ES2792853T3

ES2792853T3 - Fenilpiruvato descarboxilasa modificada genéticamente, procedimientos de preparación y usos de la misma

Info

Publication number: ES2792853T3
Application number: ES15819960T
Authority: ES
Inventors: Paresh C Sanghani; Christopher C Stowers; Brandon A Rodriguez; Eric C Shiue; Scott A Greenwalt
Original assignee: Dow Global Technologies LLC
Current assignee: Dow Global Technologies LLC
Priority date: 2014-12-10
Filing date: 2015-12-10
Publication date: 2020-11-12
Anticipated expiration: 2035-12-10
Also published as: CA2969842C; EP3230462A1; WO2016094604A1; CN107231807B; SA517381696B1; CN107231807A; BR112017012416A2; US10260060B2; US20170369863A1; EP3230462B1; CA2969842A1

Abstract

Un procedimiento para modificar genéticamente un microorganismo, que comprende (A) seleccionar un microorganismo que produce un 2-cetoácido C7-C11; y (B) insertar una secuencia de ácido nucleico no nativa que codifica al menos uno de: i. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende la mutación F385L, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa; ii. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende la mutación M461C, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa; iii. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende la mutación M461V, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa; iv. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende la mutación M461L, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa; v. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende la mutación F532V y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa; vi. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende la mutación F532L, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa; vii. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende la mutación Q536G, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa; viii. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende la mutación Q536A, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa; ix. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende la mutación Q536L, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa; x. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende la mutación Q536I, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa; xi. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende la mutación Q536V, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa; xii. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende las mutaciones F532V y Q536V, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa; xiii. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende las mutaciones M380V y M461V, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa; xiv. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende las mutaciones F385L y M461V, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa; xv. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende las mutaciones F532A y Q536V y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa; xvi. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende las mutaciones F532V y Q536A, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa; xvii. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende las mutaciones F385L y Q536V, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa; xviii. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende las mutaciones M461L y Q536V, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa; xix. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende las mutaciones M461A y Q536V, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa; xx. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende las mutaciones M461V y F532V, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa; xxi. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende las mutaciones F465L y Q536V, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa; xxii. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende las mutaciones M461V, F532V y Q536V, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa; de modo que una fenilpiruvato descarboxilasa no nativa se expresa en el microorganismo.

Description

DESCRIPCIÓN

Fenilpiruvato descarboxilasa modificada genéticamente, procedimientos de preparación y usos de la misma

La invención se refiere al campo del uso de enzimas biológicas para producir compuestos C⁶-C¹⁰, tales como alcoholes, ácidos carboxílicos y alcanos en organismos microbianos. Más particularmente, se refiere al campo del uso de una o más enzimas descarboxilasa dependientes de tiamina modificadas genéticamente para convertir un sustrato de 2-cetoácidos dado.

Muestras de microorganismos que expresan una realización particular de la descarboxilasa modificada genéticamente de la invención que representa la variante M461V tal como se describe a continuación, se han depositado en el Repositorio de Patentes de la American Tissue Type Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110, el 9 de diciembre de 2015.

Las preocupaciones geopolíticas y medioambientales han provocado que los investigadores de todo el mundo busquen la producción de productos basados en petroquímicos utilizando vías renovables, que incluyen, pero no se limitan a la fermentación utilizando microorganismos. Sin embargo, debido a que los microorganismos a menudo no pueden producir muchos de los productos basados en petroquímicos a tasas o rendimientos económicamente viables, la ingeniería metabólica se ha empleado ampliamente, ya sea para construir vías y/o canalizar metabolitos hacia la vía de interés. Actualmente, el etanol es el producto bioquímico más común elaborado con microorganismos. Sin embargo, los métodos económicamente viables para producir alcoholes de cadena más larga y ácidos carboxílicos se están buscando activamente tanto en la industria de biocombustibles como en la química.

El éxito en la producción de aminoácidos naturales por fermentación microbiana ha generado un interés significativo, específicamente en la utilización de las vías biosintéticas de aminoácidos para producir productos químicos de interés incluidos los alcoholes de cadena más larga y ácidos carboxílicos. Véase, p. ej., Becker, J.; Wittmann, C. "Systems and synthetic metabolic engineering for amino acid production - the heartbeat of industrial strain development,” Curr. Opin Biotechnol., 2012, 23:718-726; y Becker, J.; Wittmann, C. "Bio-based production of chemicals, materials and fuels - Corynebacterium glutamicum as versatile cell factory,” Curr. Opin. Biotechnol., 2012, 23:631-640. Los 2-cetoácidos, que son compuestos intermedios clave durante la biosíntesis de aminoácidos, son susceptibles de diferentes tipos de modificaciones que pueden explotarse para la biosíntesis de productos químicos dentro de las células. Véase, p. ej., Gronenberg, L.S.; Marcheschi, R.J.; Liao, J.C. "Next generation biofuel engineering in prokaryotes", Curr. Opin. Chem Biol., 2013, 17:462-471.

En un ejemplo, la Patente de EE.UU. 8.232.089 describe una levadura recombinante que expresa una vía metabólica productora de isobutanol que incluye una descarboxilasa de Azospirillum brasilense que, cuando se coexpresa con genes productores de isobutanol, convierte 2-cetoisovalerato en isobutiraldehído.

En otro ejemplo, la Patente de EE.UU. 8.298.798 describe la producción de alcoholes de cadena tanto lineal como ramificada en Escherichia coli (E. coli) a través de la descarboxilación de 2-cetoácidos, seguido de la reducción del aldehído generado mediante la expresión de ceto-isovalerato descarboxilasa en Lactobacillus lactis (L. lactis) y alcohol deshidrogenasa, ADH6, en levaduras. Véase también, Atsumi, S.; Hanai, T.; Liao, J.C. "Non-fermentative pathways for synthesis of branched-chain higher alcohols as biofuels" Nature, 2008, 451:86-89; Marcheschi, R.J.; Li, H.; Zhang, K.; Noey, E.L.; Kim, S.; Chaubey, A.; Houk, K.N.; Liao, J.C. "Synthetic recursive "+1" pathways for carbon chain elongation," ACS Chem. Biol., 2012, 7:689-697; y Zhang, K.; Sawaya, M.R.; Eisenberg, D.S.; Liao, J.C. "Expanding metabolism for biosynthesis of nonnatural alcohols", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2008, 105:20653-20658. La conversión de compuestos intermedios de 2-cetoácidos en ácidos carboxílicos dentro de las células se ha demostrado mediante la expresión de descarboxilasa y una aldehído deshidrogenasa. Véase, p. ej., Xiong, M.; Deng, J.; Woodruff, A.P.; Zhu, M.; Zhou, J.; Park, S.W.; Li, H.; Yao, F. "A bio-catalytic approach to aliphatic ketones", 2012, Sci. Rep. 2:311; y Zhang, K.; Woodruff, A.P.; Xiong, M.; Zhou, J.; Dhande, K. "A synthetic metabolic pathway for production of the platform chemical isobutyric acid", ChemSusChem, 2011,4:1068-1070.

La viabilidad de ampliar la longitud de los 2-cetoácidos dentro de la célula mediante la ingeniería genética del producto del gen LeuA de E. coli también ha ampliado la gama de productos bioquímicos que se pueden producir a partir de 2-cetoácidos. Véase, p. ej., Atsumi, S., ibid., y Zhang, K., ibid. en E. coli, los genes LeuABCD amplían la longitud de 2-cetoácidos en una unidad de carbono, como se observó durante la biosíntesis de leucina, en la que trabajan juntos para convertir 2-cetoisovalerato (un ácido de 5 carbonos) en 2-cetoisocaproato (un ácido de 6 carbonos). Marcheschi et al ACS Chem. Biol., 2012, 7:689-697, describe la expansión del sitio activo de LeuA y la extensión del cetoácido C⁴, ácido 2-cetobutírico [2-cetobutirato], en un cetoácido C⁹, ácido 2-cetononanoico [2-cetononanoato].

Si bien es posible producir alcoholes y ácidos carboxílicos de diversas longitudes en microorganismos utilizando ingeniería metabólica, la producción de un alcohol o ácido C6-C^sparticular, preferiblemente en una cantidad superior al 20 por ciento en peso (% en peso), más preferiblemente superior al 30% en peso, basado en el producto de alcoholes totales, no se ha demostrado hasta la fecha. Varios factores parecen determinar la especificidad del alcohol/ácido producido a partir de los 2-cetoácidos dentro de las células. La promiscuidad de la descarboxilasa al aceptar 2-cetoácidos de longitudes variadas conduce a aldehídos de longitudes variadas, que luego se oxidan o reducen por la aldehido o alcohol deshidrogenasa co-expresada respectiva. Por lo tanto, niveles más altos de promiscuidad, es decir, niveles más bajos de especificidad, conducen a un mayor número de productos. Esto, a su vez, puede significar rendimientos más bajos de productos específicos particularmente deseados.

La producción específica de un alcohol o ácido carboxílico a través de 2-cetoácidos también puede verse afectada desfavorablemente por el nivel de expresión de una descarboxilasa con respecto a los productos del gen LeuABCD. Los niveles más altos de una descarboxilasa que tiene una amplia especificidad de sustrato tienden a competir con el producto del gen LeuA por el compuesto intermedio de 2-cetoácido y, por lo tanto, limitan la capacidad de la vía para alargar 2-cetoácidos. Esto puede dar como resultado la formación de un alcohol o ácido carboxílico más corto de lo que puede desearse, resultando nuevamente en un producto y/o una mezcla de productos no deseados.

En general, métodos para la mejora de los organismos microbianos industriales varían desde el enfoque aleatorio de la mejora de la cepa clásica (CSI) hasta los métodos altamente racionales de ingeniería metabólica. La CSI es generalmente efectiva para aliviar la inhibición del producto o mejorar la productividad, pero es un enfoque mucho menos efectivo para generar cepas capaces de producir productos completamente nuevos. Además, la CSI es intensiva tanto en tiempo como en recursos. Para obtener cepas con alta tolerancia a los productos de fermentación inhibitorios, es necesario rastrear y seleccionar continuamente mutantes cultivando sucesivamente la cepa en los medios en presencia de concentraciones crecientes de inhibidores. Habitualmente, esto se lleva a cabo junto con la mutagénesis inducida utilizando mutágenos químicos y/o radiación ultravioleta (UV). Sin embargo, el proceso de rastreo de cultivos convencional es tedioso, lento y, a menudo, infructuoso.

Las modificaciones metabólicas son generalmente más efectivas para crear cepas que producen nuevos productos. Esto se debe a que los genes, y en algunos casos incluso las vías completas, pueden transferirse entre organismos (métodos recombinantes) y/o las enzimas pueden modificarse (métodos de ingeniería genética). Estos métodos evitan algunas de las desventajas de la CSI. La ingeniería metabólica, una expresión que comprende métodos tanto recombinantes como de ingeniería genética, es un enfoque fijado como objetivo y a menudo más rápido que se usa ampliamente para diseñar cepas para lograr mayores eficiencias en la sobreproducción de metabolitos, a través de alteraciones en la distribución del flujo metabólico. La mayor parte de este trabajo hasta la fecha está relacionada con la producción de metabolitos secundarios (tales como antibióticos), aminoácidos (p. ej., lisina) y proteínas heterólogas que utilizan organismos con una genética y fisiología bien estudiadas (p. ej., Escherichia coli, levadura y células de hibridoma). El análisis estequiométrico de las distribuciones de flujo metabólico proporciona una guía para una modificación metabólica apropiada, una formulación óptima del medio y estrategias de alimentación, y una optimización del bioproceso. Sin embargo, este enfoque aún requiere un conocimiento profundo de las redes metabólicas y reguladoras en las células de fermentación. Aunque estos enfoques racionales han tenido éxito en casos que implican un solo gen o unos pocos genes dentro de un solo grupo de genes, a menudo han sido ineficaces en casos que implican vías metabólicas más complejas o en gran parte desconocidas. Esto se debe a que habitualmente fijan como objetivo un gen a la vez y, por lo tanto, no pueden predecir interacciones complejas entre múltiples genes en una vía determinada.

La modificación de la enzima se realiza modificando esa parte del código genético, es decir, el ADN del organismo, que corresponde a la expresión de esa enzima. La modificación de enzimas puede conducir a una funcionalidad completamente nueva o puede usarse para mejorar la especificidad o eficiencia de los compuestos intermedios o productos deseados. Adicionalmente, se sabe que ciertas enzimas son promiscuas y pueden encontrarse realizando tareas más allá de sus roles naturales conocidos. Enzimas de este tipo también pueden modificarse para realizar conversiones novedosas, pero hasta la fecha el éxito de este enfoque se ha limitado con frecuencia a rendimientos de productos que no son comercialmente viables. Véase, p. ej., Zhang, K., ibid. En teoría, la modificación de múltiples enzimas en una vía puede usarse como una técnica para maximizar la especificidad y/o la eficiencia catalítica.

Un ejemplo de un organismo que se sabe que produce octanol bajo ciertas condiciones es Clostridium. Varias especies de Clostridium (p. ej., C. acetobutylicum, difficile y kluyveri) se emplean en el documento WO 2012135731. Esa publicación describe la producción de una pequeña cantidad de n-octanol, junto con otros productos, por una especie de Clostridium modificada genéticamente, y atribuye la escasa especificidad para el n-octanol a la capacidad del organismo de expresar o sobre-expresar beta-cetotiolasa (p. ej., BktB), acetil CoA acetiltransferasa (p. ej., AtoB), 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa (p. ej., Hbd, de Clostridium o PaaHI), crotonasa (p. ej., Crt) y transenoil-CoA reductasa (p. ej., Ter). En general, las modificaciones de ingeniería genética son la vía de CoA del organismo para la producción de alcoholes superiores, y esta vía evita la vía de producción de butanol, que se encuentra en muchas especies de Clostridium, implicando a enzimas sensibles al oxígeno e intermedios. La cantidad de n-octanol que se ha demostrado que se ha producido mediante esta invención es demasiado pequeña para ser comercialmente viable. Véase también, p. ej., Lee, J.Y.; Jang, Y.S.; Lee, J.; Papoutsakis, E.T.; Lee, S.Y. "Metabolic engineering of Clostridium acetobutylicum M5 for highly selective butanol production'', Biotechnol. 2009, 4:1432-1440; y Wang, Y.; Blaschek, H.P. "Optimization of butanol production from tropical maize stalk juice by fermentation with Clostridium beijerinckii", Bioresour. Technol., 2011, 102:9985-9990.

Una aplicación de la ingeniería genética que se está explorando actualmente es en el campo de la energía. Las preocupaciones sobre la escasez futura, el costo y el impacto medioambiental de la obtención y el uso de combustibles fósiles han estimulado el interés en la explotación de biomasa barata y renovable como fuentes alternativas, tanto de combustibles como de productos químicos elaborados a partir de ellos. A medida que los precios del petróleo crudo se han vuelto más volátiles, los productos químicos de base biológica y los productos industriales se han convertido en alternativas atractivas a sus contrapartes derivadas del petróleo. Los procesos de fermentación que utilizan organismos microbianos anaerobios ofrecen un camino prometedor para convertir la biomasa y los desechos agrícolas en productos útiles, al tiempo que solucionan los problemas que pueden surgir al desechar productos agrícolas de bajo valor y subproductos/desechos del procesamiento de alimentos. Algunos de los productos útiles que se pueden preparar a partir de materias primas de biomasa de bajo costo son los ácidos y alcoholes orgánicos, incluido el octanol. Alcoholes C⁶-C¹⁰encuentran un uso particular como material de partida de menor costo para preparar alcanos, alquenos y aldehídos, que son productos químicos de alimentación altamente deseables en un cierto número de industrias. Estas industrias incluyen usos como comonómeros para polimerizaciones en solución y la industria de detergentes, que utiliza estos precursores para alquilar fenoles para producir precursores de detergentes. Estos alcoholes también pueden usarse como tensioactivos; como emolientes; como espesantes en las industrias cosmética y alimentaria; como plaguicidas; y en una diversidad de otras aplicaciones.

Sumario

La presente invención proporciona un procedimiento para modificar genéticamente un microorganismo, que comprende:

(A) seleccionar un microorganismo que produce un 2-cetoácido C⁷-C¹¹; y

(B) insertar una secuencia de ácido nucleico no nativa que codifica al menos uno de:

i. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende la mutación F385L, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa;

ii. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende la mutación M461C, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa;

iii. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende la mutación M461V, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa;

iv. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende la mutación M461L, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa;

v. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende la mutación F532V y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa;

vi. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende la mutación F532L, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa;

vii. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende la mutación Q536G, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa;

viii. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende la mutación Q536A, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa;

ix. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende la mutación Q536L, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa;

x. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende la mutación Q536I, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa;

xi. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende la mutación Q536V, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa;

xii. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende las mutaciones F532V y Q536V, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa;

xiii. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende las mutaciones M380V y M461V, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa;

xiv. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende las mutaciones F385L y M461V, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa;

xv. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende las mutaciones F532A y Q536V y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa;

xvi. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende las mutaciones F532V y Q536A, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa;

xvii. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende las mutaciones F385L y Q536V, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa;

xviii. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende las mutaciones M461L y Q536V, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa;

xix una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende las mutaciones M461A y Q536V, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa;

xx. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende las mutaciones M461V y F532V, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa;

xxi. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende las mutaciones F465L y Q536V, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa;

xxii. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende las mutaciones M461V, F532V y Q536V, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa;

de modo que una fenilpiruvato descarboxilasa no nativa se expresa en el microorganismo.

También se proporciona de acuerdo con la invención un procedimiento para preparar un aldehído C⁶-C¹⁰, que comprende las etapas de:

(A) contactar a un sustrato de 2-cetoácido C⁴-C¹⁰, una isopropilmalato sintasa, una isopropilmalato isomerasa y una isopropilmalato deshidrogenasa, en condiciones tales que el sustrato 2-cetoácido C⁴-C¹⁰se convierte en un 2-cetoácido C⁷-C¹¹a través de una o más reacciones bioquímicas;

(B) contactar el 2-cetoácido C⁷-C¹¹y una fenilpiruvato descarboxilasa, comprendiendo la fenilpiruvato descarboxilasa al menos uno de:

xiii. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende las mutaciones M380V y M461V, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa; xiv. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende las mutaciones F385L y M461V, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa;

xv. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende las mutaciones F532A y Q536V, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa; xvi. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende las mutaciones F532V y Q536A, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa; xvii. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende las mutaciones F385L y Q536V, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa; xviii. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende las mutaciones M461L y Q536V, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa;

xix una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende las mutaciones M461A y Q536V, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa; xx. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende las mutaciones M461V y F532V, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa; xxi. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende las mutaciones F465L y Q536V, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa; xxii. una secuencia de aminoácidos de al menos 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende las mutaciones M461V, F532V y Q536V, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa;

bajo condiciones tales que el 2-cetoácido C⁷-C¹¹se convierte en un aldehído C⁶-C¹⁰que tiene un átomo de carbono menos que el 2-cetoácido C⁷-C¹¹que se está convirtiendo.

También se proporciona de acuerdo con la invención un polipéptido de fenilpiruvato descarboxilasa genéticamente modificado que tiene actividad de fenilpiruvato descarboxilasa, comprendiendo el polipéptido:

i. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende la mutación F385L;

ii. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende la mutación M461C;

iii. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende la mutación M461V;

iv. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos el 90 por ciento de la SEQ ID 4 de homología y que comprende la mutación M461L;

v. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos el 90 por ciento de la SEQ ID 4 de homología y que comprende la mutación F532V;

vi. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende la mutación F532L;

vii. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende la mutación de Q536G;

viii. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende la mutación Q536A;

ix. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende la mutación Q536L;

x. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende la mutación Q536I;

xi. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende la mutación Q536V;

xii. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende las mutaciones F532V y Q536V;

xiii. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende las mutaciones M380V y M461V;

xiv. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende las mutaciones F385L y M461V;

xv. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende las mutaciones F532A y Q536V;

xvi. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende las mutaciones F532V y Q536A;

xvii. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende las mutaciones F385L y Q536V;

xviii. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende las mutaciones M461L y Q536V;

xix una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende las mutaciones M461A y Q536V;

xx. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende las mutaciones M461V y F532V;

xxi. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende las mutaciones F465L y Q536V; o

xxii. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende las mutaciones M461V, F532V y Q536V.

También se proporciona de acuerdo con la invención un microorganismo modificado genéticamente, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de fenilpiruvato descarboxilasa de acuerdo con la invención.

También se proporciona de acuerdo con la invención un procedimiento para preparar un alcohol C⁶-C¹⁰, que comprende un procedimiento para producir el aldehído C⁶-C¹⁰de acuerdo con la invención, y poner en contacto dicho aldehído con una alcohol deshidrogenasa que tiene actividad de alcohol deshidrogenasa, en condiciones tales que el aldehído C⁶-C¹⁰se convierte en un correspondiente alcohol C⁶-C¹⁰.

También se proporciona de acuerdo con la invención un procedimiento para preparar un ácido carboxílico C⁶-C¹⁰, que comprende un procedimiento para producir el aldehído C⁶-C¹⁰de acuerdo con la invención, y poner en contacto dicho aldehído con una aldehído deshidrogenasa que tiene actividad de aldehído deshidrogenasa, en condiciones tales que el aldehído C⁶-C¹⁰se convierte en un correspondiente ácido carboxílico C⁶-C¹⁰.

También se proporciona de acuerdo con la invención un procedimiento para preparar un alcano C^n-1, que comprende un procedimiento para producir el aldehído C⁶-C¹⁰de acuerdo con la invención, y poner en contacto dicho aldehído con una aldehído descarbonilasa grasa que tiene actividad de aldehído descarbonilasa grasa, en condiciones tales que el aldehído C⁶-C¹⁰se convierte en un correspondiente alcano C ^n-1.

En una realización, la invención proporciona un procedimiento para modificar genéticamente un microorganismo, que comprende (A) seleccionar un microorganismo que produce un 2-cetoácido C⁷-C¹¹; y (B) insertar una secuencia de ácido nucleico no nativa que codifica una secuencia de aminoácidos correspondiente a las SEQ ID 4, 8, 14, 16, 18, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 46, 52, 54, 56, 62, 64, 66, 68 o 76; de modo que una fenilpiruvato descarboxilasa no nativa se expresa en el microorganismo.

En aún otra realización, la invención proporciona un procedimiento para preparar un aldehído C⁶-C¹⁰, un alcohol C⁶-C¹⁰, un ácido carboxílico C⁶-C¹⁰o un C⁶-C¹⁰alcano C⁶-C¹⁰, que comprende las etapas de (A) poner en contacto 2-cetobutirato o 2-cetoisovalerato, isopropilmalato sintasa, isopropilmalato isomerasa e isopropilmalato deshidrogenasa, en condiciones tales que el 2-cetobutirato o 2-cetoisovalerato se convierta en un 2-cetoácido C⁷-C¹¹; (B) poner en contacto al 2-cetoácido C⁷-C¹¹y una fenilpiruvato descarboxilasa que se expresa mediante una secuencia de ácido nucleico no nativa que codifica una secuencia de aminoácidos correspondiente a las SEQ ID 4, 8, 14, 16, 18, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 46, 52, 54, 56, 62, 64, 66, 68 o 76; bajo condiciones tales que el 2-cetoácido C⁷-C¹¹se convierte en un aldehído C⁶-C¹⁰que tiene un átomo de carbono menos que el 2-cetoácido C⁷-C¹¹convertido; y (C) opcionalmente, poner en contacto el aldehído C⁶-C¹⁰y (1) una alcohol deshidrogenasa en condiciones para formar un alcohol C⁶-C¹⁰; o (2) una aldehído deshidrogenasa en condiciones para formar un ácido carboxílico C⁶-C¹⁰; o (3) una aldehído descarbonilasa grasa bajo condiciones para formar un alcano C⁶-C¹⁰. El procedimiento se lleva a cabo de manera que cada una de las etapas y subetapas se produzca independientemente dentro o fuera de un organismo microbiano y en condiciones aerobias o anaerobias.

En aún otra realización, la invención proporciona un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos correspondiente a las SEQ ID 8, 14, 16, 18, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 46, 52, 54, 56, 62, 64, 66, 68 o 76.

También se describe aquí un microorganismo modificado genéticamente que comprende (A) una fuente de un 2-cetoácido; (B) una vía metabólica de tipo salvaje que convierte el 2-cetoácido en aldehído C⁷-C¹¹; y (C) una fenilpiruvato descarboxilasa no nativa representada por una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que corresponde a GenBank: número de acceso L26240, o una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 por ciento homóloga a la misma; dicha secuencia se ha modificado opcionalmente (1) sustituyendo Met-380 con valina; o (2) sustituyendo Phe-385 con valina, leucina o isoleucina; o (3) sustituyendo Met-461 con valina, leucina, alanina o cisteína; o (4) sustituyendo Phe-465 con valina o leucina; o (5) sustituyendo Phe-532 con glicina, alanina, valina o leucina; o (6) sustituyendo Gln-536 con valina, leucina, isoleucina, alanina o glicina; o (7) cualquier combinación de dos o tres sustituciones como se describe en (1) -(6).

Para las secuencias descritas a continuación, cada uno de los números de identificación de secuencia impar (SEQ ID) muestra la secuencia de nucleótidos, o ácido nucleico, y cada una de las SEQ ID de número par muestra la secuencia de aminoácidos codificada correspondiente. La secuencia de ácido nucleico codifica la secuencia de aminoácidos, siendo la expresión "secuencia de aminoácidos" equivalente a "polipéptido" o "proteína". Todas las referencias a las SEQ ID de proteínas (de número par) reconocen el hecho de que es posible producir una secuencia de aminoácidos dada usando codones alternativos.

Las SEQ ID 1 y 2 representan la etiqueta de histidina de 13 aminoácidos que está unida al comienzo de las secuencias de aminoácidos.

Las SEQ ID 3 y 4 representan el gen de fenilpiruvato descarboxilasa de Azospirillum brasilense de tipo salvaje correspondiente a GenBank: número de acceso L26240.

Las SEQ ID 5 y 6 representan la secuencia génica de las SEQ ID 3 y 4, pero Met-380 en AbPPDC se reemplaza con valina en la posición 380 (basada en la secuencia de aminoácidos sin la etiqueta his; con la etiqueta his de 13 aminoácidos esta sería la posición 393). La modificación tiene la denominación M380V, por lo tanto, se adhiere al patrón de la industria en el que las modificaciones de aminoácidos se definen como el código original de aminoácidos de una sola letra, seguido de la posición del aminoácido, seguido del nuevo código de aminoácidos de una sola letra.

Las SEQ ID 7 y 8 representan F385L.

Las SEQ ID 9 y 10 representan F385V.

Las SEQ ID 11 y 12 representan F385I.

Las SEQ ID 13 y 14 representan M461C.

Las SEQ ID 15 y 16 representan M461V.

Las SEQ ID 17 y 18 representan M461L.

Las SEQ ID 19 y 20 representan M461A.

Las SEQ ID 21 y 22 representan F465L.

Las SEQ ID 23 y 24 representan F532A.

Las SEQ ID 25 y 26 representan F532G.

Las SEQ ID 27 y 28 representan F532V.

Las SEQ ID 29 y 30 representan F532L.

Las SEQ ID 31 y 32 representan Q536G.

Las SEQ ID 33 y 34 representan Q536A.

Las SEQ ID 35 y 36 representan Q536L.

Las SEQ ID 37 y 38 representan Q536I.

Las SEQ ID 39 y 40 representan Q536V.

Las SEQ ID 41 y 42 representan F532V/Q536V.

Las SEQ ID 43 y 44 representan M380L/M461V.

Las SEQ ID 45 y 46 representan M380V/M461V.

Las SEQ ID 47 y 48 representan F385V/M461V.

Las SEQ ID 49 y 50 representan F385L/M461V.

Las SEQ ID 51 y 52 representan F532A/Q536V.

Las SEQ ID 53 y 54 representan F532V/Q536A.

Las SEQ ID 55 y 56 representan F385L/Q536V.

Las SEQ ID 57 y 58 representan F385V/Q536V.

Las SEQ ID 59 y 60 representan M461V/Q536V.

Las SEQ ID 61 y 62 representan M461L/Q536V.

Las SEQ ID 63 y 64 representan M461A/Q536V.

Las SEQ ID 65 y 66 representan M461V/F532V.

Las SEQ ID 67 y 68 representan F465L/Q536V.

Las SEQ ID 69 y 70 representan F465V/Q536V.

Las SEQ ID 71 y 72 representan F465L/F532V.

Las SEQ ID 73 y 74 representan F532A/Q536A.

Las SEQ ID 75 y 76 representan M461V/F532V/Q536V.

Las SEQ ID 77 y 78 representan M380V/M461V/Q536V.

Las SEQ ID 79 y 80 representan F385L/M461L/Q536V.

Las SEQ ID 81 y 82 representan M380V/F385V/M461V.

La FIGURA 1 ilustra el alargamiento de la cadena por actividad recursiva (iterativa) seguida de descarboxilación a un aldehído que es un átomo de carbono más corto que el 2-cetoácido que lo precede en la vía iterativa.

La FIGURA 2 ilustra la producción de alcohol C⁵-C⁸lineal a partir de 2-cetobutirato in vitro utilizando una combinación de isopropilmalato sintasa, isopropilmalato isomerasa, isopropilmalato deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa (A^dH6) en combinación con la variante F385L de AbPPDC (^sE^qID 8).

La FIGURA 3 ilustra la producción de alcohol C⁵-C⁸ramificado a partir de 2-cetoisovalerato in vitro usando una combinación de isopropilmalato sintasa, isopropilmalato isomerasa, isopropilmalato deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa (AdH6) en combinación con la variante F385L de AbPPDC (s Eq ID 8).

La FIGURA 4 ilustra producción de alcohol C⁵-C⁸ramificado a partir de 3-metil-2-cetopentanoato in vitro utilizando una combinación de isopropilmalato sintasa, isopropilmalato isomerasa, isopropilmalato deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa (ADH6) en combinación con la variante F385L de AbPPDC (S^eQ ID 8).

La FIGURA 5 ilustra las distribuciones medias de alcohol para las fermentaciones en botella de suero de E. colique contiene las enzimas de la "vía 1" en combinación con AbPPDC de tipo salvaje (WT), variantes de AbPPDC, KIVD WT (ceto-isovalerato descarboxilasa de Lactococcus lactis) y no descarboxilasa. ADH6 también se incluye en todas las construcciones de cepas.

En general, la presente descripción describe, entre otras cosas, dos aspectos específicos de una nueva fenilpiruvato descarboxilasa que puede ser, en el primer aspecto, la expresión de una secuencia de aminoácidos que se obtiene de Azospirillum brasilense (A. brasilense), correspondiente a GenBank: número de acceso L26240, o es al menos 80 por ciento (%) homólogo a la misma. En un segundo aspecto, la presente descripción describe la fenilpiruvato descarboxilasa genéticamente modificada previamente definida, pero con ingeniería genética intencional adicional para insertar una, dos o tres modificaciones de aminoácidos específicos dentro de la secuencia, que nuevamente sirven para modificar la eficiencia catalítica de la fenilpiruvato descarboxilasa de maneras que en muchos casos son ventajosas para llevar a cabo una diversidad de biosíntesis en las que participa la fenilpiruvato descarboxilasa. En particular, las enzimas fenilpiruvato descarboxilasa de Azospirillum brasilense de tipo salvaje o modificadas con ácido nucleico pueden usarse en combinación con enzimas isopropilmalato sintasa, isopropilmalato isomerasa e isopropilmalato deshidrogenasa para producir alcoholes, ácidos carboxílicos o alcanos.

Como se mostrará aquí, se crearon nuevas enzimas fenilpiruvato descarboxilasa con propiedades mejoradas con respecto a la enzima de tipo salvaje de un microorganismo huésped seleccionado mediante modificación genética en una de una diversidad de formas que se describen aquí; o es una enzima representada por una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% homóloga a la fenilpiruvato descarboxilasa de A. brasilense e incluye las mismas modificaciones; procedimientos para hacerlo por vía recombinante, de ingeniería o tecnología que combina enfoques recombinantes y de ingeniería; procedimientos para preparar alcoholes, ácidos carboxílicos y alcanos C⁶-C¹⁰que usan la fenilpiruvato descarboxilasa de tipo salvaje o la nueva fenilpiruvato descarboxilasa; y un organismo microbiano genéticamente modificado que puede expresar o sobre-expresar esta enzima y puede usarse para producir alcoholes, ácidos carboxílicos y alcanos C⁶-C¹⁰. Como se usa el término en el presente documento, homología se refiere a una correspondencia idéntica o funcional del 80 por ciento, o más, de los aminoácidos enumerados en la secuencia, en sus posiciones dadas.

La nueva fenilpiruvato descarboxilasa puede usarse o expresarse como parte de, en ciertas realizaciones particulares, una vía metabólica que produce acetil co-A a través de una vía anabólica (p. ej., Wood-Ljundahl) o catabólica (p. ej., glicólisis o una vía de pentosa fosfato), y finalmente participa en la conversión de un 2-cetoácido C⁷-C¹¹para formar el correspondiente aldehído C⁶-C¹⁰que tiene un carbono menos. En algunas realizaciones, el aldehído C⁶-C¹⁰puede reaccionar adicionalmente para formar un alcohol, ácido carboxílico o alcano C⁶-C¹⁰. Debido a las alteraciones específicas en su secuencia de aminoácidos que se describen en el presente documento, las fenilpiruvato descarboxilasas genéticamente modificadas de la invención ofrecen algunas diferencias significativas en la especificidad para diversos sustratos, y esta alteración en la especificidad ofrece importantes ventajas en términos de rendimiento del producto y la reducción o eliminación de productos secundarios indeseables y/o competitivos.

La invención incluye un cierto número de secuencias de aminoácidos alteradas de fenilpiruvato descarboxilasa de A. brasilense que se ha identificado que exhiben descarboxilaciones mejoradas de 2-cetoácidos C⁷-C¹¹en comparación con la secuencia de aminoácidos de A. brasilense de tipo salvaje correspondiente a GenBank: número de acceso L26240, que se muestra en la SEQ ID 4. Seis sitios dentro de la secuencia de tipo salvaje se han identificado como claves para obtener las mejoras. Estos son: Met-380, Phe-385, Met-461, Phe-465, Phe-532, Gln-536 y combinaciones de los mismos. En cada una de las alteraciones se realizan cambios en los que valina, leucina, alanina, glicina o isoleucina se sustituyen en el sitio o los sitios identificados con el aminoácido de tipo salvaje, con sustituciones que varían de un solo sitio (es decir, un solo aminoácido que constituye tres pares de bases), a una amplia diversidad de sustituciones de múltiples sitios (de 2 a 5 sitios) definidas como "combinaciones" de los sitios identificados, preferiblemente de 2 a 3. Las SEQ ID 3-82 muestran secuencias de aminoácidos para las muchas variaciones producidas que incluyen una o más de las sustituciones como se especifica. Las sustituciones pueden resumirse como sigue: (1) sustituyendo Met-380 con valina; o (2) sustituyendo Phe-385 con valina, leucina o isoleucina; o (3) sustituyendo Met-461 con valina, leucina, alanina o cisteína; o (4) sustituyendo Phe-465 con valina o leucina; o (5) sustituyendo Phe-532 con glicina, alanina, valina o leucina; o (6) sustituyendo Gln-536 con valina, leucina, isoleucina, alanina o glicina; o (7) cualquier combinación de tres sustituciones como se describe en (1) - (6).

Los expertos en la técnica entenderán que las fenilpiruvato descarboxilasas genéticamente modificadas de la invención pueden usarse in vivo, es decir, por un microorganismo modificado genéticamente, o in vitro. En vista de esto, la expresión "genéticamente modificado" o el término "modificado", tal como se usan en el presente documento, se refieren al grupo de fenilpiruvato descarboxilasas de la invención que tiene una secuencia de aminoácidos intencionadamente alterada, es decir, una secuencia de aminoácidos de "tipo no salvaje", o un organismo microbiano (dependiendo de la colocación de cualquiera de los términos como adjetivo) que tiene un genoma que se ha alterado intencionalmente en cuanto a (al menos) la(s) descarboxilasa(s) específica(s) modificada(s) descrita(s) y definida(s) como inventiva en el presente documento. Dicha alteración puede haberse logrado mediante tecnología recombinante, en donde uno o más genes se transfieren de un segundo organismo microbiano diferente a un organismo microbiano diana; o tecnología de ingeniería, en la que los ácidos nucleicos dentro del organismo microbiano diana se alteran, generalmente a través de mutagénesis dirigida al sitio, lo que resulta en la conversión de al menos un ácido nucleico en un ácido nucleico diferente y, por lo tanto, la modificación de una o más enzimas. Con las tecnologías actuales de síntesis de ADN, la tecnología recombinante también se puede lograr utilizando ADN completamente sintético que se transfiere al microorganismo diana utilizando métodos convencionales. También se pueden emplear combinaciones de cualquiera de los métodos anteriores.

La invención incluye, además, un procedimiento para preparar aldehídos C⁶-C¹⁰, ácidos carboxílicos C⁶-C¹⁰, alcanos C⁶-C¹⁰y alcoholes C⁶-C¹⁰, tales como hexanol, heptanol y/o 1-octanol, por contacto entre un sustrato inicial y una serie de enzimas que incluyen una o más de las fenilpiruvato descarboxilasas genéticamente modificadas de la invención para finalmente convertir ese sustrato, usando enzimas y etapas adicionales, al aldehído, alcohol, ácido carboxílico o alcano C⁶-C¹⁰deseado. Este procedimiento puede llevarse a cabo biosintéticamente, en una de las realizaciones descritas de una célula que se produce de forma no natural, es decir, genéticamente modificada, es decir, en un organismo microbiano que se produce de forma no natural; o producción del o de los alcoholes, ácidos carboxílicos o alcanos C⁶-C¹⁰, pueden llevarse a cabo a través de metodología in vitro, típicamente comenzando desde un punto de partida que no incluya un organismo microbiano.

Con el fin de obtener el grupo de fenilpiruvato descarboxilasas modificado de la invención, es deseable, en una realización, realizar un protocolo similar al descrito más adelante. En general, los ejemplos muestran modificaciones genéticas que implican ingeniería para alterar una o más bases de ácido nucleico en un codón dado con el fin de alterar la enzima de la cual es/son parte la o las bases de ácido nucleico. Dicha ingeniería puede usarse simplemente para producir enzimas alteradas para, p, ej., propósitos de ensayo in vitro. En contraste, el genoma de un organismo microbiano huésped puede alterarse preferiblemente para una cepa de producción a mayor escala.

La siguiente metodología, diseñada para la producción in vitro de enzimas puede llevarse a cabo como generalmente entienden los expertos en la técnica. En general, se utiliza una base de datos adecuada, tal como GenBank, para obtener los códigos genéticos de la o las enzimas de tipo salvaje, seguido de la identificación de los codones adecuados para la modificación. Esta identificación puede usarse como base para los métodos conocidos de la técnica de ingeniería de proteínas, en los que el modelado molecular por computadora identifica y también permite la diferenciación de ubicaciones estructurales en las que se pueden emplear de manera efectiva modificaciones de las interfaces enzima/sustrato. Luego se realiza una modificación deseable dada, usando una técnica de biología molecular en la que la o las alteraciones de la(s) base(s) de ácido nucleico se realiza(n) mediante mutagénesis dirigida al sitio. Luego, las enzimas de tipo variante deben someterse a purificación para separar las proteínas no fijadas como objetivo, dejando una enzima purificada que exhibirá una eficiencia catalítica más alta que la de tipo salvaje. Esto se puede ensayar adecuadamente in vitro de acuerdo con la metodología más adecuada para la enzima particular dada. Una enzima ensayada que se demuestra que tiene un nivel deseable de eficiencia catalítica se confirma por lo tanto como el producto de una modificación genética deseable, y puede usarse para métodos de producción in vitro, tal como para la conversión in vitro de un 2-cetoácido C⁷-C¹¹en el correspondiente aldehído C⁶-C¹⁰que tiene un carbono menos (p. ej., convertir 2-cetononanoato en octanal, o 2-cetooctanoato en heptanal) que luego puede reducirse, en una realización, por contacto con una alcohol deshidrogenasa de tipo salvaje o no salvaje apropiada, para formar el correspondiente alcohol C⁶-C¹⁰.

Como se indicó anteriormente, la invención puede llevarse a cabo in vivo o in vitro. Un enfoque in vivo puede ser preferido para la producción a escala comercial, aunque en algunos casos puede ser adecuado un enfoque in vitro para la producción a escala comercial. Con frecuencia, un enfoque in vitro puede ser particularmente conveniente para fines de laboratorio y de investigación general, tal como para llevar a cabo ensayos enzimáticos. Por ejemplo, se puede preparar un organismo microbiano deseable, útil para la producción fermentativa a gran escala o comercial de un producto facilitado por enzimas, tal como, en ciertas realizaciones particulares, un alcohol C⁶-C¹⁰o una combinación de alcoholes C⁶-C¹⁰. Dicha preparación puede llevarse a cabo insertando el ADN, o trozos de ADN, que codifican la enzima mejorada deseada, desde un primer organismo microbiano en el genoma de un segundo organismo microbiano "huésped" conocido o que se cree que posee uno o más vías metabólicas y/u otras características deseadas, tales como la capacidad fermentativa resistente a la inhibición, utilizando tecnología recombinante. En general el enfoque in vivo emplea dicha o dichas vías metabólicas de tipo natural de dicho organismo microbiano, primero para convertir un sustrato que contiene carbono adecuado en piruvato, y luego para convertir el piruvato en 2-cetobutirato o, alternativamente, en 2-cetoisovalerato, en un número variable de etapas.

Por ejemplo, en una realización, un sustrato que contiene carbono adecuado, tal como un azúcar C⁵o C⁶(p. ej., glucosa, sacarosa, pentosa o una combinación de las mismas) puede convertirse directamente en piruvato a través de una de las vías catabólicas o anabólicas, tal como una vía de glicólisis o fosfato de pentosa. Posteriormente, el piruvato puede convertirse primero en L-treonina, a través de PC (piruvato carboxilasa); AAT (aspartato aminotransferasa); ThrABC (ThrA, que es una aspartoquinasa/homoserina deshidrogenasa bifuncional; ThrB, que es homoserina quinasa; ThrC, que es treonina sintasa; y ASD, que es aspartato semialdehído deshidrogenasa). La L-treonina se convierte luego en 2-cetobutirato a través de Ilva (treonina deshidratasa). En una realización alternativa, el piruvato se puede convertir en 2-cetoisovalerato mediante las actividades de IlvBN/IlvGM, IlvC e IlvD en la biosíntesis de leucina. Véase también, Zhang, K.; Sawaya, M.R.; et al., ibid.

Desde este punto, un tipo salvaje o una forma genéticamente modificada de una o más de las tres enzimas dentro de la vía biosintética de leucina, que están implicadas en el alargamiento de 2-cetoácidos, operan para convertir el 2-cetobutirato o 2-cetoisovalerato en un 2-cetoácido C⁷-C¹¹. Generalmente, se hace referencia a estas enzimas, sin referencia a ningún organismo microbiano específico, como isopropilmalato sintasa, isopropilmalato isomerasa e isopropilmalato deshidrogenasa. Sin embargo, en E. coli específicamente, se les conoce como LeuA (GenBank: número de acceso NC 000913.3 ID de gen: 947465), LeuB (GenBank: número de acceso NC 000913.3 ID de gen: 944798) y LeuCD (GenBank: número de acceso NC 000913.3 ID de gen: 945076 e ID de gen: 945642), respectivamente. Un ejemplo de este alargamiento de la cadena se muestra en la FIGURA 1, en la que el 2-cetobutirato se convierte, a través de varias etapas denominadas "vía 1", en el 2-cetoácido C⁷-C¹¹, 2-cetononanoato.

En ciertas realizaciones particulares, las enzimas de tipo salvaje de la vía biosintética de leucina implicadas en la extensión de 2-cetoácidos pueden modificarse, en particular mediante la inclusión de al menos una enzima exógena, complejo enzimático o combinación de los mismos, para convertir 2-cetobutirato primero en 2-cetovalerato, luego en 2-cetocaproato, luego en 2-cetoheptanoato y continuando, si se desea, en otro 2-cetoácido alargado hasta 2-cetoundecanoato, es decir, un 2-cetoácido C⁷-C¹¹deseado, ya que se produce el alargamiento de la cadena. Sin embargo, es opcionalmente posible modificar solo una o dos de las enzimas, complejos enzimáticos o combinaciones de los mismos, para obtener una producción aceptable o deseable de 2-cetoácido C⁷-C¹¹. Estas enzimas pueden incluir LeuA, LeuB y/o LeuCD, como se mencionó anteriormente.

Particularmente aplicable a la modificación de esta parte de la vía es la divulgación de la Solicitud de Patente Internacional en tramitación N° de Serie PCT/US14/69438, presentada el 10 de diciembre de 2014, reivindicando el beneficio de la Solicitud de Patente Provisional de EE.UU. N° 61/915.040, presentada el 12 de diciembre de 2013. En ciertas realizaciones, se selecciona al menos una variante de isopropilmalato deshidrogenasa modificada (que es el producto del gen LeuB en E. coli^), o en otras realizaciones, se incluye al menos una variante modificada de LeuA (LeuA') y LeuB', preferiblemente, pero no necesariamente, como se describe en una o ambas de las solicitudes de patente referenciadas. También es preferible emplear otras combinaciones de las enzimas/complejo enzimático LeuA', LeuB' y LeuCD modificado (LeuCD'). Nuevamente, debe tenerse en cuenta que las designaciones de letra "Leu" (A, B, CD) son nombres específicos para las enzimas de la vía de leucina de la isopropilmalato sintasa, la isopropilmalato isomerasa y la isopropilmalato deshidrogenasa en E. coli, mientras que las enzimas iguales o equivalentes en la vía de leucina de otros organismos pueden tener nombres diferentes.

Finalmente, la fenilpiruvato descarboxilasa genéticamente modificada de la invención puede servir, en esta realización particular, para convertir el 2-cetoácido C⁷-C¹¹en un aldehido que tiene un carbono menos que el sustrato 2-cetoácido. En diversas realizaciones, el aldehido C⁶-C¹⁰resultante puede encontrar una amplia diversidad de usos, como un producto en sí mismo o como un producto de partida o intermedio para la producción de productos que incluyen alcoholes C⁶-C¹⁰. La preparación de alcoholes C⁶-C¹⁰se puede lograr mediante la conversión del aldehído C⁶-C¹⁰por una alcohol deshidrogenasa de tipo salvaje o genéticamente modificada apropiada, pero otros productos, tales como alcanos C⁶-C¹⁰, también pueden prepararse, a través de la acción o expresión de una aldehído descarbonilasa grasa, o ácidos carboxílicos C⁶-C¹⁰pueden prepararse por la acción o expresión de una aldehído deshidrogenasa. Véase, p. ej., Choi, Y.J.; Lee, S.Y. "Microbial production of short-chain alkanes", Nature^, 2013, 502:571-574. Por lo tanto, los aldehídos C⁶-C¹⁰son industrialmente muy útiles como excelentes productos intermedios para preparar una amplia diversidad de otros productos.

Por consiguiente, se anticipa que la familia inventiva de fenilpiruvato descarboxilasas genéticamente modificadas será aplicable en una amplia diversidad de industrias. Dichas industrias pueden incluir, por ejemplo, el uso en combustibles, plásticos, alimentos, envases, cosméticos, perfumes, productos farmacéuticos, materiales de limpieza, control de la contaminación, perfumes, fármacos y muchos otros. Si bien hay un cierto número de posibles secuencias de aminoácidos que caen completamente dentro del alcance de las reivindicaciones de la presente invención, se señala que ciertas secuencias de aminoácidos, identificadas por sus números de identificación de secuencia (SEQ ID) seleccionados de SEQ ID 34, 36, 38, 40, 42, 46, 62, 68 y 76, son particularmente adecuados y preferidos para descarboxilar los 2-cetoácidos C⁷-C¹¹.

Ejemplo 1

Diseño de variantes de fenilpiruvato descarboxilasa de A. brasilense (AbPPDC) con mayor eficacia catalítica para la descarboxilación del ácido 2-cetononanoico

Se utiliza un modelo de estructura cristalina del complejo ternario de AbPPDC con 3-deaza-tiamina difosfato y ácido 5-fenil-2-oxovalerico (PDB Código ID 2Q5Q) para identificar los residuos que recubren el bolsillo de unión de 2-cetoácidos dentro del sitio activo de AbPPDC. Véase, p. ej^., Versees, W.; Spaepen, S.; Wood, M.D.; Leeper, F.J.; Vanderleyden, J.; Steyaert, J. "Molecular mechanism of allosteric substrate activation in a thiamine diphosphatedependent decarboxylase", J. Biol. Chem.^, 2007, 282:35269-35278. Los sitios de aminoácidos denominados Met-380, Met-461, Phe-385, Phe-465, Gln-536 y Phe-532 se seleccionan para la experimentación de sustitución en función de su relación con el ácido 5-fenil-2-oxovalérico. Las sustituciones de uno o más sitios se realizan como se enumera en la Tabla 1 y se preparan las variantes.

La enzima F532V reemplaza a Phe-532 en AbPPDC por valina, mientras que la enzima F532L reemplaza a Phe-532 por leucina. La enzima F385L/M461V reemplaza a Phe-385 por leucina y Met-461 por valina. Las variantes de fenilpiruvato descarboxilasa de A. brasilense (AbPPDC) restantes en la Tabla 1 se nombran de acuerdo con el aminoácido (primera letra, con "F" que representa "fenilalanina [Phe];" "M" que representa "metionina" [Met] y "Q" que representa "glutamina" [Gln]), su posición en la secuencia de aminoácidos (el número) y el aminoácido utilizado como reemplazo (última letra, representando "L" "leucina;" representando "V" "valina;" representando "A" "alanina"; representando "C" "cisterna"; representando "I" "isoleucina"; y representando "G" "glicina").

Cada una de las variantes de AbPPDC modificadas se expresa y purifica, y luego se testa en cuanto a su actividad contra los tres sustratos, que son 2-cetohexanoato (2-KH), 2-cetooctanoato (2-KO) y 2-cetononanoato (2-KN). Se esperaría que 2-KH, 2-KO y 2-KN formen pentanal, heptanal y octanal, respectivamente, tras la descarboxilación por AbPPDC.

La evaluación de las variantes de AbPPDC se realiza en dos etapas utilizando el ensayo enzimático de alto rendimiento descrito más adelante. Inicialmente, se testa la actividad de todas las variantes frente a una sola concentración alta (2 mM) de 2-KH y 2-KN (como se muestra en la Tabla 1). Después de la evaluación inicial, se realiza un análisis cinético detallado en un número seleccionado de variantes para determinar la tasa máxima (k^cat ), concentración de sustrato que produce la mitad de la tasa máxima ⁽K^05, equivalente de K^m para enzimas que siguen la cinética de Michaelis-Menten) y la eficiencia catalítica de la enzima (k^cat/K^o,5 ) contra 2-KO y 2-KN (como se muestra en la Tabla 2). Variantes de AbPPDC, que tienen mayor especificidad (mayor k^cat/K^o,5) para 2-KN, será eficientes en la producción de octanal y productos químicos derivados de él dentro de las células.

Tabla 1. Listados de secuencias y actividad de las variantes de AbPPDC

La SEQ ID 4 es la secuencia de aminoácidos de fenilpiruvato descarboxilasa de A. brasilense (GenBank: número de acceso L26240). Las SEQ ID 6-82 son secuencias de proteínas diseñadas y expresadas en esta invención. Todas las proteínas expresadas en esta invención tienen 13 aminoácidos adicionales en el extremo N, añadidos como la etiqueta de histidina (mostrada en la SEQ ID 2).

Ejemplo 2

A. Expresión heteróloga de fenilpiruvato descarboxilasa de Azospirillum brasilense (AbPPDC) y sus variantes modificadas por ingeniería en E. coli

Para evaluar la especificidad del sustrato de la AbPPDC de tipo salvaje y sus variantes enumeradas en la Tabla 1, los genes de todas las proteínas se expresan en células de E. coli por separado y los productos proteicos se aíslan de las células. La secuencia génica de la fenilpiruvato descarboxilasa de Azospirillum brasilense (GenBank: número de acceso L26240) se descarga de la base de datos de NCBI. Los codones de 13 aminoácidos adicionales que incluyen seis (6) histidinas (his) se añaden aguas arriba del codón Met-1 de la secuencia del gen AbPPDC. Una modificación de este tipo permite la expresión de una AbPPDC marcada con Histidina que tiene 13 aminoácidos adicionales en el extremo N. Los aminoácidos adicionales se unen como ayuda para purificar la proteína en una sola etapa usando la cromatografía de Ni-NTA. La secuencia completa de AbPPDC con 13 aminoácidos adicionales (SEQ ID 2) se sintetiza químicamente y luego se clona en el vector pRSFDuet-1 (EMD Biosciences) aguas abajo del promotor de polimerasa T7 por Synthetic Genomics, Inc. (San Diego, CA). El vector final es secuenciado por Synthetic Genomics, Inc. antes del envío.

Los genes de las variantes de AbPPDC enumerados en la Tabla 1 se sintetizan químicamente o se generan usando el kit de mutagénesis dirigida al sitio Q5 de New England Biolab (n° de cat. E0554S) y se clonan en el vector pRSFDuet-1. El vector pRSFDuet-1 que contiene AbPPDC o el gen variante AbPPDC se transforma en E. coli, AbPPDC o su variante, luego se expresa y finalmente se purifica tal como se describe a más adelante.

Luego se llevan a cabo estudios de expresión en E. coli utilizando las células BL21 (DE3) competentes adquiridas de EMD Biosciences. Las transformaciones se realizan según las instrucciones del kit e implican mezclar una alícuota de 50 microlitros (pL) de células competentes con 1 pL del vector. Las células que albergan el vector de expresión AbPPDC se seleccionan usando kanamicina como marcador en el medio de crecimiento.

Transformantes de E. coli que albergan el vector de expresión AbPPDC o variante de AbPPDC se seleccionan luego en placas de agar de caldo Luria-Bertani (LB) que contienen 50 microgramos por mililitro (pg/mL) de kanamicina. Las placas se incuban a 37 grados Celsius (°C) durante 16 horas (h). Se inicia un cultivo iniciador transfiriendo una única colonia de transformante a 50 mililitros (mL) de medio LB que contiene 50 ug/mL de kanamicina y se incuba a 37 °C con agitación a 220 revoluciones por minuto (rpm) durante la noche. Al día siguiente, se inoculan 7 mL de cultivo iniciador en 800 mL de Terrific Broth (TB) y el cultivo se incuba a 37 °C hasta que el cultivo alcanza una densidad óptica a 600 nanómetros (DO⁶⁰⁰nm) de 0,5. Se agrega isopropil p-D-1-tiogalacto-piranósido (IPTG) a una concentración final de 1 mM para inducir la expresión de la AbPPDC o genes variantes de AbPPDC y el cultivo se transfiere a una incubadora a 15 °C durante 16 horas (h). Al final de las 16 h, el cultivo se centrifuga a 8000 revoluciones por minuto (rpm) para granular las células. El sedimento celular se divide en dos partes alícuotas y se almacena a -80 °C durante la noche antes de la purificación.

Un sedimento celular de E. coli tomado de 400 mL de cultivo de expresión se suspende en reactivo B-PER (Thermo Fisher Scientific, Inc., Rockford, IL) que contiene 1 pg/mL de DNAsa (Thermo Fisher Scientific, Inc., Rockford, IL), 1 pg/mL de lisozima (Thermo Fisher Scientific, Inc., Rockford, IL), 1 milimolar (mM) de ditiotreitol y cóctel inhibidor de proteasas (RPI Corp., Mount Prospect, IL). La suspensión se balancea suavemente durante 30 minutos (min) a temperatura ambiente y se centrifuga a 15.000 veces la gravedad (x g) durante 20 min para granular los desechos celulares. El sobrenadante se separa y se incuba con 5 mL de resina Co-NTA (Thermo Fisher Scientific, Inc., Rockford, IL) que se ha equilibrado previamente con un tampón de equilibrio (fosfato de sodio 50 mM, pH 8,0, que contiene cloruro de sodio 300 mM, imidazol 20 mM, 50 pL de cóctel inhibidor de proteasa y glicerol al 15%). Después de un período de incubación de 1 h a 4 °C, la resina unida a la enzima se lava con 5 volúmenes de tampón de equilibrio. AbPPDC o sus variantes se eluyen de la resina Co-NTA con tampón de equilibrio que contiene imidazol 200 mM. Las proteínas eluidas se dializan contra solución salina tamponada con fosfato y se almacenan como una solución de glicerol al 20% a -20 °C.

B. Determinación de la especificidad del sustrato de AbPPDC y variantes de AbPPDC

La evaluación de las especificidades del sustrato de las variantes de AbPPDC se realiza utilizando los métodos descritos en detalle en el Ejemplo 1.

Se desarrolla un ensayo enzimático acoplado a AbPPDC de alto rendimiento para evaluar la especificidad del sustrato de las variantes de AbPPDC. El ensayo implica reducir el aldehido producido a partir de la descarboxilación de 2-cetoácidos mediada por AbPPDC, usando una alcohol deshidrogenasa (ADH6, GenBank: número de acceso NP 014051.3). Las velocidades iniciales de las reacciones catalizadas por AbPPDC se determinan a partir de las velocidades de oxidación del fosfato de dinucleótido de adenina nicotinamida reducido (NADPH) que ocurre durante la reducción catalizada por ADH6 de aldehido.

El ensayo de detección de HTP implica incubar 2-KH 2 mM o 2-KN 2 mM con difosfato de tiamina 0,5 mM, NADPH 0,35 mM, 4,7 microgramos (pg) de levadura ADH6 (GenBank: N° de acceso NP 014051.3) y 0,3 miligramos por mililitro (mg/mL) de albúmina sérica bovina (BSA) en tampón de ensayo AbPPDC (ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico 50 mM, pH 6,8, que contiene cloruro de magnesio (MgCb)) 2,5 mM a 30 °C. La reacción se inicia mediante la adición a 30 °C de un material de enzimas de trabajo que contiene de 0,5 pg a 3,5 pg de variante de AbPPDC diluida en tampón de ensayo AbPPDC que contiene 1 mg/mL de BSA. La placa que contiene los 200 pL de la mezcla de reacción se centrifuga a 2500 x g durante 15 s y el cambio de absorbancia de la mezcla de reacción se siguió espectrofotométricamente a 340 nm en un lector de placa BioTek™, preequilibrado a 30 °C. La velocidad inicial de la reacción enzimática se calcula utilizando la velocidad de consumo de NADPH a 340 nm y el coeficiente de extinción de NADPH (6,22 mM-1cm-1) La actividad de todas las variantes se normaliza con la cantidad de enzima presente en la mezcla de reacción y se expresa en nanomoles por minuto por miligramo (nmol.min-1.mg-1) Las concentraciones de proteínas para normalizar las actividades se determinan utilizando el kit de ensayo de proteínas totales de 660 nm de Pierce Biotechnology Inc., disponible en Thermo Fisher Scientific, Inc., utilizando BSA como patrón.

Los parámetros cinéticos de la descarboxilación de 2-cetooctanoato (2-KO) y 2-cetononanoato (2-KN) por parte de AbPPDC y sus variantes también se determinan usando el mismo ensayo de enzima acoplada a HTP AbPPDC, excepto que las concentraciones de 2-KO o 2-KN varían de 0 a 4 mM.

Para las variantes de AbPPDC que exhiben activación de sustrato, como es evidente a partir de una gráfica sigmoidal de velocidades iniciales frente a la gráfica de concentración de sustrato, los parámetros cinéticos (k^cat, K⁰⁵, y k^cat/K^o,5) de la descarboxilación de 2-cetoácidos se obtienen ajustando los datos a la ecuación de Hill (que se muestra en la leyenda de la Tabla 2) mediante regresión no lineal. Para las variantes que siguen una cinética de saturación normal, los parámetros cinéticos (k^cat, K^my k^{c a t}K^M) se obtienen ajustando las velocidades iniciales a la ecuación de Michaelis-Menten mediante regresión no lineal. La regresión no lineal se realiza utilizando el software GraphPad Prism™. La Tabla 2 enumera los parámetros cinéticos de la descarboxilación de 2-KO y 2-KN por AbPPDC y sus variantes. La cantidad de enzima en la mezcla de reacción se determina usando el kit de ensayo de proteína total de 660 nm de Pierce Biotechnology Inc.™ y usando BSA como estándar.

Se espera que la reducción de la especificidad del sustrato de AbPPDC mejore la acumulación de un aldehído específico y sus productos posteriores. En general, AbPPDC prefiere los 2-cetoácidos más voluminosos, tales como el 5-fenil-2-cetopentanoato y el ácido fenilpirúvico, como lo evidencian las altas eficiencias catalíticas con respecto a esos sustratos (véase, p. ej., Spaepen, S.; Versees, W.; Gocke, D.; Pohl, M.; Steyaert, J.; Vanderleyden, J. "Characterization of phenylpyruvate decarboxylase, involved in auxin production of Azospirillum brasilense", J. Bacteriol., 2007, 189: 7626-7633).

AbPPDC y las variantes enumeradas en la Tabla 1 se rastrean en cuanto a la actividad contra 2-cetohexanoato (2-KH) 2 mM y 2-cetononanoato (2-KN) 2 mM como sustratos. Ese rastreo revela que la AbPPDC de tipo salvaje cataliza la descarboxilación de 2-KN, pero exhibe una pobre actividad contra 2-KH en las condiciones del ensayo. Todas las variantes de AbPPDC también catalizan la descarboxilación de 2-KN y exhiben una actividad relativamente baja contra 2-KH (Tabla 1). La sustitución de Gln-536 con alanina, valina, isoleucina o leucina aumenta la actividad descarboxiladora de 2-KN sobre la de la enzima de tipo salvaje, pero también mejora la actividad contra 2-KH como sustrato. Estos resultados sugieren que todas las variantes de AbPPDC enumeradas en la Tabla 1 pueden expresarse de forma activa en sistemas heterólogos. Además, todos ellos tienen una actividad significativamente mayor contra 2-KN que 2-KH, lo que sugiere que AbPPDC y las variantes descritas en el presente documento prefieren 2-cetoácidos > C⁶.

Se realiza un análisis cinético detallado en estado estacionario de todas las enzimas para determinar la velocidad máxima y la eficiencia catalítica de descarboxilar 2-cetooctanoato (2-KO) y 2-cetononanoato (2-KN). Ambos sustratos exhiben una cinética hiperbólica y no hiperbólica como se evidencia en la Tabla 2. Para las variantes de AbPPDC que muestran una cinética no hiperbólica, las velocidades iniciales de las descarboxilaciones de 2-KO y 2-KN se ajustan a la ecuación de Hill (leyenda de la Tabla 2) y la tasa máxima y las eficiencias catalíticas (k^cat/K^o.s) calculado como se muestra en la Tabla 2. Un coeficiente de Hill mayor que 1 sugiere la presencia de activación del sustrato con 2-KO y 2-KN. Se han informado activaciones de sustrato con AbPPDC y con otras descarboxilasas. Véase, también, Spaepen, S., Ibid.

Como es evidente de la Tabla 2, las sustituciones de aminoácidos afectan la eficiencia catalítica de las variantes en la captura de 2-KO y 2-KN para la catálisis de diferentes maneras. Para algunas variantes, por ejemplo, F532V, la eficiencia catalítica de la descarboxilación de 2-KN y 2-KO es 180% y 45%, respectivamente, en comparación con la de AbPPDC de tipo salvaje. Esto sugiere que la sustitución de F532V aumenta la especificidad del sustrato para 2-KN mientras que la disminuye para 2-KO. La preferencia de las variantes de AbPPDC para 2-KN sobre 2-KO se calcula tomando la relación de las eficiencias catalíticas de la variante y se muestra en la Tabla 2. Como se evidencia en la Tabla 2, las especificidades de AbPPDC y F532V son 1,8 y 5,6, respectivamente, lo que indica que su eficiencia catalítica de descarboxilar 2-KN es 1,8 y 5,6 veces mayor que la de descarboxilar 2-KO. Esto también indica que la variante F532V es 3 veces más específica que AbPPDC al preferir 2-KN sobre 2-KO. De manera similar, la preferencia de F385L por 2-KN sobre 2-KO es 5 veces mayor que la de AbPPDC. Estos datos sugieren que las sustituciones F385L y F532V mejoran la especificidad del sustrato para un 2-cetoácido más largo (por ejemplo, 2-KN) sobre uno más corto (por ejemplo, 2-KO). Por lo tanto, las variantes F385L y F532V mejorarían la acumulación de productos (C⁷-C¹⁰) más largos a base de aldehídos cuando los 2-cetoácidos se alargan utilizando la "vía 1" (FIGURA 1).

De manera similar, las especificidades de las variantes M461L, F532L, Q536G, Q536L, F532V/Q536V, M380V/M461V, F532A/Q536V, F532V/Q536A, F385L/Q536V, M461V/F532V y M461V/F532V/Q536V para 2-KN en comparación con la especificidad de cada una de las variantes para 2-KO son 3,3, 4,3, 4,8, 2,7, 3,6, 2,7, 6,8, 4,6, 4,3, 5,4 y 2,1, respectivamente. Esto sugiere que todas estas variantes son más específicas que AbPPDC en la captura de 2-KN para la catálisis.

Además de la especificidad de la variante AbPPDC para 2-KN, la acumulación máxima de octanal y productos bioquímicos derivados de ella también dependerá de las eficiencias relativas de las vías productoras de 2-KN frente a la de la variante AbPPDC. Por ejemplo, cuando la eficiencia de la vía de extensión de la cadena de 2- cetoácidos diseñada (que implica las tres enzimas, isopropilmalato sintasa, isopropilmalato isomerasa e isopropilmalato deshidrogenasa) en la producción de 2-KN es relativamente baja en comparación con la producción de 2-KO, resultaría la formación de heptanal, debido a la descarboxilación de 2-KO por parte de las variantes de AbPPDC en combinación con la reducción en la acumulación de productos químicos basados en octanal dentro de las células. En tales circunstancias, la variante AbPPDC, tal como F385L, sería la descarboxilasa preferida en función de su especificidad relativamente alta (9,1), junto con su eficiencia reducida como catalizador de descarboxilación 2-KN (Tabla 2).

Los resultados también demuestran que la sustitución de Gln-536 con un aminoácido hidrófobo (es decir, glicina, alanina, valina, leucina o isoleucina) mejora la eficiencia catalítica de AbPPDC y otras sustituciones que potencian la especificidad como se muestra en la Tabla 2. La variante Q536V es 8 y 5,7 veces más eficiente que la enzima de tipo salvaje en la descarboxilación de 2-KO y 2-KN, respectivamente (Tabla 2). De manera similar, la variante M461V/F532V/Q536V es 27 y 10 veces más eficiente que la variante M461V/F532V en la descarboxilación de 2-KO y 2-KN, respectivamente (Tabla 2). La variante M461V/F532V/Q536V es aproximadamente 17 y 20 veces más eficiente que la enzima de tipo salvaje en la descarboxilación de 2-KO y 2-KN, respectivamente (Tabla 2). La mayor eficiencia catalítica de la variante M461V/F532V/Q536V permite la descarboxilación efectiva de 2-KO a niveles intracelulares 17 veces más bajos que la enzima de tipo salvaje y fomenta la acumulación de productos químicos derivados del heptano, tal como heptanol (a través de la coexpresión con una alcohol deshidrogenasa) o heptanoato (a través de la coexpresión de una aldehído deshidrogenasa) dentro de las células.

Otras sustituciones de Gln-536, tales como con glicina, alanina, leucina o isoleucina, que también mejoran la eficiencia catalítica de la descarboxilación, también mejorarán las eficiencias catalíticas de las sustituciones potenciadoras de la especificidad. Esto se exhibe mediante la sustitución Q536A, que, cuando se agrega a una variante F532V (con k^cat/K^o,5= 4,8 mM'1min'1 para 2-KO y k^cat/K^o,5= 27 mM'1min'1 para 2-KN), da lugar a una variante F532V/Q536A (con k^cat/K^o,5 = 8,3 mM-1min-1 para 2-KO y k^cat/K^o,5 = 38 mM-1min-1 para 2-KN) que tienen eficiencias catalíticas 72% y 40% más altas, respectivamente, contra 2-KO y 2-KN.

En resumen, los resultados sugieren que la expresión de AbPPDC y sus variantes genéticamente modificadas permiten la descarboxilación eficiente de 2-cetoácidos C7-C11, y particularmente C7-C9 en este ejemplo, in vivo, y de este modo permitir la acumulación de, por ejemplo, productos químicos derivados de aldehídos tales como hexanal, heptanal y/u octanal, dentro de las células. Además, las modificaciones de F532, F385, Q536, M380, M461, F465, solas o en combinación, pueden dar lugar a organismos microbianos que exhiben una acumulación específicamente mejorada de, por ejemplo, productos químicos derivados de manera similar dentro de las células. Tabla 2. Caracterización cinética de AbPPDC y sus variantes *

respectivamente. Los resultados son la media ± error típico de 2-3 experimentos independientes. La especificidad de la variante AbPPDC se calcula tomando la relación de eficiencias catalíticas (k^cat/Ko.^s) de la variante para 2-KN a la de 2-KO.

1La convención de nomenclatura aplicada es que la primera letra indica el residuo de aminoácido que ha sido alterado. F = fenilalanina [Phe]; Q = glutamina [Gln]; M = metionina [Met]. El número indica la posición en la secuencia de aminoácidos (se muestran las posiciones 380, 385, 461,465, 532 y 536, en consecuencia). La última letra indica el residuo de aminoácido que está sustituido en esa ubicación. G = glicina; A = alanina; I = isoleucina; V = valina; L = leucina.

§ Las velocidades iniciales de estas variantes se ajustan a la ecuación clásica de Michaelis-Menton.

Ejemplo 3

Síntesis in vitro de alcoholes C⁵-C⁹con la variante F385L (SEQ ID. 8) de fenilpiruvato descarboxilasa de Azospirillum brasilense (AbPPDC)

La síntesis in vitro de alcoholes lineales con la variante F385L se realiza incubando 2-cetobutirato 0,5 mM (2-KB) con difosfato de tiamina 0,5 mM, NAD⁺2,5 mM, 0,2 miligramos por mililitro (0,2 mg/mL) de albúmina de suero bovino (BSA), acetil coenzima A 5 mM, 0,036 mg/mL de la variante H97A/S139G/N167G/P169A/G462D de isopropilmalato sintasa de E. coli (reseñado por Marcheschi, R. J. et al-. "A Synthetic Recursive "+1" pathway for carbon chain elongation " ACS Chem. Biol. 7:689-697, 2012), 0,16 mg/mL de la subunidad LeuC de isopropilmalato isomerasa (N° de acceso de GenBank NC 000913.3 ID de gen: 945076) y 0,21 mg/mL de la subunidad LeuD de isopropilmalato isomerasa (N° de acceso de GenBank NC 000913.3 iD de gen: 945642), 0,264 mg/mL de isopropilmalato deshidrogenasa de E. coli (LeuB; GenBank N° de acceso NC_000913.3 ID de gen: 944798), 0,192 mg/mL de variante L96G/V198A de isopropilmalato deshidrogenasa (reseñado en el documento WO2015089127 A1), 0,025 mg/mL de alcohol deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae (ADH6, GenBank: número de acceso NP_014051.3) y 0,0054 mg/mL de la variante F385L (SEQ ID 8) en tampón de síntesis in vitro (ácido 2-[4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il]etanosulfónico 50 mM, pH 7,5, que contiene cloruro de potasio (KCI) 30 mM y cloruro de magnesio (MgCl²) 5 mM).

La reacción se inicia con la adición de 2-cetobutirato al resto de la mezcla de reacción. Un volumen igual de tolueno de calidad analítica (CHROMOSOLVPlus™ para HPLC, > 99%, número de catálogo 650579) se superpone en la parte superior de la mezcla de reacción y la solución se incuba a 30 °C. Se agrega NADPH a la capa acuosa a una concentración final de 1 mM después de 2,5 horas de incubación a 30 °C. Se agrega NADPH adicional a la capa acuosa a una concentración final de 2 mM después de 6 horas de incubación a 30 °C. La reacción se incuba durante 18 horas adicionales a 30 °C y luego se detiene por congelación a -20 °C durante 30 minutos. Parte de la capa de tolueno se retira y analiza utilizando un cromatógrafo de gases equipado con un detector de ionización de llama (FID).

La síntesis in vitro de alcoholes ramificados con la variante F385L se realiza reemplazando el 2-cetobutirato con 2-cetoisovalerato 0,5 mM (2-KIV) o 3-metil-2-cetopentanoato 0,5 mM (3M-2KP) en la mezcla de reacción anterior y realizando el experimento, tal como se describió anteriormente.

Los alcoholes se cuantifican usando un cromatógrafo de gases de la serie 6890 de Hewlett Packard (HP) equipado con un detector de ionización de llama (FID), un inyector automático modelo G1513A y un controlador GC AutoSampler. Los analitos se separan usando una columna GC capilar DB-FFAP Agilent J&W (30 m x 0,320 mm DI x 0,25 pM de espesor de película; número de catálogo 123-3232, Agilent Technologies, Inc., Wilmington, DE 19808). La temperatura inicial del horno GC es de 40 °C, que se mantiene durante 1,50 minutos, luego se aumenta a 235 °C con un gradiente de 40 °C/minuto. Este gradiente proporciona un tiempo de ejecución total de 6,38 minutos. El caudal de la columna es de 4,0 mL/minuto, con helio como gas portador. El volumen de inyección es de 1 pL. Los ajustes de temperatura para el inyector y el detector son 225 °C.

Los títulos de alcohol producidos a partir de estas reacciones de síntesis in vitro se muestran en las FIGURAS 2, 3 y 4. Los resultados indican que la variante F385L, en combinación con la variante H97A/S139G/N167G/P169A/G462D de isopropilmalato sintasa (LeuA) de E. coli, isopropilmalato isomerasa (LeuCD) de E. coli, la isopropilmalato deshidrogenasa (LeuB) de E. coli de tipo salvaje y modificada y la alcohol deshidrogenasa (ADH6) producen alcoholes C⁵-C⁹alargados tras la incubación con 2-cetobutirato, 2-cetoisovalerato o 3-metil-2-cetopentanoato. Además, los resultados demuestran la especificidad de la variante F385L para alcoholes lineales más largos, en donde 1-octanol representa aproximadamente el 60% de los alcoholes totales generados tras la incubación con 2-cetobutirato. Con los 2-cetoácidos de cadena ramificada (2-cetoisovalerato, KIV y 3-metil-2-cetopentanoato, 3M-2-KP), se producen cantidades aproximadamente equivalentes de 5-metil-1-hexanol y 6-metil-1-heptanol tras la incubación con 2-cetoisovalerato, y se producen cantidades aproximadamente equivalentes de 3-metil-1-pentanol y 5-metil-1-heptanol tras la incubación con 3-metil-2-cetopentanoato. Estos resultados demuestran que la variante F385L acepta 2-cetoácidos de cadena lineal, así como ramificada como sustratos y puede producir aldehídos de cadena lineal y ramificada correspondientes que posteriormente podrían convertirse en otros productos, tales como alcoholes, ácidos carboxílicos o alcanos.

Ejemplo 4

Producción in vivo de alcoholes C⁵-C⁸en cepas modificadas por ingeniería genética de E. coli utilizando AbPPDC de tipo salvaje y sus variantes en combinación con las enzimas "vía 1"

MG1655 de Escherichia coli (E. coli) está modificado por ingeniería genética para fomentar la producción de alcohol lineal de cadena larga y para permitir la expresión génica de un promotor T7. Para mejorar la producción de alcohol lineal, ilvBN e ilvlH se inactivan mediante recombinación homóloga mediada por ARed tal como se describe por Datsenko, KA, Wanner, BL, "One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli products ", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000, 97(12), 6640-6645. Los genes ilvBN e IlvIH están implicados en la producción de aminoácidos de cadena ramificada, por lo que la inactivación de estos genes elimina la producción de alcoholes de cadena ramificada. El gen ilvA, que está implicado en la producción de 2-cetobutirato, se regula al alza por sustitución reemplazando su promotor nativo y el sitio de unión al ribosoma con un promotor constitutivo fuerte y un sitio de unión al ribosoma fuerte a través de la recombinación homóloga mediada por ARed tal como se describe por Datsenko y Wanner, Ibid. Para permitir la expresión de genes de los promotores T7, el lisógeno DE3 se integra en MG1655 usando el kit de lisogenización ADE3 (EMD Millipore Cat n° 69734). El genotipo de cepa resultante es MG1655 (DE3) AilvBN AilvIH ilvAup.

Alcoholes C⁵-C⁸se producen en la cepa de E. coli modificada por ingeniería genética a través de la expresión de ocho proteínas: (1) isopropilmalato sintasa (LeuA) de E. coli; (2) isopropilmalato sintasa modificada por ingeniería genética (descrito por Marcheschi et al. ACS Chem. Biol. 2012, 7, 689-697); (3) y (4) dos subunidades de isopropilmalato isomerasa (LeuCD) de E. coli; (5) isopropilmalato deshidrogenasa (LeuB); (6) variante L96G/V198A de isopropilmalato deshidrogenasa de E. coli (tal como se describe con mayor detalle en la Solicitud de Patente Internacional en tramitación N° de serie PCT/US14/69438, presentada el 10 de diciembre de 2014, reivindicando el beneficio de la Solicitud de Patente Provisional de EE.UU. N° 61/915.040, presentada el 12 de diciembre de 2013; (7) AbPPDC o sus variantes; y (8) alcohol deshidrogenasa de S. cerevisiae (ADH6). Se crean once cepas en total. Se crea una cepa que contiene solo AbPPDC de tipo salvaje. Como control negativo, también se crea una cepa sin PPDC. También se crean ocho cepas que contienen variantes de AbPPDC F532V, F358L, F385V, F532V Q536V, M461C, M461V, F385V M461C y F385L M461V. Por último, una cepa que contiene ceto-isovalerato descarboxilasa de tipo salvaje de Lactococcus lactis (KIVD; N° de acceso a GenBank AJ746364) se crea como una comparación, ya que el trabajo previo ha demostrado que KIVD es capaz de producir alcoholes de cadena larga en combinación con las enzimas de la "vía 1". Véase, p. ej., Marcheschi et al. Ibid.

El sistema Novagen Duet Vector (EMD Millipore Cat n° 71146, 71341, 71340 y 71147), que permite la expresión simultánea de ocho genes usando cuatro plásmidos compatibles, se utiliza para expresar los genes mencionados anteriormente. Cada uno de los cuatro vectores Duet se clona con dos de los ocho genes aguas abajo de los promotores T7, y los cuatro vectores Duet se transforman en la de E. coli modificada por ingeniería genética. Las cepas recombinantes que portan todos los plásmidos se seleccionan para el uso de antibióticos (ampicilina a 25 microgramos por mililitro, pg/mL, cloranfenicol a 17 pg/mL, espectinomicina a 25 pg/mL y kanamicina a 15 pg/mL) y se confirman con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando métodos conocidos por los expertos en la técnica. Se agregan antibióticos en cada una de las etapas de cultivo sólido y líquido para asegurar el mantenimiento de los plásmidos. Después de la transformación, selección de placas y confirmación por PCR, las cepas se cultivan inicialmente en una placa de agar Luria-Bertani (LB) cultivada a 37 °C. Se usa una sola colonia de placas de agar para inocular 50 mL de medio LB en un matraz de agitación de 250 mL que se cultiva aeróbicamente a 37 °C usando un agitador de incubadora a 200 rpm.

Después de 12-16 horas de cultivo en los matraces de agitación LB, se inoculan botellas de suero al 1% v/v para evaluar la producción de alcohol. El medio de fermentación de la botella de suero se prepara usando agua desionizada de acuerdo con las concentraciones que se muestran en la Tabla 1. El medio se esteriliza por filtración y se añaden 20 mL de medio a las botellas de suero de 125 mL con tapón de caucho butílico. Antes de la adición de los medios, las botellas de suero se esterilizan previamente en autoclave a 125 °C durante 30 minutos utilizando un esterilizador Steris Amsco Century SV-160H Prevac.

Tabla 1. Composición del medio utilizada para demostrar la producción de alcohol a partir de E. coli modificado de forma recombinante para contener la "vía 1" en combinación con descarboxilasa de Azospirllum brasilense (AbPPDC) o sus variantes.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para modificar genéticamente un microorganismo, que comprende

(A) seleccionar un microorganismo que produce un 2-cetoácido C⁷-C¹¹; y

i. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende la mutación F385L, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa; ii. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende la mutación M461C, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa; iii. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende la mutación M461V, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa; iv. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende la mutación M461L, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa; v. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende la mutación F532V y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa; vi. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende la mutación F532L, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa; vii. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende la mutación Q536G, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa; viii. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende la mutación Q536A, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa; ix. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende la mutación Q536L, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa; x. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende la mutación Q536I, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa; xi. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende la mutación Q536V, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa; xii. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende las mutaciones F532V y Q536V, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa;

xix. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende las mutaciones M461A y Q536V, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa;

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que:

(A) el microorganismo es Escherichia coli;

(B) la secuencia de ácido nucleico no nativa se obtiene de Azospirillum brasilense; y

(C) la fenilpiruvato descarboxilasa no nativa participa en una vía metabólica que convierte los 2-cetoácidos C⁷-C¹¹en aldehídos C⁶-C¹⁰que tienen un átomo de carbono menos que el 2-cetoácido C⁷-C¹¹que se está convirtiendo.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que la vía metabólica continúa durante la fermentación anaerobia.

4. Un microorganismo modificado genéticamente, que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una fenilpiruvato descarboxilasa de la reivindicación 7.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que:

(A) el microorganismo es una especie de Clostridium;

(B) la fenilpiruvato descarboxilasa no nativa se usa o se expresa como parte de una vía metabólica de tipo salvaje que incluye una vía de Wood-Ljungdahl; y

(C) la secuencia de aminoácidos se obtiene de Azospirillum brasilense.

6. Un procedimiento para preparar un aldehído C⁶-C¹⁰, que comprende las etapas de:

(A) poner en contacto un sustrato de 2-cetoácido C⁴-C¹⁰, una isopropilmalato sintasa, una isopropilmalato isomerasa y una isopropilmalato deshidrogenasa, en condiciones tales que el sustrato de 2-cetoácido C⁴-C¹⁰se convierte en un 2-cetoácido C⁷-C¹¹a través de una o más reacciones bioquímicas;

(B) poner en contacto el 2-cetoácido C⁷-C¹¹y una fenilpiruvato descarboxilasa, comprendiendo la fenilpiruvato descarboxilasa al menos uno de:

xv. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende las mutaciones F532A y Q536V, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa;

xxii. una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 90 por ciento de homología con la SEQ ID 4 y que comprende las mutaciones M461V, F532V y Q536V, y que tiene actividad fenilpiruvato descarboxilasa;

7. Un polipéptido de fenilpiruvato descarboxilasa genéticamente modificado que tiene actividad de fenilpiruvato descarboxilasa, comprendiendo el polipéptido:

8. El polipéptido de la reivindicación 7, en donde la secuencia de aminoácidos es al menos 95 por ciento homóloga a la misma.

9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que (A) y (B) se producen independientemente dentro o fuera de un organismo microbiano genéticamente modificado.

10. El procedimiento de la reivindicación 6 o la reivindicación 9, en el que al menos uno de los sustratos de 2-cetoácido C⁴-C¹⁰comprende 2-cetobutirato.

11. El procedimiento de la reivindicación 6 o la reivindicación 9, en el que al menos uno de los sustratos de 2-cetoácido C⁴-C¹⁰comprende 2-cetoisovalerato.

12. Un procedimiento para preparar un alcohol C⁶-C¹⁰que comprende el procedimiento de la reivindicación 6 o la reivindicación 9, en el que el aldehído C⁶-C¹⁰se pone en contacto con una alcohol deshidrogenasa que tiene actividad de alcohol deshidrogenasa, en condiciones en las que el aldehído C⁶-C¹⁰se convierte en un correspondiente alcohol C⁶-C¹⁰.

13. Un procedimiento para preparar un ácido carboxílico C⁶-C¹⁰que comprende el procedimiento de la reivindicación 6 o la reivindicación 9, en el que el aldehído C⁶-C¹⁰se pone en contacto con una aldehído deshidrogenasa que tiene actividad de aldehído deshidrogenasa, en condiciones en las que el aldehído el C⁶-C¹⁰se convierte en un correspondiente ácido carboxílico C⁶-C¹⁰.

14. Un procedimiento para preparar un alcano Cn^-1que comprende el procedimiento de la reivindicación 6 o la reivindicación 9, en el que el aldehído C⁶-C¹⁰se pone en contacto con una aldehído descarbonilasa grasa que tiene actividad de aldehído descarbonilasa grasa, en condiciones en las que el aldehído C⁶-C¹⁰se convierte en un correspondiente alcano C n^-1.

15. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6 o la reivindicación 9, en el que el procedimiento se produce bajo condiciones aerobias o anaerobias.