ES2809512T3 - Un nuevo antígeno de vacuna no de VIH de la microbiota vaginal capaz de inducir una respuesta de anticuerpos protectores neutralizadores de la mucosa contra la infección por VIH - Google Patents
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Abstract
Un antígeno de permeasa de Mycoplasma genitalium o un polinucleótido que codifica dicho antígeno en forma expresable, para su uso en la prevención y/o el tratamiento de la infección por VIH, en donde dicho antígeno de permeasa comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 4 y que comprende un epítopo reactivo de forma cruzada con un epítopo de ectodominio de VIH-gp41, y en donde dicho antígeno induce anticuerpos antipermeasa neutralizadores del VIH y reactivos de forma cruzada con el VIH.
Description
DESCRIPCIÓN
Un nuevo antígeno de vacuna no de VIH de la microbiota vaginal capaz de inducir una respuesta de anticuerpos protectores neutralizadores de la mucosa contra la infección por VIH
Sector de la técnica
La invención se refiere a un nuevo antígeno de vacuna no de VIH de la microbiota vaginal capaz de inducir una respuesta de anticuerpos protectores neutralizadores de la mucosa contra la infección por VIH y a un anticuerpo neutralizador dirigido a dicho antígeno.
Estado de la técnica
A pesar de treinta años de estudio, no hay ninguna vacuna contra el VIH. Los individuos no infectados expuestos al VIH son actualmente objeto de estudios intensos porque la identificación de los indicadores inmunitarios de la susceptibilidad reducida al VIH puede ofrecer pistas importantes para el desarrollo de una vacuna contra el VIH. Se planteó la hipótesis de que los anticuerpos monoclonales neutralizadores hipermutados, aislados de pacientes infectados con VIH, procedían de linajes de células B germinales progenitoras, sensibilizados inicialmente por autoantígenos o antígenos no de VIH-1 y estimulados para la respuesta específica a Env de VIH por otros inmunógenos (Haynes et al., Nature biotechnology, 2012, 30, 423-33). A lo largo de esta línea, se ha sugerido recientemente diseñar inmunógenos de VIH que se dirijan a receptores específicos de células B de estirpe germinal (BCR; Jardine et al., Science, 2013, 340, 711-6). Esto se consiguió mediante el "diseño inverso" de antígenos del epítopo nativo del sitio de unión de CD4 de VIH-gp120 (CD4bs-gp120) para iniciar la unión con receptores de células B de estirpe germinal. Como cabía esperar, la comparación de afinidad de diversos anticuerpos monoclonales neutralizadores hipermutados (VRC01, 12A12, 3BNC60, NIH46-45 PGV04, PGV19, PGV20, VRC-CH31) con la de su versión de estirpe germinal muestra que la afinidad del precursor de anticuerpo es de 2000 a 20000 veces menor para el dominio CD4bs-gp120 que la de las versiones hipermutadas (Hoot, S. et al., PLoS pathogens, 2013, 9, e1003106). Por el contrario, para determinar el epítopo original reconocido por VRC01, se necesitaron varias mutaciones puntuales sucesivas del dominio CD4bs-gp120 para ajustar mejor con el BCR germinal (compuesto por una cadena pesada codificada por hVH1-2*2 sin mutar). De acuerdo con los autores, solo eventos de mutación raros que cambien la naturaleza antigénica de gp120 durante la infección generarían un epítopo capaz de activar una población de células B vírgenes, precursoras de una respuesta de anticuerpos protectores. Esta población no sería reclutada por la forma nativa de la proteína de la envoltura. La dificultad de este enfoque es rastrear la evolución histórica de los antígenos víricos durante la infección en el paciente. Además, no se demostró que los antígenos de VIH de diseño inverso fueran capaces de inducir anticuerpos neutralizadores contra el VIH mediante inmunización activa.
La cepa de ratón transgénico HAMIGA (patente EP 1680 449) es una cepa de ratón transgénico humanizado que expresa IgA quiméricas humanas/murinas con regiones constantes de la cadena pesada de IgA humana (CH1 a c H3) y región variable de la cadena pesada y regiones variable y constante de la cadena ligera de ratón (VH, VL y CL).
Fraser et al. (Science, 1995, 270, 39-403) desvela la secuencia de nucleótidos completa del genoma de M. genitalium con regiones codificantes previstas, incluyendo un marcador de locus MG 468 que codifica una proteína hipotética de permeasa de transportador ABC (número de registro de GenBank AAC72488.1). Butt et al. (Infection, Genetics and Evolution, 2012, 112, 53-62) desvela la identificación de proteínas transmembrana previstas de M. genitalium que son de interés por su potencial como candidatas de vacuna contra la infección por M. genitalium . Los inventores han demostrado que un anticuerpo IgA monoclonal aislado de ratones transgénicos HAMIGA humanizados inmunizados con una permeasa truncada recombinante de Mycoplasma genitalium (fragmento 431 a 875 de proteína permeasa de transportador ABC de M. genitalium, número de registro de GenBank AAC72488.1 o SEQ ID NO: 1), un patógeno potencial del tracto genital, es capaz de neutralizar aislados primarios de VIH-1. Este es uno de los anticuerpos monoclonales neutralizadores del VIH-1 raros inducidos por inmunización activa (Nishiyama, Y. et al., The Journal of Biological Chemistry, 2009, 284, 30627-30642; Sreepian, A. et al., Journal o f Immune based Therapies and Vaccines, 2009, 7, 5) y el primero en ser inducido por un antígeno independiente del VIH-1. Todos los demás se han aislado de pacientes infectados con VIH (McCoy, L. E. y Weiss, R. A. The Journal o f Experimental Medicine, 2013, 210, 209-223). Las características de este anticuerpo IgA y la naturaleza del inmunógeno sugieren que la respuesta inmunitaria natural a la microbiota genital (comensales y/o patógenos) puede contribuir a la resistencia natural a la infección por VIH.
Objeto de la invención
A la vista de estos resultados, La proteína permeasa de Mycoplasma genitalium (SEQ ID NO: 1) representa un candidato prometedor para iniciar un protocolo de vacuna anti-VIH basado en su capacidad para sensibilizar clones de células B, capaces de reconocer adicionalmente antígenos de VIH nativos.
La invención es como se define en el conjunto de reivindicaciones adjunto.
Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a un antígeno de permeasa de Mycoplasma genitalium o a un polinucleótido que codifica dicho antígeno en forma expresable, para su uso en la prevención y/o el tratamiento de la
infección por VIH, en donde dicho antígeno de permeasa comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4 o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 4 y que comprende un epítopo reactivo de forma cruzada con el epítopo de ectodominio de VIH-gp41, y en donde dicho antígeno induce anticuerpos antipermeasa neutralizadores del VIH y reactivos de forma cruzada con el VIH. En la siguiente descripción, a menos que se especifique de otro modo, permeasa de Mycoplasma, permeasa de M. o permeasa se refieren a la proteína permeasa de M. genitalium de la SEQ ID NO: 1. La permeasa de Mycoplasma genitalium es el producto del marcador de locus MG 468 (complemento de las posiciones 570994 a 576345 en la secuencia del genoma de Mycoplasma genitalium G37, número de registro de GenBank L43967.2). La secuencia de aminoácidos de la permeasa de M. genitalium corresponde al número de registro de GenBank AAC72488.1 o la SEQ ID NO: 1.
La secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4 corresponde a una proteína permeasa truncada (restos 431 a 875 de la secuencia de aminoácidos de la permeasa de M. genitalium SEQ ID NO: 1) incluyendo los epítopos neutralizadores reactivos de forma cruzada con el VIH del ectodominio y la cola C-terminal de gp41 de VIH.
En la siguiente descripción, se usa el código de aminoácidos de una letra convencional.
El antígeno de permeasa de Mycoplasma o antígeno de permeasa para su uso de acuerdo con la invención se refiere a un antígeno que comprende una proteína derivada de permeasa de M. genitalium de la SEQ ID NO: 1, proteína que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4 o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 4 y es capaz de inducir anticuerpos antipermeasa que reaccionan de forma cruzada con el VIH y neutralizan el VIH. Los anticuerpos inducidos por el antígeno de permeasa que reaccionan de forma cruzada con el VIH y neutralizan el VIH se denominan en lo sucesivo en el presente documento anticuerpos antipermeasa, anticuerpos antipermeasa neutralizadores y reactivos de forma cruzada con el VIH o anticuerpos neutralizadores y reactivos de forma cruzada con el VIH.
En particular, el antígeno de permeasa para el uso de la invención es capaz de sensibilizar clones de células B capaces de reconocer adicionalmente antígenos de VIH nativos.
El antígeno de permeasa para el uso de la invención puede ser un antígeno aislado, natural, recombinante o sintético que comprenda o que consista en la proteína permeasa de Mycoplasma genitalium de la SEQ ID NO: 1, o un derivado inmunogénico de la misma, tal como, por ejemplo, una variante de permeasa de M. genitalium, y una proteína modificada de la misma. Las variantes de la proteína permeasa de M. genitalium derivan de secuencias de aminoácidos de tipo silvestre mediante la introducción de una o más mutaciones (supresión, inserción y/o sustitución) en posiciones de aminoácidos específicas. Las variantes de proteína permeasa de M. genitalium incluyen variantes naturales resultantes del polimorfismo del gen de la permeasa de M. genitalium, así como de variantes artificiales. Los antígenos derivados de la proteína permeasa de M. genitalium para el uso de la invención son antígenos funcionales, lo que significa que son capaces de inducir anticuerpos antipermeasa, reactivos de forma cruzada con el VIH y neutralizadores de la infección por VIH.
Los anticuerpos neutralizadores y reactivos de forma cruzada con el VIH que son inducidos por el antígeno de permeasa para el uso de la invención reconocen epítopos relacionados en las proteínas permeasa de M. genitalium y Env del HIV.
El antígeno de permeasa para el uso de la invención que es capaz de inducir una respuesta inmunitaria protectora ampliamente neutralizadora contra la infección por VIH es útil como vacuna contra el VIH preventiva y/o terapéutica.
Las propiedades del antígeno de proteína permeasa para el uso de la invención pueden ser fácilmente verificadas mediante la técnica conocida por los expertos en la materia, tales como las que se describen en los ejemplos de la presente solicitud.
El polinucleótido que codifica el antígeno en forma expresable se refiere a una molécula de ácido nucleico que, tras la expresión en una célula o en un sistema sin células, da como resultado un antígeno funcional. El polinucleótido puede ser un polinucleótido aislado que codifique dicho antígeno, tal como el polinucleótido natural de Mycoplasma genitalium que codifica dicho antígeno.
El antígeno de permeasa para el uso de la invención, que es capaz de inducir anticuerpos antipermeasa reactivos de forma cruzada con el VIH y que neutralizan el VIH, comprende al menos un epítopo de célula B o de anticuerpo de permeasa de M. genitalium, que es un epítopo neutralizador y reactivo de forma cruzada con el VIH.
El epítopo de permeasa reacciona de forma cruzada preferentemente con un epítopo de VIH-Env, más preferentemente un epítopo de VIH-gp41.
El epítopo de permeasa puede reaccionar de forma cruzada ventajosamente con un epítopo de ectodominio de VIH-gp41 de la SEQ ID NO: 2.
Como alternativa, el epítopo de permeasa puede reaccionar de forma cruzada ventajosamente con un epítopo de cola
C-terminal de VIH-gp41. El epítopo de permeasa puede reaccionar de forma cruzada con la secuencia de aminoácidos: LVGLRIVFAVLSIVNRVRQGYSPLSFQTHLPTPRGP (SEQ ID NO: 3) de la cola C-terminal de VIH-gp41 (posiciones 699 a 734 de gp41 de VIH, de acuerdo con el sistema de numeración de Ratner et al., Nature, 1985, 313, 277-284), que presenta homología de secuencia con la permeasa de M. genitalium de la SEQ ID NO: 1, como se demuestra en los ejemplos de la presente solicitud.
El antígeno de permeasa para el uso de la invención comprende uno o más epítopos neutralizadores y reactivos de forma cruzada con el VIH, en donde cada epítopo puede ser lineal o conformacional. En algunos aspectos, el antígeno de permeasa comprende al menos dos epítopos neutralizadores y reactivos de forma cruzada con el VIH idénticos o diferentes de permeasa de M. genitalium unidos entre sí directamente o a través de un brazo espaciador peptídico.
El porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos se define como el porcentaje de restos de aminoácidos en una Secuencia Comparada que son idénticos a la Secuencia de Referencia después de alinear las secuencias e introducir huecos si es necesario, para conseguir la identidad de secuencia máxima. El porcentaje de identidad se determina entonces de acuerdo con la siguiente fórmula: Porcentaje de identidad = 100 x [1-(C/R)], en donde C es el número de diferencias entre la Secuencia de Referencia y la Secuencia Comparada a lo largo de toda la longitud de la Secuencia de Referencia, en donde (i) cada aminoácido en la Secuencia de Referencia que no tiene un aminoácido alineado correspondiente en la Secuencia Comparada, (ii) cada hueco en la Secuencia de Referencia y iii) cada aminoácido alineado en la Secuencia de Referencia que es diferente de un aminoácido en la Secuencia Comparada constituye una diferencia; y R es el número de aminoácidos en la Secuencia de Referencia a lo largo de la longitud de la alineación con la Secuencia Comparada, contándose también cualquier hueco creado en la Secuencia de Referencia como un aminoácido.
La alineación con el fin de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos puede conseguirse de varias maneras conocidas para el experto en la materia, por ejemplo, usando programas informáticos de acceso público tales como BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-). Cuando se usa dicho software, los parámetros por defecto, por ejemplo, para la penalización por hueco y la penalización por extensión, se usan preferentemente. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa por defecto una longitud de palabra (W) de 3 y una expectativa (E) de 10.
La secuencia del antígeno de permeasa para el uso de la invención se selecciona preferentemente entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 4 y una secuencia que difiere de la SEQ ID NO: 4 en supresiones y/o inserciones dispersas de uno a cinco aminoácidos en dicha secuencia, sustituciones de aminoácidos y/o una supresión o supresiones N-terminales de uno o más aminoácidos en dicha secuencia. La sustitución o las sustituciones de aminoácidos en la SEQ ID NO: 4 se eligen ventajosamente entre sustituciones conservadoras, es decir, sustituciones de un aminoácido por otro que tiene propiedades químicas o físicas similares (tamaño, carga o polaridad), que generalmente no afectan negativamente a las propiedades antigénicas de la proteína/péptido. Más preferentemente, dicha sustitución o sustituciones conservadoras se eligen de entre uno de los siguientes cinco grupos: Grupo 1 - Restos alifáticos, pequeños, no polares o ligeramente polares (A, S, T, P, G); Grupo 2 - Restos polares con carga negativa y sus amidas (D, N, E, Q); Grupo 3 - Restos polares con carga positiva (H, R, K); Grupo 4 - Restos alifáticos, grandes y no polares (M, L, I, V, C); y Grupo 5 - Restos aromáticos grandes (F, Y, W).
El antígeno de permeasa para el uso de la invención puede ser una proteína permeasa de longitud completa o un fragmento inmunogénico de la misma. En algunas realizaciones el antígeno de permeasa comprende o consiste en una proteína de menos de 500 aminoácidos.
Los ejemplos de antígenos de permeasa preferidos para el uso de la invención comprenden una proteína que comprende o que consiste en la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 7.
La proteína permeasa para el uso de la invención puede comprender o consistir en aminoácidos naturales (20 aminoácidos codificados genéticamente en una configuración L y/o D) unidos a través de un enlace peptídico, así como peptidomiméticos de dicha proteína donde el aminoácido o los aminoácidos y/o el enlace peptídico o los enlaces peptídicos se han reemplazado por análogos funcionales. Dichos análogos funcionales incluyen todos los aminoácidos conocidos aparte de los 20 aminoácidos codificados genéticamente. En la Tabla 1A del documento US 2008/0234183 se proporciona una lista no limitante de aminoácidos no codificados. La proteína permeasa para el uso de la invención puede ser una proteína modificada derivada de las proteínas anteriores mediante la introducción de cualquier modificación química en uno o más restos de aminoácidos, enlaces peptídicos, extremos N y/o C-terminales de la proteína, siempre que la proteína modificada sea funcional. Estas modificaciones que se introducen en la proteína mediante los métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia, incluyen, de manera no limitante: la sustitución de un aminoácido natural por un aminoácido no proteinogénico (análogo de aminoácido o aminoácido D); la modificación del enlace peptídico, en particular con un enlace del tipo retro o retroinverso o un enlace diferente del enlace peptídico; la ciclación y la adición de un grupo químico a la cadena lateral o al extremo o los extremos de la proteína/péptido, en particular para acoplar un agente de interés a la proteína de la invención. Estas modificaciones pueden usarse para aumentar su antigenicidad, inmunogenia y/o biodisponibilidad, o para marcar la proteína/péptido. Por ejemplo, el antígeno de permeasa puede estar conjugado con un resto GPI para anclar el antígeno a la membrana celular y exponer dicho antígeno en la superficie celular.
En otro aspecto, el antígeno de permeasa para el uso de la invención es una proteína de fusión o quimérica que comprende una secuencia de aminoácidos fusionada al extremo o extremos N-terminales y/o C-terminales de una proteína permeasa que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4 o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 4 como se ha definido anteriormente. La longitud de la proteína quimérica no es crítica para la invención siempre que el antígeno de permeasa sea funcional. La proteína permeasa se fusiona con uno o más de otros restos de proteína/péptido, incluyendo otro antígenos o antígenos, en particular antígenos de VIH, y/u otros restos de proteína/péptido que potencien la activación de las células B, y/o el tráfico a los ganglios linfáticos, y/o aumenten la estabilidad y la biodisponibilidad, y/o permitan la purificación, detección, inmovilización, producción en sistemas de expresión, del antígeno de permeasa de la invención.
Estos restos pueden seleccionarse entre: (i) un componente proteínico de una partícula de tipo virus para exponer el antígeno de la invención en la superficie de nanopartículas de tipo virus, (ii) un resto de anclaje de membrana tal como el dominio transmembrana de una proteína transmembrana para anclar el antígeno en la superficie celular y exponer dicho antígeno en la superficie celular (iii) un resto de marcado tal como una proteína fluorescente (GFP y sus derivados, BFP e YFP), (iv) un resto indicador tal como un marcador enzimático (luciferasa), fosfatasa alcalina, glutatión-S-transferasa (GST), p-galactosidasa), (v) un resto de unión tal como un marcador de epítopo (poliHis6, FLAG, HA, myc.), un dominio de unión a ADN, un dominio de unión a hormona, un marcador de polilisina para la inmovilización en un soporte, (vi) un resto de estabilización y (vii) un resto de direccionamiento para dirigir la proteína quimérica a un tipo de célula o compartimento celular específico. Además, el antígeno de permeasa puede separarse del resto de péptido/proteína mediante un enlazador que sea lo suficientemente largo para evitar que se inhiban las interacciones entre el péptido de antígeno de permeasa y el resto de proteína/péptido. El enlazador también puede comprender un sitio de reconocimiento para una proteasa, por ejemplo, para retirar marcadores de afinidad y restos de estabilización de la proteína quimérica purificada de acuerdo con la presente divulgación.
El polinucleótido que codifica la proteína en forma expresable es ADN sintético o recombinante, ARN o una combinación de los mismos, ya sea monocatenarios y/o bicatenarios. Preferentemente el polinucleótido comprende una secuencia codificante optimizada para el hospedador en el que se expresa la proteína/péptido.
En otra realización preferida, el polinucleótido comprende o consiste en la SEQ ID NO: 5 o 6.
En otro aspecto, el polinucleótido para el uso de la invención se inserta en un vector. Preferentemente, dicho vector recombinante es un vector de expresión capaz de expresar dicho polinucleótido cuando se transfecta o transforma en una célula hospedadora tal como una célula procariota o eucariota. El polinucleótido se inserta en el vector de expresión con la orientación adecuada y el marco de lectura correcto para la expresión. Preferentemente, el polinucleótido está unido operativamente a al menos una secuencia reguladora de la transcripción y, opcionalmente, a al menos una secuencia reguladora de la traducción. Los vectores recombinantes incluyen los vectores habituales utilizados en ingeniería genética, vacunas y terapia génica, incluyendo, por ejemplo, plásmidos y vectores víricos.
En algunas realizaciones, el antígeno de permeasa o el polinucleótido que codifica dicho antígeno se incluyen en una composición inmunogénica o de vacuna, que comprende un vehículo farmacéutico aceptable, y opcionalmente, al menos un excipiente y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
La composición inmunogénica o de vacuna para su uso de acuerdo con la invención es capaz de inducir una respuesta inmunitaria protectora de la mucosa funcional contra la infección por VIH que puede medirse mediante diversos ensayos que son conocidos por los expertos en la materia. Los ejemplos de dichos ensayos incluyen, sin limitación: ensayos de captura del virus VIH, ensayos de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) usando células efectoras polinucleares CD89+ primarias, ensayos de inhibición mediada por Fc en macrófagos, ensayos de inducción de fagocitosis de macrófagos, ensayos de inhibición de la replicación vírica, ensayos de neutralización de la infección por VIH, ensayos de agregación de virus y ensayos de inhibición de la transcitosis.
En algunos aspectos, el antígeno de permeasa para el uso de la invención es un antígeno aislado. En otros aspectos, el antígeno de permeasa para el uso de la invención comprende M. genitalium atenuado o inactivado de células enteras vivas.
El polinucleótido que codifica dicho antígeno se inserta preferentemente en un vector de expresión.
La composición para el uso de la invención comprende una dosis terapéuticamente eficaz del antígeno/polinucleótido/vector, por ejemplo, suficiente para inducir una respuesta inmunitaria protectora específica contra el VIH, en el individuo al que se le administra. La dosis eficaz se determina y ajusta dependiendo de factores tales como la composición utilizada, la vía de administración, las características físicas del individuo en cuestión, tales como el sexo, la edad y el peso, la medicación simultánea y otros factores, que los expertos en las técnicas médicas reconocerán.
La composición se administra generalmente de acuerdo con procedimientos conocidos utilizados para la vacunación, en dosificaciones y durante períodos de tiempo eficaces para inducir una respuesta inmunitaria protectora específica
contra el VIH. La administración puede ser por inyección o por administración oral, sublingual, intranasal, rectal o vaginal, inhalación, o aplicación transdérmica. Preferentemente, la administración es por inyección intradérmica o administración intranasal, intravaginal o intrarrectal.
Los vehículos farmacéuticos son los adecuados para la vía de administración prevista, que son bien conocidos en la técnica.
El vehículo puede seleccionarse ventajosamente entre el grupo que consiste en: liposomas unilamelares o multilamelares, ISCOMS, virosomas, pseudopartículas víricas, micelas de saponina, sacáridos (poli(lactida-coglicolida)) o nanopartículas y microesferas de oro. Preferentemente, la composición comprende liposomas.
El adyuvante puede seleccionarse ventajosamente entre el grupo que consiste en: poliI:C (poliinosina-ácido policitidílico), emulsión oleosa, sustancias minerales, extractos bacterianos, qligonucleótido que contiene CpG, saponina, hidróxido de alúmina, monofosforil-lípido A (MPLA, un agonista de TLR4) y escualeno. Preferentemente, el adyuvante es capaz de inducir una respuesta de anticuerpos IgA, tal como, por ejemplo, el adyuvante poliI:C (poliinosina-ácido policitidílico). Los adyuvantes más preferidos incluyen polil:C y MPLA. La composición se formula para la administración por varias vías. Preferentemente, la composición se formula para la inyección intradérmica o la aplicación local, más preferentemente para la administración intradérmica, intranasal, intravaginal o intrarrectal. Por ejemplo, la composición se formula en un gel para la aplicación local.
De acuerdo con una realización preferida de la composición para el uso de la invención, dicha composición comprende adicionalmente un anticuerpo dirigido contra dicho antígeno de permeasa; el anticuerpo forma un complejo antígenoanticuerpo con el antígeno que tiene la ventaja de aumentar la inmunogenia del antígeno. Preferentemente, el anticuerpo es una IgA, más preferentemente una IgA humano o humanizada. El anticuerpo es ventajosamente un anticuerpo monoclonal. Por ejemplo, el anticuerpo es una IgA quimérica humana, tal como el anticuerpo monoclonal IgA quimérico humano C3G4 que comprende un segmento IgVH murino de la SEQ ID NO: 8, un segmento IgVL murino de la SEQ ID NO: 9, un segmento constante Ig-alfa1 humano de la SEQ ID NO: 10 y un segmento constante Ig-kappa murino de la SEQ ID NO: 11, que se desvela en los ejemplos de la presente solicitud.
Una composición de vacuna preferida para el uso de la invención, comprende un antígeno de permeasa de M. genitalium formulado en liposomas que contienen monofosforil lípido A (MPLA). Tanto los liposomas como el MPLA contribuyen como adyuvantes. Un ml de suspensión liposómica puede contener 1 mg de antígeno de permeasa de M. genitalium y 0,800 mg de MPLA. La composición de vacuna puede formularse en forma de un gel, para la administración por vía local, por ejemplo, por vía nasal o vaginal. El gel puede comprender Natrosol® 250 HHX al 4 % p/p (Hidroxietilcelulosa) y alcohol bencílico al 1,1 % p/p, en PBS.
El antígeno de permeasa o polinucleótido que codifica dicho antígeno como se ha definido anteriormente es una vacuna profiláctica y/o terapéutica, para su uso en la prevención y/o el tratamiento de la infección por VIH mediante la administración a un individuo de una cantidad terapéuticamente eficaz del antígeno de permeasa, polinucleótido y/o vector como se ha descrito anteriormente, preferentemente incluido en una composición inmunogénica o de vacuna como se ha descrito anteriormente.
La administración del antígeno de permeasa se usa para sensibilizar clones de células B, capaces de reconocer adicionalmente antígenos de VIH nativos. Después de la sensibilización inicial, la respuesta inmunitaria anti-VIH puede estimulares mediante la administración de un antígeno o antígenos de VIH, en particular el antígeno o los antígenos de VIH-Env. Puede usarse una mezcla de diferentes antígenos de VIH. Son antígenos de VIH preferidos el ectodominio de gp41 de VIH y/o los antígenos de la cola C-terminal.
El protocolo de vacunación puede comprender una sensibilización inicial con el antígeno de permeasa que comprende tres administraciones de antígeno de permeasa con un intervalo de un mes y una estimulación final con un antígeno o antígenos de VIH-1, un mes después de la última administración de antígeno de permeasa.
En el presente documento se desvela una preparación combinada que contiene un antígeno de permeasa, polinucleótido, vector como se describe en el presente documento y un antígeno o antígenos de VIH, en particular un antígeno o antígenos de VIH-Env, para el uso simultáneo, por separado o secuencial en la prevención y/o el tratamiento de la infección por VIH, en particular la infección por VIH-1.
Otro aspecto de la invención se refiere a un anticuerpo antipermeasa aislado reactivo de forma cruzada con el VIH y es neutralizador, o un fragmento funcional de dicho anticuerpo que comprende al menos el sitio de unión del anticuerpo, en donde el anticuerpo se dirige contra un antígeno de permeasa de M. genitalium que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 4 y que comprende un epítopo reactivo de forma cruzada con un epítopo de ectodominio de VIH-gp41. Preferentemente, el anticuerpo es una IgA, más preferentemente una IgA humana o humanizada, tal como una IgA quimérica humana. El anticuerpo es ventajosamente un anticuerpo monoclonal. En una realización preferida, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal IgA quimérico humano producido mediante inmunización de un ratón transgénico HAMIGA (patente EP 1680 449) con un antígeno de permeasa como se ha descrito anteriormente. Por
ejemplo, el anticuerpo es el anticuerpo monoclonal IgA quimérico humano C3G4 que comprende un segmento IgVH murino de la SEQ ID NO: 8, un segmento IgVL murino de la SEQ ID NO: 9, un segmento constante Ig-alfa1 humano de la SEQ ID NO: 10 y un segmento constante Ig-kappa murino de la SEQ ID NO: 11, que se desvela en los ejemplos de la presente solicitud.
En el presente documento se desvela un polinucleótido aislado que codifica dicho anticuerpo antipermeasa neutralizador y reactivo de forma cruzada con el VIH o fragmento funcional del mismo. El polinucleótido puede comprender la secuencia SEQ ID NO: 12 o 13 que codifica el segmento IgVH de la SEQ ID NO: 8 y el segmento IgVL de la SEQ ID NO: 9, respectivamente.
El anticuerpo antipermeasa es un componente útil de la composición inmunogénica o de vacuna como se ha descrito anteriormente, es también una herramienta de diagnóstico complementaria para evaluar la evolución del estado inmunitario protector y la maduración de los pacientes tratados o inmunizados contra la infección por VIH, un marcador predictivo de resistencia a la infección por VIH y una herramienta para diseñar inmunógenos de VIH capaces de inducir una respuesta de anticuerpos neutralizadores protectores contra la infección por VIH.
En el presente documento se desvela un método para la identificación de un nuevo antígeno candidato de vacuna contra un patógeno de interés, que comprende:
a) identificar un antígeno en la microbiota de la mucosa de un individuo naturalmente resistente a dicho patógeno, en particular un individuo humano, en donde el antígeno de la microbiota es de un microorganismo diferente de dicho patógeno,
b) generar un anticuerpo contra dicho antígeno de la microbiota en a),
c) someter a ensayo la actividad neutralizadora del anticuerpo obtenido en b) contra dicho patógeno, en donde una actividad neutralizadora del anticuerpo contra dicho patógeno indica que el antígeno de la microbiota es un nuevo antígeno candidato de vacuna contra dicho patógeno, para un individuo que es susceptible a dicho patógeno.
La microbiota natural puede ser de la mucosa vaginal, nasofaríngea, pulmonar o gastrointestinal.
El patógeno es un microorganismo que puede ser patógeno en algunos individuos pero no en otros individuos que se diferencian de los primeros por algunos factores tales como, por ejemplo, la edad, el sexo, el historial médico, el estado inmunitario y la microbiota.
El patógeno puede ser un virus. En algunos aspectos de dicho método, dicho patógeno es el VIH y/o dicha microbiota es de la mucosa vaginal. El anticuerpo se genera ventajosamente mediante inmunización de un ratón transgénico HAMIGA (patente EP 1680 449) con el antígeno de la microbiota, para producir IgA quiméricas humanas dirigidas contra dicho antígeno.
Una actividad neutralizadora indica que el antígeno de la microbiota es capaz de inducir una respuesta inmunitaria protectora contra dicho patógeno. La actividad de neutralización puede estar relacionada con un anticuerpo que reconoce epítopos que no pueden identificarse mediante ensayos de unión convencionales.
El polinucleótido para su uso de acuerdo con la invención se prepara mediante métodos convencionales conocidos en la técnica. Por ejemplo, se produce mediante la amplificación de una secuencia de ácidos nucleicos por PCR o RT-PCR, mediante cribado de bibliotecas de ADN genómico mediante hibridación con una sonda homóloga, o bien mediante síntesis química total o parcial. Los vectores recombinantes se construyen e introducen en células hospedadoras mediante técnicas convencionales de ADN recombinante y de ingeniería genética, que se conocen en la técnica.
La proteína para su uso de acuerdo con la invención se prepara mediante las técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia, en particular mediante la expresión de un ADN recombinante en un sistema celular adecuado (eucariota o procariota) o mediante síntesis en fase sólida o líquida. Más específicamente, la proteína y sus derivados por lo general se producen a partir del ADNc correspondiente, obtenido mediante cualquier medio conocido por los expertos en la materia; el ADNc se clona en un vector de expresión eucariota o procariota y la proteína producida en las células modificadas con el vector recombinante se purifica por cualquier medio adecuado, en particular por cromatografía de afinidad. El péptido y sus derivados por lo general se sintetizan en fase sólida, de acuerdo con la técnica de Fmoc, descrita originariamente por Merrifield et al. (J. Am. Chem. Soc., 1964, 85: 2149-) y se purifican mediante cromatografía de líquidos de alta resolución en fase inversa.
Descripción de las figuras
La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otro modo, técnicas convencionales que están dentro de la experiencia en la materia. Dichas técnicas se explican con todo detalle en la bibliografía. Además de las disposiciones anteriores, la invención también comprende otras disposiciones, que surgirán de la descripción a continuación, que se refiere a realizaciones de ejemplo del tema de la presente invención, con referencia a los dibujos adjuntos en los que:
- La figura 1 ilustra la potencia de neutralización de la infección por VIH-1 (CI90) en un ensayo de neutralización basado en CMSP de IgA sérica purificada de ratones HAMIGa inmunizados con antígeno de permeasa de Mycoplasma genitalium (PERM) o polipéptido de ectodominio de gp41 de VIH (GP). Se inmunizaron ratones HAMIGA (10 ratones por grupo) a través de dos vías diferentes (vía vaginal (VAG) o vía intradérmica (ID)) y con dos antígenos diferentes, un antígeno de permeasa truncado recombinante de M. genitalium (PERM) o el polipéptido de ectodominio de gp41 de VIH (GP). Se inmunizaron ratones HAMIGA de control (5 ratones por grupo) con Albúmina Sérica Bovina (BSA) por la vía ID. Se recogieron IgA séricas y se purificaron mediante cromatografía de afinidad. Se midió la actividad neutralizadora de la IgA sérica de cada ratón inmunizado contra la cepa de virus SF162 en un ensayo de neutralización basado en CMSP. La actividad neutralizadora se expresa como CI90 (concentración inhibidora del 90 %), es decir, la concentración (pg/ml) de IgA sérica purificada que provocó una reducción del 90 % de la infección por el virus VIH. Solamente las IgA séricas de ratones inmunizados con permeasa fueron capaces de presentar una potencia CI90 de neutralización de la infección por VIH-1 en el intervalo de 60 pg/ml. A pesar de una fuerte unión anti-gp41, ninguna de las IgA séricas de ratones inmunizados con polipéptido de ectodominio de gp41 fue capaz de generar una respuesta inmunitaria neutralizadora CI90.
- La figura 2 muestra la reactividad cruzada mediante ELISA de anticuerpos IgA séricos y secretores policlonales anti-permeasa de Mycoplasma genitalium con gp41 de VIH. Se inmunizaron ratones transgénicos HAMIGA con antígeno de permeasa (P) de Mycoplasma genitalium (M.g.) o polipéptido de ectodominio de gp41 (GP) mediante las vías intradérmica (ID) o intravaginal (VAG). Se analizaron anticuerpos IgA policlonales específicos anti gp41 de VIH-1 y antipermeasa de M.g. mediante ELISA en suero y secreciones vaginales de ratones preinmunes (Pre-I) y ratones inmunizados. Aunque la IgA policlonal (sérica y vaginal) de los ratones HAMIGA inmunizados con gp41 no muestra una unión significativa en la permeasa en ELISA, la IgA policlonal de los ratones HAMIGA inmunizados con permeasa de M. genitalium presenta una reactividad cruzada significativa contra el antígeno de ectodominio de gp41.
- La figura 3 representa el análisis por SDS-PAGE con tinción azul de Coomassie del anticuerpo IgA1 k monoclonal quimérico humano/murino neutralizante de VIH-1 C3G4. C3G4 se purificó mediante cromatografía de afinidad y las formas monoméricas y poliméricas de IgA se separaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño. C3G4 contiene las dos formas, monomérica y polimérica, de una IgA1 monoclonal. L: Marcador de peso molecular.
1. Fracción total del mAb C3G4. 2. Fracción enriquecida en IgA monomérica del mAb C3G4. 3. Fracción enriquecida con IgA polimérica del mAb C3G4.
- La figura 4 ilustra la actividad de unión y neutralización de IgA1 antipermeasa de M. genitalium monoclonal C3G4. A. La unión de IgA total, las fracciones enriquecidas en IgA monomérica y enriquecidas con IgA polimérica de C3G4 a la permeasa de M. genitalium se analizó mediante ELISA usando permeasa truncada de M. genitalium como antígeno. B. La unión de IgA total, las fracciones enriquecidas en IgA monomérica y enriquecidas con IgA polimérica de C3G4 a gp41 de VIH se analizaron mediante ELISA usando polipéptido de ectodominio de gp41 de VIH como antígeno. C. La actividad neutralizadora de las fracciones enriquecidas en IgA monomérica e IgA polimérica de C3G4 se midió frente a las cepas de virus VIH-1/SF162 y VIH-1/QHO en un ensayo de neutralización basado en CMSP. La actividad neutralizadora se expresa como CI70 (concentración inhibidora del 70 %) y CI90 (concentración inhibidora del 90 %), es decir, la concentración (mg/ml) de fracción enriquecida monomérica o enriquecida polimérica de C3G4 que provocó una reducción del 70 % y el 90 % de la infección por el virus VIH, respectivamente.
- La figura 5 ilustra la actividad de neutralización de IgAl antipermeasa de M. genitalium monoclonal C3G4 en un ensayo de neutralización basado en CMSP en nueve cepas de VIH-1. La actividad neutralizadora de la IgA1 polimérica C3G4 purificada se sometió a ensayo en diferentes cepas de laboratorio y primarias de VIH-1. La IgA1 polimérica C3G4 purificada presentó una actividad de neutralización en nueve cepas diferentes de VIH-1 con una CI80 < 18 pg/ml contra VIH-1s f 162, aislados de VIH-192BR025 y VIH-1t v 1, una CI50 <1,8 pg/ml frente a aislados de VIH-1q h o y VIH-1d u 174 y una CI50 <18 pg/ml frente a aislados de VIH-1k o n , HIV-192UG024, HIV-189.6 y HIV-1r w .
- La figura 6 representa la alineación de segmentos variables de IgH del mAb humano neutralizador de VIH VRC01 (SEQ ID NO: 17) dirigido a CD4bs-gp120 y su progenitor humano no mutado IgVH1-2*2 (SEQ ID NO: 18); anticuerpo IgA1K monoclonal quimérico humano/murino neutralizador del VIH-1 C3G4 (SEQ ID NO: 19) y su progenitor murino no mutado IgVH5-12 (SEQ ID NO: 20).
Descripción detallada de la invención
Ejemplo 1: Identificación de la respuesta inmunitaria vaginal en mujeres no infectadas altamente expuestas al VIH
1. Material y métodos
1.1 Cohortes
Se investigó una cohorte de 32 mujeres no infectadas altamente expuestas al VIH (MNIAE) de parejas serodiscordantes, en colaboración con los Centros GHESKIO (Grupo haitiano para el estudio del sarcoma de Kaposi
y las infecciones oportunistas, por sus siglas en inglés) en Haití. La cohorte de control incluía 15 sujetos no infectados y no expuestos al VIH. Ninguno de los sujetos tenía el genotipo homocigótico CCR5-Delta 32 y dos eran heterocigóticos, uno en el grupo MNIAE, el otro en el grupo de control. El estudio fue aprobado por un comité ético y se obtuvo el consentimiento informado de todas las mujeres antes del muestreo.
1.2 ELISA en secreciones vaginales
Se sometieron a ensayo secreciones vaginales de MNIAE y controles para determinar respuestas de anticuerpos IgG1 e IgA específicos de gp41 de VIH mediante ELISA, como se ha descrito anteriormente (Hocini et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses, 1997, 13, 1179-).
1.3 Transferencia Western en secreciones vaginales
Se analizaron secreciones vaginales de MNIAE y controles para determinar anticuerpos IgG1 e IgA específicos de gp160, gp110, gp41, p68, p55, p53, p40, p34 y p25 de VIH mediante transferencia Western como se ha descrito anteriormente (Hocini et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses, 1997, 13, 1179-).
1.4 Ensayo de inhibición de la transcitosis
El ensayo de inhibición de la transcitosis se realizó como se ha descrito anteriormente (Bélec, L. et al. The Journal of infectious diseases, 2001, 184, 1412-1422).
1.5 Clonación de regiones variables de IgG1 e IgA de células de la mucosa en vector fagémido
Se construyeron bibliotecas separadas de fragmentos Fab de IgA e IgG1. Brevemente, se usaron ARN mensajeros extraídos de células de la mucosa de dos sujetos seleccionados para la amplificación por separado de regiones variables de IgG1 e IgA. Se combinaron individualmente cebadores de PCR correspondientes al extremo 5' de todas las familias de dominio variable de VH y VL con un cebador derivado del primer dominio constante de IgG1 o IgA (Persson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 1991, 88, 2432-6). A continuación, los fragmentos de ADN amplificados correspondientes a cadenas pesadas y ligeras se clonaron en un vector fagémido (Persson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 1991, 88, 2432-6), permitiendo la presentación en la superficie del fragmento Fab (Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88, 7978-82).
1.6 Secuenciación de Fab de IgG e IgA recombinantes
Se secuenciaron clones individuales, de bibliotecas tanto de IgG1 como de IgA, usando la técnica de didesoxi de Sanger convencional.
1.7 Expresión de fragmentos Fab de IgG1 e IgA recombinantes
Se expresaron fragmentos Fab recombinantes usando tanto traducción en E. coli (Studier y Moffat, J. Mol. Biol., 1986, 189, 113-130) como sin células (Ryabova et al., Methods Mol. Biol. 1998, 77, 179-93).
1.8 Análisis de mutaciones de VH
Se analizaron mutaciones de VH de IgG1 e IgA recombinantes como se describe en Wang et al., BMC bioinformatics, 2008, 9 Supl 12, S20.
1.9 Identificación de epítopo de anticuerpo mediante cribado de bibliotecas de péptidos aleatorios presentados en fagos
Con el fin de identificar el epítopo reconocido por el anticuerpo, el fragmento Fab de anticuerpo recombinante se cribó frente a bibliotecas comerciales de péptidos aleatorios presentados en fagos (Ph.D. -12™ Kit de bibliotecas de péptidos presentados en fagos, NEW ENGLANd BIOLABS), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Normalmente, se aplicaron de 4 a 5 rondas de selección (bioselección).
1.10 Análisis estadístico
Se usó un ensayo de ji cuadrado de Yates para analizar las muestras de la Tabla I. La diferencia entre el grupo de control y el grupo altamente expuesto al VIH es estadísticamente significativa siempre que el valor de p sea <0,05.
2. Resultados
La respuesta inmunitaria en el tracto genital de una cohorte de mujeres no infectadas altamente expuestas al VIH (MNIAE) de parejas serodiscordantes se investigó en colaboración con los Centros GHESKIO (Grupo haitiano para el estudio del sarcoma de Kaposi y las infecciones oportunistas, por sus siglas en inglés) en Haití. Se analizaron fluidos
vaginales de 32 individuos mediante ELISA y transferencia Western, y se compararon con 15 sujetos de control no infectados y no expuestos al VIH. Ninguno de los sujetos tenía el genotipo homocigótico CCR5-Delta 32 y dos eran heterocigóticos, uno en el grupo MNIAE, el otro en el grupo de control. Se sometieron a ensayo secreciones vaginales para determinar respuestas de anticuerpos IgG1 e IgA específicos contra gp41 en ELISA. Los resultados del ELISA se confirmaron mediante transferencia Western. Solamente se conservaron las muestras que mostraban una fuerte positividad con ambas técnicas para la investigación adicional y la construcción de bibliotecas de anticuerpos.
Aunque todos los sujetos eran seronegativos para la infección por VIH, el 53 % de las MNIAE dieron resultados positivos en las secreciones vaginales para IgA anti-gp41 frente a solamente el 13 % en el grupo de control (p < 0,02) mientras que no se observó ninguna diferencia significativa para las respuestas de IgG anti-gp41 (Tabla I).
La actividad funcional de las secreciones se sometió a ensayo mediante la inhibición de la transcitosis de VIHj r c s f . Ninguna de las secreciones dio positivo en los ensayos funcionales de transcitosis, en comparación con el anticuerpo monoclonal ampliamente neutralizador de VIH-1 2F5 utilizado como control positivo. Por tanto, el ensayo de transcitosis no se usó más para el cribado de muestras.
Para caracterizar la respuesta de anticuerpos, se recogieron células de la mucosa con un Cytobrush de dos sujetos de tipo silvestre CCR5 seleccionados basándose en su respuesta fuerte contra gp41 en ELISA y transferencia Western y en las relaciones sexuales sin protección a largo plazo con al menos una pareja seropositiva para el VIH-1. Con el fin de evitar la amplificación de los genes de la pareja, todas las muestras positivas para el Antígeno Específico Prostático (PSA > 50 ng/ml) se desecharon.
Después de la amplificación específica, se colaron regiones variables de IgG e IgA en un vector fagémido permitiendo la expresión de fragmentos Fab en la superficie de fagos filamentosos. En una primera estrategia, se habrían seleccionado fagos que presentan una unión de Fab a un antígeno de gp41 recombinante. Se consideró que esta etapa de selección era innecesaria debido al perfil fuertemente oligoclonal observado del repertorio clonado. En una situación convencional, el análisis por secuenciación de clones escogidos al azar de la biblioteca debería proporcionar todo un conjunto de secuencias diferentes. Sin embargo, en el caso de los sujetos seleccionados, la gran mayoría de los clones eran idénticos o muy parecidos y representaban un gran porcentaje de la población total (hasta el 75 % para las cadenas de VH). Esto no se debió a un sesgo en la amplificación o la clonación, puesto que se obtuvo el mismo resultado cuando se construyeron bibliotecas independientes. Lo mismo ocurría con las bibliotecas de IgG1 e IgA. Para caracterizar adicionalmente este repertorio de mucosas oligoclonales, se expresaron fragmentos Fab correspondientes a los anticuerpos más representados como proteínas recombinantes.
IgG1 (llamada Toussaint) en asociación con 2 cadenas ligeras diferentes, IgA (llamada Makandal) en asociación con 2 cadenas ligeras diferentes, IgG1 (Jacmel) e IgA (Mangue). Las cadenas ligeras más representadas fueron de las familias k1 y A4. Estas dos cadenas ligeras se asociaron sistemáticamente a todas las cadenas pesadas puesto que
no fue posible determinar el apareamiento de las cadenas VH/VL originales. El análisis de las mutaciones de VH mostró que Makandal tenía un perfil no mutado germinal. Con el fin de identificar el epítopo reconocido, este anticuerpo se cribó frente a bibliotecas comerciales de péptidos aleatorios presentados en fagos. En dos cribados independientes, dos péptidos superpuestos permitieron la identificación de un epítopo correspondiente a una región de la parte C-terminal de gp41: LVGLRIVFAVLSIVNRVRQGYSPLSFQTHLPTPRGP (SEQ ID NO: 3).
Se formuló la hipótesis de que la respuesta inmunitaria oligoclonal de la mucosa de esas mujeres podría ser responsable de su resistencia a la infección por VIH y que estos anticuerpos se indujeron en respuesta a una microbiota particular y por reactividad cruzada con el dominio gp41 de la envoltura del VIH, podría prevenir la fusión vírica. Con el fin de ver si la secuencia de aminoácidos reconocida por Fab Makandal tenía alguna homología con otras proteínas del entorno, esta secuencia se comparó con una base de datos de secuencias de proteínas, excluyendo proteínas de VIH. Los datos mostraron coincidencias muy débiles, pero de forma interesante, hubo coincidencias uniformes con secuencias de proteínas bacterianas. Entre éstas, se seleccionó una permeasa de Mycoplasma genitalium (número de registro de GenBank AAC72488.1 o SEQ ID NO: 1).
Ejemplo 2 : El antígeno de permeasa de M. genitalium es capaz de inducir una respuesta sistémica y de la mucosa de anticuerpos protectores neutralizadores contra la infección por VIH en ratones HAMIGA
1. Material y métodos
1.1 Antígenos
Permeasa truncada recombinante de M. genitalium (rPermeasa o PERM)
Se insertó ADNc de permeasa truncada recombinante (SEQ ID NO: 6) preparado mediante síntesis génica (GeneART) en un vector de expresión procariota (pSP401, derivado de pET28 cer (NOVAGEN); Peubez et al., Microbial Cell factories, 2010, 9, 65-) y se expresó en la cepa de E. coli BL21. Marcado con una cola de Histidina, el antígeno (SEQ ID NO: 7) se purificó mediante cromatografía de afinidad en columna His-IMAC (BIORAD). El fragmento de proteína permeasa recombinante purificado ([rPermeasa] = 1 mg/ml en Tris 25 mM, Arginina 0,5 M, Tampón de sacarosa al 5 %, pH 8) tenía una pureza del 82 %.
Péptido de ectodominio de gp41 de VIH (GP)
La preparación de péptido de ectodominio de VIH-gp41 recombinante (GP) se desvela en Krell et al., European Journal o f Biochemistry, 2004, 271, 1566-1579. Brevemente, un fragmento de ADN de 0,6 kb que contenía la secuencia que codifica el ectodominio de gp41 de aislado de VIH LAI (secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2, correspondiente a los restos de aminoácidos 540 a 673 de gp160 (SEQ ID NO: 14)), se obtuvo mediante el uso de amplificación por PCR, como molde, un plásmido que contenía la secuencia de gp120 y la secuencia de gp41 del aislado LAI. El codón de inicio en el cebador directo es un resto de metionina de origen natural. Se añadieron un codón de parada y la secuencia de ADN que codificaba la extensión GGGGSHHHHHH (SEQ ID NO: 15) al cebador inverso. Se usó la polimerasa HF Platino (GIBCO INVITROGEN), de acuerdo con las instrucciones del fabricante, para la amplificación por PCR. El fragmento amplificado por PCR se clonó directamente en el vector pM1800 usando los sitios de restricción NcoI y XhoI. El vector de expresión pM1800 es un derivado de pET28c (NOVAGEN, en el que el origen F1 de replicación se ha suprimido y reemplazado con el fragmento Cer, permitiendo una resolución de multímeros. Para la expresión de proteínas, se transformó E. coli BL21(DE3) con los plásmidos correspondientes. Marcado con una cola de histidina, el antígeno de ectodominio (SEQ ID NO: 16) se purificó mediante cromatografía de afinidad en una columna de quelación Hi-Trap de 5 ml (a Me RSHAM PHa Rm a C iA BIOTECH). La elución de proteína se consiguió usando un tampón que comprendía Tris 50 mM/HCl, urea 8 M, NaCl 500 mM e imidazol 500 mM, pH 8,0. El replegamiento de la proteína se consiguió mediante diálisis con formiato 50 mM, Ph 2,8. A continuación, la proteína se esterilizó mediante filtración y se almacenó a -45 °C.
1.2 Inmunización
Se realizó una inmunización en ratones transgénicos HAMIGA (Patente EP 1680449), una cepa de ratón transgénico que produce IgA quiméricas humanas/murinas con regiones constantes de la cadena pesada de IgA humana y regiones constantes de la cadena ligera murina y regiones variables (de las cadenas pesadas y ligeras). Se sincronizaron los ciclos estrales de ratones transgénicos HAMIGA mediante tratamiento con Depoprovera (5 días antes de la primera inmunización, 8 días y 16 días después de la inmunización - 2 mg/ratón/inyección por vía subcutánea). Se inmunizaron ratones transgénicos HAMIGA (10 ratones por grupo) por vía intradérmica (Grupo ID en oreja) o intravaginal (Grupo VAG) dos veces con dos semanas de intervalo con la permeasa truncada recombinante de M. genitalium (PERM) en adyuvante poliI:C (10 pg/ratón/inyección, relación Poli:C 1:2,5 (25 pg/ratón/inyección, INVIVOGEN)). Para comparación, se inmunizaron diez ratones HAMIGA con polipéptido de ectodominio de gp41 por vía ID (GP/ID, 10 pg/ratón/inyección, en adyuvante polil:C (10 pg/ratón/administración, relación Polil:C 1:2,5 (25 pg/ratón/inyección, INVIVOGEN)) y por vía vaginal (GP/VAG, 10 pg/ratón/administración, en adyuvante poliI:C (10 pg/ratón/administración, relación PoliI:C 1:2,5 (25 pg/ratón/administración, INVIVOGEN)). Como control negativo, se inmunizaron cinco ratones HAMIGA con antígeno de Albúmina Sérica Bovina (BSA) por vía ID.
1.3 Recogida de lavados vaginales
Se lavaron las cavidades vaginales de ratones inmunizados cada día durante un ciclo estral completo (4 días), lavando suavemente la cavidad vaginal con 200 pl de medio fisiológico (NaCl al 0,9 %, URGO).
1.4 Titulación de la concentración de IgA sérica e IgA secretora mediante ELISA
Se titularon mediante ELISA la IgA sérica de ratones HAMIGA inmunizados (purificada mediante cromatografía de afinidad) y la IgA secretora preparada a partir de los lavados vaginales. Brevemente, se recubrieron placas de 96 pocillos (Maxisorp®, NUNC) con 1 pg/ml de anticuerpos de cabra anti-IgA humana (BECKMAN COULTER) en tampón PBS durante la noche a 4 °C. Las placas se saturaron con un tampón BSA al 2 %/PBS1X durante 30 minutos a 37 °C. La incubación de las muestras (IgA secretora, diluida 10 veces en BSA al 0,2 %/PBS o IgA sérica purificada, diluida 100 veces en BSA al 0,2 %/PBS) se realizó a 37 °C durante 2 h. El intervalo de referencia de IgA humana (de [hIgA de control] = 0,2 mg/ml a 1,56 ng/ml) se incubó siguiendo el mismo protocolo y se reveló mediante un anticuerpo policlonal anti-HIgA de cabra marcado con fosfatasa alcalina (AP) (BECKMAN c Ou LTER; diluido 2000 veces en b Sa al 0,2 %/BSA).
1.5 Preparación de IgA monoclonal
Para aislar la IgA monoclonal de ratones inmunizados contra la permeasa, se realizó la inmortalización de linfocitos de células B específicos, de acuerdo con el protocolo de Kolher y Milstein (Kohler, G. y Milstein, C. European Journal o f Immunology, 1976, 6, 511-9). Brevemente, esplenocitos de ratones inmunizados contra la permeasa se fusionaron con células de mieloma de ratones (X63 Sp2/0) y se subclonaron en placas de 96 pocillos. Los sobrenadantes de los clones de hibridoma se recogieron después de tres semanas de cultivo y se sometieron a ensayo para determinar su actividad neutralizadora en un ensayo de inhibición de la infección por VIH in vitro. Cada clon se crioconservó en medios DMSO al 10 %/SVF al 20 %/DMEM en nitrógeno líquido.
1.6 Purificación de IgA
Las IgA se purificaron mediante cromatografía de afinidad. Las formas monoméricas y poliméricas de IgA se separaron mediante cromatografía en columna de exclusión por tamaño.
1.7 Análisis de especificidad de antígeno
El fragmento de permeasa/IgA específica de ectodominio de gp41 se evaluó mediante ELISA utilizando placas Maxisorp® de 96 pocillos (NUNC) recubiertas con 1 a 5 pg/ml de antígenos durante la noche a 4 °C. Los sobrenadantes en bruto, la IgA sin purificar de los lavados vaginales o la IgA sérica purificada (diluida en PBS/Gelatina al 0,2 %) se incubaron durante 2 horas a 37 °C. La unión de IgA específica se reveló con un anticuerpo de cabra anti-IgA humana conjugado con AP (diluido 1/2000, BECKMAN COULTER).
1.8 Preparación celular
Se recogieron muestras de sangre de donantes sanos anónimos (Etablissement Frangais du Sang, EFS). Se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica mediante sedimentación Ficoll-Hypaque de las capas leucoplaquetarias. Se activaron CMSP con fitohemaglutinina-A (PHA, 1 mg/ml, SIGMA) en medio RPMI-suero de ternera fetal (FCS) al 10 % complementado con antibióticos (Penicilina y Estreptomicina, 100 Unidades/ml y 100 pg/ml, respectivamente) a la concentración de 10.106 células/ml durante 30 minutos. A continuación, las células se cultivaron en medio RPMI-FCS al 10 % complementado con antibióticos a 2.106 células/ml. Después de 3 días, las células se congelaron. Se descongelaron las CMSP de 5 donantes, se agruparon y se cultivaron durante un día antes usarse en el ensayo de neutralización.
La estirpe celular TZM-B1 se obtuvo a través del programa de reactivos de NIH. Se cultivaron células TZM-B1 en medio RPMI-FCS al 10 % complementado con antibióticos (Penicilina y Estreptomicina, 100 Unidades/ml y 100 pg/ml, respectivamente).
1.9. Preparación de virus
Se amplificaron aislados primarios de VIH-1 en leucocitos de sangre humana, como se ha descrito anteriormente (Holl et al., Blood, 2006, 107, 4466-4474). Se concentraron soluciones madre de virus recogidas en el momento de máxima producción de virus 70 veces con un punto de corte de 100 kDa con un filtro de polietersulfona (Centricon® Plus-70 Biomax Filter; MILLIPORE). Se obtuvieron aislados primarios de VIH-1 del Instituto Nacional de Control y Patrones Biológicos (NIBSC): Aislado de VIH-1s f 162 (subtipo B, R5), Aislado de VIH-1q h 0 (subtipo B, cepa R5, R5), VIH-189,6 (subtipo B, X4R5), Virus VIH-1 DU174 (subtipo C, R5), VIH-192BR025 (subtipo C R5), VIH-192UG024 (subtipo D, X4), VIH-1k o n (subtipo CRF02-AG, X4). VIH-1 BaL (subtipo B) fue proporcionado por S. Gartner, M. Popovic y R. Gallo (NIH).
Se produjeron pseudovirus VIH-Is f i 62 y VIH-1q h 0 (SF162.LS y QH0692.42) mediante cotransfección de la estirpe celular 293T con estructura principal de EnvC3 y Envs de VIH-Is f 162 y VIH-1q h 0 , respectivamente.
1.10 Ensayos de neutralización
Se realizaron ensayos de neutralización en células CMSP y TZM-bl humanas, como se ha descrito anteriormente (Mascola et al., J. Virol., 2005, 79, 10103-10107), usando dos cepas de referencia patrón de clado B como virus de pseudotipos Env (SF162.LS y QH0692.42; Li et al., J. Virol, 2005, 79, 10108-10125). La dosis inhibidora del 50 %, 70 %, 80 % o 90 % se definió como la concentración de la muestra que provocó una reducción del 50 %, 70 %, 80 % o 90 % en unidades de luminiscencia relativa (ULR; Li et al., J. Virol., 2005, 79, 10108-10125) en TZM-bl o el porcentaje de células infectadas en CMSP, respectivamente.
1.11 Inhibición mediada por Fc de la replicación del VIH en MDM
El ensayo de inhibición mediado por Fc se realizó en macrófagos derivados de monocitos (MDM). Los MDM se generaron mediante el cultivo de monocitos CD14+ con GM-CSF durante 5 días. La inhibición de la replicación de VIH-1 SF162 o HIV-1 BaL sin células en MDM se evaluó como se describió anteriormente por Holl et al. (J. Virol., 2006, 80, 6177-6181; J. Immunol., 2004, 173, 6274-6283). Brevemente, los anticuerpos y los virus se incubaron durante 1 h antes de la adición a MDM. La replicación del virus se midió después de 48 h mediante la tinción intracelular de p24 en los MDM mediante citometría de flujo. Se determinó el porcentaje de células infectadas en comparación con los macrófagos infectados de control sin anticuerpos.
2. Resultados
Un antígeno de permeasa truncada de M. genitalium (SEQ ID NO: 7, correspondiente a la secuencia de aminoácidos 431-875 de la secuencia de permeasas de M. genitalium SEQ ID NO: 1) se expresó en E. coli y se usó para inmunizar ratones transgénicos HAMIGa que expresaban IgA humana quimérica. Grupos de diez ratones HAMIGA recibieron dos administraciones de fragmento de permeasa en adyuvante Poly l-C por vía intradérmica (Grupo PERM/ID) y vaginal (Grupo PERM/VAG). Al mismo tiempo, se inmunizaron grupos de diez ratones HAMIGA con polipéptido de ectodominio gp41 (SEQ ID NO: 16) (Grupo GP/lD; Grupo GP/Va G). Como control negativo, se inmunizaron cinco ratones HAMIGA con antígeno BSA (Grupo BSA) por vía ID. Se analizaron IgA de lavados vaginales e IgA sérica purificada de ratones HAMIGA inmunizados y de control.
Para identificar la vía de inmunización y el antígeno capaz de inducir una respuesta inmunitaria neutralizadora, la actividad neutralizadora de la IgA sérica de cada ratón inmunizado se midió frente a la cepa de virus SF162, un aislado de nivel 1, en un ensayo de neutralización basado en CMSP (figura 1). Aunque todas las IgA séricas de los ratones inmunizados con PERM muestran la capacidad de reaccionar de forma cruzada con epítopos de gp41 de VIH en ELISA (figura 2), sólo ocho IgA séricas de ratones inmunizados con PERM/lD y cinco IgA séricas de ratones inmunizados con PERM/VAG pudieron presentar una potencia fuerte de neutralización de la infección por VlH-1 con una Cl90 en un intervalo de 60 pg/ml (figura 1). A pesar de una fuerte unión anti-gp41 (figura 2), ninguna IgA sérica de los grupos de ratones inmunizados con GP/lD y GP/VAG fue capaz de alcanzar la actividad neutralizadora de la Cl90 (figura 1). Como cabía esperar, en el grupo de ratones inmunizados con albúmina sérica bovina (BSA), las IgA séricas purificadas no mostraron ninguna unión a gp41 mediante ELISA ni actividad de neutralización de la infección por VlH-1 (figura 1).
Además, solamente los grupos de IgA vaginales del grupo inmunizado con PERM/lD y PERM/VAG (n = 10) presentaron una actividad de neutralización fuerte frente al VlH-1 s f 162 (un aislado de nivel 1), con la Cl90 más baja (en un intervalo de 1,5 a 2,5 pg/ml; Tabla ll). Los grupos de IgA vaginales del grupo inmunizado con PERM/VAG (n = 10) alcanzaron una Cl50<2,5 pg/ml frente al aislado QHO (un aislado de nivel 2) cuando se realizó en un ensayo de inhibición de la infección basado en células TZM-bl.
Tabla II: Actividad neutralizadora específica de VIH-1 de grupos de IgA vaginales purificadas de ratones HAMIGA inmunizados
Los sobrenadantes de clones de hibridoma de ratones inmunizados con permeasa se sometieron a ensayo para determinar la actividad neutralizadora en un ensayo en CMSP frente al aislado VIH-1s f 162. De los 900 sobrenadantes de hibridoma, 141 mostraron un 80 % de neutralización de la infección vírica, incluyendo 34 que mostraron un 90 % de potencia de neutralización. Un clon, C3G4, se subclonó tres veces y las especificidades antipermeasa se confirmaron mediante ELISA. Se estabilizó un clon llamado C3-G4.EA5.IH2.j A11 finalmente. Los segmentos variables de la inmunoglobulina neutralizadora, una IgA1,K quimérica humana, se secuenciaron y analizaron en la base de datos IMGT (www.im gt.org/vquest).
Tabla III: Secuencia y análisis de los segmentos variables de la IgAlK monoclonal quimérica humana ________________________________ neutralizadora de VIH-1, C3G4________________________________ Cadena pesada
IgH-V IgH-D IgH-J
mab hIgA1 (clon de C3G4) 5-12-1*01 F 1-1*01 2*01 F
Identidad del gen de estirpe
germinal de ratón 93,06 % 82,98 %
Secuencia de AA de IgHV EVQMVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFNKYDMSWVRQTPAK RLEWVAYISGGGGHTYYRDTLKGRFTVSRDNAKNTLYLQMNSLKS
EDTAMYY TRH T DY T Í E ID 1
mab hIgA1 (clon de C3G4) 15-103*01 1*01 F
Identidad del gen de estirpe
germinal de ratón 95,34 % 94,74 %
Secuencia de AA de IgLV DIQM NQSPSSLSASLGDTISITCRASQNINFW LSW YQLKPGNIPKQ LIYKTSNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDIATYYCLQGQS
YPW TFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 9)
El sobrenadante de C3G4 contiene una IgA1 monoclonal tanto monomérica como polimérica (Figura 3, línea 1). Se prepararon fracciones enriquecidas en formas monoméricas (Figura 3, línea 2) y poliméricas de IgA (Figura 3, línea 3) y se sometieron a ensayo su afinidad por la permeasa de M. genitalium (figura 4, A) y la reactividad cruzada con gp41 de VIH en ELISA (figura 4, B). En cada ensayo ELISA, la forma enriquecida en IgA polimérica de C3G4 presentó la mayor afinidad por la permeasa truncada de M. genitalium y el polipéptido de ectodominio de gp41.
Se sometieron a ensayo fracciones enriquecidas en IgA monomérica e IgA polimérica de C3G4 purificado principalmente en un ensayo de neutralización en CMSP con dos aislados de virus VIH-1, SF162 y QHO (figura 4C). La forma enriquecida en IgA polimérica inhibió fuertemente la infección por ambos aislados de VIH-1, SF162 (CI70 de 2 pg/ml) y QHO (CI70 de 23 pg/ml). Se consiguió una inhibición del 90 % de la infección por el aislado VIH-Is f 162 con 126 pg/ml de C3G4 enriquecido en IgA polimérica. En cada ensayo, La forma polimérica de IgA de C3G4 mostró una mayor potencia neutralizadora que la forma enriquecida en IgA monomérica de C3G4.
T ambién se sometieron a ensayo las formas monomérica y polimérica de C3G4 en un ensayo de neutralización basado en macrófagos. El ensayo muestra la actividad inhibidora mediada por Fc de los anticuerpos. Como se muestra en la Tabla IV, ambas formas presentaron una potencia de inhibición del 80% en ensayos basados en CMSP y macrófagos, en presencia de 6 pg/ml y 14 pg/ml de IgA de C3G4, respectivamente. Se consiguió el noventa por ciento de inhibición de la infección por VIH-1 cuando ambos ensayos se realizaron con 58 pg/ml de la forma polimérica de IgA de C3G4. La forma polimérica de IgA de C3G4 mostró una mayor potencia neutralizadora que la forma monomérica. La mayor avidez de la forma polimérica puede permitir al anticuerpo reconocer y capturar varias partículas víricas, a diferencia de la forma monomérica.
Tabla IV: Actividad neutralizadora específica de VIH-1 de fracciones enriquecidas monoméricas o lim ri l n i r I A 4
La actividad neutralizadora de la IgA1 de C3G4 monoclonal también se sometió a ensayo en diferentes aislados primarios de VIH-1 (Figura 5). La IgA1 polimérica purificada presentó actividad de neutralización en nueve aislados primarios diferentes de VIH-1 a una CI50 y una CI80 bajas. C3G4 neutralizó aislados de VIH-1s f 162, VIH-1b r 025 y VIH
1t v i con una gran potencia (CI80 comprendida en el intervalo de 2 a 20 pg/ml). C3G4 neutralizó VIH-1q h o , k o n , 92UG024, 89.6 y r w con potencia moderada (CI80 > 20 pg/ml).
Estos datos demuestran que el antígeno de permeasa de Mycoplasma genitalium representa un candidato de vacuna contra el VIH-1 capaz de sensibilizar una respuesta de la mucosa y sistémica de anticuerpos protectores ampliamente neutralizadores contra la infección por VIH en los individuos inmunizados.
Análisis
En este estudio, usando ratones HAMIGA para producir IgA, la inmunización con permeasa de M. genitalium adyuvada con polil:C administrada por las vías ID o vaginal indujo Ab IgA específicos capaces de reconocer el VIH-Gp41 y neutralizar aislados primarios de VIH-1.
IgA es el isotipo de anticuerpo más abundante que se produce semanalmente y se entrega mediante secreción en el área de la mucosa. Debido a que la infección por VIH se inicia generalmente en el sitio de la mucosa de entrada, los inventores presumieron que IgA imitaría mejor la respuesta en la mucosa, incluyendo la mucosa genital. El papel fundamental de la forma polimérica de IgA es evitar la entrada de patógenos mediante exclusión inmunitaria, pero también se presume que las IgA poliméricas aglutinan el virus y bloquean la transcitosis (Chomont, N. et al. Virology, 2008, 370, 246-254) y con mayor eficacia que su homólogo IgG (Hur, E. M. et al. Blood, 2012, 120, 4571-82).
La integridad del sistema inmunitario de la mucosa parece ser crítica para la tasa de progresión de la infección por VIH, porque está gravemente comprometida durante la infección aguda por VIH. Además del agotamiento masivo de linfocitos T CD4+, la frecuencia de células B productoras de IgA en el área de la mucosa disminuye drásticamente, disminuyendo las concentraciones de IgA secretoras luminales implicadas en la vía protectora de exclusión inmunitaria de patógenos (descrita tanto en la infección por VIH como por VIS); Alam et al., J. Virol., 2008, 82, 115-125; Muro-Cacho et al., J. Immunol., 1995, 154, 5555-5566; Douek et al., 2006, Nat. Immunol., 2006, 7, 235-239).
Se usaron ratones transgénicos que expresaban IgA quimérica humana (patente EP 1680 449) para garantizar la selección de un anticuerpo monoclonal de clase IgA, puesto que una inmunización convencional de ratones de tipo silvestre por lo general conduce a una respuesta específica de IgG. Esta estirpe de ratón se modificó para expresar una cadena pesada de IgA humana constante, mientras que los genes de la cadena ligera constante y variables seguían siendo del origen murino. El anticuerpo neutralizador de C3G4 se indujo mediante inmunización activa en la que el repertorio murino y no humano se ha implicado en el reconocimiento del antígeno. La posibilidad de generar la misma respuesta en seres humanos solamente puede evaluarse en ensayos clínicos.
La resistencia a la infección por VIH es un fenómeno poco frecuente. Aunque pueden contribuir varios mecanismos, incluyendo factores genéticos (mutación d32 de CCR5, alotipo MHC...) o factores inmunitarios tales como la IgA específica en secreciones vaginales dirigidas contra el gp41 de VIH-1, pueden estar implicados otros factores.
La respuesta de Ab humanos y murinos frente a muchos patógenos comunes es oligoclonal, con un uso restringido de los genes Ig V (Bos, N. A. et al., Infection and Immunity, 1996, 64, 616-623; Baxendale, H. E. y Goldblatt, D., Infection and Immunity 2006, 74, 1025-1031). Además, en la mucosa expuesta a una multitud de gérmenes, estos Ab son polirreactivos y establecen una homeostasis inmunitaria natural (Shimoda et al., Immunology, 1999, 97, 9-17).
Por tanto, los inventores proponen que la respuesta innata a la microbiota del tracto genital (comensal o patógena) también podría desempeñar un papel contra la infección por VIH (u otros patógenos). La característica innata de la respuesta es sugerida por el perfil oligoclonal de IgA encontrado en MNIAe y la característica germinal del Ab. El aislamiento de un Ab contra M. genitalium reactivo de forma cruzada con gp41 y que neutraliza VIH-1 proporciona pruebas adicionales. Aunque el pensamiento actual es que la vacuna debe inducir Ab hipermutados con el fin de neutralizar el VIH-1 (Klein, F. et al., Cell, 2013, 153, 126-38), los inventores proponen que en el sitio de la mucosa, portal principal de entrada del virus, los Ab no madurados por afinidad inducidos por comensales o patógenos específicos, podrían neutralizar y proteger contra la infección por VIH. Las MNIAE pueden tener una flora particular única con una respuesta inmunitaria nativa que contribuye a la resistencia a la infección por VIH-1. La comparación de la microbiota en MNIAE y mujeres que se infectan más tarde ayudará a aclarar esta suposición.
La clave para una estrategia de vacunación eficaz parece ser la identificación del antígeno sensibilizador que induce la selección y proliferación del linaje B progenitor para una futura maduración a lo largo de su historia inmunitaria. Para algunas infecciones víricas, el antígeno que activa inicialmente determinados linajes de células B vírgenes y que estimula las células B de memoria puede no ser idéntico.
Los inventores proponen que esta población de precursores B vírgenes puede reclutarse y sensibilizarse por antígenos, no solo de infecciones pasadas sino de la actual colonización natural de microorganismos comensales. La inmunización mediante antígenos de Mycoplasma genitalium indujo anticuerpos anti-VIH reactivos de forma cruzada e indujo una respuesta anti-VIH ampliamente neutralizadora sistémica y de la mucosa. El segmento variable IgH de uno de los anticuerpos monoclonales neutralizadores del presente estudio desvela una homología mayor con el progenitor de la estirpe germinal murina IgVH5-12 (Figura 6). De forma interesante, este segmento murino particular
Claims (11)
1. Un antígeno de permeasa de Mycoplasma genitalium o un polinucleótido que codifica dicho antígeno en forma expresable, para su uso en la prevención y/o el tratamiento de la infección por VIH, en donde dicho antígeno de permeasa comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 4 y que comprende un epítopo reactivo de forma cruzada con un epítopo de ectodominio de VIH-gp41, y en donde dicho antígeno induce anticuerpos antipermeasa neutralizadores del VIH y reactivos de forma cruzada con el VIH.
2. El antígeno de permeasa para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho antígeno de permeasa consiste en la SEQ ID NO: 4.
3. El antígeno de permeasa para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho antígeno de permeasa comprende o consiste en la SEQ ID NO: 7.
4. El antígeno de permeasa para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho epítopo de permeasa es reactivo de forma cruzada con un epítopo de ectodominio de VIH-gp41 de la SEQ ID NO: 2.
5. El polinucleótido para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho polinucleótido comprende la SEQ ID NO: 5 o 6.
6. El antígeno de permeasa o el polinucleótido que codifica dicho antígeno para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el antígeno de permeasa o el polinucleótido están contenidos en una composición inmunogénica o de vacuna que comprende un vehículo y/o un adyuvante farmacéuticamente aceptables.
7. El antígeno de permeasa o el polinucleótido que codifica dicho antígeno para su uso de acuerdo con 6, en donde la composición inmunogénica o de vacuna comprende un anticuerpo dirigido contra dicho antígeno de permeasa.
8. El antígeno de permeasa o el polinucleótido que codifica dicho antígeno para su uso de acuerdo con 7, en donde la composición inmunogénica o de vacuna comprende un anticuerpo IgA humanizado.
9. Un anticuerpo aislado o un fragmento funcional de dicho anticuerpo que comprende al menos el sitio de unión a antígeno, en donde el anticuerpo se dirige contra un antígeno de permeasa de M. genitalium que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 4 y que comprende un epítopo reactivo de forma cruzada con un epítopo de ectodominio de VIH-gp41, y en donde dicho anticuerpo es reactivo de forma cruzada con el VIH y es neutralizador del VIH.
10. El anticuerpo de la reivindicación 9, que es una IgA monoclonal quimérica humana.
11. El anticuerpo de la reivindicación 10, que comprende un segmento IgVH de la SEQ ID NO: 8 y un segmento IgVL de la SEQ ID NO: 9.
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