ES2792151T3 - Tratamiento para la esclerosis lateral amiotrófica - Google Patents

Tratamiento para la esclerosis lateral amiotrófica Download PDF

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Abstract

Un método in vitro para reducir la toxicidad de TDP-43 en una célula neuronal humana o en una célula glial humana que padece o es susceptible de padecer dicha toxicidad, que comprende: proporcionar a la célula una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido UPF1, reduciendo así la toxicidad de TDP-43 en la célula.

Description

d es c r ip c ió n
Tratamiento para la esclerosis lateral amiotrófica
Antecedentes de la invención
La esclerosis lateral amiotrófica (ELA, también llamada enfermedad de Lou Gehrig) es una enfermedad neurodegenerativa, mortal e implacablemente progresiva, con una prevalencia de aproximadamente 5 personas de cada 100.000 cada año y una media en la edad de inicio de unos 60 años. Los pacientes con ELA sufren la degeneración de las neuronas motoras en el cerebro y en la médula espinal, lo que les conduce a una cierta debilidad muscular progresiva. La ELA representa entre alrededor de 1/300 a 1/400 de todas las muertes, lo que significa que alrededor de 1.000.000 de personas que ahora están vivas en los Estados Unidos desarrollarán en un futuro la ELA. La muerte ocurre típicamente 3-5 años después del inicio de la enfermedad, debido a una parálisis respiratoria. No existe ningún tratamiento eficaz para esta enfermedad; el único medicamento aprobado para el ELA (riluzol) solo extiende la vida de algunos pacientes con ELA en apenas unos 3 meses. Por lo tanto, sigue siendo necesario crear nuevos enfoques terapéuticos para el tratamiento de la ELA.
Compendio
La presente descripción abarca el sorprendente descubrimiento de que los agentes involucrados en la descomposición del ARNm mediado sin sentido (NMD) pueden proteger a las células neuronales del daño asociado a TDP-43 o FUS/TLS. Por lo tanto, la presente invención proporciona un polipéptido UPF1 o un ácido nucleico que codifica un polipéptido UPF1 para su uso en medicamentos y, específicamente, en el tratamiento o la prevención (por ejemplo, retraso del inicio) de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA). En un aspecto, la presente descripción proporciona métodos para reducir la toxicidad del TDP-43 en una célula neuronal humana o célula glial humana que sufre dicha toxicidad o es susceptible a ella, que comprende proporcionar a la célula in vitro una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido UPF1, reduciendo así la toxicidad del TDP-43 en la célula. En algunas realizaciones, el paso de proporcionar comprende la administración de una composición que comprende el polipéptido UPF1, o un ácido nucleico que codifica el polipéptido UPF1.
En los diversos aspectos, la presente descripción proporciona un polipéptido UPF o un nucleótido que codifica el polipéptido UPF1 para su uso en el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) en un sujeto humano, en el que un polipéptido UPF1, o un ácido nucleico que codifica un polipéptido de UPF1 debe administrarse a un sujeto que sufre ELA o es susceptible de sufrirla, y en el que la ELA está asociada con la toxicidad de TDP-43; o el sujeto no tiene ninguna mutación en un gen SOD1. En algunas realizaciones, la cantidad terapéuticamente efectiva se correlaciona con una probabilidad estadísticamente significativa de reducir la toxicidad del TDP-43 en una célula neuronal o una célula de la glía. En algunas realizaciones, la cantidad terapéuticamente efectiva se correlaciona con una probabilidad estadísticamente significativa de mejorar el procesamiento del ARNm en una célula neuronal o una célula glial. En algunas realizaciones, la enfermedad, trastorno o condición no está asociada con la toxicidad de SOD1. En algunas realizaciones, el polipéptido UPF1 o el ácido nucleico que codifica el polipéptido UPF1 debe administrarse en el SNC del sujeto, tal como por una inyección intratecal.
En varios aspectos, la presente descripción proporciona un polipéptido UPF para su uso en el tratamiento de la ELA en un sujeto humano, en el que el polipéptido UPF1 debe administrarse a un sujeto que sufre ELA o es susceptible de padecerla, y en el que la ELA está asociada con la toxicidad de TDP-43 o el sujeto no tiene ninguna mutación en un gen SOD1. En algunas realizaciones, la cantidad terapéuticamente efectiva se correlaciona con una probabilidad estadísticamente significativa de reducir la toxicidad en una célula neuronal humana o una célula glial humana. En algunas realizaciones, la toxicidad es la toxicidad de TDP-43. En algunas realizaciones, la toxicidad no es la toxicidad de SOD1. En algunas realizaciones, la cantidad terapéuticamente efectiva se correlaciona con una probabilidad estadísticamente significativa de mejorar el procesamiento del ARNm en una célula neuronal humana o una célula glial humana.
Se describen en este documento métodos para identificar un agente útil en el tratamiento de la ELA que comprende: poner en contacto una población de células neuronales o células gliales que sufren o son susceptibles frente a la toxicidad de FUS/TLS o TDP-43 con un agente de ensayo; determinar un número de células viables en la población después de la etapa de contacto; y comparar el número de células viables con un control; en el que el agente de ensayo que aumenta el número de células viables en relación con el control se identifica como un agente útil en el tratamiento de la ELA. En algunas realizaciones, las células neuronales o las células gliales se transfectan con un ácido nucleico que codifica FUS/TLS o TDP-43.
También se describen en este documento métodos para identificar un agente útil en el tratamiento de la ELA que comprende: poner en contacto una población de células neuronales o células gliales que sufren o son susceptibles a la toxicidad de FUS/TLS o TDP-43 con un agente de ensayo; determinar un nivel de procesamiento del ARNm en la población de células neuronales o células gliales después de la etapa de contacto; y comparar el nivel de procesamiento de ARNm con un control; en el que el agente de ensayo que aumenta el nivel de procesamiento de ARNm en relación con el control se identifica como agente útil en el tratamiento del ELA.
También se describen en el presente documento métodos de identificación de un agente útil en el tratamiento de la ELA que comprende: poner en contacto una primera población de células neuronales o células gliales que sufren o son susceptibles a la toxicidad de FUS/TLS o TDP-43 con un agente de ensayo; determinar un primer número de células viables en la primera población después de la etapa de contacto; administrar un polipéptido NMD a una segunda población de células neuronales o células gliales que sufren o son susceptibles a la toxicidad de FUS/TLS o TDP-43; y determinar un segundo número de células viables en la segunda población después de la etapa de administración; en el que un primer número de células viables que es comparable al segundo número de células viables indica que el agente de ensayo es un agente útil en el tratamiento de la ELA.
En varios aspectos, la presente descripción proporciona composiciones farmacéuticas para el uso de ELA que comprende un polipéptido UPF1, o un ácido nucleico que codifica un polipéptido UPF1, y un excipiente farmacéuticamente aceptable, en el que la ELA está asociada con la toxicidad de TDP-43 o el sujeto no tiene ninguna mutación en un gen SOD1. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende además un agente de reconocimiento. En algunas realizaciones, tras la administración a un sujeto, el agente de reconocimiento detecta selectivamente la composición en el cerebro.
En varios aspectos, la presente descripción proporciona un polipéptido UPF1 para el tratamiento de la ELA en un sujeto humano que sufre o es susceptible de sufrir la ELA, en el que el polipéptido UPF1 debe administrarse a dicho sujeto, en el que el sujeto no tiene ninguna mutación en un gen SOD1. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una mutación en un gen ALS2, un gen VAPB, un gen SETX, un gen TDP-43, un gen FUS/TLS o un gen OPTN.
Breve descripción de los dibujos
Las siguientes figuras se presentan únicamente con fines ilustrativos y no pretenden ser limitantes.
La FIG. 1A es una representación gráfica de la muerte celular de neuronas después de la expresión de UPF1. La FIG. 1B es una representación gráfica de la muerte celular de neuronas tras la expresión de TDP-43 y UPF1. Los materiales, métodos y ejemplos son ilustrativos solamente y no pretenden ser limitantes. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen el mismo significado que comúnmente es entendido por los expertos en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque puedan utilizarse en la práctica métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento o en las pruebas de la presente invención, a continuación se describen algunos métodos y materiales adecuados.
Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, y de las reivindicaciones.
Definiciones
Para que la presente invención se entienda más fácilmente, ciertos términos se definen primero a continuación. Otras definiciones para los siguientes términos y expresiones se establecen a lo largo de la memoria descriptiva. Aproximadamente: Tal como se utiliza en el presente documento, el término "aproximadamente", tal como se aplica a uno o más valores de interés, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia declarado. En ciertas realizaciones, el término "aproximadamente" se refiere a un intervalo de valores dentro del 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, o menos en cualquier dirección (mayor o menor que) del valor de referencia indicado a menos que se indique lo contrario o sea evidente de otro modo a partir del contexto (excepto cuando dicho número supere el 100% de un valor posible).
Mejora: Tal como se utiliza en el presente documento, el término "mejora" significa la prevención, reducción o paliación de un estado, o la mejora del estado de un sujeto. La mejora incluye, pero no requiere, una recuperación completa o prevención completa de una condición de enfermedad.
Parte característica: Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "parte característica" de una sustancia, en el sentido más amplio, es aquel que comparte cierto grado de secuencia o identidad estructural con respecto a toda la sustancia. En determinadas realizaciones, una parte característica comparte al menos una característica funcional con la sustancia intacta. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una "porción característica" de un polipéptido o proteína es una que contiene un tramo continuo de aminoácidos, o una colección de tramos continuos de aminoácidos, que juntos son característicos de un polipéptido o proteína. En algunas realizaciones, cada uno de estos tramos continuos contiene al menos 2, 5, 10, 15, 20, 50 o más aminoácidos. En algunas realizaciones, dicho tramo continuo incluye ciertos residuos cuya posición e identidad son fijas; ciertos residuos cuya identidad tolera cierta variabilidad (es decir, se acepta uno de los pocos residuos especificados); y, opcionalmente, ciertos residuos cuya identidad es variable (es decir, se acepta cualquier residuo). En general, una porción característica de una sustancia (por ejemplo, de un polipéptido o proteína) es una que, además de la identidad de secuenciación y/o estructural especificada anteriormente, comparte al menos una característica funcional con la sustancia intacta pertinente. En algunas realizaciones, una porción característica puede ser biológicamente activa.
Secuencia característica: Una "secuencia característica" es una secuencia que se encuentra en todos los miembros de una familia de polipéptidos o ácidos nucleicos y, por lo tanto, puede ser utilizada por los expertos en la técnica para definir a los miembros de la familia.
Terapia combinada: La expresión "terapia combinada", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a aquellas situaciones en las que dos o más agentes farmacéuticos diferentes se administran en regímenes concomitantes para que el sujeto se exponga simultáneamente a ambos agentes. Cuando se utiliza en terapia de combinación, se pueden administrar dos o más agentes diferentes simultáneamente o por separado. Esta administración en combinación puede incluir la administración simultánea de los dos o más agentes en la misma forma de dosificación, la administración simultánea en formas de dosificación separadas, y la administración separada. Es decir, dos o más agentes se pueden formular juntos en la misma forma de dosificación y se administran simultáneamente. Alternativamente, dos o más agentes se pueden administrar simultáneamente, donde los agentes están presentes en formulaciones separadas. En otra alternativa, un primer agente se puede administrar solo seguido de uno o más agentes adicionales. En el protocolo de administración independiente, se pueden administrar dos o más agentes con unos minutos de diferencia, o con unas horas de diferencia, o con unos días de diferencia.
Comparable: La expresión "comparable", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un sistema, conjunto de condiciones, efectos o resultados que son lo suficientemente similares a un sistema de prueba, conjunto de condiciones, efectos o resultados, que permiten una comparación científicamente legítima. Los expertos en la técnica apreciarán y comprenderán qué sistemas, conjuntos de condiciones, efectos o resultados son suficientemente similares para ser "comparables" a cualquier sistema de prueba en particular, conjunto de condiciones, efectos o resultados como se describe en el presente documento.
Correlatos: El término "correlatos", tal como se utiliza en el presente documento, tiene su significado corriente de "mostrar una correlación con". Los expertos en la técnica apreciarán que dos características, elementos o valores muestran una correlación entre sí si muestran una tendencia a aparecer y/ o a variar, juntos. En algunas realizaciones, una correlación es estadísticamente significativa cuando su valor p es menor que 0,05; en algunas realizaciones, una correlación es estadísticamente significativa cuando su valor p es menor que 0,01. En algunas realizaciones, la correlación se evalúa mediante el análisis de regresión. En algunas realizaciones, una correlación es un coeficiente de correlación.
Homología: Tal como se utiliza en el presente documento, el término "homología" se refiere a la relación general entre moléculas poliméricas, por ejemplo, entre moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, moléculas de ADN y/o moléculas de ARN) y/o entre moléculas de polipéptidos. En algunas realizaciones, las moléculas poliméricas se consideran "homólogas" entre sí si sus secuencias son al menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o 99% idénticas. En algunas realizaciones, las moléculas poliméricas se consideran "homólogas" entre sí si sus secuencias son al menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99% similares.
Identidad: Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "identidad" se refiere a la relación general entre moléculas poliméricas, por ejemplo, entre moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, moléculas de ADN y/o moléculas de ARN) y/o entre moléculas de polipéptidos. El cálculo de la identidad porcentual de dos secuencias de ácido nucleico, por ejemplo, se puede realizar alineando las dos secuencias con fines de comparación óptimos (por ejemplo, se puede inducir las huecos en una o ambas secuencias de ácido nucleico para una alineación óptima y las secuencias no idénticas pueden ser ignoradas a efectos de comparación). En determinadas realizaciones, la longitud de una secuencia alineada a efectos de comparación es al menos un 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, o sustancialmente 100% de la longitud de la secuencia de referencia. A continuación, se comparan los nucleótidos en las posiciones de los nucleótidos correspondientes. Cuando es ocupada una posición en la primera secuencia por el mismo nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que debe introducirse para una alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación de la identidad porcentual entre dos secuencias se puede realizar mediante un algoritmo matemático. Por ejemplo, la identidad porcentual entre dos secuencias de nucleótidos se puede determinar utilizando el algoritmo de Meyers y Miller (CABIOS, 1989, 4:11-17), que se ha incorporado al programa ALIGN (versión 2.0) utilizando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos puede, alternativamente, determinarse utilizando el programa GAP en el paquete de software GCG utilizando una matriz NWSgapdna.CMP.
Mejorar, aumentar o reducir: Tal y como se utiliza en el presente documento, los términos "mejorar", "aumentar" o "reducir" o sus equivalentes gramaticales, indican valores que son relativos a una medición de referencia (por ejemplo, línea de base), como una medición tomada en condiciones comparables (por ejemplo, en el mismo individuo antes del inicio del tratamiento descrito en el presente documento, o una medición en un individuo de control (o múltiples individuos de control) en ausencia de tratamiento) descrito en el presente documento.
Agente NMD: Como se utiliza en el presente documento, la expresión "agente NMD" se refiere a un polipéptido NMD, un ácido nucleico que codifica un polipéptido NMD, o un agente que aumenta el nivel y/o la actividad del polipéptido NMD. En algunas realizaciones, un agente NMD es un agente terapéutico.
Polipéptido NMD: Como se utiliza en el presente documento, la expresión "polipéptido NMD" se refiere a un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos incluye al menos una secuencia característica y/o muestra al menos 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71% o 70% de identidad con una proteína involucrada en la descomposición del ARNm mediada anti-sentido (por ejemplo, UPF1, UPF2, UPF3, SMG1, SMG5, SMG6 o SMG7). Una amplia variedad de secuencias NMD de moscas, vertebrados, y mamíferos son conocidas en la técnica, como las descritas en el presente documento; en algunas realizaciones, un polipéptido NMD comparte al menos una secuencia característica y / o muestra el grado especificado de identidad de secuencia global con uno de los UPF1, UPF2, UPF3, SMG1, SMG5, SMG6, o SMG7 establecidos en el presente documento (cada uno de los cuales puede ser considerado un polipéptido NMD de "referencia"). En algunas realizaciones, un polipéptido NMD, tal y como se describe en este documento, comparte al menos una actividad biológica con un polipéptido NMD de referencia como se establece en el presente documento. En algunas de esas realizaciones, la actividad biológica compartida se relaciona con la descomposición del ARNm mediada anti-sentido.
Polipéptido: Tal y como se utiliza en el presente documento, un "polipéptido", hablando en términos generales, es una cadena de al menos dos aminoácidos unidos entre sí por un enlace peptídico. En algunas realizaciones, un polipéptido puede incluir al menos 3-5 aminoácidos, cada uno de los cuales se une a otros por medio de al menos un enlace péptido. Los expertos en la técnica apreciarán que los polipéptidos a veces incluyen aminoácidos "no naturales" u otras entidades que, sin embargo, son capaces de integrarse en una cadena de polipéptidos, opcionalmente.
Proteína: Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "proteína" se refiere a un polipéptido (es decir, una cadena de al menos dos aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos). Las proteínas pueden incluir restos distintos de los aminoácidos (por ejemplo, pueden ser glicoproteínas, proteoglicanos, etc.) y/o pueden procesarse o modificarse de otro modo. Los expertos en la técnica apreciarán que una "proteína" puede ser una cadena de polipéptidos completa tal y como es producida por alguna célula (con o sin una secuencia de señal), o puede ser una porción característica de la misma. Los expertos apreciarán que una proteína puede incluir algunas veces más de una cadena de polipéptidos, por ejemplo, unidos por uno o más enlaces de disulfuro o asociados por otros medios. Los polipéptidos pueden contener L-aminoácidos, D-aminoácidos, o ambos y pueden contener cualquiera de una variedad de modificaciones de aminoácidos o análogos conocidos en la técnica. Las modificaciones útiles incluyen, por ejemplo, acetilación terminal, amidación, metilación, etc. En algunas realizaciones, las proteínas pueden comprender aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales, aminoácidos sintéticos y sus combinaciones. El término "péptido" se utiliza generalmente para referirse a un polipéptido que tiene una longitud de menos de 100 aminoácidos, menos de unos 50 aminoácidos, menos de 20 aminoácidos, o menos de 10 aminoácidos.
Proporcionar: Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "proporcionar" se refiere a la realización de una manipulación que hace que una entidad de interés esté presente en un nivel y/o con una actividad superior a la observada en condiciones de otro modo comparables previo o sin ninguna manipulación. En algunas realizaciones, proporcionar consiste o comprende la administración de la propia entidad (sola o como parte de una composición); en alguna realización, proporcionar consiste o comprende la administración de un agente que cause un aumento en el nivel y /o la actividad de la entidad de interés. Por ejemplo, cuando la entidad de interés es o comprende un polipéptido, en algunas realizaciones, "proporcionar" el polipéptido consiste o comprende la administración del polipéptido (por ejemplo, a una célula, ya sea aislada o en un organismo); en algunas realizaciones, "proporcionar" el polipéptido consiste o comprende la administración de un ácido nucleico que codifica el polipéptido; en algunas realizaciones, "proporcionar" el polipéptido consiste o comprende la administración de un agente que resulta en una mayor expresión de una copia endógena del polipéptido (por ejemplo, estimulando una o más de una transcripción, procesamiento de ARN, traducción, etc. y/o inhibiendo un inhibidor de uno de estos).
Referencia: Una entidad de "referencia", sistema, cantidad, conjunto de condiciones, etc., es una contra la cual se compara una entidad de prueba, sistema, cantidad, conjunto de condiciones, etc. como se describe en el presente documento. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un individuo de "referencia" es un individuo de control que no está sufriendo ninguna forma de la enfermedad ELA o no es susceptible a esta tampoco; en algunas realizaciones, un individuo de "referencia" es un individuo de control afectado con la misma forma de la enfermedad de ELA que un individuo que esté siendo tratado y, opcionalmente, que tiene aproximadamente la misma edad que el individuo que está siendo tratado (para asegurar que las etapas de la enfermedad en el individuo tratado y el individuo o individuos control sean comparables.
Sujeto: Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "sujeto", "individuo" o "paciente" se refiere a cualquier organismo sobre el que las realizaciones de la invención pueden ser utilizadas o administradas, por ejemplo, con fines experimentales, diagnósticos, profilácticos y/o terapéuticos. Los sujetos típicos incluyen animales (por ejemplo, mamíferos como ratones, ratas, conejos, primates no humanos y seres humanos; insectos; gusanos; etc.).
Célula diana o tejido diana: Tal y como se utiliza en el presente documento, las expresiones "célula diana" o "tejido diana" se refieren a cualquier célula, tejido u organismo que se vea afectado por la ELA a tratar, o cualquier célula, tejido u organismo en el que se exprese alguna proteína implicada en la ELA. En algunas realizaciones, las células diana, los tejidos diana u organismos diana incluyen aquellas células, tejidos u organismos en los que hay una cantidad detectable o anormalmente alta de FUS o TDP-43 (por ejemplo, comparable a la observada en pacientes que sufren o son susceptibles de sufrir ELA). En algunas realizaciones, las células diana, los tejidos diana u organismos diana incluyen aquellas células, tejidos u organismos que muestran una patología, síntoma o característica asociado a una enfermedad.
Agente terapéutico: Tal y como se utiliza en el presente documento, la frase "agente terapéutico" se refiere a cualquier agente que, cuando se administra a un sujeto, tiene un efecto terapéutico y/o provoca un efecto biológico y/o farmacológico deseado.
Régimen terapéutico: Tal y como se utiliza en el presente documento, la expresión "régimen terapéutico" se refiere a cualquier agente utilizado para aliviar, parcial o completamente, mejorar, paliar, inhibir, prevenir, retrasar la aparición de uno o más síntomas o características de una enfermedad, trastorno, y / o condición particular, reducir su gravedad y / o reducir la incidencia. Puede incluir la administración de una o más dosis, opcionalmente espaciadas por intervalos de tiempo regulares o variados. En algunas realizaciones, un régimen terapéutico es aquel cuyo rendimiento está diseñado para lograr y/o está correlacionado con el logro de un efecto particular (por ejemplo, en una población relevante de células, tejidos u organismos), por ejemplo, reduciendo o eliminando una condición o enfermedad perjudicial como la ELA. En algunas realizaciones, el tratamiento incluye la administración de uno o más agentes terapéuticos simultáneamente, secuencialmente o en diferentes momentos, durante la misma o diferente cantidad de tiempo. En algunas realizaciones, el "régimen de tratamiento" incluye métodos genéticos como la terapia génica, la eliminación de genes u otros métodos conocidos por inducir o reducir la expresión (por ejemplo, la transcripción, el procesamiento y/o la traducción de un producto genético en particular, como una transcripción primaria o ARNm).
Cantidad terapéuticamente eficaz: Tal y como se utiliza en el presente documento, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad de un agente terapéutico (por ejemplo, un polipéptido NMD) que confiere un efecto terapéutico sobre el sujeto tratado, con una relación beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento médico. Tal efecto terapéutico puede ser objetivo (es decir, medible por alguna prueba o marcador) o subjetivo (es decir, el sujeto da una indicación o siente un efecto). En algunas realizaciones, la "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad de un agente terapéutico o una composición efectiva para tratar, mejorar o prevenir (por ejemplo, el retraso en su aparición) de una enfermedad o condición relevante, y/o exhibir un efecto terapéutico o preventivo detectable, tal y como es aliviar los síntomas asociados con la enfermedad, prevenir o retrasar el inicio de la enfermedad, y/o también disminuir la gravedad o frecuencia de los síntomas de la enfermedad. Una cantidad terapéuticamente eficaz debe comúnmente administrarse en un régimen de dosificación que puede comprender múltiples dosis unitarias. Para cualquier agente terapéutico en particular, una cantidad terapéuticamente eficaz (y/o una dosis unitaria adecuada dentro de un régimen de dosificación eficaz) puede variar, por ejemplo, dependiendo de la vía de administración, o de la combinación con otros agentes terapéuticos.
Alternativamente o adicionalmente, una cantidad específica terapéuticamente eficaz (y/o dosis unitaria) para cualquier paciente en particular puede depender de una variedad de factores, incluyendo la forma particular de ELA que se está tratando; la gravedad de la ELA; la actividad del agente terapéutico específico empleado; la composición específica empleada; la edad, el peso corporal, el estado de salud general, el sexo y la dieta del paciente; el tiempo de administración, la vía de administración y/o la tasa de excreción o metabolismo del agente terapéutico específico empleado; la duración del tratamiento; y factores similares como son reconocidos en las artes médicas.
Tratamiento: Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "tratamiento" (también "tratar" o "que trata") se refiere a cualquier administración de un agente terapéutico (por ejemplo, un polipéptido NMD) de acuerdo con un régimen terapéutico que logra un efecto deseado en el sentido de que alivia parcial o completamente, mejora, palia, inhibe, retrasa la aparición, reduce la gravedad y/o reduce la incidencia de uno o más síntomas o características de una enfermedad en particular, trastorno, y / o condición (por ejemplo, ELA); en algunas realizaciones, la administración del agente terapéutico de acuerdo con el régimen terapéutico está correlacionada con el logro del efecto deseado. Dicho tratamiento puede ser en un sujeto que no presente signos de enfermedad, ni de trastorno y/o condición relevante y/o en un sujeto que sólo presente signos iniciales de la enfermedad, trastorno y/o condición. Alternativa o adicionalmente, dicho tratamiento puede ser en un sujeto que presente uno o más signos establecidos de la enfermedad, trastorno y/o condición pertinentes. En algunas realizaciones, el tratamiento puede ser en un sujeto que haya sido diagnosticado como que sufre de una enfermedad, trastorno y/o condición relevantes. En algunas realizaciones, el tratamiento puede ser en un sujeto que se sabe que tiene uno o más factores de susceptibilidad que están estadísticamente correlacionados con un mayor riesgo del desarrollo de la enfermedad, trastorno y/o condición pertinentes.
Descripción detallada de la invención
La presente descripción abarca el sorprendente descubrimiento de que la UPF1 puede prevenir la toxicidad neuronal debida a TDP-43. La UPF1 es una proteína involucrada en la destrucción del ARNm mediado sin sentido (NMD). En consecuencia, la descripción proporciona, entre otras cosas, diversas modalidades terapéuticas, incluyendo el uso del polipéptido NMD UPF1 para tratar la esclerosis lateral amiotrófica (ELA).
Esclerosis lateral amiotrófica (ELA)
La ELA, que existe en formas heredadas y aleatorias, se caracteriza por la degeneración de las neuronas motoras espinales, lo que conduce a la parálisis y la muerte. Mientras que la mayoría de las formas de ELA son esporádicas e idiopáticas (ELAe), alrededor del 10% de los casos se heredan de una manera mendeliana y se denomina en tal caso ELA familiar (ELAf). La presente invención proporciona composiciones y métodos útiles para el tratamiento de la ELA.
Mediante el análisis genético, se han identificado varios genes que causan las ELAf. Las primeras mutaciones fueron identificadas en SOD1, que codifica la superóxido dismutasa de cobre/zinc expresada ubicuamente. Estas variantes están involucradas en aproximadamente el 20% de los casos de ELAf en todo el mundo (Rosen et al., Nature 362:59-62 (1993)). Otros genes involucrados en las ELAf incluyen genes que codifican para alsin (ALS2), una proteína B de membrana asociada a vesículas (VAPB) (Nishimura et al., Am. J. Hum. Genet. 75:822-831 (2004)), senataxin (SETX) (Chen et al., Am. J. Hum. Genet. 74:1128-1135 (2004)), Proteína de unión al ADN TAR (TDP-43) (Sreedharan et al., Science 319:1668-1672 (2008)), fusionado en sarcoma o transubicado en liposarcoma (FUS/TLS) (Kwiatkowski et al., Science 323:1205-1208 (2009); Vance et al., Science 323:1208-1211 (2009)), y optineurin (OpTN) (Maruyama et al., Nature 465:223-226 (2010)). El FUS/TLS es una proteína de unión al ácido nucleico en la que, cuando se muta, puede causar un subconjunto de ELAf y también puede aumentar el riesgo de padecer la enfermedad esporádica. Aunque el FUS/TLS se encuentra por lo normal predominantemente en el núcleo, las formas mutantes patógenas de FUS/TLS pasan, y las inclusiones de forma, al citoplasma de las neuronas motoras espinales afectadas o la glía.
Los estudios de estos genes han proporcionado información sobre los procesos bioquímicos que pueden ser fundamentales en la ELA. Los mecanismos putativos de las neuronas motoras que reconocen la toxicidad incluyen la excitotoxicidad del glutamato, el daño oxidativo, la inhibición proteosómica, la disfunción mitocondrial, el estrés RE, defectos en el transporte axonal, deficiencia de señalización del factor de crecimiento y disfunción celular glial (Rothstein et al., Ann. Neurol. 65:S3-S9 (2009); Ilieva et al., J. Cell Biol. 187:761 -772 (2009)).
Descomposición del ARNm mediado sin sentido
En las células de mamíferos, la expresión de genes codificantes proteicos requiere una serie de pasos en los que el pre-mRNA se procesa hasta ARNm en el núcleo antes de que el ARNm se traduzca en proteínas en el citoplasma. Estos pasos están sujetos a controles de calidad para garantizar que sólo el ARNm completamente procesado se exporte al citoplasma (véase, por ejemplo, Maquat et al., Cell 104:173-176 (2001)). Una forma de control de calidad, llamada vigilancia del ARNm o descomposición del ARNm mediado por sin sentido (NMD), degrada los ARNm que terminan prematuramente la traducción más de 50-55 nucleótidos después de una unión exón-exón como un medio para prevenir la síntesis de proteínas truncadas potencialmente dañinas (ver, por ejemplo, Maquat, J. Cell Sci.
118:1773-1776 (2005); Nicholson et al., Biochem. Soc. Trans. 38:1615-20 (2010)). Un número de proteínas están involucradas en NMD en las células de mamíferos, incluyendo UPF1, UPF2, Up F3, SMG1, SMG5, SMG6 y SMG7 (Wittkopp et al., Mol. Cell Biol. 29:3517-3528 (2009); Rehwinkel et al, Trends Biochem. Sci. 31:639-646 (2006); Rehwinkel et al., RNA 11:1530-1544 (2005)). Según la presente descripción, cualesquiera polipéptidos NMD se pueden utilizar para tratar la ELA en los métodos descritos en este documento.
Secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos NMD
Los métodos, usos y composiciones descritos en este documento incluyen, por ejemplo, ácidos nucleicos que codifican el polipéptido NMD UPF1. Según la presente descripción, tales ácidos nucleicos (y polipéptidos) son útiles en el tratamiento de la ELA. En algunas realizaciones, tales ácidos nucleicos tienen o incluyen una secuencia de nucleótidos como se establece en SEQ ID NO:1, o elementos de secuencia característicos de los mismos o en los mismos. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos útiles muestran al menos 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%,81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71% o 70% de identidad de secuencia general con SEQ ID NO:1. Alternativamente o además, en algunas realizaciones, los ácidos nucleicos útiles incluyen al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o más residuos contiguos que se encuentran en SEQ ID NO:1. En algunas realizaciones, se generan ácidos nucleicos útiles in vitro, en algunas realizaciones, se generan ácidos nucleicos in vivo útiles. En algunas realizaciones, se generan ácidos nucleicos útiles utilizando medios tecnológicos de ingeniería genética (por ejemplo, para la producción y/o la mutagénesis de una secuencia de referencia). Por poner sólo algunos ejemplos, en algunas realizaciones, las variantes de ácido nucleico de SEQ ID NO:1 se generan utilizando técnicas tales como mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis química aleatoria, procedimientos de eliminación de exonucleasa III y técnicas de clonación estándar. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos útiles se generan utilizando procedimientos de síntesis y/o de modificación química.
Diversos métodos de fabricación de ácidos nucleicos que son "variantes" con respecto al ácido nucleico de referencia (por ejemplo, un ácido nucleico de origen natural u otro tipo) son habituales en la técnica. Estos incluyen, por ejemplo, procedimientos en los que las secuencias de ácido nucleico obtenidas a partir de aislados naturales son modificados para generar ácidos nucleicos que codifican polipéptidos con características que mejoran su valor en aplicaciones industriales o de laboratorio. En algunas de tales realizaciones de dichos procedimientos, se genera y caracteriza un gran número de secuencias de variantes que tienen una o más diferencias de nucleótidos con respecto a la secuencia obtenida del aislado natural. Típicamente, estas diferencias de nucleótidos resultan en cambios de aminoácidos con respecto a los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos de los aislados naturales.
Por ejemplo, se pueden crear variantes utilizando una PCR propensa a errores (véase, por ejemplo, Leung et al., Technique 1:11-15, 1989; y Caldwell et al., PCR Methods Applic. 2:28-33, 1992). En la PCR propensa a errores, la PCR se realiza en condiciones en las que la fidelidad de la copia de la ADN polimerasa es baja, de modo que se obtiene una alta tasa de mutaciones puntuales a lo largo de toda la longitud del producto PCR. Brevemente, en tales procedimientos, los ácidos nucleicos que se mutan se mezclan con cebadores de la PCR, tampón de reacción, MgCl2, MnCl2, Taq polimerasa, y una concentración adecuada de dNTPS para lograr una alta tasa de mutación puntual a lo largo de toda longitud del producto PCR. Por ejemplo, la reacción se puede realizar utilizando 20 fmoles de ácido nucleico a ser mutado, 30 pmol de cada cebador PCR, un tampón de reacción compuesto por 50 mM de KCl,10 mM de Tris HCl (pH 8,3), y 0,01% de gelatina, MgCl27 mM, MnCl20,5 mM, 5 unidades de polimerasa Taq, 0,2 mM de dGTP, 0,2 mM de dATP, 1 mM de dCTP y 1 mM de dTTP. La PCR se puede realizar durante 30 ciclos de 94°C durante 1 min, 45°C durante 1 min y 72°C durante 1 min. Sin embargo, se apreciará que estos parámetros pueden variar según corresponda. Los ácidos nucleicos mutagenizados se clonan en un vector apropiado y se evalúan las actividades de los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos mutagenizados.
Las variantes también se pueden crear utilizando mutagénesis dirigida por oligonucleótidos para generar mutaciones específicas del sitio en cualquier ADN clonado de interés. La mutagénesis de oligonucleótidos se describe, por ejemplo, en Reidhaar-Olson et al., Science 241:53-57 (1988). En resumen, en tales procedimientos se sintetiza una pluralidad de oligonucleótidos bicatenario que llevan una o más mutaciones que se deben introducir al ADN clonado y se insertan en el ADN clonado para ser mutagenizados. Se recuperan clones que contienen el ADN mutagenizado y se evalúan las actividades de los polipéptidos que codifican.
Otro método para generar variantes es el montaje de la PCR. El montaje de la PCR implica la incorporación de un producto PCR a partir de una mezcla de pequeños fragmentos de ADN. Un gran número de reacciones PCR diferentes se producen en paralelo en el mismo vial, con los productos de una reacción cebando los productos de otra reacción. La PCR de montaje se describe, por ejemplo, en la Pat. de EE.UU. No. 5.965.408. Otro método de generación de variantes es la mutagénesis PCR sexual. En la mutagénesis PCR sexual, la recombinación homóloga forzada ocurre entre las moléculas de ADN de diferentes, pero altamente relacionadas, secuencias de ADN in vitro como resultado de una fragmentación aleatoria de la molécula de ADN basada en la homología de secuencia. Esto es seguido por la fijación del cruce por la extensión de cebador en una reacción PCR. La mutagénesis de la PCR sexual está escrita, por ejemplo, en Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:10747-10751 (1994).
También pueden ser creadas variantes por mutagénesis in vivo. En algunas realizaciones, las mutaciones aleatorias en una secuencia de ácido nucleico se generan propagando la secuencia en una cepa bacteriana, tal como en una cepa de E. coli, que transmite mutaciones en una o más de las vías de reparación del ADN. Estas cepas "mutadoras" tienen una tasa de mutación aleatoria más alta que la de una cepa de tipo salvaje. La propagación de una secuencia de ADN en una de estas cepas generará mutaciones aleatorias dentro del ADN. Las cepas mutadoras adecuadas para su uso para la mutagénesis in vivo se describen, por ejemplo, en la Publicación PCT No. WO 91/16427.
También se pueden generar variantes utilizando mutagénesis de casete. En la mutagénesis de casete, una pequeña región de una molécula de ADN bicatenario se reemplaza por un "casete" de oligonucleótido sintético que difiere de la secuencia nativa. El oligonucleótido a menudo contiene una secuencia nativa completa y / o parcialmente aleatoria. La mutagénesis recursiva del conjunto también se puede utilizar para generar variantes. La mutagénesis recursiva del conjunto es un algoritmo para la ingeniería de proteínas (es decir, mutagénesis de proteínas) desarrollada para producir diversas poblaciones de mutantes fenotípicamente relacionados cuyos miembros difieren en la secuencia de aminoácidos. Este método utiliza un mecanismo de retroalimentación para controlar rondas sucesivas de mutagénesis combinatoria de casete. La mutagénesis de conjuntos recursivos se describe, por ejemplo, en Arkin et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 89:7811 -7815 (1992).
En algunas realizaciones, se crean variantes utilizando mutagénesis de conjunto exponencial. La mutagénesis de conjunto exponencial es un procedimiento para generar bibliotecas combinatorias con un alto porcentaje de mutantes únicos y funcionales, en el que pequeños grupos de residuos se aleatorizan en paralelo para identificar, en cada posición alterada, aminoácidos que conducen a proteínas funcionales. La mutagénesis de ensamblaje exponencial se describe, por ejemplo, en Delegrave et al., Biotech. Res. 11:1548-1552 (1993). La mutagénesis aleatoria y dirigida por el sitio se describen, por ejemplo, en Arnold, Curr. Opin. Biotech. 4:450-455 (1993). En algunas realizaciones, se crean variantes utilizando procedimientos de barajado en los que porciones de una pluralidad de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos distintos se fusionan para crear secuencias de ácido nucleico quimérico que codifican polipéptidos quiméricos como se describe, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. Nos. 5.965.408 y 5.939.250.
En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos para su uso de acuerdo con la presente descripción comprenden residuos de nucleótidos de origen natural. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos para su uso de acuerdo con la presente descripción incluyen uno o más "análogos" de nucleótidos. Un análogo de nucleótido es un nucleótido (es decir, una entidad que se incorpora a un polímero de ácido nucleico sin alterar significativamente la estructura y/o función de ese polímero) cuya estructura química difiere de la de los residuos de referencia de ácidos ribonucleicos o desoxirribonucleicos naturales adenina, guanina, citosina, timina y uracilo. En algunas realizaciones, un análogo de nucleótido difiere de su nucleótido de referencia en el resto base, el resto azúcar y/o la estructura de fosfato. En algunas realizaciones, un análogo de nucleótido contribuye a una o más características alteradas en un polímero de ácido nucleico en el que se incorpora en comparación con un polímero de ácido nucleico comparable que contiene su nucleótido de referencia en lugar del análogo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, dicho polímero que contiene el análogo muestra mejores estabilidad, hibridación y/o solubilidad.
En algunas realizaciones, las alteraciones del resto de la base que se encuentran en los análogos de nucleótidos incluyen desoxiuridina para la desoxitimidina y 5-metil-2'-desoxicitidina o 5-bromo-2'-desoxicitidina para la desoxicitodina. En algunas realizaciones, las alteraciones del resto del azúcar que se encuentran en los análogos de nucleótidos incluyen la modificación del 2'-hidroxilo del azúcar de ribosa para formar azúcares de 2'-O-metilo o 2'-O-alilo. En algunas realizaciones, las alteraciones de la estructura de la desoxirribosa fosfato que se encuentran en los análogos de nucleótidos incluyen ácidos nucleicos de morfonilo, en los que cada resto base se une a un anillo de seis miembros de morfolino o ácidos nucleicos peptídicos, en los que la estructura de desoxifosfato se sustituye por una estructura de pseudopéptido y se conservan las cuatro bases (véase, por ejemplo, Summerton et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7:187-195 (1997); Hyrup et al., Bioorgan. Med. Chem. 4:5-23(1996)). Alternativa o adicionalmente, los análogos de nucleótidos pueden tener una estructura de fosfotioato o fosfoditioato, un fosforoamidito o una estructura de fosfotriester de alquilo.
En algunos casos, un polinucleótido UPF1 o variante para su uso de acuerdo con la presente descripción incluye alteraciones de codón o codones para optimizar la expresión en una célula huésped determinada. Por ejemplo, para la expresión en E. coli, un polinucleótido o variante NMP puede incluir uno o más codones alterados como se describe, por ejemplo, en Grosjean et al., Gene 18:199-209 (1982).
Polipéptidos NMD
Los métodos, usos y composiciones descritos utilizan el polipéptido NMD UPF1. Según la presente descripción, este polipéptido es útil en el tratamiento de la ELA. En algunas realizaciones, tal polipéptido útil en la práctica de la presente descripción tiene o incluye la secuencia de aminoácidos que se establece en SEQ ID NO:2, o elementos de secuencia característicos de la misma o en la misma. En algunas realizaciones, los polipéptidos útiles muestran al menos 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%,82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71% o 70% de identidad de secuencia global con s Eq ID NO:2. Alternativa o adicionalmente, en algunas realizaciones, los polipéptidos útiles incluyen al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100 o 150 o más residuos de aminoácidos contiguos que se encuentran en SEQ ID NO:2. En algunas realizaciones, el polipéptido útil difiere de su polipéptido de referencia (por ejemplo, un polipéptido que tiene o incluye una secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO:2, o elementos de secuencia característicos de los mismos o en el mismo) por uno o más residuos de aminoácidos. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la diferencia es una sustitución conservadora o no conservadora de uno o más residuos de aminoácidos. Las sustituciones conservadoras son aquellas que sustituyen un aminoácido dado en un polipéptido por otro aminoácido de características similares. Las sustituciones conservadoras típicas comportan los siguientes reemplazos: reemplazo de un aminoácido alifático, como alanina, valina, leucina y isoleucina, con otro aminoácido alifático; reemplazo de una serina con una treonina o viceversa; la sustitución de un residuo ácido, como el ácido aspártico y el ácido glutámico, por otro residuo ácido; la sustitución de un residuo que lleve un grupo de amida, como la asparagina y la glutamina, por otro residuo que lleve un grupo de amida; el intercambio de un residuo básico, como la lisina y la arginina, por otro residuo básico; y la sustitución de un residuo aromático, como la fenilalanina y la tirosina, por otro residuo aromático.
En algunas realizaciones, los polipéptidos UPF1 incluyen un grupo sustitutivo en uno o más residuos de aminoácidos. Otros polipéptidos útiles están asociados (por ejemplo, fusionados, vinculados o acoplados) con otro resto (por ejemplo, un péptido o molécula). Por ejemplo, los polipéptidos UPF1 útiles se pueden fusionar, vincular o acoplar a una secuencia de aminoácidos (por ejemplo, una secuencia líder, una secuencia secretora, una secuencia de proproteínas, un segundo polipéptido o una secuencia que facilite la purificación, el enriquecimiento o la estabilización del polipéptido). En otras determinadas realizaciones, el polipéptido incluye un agente de reconocimiento, por ejemplo, el agente de reconocimiento descrito en este documento.
Se conocen diversos métodos de fabricación de polipéptidos en la técnica y se pueden utilizar para preparar polipéptidos NMD como el UPF1. Por ejemplo, los polipéptidos NMD pueden ser producidos de forma recombinante mediante la utilización de un sistema de células huésped diseñado para expresar un ácido nucleico que codifique un polipéptido NMD (por ejemplo, el ácido nucleico descrito en este documento). Alternativa o adicionalmente, el polipéptido NMD se puede producir activando un gen endógeno (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un polipéptido NMD presente endógenamente en una célula). Alternativa o adicionalmente, el polipéptido NMD puede ser parcial o totalmente preparado por síntesis química. Alternativa o adicionalmente, el polipéptido NMD puede ser purificado a partir de fuentes naturales.
Cuando se produce de forma recombinante un polipéptido UPF1, se puede utilizar cualquier sistema de expresión. Los sistemas de expresión conocidos incluyen, entre otros, por ejemplo, células de huevo, baculovirus, plantas, levaduras o mamíferos.
En algunas realizaciones, el polipéptido UPF1 adecuado para su uso en los métodos descritos en este documento se produce en células de mamíferos. Ejemplos no limitativos de células de mamíferos que se pueden utilizar incluyen la línea de mieloma del ratón BALB/c (NSO/l, ECACC No: 85110503); retinoblastos humanos (PER.C6, CruCell, Leiden, Países Bajos); línea CVI renal de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea renal embrionaria humana (células 293 o 293 subclonadas para su crecimiento en el cultivo de la suspensión, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59,1977); línea celular de fibrosarcoma humano (por ejemplo, HT1080); células renales de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino /-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. uSa , 77:4216, 1980); células sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251, 1980); células renales de monos (CV1 ATCC CCL 70); células renales de monos verdes africanos (VERO-76, ATCC CRL-1 587); células de carcinoma cervical humano (HeLa, ATCC CCL 2); células renales caninas (MDCK, ATCC CCL 34); células hepáticas de rata de búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68, 1982); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2).
Agentes de reconocimiento
Un agente NMD descrito en este documento se puede proporcionar en asociación con un agente de reconocimiento y/o puede incluirlo. El agente NMD utilizado en los métodos de la invención, para su uso en el tratamiento de acuerdo con la invención o en la composición farmacéutica para su uso en el tratamiento según la invención es un polipéptido UPF1 o un ácido nucleico que codifica un polipéptido UPF1.
La presente descripción no se limita a ningún agente de reconocimiento particular, y se puede utilizar una variedad de agentes de reconocimiento. Ejemplos de estos agentes de reconocimiento incluyen, entre otros, ácidos nucleicos (por ejemplo, ARN y ADN), polipéptidos (por ejemplo, ligandos receptores, péptidos de señal, avidina, proteína A y proteínas de unión de antígeno), polisacáridos, biotina, grupos hidrófobos, grupos hidrófilos, fármacos y cualquier molécula orgánica que se una a las células diana o a los tejidos diana (por ejemplo, receptores de células diana o tejidos diana).
Los agentes de reconocimiento se pueden asociar con agentes NMD de varias maneras. Por ejemplo, los agentes de reconocimiento de polipéptidos se pueden acoplar o fusionar a un polipéptido NMD. En otras realizaciones, el agente de reconocimiento está asociado (por ejemplo, unidos covalente o no covalentemente) a un agente NMD con un enlazante corto (por ejemplo, acoplamiento directo), medio (por ejemplo, utilizando enlaces bifuncionales de moléculas pequeñas como SPDP (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, Ill.)) o largos (por ejemplo, enlaces bifuncionales PEG (Nektar Therapeutics, Inc., San Carlos, California)).
En algunos casos, los agentes de reconocimiento son o comprenden proteínas de unión a antígenos o anticuerpos o porciones de unión de los mismos. Se pueden generar anticuerpos para permitir la focalización específica de antígenos o inmunogenes (por ejemplo, antígenos específicos de células diana o tejido diana). Tales anticuerpos incluyen, entre otros, anticuerpos policlonales; anticuerpos monoclonales o sus fragmentos de unión a antígeno; anticuerpos modificados como anticuerpos quiméricos, anticuerpos remodelados, o anticuerpos humanizados, o fragmentos de los mismos (por ejemplo, Fv, Fab', Fab, F(ab')2); o anticuerpos biosintéticos, por ejemplo, anticuerpos monocatenarios, anticuerpos de dominio único (DAB), Fvs o Fvs monocatenarios (scFv) (véase, por ejemplo, en Harlow et al., Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol I. Cold Spring Harbor Laboratory (Dic, 1, 1998). Zola, Monoclonal Antibodies: Preparation and Use of Monoclonal Antibodies and Engineered Antibody Derivatives, Springer Verlag (15 de diciembre de 2000; 1a edición)). La unión de anticuerpos se puede realizar por cualquier método conocido, por ejemplo, mediante una unión covalente estándar a grupos de aminas libres (véase, por ejemplo, Torchilin et al., Hybridoma 6:229-240 (1987); Torchilin et al, Biochim. Biophys. Acta 1511:397-411 (2001); Masuko et al., Biomacromol. 6:800-884 (2005)).
En algunos casos, el agente de reconocimiento es o comprende un ácido nucleico (por ejemplo, ARN o ADN). En algunos ejemplos, los agentes de reconocimiento de ácido nucleico están diseñados para hibridarse mediante el emparejamiento de bases con un ácido nucleico determinado (por ejemplo, ADN cromosómico, ARNm o ARN ribosómico). En algunas situaciones, los agentes de reconocimiento de ácido nucleico se unen a un ligando en una célula diana o tejido diana. Por ejemplo, un ácido nucleico puede unirse al factor de crecimiento del nervio humano (Binkley et al., Nucl. Acids Res. 23:3198-205 (1995)). Los ácidos nucleicos que unen ligandos se identifican mediante métodos conocidos, como los procedimientos SELEX (véase, por ejemplo, los documentos Pat. de EE.UU.
N25.475.096; 5.270.163; y 5.475.096; y WO 97/38134; WO 98/33941; y WO 99/07724). En algunas realizaciones, los agentes de reconocimiento pueden ser o comprender aptámeros, por ejemplo, que se unan a secuencias particulares.
En algunas realizaciones, el agente de reconocimiento se une a un receptor en la superficie de una célula cerebral para facilitar la captación celular. Por ejemplo, el agente de reconocimiento puede ser manosa-6-fosfato (M6P), oligosacáridos bis-fosforilados, o IGF-II, que son útiles para detectar al receptor de la manona-6-fosfato independiente del catión (CI-MPR) en una célula cerebral. En algunas realizaciones, el agente de reconocimiento es o comprende ascorbato, que es tomado por un transportador de la vitamina C dependiente del sodio (SVCT2), (véase, por ejemplo, Tsukaguchi et al., Nature 399:70-75 (1999)), que es útil para reconocer una célula cerebral. Administración terapéutica
Los agentes NMD (por ejemplo, polinucleótidos NMD, un ácido nucleico que codifique un polipéptido NMD o un agente que aumente el nivel y/o la actividad del polipéptido NMD) descritos en el presente documento se pueden utilizar para tratar la ELA, por ejemplo, sujetos que sufren o son susceptibles de sufrir ELA. El agente NMD para su uso en el tratamiento según la invención o en la composición farmacéutica para su uso en el tratamiento según la invención es un polipéptido UPF1 o un ácido nucleico que codifica un polipéptido UPF1. La ruta y/o el modo de administración del agente NMD descrito en este documento pueden variar dependiendo de los resultados deseados. Todo experto en la técnica, por ejemplo, los médicos, son conscientes de que los regímenes de dosificación se pueden ajustar para proporcionar la respuesta deseada, por ejemplo, una respuesta terapéutica.
Las vías de administración incluyen, entre otras, intradérmicas, intramusculares, intraperitoneales, intravenosas, subcutáneas, intranasales, epidurales, orales, sublinguales, intracerebrales, intratecales, intravaginales, transdérmicas, rectales, por inhalación o tópicas, particularmente en los oídos, nariz, ojos o piel. El modo de administración queda a discreción del practicante.
En algunos casos, el agente NMD descrito en este documento (por ejemplo, una formulación farmacéutica de un agente NMD) puede cruzar eficazmente la barrera hematoencefálica y entrar en el cerebro. En otros casos, el agente NMD puede ser administrado utilizando técnicas diseñadas para permitir o para mejorar la capacidad de la formulación para cruzar la barrera hematoencefálica. Estas técnicas se conocen en la técnica (por ejemplo, WO 89/10134; Cloughesy et al., J. Neurooncol. 26:125-132 (1995); y Begley, J. Pharm. Pharmacol. 48:136-146 (1996)). Los componentes de una formulación también se pueden modificar (por ejemplo, químicamente) usando métodos conocidos en la técnica para facilitar su entrada en el SNC.
Por ejemplo, los métodos físicos de transporte de composiciones a través de la barrera hematoencefálica incluyen, entre otros, eludir la barrera hematoencefálica por completo, o mediante la creación de aberturas en la barrera hematoencefálica. Los métodos de elusión incluyen, entre otros, la inyección directa en el cerebro (ver, por ejemplo, Papanastassiou et al., Gene Therapy 9: 398-406 (2002)) e implantar un dispositivo de administración en el cerebro (ver, por ejemplo, Gill et al., Nature Med. 9: 589- 595 (2003); y Glia Wafers®, Guildford Pharmaceutical). Los métodos para crear aberturas en la barrera incluyen, entre otros, ultrasonido (ver, por ejemplo, la Publicación de Patente de EE.UU. No. 2002/0038086), presión osmótica (por ejemplo, por administración de manitol hipertónico (Neuwelt, E. A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Vols 1 & 2, Plenum Press, N.Y. (1989), permeabilización, por ejemplo, por bradiquinina o permeabilizador A-7 (véase, por ejemplo, los documentos Pat. de EE.UU. Nos. 5.112.596, 5.268.164, 5.506.206 y 5.686.416), y la transfección de neuronas que se extienden por la barrera hematoencefálica con vectores que contienen genes que codifican un agente NMD (véase, por ejemplo, Publ. Patente de EE.UU. N2.20030083299).
Los métodos basados en lípidos también se pueden utilizar para transportar un agente NMD a través de la barrera hematoencefálica. Los métodos ejemplares y no limitativos incluyen encapsular un agente NMD en liposomas que están acoplados al agente de reconocimiento descrito en este documento (por ejemplo, un anticuerpo que se une a los receptores en el endotelio vascular de la barrera hematoencefálica (véase, por ejemplo, Publ. Patente de EE.UU. N°. 20020025313). En otras realizaciones, el agente de reconocimiento está recubierto de partículas de lipoproteínas de baja densidad (véase, por ejemplo, la Publ. Patente de EE.UU. N°. 20040204354) o una polipoproteína E (véase, por ejemplo, Publ. Patente de EE.Uu . N°. 20040131692).
En algunas realizaciones, el agente NMD se administra al SNC de un sujeto, por ejemplo, mediante la administración en el líquido cefalorraquídeo (LCR) de un sujeto que necesita tratamiento. Tal como se utiliza en el presente documento, la administración intratecal (también conocida como inyección intratecal) se refiere a una inyección en el canal espinal (espacio intratecal que rodea la médula espinal). Se pueden utilizar varias técnicas, incluyendo, sin limitación, la inyección cerebroventricular lateral a través de un agujero de rebaba o una punción cistemal o lumbar o similares. Los métodos ejemplares se describen en Lazorthes et al., Adv. Tech. Stand. Neurosurg. 18:143-192 (1991), y Omaya, Cancer Drug Deliv. 1:169-179 (1984).
En algunos casos, el agente NMD descrito en este documento debe administrarse localmente. Esto puede lograrse, por ejemplo, mediante perfusión local durante la cirugía, aplicación tópica (por ejemplo, en una crema o loción), por inyección, por medio de un catéter, por medio de un supositorio o enema, o por medio de un implante, siendo dicho implante de un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluyendo membranas, como las membranas sialásticas, o fibras. En algunas situaciones, el agente NMD descrito en este documento se introduce en el sistema nervioso central, sistema circulatorio o tracto gastrointestinal por cualquier vía adecuada, incluyendo inyección intraventricular, inyección intratecal, inyección paraspinal, inyección epidural, enema y por inyección adyacente a un nervio periférico.
Específicamente, se pueden utilizar varios dispositivos para la entrega intratecal de los agentes NMD descritos en este documento. En algunas realizaciones, el dispositivo para la administración intratecal contiene un puerto de entrada de fluidos (por ejemplo, un puerto inyectable); un cuerpo hueco (por ejemplo, un catéter) que tiene un primer orificio de flujo en comunicación fluida con el puerto de entrada del fluido y un segundo orificio de flujo configurado para su inserción en la médula espinal; y un mecanismo de aseguramiento para asegurar la inserción del cuerpo hueco en la médula espinal. Se pueden utilizar otros dispositivos para efectuar la administración intratecal de una composición terapéutica. Por ejemplo, las formulaciones que contienen agentes NMD se pueden administrar utilizando un reservorio de Ommaya que es común que se utilice para la administración intratecal de medicamentos para la carcinomatosis meníngea (Lancet 2: 983-84, 1963). Más específicamente, el tubo ventricular debe ser insertado a través de un agujero formado en el cuerno anterior y debe ser conectado a un depósito Ommaya instalado bajo el cuero cabelludo, y el depósito debe ser perforado subcutáneamente para entregar intratecalmente el agente nMd , que se inyecta en el depósito. Otros dispositivos para la administración intratecal de composiciones terapéuticas o formulaciones a un individuo se describen en el documento Pat. de EE.UU. No 6.217.552. Alternativamente, el agente NMD puede administrarse intratecalmente, por ejemplo, mediante una sola inyección o por perfusión continua. Debe entenderse que el tratamiento de dosificación puede estar en la forma de una administración de dosis única o dosis múltiples.
En algunas realizaciones, la administración intratecal se puede realizar mediante punción lumbar (es decir, bolo lento) o a través de un sistema de administración de catéter de puerto (es decir, perfusión o bolo).
En relación con la administración intravenosa, el volumen de dosis única adecuado para la administración intratecal suele ser pequeño. Típicamente, la administración intratecal mantiene el equilibrio de la composición del LCR, así como la presión intracraneal del sujeto. En algunas realizaciones, la administración intratecal se realiza sin la retirada correspondiente del LCR en el sujeto. En algunas realizaciones, un volumen de dosis única adecuado puede ser, por ejemplo, inferior a aproximadamente 10 ml, 8 ml, 6 ml, 5 ml, 4 ml, 3 ml, 2 ml, 1,5 ml, 1 ml o 0,5 ml. En algunas realizaciones, el volumen de dosis única adecuado puede ser de aproximadamente 0,5-5 ml, 0,5-4 ml, 0,5-3 ml, 0,5-2 ml, 0,5-1 ml, 1-3 ml, 1-5 ml, 1,5-3 ml, 1-4 ml o 0,5-1,5 ml. En algunas realizaciones, la administración intratecal de acuerdo con el presente invento implica una cantidad deseada de LCR que se retirará primero. En algunas realizaciones, menos de aproximadamente 10 ml (p. ej., menos de aproximadamente 9 ml, 8 ml, 7 ml, 6 ml, 5 ml, 4 ml, 3 ml, 2 ml, 1 ml) de LCR se retirará primero antes de la administración intratecal. En esos casos, el volumen de dosis única adecuado puede ser, por ejemplo, superior a aproximadamente 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 7 ml, 8 ml, 9 ml, 10ml, 15 ml, o 20 ml.
La administración pulmonar también se puede emplear, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador, y formulación con un agente aerosolizante, o mediante perfusión en un fluorocarbono o un tensioactivo pulmonar sintético.
El agente NMD descrito en este documento puede formularse como una composición farmacéutica que incluya una cantidad adecuada de un excipiente fisiológicamente aceptable (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences pp. 1447-1676 (Alfonso R. Gennaro, ed., 19a ed. 1995)). Estos excipientes fisiológicamente aceptables pueden ser, por ejemplo, líquidos, como agua y aceites, incluidos los de origen petrolero, animal, vegetal o sintético, como el aceite de cacahuete, el aceite de soja, el aceite mineral, el aceite de sésamo y similares. Los excipientes fisiológicamente aceptables pueden ser solución salina, goma acacia, gelatina, pasta de almidón, talco, queratina, sílice coloidal, urea y similares. Además, se pueden utilizar agentes auxiliares, estabilizadores, espesantes, lubricantes y colorantes. En una situación, los excipientes fisiológicamente aceptables son estériles cuando se administran a un animal. El excipiente fisiológicamente aceptable debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe preservarse contra la acción contaminante de los microorganismos. Las soluciones salinas de soluciones acuosas de dextrosa y glicerol también se pueden emplear como excipientes líquidos, especialmente para soluciones inyectables. Los excipientes fisiológicamente aceptables adecuados también incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel sílice, estearato sódico, glicerol monoestearato, talco, cloruro de sodio, leche desnatada seca, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. Otros ejemplos de excipientes fisiológicamente aceptables adecuados se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences pp.
1447-1676 (Alfonso R. Gennaro, ed., 19a ed. 1995). Las composiciones farmacéuticas, si se desean, también pueden contener pequeñas cantidades de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tampón del pH.
Los portadores de líquidos se pueden utilizar en la preparación de soluciones, suspensiones, emulsiones, jarabes y elixires. El agente NMD descrito en este documento puede ser suspendido en un portador de líquidos farmacéuticamente aceptable como agua, un disolvente orgánico, una mezcla de ambos, o aceites o grasas farmacéuticamente aceptables. El portador líquido puede contener otros aditivos farmacéuticos adecuados, incluidos solubilizantes, emulsionantes, tampones, conservantes, edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes de suspensión, agentes espesantes, colores, reguladores de la viscosidad, estabilizantes u osmoreguladores. Ejemplos adecuados de portadores de líquidos para la administración oral y parenteral incluyen agua (particularmente conteniendo los aditivos descritos en este documento, por ejemplo, derivados de celulosa, incluyendo solución de carboximetilcelulosa sódica), alcoholes (incluyendo alcoholes monohídricos y alcoholes polihídricos, por ejemplo, glicoles) y sus derivados, y aceites (por ejemplo, aceite de coco fraccionado y aceite de araquis). Para la administración parenteral el portador también puede ser un éster aceitoso como el oleato etílico y el miristato de isopropilo. Los portadores de líquidos pueden estar en forma líquida estéril para su administración. El portador líquido para composiciones presurizadas puede ser un hidrocarburo halogenado u otro propelente farmacéuticamente aceptable.
En otros casos, el agente NMD descrito en este documento está formulado para su administración intravenosa. Las composiciones para administración intravenosa pueden comprender un tampón acuoso isotónico estéril. Las composiciones también pueden incluir un agente solubilizante. Las composiciones para la administración intravenosa pueden incluir opcionalmente un anestésico local como la lidocaína para disminuir el dolor en el lugar de la inyección. Los ingredientes se pueden suministrar por separado o mezclarse en una forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado sin agua en un recipiente herméticamente sellado como una ampolla o un sobre que indique la cantidad de agente activo. Cuando un agente NMD descrito en este documento deba administrarse por perfusión, se puede dispensar, por ejemplo, con un frasco de perfusión que contenga agua estéril de grado farmacéutico o una solución salina. Cuando un agente NMD descrito en este documento se administre por inyección, se puede proporcionar una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina para que los ingredientes se puedan mezclar antes de la administración.
El agente NMD descrito en este documento se puede administrar rectal o vaginalmente en la forma de un supositorio convencional. Las formulaciones en supositorio se pueden preparar utilizando métodos conocidos por los expertos en la técnica a partir de materiales tradicionales, incluyendo manteca de cacao, con o sin la adición de ceras para alterar el punto de fusión del supositorio, y glicerina. También se pueden utilizar bases de supositorios solubles en agua, como polietilenglicol de diversos pesos moleculares.
La cantidad del agente NMD descrito en este documento que es eficaz para el tratamiento de la ELA se puede determinar utilizando técnicas clínicas estándar conocidas por los expertos en la técnica. Además, los ensayos in vitro o in vivo se pueden emplear opcionalmente para ayudar a identificar intervalos de dosificación óptimos. La dosis precisa a emplear también puede depender de la vía de administración, la condición, la gravedad de la condición que se está tratando, así como varios factores físicos relacionados con la persona que está siendo tratada, y se puede decidir según al juicio del profesional de la salud.
Las composiciones descritas en el presente documento (por ejemplo, las cantidades terapéuticamente efectivas de las composiciones descritas en el presente documento) pueden administrarse como administraciones individuales o como administraciones múltiples. Dichas composiciones se pueden administrar a intervalos regulares, dependiendo de la naturaleza, gravedad y extensión de la condición del sujeto (por ejemplo, ELA). En algunas realizaciones, la cantidad terapéuticamente eficaz de un agente terapéutico (por ejemplo, un agente NMD) se administra intratecalmente y periódicamente a intervalos regulares (por ejemplo, una vez al año, una vez cada seis meses, una vez cada cinco meses, una vez cada tres meses, bimestralmente (una vez cada dos meses), mensualmente (una vez al mes), quincenalmente (una vez cada dos semanas), o semanalmente).
Tal y como se usa en el presente documento, la expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se determina en gran medida sobre la base de la cantidad total del agente terapéutico contenido en las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento. Generalmente, la cantidad terapéuticamente efectiva es suficiente para lograr un beneficio significativo para un sujeto (por ejemplo, tratar, modular, curar, prevenir y/o mejorar la ELA). Por ejemplo, la cantidad terapéuticamente eficaz puede ser una cantidad suficiente para lograr el efecto terapéutico y/o profiláctico deseado, tal como una cantidad suficiente para tratar la ELA o sus síntomas. Generalmente, la cantidad del agente terapéutico (por ejemplo, un agente NMD) administrado al sujeto necesitado de éste dependerá de las características del sujeto. Tales características incluyen la condición, gravedad de la enfermedad, estado de salud general, edad, sexo y peso corporal del sujeto. Todo experto en la técnica será capaz de determinar fácilmente las dosis adecuadas dependiendo de estos y otros factores relacionados. Además, pueden emplearse opcionalmente ensayos dianas y subjetivos para identificar intervalos de dosificación óptimos. La cantidad terapéuticamente eficaz se puede administrar en un régimen de dosificación que puede incluir múltiples dosis unitarias.
En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz oscila entre aproximadamente 0,005 mg/kg de peso cerebral a 500 mg/kg de peso cerebral, por ejemplo, de aproximadamente 0,005 mg/kg de peso cerebral a 400 mg/kg de peso cerebral, desde aproximadamente 0,005 mg/kg de peso cerebral hasta 300 mg/kg de peso cerebral, desde aproximadamente 0,005 mg/kg de peso cerebral hasta 200 mg/kg de peso cerebral, desde aproximadamente 0,005 de peso cerebral a 100 mg/kg de peso cerebral, desde aproximadamente 0,005 mg/kg de peso cerebral hasta 90 mg/kg de peso cerebral, desde aproximadamente 0,005 mg/kg de peso cerebral hasta 80 mg/kg de peso cerebral, , desde aproximadamente 0,005 mg/kg de peso cerebral hasta 70 mg/kg de peso cerebral, desde aproximadamente 0,005 mg/kg de peso cerebral hasta 60 mg/kg de peso cerebral, desde aproximadamente 0,005 mg/kg de peso cerebral hasta 50 mg/kg de peso cerebral, desde aproximadamente 0,005 mg/kg de peso cerebral hasta 40 mg/kg de peso cerebral, de aproximadamente 0,005 mg/kg de peso cerebral a 30 mg/kg de peso cerebral, desde aproximadamente 0,005 mg/kg de peso cerebral hasta 25 mg/kg de peso cerebral, desde aproximadamente 0,005 mg/kg de peso cerebral hasta 20 mg/kg de peso cerebral, desde aproximadamente 0,005 mg/kg de peso cerebral hasta 15 mg/kg de peso cerebral, desde aproximadamente 0,005 mg/kg de peso cerebral hasta 10 mg/kg de peso cerebral.
En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz es mayor que aproximadamente 0,1 mg/kg de peso cerebral, mayor que aproximadamente 0,5 mg/kg de peso cerebral, mayor que aproximadamente 1,0 mg/kg de peso cerebral, mayor que aproximadamente 3 mg/kg de peso cerebral, mayor que aproximadamente 5 mg/kg de peso cerebral, mayor que aproximadamente 10 mg/kg de peso cerebral, mayor que aproximadamente 15 mg/kg de peso cerebral, mayor que aproximadamente 20 mg/kg de peso cerebral, mayor que aproximadamente 30 mg/kg de peso cerebral, mayor que aproximadamente 40 mg/kg de peso cerebral, mayor que aproximadamente 50 mg/kg de peso cerebral, mayor que aproximadamente 60 mg/kg de peso cerebral, mayor que aproximadamente 70 mg/kg de peso cerebral, mayor que aproximadamente 80 mg/kg de peso cerebral, mayor que aproximadamente 90 mg/kg de peso cerebral, mayor que aproximadamente 100 mg/kg de peso cerebral, mayor que aproximadamente 150 mg/kg de peso cerebral, mayor que aproximadamente 200 mg/kg de peso cerebral, mayor que aproximadamente 250 mg/kg de peso cerebral, mayor que aproximadamente 300 mg/kg de peso cerebral, mayor que aproximadamente 400 mg/kg de peso cerebral, mayor que aproximadamente 450 mg/kg de peso cerebral, mayor que aproximadamente 500 mg/kg de peso cerebral.
En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz se puede expresar como mg/kg de peso corporal. Como todo experto en la técnica apreciaría, los pesos cerebrales y los pesos corporales pueden estar correlacionados (véase, por ejemplo, Dekaban, Ann. Neurol. 4:345-56 (1978)).
En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz puede expresarse como mg/15 cc de líquido cefalorraquídeo. Como apreciarían los expertos en la técnica, las dosis terapéuticamente efectivas basadas en pesos cerebrales y pesos corporales se pueden convertir en mg/15 cc de LCR. Por ejemplo, el volumen de LCR en humanos adultos es de aproximadamente 150 ml (Johanson et al., Cerebroespinal Fluid Res. 14:5:10 (2008)). Por lo tanto, las inyecciones monodosis de 0,1 mg a 50 mg de proteína en adultos serían de aproximadamente 0,01 mg/15 cc de LCR (0,1 mg) a 5,0 mg/15 cc de dosis de LCR (50 mg) en adultos.
Debe entenderse además que para cualquier sujeto en particular, los regímenes de dosificación específicos se pueden ajustar con el tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de un agente NMD y que los intervalos de dosificación establecidos en este documento son ejemplares solamente y no están destinados a limitar el alcance o la práctica de la invención reivindicada.
En algunos casos, la composición farmacéutica descrita en este documento está en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como una tableta, cápsula, polvo, solución, suspensión, emulsión, gránulo, o supositorio. En tal forma, la composición farmacéutica se puede subdividir en dosis unitarias que contengan cantidades apropiadas de un agente NMD descrito en este documento. La forma de dosificación unitaria puede ser un paquete de una composición farmacéutica, por ejemplo, polvos envasados, viales, ampollas, jeringas precargadas o sobres que contienen líquidos. La forma de dosificación unitaria puede ser, por ejemplo, una cápsula o tableta por sí misma, o puede ser un número adecuado de cualquiera de estas composiciones en la forma de un paquete. Tal forma de dosificación unitaria puede contener de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 250 mg/kg, y se puede administrar en una sola dosis o en dos o más dosis divididas.
Terapia genética
En las realizaciones en las que el agente NMD consiste o comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido UPF1, la presente descripción incluye métodos de administración de dicho ácido nucleico a un sujeto para tratar la ELA.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica el polipéptido UPF1 se inserta en un vector viral para su administración a un sujeto. Por ejemplo, se pueden utilizar vectores retrovirales como sistema de administración recombinante para transferir ácidos nucleicos que codifican polipéptidos UPF1 in vivo (ver, por ejemplo, Dropulic, Hum. Gene Ther. 22:649-57 (2011); y Kumar et al., Curr. Gene Ther. 11:144-53 (2011)). Los retrovirus útiles en los métodos de la presente descripción incluyen, entre otros, el virus de la leucemia murina (MLV), el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el virus equino de la anemia infecciosa (EIAV), virus tumoral mamario de ratón (MMTV) virus del sarcoma de Rou (RSV), virus del sarcoma de Fujinami (FuSV), virus del osteosarcoma murino FBR (FBR MSV), virus del sarcoma murino de Moloney (Mo-MSV), el virus murino de la leucemia de Abelson (A-MLV), el virus 29 de la mielocitomatosis aviar (MC29), el virus de la eritroblastosis aviar (AEV) y todos los demás retrovirales, incluidos los lentivirus (véase, por ejemplo, Coffin et al., "Retroviruses", 1997 Cold Spring Harbor Laboratory Press Eds: J M Coffin, S M Hughes, H E Varmus, pp. 758-763)). Un retrovirus defectuoso de replicación se puede empaquetar en viriones que se pueden utilizar para infectar una célula diana mediante el uso de un virus auxiliar por técnicas estándar (ver, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M. et al. (eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Secciones 9.10-9.14).
En otras realizaciones, los vectores derivados del adenovirus se utilizan para suministrar ácidos nucleicos que codifican polipéptidos UPF1. El genoma de un adenovirus puede ser manipulado de tal manera que codifique y exprese un polipéptido UPF1, pero se inactiva en términos de su capacidad para replicarse en un ciclo de vida viral lítico normal (ver, por ejemplo, Berkner et al. (1988) BioTechniques 6:616; Rosenfeld et al. (1991) Science 252:431-434; y Rosenfeld et al. (1992) Cell 68:143-155). Los vectores adenovirales adecuados útiles en los métodos de la presente descripción incluyen los derivados de la cepa de adenovirus Ad tipo 5 d1324 u otras cepas de adenovirus (por ejemplo, Ad2, Ad3, Ad7, etc.).
En algunas realizaciones, se utiliza un virus adeno-asociado (AAV) para suministrar el ácido nucleico que codifica el polipéptido UPF1 (véase, por ejemplo, Muzyczka et al. (1992) Curr. Topics in Micro. and Immunol. 158:97-129). Se ha introducido una variedad de ácidos nucleicos en diferentes tipos de células utilizando vectores AAV (véase, por ejemplo, Hermonat et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470; Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol.
4:2072-2081; Wondisford et al. (1988) Mol. Endocrinol. 2:32-39; Tratschin et al. (1984) J. Virol. 51:611-619; y Flotte et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:3781-3790). Los AAV especialmente útiles incluyen aquellos que normalmente infectan a los seres humanos (por ejemplo, los serotipos 1, 2, 3A, 3B, 4, 5 y 6) o los primates (por ejemplo, los serotipos 1 y 4).
En otras realizaciones, los métodos no virales son útiles para suministrar un ácido nucleico que codifica un polipéptido UPF1 a un sujeto. Estos métodos no virales de transferencia de genes pueden explotar los mecanismos utilizados normalmente por las células de mamíferos para la utilización y el transporte intracelular de macromoléculas. Por ejemplo, se pueden utilizar sistemas de administración liposómicos, conjugados de polilisina y cubiertas virales artificiales. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica el polipéptido UPF1 está atrapado en liposomas que llevan cargas positivas en su superficie (por ejemplo, lipofectinas). En algunas realizaciones, el liposoma se puede conjugar con un agente de reconocimiento descrito en este documento (véase, por ejemplo, Mizuno et al. (1992) No Shinkei Geka 20:547-551).
Ciertos polímeros catiónicos ("agentes de complejidad") conocidos por unirse espontáneamente y condensar ácidos nucleicos en nanopartículas también se pueden utilizar incluyendo, por ejemplo, proteínas naturales, péptidos o derivados, así como polímeros catiónicos sintéticos como polietilenimina (PEI), polilisina (PLL), etc. Muchos polímeros útiles contienen ambos grupos amino cargables que permiten la interacción iónica con fosfato de ADN cargado negativamente, y una región degradable, como un enlace de éster hidrolizable. Ejemplos de estos incluyen, sin limitación, poli(L-ácido alfa-(4-aminobutil)-glicólico), red poli(éster de amino), y poli(ésteres de beta-amino). Estos agentes de complejación pueden proteger el ADN contra la degradación, por ejemplo, mediante nucleasas, componentes séricos, etc., y crear una carga superficial menos negativa que pueda facilitar el paso a través de membranas hidrofóbicas (por ejemplo, citoplasmática, lisosómica, endosómica, nuclear) de la célula. Ciertos agentes complejantes facilitan eventos de tráfico intracelular como escapes endosómicos, transporte citoplasmático y entrada nuclear, y pueden disociarse del ácido nucleico.
Terapia basada en células
El polinucleótido UPF1 también se puede proporcionar ventajosamente a una célula ex vivo, seguido de la administración de la célula viva al sujeto. En algunas realizaciones, las células primarias o secundarias están genéticamente diseñadas para expresar un polipéptido UPF1. Tales células se pueden obtener a partir de una variedad de tejidos e incluyen tipos celulares que se pueden mantener propagados en el cultivo. Por ejemplo, las células primarias y secundarias incluyen fibroblastos, células endoteliales, células gliales y células neuronales. En algunas realizaciones, las células primarias se obtienen a partir de un individuo al que se le va a administrar una célula primaria o secundaria genéticamente diseñada. También se pueden obtener células primarias a partir de un donante (que no sea el receptor) de la misma especie u otra especie (por ejemplo, ratón, rata, conejo, gato, perro, cerdo, vaca, pájaro, oveja, cabra, caballo).
Las células primarias o secundarias (por ejemplo, de origen vertebrado o de mamíferos) pueden ser transfectadas con un ácido nucleico que codifica un polipéptido UPF1. En algunas realizaciones, la célula es transfectada con una secuencia de ácido nucleico exógena que incluye un ácido nucleico que codifica un polipéptido UPF1 y una secuencia de ácido nucleico adicional (por ejemplo, una secuencia reguladora, por ejemplo, un promotor, que causa la expresión, por ejemplo, una expresión inducible o sobre-regulación de una secuencia UPF1 endógena). Las células primarias o secundarias transfectadas también pueden incluir un ADN que codifique un marcador seleccionable que confiera un fenotipo seleccionable, facilitando su identificación y aislamiento.
Las células que han sido modificadas para expresar una proteína recombinante para su uso en el tratamiento de enfermedades también son muy conocidas. Véase, por ejemplo, la Pat. de EE.UU. No. 5.399.346 que describe métodos para introducir un ácido nucleico en una célula humana primaria para su introducción en un ser humano. Aunque el uso de células humanas para la terapia ex vivo se prefiere en algunas realizaciones, otras células como las células bacterianas pueden ser implantadas en la vasculatura de un sujeto, liberando continuamente el agente terapéutico. Véase, por ejemplo, Pat. de EE.UU. 4.309.776 y 5.704.910.
Kits
El agente NMD descrito en este documento (por ejemplo, una composición farmacéutica que comprende un agente NMD) se puede proporcionar en un kit. En algunos casos, el kit incluye (a) un recipiente que contiene el agente NMD descrito en el presente documento (por ejemplo, una composición farmacéutica que comprende el agente NMD) y, opcionalmente (b) material informativo. El material informativo puede ser descriptivo, instructivo, comercial u otros tipos de materiales relacionados con los métodos descritos en el presente documento y/o el uso de un agente NMD, por ejemplo, para beneficio terapéutico.
El material informativo de los kits no está limitado en su forma. En algunos casos, el material informativo puede incluir información sobre la producción de un agente NMD, el peso molecular de un agente NMD, la concentración, la fecha de caducidad, la información por lotes o del sitio de producción, etc. En otras situaciones, el material informativo se refiere a un agente NMD que se debe administrar, por ejemplo, en una cantidad, forma o modo de administración adecuado (por ejemplo, una dosis, forma de dosificación o modo de administración descrito en este documento).
En algunos casos, el material informativo, por ejemplo, las instrucciones, se proporcionan impresos, por ejemplo, en un texto impreso, dibujo y/o fotografía, por ejemplo, una etiqueta o una hoja impresa. El material informativo también se puede proporcionar en otros formatos, como Braille, material informático, de grabación de vídeos o grabación de audios. En otros casos, el material informativo del kit es información de contacto, por ejemplo, una dirección física, dirección de correo electrónico, sitio web o número de teléfono, donde el usuario del kit puede obtener información sustantiva sobre el agente NMD en él y / o su uso en los métodos descritos en el presente documento. El material informativo también se puede proporcionar en cualquier combinación de formatos.
Además de un agente NMD, el kit puede incluir otros ingredientes, como un disolvente o tampón, un estabilizador o un conservante. El kit también puede incluir otros agentes, por ejemplo, un segundo o un tercer agente, por ejemplo, otros agentes terapéuticos. Los componentes se pueden proporcionar en cualquier forma, por ejemplo, líquida, seca o liofilizada. Los componentes pueden ser sustancialmente puros (aunque se pueden combinar juntos o administrarse separados entre sí) y / o estériles. Cuando los componentes se proporcionan en una solución líquida, la solución líquida puede ser una solución acuosa, tal como una solución acuosa estéril. Cuando los componentes se proporcionan como una forma seca, la reconstitución generalmente es mediante la adición de un disolvente adecuado. El disolvente, por ejemplo, agua estéril o tampón, se puede proporcionar opcionalmente en el kit.
El kit puede incluir uno o más recipientes para un agente NMD u otros agentes. En algunos casos, el kit contiene recipientes, divisores o compartimentos separados para el agente NMD y el material informativo. Por ejemplo, el agente NMD puede estar contenido en una botella, vial o jeringa, y el material informativo puede estar contenido en un manguito o paquete de plástico. En otras situaciones, los elementos separados del kit se encuentran dentro de un único recipiente no dividido. Por ejemplo, el agente NMD puede estar contenido en una botella, vial o jeringa que se haya adjuntado al material informativo en forma de una etiqueta. En algunos casos, el kit puede incluir una pluralidad (por ejemplo, un envase) de envases individuales, conteniendo cada uno una o más formas de dosificación unitaria (por ejemplo, la forma de dosificación descrita en este documento) de un agente NMD. Los recipientes pueden incluir una dosis unitaria, por ejemplo, una unidad que incluya un agente NMD. Por ejemplo, el kit puede incluir una pluralidad de jeringas, ampollas, paquetes de papel de aluminio, blísters o dispositivos médicos, por ejemplo, cada uno de los cuales conteniendo una dosis unitaria. Los recipientes de los kits pueden ser herméticos, resistentes al agua (por ejemplo, impermeables a los cambios de humedad o evaporación) y/o herméticos.
El kit puede incluir opcionalmente un dispositivo adecuado para la administración de un agente NMD, por ejemplo, una jeringa u otro dispositivo de administración adecuado. El dispositivo se puede proporcionar precargado con un agente NMD, por ejemplo, en una dosis unitaria, o puede estar vacío, pero ser adecuado para la carga.
Tratamiento de la ELA
La presente invención abarca el sorprendente hallazgo de que los agentes NMD son útiles, entre otras cosas, en el tratamiento o la prevención (es decir, retraso de la aparición) de la ELA. UPF1 fue identificado inicialmente como uno de los muchos genes capaces de restablecer la toxicidad mediada por FUS/TLS en un modelo de levadura (Ju et al., PLoS Biol. 9:e1001052 (2011)). Sin embargo, la presente constatación de que la expresión de UPF1 en células neuronales que expresan TDP-43 reduce la toxicidad celular es sorprendente, especialmente teniendo en cuenta la constatación de que la expresión de UPF1 no tuvo ningún efecto sobre los niveles en citoplasma de FUS/TLS o TDP-43 en las células neuronales. En consecuencia, en algunas realizaciones, se debe proporcionar al sistema nervioso central de un sujeto, por ejemplo, a un sujeto que sufre o es susceptible de sufrir la ELA, un agente NMD, un polipéptido UPF1 o un ácido nucleico que codifica un polipéptido UPF1. En algunas realizaciones, el agente NMD debe proporcionarse a una o más de las células diana o tejidos del cerebro, la médula espinal y/o los órganos periféricos. En algunas realizaciones, las células o tejidos diana incluyen las células o tejidos que muestran una patología, síntoma o característica asociada a la enfermedad. En algunas realizaciones, las células o tejidos diana incluyen aquellas células o tejidos en los que el TDP-43 se expresa a un nivel elevado, por ejemplo, las células en las que TDP-43 se expresa a un nivel elevado en el citoplasma de las células. Tal y como se utiliza en el presente documento, el tejido diana puede ser un tejido diana cerebral, un tejido diana de la médula espinal y/o un tejido diana periférico.
Las composiciones descritas en el presente documento se pueden proporcionar directamente en el SNC de un sujeto que sufre o está en riesgo de desarrollar ELA, logrando así una concentración terapéutica dentro de las células y tejidos afectados del SNC (por ejemplo, el cerebro). Por ejemplo, se puede proporcionar un polipéptido UPF1 o un ácido nucleico que codifica un polipéptido UPF1 a las células o tejidos diana del cerebro, la médula espinal y/o los órganos periféricos para tratar la ELA. Tal y como se utiliza en el presente documento, el término "tratar" o "tratamiento" se refiere a la mejora de uno o más síntomas asociados con la enfermedad, la prevención o el retraso de la aparición de uno o más síntomas de la enfermedad, y / o disminuir la gravedad o frecuencia de uno o más síntomas de la enfermedad.
En algunas realizaciones, el tratamiento se refiere a la mitigación parcial o completa, mejora, alivio, inhibición, retraso del inicio, reducción de la gravedad y / o incidencia del deterioro neurológico en un paciente que sufre o es susceptible de sufrir ELA. Tal y como se utiliza en el presente documento, la expresión "deterioro neurológico" incluye varios síntomas asociados con la incomunicación del sistema nervioso central (por ejemplo, el cerebro y la médula espinal). Los síntomas de deterioro neurológico pueden incluir, por ejemplo, retraso del desarrollo, deterioro cognitivo progresivo, pérdida de audición, deterioro del desarrollo del habla, déficits sensomotores, hiperactividad, agresividad y/o trastornos del sueño, entre otros.
En algunas realizaciones, el tratamiento se refiere a la disminución de la toxicidad de varias células o tejidos. En algunas realizaciones, el tratamiento se refiere a la disminución de la toxicidad neuronal debido a TDP-43 en los tejidos diana del cerebro, neuronas de la médula espinal, y / o tejidos diana periféricos. En ciertas realizaciones, la toxicidad se reduce en aproximadamente un 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% o más en comparación con un control. En algunas realizaciones, la toxicidad se reduce al menos 1 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces o 10 veces en comparación con el control. En algunas realizaciones, la toxicidad se mide mediante pruebas conocidas por los expertos en la técnica, incluidos, entre otros, los métodos de neuroimagen (por ejemplo, tomografías computarizadas CT, resonancia magnética, MRI, resonancia magnética, MRI, funcional, etc.).
En determinadas realizaciones, el tratamiento según la presente descripción da como resultado una reducción (por ejemplo, alrededor de un 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 97,5%, 99% o más de reducción) o una eliminación completa de la presencia, o alternativamente la acumulación, de uno o más marcadores patológicos, clínicos o biológicos que están asociados con la ELA. Por ejemplo, en algunas realizaciones, tras la administración a un sujeto, la composición farmacéutica descrita en este documento demuestra o logra una reducción en la pérdida muscular, la flexibilidad muscular, la debilidad muscular, la espasticidad, los reflejos anormales del tendón, el signo de Babinski, los problemas respiratorios, la debilidad facial, el habla sorda, la pérdida de percepción, la pérdida de razonamiento, la pérdida de juicio y/o la pérdida de la imaginación.
En algunas realizaciones, el tratamiento se refiere al aumento de la supervivencia (por ejemplo, el tiempo de supervivencia). Por ejemplo, el tratamiento puede resultar en un aumento de la esperanza de vida de un paciente. En algunas realizaciones, el tratamiento da como resultado un aumento de la esperanza de vida de un paciente en más de aproximadamente 5%, aproximadamente 10%, aproximadamente 15%, aproximadamente 20%, aproximadamente 25%, aproximadamente 30%, aproximadamente 35%, aproximadamente 40%, aproximadamente 45%, aproximadamente 50%, aproximadamente 55%, aproximadamente 60%, aproximadamente 65%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 100%, aproximadamente 105%, aproximadamente 110%, aproximadamente 115%, aproximadamente 120%, aproximadamente 125%, aproximadamente 130%, aproximadamente 135%, aproximadamente 140%, aproximadamente 145%, aproximadamente 150%, aproximadamente 155%, aproximadamente 160%, aproximadamente 165%, aproximadamente 170%, aproximadamente 175%, aproximadamente 180%, aproximadamente 185%, aproximadamente 190%, aproximadamente 195%, aproximadamente 200% o más, en comparación con la esperanza de vida media de uno o más individuos de control con ELA sin tratamiento. En algunas realizaciones, el tratamiento da como resultado un aumento de la esperanza de vida de un paciente en más de 6 meses, aproximadamente 7 meses, aproximadamente 8 meses, aproximadamente 9 meses, aproximadamente 10 meses, aproximadamente 11 meses, aproximadamente 12 meses, aproximadamente 2 años, aproximadamente 3 años, aproximadamente 4 años, aproximadamente 5 años, aproximadamente 6 años, aproximadamente 7 años, aproximadamente 8 años, aproximadamente 9 años, aproximadamente 10 años o más, en comparación con la esperanza de vida promedio de uno o más individuos control con ELA sin tratamiento. En algunas realizaciones, el tratamiento da como resultado una supervivencia a largo plazo de un paciente. Tal y como se utiliza en el presente documento, la expresión "supervivencia a largo plazo" se refiere a un tiempo de supervivencia o esperanza de vida más largo que aproximadamente 40 años, 45 años, 50 años, 55 años, 60 años o más.
El término "mejorar", "aumentar" o "reducir", tal como se usa en el presente documento, indica valores relativos a un control. En algunas realizaciones, el control adecuado es una medida basal, tal como una medición en el mismo individuo antes del inicio del tratamiento descrito en el presente documento, o una medición en un individuo de control (o individuos múltiples control) en ausencia del tratamiento descrito en el presente documento. Un "individuo control" es un individuo afectado por el ELA, que tiene aproximadamente la misma edad y/o género que la persona que está siendo tratada (para asegurar que las etapas de la enfermedad en el individuo tratado y el individuo o individuos de control son comparables).
El individuo (también conocido como "paciente" o "sujeto") que recibe el tratamiento es un individuo (feto, bebé, niño, adolescente o humano adulto) que tiene ELA o que tiene el potencial de desarrollar ELA. En algunos casos, el sujeto a tratar está genéticamente predispuesto a desarrollar ELA. Por ejemplo, el sujeto a tratar tiene una mutación en un gen ALS2, gen VAPB, gen SETX, gen TDP-43, gen FUS/TLS y/o gen OPTN.
Terapia combinada
En algunas realizaciones, el agente NMD descrito en este documento debe administrarse a un sujeto en combinación con una o más terapias adicionales para tratar la ELA o uno o más síntomas de la ELA. Por ejemplo, el agente NMD se puede administrar en combinación con riluzol (Rilutek®, Sanofi-Aventis, Bridgewater, NJ), baclofeno, diazepam, trihexifenidilo o amitriptilina.
En algunas realizaciones, la administración combinada del agente NMD y el segundo agente da como resultado una mejora en la ELA o un síntoma de la misma en un grado mayor que el producida por el agente NMD o el segundo agente solo. La diferencia entre el efecto combinado y el efecto de cada agente por sí solo puede ser una diferencia estadísticamente significativa.
En algunas realizaciones, la administración combinada del agente NMD y el segundo agente permite la administración del segundo agente a una dosis reducida, a un número menor de dosis, y / o a una menor frecuencia de dosificación en comparación con el régimen de dosificación estándar aprobado para el segundo agente. Por ejemplo, el régimen aprobado estándar para el Rilutek® es 50 mg cada 12 horas. En consecuencia, para la administración en combinación con un agente NMD, la cantidad terapéuticamente eficaz de Rilutek® puede ser una dosis de menos de aproximadamente 50 mg y/o una frecuencia mayor que aproximadamente cada 12 horas.
En algunas realizaciones, el agente inmunosupresor conocido por el experto se puede administrar a un sujeto en combinación con un polipéptido UPF1 descrito en este documento. Los agentes inmunosupresores ejemplares incluyen, entre otros, ciclosporina, FK506, rapamicina, CTLA4-Ig, agentes anti-TNF (como el etanercept), daclizumab (p. ej., Zenapax™), agentes anti-CD2, agentes anti-CD4 y agentes anti-CD40.
Métodos de identificación de moduladores de la expresión o actividad de polipéptidos NMD
Los polipéptidos NMD descritos en este documento (por ejemplo, los polipéptidos UPF1, UPF2, UPF3, SMG1, SMG5, SMG6 o SMG7) son útiles para identificar agentes que pueden utilizarse potencialmente para tratar la ELA. Por ejemplo, un agente que aumenta la expresión o la actividad de un polipéptido NMD se puede identificar como un agente que se puede utilizar para tratar la ELA. Existen métodos numéricos para evaluar si un agente altera la expresión de polipéptido NMD o la actividad o nivel de los polipéptidos NMD. La capacidad de un agente de prueba para modular (por ejemplo, aumentar o disminuir) la expresión (por ejemplo, de forma permanente o temporal) de un promotor de polinucleótidos NMD puede ser evaluada, por ejemplo, por el ensayo de transcripción de reportero de rutina (por ejemplo, LacZ, luciferasa o GFP). Por ejemplo, puede ponerse en contacto una célula o animal transgénico cuyo genoma comprenda un gen reportero vinculado operativamente a un promotor polinucleótido NMD, con el agente de prueba, de modo que la capacidad del agente de prueba para aumentar o disminuir la actividad del reportero será indicativa de la capacidad del agente para modular el polipéptido NMD.
Los efectos del agente de prueba en la expresión del polipéptido NMD o la actividad o el nivel del polipéptido NMD se pueden evaluar en una célula, un lisado celular o un sujeto, preferiblemente un mamífero experimental no humano y, más preferiblemente, un roedor (por ejemplo, una rata, un ratón, un conejo) o un explante del mismo. Los métodos de evaluación de la expresión de polipéptidos NMD son habituales en la técnica, por ejemplo, análisis Northern, ensayo de protección de ribonucleasas, reacción en cadena de polimerasa-transcripción inversa (RT-PCR) o hibridación in situ del ARN (véase, por ejemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a ed.
2001)). El nivel de polipéptido NMD puede ser monitoreado, por ejemplo, por análisis Western, inmunoensayo o hibridación in situ. En algunas realizaciones, se transfecta la construcción de ADN que codifica el polipéptido NMD/proteína de fusión GFP en células, y se determina el nivel de fluorescencia de GFP en presencia o ausencia de un agente de prueba. El aumento de la fluorescencia en presencia del agente de prueba es indicativo de la capacidad del agente de prueba para aumentar el nivel del polipéptido NMD.
El efecto del agente de prueba en la expresión del polipéptido NMD o la actividad o nivel del polipéptido NMD puede confirmarse en un segundo ensayo, por ejemplo, se observa como un cambio, en presencia del agente de prueba, en la capacidad del polipéptido NMD para reducir la toxicidad de una célula, por ejemplo, una célula neuronal, que expresa TDP-43 y/o FUS.
Los agentes y agentes de ensayo que se utilizarán en los métodos descritos en el presente documento incluyen extractos crudos, o parcial o sustancialmente purificados, de fuentes orgánicas, por ejemplo, extractos botánicos (por ejemplo, hierbas) y algas, elementos inorgánicos o compuestos, así como agentes parcial o sustancialmente purificados o sintéticos, por ejemplo, moléculas pequeñas, polipéptidos, anticuerpos y polinucleótidos, y bibliotecas de estos.
En un ejemplo, se pueden producir u obtener bibliotecas químicas combinatorias que muestreen compuestos químicos que están relacionados estructural o químicamente o no. La preparación y el cribado de bibliotecas químicas combinatorias es habitual para los expertos en la técnica. Tales bibliotecas químicas combinatorias incluyen, entre otras, bibliotecas de péptidos (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos No. 5.010.175; Furka, Int. J. Pept. Prot. Res. 37:487-493 (1991); y Houghton et al., Nature 354:84-88 (1991)). También se pueden utilizar otras farmacias para generar bibliotecas de diversidad química. Tales productos químicos incluyen, entre otros: peptoides (por ejemplo, la Publicación PCT No. WO 91/19735), péptidos codificados (por ejemplo, la Publicación PCT No. w O 93/20242), bio-oligómeros aleatorios (por ejemplo, la Publicación PCT No. WO 92/00091), benzodiazepinas (p. ej., la Pat. de EE.UU. No. 5.288.514), diversómeros como hidantoínas, benzodiazepinas y dipéptidos (Hobbs et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90:6909-6913 (1993)), polipéptidos vinílogos (Hagihara et al., J. Amer. 114:6568 (1992)), péptido-miméticos no peptídicos con estructuras de glucosa (Hirschmann et al., J. Amer. Chem. Soc. 114:9217-9218 (1992)), síntesis orgánicas análogas de pequeñas bibliotecas de compuestos (Chen et al., J. Amer. Chem. Soc. 116:2661 (1994)), oligocarbamatos (Cho et al., Science 261:1303 (1993)), y/o fosfonatos de peptidilo (Campbell et al., J. Org. Chem. 59:658 (1994)), bibliotecas de ácidos nucleicos, bibliotecas de ácidos nucleicos peptídicas (véase, por ejemplo, Pat. de EE.UU. No. 5.539.083), bibliotecas de anticuerpos (véase, por ejemplo, Vaughn et al., Nature Biotechnology, 14(3):309-314 (1996) y el documento PCT/US96/10287), bibliotecas de carbohidratos (véase, p. ej., Liang et al., Science, 274:1520-1522 (1996) y la Pat. de EE.UU. No 5.593.853) y bibliotecas de moléculas orgánicas pequeñas (véase, por ejemplo, benzodiazepinas, Baum C&EN, 18 de enero, página 33 (1993); isoprenoides, Pat. de EE.UU. No. 5.569.588; tiazolidinonas y metatiazanonas, Pat. de Estados Unidos No. 5.549.974; pirrolidinas, Pat. de Estados Unidos No. 5.525.735 y 5.519.134; compuestos de morfolino, Pat. de EE.UU. No 5.506.337; benzodiazepinas, Pat. de EE.UU. No. 5.288.514, etc.).
La invención se ilustrará a continuación con los siguientes ejemplos. Los ejemplos se proporcionan únicamente con fines ilustrativos. No deben interpretarse como que limitan el alcance o el contenido de la invención de ninguna manera.
Ejemplos
Ejemplo 1: La expresión de UPF1 en neuronas elimina la toxicidad de FUS o TDP-43
El presente ejemplo describe la reducción de la toxicidad neuronal mediada por TDP-43 o FUS por UPF1.
Se utilizó un modelo de levadura de ELA para identificar un gen humano, UPF1, que suprimió la toxicidad del FUS/TLS en levadura (Ju et al., PLoS Biol. 9:e1001052 (2011)). Además, la UPF1 fue capaz de suprimir la citotoxicidad de las mutaciones de TDP-43 asociadas a ELA en levadura.
Para probar la eficacia de UPF1 en la reducción de la citotoxicidad mediada por TDP-43 o FUS en neuronas, UPF1 se expresó en neuronas motoras que expresaban FUS o TDP-43 asociados a la enfermedad. Las neuronas motoras fueron aisladas de ratones o creadas a partir de fibroblastos tomados de pacientes con ELA humana utilizando técnicas de células iPS (descritas en Yamanaka et al., Cell 126:663-676 (2006)). FUS o TDP-43 fueron marcados con EGFP (Proteína Verde Fluorescente Potenciada) y fueron expresados en neuronas motoras, que fueron visualizadas por microscopia fluorescente usando mApple.
Las neuronas motoras murieron a los pocos días de la expresión de FUS o TDP-43 debido a la toxicidad de estas proteínas relacionadas con la ELA. La UPF1 se expresó en las neuronas motoras y se determinaron las curvas de supervivencia de Kaplan-Meyer. Como se muestra en la Figura 1A, la expresión de UPF1 no tuvo ningún efecto sobre la supervivencia de las neuronas naturales, lo que indica que UPF1 no era un factor de supervivencia genérico. Sin embargo, como se muestra en la Figura 1B, UPF1 fue capaz de eliminar completamente la toxicidad de TDP-43 de una manera dependiente de la dosis. UPF1 tuvo un efecto similar en las células que expresaban FUS (datos no mostrados). Además, la expresión de UPF1 no pudo recuperar la toxicidad de los mutantes asociados a la ELA de SOD1, demostrando por primera vez que los ELAf dependientes de SOD1 son una enfermedad distinta mecanísticamente.
Ejemplo 2: Ensayo de selección en levadura para compuestos que recuperan la toxicidad de FUS
Se desarrolló una selección de fármaco basada en el modelo de levadura descrito en el Ejemplo 1 para identificar compuestos que recuperaban la toxicidad resultante de la expresión de FUS. Debido a que el fenotipo fue recuperado de la muerte celular, la selección mostró una señal excepcionalmente buena con respecto al ruido, con una puntuación de Z’ de aproximadamente 0,8.
Brevemente, se diseñaron dos cepas de levadura: "1XFUS", en la que un gen FUS se integró establemente en el locus HIS; y "1XVec", en el que se integró un vector vacío en el mismo locus. Los medios utilizados fueron YPRafinosa y 2XYPGalactosa (2X concentrado). Las células de levadura se cultivaron inoculando una sola colonia de la cepa 1XFUS o la cepa 1XVec en 2 ml de un medio de YPRafinosa y se cultivaron durante la noche a 30°C. Los cultivos nocturnos se utilizaron entonces para inocular 50 ml de medio YPRafinosa a una OD600=0,2 y se cultivaron durante 24 horas a 30°C.
Los cultivos se diluyeron entonces en 500 ml de medio YPGalactosa 2X a OD600=0,2. Se rellenaron placas de 384 pocillos previamente con 25 pl de cada compuesto de ensayo a una concentración de 30 pM. Se utilizó un Multidrop para añadir 25 pl de la suspensión de 1XFUS a cada pocilio en las columnas 1-23 de la placa; se añadió 1XVec a cada pocilio en la columna 24 como control. La levadura y los compuestos se mezclaron a fondo. Las placas se mantuvieron en una incubadora humidificada a 30°C. El OD600 de cada placa fue monitoreado a las 24 h y 48 horas.
El compuesto o compuestos que rescataron el crecimiento de 1XFUS fueron seleccionados y reevaluados. Los compuestos que pasaron la reevaluación se comprobaron en un experimento de respuesta de 10 dosis. Los compuestos que mostraron buenas respuestas de la dosis fueron reordenados, y reevaluados.
Secuencias
Secuencia de nucleótidos UPF1 (No. de entrada del GenBank U59323.1, nt 176-3532) (SEQ ID NO:1)
176 atgag 131 cgtggaggcg tacgggccca gctcgcagac tctcactttc ctggacacgg aggaggccga 241 gctgcttggc gccgacacac agggctccga gttcgagttc accgacttta ctcttcctag 301 ccagacgcag acgccccccg gcggccccgg cggcccgggc ggtggcggcg cgggaagccc 361 gggcggcgcg ggcgccggcg ctgcggcggg acagctcgac gcgcaggttg ggcccgaagg 421 catcctgcag aacggggctg tggacgacag tgtagccaag accagccagt tgttggctga 481 gttgaacttc gaggaagatg aagaagacac ctattacacg aaggacctcc ccatacacgc 541 ctgcagttac tgtggaatac acgatcctgc ctgcgtggtt tactgtaata ccagcaagaa 601 gtggttctgc aacggacgtg gaaataette tggcagccac attgtaaatc accttgtgag 661 ggcaaaatgc aaagaggtga ccc tgeaeco ggacgggccc ctgggggaga cagtcctgga 721 gtgctacaac tgcggctgtc gcaacgtctt cctcctcggc ttcatcccgg ccaaagctga 781 ctcagtggtg gtgctgctgt gcaggcagcc ctgtgccagc cagagcagcc tcaaggacat 841 caactgggac agetegeagt ggcagccgct gatccaggac cgctgcttcc tgtcctggct 901 ggtcaagatc ccctccgagc aggagcagct gcgggcacgc cagatcacgg cacagcagat 961 caacaagctg gaggagctgt ggaaggaaaa ccc Lte L.gcc acgctggagg acctggagaa 1021 gccgggggtg gacgaggagc cgcagcatgt cctcctgcgg tacgaggacg cctaccagta 1081 ccagaacata ttcgggcccc tggtcaagct ggaggccgac tacgacaaga agctgaagga 1141 gtcccagact caagataaea tcactgtcag gtgggacctg ggccttaaca agaagagaat 1201 cgcctacttc actttgccca agactgactc tgacatgcgg ctcatgcagg gggatgagat 1261 atgcctgcgg tacaaagggg accttgcgcc cctgtggaaa gggatcggcc acgtcatcaa 1321 ggtccctgat aattatggcg atgagatcgc cattgagctg cggagcagcg tgggtgcacc 1381 tgtggaggtg actcacaact tccaggtgga ttttgtgtgg aagtcgacct cctttgacag 1441 gatgcagagc gcattgaaaa cgtttgccgt ggatgagacc tcggtgtctg gctacatcta 1501 ccacaagctg ttgggccacg aggtggagga cgtaatcacc aagtgccagc tgcccaagcg 1561 cttcacggcg cagggcctcc ccgacctcaa ccactcccag gtttatgccg tgaagactgt 1621 gctgcaaaga ccactgagcc tgatccaggg cccgccaggc acggggaaga cggtgacgtc 1681 ggccaccatc gtctaccacc tggcccggca aggcaacggg ccggtgctgg tgtgtgctcc 1741 gagcaacatc gccgtggacc agctaacgga gaagatccac cagacggggc taaaggtcgt 1801 gcgcctctgc gccaagagcc gtgaggccat cgactccccg gtgtcttttc tggccctgca 1861 caaccagatc aggaacatgg acagcatgee tgagctgcag aagctgcagc agctgaaaga 1921 cgagactggg gagctgtcgt ctgccgacga gaagcggtac cgggccttga agcgcaccgc 1981 agag agaga g ctgctgatga acgcagatgt catctgctgc acatgtgtgg gcgccggtga 2041 cccgaggctg gccaagatgc agttccgctc cattttaatc gacgaaagca cccaggccac 2101 cgagccggag tgcatggttc ccgtggtcct cggggccaag cagctgatcc ttgtaggcga 2161 ccactgccag ctgggcccag tggtgatgtg caagaaggcg gccaaggccg ggctgtcaca 2221 gtcgctcttc gagcgcctgg tggtgctggg oatccggccc atccgcctgc aggtccagta 2281 ccggatgcac cctgcactca gcgccttccc atccaacatc ttctacgagg g e t c c c t c c a 2341 gaatggtgtc actgcagcgg atcgtgtgaa gaagggattt gacttccagt ggccccaacc 2401 cgataaaccg a tg11 c11c L. ocg tgaccca gggccaagag gago ttgcca gctcgggcac 2461 ctcctacctg aacaggaccg aggctgcgaa cgtggagaag atcaccacga agttgctgaa 2521 ggeaggcgec aagccggacc agattggcat catcacgccc tacgagggcc agcgctccta 2581 cctggtgcag tacatgcagt tcagcggctc cctgcacace aagctctacc aggaagtgga 2641 gatcgccagt gtggacgcct ttcagggacg cgagaaggac ttcatcatee tgtcctgtgt 2701 gcgggccaac gagcaccaag gcattggctt tttaaatgac cccaggcgtc tgaacgtggc 2761 cctgaccaga gcaaggtatg gcgtcatcat tgtgggcaac ccgaaggcac tatcaaagca 2821 gccgctctgg aaccacctgc tgaactacta taaggagcag aaggtgctgg tggaggggcc 288'. getcaacaac ctgcgtgaga gcctcatgca gttcagcaag ccacggaagc tggtcaacac 2841 tatcaacccg ggagcccgct tcatgaccac agccatgtat gatgcccggg aggccatcat 3001 cccaggctcc gtctatgatc ggagcagcca gggccggcct tccagcatgt acttccagac 3061 ccatgaccag attggcatga tcagtgccgg ccctagccac gtggctgcca tgaaca tccc 3121 catccccttc aacctggtca tgccacccat gccaccgcct ggctattttg gacaagccaa 3181 cgggcctgct gcagggcgag gcaccccgaa aggcaagact ggtcgtgggg gacgccagaa 3241 gaaccgcttt gggcttcctg gacccagcca gacL aacete cccaacagcc aagccagcca 3301 ggatgtggcg tcacagccct tctctcaggg cgccctgacg cagggctaca tctccatgag 3361 ccagccttcc cagatgagcc ageecggcct ctcccagccg gagctgtccc aggacagtta 3421 ccttggtgac gagtttaaat cacaaatcga cgtggcgctc tcacaggact ccacgtacca 3481 gggagagcgg gcttaccagc atggcggggt gacggggctg tcccagtatt aa
Secuencia de aminoácidos UPF1 (No. de entrada del GenBank AAC51140.1) (SEQ ID NO:2)
1 msveaygpss qtlt fldr.ee aellgadtqg sefeftdftl psqtqtppgg pggpggggag 61 spggagagaa agqldaqvgp egilqngavd dsvaktsq11 aelnfeedee dtyytkdlpi 12 1 hacsycg ilid pacvvycnts kkwfcngrgn tsgsh ivnlil vtalckevL1 hkdgplgetv 181 lecyncgcrn vfllgfipak adsvwllcr qpcasqsslk dinwdssqwq pliqdrcfls 241 wlvkipseqe ql rrarqitaq qinkleelwk enosatledl ekpgvdeepq hvllryeday 301 q y q n i I g p 1v kleadydkkl kesqtqdnit vrwdLglnkk riayftlpkt dsdmrlmqgd 361 eiclrykgdl aplwkgighv ikvpdnygde iaialrssvg apvevthnfq vdfvwkstsf 421 drmqsalktf avdetsvsgy iyhkllghev edvitkcqlp krftaqglpd lnhsqvyavk 481 Lv1qrplsi i qgppgtgktv Lso Livyh1a rqgngpvlvc apsniavdql tekihqtglk 541 wrlcaksre aidapvsfla lhnqi rnmds mpelqklqql kdetgelssa dekryralkr 601 taerellmna dvicctcvga gdprlakmqf rsilidestq atepecmvpv vlgakqlilv 661 gdhcqlgpvv mckkaakagl sqslferlvv 1q irpj rlqv qyrmhpalsa rpsni fyegs 721 lqngvtaadr vkkgfdfqwp qpdkpmffyv tqgqeeiass gtsylnrtea anvekittkl 781 lkagakpdqi giitpyegqr sylvqymqfs g s Ihel Iyqc veiasvdafq grekdfilis 841 cvranehqgí gflndprrln valtrarygv iivgnpkals kqplwnhlln yykeqkvlve 001 gplnnlresl mqfskprklv ntinpgarfm ttamydarea iipgsvydrs sqgrpssmyf 961 qthdqigmis agpshvaamn ipipfnlvmp pmpppgyfgq angpaagrg t pkgktgrggr 1021 qknrfglpop sqtnlpnsqa sqdvasqpfs qgal tqgyis msqpsqmsqp glsqpelsqd 1081 sylgdefksq idvalsqdst yqgerayqhg gvtglsqy
Secuencia de nucleótidos UPF2 (No. de entrada del GenBank AF318574.1, nt 76-3894) (SEQ ID NO:3)
7 6 atgee agctgagcgt aaaaagccag caagtatgga agaaaaagac 121 tctttaccaa acaacaagga aaaagactgc agtgaaaggc ggacagtgag cagcaaggag 181 aggccaaaag aegatatcaa gctcactgcc aagaaggagg tcagcaaggc ccctgaagac 2 41 aagaagaaga gactggaaga tgataagaga aaaaaggaag acaaggaacg caagaaaaaa 301 gacgaagaaa aggtgaaggc agaggaagaa tcaaagaaaa aagaagagga agaaaaaaag 361 aaacaL caag aggaagagag aaagaagcaa gaagagcagg ceaaacgtea gcaagaagaa 421 gaagcagctg ctcagatgaa agaaaaagaa gaatccattc agettcatea ggaagcttgg 481 gaacgacatc a tttaagaaa ggaacttcgt agcaaaaacc aaaatgctcc ggacagccga 54 1 ccagaggaaa jc Lee Ltcag c c g c c te g a c tcaagtLLga agaaaaaesc Lgcc111g tc 601 aagaaactaa aaactattac agaacaacag agagactcct tgtcccatga ttttaatggc 661 ctaaatttaa gcaaa taca L. tgeagaaget qtagetteca tcgtggaagc aaaactaaaa 721 atctctgatg tgaactgtgc tgtgcacctc tgctctctct ttcaccagcg ttatgctgac 781 tttgccccat c ac11 c11aa ggtctggaaa aaacattttg aagcaaggaa agaggagaaa 841 acacctaaca tcaccaagtL aagaactgat ttgcgtttta ttgeagaatt gacaatagtt 301 gggattttca ctgacaagga aggtctttcc ttaatctatg aacagctaaa aaatattatt 961 aatgctgatc gggagtccca cactcatgtc tctgtagtga ttagtttctg tcgacattgt 1021 ggagatgata ttgctggact tg taccaagg aaagtaaaga gtgctgcaga gaagtLtaat 1081 ttgagttttc ctcctagtga gataattagt ccagagaaac aacagccctt ccagaatctt 1141 11aaaagagt actttacgtc tttgaccaaa cacctgaaaa gggaccacag ggagctccag 1201 aatactgaga gacaaaacag gegeatteta cattctaaag gggagctcag tgaagaLogo 1261 cataaacagt atgaggaatt tgctatgtct taccagaagc tgctggcaaa ttctcaatcc 1321 ttagcagacc ttttggatga aaatatgcca gatettcctc aagacaaacc cacaccagaa 1381 gaacatgggc ctggaattga tatattcaca cctggtaaac ctggagaata tgacttggaa 1441 ggtggtatat gggaagatga agatgetegg aatttttatg agaacctcat tgatttgaag 1501 gcttttgtcc cagcca te L.t gtttaaagac oo tgaaaaaa gttgtcagaa taaagagtec 1561 aacaaagatg ataccaaaga ggcaaaagaa tctaaggaga ataaggaggt atcaagtccc 1621 gatgatttgg aacttgagtt ggagaateta gaaattaatg atgacacctt agaattagag 1681 ggtggagatg aagctgaaga tcttacaaag aaacttcttg atgaacaaga acaagaagat 1741 gaggaagcca gcactggatc Leo Lctcaag ctcatagtag atget Ll.ee t acagcagtLo 1801 cccaactgtg tcaaccgaga tctgatagac aaggcagcaa tggatttttg catgaacatg 1861 aacacaaaag caaacaggaa gaagttggta cgggcactct tcatagttcc tagacaaagg 1921 ttggatttgc taccatttta tgcaagattg gttgctacaL tgcatccctg catgtctgat 1981 gtagcagagg atctttgttc catgctgagg ggggatttca gatttcatgt acggaaaaag 2041 gaccagatca atattgaaac aaagaataaa actgttcgtt ttataggaga actaactaag 2101 tttaagatgt tcaccaaaaa tgacacactg cattgtttaa agatgettet gtcagacttc 2161 tctcatcacc atattgaaat ggcatgcacc ctgctggaga catgtggacg gt.ttct.r.tr.c 2721 agatctccag o oteL cacct gaggaccagt gtacttL tgg agcaaatgat gagaaagaag 2281 caagcaatgc atcttgatgc gagatacgtc acaatggtag agaatgeata ttactactgc 2341 aacccacctc cagctgaaaa aaccgtgaaa aagaaacgtc ctcctctcca ggaatatgtc 2401 cggaaacttt tgtacaaaga tetetetaag gttaccaccg agaaggtttt gagacagatg 2461 cgaaagctgc cctggcagga ccaagaagtg aaagactatg ttatttgttg tatgataaac 2521 atctggaatg tgaaatataa tagtattcat tgtgtagcca acctcttagc aggactagtg 2581 ctctaccaag aggatgttgg gatccacgtt gtggatggag tgttagaaga tattcgatLa 2641 ggaat ggagg ttaatcaacc taaatttaat cagaggcgca tcagcagtgc caagttctta 2701 ggagaacttt acaattaccg aatggtggaa tcagctgtta ttttcagaac tctgtattct 2761 tttacctcat ttggtgttaa Lee tgatggc LetccaagtL ccctggaccc acctgagcat 2821 cttttcagaa ttagactcgt atgcactatt ctggacacat gtggccagta ctttgacaga 2881 ggttccagta aacgaaaact tgattgtttc cttgtatatt ttcagcgtta tgtttggtgg 2941 aagaaaagtt tggaggtttg gacaaaagac catccatttc ctattga ■_ot agattacatg 3001 atcagtgata cactagaact gctaagacca aagatcaaac tctgtaattc tctggaagaa 3061 tccatcaggc aggtacaaga cttggaacga gaattetLaa taaaactagg cctagtaaat 3121 gacaaagact caaaagatte tatgacagaa ggagaaaatc ttgaagagga tgaagaagaa 3181 gaagaaggtg gggctgaaac agaagaacaa tctggaaatg aaagtgaagt aaatgagcca 3241 gaagaagagg agggttctga taatgatgat gatgagggag aagaagagga ggaagagaat 3301 acagattacc ttacagattc coa taaggaa oo tgaaaccg atgaagagaa tactgaggta 3361 atgattaaag gcggtggact taagcatgta ccttgtgtag aagatgagga cttcattcaa 3421 gctctggata aaatgatgct agaaaatcta cagcaacgaa gtggtgaatc tgttaaagtg 3481 caccaactag a t g t g g c c a l Lee LLtgeat ctcaaaagcc agctgaggaa agggccccca 3541 ctgggaggtg gggaaggaga ggctgagtct gcagacacaa tgccgtttgt catgttaaca 3601 agaaaaggca a taaacagca gtttaagate cttaatgtac ccatgtcctc te aael.Lee t 3661 gcaaatcact ggaaccagca acaggcagaa caagaagaga ggatgagaat gaagaagctc 3721 acactagata tcaatgaacg gcaagaacaa gaagattatc aagaaatgtt gcagtctctt
3781 gcacagcgcc cagctccagc aaacaccaat cgtgagaggc ggcctcgcta ccaacatccg 3841 aagggagcac etaatgeaga tetaatettt aagactggtg ggaggagacg 1.1.,ga
Secuencia de aminoácidos UPF2 (No. de entrada del GenBank AAG60689.1) (SEQ ID NO:4)
1 mpaerkkpas meekdslpnn kekdcserrt vsskerpkdd ikltakkevs kapedkkkrl 61 eddkrkkedk erkkkdeekv kaeeeskkke eeekkkhqee erkkqeeqak tqqeeeaaaq 121 mkekeesiql hqeawerhhl rkelrsknqn apdsrpeenf zsrldss Ikk ntafvkklkt 181 iteqqrdsls hdfnglnlsk yiaeavasiv eaklkisdvn cavhlcslfh qryadfapsl 241 lqvwkkhfea rkeektpnit k_r tdlrfia eltivgiftd keglsliyeq lkr__inadre 301 shthvsvvis fcrhcgddia glvprkvksa aekfnlsfpp se iispekqq pfqnllkeyf 361 tsltkhlkrd hrelqnterq nrrilhskge lsedrhkqye efamsyqkll ansqsladll 421 denmpdlpqd kptpeehgpg idiftpgkpg eydleggiwe dedarnfyen lidlkafvpa 481 ilfkdneksc qnkesnkddt keakeskenk evsspddlel elenlei ndd tleleggdea 541 edltkkllde qeqedeeast gshlklivda flqqlpncvn rdlidkaamd fcmnmntkan 601 rkklvralfi vprqrldllp fyarlvatlh pcmsdvaedl csmlrgdfrf hvrkkdqini 661 etknktvrfi geltkfkmft kndtlhclkm llsdfshhhi emactlíete grflfrspes 721 hlrtsvlleq mmrkkqamhl daryvtmven ayyycnpppa ektvkkkrpp lqeyvrklly 781 kdlskvttek vlrqmrklpw qdqevkdyvi ccminiwnvk ynsihcvanl laglvlyqed 841 vgihvvdgvl edirlgmevn qpkfnqrris sak f qsl yn yrmvesavif r L ysfL.s£g 901 vnpdgspssl dppehlfrir lvctildtcg qyfdrgsskr kldcflvyfq ryvwwkksle 961 vwtkdhpfpi didymisdtl c 11 rpkí k]c nsleesirqv qdlereflik lg:vndkdsk 1021 dsmtegenle edeeeeegga eteeqsgnes evnepeeeeg sdndddegee eeeentdylt 1081 dsnkenetde entevmikgg glkhvpcved edfiqaldkm mlenlqqrsg esvkvhqldv 1141 aiplhlksql rkgpplggge geaes^d L.mp fvmltrkgnk qqfkilnvpm ssqlaanhwn 1201 qqqaeqeerm rmkkltldin erqeqedyqe mlqslaqrpa pantnrerrp ryqhpkgapn 1261 adlifktggr rr
Secuencia de nucleótidos UPF3 (No. de entrada del GenBank AF318575_1, nt 22-1380) (SEQ ID NO:5)
22 atgctgtcg gccctagaag tgcagttcca ccgcgactcg 61 cagcagcagg aggctgagac gccgccaact tcgtcctccg gttgcggggg cggtgcgggc 121 aaacctcgcg aggagaagag gacggccctg agcaaggtgg tcatccgccg cctgcctccg 181 ggcctcacea aggagcagct ggaggagcag ctgcgcccgc tgccagcaca cgactacttc 241 gagttcttcg ccgccgacct gagtctttat cctcatctct actcaagagc atacattaat 301 tttaggaatc ctgatgacat ccttcttttt agagatcgtt ttgatggata tatetteett 361 gacagcaaag geetagaata tcctgcagtg gtagagtttg ctccattcca gaagatagee 421 aaaaagaagc tgagaaaaaa agatgccaag actggaagca tegaagatga tccagaatat 481 aagaagtttt tagaaaccta ctgtgtggag gaagagaaga ccagtgccaa ccctgagact 541 ctgctggggg agatggaggc gaagacaaga gagctcattg ctagaagaac cacacctctt 601 ttggaatata ttaaaaatag aaaattagaa aagcagagaa ttegagaaga gaagcgagaa 661 gaacggagga ggagagagtt agaaaagaaa cgtttgcggg aagaggaaaa aagaagaaga 721 agagaagaag aaagatgcaa aaaaaaagag acagataaac agaagaaaat tgcagagaaa 781 gaagtaagga ttaagcttct taagaaacca gaaaagggag aggaaccaac cacagagaaa 841 ccaaaagaaa gaggagagga gattgatact ggaggtggca agcaggaatc ctgtgccccc 901 ggtgcagtcg taaaagccag gcccatggaa ggctcgctgg aggagcccca ggagacgtca 961 cacagcggca gtgataaaga gcacagggat gtggagagat ctcaagaaca agaatctgaa
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1 mlsalevqfh r : • ' i ' - ; . - ' pptsssgcgg gagkpreekr ta1Skvvirr lppgltkeql 61 eeqlrplpah dyfeffaadl slyphlysra yinfrnpddi llfrdrfdgy ifldskgley 121 pavvefapfq kiakkklrkk daktgsised peykkflety cveeektsan petllgemea 181 ktreliarrt tplleyiknr klekqriree kreerrrrel ekkrlreeek rrrreeerck 241 kket dkqkki aekevri kll kkpekgeept tekpkergee idtgggkqes capgawkar 301 pmegsleepq etshsgsdke hrdversqeq eseaqryhvd dgrrhrahhe pe r'.srrsed 361 eqrwg kgp gq drgkkgsqds gapgeamerl graqrcddsp aprkerlank drpalqlydp 421 garfrarecg gnrrickaeg sgtgpekree ae
Secuencia de nucleótidos SMG1 (No. de entrada del GenBank NM_015092.4, nt 364-11349) (SEQ ID NO:7)
364 atgagcc gcagagcccc ggggtctcgg ctgagcagcg gcggcggcgg cggcggcacc 421 aagtatccgc ggagctggaa tgactggcaa cccagaactg atagtgeate agccgaccca 481 gataatttaa aatattette atccagagat agaggtggtt cttcctctta tggactgcaa 541 ccttcaaatt cagctgtggt gtctcggcaa aggcacgatg ataccagagt ccacgctgac 601 atacagaatg acgaaaaggg tggctacagt gtcaatggag gatctgggga aaataettat 661 ggtcggaagt cgttggggca agagctgagg gttaacaatg tgaccagccc tgagttcacc 711 agtgttcagc atggcagtcg tgctttagcc accaaagaca tgaggaaatc acaggagaga 7 31 tegatgtett attctgatga gtctcgactg tegaatette ttcggaggat cacccgggaa 841 gacgacagag accgaagatt ggctactgta aagcagttga aagaatttat tcagcaacca 901 gaaaataagc tggtactagt taaacaattg gataatatct tggctgctgt acatgacgtg 961 cttaatgaaa gtagcaaatt gcttcaggag ttgagacagg agggagcttg ctgtcttggc 1021 cttctttgtg cttctctgag ctatgaggct gagaagatct tcaagtggat ttttagcaaa 1081 tttagctcat ctgcaaaaga tgaagttaaa ctcctctact tatgtgccac ctacaaagca 1141 ctagagactg taggagaaaa gaaagccttt teatetgtaa tgcagcttgt aatgaccagc 12 01 ctgcagtcta ttcttgaaaa tgtggataca ccagaattgc tttgtaaatg tgttaagtgc 12 61 attcttttgg tggctcgatg ttaccctcat attttcagca ctaattttag ggatacagtt 13 21 gatatattag ttggatggca tatagatcat actcagaaac cttcgctcac gcagcaggta 1381 tctgggtggt tgcagag ttt ggagccattt tgggtagctg atettgeatt ttctactact 1441 cttcttggtc agtttctgga agacatggaa gcatatgctg aggacctcag ccatgtggcc 15 01 tctggggaat cagtggatga agatgtccct cctccatcag tgtcattacc aaagctggct 1561 gcacttctcc gggtatttag tactgtggtg aggagcattg gggaacgctt cagcccaatt 167 1 cggggtcctc caattactga ggcatatgta acagatgttc tgtacagagt aatgagatgt 1681 gtgacggctg caaaccaggt gtttttttct gaggctgtgt tgacagctgc taatgagtgt 114 1 gttggtgttt tgctcggcag cttggatcct agcatgacta tacattgtga catggtcatt 1 801 acatatggat tagaccaact ggagaattgc cagacttgtg gtaccgatta tatcatctca 1861 gtcttgaatt tactcacgct gattgttgaa cagataaata cgaaactgcc atcatcattt 11;71 gtagaaaaac tgtttatacc ateatetaaa ctactattct tgcgttatca taaagaaaaa 18 8 _ gaggttgttg ctgtagccca tgctgtttat caagcagtgc tcagcttgaa gaatattcct 2 041 gttttggaga ctgcctataa gttaatattg ggagaaatga cttgtgecct aaacaacctc 2101 ctacacagtc tacaacttcc tgaggcctgt tctgaaataa aacatgaggc ttttaagaat 2161 catgtgttca atgtagacaa tgcaaaattt gtagttatat ttgacctcag tgccctgact 222 1 acaattggaa atgccaaaaa ctcactaata gggatgtggg cgctatctcc aactgtcttt 2281 gcacttctga gtaagaatct gatgattgtg cacagtgacc tggctgttca cccccccccc 234 1 attcagtatg ctgtgctcta cacattgtat tctcattgta ccaggcatga tcactttatc 240 1 tctagtagcc tcagttcttc ctctccttct tcgttcgat.g gagctgtgat tagcactgta 2461 actacggcta caaagaaaca tttctcaatt atattaaatc ttctgggaat attacttaag 2521 aaagataacc ttaaccagga cacgaggaaa ;::.qttaatga cttgggcttt ggaagcagct 2581 gttttaatga agaagtctga aacatacgca cctttattct ctcttccgtc tttccataaa 264 1 ttttgcaaag gccttttagc caacactctc gttgaagatg tgaatatctg tctgcaggca 2 1 0 1 tgcagcagtc tacatgctct CCCCt.Ctt.CC ttgccagatg atcttttaca gagatgtgtc 2261 gatgtttgcc gtgttcaact agtgcacagt ggaactcgta ttcgacaagc atttggaaaa 2821 ctgttgaaat caattccttt agatgt tgtc ctaagcaata acaatcacao agaaattcaa 288 ' gaaatttctt tagcattaag aagtcacatg agtaaagcac caagtaatac accccacccc 2941 caagatttct ctgatgttat tagttttatt ttgtatggga actctcatag aacagggaag 3001 gacaattggt tggaaagact gttctatagc tgccagagac tggataagcg tgaccagtca 3061 acaattccac gcaatctcct gaagacagat gctgtccttt ggcagtgggc catatgggaa 212 _ gctgcacaat tcactg 1.Lc: ttctaagctg agaaccccac tgggcagagc tcaagacacc 3181 ttccagacaa ttgaaggtat cattcgaagt ctcgcagctc acacattaaa ccctgatcag 3241 gatgttagtc agtggacaac tgcagacaat gatgaaggcc atggtaacaa ccaacttaga 330 1 cttgttcttc ttctgcagta tctggaaaat ctggagaaat taatgtataa tgcatacgag 3361 ggatgtgcta atgcattaac tceacctccc aaggtcatta gaactttttt ctataccaat 342 1 cgccaaactt gtcaggactg gctaacgcgg attcgactct ccatcatgag ggtaggattg 3481 ttggcaggcc agcctgcagt gacagtgaga catggctttg acct.cc~.tac agagatgaaa 3541 acaaccagcc tatctcaggg gaatgaattg gaagtaacca ttatgatggt ggtagaagca 3601 ttatgtgaac ttcattgtcc tgaagctata cagggaattg ctgtctggtc aceat.ceate.
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accactagga 6961 acaagatcag gactaatcca gtgggtagat ggagccacac ccttatttgg tctttacaaa 7021 cgatggcaac aacgggaagc tgccttacaa gcacaaaagg cccaagattc ctaccaaact 7081 cctcagaatc ctggaattgt accccgtcct agtgaacttt attacagtaa aattggccct 7142 gctttgaaaa cagttgggct tagcctggat gtgtcccgtc gggattggcc tcttcatgta 7201 atgaaggcag tattggaaga gttaatggag gccacacccc cgaatctcct tgccaaagag 726 2 ctctggtcat cttgcacaac acctgatgaa tggtggagag ttacgcagtc ttatgcaaga 732 _ tctactgcag tcatgtctat ggttggatac ataattggcc ttggagacag acatctggat 7381 aatgttctta tagatatgac gactggagaa gttgttcaca tagattacaa tgtttgcttt 744 2 gaaaaaggta aaagccttag agttcctgag aaagtacctt ttcgaatgac acaaaacatt 7501 gaaacagcac tgggtgtaac tggagtagaa ggtgtattta ggctttcatg tgagcaggtt 7561 ttacacatta tgcggcgtgg cagagagacc ctgctgacgc tgctggaggc ctttgtgtac 7621 gaccctctgg tggactggac agcaggaggc gaggctgggt ttgctggtgc tgtctatggt 7681 ggaggtggcc agcaggccga gagcaagcag agcaagagag agatggagcg agagatcacc 774 _ cgcagcctgt tttcttctag agtagctgag attaaggtga actggtttaa 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tggtaccttt 9481 tctaaaacat tgtcaggatc aagttcactt gaagatcaga atactgtgaa tgggcctgta 9541 cagattgtca atgtgaaaac cctttttaga aactcttgtt tcagtgaaga ccaaatggcc 360'. aaacctatca aggcattcac agctgacttt gtgaggcagc tcttgatagg gctacccaac 9661 caagccctcg gactcacact gtgcagtttt atcagtgctc tgggtgtaga catcattgct 3721 caagtagagg caaaggactt tggtgccgaa agcaaagttt ctgttgatga tctctgtaag 9781 aaagcggtgg aacataacat ccagataggg aaq t t .c~ .c tc agctggttat gaacagggca 3841 actgtgttag caagttctta cgacactgcc tggaagaagc atgacttggt gcgaaggcta 9901 gaaaccagta tttcttcttg taagacaagc ctgcagcggg ttcagctgca tattgccatg 9961 tttcagtggc aacatgaaga tctacttatc aatagaccac aagccatgtc agtcacacct 10021 cccccacggt ctgctatcct aaccagcatg aaaaagaagc tgcataccct gagccagatt 10081 gaaacttcta ttgcaacagt tcaggagaag ctagctgcac ttgaatcaag tattgaacag 10141 cgactcaagt gggcaggtgg tgccaaccct gcattggccc ctgtactaca agattttgaa 10201 gcaacgatag ctgaaagaag aaatcttgtc cttaaagaga gccaaagagc aagtcaggtc 1C2C_ acatttctct gcagcaatat cattcatttt gaaagtttac gaacaagaac tgeagaagee 10321 ttaaacctgg atgcggcgtt atttgaacta atcaagcgat gtcagcagat gtgttcgttt 10381 gcatcacagt ttaacagttc agtgtctgag ttagagcttc gtttattaca gagagtggac 10441 actggtcttg aacatcctat tggcagctct gaatggcttt tgtcagcaca caaacagttg 10501 acccaggata tgtctactca gagggcaatt cagacagaga aagageagea gatagaaacg 10561 gtctgtgaaa caattcagaa tctggttgat aatataaaga ctgtgctcac tggtcataac 10621 cgacagcttg gagatgtcaa acatctcttg aaagctatgg ctaaggatga agaagetget 10681 ctggcagatg gtgaagatgt tccctatgag aacagtgtta ggcagttttt gggtgaatat 10741 aaatcatggc aagacaacat tcaaacagtt ctatttacat tagtccaggc tatgggtcag 10 8 0 gttcgaagtc aagaacacgt tgaaatgctc caggaaatca ctcccacctt gaaagaactg 10861 aaaacacaaa gtcagagtat ctataataat ttagtgagtt ttgcatcacc cttagtcacc 10921 gatgcaacaa atgaatgttc gagtccaacg tcatctgcta cttatcagcc atccttcgct 10981 gcagcagtcc ggagtaacac tggccagaag actcagcctg atgtcatgtc acagaatgct 11041 agaaagctga tccagaaaaa tcttgctaca tcagctgata ctccaccaag caccgttcca '.110'. ggaactggca agagtgttgc ttgtagtcct aaaaaggcag tcagagaccc taaaactggg 11161 aaagcggtgc aagagagaaa ctcctatgca gtgagtgtgt ggaagagagt gaaagccaag 11221 ttagagggcc gagatgttga tccgaatagg aggatgtcag ttgctgaaca ggttgactat 11281 gtcattaagg aagcaactaa tctagataac ttggctcagc tgtatgaagg ttggacagcc 11341 tgggtgtga
Secuencia de aminoácidos SMG1 (No. de entrada del GenBank NP_055907.3) (SEQ ID NO:8)
1 msrrapgsrl ssggggggL k yprswndwqp rtdsasadpd nlkysssrdr ggsssyglqp 61 snsavvsrqr hddtrvhadi qndekggysv nggsgentyg rkslgqelrv nnvtspefts 121 vqhgsralat kdmrksqers xsysdssrls nllrrit. red dtdrrlatvk qlkefiqqpe 13'. nklvi vkq 1d nilaavhdvl ness kLlqel rqegaccIgl lcaslsyeae k ifkw i.fskf 241 sssakdevkl lylcatykal etvgekkafs svmq".vmt si qsilenvdtp el 1ckcvk c 1 3 01 llvarcyphi i stnfrdtvd ilvgwhidht qkpsltqqvs gwlqslepfw vadlafsttl 361 lgqf1edmea yaedlshvas gesvdedvpp p svs'.pk1a a 11 rv Tstvv c s ige r s p ir 421 gppiteayvt dvlyrvmrcv taanqvffse avltaanecv g v lLgsldps mtihcdmvit 481 ygldqlencq tcgtdyiisv l n l J t L í v e q intklpssfv eklfipsskl 1£:.-hkeke 541 vvavahavyq avlslknipv letayklilg emtcalnnll hslqlpeacs eikheafknh 601 vfnvdnakfv vifdlsaltt ignaknsllg mwalsptvfa llsknlmivh sdlavhfpai 661 qyavlytlys he L.rhdh ris CC ".GSGSpSl fdgavistvt tat k k h si i 1n11g i1lkk 721 dnlnqdtrkl lmtwaleaav lmkksetyap lfslpsfhkf ckgllantlv edvnlclqac 781 sslhalsssl pddllqrcvd vcrvqlvhsg trirqafgkl lksipldvv1 snnnhteiqe 841 islalrshms kapsntfhpq df sdvL sfi1 ygnshrtgkd nvjJee1f ysc qrldkrdqst 901 iprnllktda vlwqwaiwea aqftvlsklr tplgraqdtf qtiegiix e1 aahtlnpdqd 961 vsqwttadnd eghgnnqlrl v i : I q y : e n l eklmynayeg canaltsppk V irt f í y t n r 1021 qtcqdwltri rlsimrvgll agqpavtvrh gfdlltemkt tslsqgnele v t i m w e a l 1081 celhcpeaiq giavwsssiv gknllwinsv aqqaegrfek asveyqehlc amtgvdccis 1141 sfdksvltla nagrnsaspk hslngesrkt vlskptdssp ev iny 1gr.ko cecyisiadw 12 01 aavqewqna i hdlkkstsst slnlkadfny ikslssfesg kfvecteqle llpgeninll 12 61 agg skakidm kkllpnmlsp dprelqksie vqllrssvcl atalnpieqd qkwqsitenv 12 21 vky_kqts r1 algplrlstl tvsqs1pv1s tlqlycssal entvsnxlst ede : [ ■ I f s e 1381 alrsckqhdv rpwmqalryt myqnqlleki keqtvpirsh 1rr.e".g 1ta a k farkrgnvsl 1441 atrllaqcse vqlgktttaq dlvqhfkkls tqgqvdekwg peldiektkl lytagqstha 1501 memlsscais fcksvkaeya vaksiltlak wiqaewkeis gqlkqvyraq hqqnftglst I5 61 lskniltl¡s 1psvntmeee yprie se stv higvgepdfi ".gq".yhi ssv qapevakswa 1621 alaswayrwg rkvvdnasqg egvrllprek sevqnllpdt iteeekeriy gilgqavcrp 1681 agiqdeditl q iLscedr.ee ddmvdviwrq lisscpwlse ldesategvi kvwrkvvdri 1741 fslyklscsa yftflklnag qipldeddpr lhlshrveqs tddmivmat1 rllrllvkha 1801 gelrqylehg lettptapwr giipql fsxl nhpevyvrqs icnllcrvaq dsphlilypa 1861 ivgtislsse sqasgnkfst a ip111gn iq geel1vsece ggsppasqds nkdepksgln 1921 edqammqdcy skivdklssa nptmvlqvqm lvaelrrvtv lwdelwlgvl lqqhmyvlrr 1981 iqqledevkr vqnrmtlrke ekiaimrekh talmkpivfa lehvrsitaa paetphekwf 2041 qdnygdaien aleklktpln pakpgsswip fkeimlslqq raqkrasyi1 rleeispwla 2101 amtnteialp gevsardtvt ihsvggti ti lptktkpkki ".n gsdgksy pylfkgledl 2161 hlderimqfl sivntmfati nrqetprfha rhysvtplgt rsgliqwvdg atplfglykr 2221 wqqreaalqa qkaqdsyqtp qnpgivprps elyyskigpa lktvglsldv srrdwplhvm 2281 kavleelmea tppnllakel wsscttpdew wrvtqsyars tavmsmvgyi iglgdrhldn 23 41 v1idm1.1yev vhidynvcfe kgkslrvpek vpfrmtqnie talgvtgveg vfrlsceqvl 2401 himrrgretl 1tileafvyd plvdwtagge agfagavygg ggqqaeskqs kremereitr 2461 slfssrvaei kvrrwfknrde mlvvlpkldg S1 ciéyl s1qe qltdveklqg klleeiefle 2521 gaegvdhpsh tlqhryseht qlqtqqravq eaiqvklnef eqwithyqaa fnnleatqla 2581 sllqeistqm dlgppsyvpa taflqnagqa hlisqceqle gevgallqqr rsvlrgcleq 2641 lhhyatvalq ypkaifqkhr ieqwktwmee licnttverc qelyrkyemq yapqppptvc 2701 qfitatemtl qryaadinsr 1 ixqvee1 kq eavtvpvced q1k o ic rc ik. vflhengeeg 2761 slslasviis a Lc11 I.rrn I mmegaassag eqlvdltsrd gawf1cc1 es msgnvtclvq 2821 llkqchlvpq dldipnpmea setvhlangv ytslqelnsn frqiifpeal rclmkgeytl 2881 esmlheldgl ieqttdgvpl qtlveslqay lrnaamglee ethahyidva rllhaqygel 2941 iqprngsvde tpkmsagqml lvafdgmfaq vetafsllve k1nkmeLpia wrkidiirea 3001 rstqvnffdd dnhrqvleei fflkrlqtik eff rlcgtf s ktlsgsssle dqntvngpvq 3061 ivnvktlfrn sefsedqmak pikaftadfv rqlliglpnq algltlcsfi salgvdiiaq 3121 veakdfga ss kvsvddlckk avehniqigk fsqlvmnrat vlassydtaw kkhdlvrrle 3181 tsisscktsl qrvqlhiamf qwqhedllin rpqamsvtpp prsailtsmk kklhtlsqie 324'. tsiatvqekl aa lessíeqr lkwagganpa lapv 1qd íoa t iaoern1v1 kesqrasqvt 3301 flcsniihfe slrtrtaeal nldaalfeli krcqqmcsfa sqfnssvsel elrllqrvdt 3361 glehpigsse wllsahkqlt qdmstqraiq tekeqqietv cetiqnlvdn iktvltghnr 3421 qlgdvkhllk amakdeeaal adgedvpyen svrqflgeyk swqdniqtvl ftlvqaragqv 3481 rsqehvemlq eitptlkelk tqsqsiynnl vsfasplvtd atnecsspts satyqpsfaa 3541 avrsntgqkt qpdvmsqnar kliqknlats adtppstvpg tgksvacspk kavrdpktgk 3601 avqernsyav svwkrvkakl egrdvdpnrr msvaeqvdyv ikeatnldnl aqlyegwtaw 3661 v
Secuencia de nucleótidos SMG5 (No. de entrada del GenBank NM_015327.2, nt 150-3200) (SEQ ID NO:9)
150 a tgagccaagg cccccccaca ggggagagca 181 gcgagcccga agcaaaagtc ctecacacta agcggcttta ccgggctgtg gtggaggctg 241 tgcatcgact tgacctea Le ctttgcaaca aaactgctta tcaagaagta ttcaaaccag 301 aaaacattag cctgaggaac aagctgcgtg agctctgcgt caagcttatg ttcctgcacc 361 cagtggacta tgggagaaag gctgaggagc tgctgtggag aaaggtatac tatgaagtta 421 tccagcttat caagactaac aaaaagcaca tccacagccg gageactttg gaatgtgcct 481 acaggacgca cctggttgct ggtattggct tctaccagca tctccttctc tatatccagt 541 cccactacca gctggaactg cagtgctgca tcgactggac ccatgtcact gaccccctca 601 taggatgcaa gaagccagtg Lctgc ctca g ggaaggagat ggattgggca cagatggcat 661 gtcaccgatg tctggtgtat ctgggggatt tgtcccgata tcagaatgaa ttagctggcg 721 tagataccga getgctagee gagagatttt actaccaagc cctgtcagta gctcctcaga 781 ttggaatgcc cttcaatcag ctgggcaccc tggcaggcag caagtactat aatgtggaag 841 ccatgtattg ctacctgcgc tgcatccagt cagaagtgtc ctttgaggga gcctatggga 901 acctcaagcg gctgtatgae aaggcagcea aaatgtacca ccaactgaag aagtgtgaga 961 ctcggaaact gtctcctggc aaaaagcgat gtaaagacat taaaaggttg ctagtgaact 1021 ttatgtatct gcaaagcctc ctacagccca aaagcagctc cgtggactca gagctgacct 1081 cactttgcca gtcagtcctg gaggacttca acctctgcct cttctacctg ccctcctcac 1141 ccaacctcag cctggccag L. gaggatgagg aggagtatga gagtgga4 at ge 4.4.Lcctcc 1201 cggaccttct catctttcaa atggtcatca tetgeettat gtgtgtgcac agcttggaga 1261 gagcaggatc caagcagtac agtgcagcca ttgccttcac cctggccctc ti.ttcccacc 1321 tcgtcaatca tgtcaacata cggctgcagg ctgagctgga agagggcgag aatcccgtcc 1381 cggcattcca gagtgatggc acagatgaac cagagtccaa ggaacctgtg gagaaagagg 1441 aggagccaga tcctgagcct cctcctgtaa caccccaagt gggtgagggc agaaagagee 1501 gtaagttctc tcgcctctcc tgtctccgcc gtcgccgcca cccacccaaa gttggtgatg 1561 acagtgacct gagtgaaggc tttgaatcgg actcaagcca tgactcagcc cgggccagtg 1621 agggctcaga cagtggctct gacaagagtc ttgaaggtgg gggaacggcc tttgatgctg 1681 aaacagactc ggaaatgaat agccaggagt cccgatcaga cttggaagat atggaggaag 1741 aggaggggac acggtcacea accctggage cccctcgggg cagatcagag gctcccgatt 1801 ccctcaatgg cccactgggc cccagtgagg e t a g e a t t g c c a g c a a t e t a caagccatgt 1861 ccacccagat gttecagact aagcgctgct tccgactggc ceceaccttt ageaacctgc 1321 tcctccagcc caccaccaac cctcata cet. cggccagcca caggccttgc gtcaatgggg 1981 atgtagacaa geetlcagag ccagcctctg aggagggctc tgagtcggag gggagtgagt 2041 ccagtggacg ctcctgtcgg aatgagcgca gcatccagga gaagcttcag gtcctgatgg 2101 ccgaaggtct gcttcctgct gtgaaagtct tcctggactg gcttcggacc aaccccgacc 2161 tcatcatcgt gtgtgcgcag ágetetcaaa gteL gtggaa ccgcctgtet gtgttgctga 2221 atctgttgcc tgctgctggt gaactccagg agtctggcct ggccttgtgt cctgaggtcc 2281 aagatcttct tgaaggttgL gaactgcctg acctcccctc tageettetg ctcccagagg 2341 acatggctct tcgtaacctg cccccgctcc gagctgccca cagacgcttt aactttgaca 2401 cggatcggcc cctgctcagc accttagagg agtcagtggt gcgcatctgc tgcatccgca 2461 gctttggtca tlteategee cgcctgcaag geageatcct gcagttcaac ccagaggttg 2521 gcatcttcgt cagcattgcc cagtctgagc aggagagcct getgcagcag gcccaggcac 2581 agttccgaat ggcacaggag gaagctcgtc ggaacaggct catgagagac atggctcagc 2641 tacgacttca gctcgaagtg tctcagctgg agggcagcct gcagcagccc aaggcccagt 2701 cagccatgtc tccctacctc gtccctgaca cccaggccct ctgccaccat ctccctgtca 2761 tccgccaact ggccaccag L. ggccgcttea ttgtea teat cccaaggaca gtgatcgatg 2321 gcctggattt gctgaagaag gaacacccag gggcccggga tgggattcgg tacctggagg 2881 cagagtttaa aaaaggaaac aggtacattc gctgccagaa agaggtggga aagagctttg 2941 agcggcataa gctgaagagg caggatgcag atgcctggac teL ctataag atcctagaca 3001 gctgcaaaca gctgactctg gcccaggggg caggtgagga ggatccgagt ggcatggtga 3061 ccatcatcac aggccttcca ctggacaacc ccagcgtgct ttcaggcccc atgcaggcag 3121 ccctgcaggc cgctgcccac gccagtgtgg acatcaagaa tgttctggac ttctacaagc 3181 agtggaagga aattggttga
Secuencia de aminoácidos SMG5 (No. de entrada del GenBank NP_056142.2) (SEQ ID NO:10)
1 msqgpptgea sepeakvlht krlyrawea vhrldlilcn ktayqevfkp enislrnklr 61 o l e v k l m f 1h pvdygrkaee llwrkvyyev i q : i k t n k k h ihs rstlcea yrthlvagig 121 f y q h 1y iq shyqlelqcc idwthvtdpl igckkpvsas gkemdwaqma chrclvylgd 181 lsryqnelag vdtellaerf yyqalsvapq igmpfnqlgt lagskyynve amycylrciq 241 sevsfegayg nlkrlydkaa kmyhqlkkce trklspgkkr c k d L k r l l v n fir.y1qs 11qp 301 ksssvdselt slcqsvIedi a1 c1 £ylp ss p n 1s Iasede eeyesgyaI1 pd Lliiemv i 361 iclmcvhsle ragskqysaa iaftlalf ah lvnhvnirlq aeleegenpv pafqsdgtde 421 peskepveke eepdpepppv tpqvgegrks rkfsrlsclr rrrhppkvgd dsdlsegfes 481 dsshdsaras egsdsgsdks lsggg Lafda etdsemnsqe s rsdsames eegtrsptle 541 pprgrseapd slngplgpae aaiaanlqam atqrafqtkrc frlaptfanl llqpttnpht 6 0 : sashrpcvng dvdkpaepaa eegsesegae ssgrscrner siqeklqvlm aegllpavkv 661 fldwlrtnpd 1i ivcaqssq si wnrlsvl 1 nllpaagelq esglalepev qdl egcel p 721 dlpsslllpe dmalrnlppl raahrrfnfd tdrpllstle eswriccir sfghfiarlq 781 gsilqfnpev gifvsiaqse qesllqqaqa qfrmaqeear rnrlmrdmaq 1 r l q 1e v s q l 841 egslqqpkaq samspylvpd tqalchhlpv irqlatsgrf iviíprtvid gldllkkehp 001 gardgiryle aefkkgnryi rcqkevgksf erhklkrqda dawtlykild sckqltlaqg 961 ageedpsgmv ti itglpldn psvlsgpmqa alqaaahasv Ó iknv C yk qwkeig
Secuencia de nucleótidos SMG6 (No. de entrada del GenBank BC064916.1, nt 296-1831) (SEQ ID NO:11)
28 6 atgga 301 gacattccct gcagtggctg agaaggtcct caaggagttc eaggtgttac tgcagcacag 361 cccctctccc aL tggaagta cccgcatgct gcagcttatg aceatcaaLo tgtttgcagt 421 acacaactcc cagctgaaag actgcttctc ggaggagtgc cgctctgtga tccaggaaca 481 agccgcagct ctgggcttgg ccatgttttc tctactggtc cgccgctgca cctgcttact 541 taaggagtcc gccaaagcL c agctgtcctc tcctgaggac caggatgacc aagacgacat 601 caaggtgteL teetttgtcc cggacctgaa ggagctgctc cccagtgtea aagtctggtc 661 agattggatg ctcggctacc cggacacctg gaatcctcct cccacatece tggatctgcc 721 etegeatgt i. getgtggatg tatggtcgac ge tggctgat ttctgtaaca tactgactgc 781 agtgaatcag tctgaggtge cactgtacaa ggacccggat gatgacctca ccctL cttat 341 cctggaagag gatcggcttc tctcgggctt tgtccccttg ctggctgccc ctcaggaccc 801 ctgctacgtg gagaaaacct cggataaggt La ttgeaget gactgcaaaa gggtcacagt 361 gctgaagtat tttctggaag ccctttgtgg acaagaagag cctctgctgg cattcaaggg 1021 tggaaagtat gtgtcagtgg cacecgtccc agacaccatg ggaaaggaaa tgggaagcca 1081 agagggaaca cgactggaag atgaggagga ggatgtggtg attgaagact ttgaggaaga 1141 11 cagagget gaaggcagcg gaggcgagga tgacatcagg gagcttcggg ccaagaagct 1201 ggctctggcc aggaagatag ctgagcagca gcgtcgccag gaaaagatcc aggctgtcct 1261 ggaggaccac agtcagatga ggcagatgga gctcgaaate agacctttgt tcctcgtacc 1321 agacaccaac ggcttcattg accacctggc cagtctggcg cggctgctgg agagcaggaa 1381 gtacatcctg gtggtgcccc tcatcgtgat caatgagctg gacggcetgg ccaaggggea 1441 ggagacagac caccgggctg ggggctacgc ccg Lgtgg '.a caagagaagg cccgcaagtc 1501 catcgagttc ctcgagcagc gattegagag tcgggactct tgcctgcgag ccctgaccag 1561 ccgtggcaat gaactcgaat cca lcgce11 ccgcagtgag gacatcactg gccagctggg 1621 taacaacgat gatctcatcc tgtcctgctg cetecaetac tgcaaagaca aggctaagga 1681 cttcatgccc gccagcaaag aggagccaat ccggctactg cgggaggtgg tgctgttgac 1741 ggatgaccgg aacctgcgtg tgaaggcgct cacaaggaat gttcctgtac gggacatccc 1801 agccttcctc acgtgggccc aggtgggctg a
Secuencia de nucleótidos SMG6 (No. de entrada del GenBank AAH64916.1) (SEQ ID NO:12)
1 metfpavaek vlkefqvllq hspspigstr mlqlmtinmf avhnsqlkdc fseecrsviq 61 eqaaalglam fsllvrrctc llkesakaql sspedqddqd dikvssfvpd lkellpsvkv 121 wsdwmlgypd twnppptsld lpshvavdvw stladfcnil tavnqsevpl ykdpdddltl 181 lileedrlls gfvpllaapq dpcyvektsd kviaadckrv tvlkyfleal cgqeepllaf 241 kggkyvsvap vpdtmgkemg sqegtrlede eedvviedfe edseaegsgg eddirelrak 301 klalarkiae qqrrqekiqa vledhsqmrq meleirplfl vpdtngfidh laslarlles 361 rkyilvvpli vineldglak gqetdhragg yarvvqekar ksiefleqrf esrdsclral 421 tsrgnelesi afrseditgq lgnnddlils cclhyckdka kdfmpaskee pirllrevvl 481 ltddrnlrvk altrnvpvrd ipafltwaqv g
Secuencia de nucleótidos SMG7 (No. de entrada del GenBank BC036381.1, nt 119-3655) (SEQ ID NO:13)
119 a t 121 gagcctgcag agcgcgcagt acctccggca ggcagaagtc ctgaaggctg acatgacaga 181 ttctaagctg ggtccagctg aagtctggac atccaggcag gctctgcagg acctgtacca 241 gaaaatgcta gl_taccga Lt tggaatacgc tttagacaag aaagtagaac aggaL etetg 301 gaatcacgcc tttaagaatc agatcacaac actacaaggc caggcaaaga atcgagcaaa 361 tccgaategg agtgaagttc aggcaaacct ttctetgttc ctagaggcag ctagtggctt 421 ctatactcag t t a t t a c a a g aactgtgtac agtatttaat gtagalLea c catgccgtgt 4 81 gaagtcttcc caattgggaa LtaL cagcaa taaacagacg cataccagcg ceatagtgaa 541 gccacagtct agetoetgtt cctatatctg ccagcactgc ctcgtccacc ttggagacat 601 t g c t e g a t a c agaaaccaga ccagccaggc agagtcctac tataggcatg c a g c t e a g e t 661 tgt cccctcc aatggtcagc cttataatca gttggctatc ttagcttctt ccaaaggaga 721 ccatctgacc acaattttct actactgcag aagcattgct gtgaagttcc ctttcccagc tgcctccaoL ú j tctgcaaa aagcactttc taaagcactg gaaagccgag atgaggtgaa 841 aaccaagtgg ggtgtttctg acttcatcaa ggcctttatt aaattccacg gtcatgtgta 901 cctgagtaag agcttggaaa agttgagccc tettegagag aaattggaag aacagtttaa 961 gaggctgcta ttccaaaaag ctttcaactc teageagtta g LLca tgtea c Lgtcattaa 1021 cctgtttcaa cttcatcacc ttcgtgactt tagcaatgaa accgagcagc aoacttatag 106 1 ccaagatgag cagcta tg LL. ggacacagtt gctggccctc t t t a t g L c t t tleccggea t 1141 cctgtgcaag tgtcctctac agaatgagtc tcaggaggag tcctacaatg cctatcctct 1201 tccagcagtc aaggtctcca tggactggct aagactcaga cccagggtct ttcaggaggc 1261 agtggtggat gaaagacagt acatttggcc ctggttgatt tctcttctga atagtttcca 1321 Leecea Leaa gaggacctct caagtattag tgcgacacca cttccagagg agtttgaatt 1381 aeaa gga111 ttggcattga gaccttcttt caggaacttg gatttttcca aaggtcacca 1441 gggtattaca ggggacaaag aaggccagca aegaegaata cgacagcaac gcttgatctc 1501 tataggcaaa tggattgctg ataatcagcc aaggctgatt cagtgtgaaa atgaggtagg 1561 gaaattgttg 11La tcacag aaateccaga attaatactg gaagacccca gtgaagccaa 1621 agagaacctc attctgcaag aaacatctgt gatagagtcg ctggctgcag atgggagccc 1681 agggctaaaa teagtgetat ctacaagccg aaatttaagc aacaactgtg acacaggaga 1741 gaagccagtg gltacettca aagaaaacat taagacacga gaagtgaaca gagaccaagg 1801 aagaagtttt cctcccaaag aggtaaaatc ccagacagaa ctaagaaaga ctccagtgtc 186'. tgaagccaga aaaacaccLg taactcaaac cccaactcaa gcaagtaact cccagttcat 1821 ccccattcat caccctggag ccttccctcc tcttcccagc aggccagggt ttccgccccc 1981 aacatatgtt atccccccgc ctgtggcatt ttctatgggc tcaggttaca ccttcccagc 2041 Lee Lg tttcL etcccaggaa ccttLee tea gcctacagct caetetccag caggaaacca 2101 ggtgcaagct gggaaacagt cccacattcc ttacagccag caacggccct ctggaccagg 2161 gccaatgaac cagggacctc aacaatcaca gccaccttcc cagcaacccc ttacatcttt 2221 accagct.cag ccaacagcac agtctacaag ccagctgcag gttcaagctc taactcagca 2261 acaacaatcc cctacaaaag ctgtgccggc tttggggaaa agcccgccL c accactctgg 2341 attccagcag tatcaacagg cagatgcctc caaacagctg tggaatcccc ctcaggttca 2 401 aggcccatta gggaaaatta tgcctgtgaa acagccctac taccttcaga cccaagaccc 2461 c j taaaactq tttgagccgt cattgcaacc tcctgtaatg cagcagcagc ctctagaaaa 21:21 aaaaatgaag ccttttccca tggagccata taaccataat ccctcagaag tcaaggtccc 256 1 agaattcea c tgggattctt cctacagca ggctgataac agatctgtaa tggcacagca 2 641 agcaaacata gaccgcaggg gcaaacggtc accaggaatc ttccgtccag agcaggatcc 2701 tgtacccaga atgccgtttg aggaccccaa gagctcccct ctgcttcctc cggacctgtt 27 81 aaagagtctg gctgccttgg aggaagagga agagctgatt ttttctaaca cLcctgatet 2821 ttacccggct ctgctggggc ctctcgcetc tcttcctgga cgaagccttt ttaaatcctt 2881 attggagaag ccctcagagc tcatgtcaca ttcatcctct ttcctgtccc tcaccggatt 2 941 ctctctcaat caggaaagat acccaaataa tagtatgttc aatgaggtat atgggaaaaa 3001 cctgacatcc agctccaaag cagaactcag tccctcaatg gccccccagg aaacatctct 3061 gtattccctt tttgaaggga ctccgtggtc tccatcactt cctgccagtt cagatcattc 3121 aacaccagcc agccagtctc ctcattcctc taacccaagc agcctaccca getetcctce 3161 aacacacaac cataattctg ttccattctc caattttgga cccattggga ctccagataa 3241 cagggataga aggactgcag atcggtggaa aactgataag ccagccatgg gtgggtttgg 3301 ca LtgattaL ctctcagcaa cgtcatcctc tgagagcagt tggcatcagg ccagcactcc 3361 gagtggcacc tggacaggcc atggcccttc catggaggat tcctctgctg tcctcatgga 3421 aagcctaaag aagcaacagc atggggtcca gcagttgggg cccaaaagac agtctgaaga 3481 ggaaggaagc agcagtatct gcgtagccca cagagggccc aggcccctgc ccagctgcag 3541 tctcccagcc tccactttca gagtgaaatt caaggcagca cggacatgtg cccatcaggc 3601 acagaagaaa acacgacgtc gtccattttg gaagagaega aagaaaggaa aataa
Secuencia de aminoácidos SMG7 (No. de entrada del GenBank AAH36381.1) (SEQ ID NO:14)
1 mslqsaqylr qaevlkadmt dsklgpaevw ts rqaqdl y qkralvtdley ¿1 dkkveqd 61 wnhafknqit tlqgqaknra nprirsevqan lslfleaasg fytqllqelc tvfnvdlpcr 121 vkssqlgiis nkqthtsaiv kpqssscsyi eche 1vhIgd iaryrnqtsq aesyyrhaaq 18'. lvpsngqpyn qlailasskg dhltt iíyye rsiavkfpfp aastnlqkal skalesrdev 241 ktkwgvsdfi kafi kEhghv ylskslekls plrekleeqf kr13 rqkafn sqqlvhvtvi 301 nlfqlhhlrd ísneteqhty sqdeqlcwtq llalfmsflg ilckcplqne sqee synayp 361 lpavkvsmdw 1 rl rpi v rqe avvderqyiw pwli silnsf hpheedles i satp1pesie 421 lqgflalrps frnldfskgh qgitgdkegq qrrirqqrli sigkwiadnq prliqcenev 48 ' gkllf ite ip eliledpsea kenlilqets vieslaadgs pglksvlsts rnlsnncdtg 541 ekpvvtfken iktrevnrdq grsfppkevk sqtelrktpv searktpvtq tptqasnsqf £01 ipihhpgafp plpsrpgfpp ptyvipppva fsmgsgytfp agvsvpgtf1 qptahspagn 661 qvqagkqshi pysqqrpsgp gpmnqgpqqs qppsqqplts lpaqptaqst sqlqvqaltq 721 qqqsptkavp algkspphhs gfqqyqqada skqlwnppqv qgplgkimpv kqpyylqtqd 781 piklfepslq ppvmqqqple kkmkpfpmep ynhnpsevkv pefywdssys madnrsvmaq 841 qanidrrgkr spgií rpeqd pvprmpfedp ksspllppdl 1kslaaleee eelifsntpd 50'^ lypallgpla sipg ts1 Tks llekpselms hsssflsltg fsinqerypn nsmfnevygk 961 nltssskael spsmapqets lyslfegtpw spslpassdh stpasqsphs srrpsslpssp 10 2 pthnhnsvpf snfgpigtpd nrdrrtadrw ktdkpamggf gidylsatss sesswhqast 1081 psgtwtghgp smedssavlm eslkkqqhgv qqlgpkrqse eegsssicva hrgprplpsc 1141 slpastfrvk fkaartcahq aqkktrrrpf wkrrkkgk

Claims (15)

r e iv in d ic a c io n e s
1. Un método in vitro para reducir la toxicidad de TDP-43 en una célula neuronal humana o en una célula glial humana que padece o es susceptible de padecer dicha toxicidad, que comprende:
proporcionar a la célula una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido UPF1, reduciendo así la toxicidad de TDP-43 en la célula.
2. El método de la reivindicación 1, en el que la cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad que se correlaciona con una probabilidad estadísticamente significativa de reducir la toxicidad de TDP-43 en la célula.
3. El método de la reivindicación 1 o 2, en el que la etapa de proporcionar comprende administrar una composición que comprende el polipéptido UPF1; o
donde la etapa de proporcionar comprende administrar una composición que comprende un ácido nucleico que codifica el polipéptido UPF1.
4. Un polipéptido UPF1 para su uso en el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) en un sujeto humano, en el que el polipéptido UPF1 se administrará a un sujeto que padece o es susceptible de padecer ELA, y en el que (i) la ELA está asociada con la toxicidad de TDP-43; o
(ii) el sujeto no tiene ninguna mutación en el gen SOD1.
5. El polipéptido UPF1 para su uso de la reivindicación 4, en el que debe administrarse una composición que comprende el polipéptido UPF1; o
en el que debe administrarse una composición que comprende un ácido nucleico que codifica el polipéptido UPF1.
6. El polipéptido UPF1 para su uso de la reivindicación 5, en el que el polipéptido UPF1 o el ácido nucleico debe administrarse en el SNC del sujeto.
7. El polipéptido UPF1 para su uso de la reivindicación 5 o 6, en el que el polipéptido UPF1 o el ácido nucleico debe administrarse al sujeto mediante inyección intratecal.
8. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido UPF1 o un ácido nucleico que codifica un polipéptido UPF1, y un excipiente farmacéuticamente aceptable para usar en el tratamiento de la ELA, en el que (i) la ELA está asociada con la toxicidad de TDP-43; o
(ii) el sujeto que tiene ELA no tiene ninguna mutación en el gen SOD1.
9. La composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 8, que comprende además un agente de reconocimiento.
10. La composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 8 o 9, en la que el polipéptido UPF1 comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEO ID NO: 2, o comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
11. El polipéptido UPF1 para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en el que el polipéptido UPF1 comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, o comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
12. Un ácido nucleico que codifica el polipéptido UPF1 para su uso en el tratamiento de ELA en un sujeto humano que padece o es susceptible de padecer ELA, en el que
(i) la ELA está asociada con la toxicidad de TDP-43; o
(ii) el sujeto no tiene ninguna mutación en el gen SOD1.
13. El ácido nucleico que codifica el polipéptido UPF1 para su uso de la reivindicación 12, en el que el ácido nucleico codifica un polipéptido UPF1 que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, o que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
14. El polipéptido UPF1 para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, la composición farmacéutica para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 o el ácido nucleico que codifica UPF1 para el uso de la reivindicación 12 o 13, en donde la ELA está asociada con la toxicidad de TDP-43.
15. El polipéptido UPF1 para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, la composición farmacéutica para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 o el ácido nucleico que codifica UPF1 para el uso de la reivindicación 12 o 13, en donde el sujeto no tiene ninguna mutación en el gen SOD1.
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