 x 20 mi), y salmuera (3 x 20 mi). La fase orgánica se secó (Na2S04 anhidro), filtró y evaporó a sequedad. El residuo se purificó mediante cromatografía circular centrífuga empleando diclorometano:MeOH (100:1 a 20:1) como eluyente, obteniéndose 55 mg (68 %) del compuesto 9. EM (ESI+): m/z 830,5 (M+H)+.
1H-RMN (400 MHz, Acetona-cfe) 57,67 (d, J= 7,5 Hz, 1H, NH), 7,53 (d, J= 8,4 Hz, 1H, NH), 7,35 (d, J= 7,6 Hz, 1H, NH), 6,27 (s, 1H, NH), 5,94 (d, J = 8,3 Hz, 1H, NH), 4,19 (m, 3H, Ha), 4,01 (m, 1H, Ha), 3,84 (m, 1H, Ha), 2,19 (m, 4H, CH2), 1,80-1,45 (m, 4H, CH2), 1,42 - 1,27 (m, 47H, Boc, OtBu y CH2), 1,23 (2d, J = 2,33 Hz, 3H, CH3), 1,22 (d, J =2,46Hz, 3H,CH3).
(S)-Alanil-Y-(R)-glutamil-meso-diaminopimelil-(R)-alanina (PGN-1)
Figure imgf000020_0001
A una disolución del intermedio protegido 9 (55 mg, 0,06 mmol) en diclorometano (10ml), se añadió trifluoroacético (TFA). Después de agitar a temperatura ambiente durante la noche, la disolución se evaporó a sequedad. El residuo se coevaporó varias veces con una mezcla de diclorometano y metanol para retirar el TFA residual.
1H-RMN (500 MHz, Metanol-d4) 64,40 (m, 3H, Ha), 3,99 (m, 1H, Ha), 3,87 (m, 1H, Ha), 2,37 (m, 2H, CH2Giu), 2,27 (m, 1 H, CHG,U), 1,96 (m, 2H, CHDap, CHg,u), 1,86 (m, 2H, CH dap, CHdap), 1,68 (m, 1 H, CHdap), 1,53 (m, 5H, CH3(s)Aia y CH2CH2DAPCH2), 1,39 (d, 3H, CH3(R)Aia). RMN de 13C (126 MHz, Metanol-d4) 5 174,52; 173,19; 173,16; 172,27; 169,82; 168,23; 52,84; 52,80; 51,94; 48,87; 48,07; 31,26; 31,23; 29,83; 27,15; 21,09; 16,41.
Para la obtención del clorhidrato, se trató una disolución en agua del compuesto en forma de sal de TFA con varias gotas de ácido clorhídrico (37 %). La disolución acuosa se lavó varias veces con acetato de etilo y posteriormente se liofilizó, obteniéndose 11,7mg (35%) de PGN-1 en forma de una espuma verdosa. HRMS (ESI, positiva): m/z calculada para C18H32N5O9 462,2267; encontrada 462,22054. Esta fue la forma en la que se ensayó el compuesto.
1-[(R)-(1-ferc-butoxipropan-2-il)amino]-7-feA'c-butil-(2S,6R)-Wa-[W-(W-fercbutoxicarbonil-L-alanil)-D-glutamil-a-ferc-butiléster]-N€-(ferc-butoxicarbonil)-2,6-diaminopimelato (10)
Figure imgf000021_0001
A una disolución del intermedio ácido 8 (40 mg, 0,057 mmol) en DMF (10 mi), se añadieron ferc-butil-D-alaninol (9 mg, 0,068 mmol), HATU (23,5 mg, 0,057 mmol) y DIPEA (19 pl, 0,11 mmol). La mezcla de reacción se agitó a 30 °C durante una noche y después se evaporó a sequedad. El residuo se disolvió en diclorometano (20 mi) y se lavó sucesivamente con disoluciones acuosas de ácido cítrico (10 %) (3 x 20 mi), solución saturada de NaHC03 (3 x 20 mi), y salmuera (3 x 20 mi). La fase orgánica se secó (Na2S04 anhidro), filtró y evaporó a sequedad. El residuo se purificó mediante cromatografía circular centrífuga empleando diclorometano:MeOH (100:1 a 10:1) como eluyente, obteniéndose 32,8mg (60%) del compuesto 10 en forma de un jarabe incoloro. HPLC [gradiente: A:B, 50-100 % deAen 10 min]: 6,45 min.
1H-RMN (400 MHz, Acetona-cfe) 5 7,60 (d, J = 8,5 Hz, 1H, NH), 7,26 (d, J = 7,8 Hz, 2H, NH), 6,32 (s, 1H, NH), 5,99 (d, J = 8,3 Hz, 1H, NH), 4,29 (m, 2H, 2Ha), 4,13 (m, 1H, Ha), 3,98 (m, 2H, 2Ha), 3,35 (m, 1H, CH2OH), 3,24 (m, 1H, CH2OH), 2,26 (m, 1H, CH2), 1,91 - 1,56 (m, 2H, CH2), 1,42 (d, J = 13,1 Hz, 43H, Boc, OtBu y CH2
dap), 1,36 (d, J = 7,2 Hz, CH3), 1,15 (m, 12H, 0 ‘Bu y CH3). MS (ES+): m/z 817,05 (M+H)+.
1-[(K)-(1-hidroxipropan-2-il)amino]-(2S,6K)-Wa-[W-(L-alanil)-D-glutamil]-2,6-diaminopimelato (PGN-2)
Figure imgf000022_0001
A una disolución del intermedio protegido 10 (32,8mg, 0,04mmol) en diclorometano (10 mi), se le añadió TFA. Después de agitar a temperatura ambiente durante la noche, se evaporó la disolución a sequedad. El residuo se coevaporó varias veces con una mezcla de diclorometano y MeOH para retirar el TFA residual.
Para la obtención del corrrespondiente clorhidrato, se trató una disolución en agua del compuesto en forma de sal de TFA con varias gotas de ácido clorhídrico (37 %). La disolución acuosa se lavó varias veces con acetato de etilo y a continuación se liofilizó, obteniéndose 19,1 mg (69 %) de PGN-2 en forma de una espuma verdosa. Esta fue la forma en la que se ensayó y caracterizó el compuesto. HRMS (ESI, positiva): m/z calculado para C18H35N5O8449,2486; encontrada 449,2481.
1H-RMN (500 MHz, D20) 5 4,24 (m, 1H, Ha), 4,10 (m, 1H, Ha), 3,98 (c, J = 7,0 Hz, 1H, Ha), 3,85 (m, 1H, CH, Ha), 3,80 (m, 1H, CHCH2OH), 3,41 (m, 1H, CH2aOH), 3,35 (m, 1H, CH2BOH), 2,26 (m, 2H, CH2Giu), 2,07 (m, 1H, CHoiu), 1,88 (m, 1H, CHgiu), 1,80 (m, 2H, CH2Dap), 1,63 (m, 2H, CH2Dap), 1,41 (d, J = 7,0 Hz, 3H, CH3(s)Aia), 1,35 (m, 2H, CH2CH2DapCH2), 0,96 (d, J = 6,8 Hz, 3H,_CH3CHCH2OH). 13C-RMN (125 MHz, D20) 5 174,76; 174,65; 173,27; 172,33; 170,74; 64,22; 53,70; 52,90; 52,14; 48,97; 47,21; 31,21; 30,60; 29,34; 26,40; 20,76; 16,51; 15,71.
1-(1-ferc-butoxi-2-hidroxipropilamino)-7-ferc-butil-(2S,6R)-Wa-[W-(W-feA'cbutoxicarbonil-L-alanil)-D-glutamil-a-ferc-butiléster]-N€-(ferc-butoxicarbonil)-2,6-diaminopimelato (11)
Figure imgf000023_0001
A una disolución del intermedio ácido 8 (56,8 mg, 0,081 mmol) en DMF (10 mi), se añadieron ferc-butil-1-amino-2-propanol (12,7mg, 0,09mmol), HATU (33,4mg, 0,081 mmol) y DIPEA (14 pl, 0,081 mmol). La mezcla de reacción se agitó a 30°C durante una noche y después se evaporó a sequedad. El residuo se disolvió en diclorometano (20 mi) y se lavó sucesivamente con soluciones acuosas de ácido cítrico (10 %) (3 x 20 mi), solución saturada de NaHC03 (3 x 20 mi), y salmuera (3 x 20 mi). La fase orgánica se secó (Na2S04 anhidro), filtró y evaporó a sequedad. El residuo se purificó mediante cromatografía circular centrífuga empleando diclorometano:MeOH (100:1 a 10:1) como eluyente, obteniéndose 43mg (65%) del compuesto 11 en forma de un aceite incoloro.
1H-RMN (400 MHz, Acetona-d6) 57,51 (s, 1H, NH), 7,38 (d, J = 19,5 Hz, 1H, NH), 7,20 (dd, J = 17,8; 7,7 Hz, 1H, NH), 6,23 (s, 1H, NH), 5,86 (d, J = 8,3 Hz, 1H, NH), 4,19 (m, 2H, Ha), 4,01 (s, 1H, Ha), 3,84 (m, 1H, Ha), 3,67 (m, 1H, Ha), 2,99 (m, 2H, CH2), 2,17 (m, 5H, CH2), 1,78 - 1,56 (m, 2H, CH2), 1,51 (m, 2H, CH2), 1,32 (m, 37H, OtBu, Boc y CH2), 1,04 (s, 12H, OtBu y CH3), 0,92 (t, J = 5,5 Hz, 3H, CH3).
-[2-hidroxipropilamino]-(2S,6R)-Wa-[W-(L-alanil)-D-glutamil]-2,6-diaminopimelato (PGN-3)
Figure imgf000024_0001
A una disolución del intermedio protegido 11 (43mg, 0,05mmol) en diclorometano (10 mi), se le añadió TFA. Después de agitar a temperatura ambiente durante una noche, se evaporó la disolución a sequedad y el residuo se coevaporó varias veces con una mezcla de diclorometano y MeOH para retirar el TFA residual.
Para la obtención del correspondiente clorhidrato, se trató una disolución en agua de del compuesto en forma de sal de TFA con varias gotas de ácido clorhídrico (37 %). La disolución acuosa se lavó varias veces con acetato de etilo y a continuación se liofilizó, obteniéndose 22,1 mg (63 %) de PGN-3 en forma de una espuma verdosa. Esta fue la forma en la que se ensayó y caracterizó el compuesto. HRMS (ESI, positiva): m/z calculado para C18H35N5O8449,2486; encontrada 449,2499.
1H-RMN (500 MHz, D20) 54,11 (m, 2H, 2Ha), 3,98 (c, J= 7,0 Hz, 1H, Ha), 3,78 (c, J = 6,1 Hz, 1H, CH3CHOH), 3,62 (m, 1H, Ha), 3,09 (m, 2H, CH2N), 2,25 (m, 2H, CH2Giu), 2,02 (m, 1 H, CHoiu), 1,90- 1,48 (m, 4H, CHg,u, CH2Dap y CH2Dap), 1,41 (d, J = 7.0 Hz, 3H, CH3(s)Aia), 1,33 (m, 2H, CH2CH2DapCH2), 1,01 (d, J = 6,2 Hz, 3H, CH3CHOH).
1H-RMN (400 MHz, D20) 5 4,19 (m, 1H, Ha), 4,17 (m, 1H, Ha), 4,05 (c, J = 7.1 Hz, 1H, Ha), 3,84 (c, J= 6,1 Hz, 1H, Ha), 3,69 (m, 1H, CH3CHOH), 3,17 (m, 2H, CH2N), 2,32 (m, 2H, CH2G,U), 2,09 (m, 1H, CH2G,U), 1,92 (m, 1H, CH2G,U), 1,83 (m, 2H, CH2Dap), 1,70 (m, 2H, CH2Dap), 1,49 (d, J = 7,0 Hz, 3H, CH3(S)Aia), 1,41 (m, 2H, CH2CH2dapCH2), 1,07 (d, J = 6,1 Hz, 3H, CH3CHOH). 13C-RMN (100 MHz, D20) 5 175,43; 174,23; 170,47; 66,14; 54,51; 53,91; 49,19; 46,00; 31,76; 30,67; 29,89; 27,20; 20,98; 19,43; 16,61.
Lineas celulares. Se cultivaron fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) procedentes de ratones “C57BL/6 knock-in” que expresaban GFP-p65 en medio “Dulbecco (DMEM) modified Eagles’s” suplementado con suero de ternera fetal (FBS) al 10 % (v/v), p-mercaptoetanol 50 pM, L-glutamina al 1 % (p/v), piruvato de sodio al 1 % (p/v) y aminoácidos no esenciales al 1 %, según lo descrito (Ramos-Marques et al., 2017). Las células se cultivaron a 370C con atmósfera de CO2 humidificada al 5 %. Para los experimentos de microinyección, las células se cultivaron en placas de fondo de vidrio de rejilla alta 50 de p-placa de 35 mm (Ibidi, Martinsried, Alemania).
Microinyección de péptidos sintéticos. Los péptidos sintetizados se disolvieron en agua estéril hasta alcanzar una concentración de 20 mM. A esta disolución se le añadió dextrano rojo Texas 70 kDa hasta llegar a una concentración final de 2 mg/ml. Para evitar la obstrucción de la aguja del microinyector, se centrifugó un volumen de 50pl de esta solución de péptido/dextrano rojo Texas a 14.000xg durante 30 min, 4 °C, antes de su uso. Tras la microinyección de una media de 8 a 10 rejillas por placa, se mantuvo el cultivo celular a 370C con una atmósfera de CO2 al 5 % humidificada durante el tiempo deseado (30 min). Seguidamente, se lavaron las células con tampón fosfato salino (PBS) a pH 7,4 y se fijaron en paraformaldehído (PFA) al 3 % durante 20 min a temperatura ambiente. Después de este tiempo, se retiró el PFA mediante dos lavados en serie con PBS, pH 7,4 y las células se visualizaron en un microscopio de fluorescencia invertido (Leica DIM6000).
Resultados v análisis
Ensayo de estimulación de NF-Kb
Los péptidos PGN-1, PGN-2 y PGN-3 se microinyectaron en fibroblastos indicadores que expresaban GFP-p65 y a continuación se determinó su actividad biológica. Los resultados (Figura 1) demostraron claramente que el péptido PGN-1 (con estructura estimulante canónica) fue capaz de desencadenar la translocación al núcleo de la subunidad GF-65 de NF-kB. Más del 95 % de las células microinyectadas con este péptido muestran la señal de GFP-p65 en el núcleo tras 30 o 90 min de microinyección de péptidos (Figura 1). Este hecho fue indicativo de la estimulación de NF-kB, ya que es todo el complejo NF-kB activo (p50/p65) el que se traslada al núcleo tras la degradación de la proteína IkB inhibidora.
Respecto a los péptidos PGN-2 y PGN-3, se observó una menor capacidad estimulante, específicamente para el caso de PGN-2, en el que solo el 10-20 % de las células microinyectadas mostraron una señal de GFP-65 en el núcleo tras 30 min y no se observó ninguna célula con dicho fenotipo a los 90 min de la inyección (Figura 1).
PGN-3 mostró un comportamiento intermedio en comparación con PGN-1 y PGN-2 (Figura 1). De estos resultados se puede concluir que la introducción de un aminoalcohol en el péptido PGN-2 podría inhibir la estimulación de NOD1 y, por tanto, impedir la translocación nuclear de NF-kB.
Por lo tanto, estos resultados apoyan firmemente la idea de una modificación del peptidoglicano de Salmonella intracelular que podría afectar a NF-kB, generando un efecto antiinflamatorio. Dicha estrategia podría facilitar al patógeno el establecimiento de un estado de infección persistente en la célula hospedadora. La nueva estructura química PGN-2 es, por consiguiente, aplicable como un nuevo agenteantiinflamatorio.
Esquemas
Esquema 1. Síntesis del intermedio 5
Figure imgf000026_0001
Esquema 2. Síntesis del intermedio 8
Figure imgf000026_0002
Esquema 3. Síntesis de PGN-1, PGN-2 y PGN-3
Figure imgf000027_0001
Referencias
• Caruso, R., Warner, N., Inohara, N. y Nunez, G. (2014). “NOD1 and NOD2:
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Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un compuesto de fórmula general I:
    Figure imgf000029_0001
    donde:
    Ri es hidrógeno, metilo, isopropilo, isobutilo, fenilmetileno, hidroxifenilmetileno o fenilindolilmetileno;
    R2 es C1-4 alquilo, -O R3 o -COOR3, donde C1-4 alquilo está opcionalmente sustituido por un grupo -OR3 en cualquier posición disponible; y
    cada R3 es independientemente hidrógeno o C1-4 alquilo,
    con la condición de que el compuesto PGN-1 se excluye de la definición de fórmula general I:
    Figure imgf000029_0002
    2. Elcompuestodefórmulageneral l.dondeRi esmetilo.
    3. El compuesto de fórmula general I, donde R3 es hidrógeno.
    4. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, seleccionado entre:
    Figure imgf000030_0001
    PGN-3
    5.
    Figure imgf000030_0002
    Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula general I según lo definido en cualquiera de las reivindicaciones 1a4.
    Un proceso de obtención de un compuesto de fórmula general I:
    Figure imgf000030_0003
    donde:
    Ri es hidrógeno, metilo, isopropilo, isobutilo, fenilmetileno, hidroxifenilmetileno o fenilindolilmetileno;
    R2 es C1-4 alquilo, -O R3 o -COOR3, donde C1-4 alquilo está opcionalmente sustituido por un grupo -OR3 en cualquier posición disponible; y
    cada R3 es independientemente hidrógeno o C1-4 alquilo,
    que comprende la reacción entre un compuesto de fórmula II y un compuesto de fórmula III en presencia de una base y un reactivo de acoplamiento:
    Figure imgf000031_0001
    donde Ri y R2 tienen el significado descrito anteriormente para un compuesto de fórmula I, y PG1 y PG2 representan respectivamente grupos protectores de amina y ácido carboxílico, seguida de la eliminación de los grupos protectores PG1 y PG2.
    7. El proceso de acuerdo con la reivindicación 5 , donde el compuesto de fórmula general I se selecciona entre:
    8. Un compuesto de fórmula general I o una composición farmacéutica del mismo:
    Figure imgf000032_0001
    donde:
    Ri es hidrógeno, metilo, isopropilo, isobutilo, fenilmetileno, hidroxifenilmetileno o fenilindolilmetileno;
    R2 es C1-4 alquilo, -OR3 o -COOR3, donde C1-4 alquilo está opcionalmente sustituido por un grupo -OR3 en cualquier posición disponible; y
    cada R3 es independientemente hidrógeno o C1-4 alquilo,
    para su uso en el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad que cursa coninflamación.
    9. El compuesto para el uso de acuerdo con la reivindicación 8, donde el compuesto de fórmula general I se selecciona entre:
    Figure imgf000032_0002
    Figure imgf000033_0001
    PGN-3
    10. El compuesto para el uso de acuerdo con la reivindicación 9, donde la inflamación se selecciona entre infecciones microbianas y reacciones alérgicas a formulaciones derivadas de la pared celular microbiana que contienen peptidoglicano, y trastornos inmunitarios y autoinmunitarios.
    11. El compuesto para el uso de acuerdo con la reivindicación 10, donde las infecciones microbianas son infecciones microbianas con patología inflamatoria asociada donde el agente etiológico se selecciona entre bacterias, virus, hongos y protozoos.
    12. El compuesto para el uso de acuerdo con la reivindicación 11, donde las infecciones bacterianas se seleccionan entre salmonelosis, listeriosis y enfermedades causadas por patógenos bacterianos intracelulares que producen un peptidoglicano que contiene meso-DAP reconocido por NOD1.
    13. El compuesto para el uso de acuerdo con la reivindicación 10, donde los trastornos inmunitarios y autoinmunitarios se seleccionan entre enfermedades inflamatorias del intestino y artropatías.
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