ES2826378T3 - Sacarosa fosforilasas mutantes con actividad de glicosilación mejorada hacia polifenoles - Google Patents

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Mareike Dirks-Hofmeister
Winter Karel De
Tom Verhaeghe
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Abstract

Un procedimiento in vitro para glicosilar un polifenol que comprende: - poner en contacto in vitro una sacarosa fosforilasa que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº 1, la SEQ ID Nº 2, la SEQ ID Nº 3, la SEQ ID Nº 4 o la SEQ ID Nº 5 con sacarosa o alfa-glucosa-1-fosfato, y un polifenol, y - glicosilar dicho polifenol.

Description

DESCRIPCIÓN
Sacarosa fosforilasas mutantes con actividad de glicosilación mejorada hacia polifenoles
Campo técnico de la invención
La presente invención se refiere a la glicosilación de polifenoles mediante biocatálisis. Más específicamente, la presente invención divulga mutantes particulares de la sacarosa fosforilasa termoestable derivada del microorganismo Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum que glicosilan eficazmente polifenoles tales como resveratrol.
Antecedentes
Los polifenoles son productos naturales con importantes aplicaciones en la industria cosmética, farmacéutica y alimentaria (Quideau et al., 2011; Espín et al., 2007). En particular, el resveratrol (3,5,4'-trihidroxiestilbeno) se considera un compuesto muy interesante, dado que varios estudios han notificado que es anticancerígeno, antiinflamatorio, antimicrobiano e incluso que amplía el periodo de vida de seres humanos (Frémont, 2000; Novelle et al., 2015; Park y Pezzuto, 2015; Biagi y Bertelli, 2015). La glicosilación del resveratrol puede mejorar significativamente su solubilidad y su biodisponibilidad, pero el efecto difiere según el tipo de enlace glicosídico (Thuan y Sohng, 2013; Torres et al., 2011; Ozaki et al., 2011). Por ejemplo, se ha descubierto que el 3-a-glucósido de resveratrol es más soluble que el 3-p-glucósido (Torres et al., 2011). Para la glicosilación estereoespecífica y regioespecífica, las ventajas de la biocatálisis sobre los procesos químicos son obvias (de Roode et al., 2003; Desmet et al., 2012; Bornscheuer et al., 2013).
La mayor parte de las glicosil transferasas requieren sustratos donantes activados por nucleótidos (por ejemplo, UDP-Glc), que son bastante caros para aplicaciones a gran escala (Bungaruang et al., 2013; Breton et al., 2012; Gantt et al., 2011; Palcic, 2011; Lairson et al., 2008). Sin embargo, unas pocas enzimas son capaces de catalizar reacciones de transglicosilación a partir de azúcares sencillos tales como maltodextrinas (por ejemplo, CGTasa) o sacarosa (por ejemplo, glucano-sacarasa) (Desmet et al., 2012). De forma similar, la sacarosa fosforilasa (SP, EC 2.4.1.7) puede transferir el resto de glucosa de la sacarosa a una diversidad de aceptores a través de un mecanismo de doble desplazamiento (Puchart, 2015; Desmet y Soetaert, 2012; Goedl et al., 2008; Aerts, Verhaeghe, Roman, Stevens, Desmet y Soetaert, 2011a). Cabe señalar que la sacarosa no solo es barata sino también muy reactiva, con un contenido energético comparable al de los azúcares nucleotídicos (Monsan et al., 2010). De esta forma se pueden obtener altos rendimientos, tal como se ha informado para la producción de 2-O-alfa-D-glucopiranosil-sn-glicerol, un agente hidratante para cosméticos comercializado con la denominación comercial Glycoin® (Goedl et al., 2008).
Desafortunadamente, la actividad de SP sobre aceptores (poli)fenólicos es muy baja, incluso apenas detectable en la mayor parte de los casos (Aerts, Verhaeghe, Roman, Stevens, Desmet y Soetaert, 2011b; Kitao et al., 2014; De Winter et al., 2014; De Winter et al., 2013). Se ha sugerido que el problema principal es la baja afinidad de la enzima por dichos compuestos, que no se puede compensar aumentando las concentraciones de aceptor debido a su baja solubilidad (De Winter et al., 2013; Aerts, Verhaeghe, Roman, Stevens, Desmet y Soetaert, 2011a). Aunque se ha informado del aumento de las tasas de transglicosilación tras la adición de disolventes orgánicos (De Winter et al., 2014; De Winter et al., 2013), sin embargo, nunca se ha logrado la saturación de la enzima y la productividad ha seguido siendo generalmente demasiado baja para aplicaciones prácticas. Con resveratrol, por ejemplo, el mejor resultado se ha obtenido en líquido iónico AMMOENG™ 101 al 20%, pero solo generó una concentración 3 mM de 3-alfa-glucósido de resveratrol (De Winter et al., 2013). Por lo tanto, existe una necesidad urgente de encontrar o diseñar una SP capaz de glicosilar eficazmente polifenoles tales como el resveratrol.
Hasta ahora se han identificado dos enzimas SP (termo)estables, a saber, una en Bifidobacterium adolescentis (BaSP, Cerdobbel et al., 2011; documento WO2011/124538) y una en Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum (TtSPP, documento WO2014/060452). La última enzima en realidad prefiere la sacarosa-6'-fosfato como sustrato (EC 2.4.1.329) pero aún puede utilizar eficazmente sacarosa como donante de glicosilo (Km = 77 mM) (Verhaeghe et al., 2014). Estos últimos autores divulgaron además una variante R134A de TtSPP, que se ha demostrado que desempeña un papel en la unión de sacarosa-6'-fosfato o fructosa-6-fosfato.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Comparación de la actividad de transglicosilación de BaSP, TtSPP y R134A sobre resveratrol y sus elementos constitutivos resorcinol y orcinol.
Figura 2. Promiscuidad de aceptor de TtSPP y R134A en comparación con BaSP. (A) Comparación semicuantitativa de transglicosilación de catecol, 4-metil-catecol y quercetina. (B) Estudio cualitativo de promiscuidad en diversos aceptores monofenólicos y polifenólicos. (C) Esqueleto estructural de polifenoles naturales.
Figura 3. Evolución temporal de la glicosilación del resveratrol por la variante R134A (1 g l -1 de enzima, 10 g l -1 de resveratrol y sacarosa 1 M a pH 6,5 y 55 °C)
Descripción de la invención
La presente invención divulga variantes mejoradas, tales como TtSPP_R134A, que pueden utilizarse para la glicosilación eficaz de polifenoles tales como resveratrol a escalas de gramos. De hecho, estos nuevos biocatalizadores son capaces de (i) alcanzar una conversión completa y específica de resveratrol en (ii) un sistema acuoso sin la necesidad de la adición de disolventes y (iii) utilizar sacarosa como donante de glicosilo económico y renovable. Sin embargo, es evidente que la eficacia mejorada de la variante no se limita al resveratrol, sino que también se demuestra en varios aceptores grandes, lo que revela una promiscuidad de sustrato que es útil para aplicaciones prácticas en diversos sectores industriales.
Por tanto, la presente invención se refiere a un procedimiento in vitro para glicosilar un polifenol que comprende: - poner en contacto in vitro una sacarosa fosforilasa que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N° 1 (= variante R134A de TtSPP), la SEQ ID N° 2 (= variante R134V de TtSPP), la SEQ ID N° 3 (= variante R134T de TtSPP), la SEQ ID N° 4 (variante R134G de TtSPP) o la SEQ ID N° 5 (= variante de TtSPP en la que R134 está eliminado) con sacarosa (o alternativamente con alfa-glucosa-1-fosfato) y un polifenol, y
- glicosilar dicho polifenol.
La SEQ ID N° 1 es la secuencia de aminoácidos siguiente (A134 está indicado en negrita y subrayado):
MALKNKVQLITYPDSLGGNLKTLNDVLEKYFSDVFGGVHILPPFPSSGDRGFAPITYSEIEPKFGTWYDIKKMAENFDILLDLMVNH VSRRSIYFQDFLKKGRKSEYADMFITLDKLWKDGKPVKGDIEKMFLARTLPYSTFKIEETGEEEKVWTTFGKTDPSEQIDLDVNSHL VREFLLEVFKTFSNFGVKIVRLDAVGYVIKKIGTSCFFVEPEIYEFLDWAKGQAASYGIELLLEVHSQFEVQYKLAERGFLIYDFILPFTV LYTLINKSNEMLYHYLKNRPINQFTMLDCHDGIPVKPDLDGUDTKKAKEWDICVQRGANLSLIYGDKYKSEDGFDVHQINCTYYS ALNCDDDAYLAARAIQFFTPGIPQVYYVGLLAGVNDFEAVKKTKEGREINRHNYGLKEIEESVQKNWQRLLKLIRFRNEYEAFNGE FFIEDCRKDEIRLTWKKDDKRCSLFIDLKTYKTTIDYINEFJGEEVKYLV
La SEQ ID N° 2 es la secuencia de aminoácidos siguiente (V134 está indicado en negrita y subrayado):
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La SEQ ID N° 3 es la secuencia de aminoácidos siguiente ¡T134 está indicado en negrita y subrayado):
MALKNKVQLITYPDSLGGIMLKTLNDVLEKYFSDVFGGVHILPPFPSSGDRGFAPITYSEIEPKFGTWYDIKKMAENFDILLDLMVNH VSRRSIYFQDFLKKGRKSEYADMFITLDKLWKDGKPVKGDIEKMFLIRTLPYSTFKIEETGEEEKVWTTFGKTDPSEQIDLDVNSHL VREFLLEVFKTFSNFGVKIVRLDAVGYVIKKIGTSCFFVEPEIYEFLDWAKGQAASYGIELLLEVHSQFEVQYKLAERGFLIYDFILPFTV LYTLINKSNEMLYHYLKNRPINQFTMLDCHDGIPVKPDLDGLIDTKKAKEVVDICVQRGANLSLIYGDKYKSEDGFDVHQIIMCTYYS ALNCDDDAYLAARAIQFFTPGIPQVYYVGLLAGVNDFEAVKKTKEGREINRHNYGLKEIEESVQKNWQRLLKURFRNEYEAFNGE FFIEDCRKDEIRLTWKKDDKRCSLFIDLKTYKTTIDYINENGEEVKYLV
La SEQ ID N° 4 es la secuencia de aminoácidos siguiente (G134 está Indicado en negrita y subrayado):
MALKNKVQUTYPDSLGGNLKTLNDVLEKYFSDVFGGVHILPPFPSSGDRGFAPITYSEIEPKFGTWYDIKKMAENFDILLDLMVNH VSRRSIYFQDFLKKGRKSEYADMFITLDKLWKDGKPVKGDIEKMFLGRTLPYSTFKIEETGEEEKVWTTFGKTDPSEQIDLDVNSHL VREFLLEVFKTFSNFGVKIVRLDAVGYVIKKIGTSCFFVEPEIYEFLDWAKGQAASYGIELLLEVHSQFEVQYKLAERGFLIYDFILPFTV LYTUNKSNEMLYHYLKNRPINQFTMLDCHDGIPVKPDLDGUDTKKAKEVVDICVQRGANLSLIYGDKYKSEDGFDVHQINCTYYS ALNCDDDAYLAARAIQFFTPGIPQVYYVGLLAGVNDFEAVKKTKEGREINRHNYGLKEIEESVQKNVVQRLLKLIRFRNEYEAFNGE FFIEDCRKDEIRLTWKKDDKRCSLFIDLKTYKTTIDYIIMENGEEVKYLV
La SEQ ID N° 5 es la secuencia de aminoácidos siguiente (el am inoácido 134 de TtSPP está eliminado):
MALKNKVQLITYPDSLGGNLKTLNDVLEKYFSDVFGGVHILPPFPSSGDRGFAPITYSEIEPKFGTWYDIKKMAENFDILLDLMVNH VSRRSIYFQDFLKKGRKSEYADMFITLDKLWKDGKPVKGDIEKMFLRTLPYSTFKIEETGEEEKVWTTFGKTDPSEQIDLDVNSHLV REFLLEVFKTFSNFGVKIVRLDAVGYVIKKIGTSCFFVEPEIYEFLDWAKGQAASYGIELLLEVHSQFEVQYKLAERGFLIYDFILPFTVL YTUNKSNEMLYFIYLKNRPINQFTMLDCHDGIPVKPDLDGLIDTKKAKEWDICVQRGANLSLIYGDKYKSEDGFDVHQINCTYYSA LNCDDDAYLAARAIQFFTPGIPQVYYVGLLAGVNDFEAVKKTKEGREINRHNYGLKEIEESVQKNWQRLLKURFRNEYEAFNGEF FIEDCRKDEIRLTWKKDDKRCSLFIDLKTYKTTIDYINENGEEVKYLV
El término polifenol se refiere a moléculas hidroxiladas que contienen al menos dos anillos de benceno. Estos últimos polifenoles comprenden los flavonoides y los estilbenoides. Las fórmulas estructurales de estos últimos polifenoles y representantes específicos son las siguientes:
Figure imgf000004_0001
en las que R es al menos un H y/o glucósidos unidos.
Por lo tanto, la presente invención se refiere también específicamente a un procedimiento in vitro tal como se ha indicado anteriormente en el que dicho polifenol es un estilbenoide, un procedimiento in vitro tal como se ha indicado anteriormente en el que dicho estilbenoide es resveratrol, un procedimiento in vitro tal como se ha indicado anteriormente en el que dicho polifenol es un flavonoide, y un procedimiento in vitro tal como se ha indicado anteriormente en el que dicho flavonoide es apigenina, hesperetina, quercetina o epicatequina.
Además, la presente invención se refiere a un sistema in vitro tal como se ha indicado anteriormente en el que dicho polifenol es un fenoxifenol que tiene la fórmula estructural siguiente:
Figure imgf000005_0001
que R es al menos un H y/o glucósidos unidos.
La presente invención se refiere también a un procedimiento in vitro tal como se ha descrito anteriormente en el que dicha sacarosa fosforilasa es un fragmento de la SEQ ID N° 1, 2, 3, 4 o 5, en el que dicho fragmento comprende, además de tener el aminoácido A, V , T o G en la posición 134 de la SEQ ID N° 1-4, respectivamente, o de tener una deleción en la posición 134 tal como se muestra en la SEQ ID N° 5, al menos los 16 aminoácidos catalíticos en las posiciones de aminoácidos que se muestran en la SEQ ID N° 6.
La SEQ ID N° 6 es, por lo tanto, la secuencia de aminoácidos de TtSPP, en la que se indica en negrita los 16 aminoácidos catalíticos de TtSPP además de X en la posición 134 de la SEQ ID N° 1-4, en la que X = el aminoácido A, V, T o G en la posición 134 de la SEQ ID N° 1-4, o está eliminado tal como se muestra en la SEQ ID N° 5:
m alkn kvq litypdslg g nlktlnd vlekyfsdvfg g vhilppfpssg§ rg| a p ity s e ie p k fg tw y d ik k m a e n fd illd lm v n
0VSRRSIYFQDFLKKGRKSEYADMFFrLDKLWKDGKPVKGDIEKMFLXRTLPYSTFKIEETGEEEKVWTT§GKTDPSE@IDLDVNS
hlvrefllevfktfsnfgvkiv [r|l[d^ v g ^ vikkig tscffvepeiyefldw akg q aasyg ielll[e|v|h1sqfevqyklaergfliydfil
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En otras palabras, la presente invención se refiere a un procedimiento in vitro para glicosilar un polifenol que comprende:
- poner en contacto in vitro una sacarosa fosforilasa con sacarosa o alfa-glucosa-1-fosfato, y un polifenol, y
- glicosilar dicho polifenol, en el que dicha sacarosa fosforilasa es un fragmento de la SEQ ID N° 1,2, 3, 4 o 5, en el que dicho fragmento comprende, además de tener el aminoácido A, V, T o G en la posición 134 de la SEQ ID N° 1­ 4, respectivamente, o de tener una deleción en la posición 134 tal como se muestra en la SEQ ID N° 5, al menos los siguientes 16 aminoácidos catalíticos de la SEQ ID N° 6: D49, F52, H87, F157, Q165, R195, D197, a 198, Y201, E238, H240, H295, D296, D342, Q345 y R399, y en el que el fragmento tiene una actividad de glicosilación de polifenoles mejorada en comparación con la actividad de la sacarosa fosforilasa nativa de Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum.
El término "un fragmento de la SEQ ID N° 1,2, 3, 4 o 5" se refiere a una porción de la SEQ ID N° 1,2, 3, 4 o 5 que contiene menos aminoácidos que la SEQ ID N° 1,2, 3, 4 o 5 y que tiene una identidad de secuencia del 100% con la SEQ ID N° 1,2, 3, 4 o 5.
La presente invención se refiere además a una variante de la sacarosa fosforilasa termoestable derivada del microorganismo Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum que se caracteriza por comprender la SEQ ID N° 2, 3, 4 o 5, o por comprender un fragmento tal como se ha definido anteriormente.
Se describe además, pero no dentro del alcance de la invención reivindicada, un procedimiento in vitro para glicosilar un polifenol que comprende:
- poner en contacto in vitro una sacarosa fosforilasa con sacarosa o alfa-glucosa-1 fosfato, y un polifenol, y
- glicosilar dicho polifenol, en el que dicha sacarosa fosforilasa es un fragmento de la SEQ ID N° 1, 2, 3, 4 o 5 que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID N° 1, 2, 3, 4 o 5 y en el que dicho fragmento comprende, además de tener el aminoácido A, V, T o G en la posición 134 de la SEQ ID N° 1-4, respectivamente, o de tener una deleción en la posición 134 tal como se muestra en la SEQ ID N° 5, al menos la siguientes 16 aminoácidos catalíticos de la SEQ ID N° 6: D49, F52, H87, F157, Q165, 195, D197, A198, Y201, E238, H240, H295, D296, D342, Q345 y R399. El término "al menos el 90% de identidad de secuencia" se refiere a una identidad de secuencia del 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% de identidad de secuencia con la SEQ ID N° 1,2, 3, 4 o Ejemplos
Materiales y procedimientos
Productos químicos. Todos los productos químicos eran de grado analítico y se adquirieron o bien de Sigma-Aldrich o bien de Carbosynth.
Clonación, expresión y mutagénesis. Los constructos de vectores para la expresión heteróloga de las secuencias de los genes BaSP y TtSPP, así como las variantes diseñadas, se insertaron en el vector pCXP34h y se expresaron de forma continua en células de E. coli BL21 tal como se ha descrito anteriormente (Verhaeghe et al., 2014). Se introdujeron mutaciones específicas de sitio utilizando cebadores fosforilados para PCR de plásmido completo y ligación sucesiva. La generación de la biblioteca de saturación de sitio único de la posición R134 se realizó igualmente utilizando un procedimiento de amplificación de plásmido completo con cebadores de degeneración NNK. La aleatorización satisfactoria y los plásmidos finales se comprobaron mediante secuenciación.
Extracción y purificación de proteínas. Las proteínas recombinantes se produjeron y se purificaron térmicamente tal como se ha descrito anteriormente (Cerdobbel et al., 2010). Se generaron extractos de proteína bruta con fines de cribado exponiendo sedimentos celulares congelados de cultivos de producción a tampón de lisis (tampón MOPS 50 mM, Na2SO450 mM, MgSO44 mM, EDTA 1 mM, 1 g l-1 de lisozima, PMSF 100 pM, pH 7,5) durante 30 min a 37 °C.
Los sobrenadantes, después de la centrifugación, se asignaron como extractos de proteína bruta. Los contenidos de proteína se determinaron según Bradford utilizando BSA como patrón. Todas las proteínas se almacenaron a 4 °C hasta su uso posterior.
Ensayos de cribado. Se incubaron proteínas purificadas térmicamente (para ensayos en diferentes aceptores) o extractos de proteína bruta (para cribado de bibliotecas) hasta una concentración final de 1 g l -1 con 10 g l -1 de aceptor y sacarosa 1 M en tampón MOPS 50 mM, a pH 6,5. Los ensayos se realizaron a 37 °C en placas de microvaloración con agitación a 200 rpm. Las cantidades de producto se evaluaron después de 16 h mediante análisis TLC semicuantitativo: se dispuso 1 pl de cada solución de muestra en una placa de sílice (TLC-gel de sílice 60 F254, Merck Millipore) y se desarrolló en un sistema de disolventes de acetato de etilo:metanol:agua (30:5:4, v/v/v). Las placas se oxidaron con ácido sulfúrico al 10% y se determinaron las intensidades de las manchas utilizando ImageJ.
Cinética enzimática. La cinética de las variantes enzimáticas sobre resveratrol se determinó en un sistema acuoso que contenía líquido iónico AMMOENG 101 al 20% (proporcionado amablemente por Evonik Industries AG) para disolver el aceptor en un intervalo de 0 a 200 mM. A esta concentración de líquido iónico, los parámetros cinéticos de la enzima para sus sustratos naturales no se ven afectados. Las reacciones se iniciaron combinando enzimas purificadas térmicamente 8,5 pM, sacarosa 1 M y la concentración de aceptor respectiva a 55 °C. Para determinar la velocidad inicial, se tomaron muestras cada 15 minutos durante una hora y se inactivaron mediante una dilución de diez veces en etanol puro. La formación de producto se cuantificó de nuevo mediante análisis TLC e ImageJ, utilizando 3-alfaglucósido de resveratrol purificado como patrón de TLC y una curva patrón respectiva para los cálculos. Los parámetros cinéticos se calcularon mediante regresión no lineal de la ecuación de Michaelis-Menten con SigmaPlot v13.0. Todos los experimentos se realizaron por triplicado para obtener parámetros cinéticos como valores medios reproducibles ± errores estándar.
Producción y purificación de 3-alfa-glucósido de resveratrol. Se llevó a cabo un aumento de escala de las reacciones de transglicosilación sobre resveratrol hasta volúmenes de 400 ml. Los reactores se agitaron de forma continua a 55 °C durante 24 h, y contenían sacarosa 1 M, 1 m g l-1 de enzima y 10 g l -1 de resveratrol (suspensión) en tampón MOPS 50 mM, pH 6,5. Gracias a la conversión cuantitativa del resveratrol, su glucósido podría aislarse sencillamente mediante extracciones repetidas de acetato de etilo hasta una pureza > 90%. El disolvente se evaporó y el producto seco se analizó mediante HPLC para determinar la pureza y el rendimiento. Para verificar la identidad del compuesto por RMN y producir los patrones (TLC, HPLC), se realizó una purificación adicional mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (EtOAC: MeOH: H2O; 30:5:4; v/v/v) tal como se ha descrito anteriormente (De Winter et al., 2013).
Análisis por HPLC. Se realizó un seguimiento de las reacciones durante 24 h. Se tomaron muestras en varios puntos temporales inactivando partes alícuotas a 100 °C durante 10 min, operación seguida de centrifugación. Los sobrenadantes se filtraron a través de un filtro de poliestireno de 0,2 pm, se diluyeron en DMSO y se analizaron por HPLC utilizando una columna Waters XBridge Amida polar (250 x 4,6 mm, 3,5 pm) y un detector Alltech 2000ES ELSD (40 °C, flujo de gas: 1,5 lm in-1), con una mezcla en gradiente de eluyente A (acetonitrilo, trietilamina al 0,2%) y eluyente B (trietilamina al 0,2%): 90% de disolvente A (6 min), 10-25% de disolvente B (por etapas, 3% min-1), 25% de disolvente B (20 min) y 90% de disolvente A (10 min). Las concentraciones de ingredientes y los rendimientos respectivos se calcularon según patrones de fructosa, glucosa y 3-alfa-glucósido de resveratrol.
Análisis por RMN de 3-alfa-glucósido de resveratrol. La estructura química del glucósido de resveratrol purificado se dedujo a partir de la combinación análisis espectroscópico por RMN 1D (RMN de 1H y RMN de 13C) y RMN 2D (gCOSY, gHSQC y gHMBC); los valores de J se proporcionan en Hz.
5h(400 MHz; CDsOD) 7,39 (2 H, d, J = 8,6, 2 '-H y 6'-H), 7,04 (1 H, d, J = 16,3, 8-H), 6,87 (1 H, d, J = 16,3, 7-H), 6,86 (1 H, s, 2-H),6,80 (2 H, d, J = 8,6, 3 '-H y 5 ’-H), 6,62 (1 H, s, 6-H), 6,54 (1 H, s, 4-H), 5,50 (1 H, d, J = 3,5, 1"-H), 3,87 (1 H, dd, J = 9 ,7 y 8,9, 3"-H), 3,76 (2 H, m, 6"-Ha, 6"-Hb), 3,72 (1 H, ddd, J = 9,7, 4,2 y 2,5, 5"-H), 3,60 (1 H, dd, J = 9 ,7y 3,6, 2"-H) y 3,48 (1 H, dd, J = 9 ,7 y 8,9, 4"-H).
5c( 100 MHz; CD 3 OD) 160,23 (C-3), 159,87 (c-5), 158,73 (C-4'), 141,75 (C-1), 130,63 (C-1), 130,25 (C-8), 129,18 (C -2 'y C-6'), 127,01 (C-7), 116,83 (C -3 'y C-5'), 108,70 (C-6), 107,85 (C-2), 104,88 (C-4), 99,61 (C-1"), 75,28 (C-3"), 74,63 (C-5"), 73,64 (C-2"), 71,81 (C-4"), 62,63 (C-6").
Según el experimento COSY, el espectro de protones muestra un grupo -CH=CH-, sistemas de espín AA'BB' y AMX de anillos aromáticos paradisustituidos y trisustituidos en 1,3,5, y una unidad de sacárido. El conjunto de constantes vecinales extraídas (d, J = 3,5 Hz) identificó a-glucosa, mientras que la magnitud de J7-H, 8-h (16,3 Hz) demostró la conformación trans de resveratrol. La posición de la glicosilación se confirmó por el contacto HMBC del C-3 con 1 "-H.
Resultados
Hasta la fecha se han identificado dos enzimas SP (termo)estables, a saber, una en Bifidobacterium adolescentis (BaSP) y una en Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum (TtSPP).[9] Esta última en realidad prefiere sacarosa-6'-fosfato como sustrato (EC 2.4.1.329) pero aún puede utilizar eficazmente sacarosa como donante de glicosilo (Km = 77 mM).[9b] Ninguna de estas enzimas muestra una actividad significativa sobre resveratrol u otros compuestos polifenólicos como aceptor.
Analizamos la variante R134A correspondiente para determinar la actividad de transglicosilación sobre resveratrol y elementos constitutivos más pequeños (figura 1). Efectivamente, la disminución gradual en la actividad de resorcinol > orcinol > resveratrol observada con la enzima de tipo silvestre estuvo casi equilibrada con la variante, que retuvo más de la mitad de su actividad sobre resveratrol. La mutagénesis de saturación de sitio de la posición 134 no produjo variantes que fueran mejores que R134A, pero otros aminoácidos pequeños tales como valina y treonina también ofrecieron actividades aumentadas en comparación con la arginina de tipo silvestre. Esto confirmó nuestra hipótesis de que una cadena lateral voluminosa limita la unión de aceptores grandes en el sitio activo de SP. No obstante, esto solo fue válido para la posición 134, ya que la mutación de otros residuos en la entrada del sitio activo (por ejemplo, K301 o H344) a alanina no tuvo un efecto similar.
Es interesente destacar que las variantes de R134 no cerradas nos permitieron determinar los parámetros cinéticos para la glicosilación del resveratrol (tabla 1), lo que nunca ha sido posible con la enzima de tipo silvestre. Estas mediciones revelaron que la afinidad por el resveratrol es bastante razonable, con valores de Km en el intervalo de 50­ 200 mM. Como era de esperar, las mejoras en la accesibilidad influyen intensamente en el valor de kcat, que aumenta gradualmente a 2,4 s-1 cuando se introducen cadenas laterales más pequeñas en la posición 134. La mayor eficacia catalítica (12,8 M-1 s-1) se observa con la variante R134A, que por lo tanto es la enzima de elección para su aplicación en la síntesis de glucósidos.
Tabla 1. Parámetros cinéticos de variantes de TtSPP para la glicosilación de resveratrol[a]
enzima Km [mM] kcat [s-1] kcat/Km [M-1-s-1]
R134A 185 ± 32 2,36 ± 0,25 12,8 ± 2,6
R134V 110 ± 9 0,45 ± 0,02 4,1 ± 0,4
R134T 56 ± 8 0,08 ± 0,004 1,4 ± 0,2
[a] Utilizando como cosustrato sacarosa 1 M a pH 6,5 y 55 °C
La accesibilidad mejorada del sitio activo no debe ser exclusiva del resveratrol, sino que también debe notarse con otros aceptadores grandes. Por lo tanto, se analizó la variante R134A en una diversidad de (poli)fenoles para evaluar su promiscuidad total y su potencial como biocatalizador. De forma similar a las series de meta-bencenodiol (resorcinol - orcinol - resveratrol) mostradas en la figura 1, se observó de nuevo una disminución gradual de la actividad con las series de orto-bencenodiol (catecol > 4-metil-catecol > quercetina) para las enzimas de tipo silvestre (figura 2A). También en este caso, TtSPP mostró actividades de transglicosilación más altas que BaSP sobre los compuestos más pequeños, pero ninguno tuvo actividad sobre la quercetina, un representante voluminoso de la clase de los flavonoles. Por el contrario, se pudieron detectar cantidades significativas de producto de transglicosilación con la variante R134A, lo que confirma la capacidad mejorada de la enzima para unirse a aceptores más grandes gracias a su sitio activo no cerrado.
Al comparar estas tres enzimas en más aceptores fenólicos, la promiscuidad aumentada de R134A hacia moléculas grandes se hizo aún más obvia (figura 2B). De hecho, esta última mostró actividad sobre estructuras de las cinco clases principales de flavonoides (apigenina, epicatequina, quercetina y hesperetina), pero también sobre polifenoles artificiales tales como fenoxifenoles (figura 2C) a diferencia de TtSPP y BaSP, respectivamente. Este experimento de cribado demuestra que la variante R134A es un biocatalizador promiscuo que puede utilizarse para la glicosilación de varios compuestos polifenólicos de importancia industrial. Por lo tanto, esta nueva enzima es una diana muy prometedora para una manipulación por ingeniería genética posterior, ya que ha abierto la puerta a descubrir y explotar nuevas identidades, propiedades y aplicaciones de productos glicosilados.
A continuación, se demostró la viabilidad de utilizar la variante R134A como biocatalizador para la glicosilación de resveratrol en un sistema acuoso mezclando la enzima y sacarosa 1 M con una suspensión saturada de 10 g-l-1 de resveratrol. Después de 24 horas de incubación a 55 °C, se logró la conversión completa del aceptor (figura 3) y se produjeron 17,1 ± 0,6 g l '1 de 3-alfa-glucósido de resveratrol. La estructura del producto se determinó mediante espectroscopia de RMN (véase la información complementaria) para confirmar la estricta regioselectividad de la enzima. Este proceso de producción no solo es selectivo y eficaz, sino que también se puede implementar fácilmente a escalas comerciales más grandes.
Referencias
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Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento in vitro para glicosilar un polifenol que comprende:
- poner en contacto in vitro una sacarosa fosforilasa que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N° 1, la SEQ ID N° 2, la SEQ ID N° 3, la SEQ ID N° 4 o la SeQ ID N° 5 con sacarosa o alfa-glucosa-1-fosfato, y un polifenol, y
- glicosilar dicho polifenol.
2. Un procedimiento in vitro según la reivindicación 1, en el que dicho polifenol es un estilbenoide.
3. Un procedimiento in vitro según la reivindicación 2, en el que dicho estilbenoide es resveratrol.
4. Un procedimiento in vitro según la reivindicación 1, en el que dicho polifenol es un flavonoide.
5. Un procedimiento in vitro según la reivindicación 4, en el que dicho flavonoide es apigenina, hesperetina, quercetina o epicatequina.
6. Un procedimiento in vitro según la reivindicación 1, en el que dicho polifenol es un fenoxifenol.
7. Un procedimiento in vitro para glicosilar un polifenol que comprende:
- poner en contacto in vitro una sacarosa fosforilasa con sacarosa o alfa-glucosa-1 fosfato, y un polifenol, y - glicosilar dicho polifenol, en el que dicha sacarosa fosforilasa es un fragmento de la SEQ ID N° 1,2, 3, 4 o 5, en el que dicho fragmento comprende, además de tener el aminoácido A, V, T o G en la posición 134 de la SEQ ID N° 1­ 4, respectivamente, o de tener una deleción en la posición 134 tal como se muestra en la SEQ ID N° 5, al menos los siguientes 16 aminoácidos catalíticos de la SEQ ID N° 6: D49, F52, H87, F157, Q165, R195, D197, A198, Y201, E238, H240, H295, D296, D342, Q345 y R399, y en el que el fragmento tiene una actividad de glicosilación de polifenoles mejorada en comparación con la actividad de la sacarosa fosforilasa nativa de Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum.
8. Una variante de la sacarosa fosforilasa termoestable derivada del microorganismo Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum que se caracteriza por comprender la SEQ ID N° 2, 3, 4 o 5, o por comprender un fragmento según la reivindicación 7.
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