ES2772073T3

ES2772073T3 - Microscopía confocal rápida para apoyar procedimientos quirúrgicos

Info

Publication number: ES2772073T3
Application number: ES09801090T
Authority: ES
Inventors: Daniel S Gareau
Original assignee: Sloan Kettering Institute for Cancer Research; Oregon Health Science University
Current assignee: Oregon Health Science University; Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Priority date: 2008-07-25
Filing date: 2009-07-24
Publication date: 2020-07-07
Anticipated expiration: 2029-07-24
Also published as: EP2318875A1; AU2009273838A1; US20110116694A1; US20160018632A1; EP2318875A4; US10001635B2; EP2318875B1; WO2010011953A1; US9176310B2; CA2731956A1

Abstract

Un método para presentar una imagen multimodal desde un microscopio confocal, que comprende: poner en contacto una superficie de una muestra biológica extirpada con un colorante fluorescente nuclear que marca selectivamente núcleos en modo de fluorescencia; iluminar un punto en la superficie de la muestra biológica extirpada con un haz de luz utilizando un microscopio confocal; detectar una primera intensidad de emisión desde el punto en un primer intervalo de propiedades ópticas, en donde la primera intensidad de emisión es del colorante fluorescente nuclear; detectar una segunda intensidad de emisión desde el punto en un segundo intervalo de propiedades ópticas, en donde la segunda intensidad de emisión es de una reflectancia sin tinción; y colorear un píxel que corresponde al punto en una imagen utilizando una combinación lineal de la primera intensidad de emisión detectada desde el punto y la segunda intensidad de emisión detectada desde el punto, en donde colorear el píxel comprende la utilización de una combinación lineal de componentes de color de un colorante de hematoxilina púrpura multiplicada por la intensidad de emisión de fluorescencia desde el punto para imitar un colorante de hematoxilina púrpura, y de componentes de color de un colorante de eosina rosa multiplicado por la intensidad de emisión de reflectancia desde el punto para imitar un colorante de eosina rosa.

Description

DESCRIPCIÓN

Microscopía confocal rápida para apoyar procedimientos quirúrgicos

Antecedentes de la invención

1. Campo de la invención

Las realizaciones de la presente invención se refieren a microscopía confocal con fluorescencia para apoyar procedimientos quirúrgicos, como la cirugía por etapas para extirpar tumores que no son naturalmente visibles para un cirujano. En algunas realizaciones, la microscopía confocal multimodal se utiliza para representar imágenes que emulan secciones histológicas congeladas.

El documento US 6195451 B describe un medio para teñir una muestra con un tinte fluorescente, un medio para producir una imagen de campo oscuro de la muestra teñida con el tinte fluorescente, y un medio para transformar una imagen de una muestra teñida con uno o más tintes de campo oscuro en una imagen teñida con uno o más tintes de campo brillante para examinarla en un monitor de ordenador.

2. Descripción de la técnica relacionada

Varios procedimientos quirúrgicos para extirpar tumores implican una morfología celular que es difícil de discernir a simple vista. En tales circunstancias, se realizan sucesivas escisiones por etapas y cada muestra de tejido resecado se somete a un examen histológico para determinar la extensión restante del tumor. La posición y extensión del tumor que se evidencia en las secciones histológicas se utilizan para guiar la próxima escisión. Sin embargo, el procedimiento para preparar las secciones histológicas es tedioso y lento, que a menudo supera los 30 minutos por sección. Así, los procedimientos quirúrgicos que dependen de tales secciones histológicas pueden extenderse a dos horas y más, aumentando la exposición del paciente a infecciones y consecuencias indeseables de la cirugía, y limitando la disponibilidad de los cirujanos para otros procedimientos.

Por ejemplo, la cirugía de Mohs para la extirpación del carcinoma de células basales (CCB) de piel a menudo requiere varias escisiones. Después de cada escisión, se prepara una sección histológica congelada mientras el cirujano espera. La ubicación y extensión del tumor evidente en la sección histológica congelada guía la próxima escisión. La preparación de la sección histológica congelada, incluyendo la tinción para mejorar la visibilidad de ciertas estructuras, es tediosa y se tardan de 24 a 40 minutos. Por lo tanto, la cirugía suele durar varias horas.

Otros procedimientos quirúrgicos que implican ver la histología de las escisiones por etapas incluyen la extirpación de lesiones de la mucosa oral, de nódulos tiroideos, de glándulas paratiroides y del hueso, e incluyen biopsias con aguja gruesa y lumpectomías de mama, así como biopsias de hígado y vejiga interoperatorias, entre otras.

La microscopía confocal es capaz de observar directamente, en tiempo real, estructuras muy pequeñas en un campo de visión muy pequeño y puede observar directamente tumores en tejido extirpado. Un microscopio confocal logra una resolución muy alta al utilizar la misma lente objetivo para enfocar tanto un haz paralelo de luz incidente como la luz resultante emitida en el mismo pequeño punto en o cerca de la superficie del tejido objetivo. Por ejemplo, un microscopio confocal típico que utiliza una lente objetivo que magnifica un objeto en el plano focal 30 veces (30X) resuelve puntos que son aproximadamente de la mitad de un micrómetro (pm, 1 pm = 10-6 metros) transversalmente, suficiente para resolver la morfología del núcleo de una célula, que es de aproximadamente 10 micrómetros. Se obtiene un campo de visión escaneando el punto confocal a través del tejido cambiando el ángulo del haz de luz incidente. En un ejemplo de microscopio confocal, el campo de visión es de aproximadamente 400 pm e incluye aproximadamente 1024 filas y 1024 columnas de píxeles, para una imagen individual de aproximadamente un millón de píxeles.

Este campo de visión del microscopio confocal es pequeño en comparación con el campo de visión de las secciones histológicas. Una sección histológica a menudo incluye un campo de visión que varía de milímetros a decenas de milímetros (mm, 1 mm = 10-3 metros) transversalmente, aproximadamente cuarenta veces más grande que el campo de visión del microscopio confocal. Por ejemplo, en la cirugía de Mohs, se utiliza un aumento de 2X en un microscopio óptico estándar para ver una porción de 12 mm por 12 mm (12x12 mm) de la sección histológica congelada.

Yanyun Li et al.: Dual mode reflectance and fluorescence confocal laser scanning microscopy for in vivo imaging melanoma progression in murine skin, Journal of investigative dermatology, vol. 125, n.° 4, 1 de octubre de 2005 (2005-10-01), las páginas 798-804 describen un sistema de formación de imágenes confocales in vivo por contraste simultáneo de fluorescencia y reflectancia la piel murina utilizando fuentes de luz láser de 488 nm (modo de fluorescencia) y 830 nm (modo de reflectancia).

Algunos ejemplos

Los aspectos de la invención son de conformidad con la reivindicación independiente adjunta. Se proporcionan técnicas de microscopía confocal, que ofrecen una o más ventajas sobre los enfoques de la técnica anterior.

En un conjunto de ejemplos ilustrativos, un aparato para montar tejido extirpado para su examen con un microscopio confocal incluye una platina y un portamuestras. La platina está configurada con el fin de ajustarse para alinear una superficie de la platina con un plano focal de un microscopio confocal. El portamuestras incluye una placa transparente configurada para comprimir una muestra de tejido extirpado. El portamuestras se monta de forma extraíble en la platina de modo que la placa transparente quede al ras con la superficie que está alineada con el plano focal del microscopio confocal sin un ajuste adicional de la platina.

En otro conjunto de ejemplos ilustrativos, un aparato incluye un miembro de soporte que incluye un orificio pasante axial con una sección transversal no circular. Se fija una placa transparente en un extremo del orificio pasante axial. Una placa tiene una sección transversal no circular que coincide con la sección transversal no circular del orificio pasante axial. Un pistón está configurado para dirigir la placa dentro del orificio pasante axial hacia la placa transparente y comprimir una muestra de tejido extirpado entre la placa y la placa transparente. En algunos de estos ejemplos, un gel está configurado para colocarse entre la placa y el tejido extirpado durante la compresión del tejido extirpado entre la placa y la placa transparente. El gel, cuando está comprimido, retiene el tejido extirpado comprimido contra la placa transparente para evitar un movimiento lateral del tejido extirpado comprimido con respecto a la placa transparente.

En otro conjunto de ejemplos ilustrativos, un método incluye determinar una posición z de reflectancia máxima en cada una de las tres posiciones horizontales para una platina móvil. Uno o más tornillos de ajuste en la platina se controlan con un actuador de microposicionamiento para que las posiciones z ajustadas para las tres posiciones horizontales sean paralelas a un plano focal de un microscopio confocal.

En otro conjunto de ejemplos ilustrativos, un método para corregir automáticamente un plano focal de un microscopio confocal incluye determinar una posición z de reflectancia máxima en cada una de las tres posiciones horizontales para una platina móvil. Se determina un plano a través de las posiciones z de máxima reflectancia en las tres posiciones horizontales. Se determina una ubicación z para una lente objetivo en cada posición horizontal para la platina móvil, de modo que la lente objetivo se enfoca a una distancia constante del plano. Una posición vertical de la lente objetivo se controla con un actuador de microposicionamiento para que coincida con la ubicación z de la lente objetivo correspondiente a una posición horizontal actual de la platina móvil.

En otro conjunto de ejemplos ilustrativos, un método para fusionar imágenes superpuestas de un microscopio confocal incluye determinar una traslación de una primera imagen con respecto a una segunda imagen que minimiza una diferencia de intensidad lumínica en una región de superposición entre la primera imagen y la segunda imagen. Las intensidades lumínicas de un píxel en la región de superposición de la primera imagen y de un píxel correspondiente en la segunda imagen trasladada se promedian para producir una imagen fusionada.

En otro conjunto de ejemplos ilustrativos, un método para corregir la iluminación incluye recibir un conjunto de múltiples imágenes desde un microscopio confocal. Cada imagen incluye una matriz bidimensional de píxeles, ubicados mediante un número de fila y un número de columna, y cada imagen cubre una porción diferente de una única muestra. Se determina una intensidad promedio de píxeles para cada ubicación de píxel promediando los valores de intensidad en la ubicación de píxel sobre cada imagen del conjunto. Una corrección de iluminación de píxeles basada en la intensidad promedio de píxeles para cada ubicación de píxel se aplica a cada píxel en la ubicación de píxel en el conjunto de imágenes.

En otro conjunto de ejemplos ilustrativos, un método para detectar núcleos celulares con un microscopio confocal incluye poner en contacto una superficie de una muestra de tejido extirpado con una solución de naranja de acridina. Un punto en la superficie de la muestra extirpada se ilumina con un haz láser con una longitud de onda de aproximadamente 488 nanómetros (nm, 1 nm = 10-9 metros). La intensidad de emisión fluorescente desde el punto se detecta en un intervalo de longitud de onda por encima de aproximadamente 500 nm.

De acuerdo con la invención, se proporciona un método para presentar una imagen multimodal de un microscopio confocal que comprende: incluye poner en contacto una superficie de una muestra biológica extirpada con un colorante fluorescente nuclear que marca selectivamente los núcleos en modo de fluorescencia; iluminando un punto en una superficie de la muestra biológica extirpada con un haz de luz utilizando un microscopio confocal, detectar una primera intensidad de emisión desde el punto en un primer intervalo de propiedades ópticas, en donde la primera intensidad de emisión es del colorante fluorescente nuclear; detectar una segunda intensidad de emisión desde el punto en un segundo intervalo de propiedades ópticas, en donde la segunda intensidad de emisión es de una reflectancia sin tinción; y colorear un píxel que corresponde al punto en una imagen utilizando una combinación lineal de la primera intensidad de emisión detectada desde el punto y la segunda intensidad de emisión detectada desde el punto, en donde colorear el píxel comprende la utilización de una combinación lineal de componentes de color del colorante de hematoxilina púrpura multiplicado por la intensidad de emisión de fluorescencia desde el punto para imitar un colorante de hematoxilina púrpura, y los componentes de color del colorante de eosina rosa multiplicado por la intensidad de emisión de reflectancia desde el punto para imitar un colorante de eosina rosa.

En otro conjunto de ejemplos ilustrativos, un aparato para modular la longitud de onda de irradiancia en un microscopio confocal que tiene una pluralidad de láseres, incluye un detector para seguir cada ciclo de movimiento de un espejo utilizado para escanear una dirección de un plano focal del microscopio confocal con irradiancia. Un componente de deflexión desvía diferencialmente una pluralidad correspondiente de haces láser de la pluralidad de láseres. Un controlador hace que el componente de deflexión desvíe un haz láser diferente de la pluralidad de haces láser hacia el espejo con cada ciclo. En algunos de estos ejemplos ilustrativos, el componente de deflexión es un deflector acústico-óptico.

En uno o más ejemplos ilustrativos adicionales, un aparato, sistema o medio legible por ordenador está configurado para realizar una o más etapas de los métodos anteriores.

Breve descripción de los dibujos

La presente invención se ilustra, a modo de ejemplo y no a modo de limitación, en las figuras de los dibujos adjuntos y en los que los números de referencia similares se refieren a elementos similares y en los que:

la figura 1 es un diagrama de bloques que ilustra un ejemplo de aparato para fijar una muestra en un plano focal de un microscopio confocal;

la figura 2A es un diagrama de bloques que ilustra una platina y una vista despiezada de un portamuestras; la figura 2B es un diagrama que ilustra un ejemplo de dimensiones de una carcasa de pistón y de un pistón; la figura 3A es un diagrama de flujo que ilustra a un alto nivel un método para producir una imagen fusionada; la figura 3B es un diagrama de flujo que ilustra una etapa del método de la figura 3A;

la figura 4A, la figura 4B, la figura 4C, la figura 4D y la figura 4E son imágenes de fluorescencia que ilustran la aplicación de fusión de imágenes para el microscopio confocal;

la figura 5 es un diagrama de flujo que ilustra a un alto nivel un método para corregir la intensidad de una iluminación no uniforme;

la figura 6 es un diagrama de flujo que ilustra a un alto nivel un método para obtener fluorescencia que proporciona un alto contraste en los núcleos celulares con una tinción rápida;

la figura 7A es un diagrama de bloques que ilustra un microscopio confocal de reflectancia/fluorescencia multimodal;

la figura 7B es un diagrama de bloques que ilustra un microscopio confocal de reflectancia/fluorescencia multimodal;

la figura 7C es un diagrama de bloques que ilustra un microscopio confocal de reflectancia/fluorescencia multimodal;

la figura 8 es un gráfico que ilustra la intensidad de emisión de fluorescencia detectada;

la figura 9 es un diagrama de flujo que ilustra a un alto nivel un método para producir una imagen multimodal, de acuerdo una realización;

la figura 10 es una imagen que ilustra el modo de fluorescencia individual del microscopio, de acuerdo una realización;

la figura 11 es una imagen que ilustra el modo de reflectancia individual del microscopio en la misma muestra, de acuerdo una realización;

la figura 12 es una imagen que ilustra la coloración de píxeles para asemejarse a la histología, de acuerdo una realización;

la figura 13 es una imagen que ilustra un ejemplo de histología;

la figura 14 es una imagen que ilustra una porción ampliada de la imagen en color de la figura 12, de acuerdo una realización;

la figura 15 es un diagrama de bloques que ilustra un sistema informático;

la figura 16A es un diagrama de bloques que ilustra una platina ajustable y un portamuestras extraíble;

la figura 16B es un diagrama de bloques que ilustra un ajuste automatizado;

la figura 17 es un gráfico que ilustra perfiles de absorción para dos tinciones fluorescentes, de acuerdo una realización; y

la figura 18 es un gráfico que ilustra la coloración de píxeles de dos imágenes de fluorescencia para una asemejarse a la histología, de acuerdo una realización.

Descripción detallada

Se describen técnicas para microscopía confocal rápida, tal y como resulta útil en procedimientos quirúrgicos. En la siguiente descripción, a efectos de explicación, se exponen numerosos detalles específicos para proporcionar una comprensión exhaustiva de la presente invención. No obstante, para un experto en la materia será evidente que la presente invención se puede poner en práctica sin estos detalles específicos. En otros casos, se muestran estructuras y dispositivos bien conocidos en forma de diagrama de bloques para evitar ensombrecer innecesariamente la presente invención.

Por comodidad, el término emisión se utiliza en el presente documento para referirse a cualquier luz de un objeto, ya sea generada por el objeto, tal como la fluorescencia, o reflejada desde el objeto. Algunas realizaciones de la invención se describen a continuación en el contexto de la cirugía de Mohs para la escisión por etapas de carcinomas CCB. Sin embargo, la invención no está limitada a este contexto. En otras realizaciones, la microscopía confocal rápida se utiliza como apoyo en otras cirugías por etapas y biopsias intraoperatorias para varias cirugías para tratar varios trastornos, incluyendo y, por lo tanto, sin limitarse a, la eliminación de lesiones de la mucosa oral, de nódulos tiroideos, de glándulas paratiroides y del hueso, e incluyen biopsias con aguja gruesa y lumpectomías de mama, así como biopsias de hígado y vejiga interoperatorias.

1. Visión de conjunto

Se ha determinado que los microscopios confocales configurados con una platina de movimiento gradual pueden recopilar múltiples imágenes en dos dimensiones que se pueden juntar en un mosaico para proporcionar un campo de visión más amplio, comparable a un campo de visión proporcionado por las secciones histológicas y en el que se confía durante las cirugías por etapas. (Véase Patel Y. G., Nehal K. S., Aranda I., Li Y., Halpern A.C., Rajadhyaksha M., "Confocal reflectance mosaicing of basal cell carcinomas in Mohs surgical skin excisions", J. Biomed. Optics, vol.

12, n.° 3, pág. 034027, 2007)

Por otro lado, el inventor ha determinado que las imágenes de microscopía confocal fluorescente dispuestas en un mosaico pueden servir de apoyo a la cirugía de Mohs en mucho menos tiempo (9 minutos o menos) que las secciones histológicas congeladas (24 minutos o más). Véase D. S. Gareau, Y. G. Patel, Y. Li, I. Aranda, A.C. Halpern, K.S. Nehal y M. Rajadhyaksha, "Confocal mosaicing microscopy in skin excisions: a demonstration of rapid surgical pathology", Journal of Microscopy, vol. 233, n.° 1, págs. 149-159, enero de 2009 (en adelante Gareau). Por otro lado, el inventor ha determinado mejoras en la fijación de la muestra, corrección de la iluminación, fusión de imágenes y operación multimodal que aceleran o mejoran aún más los resultados en apoyo de los procedimientos quirúrgicos en general y la cirugía de Mohs en particular.

Los diversos ejemplos que admiten la microscopía confocal rápida para servir de apoyo para los procedimientos quirúrgicos se describen con más detalle en las siguientes secciones: 2. Aparato de fijación de tejidos; 3. Fusión de imágenes para mosaico; 4. Corrección de iluminación; 5. Tinción rápida para contraste de fluorescencia nuclear; y, 6. Presentación de imagen multimodal. El hardware informático para implementar algunos métodos en algunos ejemplos se describe en la sección 7, y la sección 8 indica ampliaciones y alternativas.

Estas técnicas aceleran o mejoran la rápida formación de imágenes. Utilizando estas técnicas, las imágenes pueden estar disponibles para una cirugía por etapas o biopsias intraoperatorias mucho antes de que las secciones histológicas puedan estar disponibles. Por lo tanto, estas técnicas tienen el potencial de sustituir la utilización de secciones histológicas durante la cirugía y, por lo tanto, de reducir costes para los hospitales de realización de tales cirugías y disminuir los peligros de la cirugía para el paciente.

2. Aparato de fijación de tejidos

Se han desarrollado algunas mejoras en la fijación de tejido en un plano focal para microscopía confocal. En primer lugar, un portamuestras para comprimir la muestra contra una ventana de visualización se separa de una platina que está en alineación fija (aunque no necesariamente en alineación paralela) con un plano focal de una lente objetivo del microscopio confocal. En segundo lugar, se configura un portamuestras para evitar que la muestra se tuerza mientras esta se comprime contra la ventana de visualización.

El portamuestras se separa de la platina porque se puede tardar varios minutos en ajustar los tornillos manuales para alinear una platina con el plano focal de la lente objetivo. Para ahorrar tiempo durante un procedimiento quirúrgico, los inventores configuraron la platina para que estuviera alineado de antemano. Una vez que comienza la cirugía y se recoge una muestra, la muestra se comprime en un portamuestras separado en unos pocos segundos. El portamuestras se coloca entonces en la platina previamente alineada, donde el portamuestras se puede mover lateralmente con facilidad para centrarse en la región de interés en otros pocos segundos. Bien la platina es paralela al plano focal o bien las desviaciones verticales en función de la posición horizontal se pueden compensar moviendo gradualmente la lente objetivo. Así, sin más ajustes, puede comenzar la recopilación de imágenes de microscopía confocal.

Así, de acuerdo con algunos ejemplos, un aparato para montar tejido extirpado para su examen con un microscopio confocal incluye una platina y un portamuestras. La platina está configurada para fijar una superficie de la platina con respecto a un plano focal de un microscopio confocal. El portamuestras incluye una placa transparente configurada para comprimir una muestra de tejido extirpado. El portamuestras se monta de forma extraíble en la platina de modo que la placa transparente esté en una relación conocida con la superficie que está en una alineación fija con el plano focal del microscopio confocal sin un ajuste adicional de la platina.

La figura 1 es un diagrama de bloques que ilustra un ejemplo de aparato 100 para fijar una muestra en relación con un plano focal de un microscopio confocal. El aparato 100 es un conjunto de portamuestras/platina alineados por separado que incluye un portamuestras 110 y una platina 150 separada. También se muestra una muestra 190 con fines ilustrativos; sin embargo, la muestra 190 no forma parte del aparato 100.

El portamuestras 110 incluye un componente de pistón 120 y una carcasa 130 de pistón. El componente de pistón 120 incluye el pistón 122. La carcasa 130 del pistón incluye un orificio pasante y una ventana 132. El pistón 122 se desplaza a través del orificio pasante para comprimir la muestra 190 contra la ventana 132 para su visualización. En algunos ejemplos, se incluye un disco de gel 140 en el orificio pasante entre la muestra 190 y el pistón 122 para ayudar a fijar la muestra 190 contra la ventana a fin de evitar un movimiento lateral y acolchar la muestra 190 frente al pistón 122. Cuando el pistón 122 se inserta en el orificio pasante de la carcasa 132, una superficie de la muestra se presiona plana contra la superficie superior de la ventana, como lo indica la ubicación de la superficie de la muestra 192. En un ejemplo, el componente de pistón 120 y la carcasa 130 del pistón están hechos de policarbonato, la ventana 132 está hecha de vidrio y el disco de gel 140 está hecho de gel de agarosa al 3 %. En algunos ejemplos, el gel tiene una forma especial para incluir una gran superficie convexa para presionar primero el centro de la escisión y una pequeña superficie cóncava para fijar la escisión en el centro de la ventana.

La platina 150 incluye una plataforma de visualización 160 y una montura 170 de plataforma. La montura 170 de la plataforma incluye una carcasa 172 de lente, una base 174, una lente objetivo 176 y una varilla 178. La varilla 178 conecta la base 174 a un motor de movimiento gradual de modo que la carcasa 172 de la lente, la base 174 y la plataforma 160 unida puedan moverse gradualmente en horizontal con respecto a la lente objetivo 176 y otros componentes ópticos (no mostrados) en ambas direcciones x e y. El movimiento gradual en las direcciones x e y se realiza para recopilar una matriz bidimensional de imágenes superpuestas que se pueden fusionar en un mosaico con un campo de visión más amplio que las imágenes individuales. En algunos ejemplos, la platina incluye una segunda varilla (no mostrada), perpendicular a la varilla 178, hasta un segundo motor de movimiento gradual, de modo que la carcasa 172 de la lente, la base 174 y la plataforma 160 unida puedan moverse gradualmente en horizontal en una dirección perpendicular.

La plataforma de visualización 160 es una placa que incluye una ventana 162. La plataforma está unida a la carcasa 172 de la lente a través de tornillos manuales 166 ajustables. La superficie superior de la plataforma 160 se mantiene al ras con la superficie inferior de las cabezas de los tornillos manuales 166 mediante los resortes 164. A medida que se aprietan o aflojan los tornillos manuales para un movimiento hacia abajo o hacia arriba, la plataforma responde. Por lo tanto, los tornillos manuales pueden girarse para ajustar la inclinación y el ladeo de la superficie superior de la plataforma de visualización 160 y su ventana 162.

Cuando el portamuestras se coloca en la plataforma de visualización, la superficie visible de la muestra 192 está por encima de la superficie superior de la plataforma 160 por al menos el grosor de la ventana 132 del portamuestras. Por lo tanto, los tornillos manuales se ajustan hasta que el plano focal de la lente objetivo 176 sea paralelo (o casi paralelo) a y esté encima de la superficie superior de la plataforma 160 a una profundidad de tejido deseada (p. ej., 1 mm) más el grosor de la ventana 132 y cualquier desplazamiento entre la ventana 132 y la parte inferior de la carcasa del pistón (cero en la figura 1, pero distinto de cero en otros ejemplos descritos más adelante con referencia a la figura 2B). En algunos ejemplos, cualquier desviación de paralelismo puede corregirse moviendo gradualmente en vertical de la lente objetivo, como se describe en mayor detalle a continuación. El ajuste de los tornillos manuales para fijar la plataforma de visualización 160 de la platina 150 puede realizarse incluso antes de que se recoja una muestra. Cuando se recoge una muestra, se coloca en el portamuestras 110 y se comprime contra la ventana 132 en tan solo unos segundos. El portamuestras se coloca en la superficie de la plataforma 160 y se mueve lateralmente, en paralelo a la plataforma 160 hasta que la porción de la muestra de interés esté centrada sobre la lente objetivo. Dado que la platina ya está en alineación fija, la formación de imágenes de la muestra puede comenzar de inmediato, no es necesario un ajuste adicional de los tornillos manuales 166.

En los ejemplos ilustrados, la base 174 está hecha de latón, la carcasa 172 de la lente está hecha de aluminio y la plataforma 160 está hecha de acero inoxidable.

En algunos ejemplos, el pistón 122 y el orificio pasante de la carcasa 130 del pistón están roscados para mover el pistón para que comprima la muestra y mantener el pistón en su sitio cuando la muestra se ha comprimido hasta el grado deseado. Tanto el pistón 122 como el orificio pasante tienen una sección transversal circular en estos ejemplos. Sin embargo, la torsión del pistón 122 contra el gel 140 y la muestra 190 podría distorsionar la superficie de la muestra contra la ventana 132. Así, en algunos ejemplos, el portamuestras se modifica para reducir o eliminar la distorsión de la muestra cuando un pistón se tuerce mientras se desplaza a través del orificio pasante.

Así, en algunos ejemplos, un aparato incluye una carcasa de pistón que incluye un orificio pasante axial con una sección transversal no circular. Se fija una placa transparente en un extremo del orificio pasante axial. Otra placa tiene una sección transversal no circular que coincide con la sección transversal no circular del orificio pasante axial. Un pistón está configurado para dirigir la placa dentro del orificio pasante axial hacia la placa transparente y comprimir una muestra de tejido extirpado entre la placa y la placa transparente. En algunos de estos ejemplos, un gel está configurado para colocarse entre la placa y la muestra durante la compresión de la muestra entre la placa y la placa transparente. El gel, cuando está comprimido, retiene el tejido extirpado comprimido contra la placa transparente para evitar un movimiento lateral del tejido extirpado comprimido con respecto a la placa transparente.

La figura 2A es un diagrama de bloques que ilustra una platina 250 y una vista despiezada de un portamuestras 200, de acuerdo con uno de estos ejemplos. El portamuestras 200 incluye un componente de pistón 120 con el pistón 122, como se ha descrito anteriormente, y una carcasa 230 de pistón modificada. La carcasa 230 de pistón modificada tiene un orificio pasante no circular 231 y una placa 244 con una sección transversal rectangular que coincide con la sección transversal no circular del orificio pasante 231. Tal y como se utiliza en el presente documento, una sección transversal de la placa coincide con la sección transversal del orificio pasante si encaja dentro de la sección transversal y no puede girar en el plano de la sección transversal cuando está dispuesta dentro del orificio pasante. En algunos ejemplos, la sección transversal de la placa es la misma que la sección transversal del orificio pasante. La desviación de una sección transversal circular es lo suficientemente pequeña como para que las roscas del pistón 122 se acoplen en las porciones circulares del orificio pasante 231.

Así, cuando el pistón está enroscado en el orificio pasante, la placa se desplaza a lo largo del eje del orificio pasante para comprimir el gel 140 y la muestra 190, pero no se tuerce y, por lo tanto, no distorsiona el gel 140 ni la muestra.

En algunos ejemplos, el disco de gel 140 se sustituye con un gel que tiene una sección transversal que coincide con la sección transversal del orificio pasante 231.

En el ejemplo ilustrado, el portamuestras 200 incluye imanes 238. Los imanes se mantienen en su sitio mediante la placa frontal 234. La placa frontal 234 también incluye la ventana 132. En el ejemplo ilustrado, la placa frontal tiene un orificio más pequeño que el imán para que el imán no se caiga. En algunos ejemplos, los imanes 238 tienen un labio que es más grande que el orificio, pero una cara que se ajusta a través del orificio para hacer un mejor contacto con la plataforma de visualización 160. Los imanes retienen el portamuestras 200 en su sitio cuando el soporte está colocado en la plataforma de visualización 160 de la platina 150. En el ejemplo ilustrado, la plataforma de visualización 260 en la platina 250 está hecha de un material magnético para ejercer mayor fuerza de atracción sobre los imanes 238 en el portamuestras 200. La platina 250 incluye tornillos manuales 166, como se ha descrito anteriormente, para ajustar el ladeo y la inclinación de la plataforma 260.

La figura 2B es un diagrama que ilustra un ejemplo de dimensiones de una carcasa 230 de pistón y de un componente de pistón 120, de acuerdo con un ejemplo. Este ejemplo se fabricó para acoplarse magnéticamente en una platina configurada como la platina THORLAB™ de Newton disponible comercialmente, platina Nueva Jersey KM200, pero fabricada con un material magnético. El orificio pasante tiene roscas en un radio r2 = 23,4 milímetros (mm, 1 mm = 10-3 metros) que coincide con el radio del pistón de compresión roscado 122, que tiene un diámetro de 2r2. Las roscas del orificio pasante comienzan a una altura h2 = 4 mm por encima de la cara inferior de la carcasa 230 del pistón. El vidrio circular que cubre la ventana óptica 132 también tiene un radio de r2 = 23,4 mm y se instala sobre una cara inferior de la carcasa 230 del pistón a una distancia de h-F 2 mm, que tiene una abertura circular con un radio n = 21,4 mm. El orificio del imán para el imán 238 está en la carcasa 230 del pistón en un radio r3= 25,4 mm y la parte inferior de la carcasa 230 del pistón en este radio está a una altura de h3= 7,6 mm y se extiende adicionalmente hasta un radio de r4= 28,4 mm. La parte superior de la carcasa 230 del pistón está a una altura tu= 25,4 mm. La altura de las roscas del pistón 122 es h4-h2 = 21,4 mm.

La figura 16A es un diagrama de bloques que ilustra una platina ajustable 1650 y un portamuestras extraíble 1610, de acuerdo con otro ejemplo 1600. El portamuestras 1610 incluye un componente de pistón 1620 y una carcasa 1630 de pistón. El componente de pistón 1620 incluye un pistón roscado 1622 dispuesto en un orificio pasante roscado. El componente de pistón 1620 se une a la carcasa 1630 del pistón después de colocar una muestra dentro, utilizando fijaciones, tal como clips o tornillos, como indica la flecha 1628.

La carcasa 1630 del pistón incluye un orificio pasante. En el orificio pasante se coloca un portaobjetos 1632 de vidrio como ventana, una muestra 1619, Gel de agarosa 1640 y una placa 1644, tal como otro portaobjetos de vidrio. El pistón 1622 se desplaza a través del orificio pasante para comprimir la muestra 1619 contra la ventana 1632 para su visualización. El disco de gel 1640 se incluye en el orificio pasante entre la muestra 1619 y la placa 1644 para ayudar a fijar la muestra 1619 contra la ventana a fin de evitar un movimiento lateral y acolchar la muestra 1619 frente al pistón 1622 y la placa 1644. La placa 1644 se incluye para evitar que el movimiento de torsión del pistón roscado 1622 distorsione el gel 1640 y la muestra 1619. Cuando el pistón 1622 se ha insertado en el orificio pasante de la carcasa 1632, una superficie de la muestra se presiona plana contra la superficie superior de la ventana 1632. La carcasa 1632 del pistón incluye imanes 1638 para proporcionar una fuerza de atracción a la pletina 1650, como indican las flechas punteadas. En el ejemplo ilustrado, los imanes 1638 están dispuestos en orificios ciegos formados en una base de carcasa de pistón 1630 donde se fijan utilizando cualquier forma conocida en la técnica, incluyendo confiar solo en la fuerza de gravedad y su propia atracción magnética a la platina 1650 de debajo.

La platina 1650 incluye una plataforma de visualización 1660 con un orificio de visualización 1662 y una montura 1652 de plataforma. En el ejemplo ilustrado, la montura 1652 de la plataforma es una platina XYZ, de LUCID, INC.™, Rochester, Nueva York, que puede moverse gradualmente en pequeños incrementos en las tres dimensiones espaciales. También en este ejemplo ilustrado, la plataforma 1660 está unida a la montura 1652 de la plataforma a través de una junta esférica 1668 de altura fija y solo dos tornillos de ajuste 1666a y 1666b que están automatizados con actuadores de microposicionamiento.

La figura 16B es un diagrama de bloques 1670 que ilustra un ajuste automatizado de acuerdo con un ejemplo. El eje horizontal 1672 indica la distancia en una dirección y en unidades arbitrarias; y el eje horizontal 1674 indica la distancia en una dirección perpendicular x en unidades arbitrarias. El eje vertical 1676 indica la distancia en una dirección z perpendicular y vertical en unidades arbitrarias.

De acuerdo con este proceso de ajuste automatizado, las exploraciones z se adquieren en tres ubicaciones indicadas por coordenadas x-y debajo de tres puntos 1681, 1682, 1683 representados por círculos oscuros, en un plano inclinado 1680. Se desea mover estos puntos a los puntos correspondientes 1681, 1692 y 1693, respectivamente, (los dos últimos representados por círculos transparentes) en un plano focal 1690 del microscopio. La exploración z mide la posición del pico de intensidad de reflexión. La intensidad máxima de la señal siempre está en la ubicación de la interfaz de vidrio con el tejido. La muestra se mueve axialmente en una ubicación x-y particular (p. ej., a una distancia y 1685a y una distancia x 1685b para el punto 1681) para determinar una posición axial (p. ej., 1685c) con máxima intensidad. Las tres posiciones pico de la señal axial (p. ej., 1685c, 1686 y 1687c), en las posiciones x-y correspondientes se determina para deducir la inclinación del plano 1680 con respecto al plano focal 1690. Los ajustes relativos de los dos tornillos de fijación automatizada 1666a y 1666b se determinan para mover el punto 1682 en el plano inclinado 1680 hacia abajo hasta el punto 1692 en el plano focal 1690 y el punto 1683 en el plano inclinado 1680 hacia arriba hasta el punto 1693 en el plano focal 1690.

En algunos ejemplos, además de, o en lugar de, automatizar el ajuste de la plataforma de visualización 1660, la inclinación del plano 1680 con respecto al plano focal deseado se determina una vez, y para mediciones posteriores, a medida que la lente objetivo se mueve gradualmente en horizontal, la posición vertical de la lente objetivo se corrige mediante el movimiento vertical automatizado (dirección z) de la lente objetivo a través del orificio 1662 en función de la inclinación del plano 1680. Hay lentes objetivo de movimiento gradual en vertical para microscopía confocal comercialmente disponibles.

3. Fusión de imágenes para mosaico

La calidad de los mosaicos en la formación de imágenes confocales en un área grande es crítica para el diagnóstico de tumores en la patología del cáncer. El trabajo anterior condujo a un algoritmo de combinación de imágenes que recortaba imágenes individuales y las unía entre sí de manera constante en la cara del mosaico. El hardware de adquisición de imágenes movió la muestra una distancia fija entre las imágenes de adquisición. La distancia fija era menor que la anchura de la imagen, por lo que hubo algo de superposición que luego se recortó. El procesamiento de datos involucraba un conocimiento a priori sobre la cantidad exacta de superposición, que se asumió que era idéntica entre fotogramas vecinos de todas partes del interior del mosaico.

Se desarrolló una nueva técnica para adaptar de manera personalizada cada fotograma al mosaico. Así, en algunos ejemplos, un método para fusionar imágenes superpuestas de un microscopio confocal incluye determinar una traslación de una primera imagen con respecto a una segunda imagen que minimiza una diferencia de intensidad lumínica en una región de superposición entre la primera imagen y la segunda imagen. Las intensidades lumínicas de un píxel en la región de superposición de la primera imagen y de un píxel correspondiente en la segunda imagen trasladada se promedian para producir una imagen fusionada.

En un ejemplo particular, las imágenes se configuran para superponerse con una suposición inicial en el desplazamiento, que es introducido por el usuario. En ejemplos con un conocimiento a priori, la suposición inicial se establece igual a la superposición aproximada a priori basada en el tamaño del movimiento gradual y el tamaño de la imagen. Por ejemplo, en el caso del microscopio confocal de movimiento gradual, se conoce el posicionamiento general de los fotogramas adyacentes. Normalmente, hay alrededor de 20 píxeles superpuestos horizontalmente y 10 píxeles superpuestos verticalmente, pero estos parámetros pueden variar debido a la falta de uniformidad mecánica durante la adquisición de la matriz bidimensional de imágenes individuales. El proceso de ajuste personalizado supone iterativamente el desplazamiento hasta que se determina el desplazamiento correcto (posicionamiento relativo) para las dos imágenes donde la diferencia de intensidad entre píxeles en la región de superposición es mínima. El proceso trabaja para minimizar el error que consiste en la suma de las diferencias de píxeles superpuestos normalizada por el número de píxeles superpuestos. De este modo, el error de píxel medio se determina y minimiza de manera que las mismas características en las dos imágenes estén colocalizadas. En algunos ejemplos, las imágenes de una tira se trasladan de una en una para construir una tira completa. Cuando todas estas tiras están formadas, cada tira se traslada, de una en una a las tiras ya trasladadas para formar el mosaico.

En algunos ejemplos, se fusionan los cubos de imágenes en 3-D, primero fusionando cubos en una dimensión en tiras de cubos, para cada una de las diversas profundidades, como se ha descrito anteriormente para las imágenes. Todas las tiras de cubos fusionadas a una profundidad forman, lo que en el presente documento se denomina un panel. Cuando todos estos paneles están formados, cada panel se traslada, de uno en uno a los paneles ya trasladados para formar el cubo de mosaico. Este ejemplo es útil en conjuntos de cortes de dispositivos de escáner como en la formación de imágenes por tomografía computarizada de rayos X y por resonancia magnética (MR), por ejemplo, para la detección de un melanoma en vivo. En algunos ejemplos, este proceso se extiende a las dimensiones cuarta y superior, p. ej., para incluir una dimensión temporal.

La figura 3A es un diagrama de flujo que ilustra a un alto nivel, un método 300 para producir una imagen fusionada, de acuerdo con un ejemplo. Aunque las etapas se muestran en la figura 3 y diagramas de flujo posteriores en un orden particular a efectos de ilustración, en otros ejemplos, una o más etapas o porciones de los mismos se realizan en un orden diferente o se solapan a lo largo del tiempo o se omiten o se añaden etapas adicionales, o el método se cambia según determinadas combinaciones.

En la etapa 310, se reciben datos de imágenes para dos o más imágenes superpuestas desde un microscopio confocal. En la etapa 320, se determina un desplazamiento que minimiza un error, basándose en la diferencia de intensidad promedio entre píxeles en las ubicaciones correspondientes en una región de superposición. Se puede utilizar cualquier método para determinar el mejor desplazamiento. En un ejemplo, se realiza una búsqueda de gradiente en la que un cambio en el desplazamiento está asociado con un cambio en el error, y se selecciona un nuevo desplazamiento en una dirección que reduzca el error. En la etapa 330, las intensidades en dos o más píxeles en una ubicación correspondiente se promedian para formar una imagen fusionada, también denominada mosaico. En la etapa 340, la intensidad en una región de superposición se corrige para una iluminación no uniforme. En algunos ejemplos, se omite la etapa 340; y, en algunos ejemplos, se emplea una corrección de iluminación, como la descrita en la siguiente sección.

La figura 3B es un diagrama de flujo que ilustra una etapa del método de la figura 3, de acuerdo con un ejemplo. El método 350 representado en la figura 3B es un ejemplo particular de la etapa 310 y la etapa 320 para determinar los desplazamientos multidimensionales. En un ejemplo ilustrado de las etapas 310 y 320, el método 350 se aplica en dos dimensiones para producir un único panel que es un mosaico de pequeñas imágenes individuales.

En la etapa 352 del método 350, se reciben todos los datos del escáner que se van a fusionar. Tal y como se utilizan en el presente documento, un escáner es una matriz multidimensional de valores de intensidad, tal como una imagen 2-D de elementos de píxel (píxeles), un volumen 3-D de elementos de volumen (vóxeles), o una matriz dimensional superior de elementos de un escáner. Tal y como se utilizan en el presente documento, un elemento de escáner se refiere a un píxel individual, vóxel u otro elemento de matriz dimensional superior de un escáner. En la etapa 352, se selecciona un primer escáner para una primera tira en una primera dimensión para un primer panel (para una primera vez u otra o más dimensiones) para iniciar el proceso. En el ejemplo ilustrado, durante la etapa 352 se selecciona una primera imagen individual en una primera tira de imágenes para la dirección x para un primer mosaico.

En la etapa 354, se selecciona el siguiente escáner, tira o panel adyacente en la dimensión actual. Por ejemplo, se selecciona la siguiente imagen adyacente en la dimensión x. En la etapa 356 se determina un desplazamiento en la dimensión actual para minimizar una función de error. En el ejemplo ilustrado, la función de error se basa en las diferencias de intensidad entre los elementos de escáner correspondientes en una región de superposición entre el siguiente escáner (o tira o panel, escáner/tira/panel designado) y el último escáner/tira/panel ya trasladado. Por ejemplo, se determina un desplazamiento en la dimensión x para la imagen adyacente

En la etapa 358 se determina si todavía falta algún escáner/tira/panel adyacente por desplazar. Si es así, el control vuelve a la etapa 354 para seleccionarlo como el siguiente. Por ejemplo, si todavía hay otra imagen adyacente a la primera tira en la dimensión x, entonces será la siguiente imagen para la que se determine un desplazamiento. Si se determina en la etapa 358 que no hay ningún escáner/tira/panel adyacente, entonces la tira o panel o cubo actual a desplazar está completo. El control pasa a la etapa 360. Por ejemplo, cuando la última imagen de la primera tira está desplazada, no hay imagen adyacente en la dimensión x y el control pasa a la etapa 360.

En la etapa 360 se determina si todos los escáneres se han desplazado a tiras. Si es así, entonces se ha terminado con la primera dimensión y el control pasa a la etapa 364 para configurar la dimensión actual a la segunda dimensión. En algunos ejemplos, la etapa 360 incluye determinar si la dimensión actual ya se ha configurado para una dimensión superior.

Si en la etapa 360 se ha determinado que no todos los escáneres se han desplazado a unas tiras, entonces el control pasa a la etapa 362 para seleccionar el primer escáner en la siguiente tira. Si se están desplazando varios paneles (o tiempos), entonces el primer escáner de la siguiente tira puede estar en un panel diferente (o tiempo diferente). El control vuelve entonces a la etapa 354 para seleccionar el siguiente escáner adyacente.

Después de la etapa 364, el control pasa a la etapa 370. En la etapa 370 se determina si todas las tiras están desplazadas a los paneles. Si es así, entonces se ha terminado con la segunda dimensión y el control pasa a la etapa 374 para configurar la dimensión actual a la tercera dimensión. Si no hay una tercera dimensión (p. ej., cuando se determinan dos desplazamientos bidimensionales para imágenes individuales en un mosaico, no hay tercera dimensión), entonces la determinación de desplazamiento está completa. En este ejemplo, las etapas 374, 380, 382 y 384 se omiten para que el control pase directamente a la etapa 330 en la figura 3A. En algunos ejemplos, la etapa 370 incluye determinar si la dimensión actual ya se ha configurado para la tercera dimensión o una superior.

Si se determina en la etapa 370 que todas las tiras no se han desplazado a unos paneles, entonces el control pasa a la etapa 372 para seleccionar la primera tira en el siguiente panel, tal como la primera tira en el primer panel. Si se están desplazando varios paneles (o tiempos), entonces la primera tira del siguiente panel puede estar en un panel diferente (o tiempo diferente). El control luego vuelve a la etapa 354 para seleccionar la siguiente tira adyacente. Después de la etapa 374, el control pasa a la etapa 380. En la etapa 380 se determina si todos los paneles están desplazados. Si es así, entonces la tercera dimensión ha terminado y el control pasa a la etapa 384 para continuar el proceso para una cuarta y dimensiones superiores, si las hubiera. En algunos ejemplos, la etapa 380 incluye determinar si la dimensión actual ya se ha configurado para las dimensiones superiores.

Si se determina en la etapa 380 que no todos los paneles se han desplazado, entonces, el control pasa a la etapa 382 para seleccionar el primer panel. Si se están desplazando varios cubos, entonces, el primer panel puede estar en un cubo diferente (por ejemplo, en un tiempo diferente). El control vuelve entonces a la etapa 354 para seleccionar el siguiente panel adyacente. El proceso continúa en la etapa 384 hasta que se hayan determinado los desplazamientos para todos los escáneres multidimensionales en todas las dimensiones. Entonces, el control pasa a la etapa 330 de la figura 3A.

La figura 4A, la figura 4B, la figura 4C, la figura 4D y la figura 4E son imágenes adyacentes que ilustran la aplicación de la fusión de imágenes para el microscopio confocal, de acuerdo con un ejemplo.

De la figura 4A a la figura 4D se muestra la segunda etapa para unir dos imágenes adyacentes entre sí, la etapa 320 anterior, que es la alineación de las imágenes que se van a superponer con el corregistro de características adecuado, y la tercera etapa, etapa 330, de promediar las intensidades en los píxeles de la región de superposición. La figura 4A es una imagen 410 que ilustra una suposición inicial en la posición relativa. La desalineación de la imagen es evidente en una línea oscura 412. El recuadro insertado indica una porción 414 de la imagen 410 que se muestra con mayor detalle en una figura posterior.

Después de minimizar el error en la etapa 320, una comparación de las dos imágenes se muestra en la figura 4B. La figura 4C muestra una vista ampliada de la porción 414 indicada por el recuadro insertado en la figura 4A después de promediar intensidades en los píxeles de las ubicaciones correspondientes. Debido a que esta porción de imagen se obtiene antes de haber determinado el mejor desplazamiento, las dos imágenes están desalineadas, desenfocando las células en la región de superposición donde se han promediado las imágenes. La figura 4D muestra la porción 444 de una imagen en la misma ubicación que la porción 414 de la imagen fusionada, pero después del traslado según el desplazamiento que minimiza el error. Las células ya no se ven borrosas después de ejecutar el programa porque se las ha hecho coincidir espacialmente.

Si bien la alineación de características es mejor, sigue habiendo discontinuidades de intensidad. La figura 4B muestra una imagen compuesta provisional 420 que presenta una banda oscura vertical en el centro con un borde izquierdo 422 de discontinuidad de intensidad donde la banda limita con la imagen izquierda, y un borde derecho 424 de discontinuidad de intensidad donde la banda limita con la imagen derecha. La banda oscura está compuesta por los bordes de dos imágenes individuales que, debido al viñeteado del microscopio óptico, son más oscuros que los centros de las imágenes individuales. El viñeteado es el proceso de escanear el punto de medición a lo largo de un plano focal de la lente objetivo variando el ángulo de incidencia del haz de luz de iluminación en la lente objetivo. Mientras el haz en ángulo golpea la muestra objetivo en un punto diferente, se pierde una porción del haz de iluminación paralelo fuera de la lente. Por lo tanto, los píxeles externos de cada imagen individual están menos iluminados que los píxeles centrales.

Dado que supone un desafío optimizar completamente el microscopio para lograr una sensibilidad de campo uniforme, las intensidades en la región de superposición se normalizaron con el resto de la imagen, en algunos ejemplos, en la etapa 340. Los píxeles (Pii) a la izquierda del borde izquierdo 422 tienen un valor más alto que los píxeles (Pir) a la derecha del borde izquierdo 422. Para cada fila horizontal de píxeles dentro de la banda, se encontró un multiplicador (m1), tal que Pi*m1 = Pⁱⁱ. De manera similar, se encontró un segundo multiplicador (m2) tal que Pri* m1 = Prr. Un vector lineal que varió de m1 a m2 se multiplicó por cada fila horizontal para lograr la normalización de la fila de modo que esta tuviera una transición continuada de la imagen izquierda a la imagen derecha. De este modo, se eliminó la banda oscura en el centro de la imagen fusionada 420. El resultado se muestra en la figura. 4E como imagen 450.

4. Corrección de iluminación

En otro conjunto de ejemplos, un método para corregir la iluminación incluye recibir un conjunto de múltiples imágenes desde un microscopio confocal. Cada imagen incluye una matriz bidimensional de píxeles ubicados mediante un número de fila y un número de columna; y cada imagen cubre una porción diferente de una única muestra. Se determina una intensidad promedio de píxeles para cada ubicación de píxel promediando los valores de intensidad en la ubicación de píxel sobre cada imagen del conjunto. Una corrección de iluminación de píxeles basada en la intensidad promedio de píxeles para cada ubicación de píxel se aplica a cada píxel en la ubicación de píxel en cada imagen del conjunto de imágenes.

La figura 5 es un diagrama de flujo que ilustra a un alto nivel un método 500 para corregir la intensidad para una iluminación no uniforme (también denominada en el presente documento corrección de iluminación), de acuerdo con este ejemplo. En la etapa 510, se obtienen datos para una gran cantidad de imágenes individuales. Por ejemplo, en algunos ejemplos, se reciben todas las imágenes individuales (430x430 pm) para un mosaico con un amplio campo de visión (12x12 mm). Esto son aproximadamente 30x30 imágenes para una superposición del 10%, p. ej., aproximadamente 1000 imágenes. En la etapa 520, se determina la intensidad promedio en cada ubicación de píxel. Por ejemplo, con una resolución de aproximadamente 0,5 pm, cada imagen tiene un millón de píxeles, de modo que se obtiene un millón de valores, cada uno promediado sobre 1000 valores de intensidad individuales.

En la etapa 530, se aplica una corrección de iluminación a cada píxel en función del valor promedio para la ubicación de ese píxel. En algunos ejemplos, la corrección se determina multiplicando el píxel de cada imagen por una relación de un pico de intensidad de píxel en la imagen promedio respecto al píxel en la ubicación correspondiente en la imagen promedio.

5. Tinción rápida para contraste de fluorescencia nuclear

En otro conjunto de ejemplos, un método para detectar núcleos celulares con un microscopio confocal incluye poner en contacto una superficie de una muestra de tejido extirpado con un 1 milimolar (mM, 1 mM = 10-3 Molar) de solución de naranja de acridina durante 20 segundos. Un punto en la superficie de la muestra extirpada se ilumina con un haz láser con una longitud de onda de aproximadamente 488 nanómetros (nm, 1 nm = 10-9 metros). La intensidad de emisión fluorescente desde el punto se detecta en un intervalo de longitud de onda por encima de aproximadamente 500 nm. Dado que el colorante se realiza tan rápidamente, se pueden obtener rápidamente imágenes confocales fluorescentes con buen contraste nuclear en comparación con las secciones histológicas.

La figura 6 es un diagrama de flujo que ilustra a un alto nivel un método 600 para obtener una fluorescencia que proporciona un alto contraste en los núcleos celulares con una tinción rápida, de acuerdo con un ejemplo. En la etapa 610, la superficie de una muestra se pone en contacto con 1 milimolar (mM, ImM = 10-3 Molar) de solución de naranja de acridina durante 20 segundos. En la etapa 620, se ilumina uno o más puntos de una superficie de una muestra con luz láser que tiene una longitud de onda de aproximadamente 488 nanómetros (nm, 1 nm = 10 9 metros). En algunos ejemplos, se cambia la fuente de luz del microscopio confocal, p. ej., se sustituye un láser de 830 nm por un láser de 488 nm durante la etapa 620. En la etapa 630, se detecta en el punto la emisión fluorescente (también denominada intensidad de emisión de fluorescencia), p. ej., a longitudes de onda de aproximadamente 500 nm y superiores. En la figura 7A se ha representado un aparato para detectar esta emisión de fluorescencia simultáneamente con una intensidad de emisión de reflectancia, con ejemplos alternativos ilustrados en la figura 7B y la figura 7C. En la etapa 640, se determina la presencia de núcleos celulares en el punto en función de la emisión fluorescente detectada.

Como se describe en Gareau, normalmente, un núcleo en un tumor de un carcinoma de células basales (CCB) se ve como 100 píxeles aproximadamente en una imagen individual, pero posteriormente aparece como solo 1 píxel aproximadamente en un mosaico. Esto se debe a la reducción de los mosaicos de resolución completa por un factor de 10 para que coincida con el tamaño de píxel y la resolución de una vista 2X de histología. Utilizando un modelo de dispersión de Mie para la detectabilidad en un microscopio confocal de reflectancia, se calculó que el contraste nuclear caería de aproximadamente 100 a aproximadamente 1 con respecto a la brillante dermis circundante, lo que resulta una pérdida significativa de la capacidad de detección visual de tumores CCB pequeños o muy pequeños.

En fluorescencia, sin embargo, con un agente de contraste que tiña específicamente los núcleos, se puede recoger muy poca luz de la dermis circundante (excepto, quizás, para una autofluorescencia débil). Recientemente se ha notificado la detección de tumores de CCB grandes y pequeños y también de carcinomas de células escamosas (CCS) con fluorescencia usando azul de metileno y azul de toluideno. Elegimos el naranja de acridina, que es otro colorante nuclear de éxito probado para la microscopía confocal. El naranja de acridina tiñe diferencialmente el ADN nuclear y el ARN citoplasmático de las células endoteliales. Sin embargo, se esperaba que la tinción fuera solo del núcleo en los queratinocitos epidérmicos. El naranja de acridina tiene un rendimiento cuántico del 75 % cuando se une al ADN y un coeficiente de extinción de aproximadamente 53.000 moles por litro-centímetro (ltr-cm). Utilizando un modelo analítico de detectabilidad en un microscopio confocal de fluorescencia, se estima que el contraste nuclear cae de 105 a 103 en relación con una dermis significativamente oscurecida. Así, se esperaba ver tumores pequeños y pequeños en los mosaicos.

En este caso, se ha demostrado que la utilización de fluorescencia con naranja de acridina aumenta el contraste del núcleo con respecto a la dermis de los tumores CCB en mosaicos confocales. La comparación visual de mosaicos con la histología congelada de Mohs correspondiente fue favorable. Los resultados muestran que la detectabilidad de tumores CCB pequeños tal como micronodulares, infiltrantes y la esclerosantes mejoró considerablemente con respecto a la reflectancia por sí sola. La detectabilidad de tumores grandes y pequeños demuestra la viabilidad de la microscopía de mosaico confocal de área grande hacia una patología rápida en tejido extirpado quirúrgicamente para acelerar y guiar la cirugía.

Solo la superficie del tejido extirpado se examina en la histología de Mohs, para determinar la extensión lateral del tumor. Así, para la generación de imágenes, no es necesario que la tinción con naranja de acridina sobrepase algunas capas de células. Una capa celular en la piel tiene aproximadamente 10 micras (|jm) de grosor; y el cirujano de Mohs generalmente examina de 3 a 5 secciones histológicas congeladas, que tiene cada una aproximadamente de 5 a 6 jm de grosor. Así pues, se consideró obtener imágenes a una profundidad máxima de aproximadamente 30 jm, que corresponde a aproximadamente 3 capas celulares. (Esta profundidad también es aproximadamente el máximo al que es posible obtener imágenes confocales en tiempo real en el tejido dérmico con una iluminación azul de 488 nm de potencia muy baja en milivatios). Utilizando una distancia de difusión de 30 jm , el tiempo de difusión promedio es de 0,6 milisegundos para el tumor y de 0,37 segundos para el tejido normal.

La figura 7A es un diagrama de bloques que ilustra un microscopio 700 confocal de reflectancia/fluorescencia multimodal, de acuerdo con un ejemplo. Este microscopio es capaz de detectar la intensidad de emisión de fluorescencia descrita en la etapa 630, anterior; así como las medidas multimodales descritas con más detalle en la siguiente sección.

El microscopio confocal 700 incluye componentes presentes en un microscopio confocal de reflectancia provisto externamente, tales como lentes 770, espejos 772, expansor de haz 7X 773, telescopios de retransmisión 774, polígono de rotación 776 para hacer un barrido a través de los ángulos de exploración de la iluminación y los haces de retorno en una dimensión (x), espejo de exploración galvonométrico 778 para cambiar el ángulo de exploración en una dimensión perpendicular (y), lente objetivo 780, divisor de haz de polarización 724 y fotodiodo de avalancha (APD^r) 722 para detectar la intensidad de emisión de reflectancia en un haz de reflectancia 720.

El microscopio confocal 700 incluye nuevos componentes, contenidos en óvalos, tal como una platina y un portamuestras 790 nuevos (p. ej., como se ha representa en la figura 1 o la figura 2A y la figura 2B). El microscopio confocal 700 también incluye un láser de iones de argón 710 que emite en un intervalo de longitud de onda que incluye 488 nm, y un filtro de selección 714 de 488 nm. El láser 710 sustituye el láser original suministrado externamente que emite a 830 nm para excitar la fluorescencia en el colorante naranja de acridina introducido en la muestra. La iluminación del tejido tiene una potencia de bajo nivel de 0,3 a 1 milivatios (mW, 1 mW = 10-3 Vatios). También se añade al microscopio 700 un divisor de haz dicroico 734 para reflejar solo el haz de fluorescencia 730 en un nuevo canal fluorescente. El canal fluorescente incluye un filtro de rechazo 735 de 488 nm, una lente 736 y un fotodiodo de avalancha 738 (APD^f) para detectar la intensidad de emisión de fluorescencia en el haz de fluorescencia 730.

En un ejemplo experimental utilizado para generar algunas imágenes que se describen a continuación, no se incluyeron todas las mejoras descritas anteriormente. En este ejemplo experimental, la óptica de detección de fluorescencia consiste en un Divisor de haz dicroico 510DCSPRX CHROMA™ de Rockingham, Vermont, un filtro de rechazo de excitación 510EFLP, OMEGA OPTICAL™ de Brattleboro, Vermont, para bloquear la luz externa reflejada y un fotodiodo de avalancha C30659-900-R8A PERKIN-ELMER™, de Vaudreuil, Quebec, Canadá. La detección en el canal de fluorescencia se debió principalmente a la emisión de los núcleos teñidos de naranja de acridina con prácticamente ninguno del citoplasma. La autofluorescencia de la dermis es unos pocos grados de magnitud más débil que la fluorescencia del naranja de acridina y, por lo tanto, no fue detectada por las condiciones de detección de bajo poder de iluminación y muy confocales (es decir, de un pequeño poro).

Una lente objetivo de inmersión en agua diseñada a medida (StableView, de LUCID INC.™) se utilizó para obtener imágenes a través de un portaobjetos de vidrio de 1 mm de grosor. En lugar de los cubreobjetos finos que convencionalmente se utilizan con lentes objetivos, se utilizó un portaobjetos de vidrio grueso para montar y estabilizar muestras de tejido no convencionales, como escisiones quirúrgicas. La lente objetivo presenta un aumento de 30X para proporcionar un campo de visión de 430 jm . Con una apertura numérica de 0,9, el grosor de sección axial calculado es: Az = 1,4nA/NA2 = 1,1 jm y la resolución lateral es: Ax = 0,46A/NA = 0,25 jm, que es adecuado para la formar imágenes de morfología nuclear. Con frecuencia, se sustituyó un gel a base de agua por agua como medio de inmersión.

Las escisiones quirúrgicas a menudo son gruesas, grandes y con una forma inusual. Por otro lado, el tejido es fresco, está vivo, hidratado y es mecánicamente compatible y, por lo tanto, no es fácil de montar en un microscopio. Se diseñó una fijación de tejido personalizada, como se ha descrito anteriormente, para que las escisiones quirúrgicas de Mohs pudieran montarse y comprimirse suavemente sobre el portaobjetos de un microscopio. El ejemplo que produjo las imágenes de más adelante utilizaba un pistón roscado que se apretaba para comprimir suavemente e incrustar una escisión en un disco de gel, de modo que la escisión quedara estabilizada. La distorsión por el movimiento de rotación del pistón que podrían hacer que el gel y, posteriormente, los bordes del tejido se torcieran y se distorsionaran se evita como se describe aquí o más arriba. Para el ejemplo ilustrativo utilizado para generar las imágenes que se describen más adelante, se colocó un fino disco de policarbonato y unos rodamientos de agujas obtenidos con el número de pieza 5909K31 de MCMASTER-CARR ™ de Nueva Jersey, entre el pistón y el disco de gel. La fijación permite un control repetible y preciso del aplanamiento, ladeo, inclinación, combado y estabilidad de la superficie del tejido a tomar en imágenes. La funcionalidad de la fijación de tejido imita el funcionamiento de un criostato que es el equipo estándar para preparar secciones histológicas congeladas para la cirugía de Mohs. La formación de imágenes en reflectancia se utilizó para guiar la distancia z y los ajustes de ladeo e inclinación de modo que la superficie del tejido se orientara exactamente en paralelo al plano focal de la lente objetivo. El proceso consistió en trasladar la escisión montada lateralmente y ajustar cuatro tornillos manuales hasta que el foco se moviera a lo largo de la interfaz reflectante de agua/tejido. Esta alineación permitió la adquisición de imágenes contiguas en grandes áreas de 10 a 20 mm.

Después de montar la escisión en la fijación de tejido y de colocarla y orientarla adecuadamente, se adquirieron imágenes confocales. Se obtuvieron imágenes de la superficie de la escisión. Debido al proceso de descongelación, tinción y enjuague, se esperaban pequeñas distorsiones en la superficie de la que se tomaron imágenes debido al comportamiento del tejido. Así, se esperaba que los mosaicos mostraran una estrecha correspondencia, aunque no exactamente de uno a uno, con las secciones congeladas que fueron preparadas por el técnico durante la cirugía de Mohs.

De las 3 a 5 secciones histológicas congeladas que se preparan durante la cirugía, el cirujano de Mohs generalmente examina la primera para determinar la diseminación lateral de los tumores en la superficie extirpada. Ocasionalmente, si la calidad de la primera sección es deficiente o si la determinación de los márgenes tumorales no es muy clara, el cirujano de Mohs examina las secciones restantes. Algunas veces se preparan secciones adicionales si el cirujano de Mohs desea examinar más a fondo las capas más profundas de tejido. Para las imágenes ilustrativas que se muestran a continuación, sin embargo, solo se adquirieron imágenes y se crearon mosaicos de la superficie expuesta de las escisiones descartadas. Esta superficie expuesta corresponde a la última sección congelada de Mohs. La posterior comparación de los mosaicos con la histología se limitó, por tanto, a la última sección congelada.

Los mosaicos confocales se pueden adquirir rápidamente. Para su adquisición, una rutina continua de etapas y capturas requiere aproximadamente 5 minutos para imágenes de 36x36. Transferir y archivar imágenes seguidas de un procesamiento para crear un mosaico requiere otros 4 minutos en otro PC. Así, el tiempo total para crear un mosaico es de hasta 9 minutos para el ejemplo que produjo las imágenes de más adelante. Se esperan lapsos de tiempo más cortos para otros ejemplos que incorporan otras características descritas anteriormente.

En los bordes de las imágenes, se observaron perceptiblemente bandas oscuras debido al artefacto inducido por la curvatura del campo y la pérdida de iluminación debido al viñeteado. Estas se corrigieron con el algoritmo de unión de imágenes, basado en mediciones de calibración en el microscopio confocal para las imágenes que se muestran más adelante. Se calculó que la curvatura de campo Petzval en el microscopio era de aproximadamente 3,8 pm y se midió que era de 5 pm. Cuando se enfoca la superficie de la escisión, la curvatura de campo da como resultado que el tejido se vea en el centro, pero rodeado por un anillo anular en la periferia de la imagen. El anillo se debe a la ventana de vidrio superpuesta en el ejemplo experimental y da como resultado un artefacto de iluminación. El artefacto aparece como bandas brillantes en reflectancia, pero como bandas oscuras en fluorescencia. Al enfocar a un poco más de 5 pm de profundidad por debajo de la superficie del tejido, a menudo el artefacto se minimizaba. Como resultado de un enfoque más profundo, se anticiparon pequeños desajustes con la sección congelada de la superficie y pequeñas pérdidas en correlación con la histología congelada. Las bandas oscuras se eliminaron en gran medida recortando el 10 % de superposición entre imágenes en el algoritmo de unión de imágenes del ejemplo experimental.

Para caracterizar las viñetas en el ejemplo experimental, la pérdida de la iluminación a través del campo de visión se midió con un objetivo fluorescente estándar. Se comprimió una gota de naranja de acridina entre un portaobjetos y un cubreobjetos de un microscopio y se adquirió un apilamiento axial de imágenes. Las imágenes se promediaron en profundidad para determinar el viñeteado en ambas direcciones x e y. El viñeteado se corrigió con un ajuste polinómico de brillo invertido en el algoritmo de unión de imágenes.

El traslado de las platinas XY lineales se estableció en paralelo a las direcciones x e y del barrido óptico de retícula en el microscopio confocal. Se utilizaron mosaicos de un objetivo de prueba de rejilla reflectante para calibrar las desalineaciones angulares. Gareau muestra un mosaico de un objetivo de rejilla reflectante (Regla Ronchi con 200 lpi de EDMUND INDUSTRIAL OPTICS™ de Barrington, Nueva Jersey) que muestra la alineación angular y el registro lateral en ambas direcciones x e y. El mosaico se creó recortando un 10 % de superposición entre imágenes y uniendo imágenes de 3x3. Las líneas de la rejilla aparecen continuas hasta 5 píxeles entre las imágenes. Sin embargo, como se explica a continuación, los mosaicos de tamaño completo se reducen de 8 a 10X, de modo que la falta de coincidencia lateral esté a nivel de subpíxel y no se aprecie en la visualización final.

Los mosaicos en el ejemplo experimental se crearon con el software MATLAB™ (versión 7.4, MATHWORKS™, Natick, Massachusetts). El algoritmo implementó las siguientes etapas: recorte de la superposición entre imágenes, fusión de imágenes en un único mosaico compuesto y corrección de las bandas oscuras residuales entre imágenes. La cantidad de recorte fue del 10 %, según lo predefinido por la distancia de movimiento gradual de las etapas de traslado XY durante la adquisición de la imagen, y se ajustó aún más con precisión mediante mediciones de superposición utilizando el software de análisis de imágenes (IPLab Spectrum, versión 3.6.5, BD BIOSCIENCES, INC.™, Rockville, Maryland). Basándose en la experiencia, la superposición entre imágenes permaneció repetidamente consistente a través de mosaicos grandes con errores mínimos. Después del recortado, las imágenes se concatenaron en un único mosaico compuesto. El recortado elimina las bandas oscuras debidas a la curvatura del campo. La pérdida de iluminación debido al viñeteado se corrigió después con ajustes polinómicos de corrección de brillo invertido en ambas direcciones x e y. Los polinomios fueron diseñados empíricamente para aplanar la pérdida de iluminación en las imágenes. El diseño de los polinomios es específico para estos mosaicos de fluorescencia, pero se basa en un filtro anti-rayas creado originalmente por Marc Lehman, y está disponible como software de código abierto denominado GNU Image Manipulation Program (GIMP). El código fuente y ejecutable de Lehman se puede descargar de Internet.

La escala de grises o de brillo de píxeles se define como I(x, y), donde x e y son posiciones de columna y fila, respectivamente, de píxeles individuales. Horizontalmente a través de todo el mosaico, el perfil de brillo promedio I(x) se determinó promediando los valores de píxeles en columnas en función de la ubicación x de un píxel. De manera similar, verticalmente a través de todo el mosaico, el perfil de brillo promedio I(y) se determinó promediando los valores de píxeles de cada fila en función de la ubicación y de un píxel. El promedio entre columnas y filas de los mosaicos completos proporciona una estimación de baja frecuencia suavizada globalmente de las variaciones espaciales de alta frecuencia en la fluorescencia del tejido. Los perfiles de brillo promedio representan tanto la señal de fluorescencia de las regiones centrales de las imágenes como la pérdida de iluminación en los bordes. Los ajustes polinómicos para el brillo en la dirección x y en la dirección y se modelaron aún más en términos de un promedio móvil de los perfiles de brillo promedio.

El polinomio basado en el promedio móvil se ajusta a las versiones suavizadas localmente de los perfiles de brillo promedio. Los ajustes del polinomio de promedio móvil también representan tanto las señales de fluorescencia de las regiones centrales como la pérdida de iluminación cerca de los bordes de las imágenes. El propósito de estos ajustes polinómicos era aislar espacialmente las regiones de pérdida de iluminación de baja frecuencia cerca de los bordes de las imágenes de las señales de fluorescencia de frecuencia relativamente alta en las regiones centrales. El aislamiento de las dos regiones permitió posteriormente aplicar correcciones principalmente en la pérdida de iluminación, pero ninguna en las señales de fluorescencia. La anchura del filtro, W, se probó empíricamente en el intervalo de 24 a 100 píxeles. Basándose en un examen visual, se descubrió que una pequeña anchura de 36 píxeles proporcionaba la coincidencia óptima del ajuste polinómico de promedio móvil con el perfil de brillo promedio. Las ventanas más pequeñas producían muy poca suavización de las diferencias entre las señales de fluorescencia de alta frecuencia espacial en las regiones centrales de las imágenes y la pérdida de iluminación de baja frecuencia cerca de los bordes, y, por lo tanto, el aislamiento no deseado de las dos regiones. Esto dio como resultado correcciones mínimas de la señal de fluorescencia, pero muy poca corrección para la pérdida de iluminación. Unas ventanas más grandes dieron como resultado demasiado suavizado y, de nuevo, poco aislamiento no deseado, lo que resultó en demasiada corrección de la pérdida de iluminación y también grandes correcciones no deseadas en la señal de fluorescencia.

Al restar los perfiles de brillo promedio de los ajustes polinómicos de promedio móvil, se eliminaron sustancialmente las señales de fluorescencia de las regiones centrales y representaron principalmente la pérdida de iluminación cerca de los bordes. Esta resta resultó en un polinomio de corrección de brillo invertido. Los polinomios de corrección fueron mínimos en las regiones centrales de las imágenes del mosaico que están iluminadas de manera relativamente uniforme. El examen visual mostró que, con una anchura de filtro promedio de 36 píxeles, los polinomios de corrección estaban cerca del cero. Sin embargo, eran apropiadamente grandes cerca de los bordes que muestran la pérdida de iluminación. Así, los polinomios de corrección se aplicaron principalmente en las regiones de pérdida de iluminación, pero no en las regiones centrales de las imágenes en el ejemplo experimental.

En el ejemplo experimental, los polinomios de corrección de brillo invertido se añadieron de nuevo al mosaico original para aplanar la pérdida de iluminación en las imágenes. La pérdida de iluminación en los bordes entre las imágenes se corrigió en la dirección y (fila a fila) y en la dirección x (columna a columna) para producir un nuevo brillo o una distribución de píxeles en escala de grises.

Dado que las correcciones para el ejemplo experimental se basan en una aproximación de promedio móvil de la distribución real del brillo de píxeles, se usó un factor de escalado para ajustar el brillo en las regiones de señal de fluorescencia y viñeteado en los niveles apropiados. El factor de escalado se probó empíricamente en el intervalo de 8 a 128. Basándose en un examen visual, se determinó un factor de 32 para proporcionar el brillo óptimo para los mosaicos. Los factores de escalado más pequeños dieron como resultado unos mosaicos que parecían oscuros; mientras que un factor de escalado mayor dio como resultado demasiado brillo y saturación. A cada fila (o columna) de escalas de grises de píxeles I(x, y), se aplicaron los ajustes polinómicos de brillo invertido proporcionalmente a la señal de fluorescencia promediada localmente. Este enfoque minimizó las correcciones en regiones centrales de imágenes iluminadas de manera relativamente uniforme y limitó las correcciones principalmente a la pérdida de iluminación cerca de los bordes.

El algoritmo para el ejemplo experimental funcionó eficazmente para corregir la pérdida de iluminación bien definida en los bordes de las imágenes debido al viñeteado. El algoritmo se aplicó a los cincuenta mosaicos que se adquirieron para lograr resultados repetibles. La ventaja de este algoritmo es que los polinomios de corrección pueden determinarse "a ciegas" en cualquier mosaico dado sin requerir un conocimiento a priori del viñeteado en el microscopio. Los perfiles de brillo promedio y los ajustes de polinomios de promedio móvil produjeron una estimación de la pérdida de iluminación debido al viñeteado. También se estimó y corrigió cualquier error instrumental adicional de iluminación. La etapa principal consistió en determinar los valores de anchura W y el factor de escalado inicialmente en 2 a 3 mosaicos. Se descubrió que los valores se pueden utilizar después consistentemente. Las correcciones fueron casi cero en la señal de fluorescencia, de modo que la ganancia visual o la pérdida de contraste parecían ser mínimas y no parecían afectar al análisis posterior de mosaicos y a la comparación con la histología. El mosaico final procesado se guardó en formato TIFF.

Cada imagen constaba de 640x480 píxeles, tenía una escala de grises de 8 bits y consumía aproximadamente 1/4 megabytes (MB, 1 MB = 106 bytes de ocho dígitos binarios) de memoria. Así, un mosaico completo de hasta 36x36 imágenes consta de 23.040 x 17.280 píxeles y consume 325 MB de memoria. Los mosaicos se redujeron utilizando la interpolación bilineal para hacer que la resolución lateral y la pixelación mostradas fueran equivalentes a las de una vista de histología ampliada 2X. El mosaico final se muestra al cirujano de Mohs con una resolución lateral de aproximadamente 4 mm, y consiste en aproximadamente 2500 x 2500 píxeles y consume menos de 4 MB de memoria. Las escisiones de Mohs a veces tienen una forma ovalada o alargada y pueden tener hasta 30 mm de largo. Para tales escisiones, se crearon mosaicos más grandes que mostraban hasta 30x10 mm adquiriendo múltiples mosaicos adyacentes de 10x10 mm y uniéndolos en PHOTOSHOP™ de ADOBE SYSTEMS INc Or PORATED™ de San José, California.

Se observaron mosaicos en un monitor de pantalla plana de 30 pulgadas (DELL™ 222-7175 con una tarjeta de vídeo GeForce 8800 GTS de DELL™ de Round Rock, Texas) de 2.500 x 1.600 píxeles. Un mosaico de tamaño completo es equivalente a una vista ampliada 2X. También se observaron con un zoom digital, porciones más pequeñas, denominadas sub-mosaicos. La visualización de sub-mosaicos es equivalente a mayores aumentos, de 4X y 10X.

Se compararon cincuenta mosaicos con las secciones correspondientes de histología congelada de Mohs. Las secciones congeladas fueron las que se prepararon durante la cirugía para el cirujano de Mohs. Estas secciones se prepararon con tinciones estándar de hematoxilina y eosina (H&E). La superficie de la escisión congelada descartada, descongelada, de la que se tomaron imágenes corresponde a la sección final que se preparó. Por lo tanto, los mosaicos se compararon con la última sección congelada de Mohs.

Las características nucleares y morfológicas se evaluaron en los mosaicos y se compararon con la histología. El cirujano de Mohs evaluó aquellas características que se examinan habitualmente en la histología y que son necesarias para detectar tumores CCB con respecto a la piel normal. Las características de la presencia de tumores CCB son un pleomorfismo nuclear (formas y tamaños atípicos), aumento de la densidad nuclear general, configuración en empalizada (disposición de tipo "cerca-piquete" de núcleos alrededor de la periferia interna del tumor), grietas ("fosas" de apariencia oscura alrededor de la periferia externa de los tumores que están llenas de mucina ópticamente transparente) y la presencia de infiltrados inflamatorios. Las características de la piel normal son el margen epidérmico (epidermis a lo largo de la mitad de la periferia de la escisión), folículos pilosos, glándulas sebáceas y glándulas ecrinas.

El cirujano de Mohs utiliza una lente objetivo con un aumento de 2X para examinar rápidamente grandes áreas de histología. Se utilizan lentes objetivos con aumentos de 4X y 10X, cuando se desea una inspección más minuciosa de los detalles nucleares. Se evaluaron mosaicos y sub-mosaicos completos con aumentos equivalentes. Los sub mosaicos generalmente consistieron en una cuarta parte del mosaico completo, dado que el cirujano de Mohs generalmente registra la presencia o ausencia de tumor CCB en cuadrantes.

Se realizaron experimentos para investigar los efectos de la exposición durante 20 segundos a 1 milimoles (mM, 1 mM = 10'3 Moles) de naranja de acridina en una histología posterior. Los posibles efectos incluyen deterioro tisular, degradación del ARN y a Dn debido a la autólisis, digestión del tejido a temperatura ambiente debido a enzimas proteolíticas, hinchazón del citoplasma y separación de la epidermis de la dermis. Estos efectos pueden conllevar que se impida la tinción H&E y una apariencia "desvaída". Se reprocesaron diez escisiones para secciones histológicas congeladas teñidas con H&E después de una tinción con acridina naranja y formación de imágenes confocales. Las secciones congeladas se compararon con las secciones de Mohs correspondientes. En la evaluación y comparación, realizadas por el cirujano de Mohs "a ciegas", se analizaron las posibles alteraciones y distorsiones de los tejidos, así como la cromaticidad del colorante.

Los cincuenta mosaicos que se crearon, para compararlos con la histología, demostraron la repetibilidad del algoritmo de fijación y mosaico de tejidos. Se observó que el registro lateral entre los bordes de las imágenes era a nivel de subpíxel. Los mosaicos aparecían sin uniones razonablemente visibles y contiguos con alta resolución y una iluminación razonablemente uniforme sobre grandes áreas de tejido, y fueron útiles para la visualización clínica y la comparación con la histología. La calidad de imagen de los mosaicos fue repetible y consistentemente alta para el examen de las características morfológicas que son clínicamente importantes para la patología quirúrgica. En las escisiones de piel de Mohs, las características incluyen los bordes del tejido, los márgenes epidérmicos, la dermis normal y el detalle nuclear y morfología macroscópica de los CCB.

Se logró una excelente comparación entre los mosaicos confocales y la correspondiente histología congelada de Mohs para los CCB, así como la morfología de la piel normal. El margen epidérmico de las escisiones junto con la unión dermoepidérmica se identificó clara y repetidamente en los mosaicos. Las estructuras normales de la dermis, como las glándulas sebáceas, los folículos pilosos y las glándulas ecrinas se visualizaron fácil y consistentemente. La morfología general de los CCB en términos de forma, tamaño y ubicación de los nidos tumorales observados en los mosaicos se correspondían perfectamente con los observados en la histología congelada. Adicionalmente, la morfología atípica de los núcleos de los CCB en términos de pleomorfismo (variedad de formas, tamaños, orientaciones y distribuciones irregulares), hacinamiento (aumento de la densidad) y la configuración en empalizada se visualizó claramente en los mosaicos y se correspondía perfectamente con la histología. Se observaron infiltrados inflamatorios alrededor de los nidos de CCB. La tinción nuclear con naranja de acridina proporcionó claramente un mejor contraste de fluorescencia de los tumores con respecto a la dermis del fondo tanto para los tipos de CCB grandes como pequeños. Los tipos grandes incluyen los tipos superficiales y nodulares, mientras que los tipos pequeños incluyen los micronodulares, infiltrantes y esclerosantes. Dado que los tipos grandes eran fácilmente detectables (incluso con contraste de reflectancia), se han presentado los casos más difíciles de tipos pequeños en las siguientes figuras.

El efecto de la coloración con naranja de acridina y el mosaico confocal en el procesamiento posterior de tejidos y la histología congelada teñida con H&E fue mínimo. No hubo diferencia en la tinción de la morfología nuclear, celular y dérmica entre las secciones congeladas que se prepararon antes y después de la toma de imágenes. El proceso de tinción con naranja de acridina no altera el tejido en modo alguno y no afecta negativamente a la capacidad para proporcionar diagnósticos clínicos precisos de las secciones congeladas que posteriormente se tiñen con H&E. Sin embargo, la exposición prolongada del tejido a una temperatura ambiente de laboratorio relativamente cálida provocó la degradación del tejido. Por lo que se tuvo cuidado de mantener frescas las escisiones en solución salina isotónica antes y después de la toma de imágenes y de acelerar el reprocesamiento. Posteriormente, esto condujo a secciones congeladas reproducibles para las ocho escisiones restantes.

La figura 8 es un gráfico 800 que ilustra la intensidad de emisión de fluorescencia detectada, de acuerdo con un ejemplo. El eje horizontal 802 es una longitud de onda óptica en nanómetros. El eje vertical 802 es la intensidad en unidades arbitrarias. La reflexión del divisor de haz dicroico está indicada por la curva 810. La longitud de onda de excitación de fluorescencia a 488 nm se indica con la flecha 820. Como se puede observar, el divisor de haz dicroico no refleja la longitud de onda de excitación en el canal de fluorescencia. La intensidad de las emisiones de fluorescencia del colorante naranja de acridina está indicada por la curva 830 y alcanza su punto máximo a aproximadamente 540 nm. Como se puede observar, el divisor de haz dicroico refleja todo el intervalo de longitud de onda de fluorescencia en el canal de fluorescencia.

Como se ha descrito anteriormente, la intensidad de emisión de fluorescencia proporciona un fuerte contraste entre el núcleo y el citoplasma de una célula y proporciona una buena medida de células tumorales que agrupan muchos núcleos en un área pequeña. Además del contraste nuclear/citoplasmático, La dermis también es oscura, lo que lleva asimismo a un alto contraste nuclear/dérmico.

6. Presentación de imagen multimodal

En un conjunto de realizaciones, un método para presentar una imagen multimodal incluye iluminar un punto en una superficie de una muestra biológica con un haz de luz utilizando un microscopio confocal. Se detecta una primera intensidad de emisión desde el punto en un primer intervalo de propiedades ópticas, como la longitud de onda, polarización y fase. Se detecta una segunda intensidad de emisión desde el punto en un segundo intervalo de propiedades ópticas. Se colorea un píxel que corresponde al punto en una imagen utilizando una combinación lineal u otra combinación de la primera intensidad de emisión detectada desde el punto y la segunda intensidad de emisión detectada desde el punto. En algunas de estas realizaciones, el píxel se colorea para que se asemeje a un color producido por una sección histológica de tejido en ese punto.

La figura 9 es un diagrama de flujo que ilustra a un alto nivel un método 900 para producir una imagen multimodal, de acuerdo una realización. En la etapa 910, se tiñe una superficie de una muestra para mejorar el contraste de las características importantes para la histología. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se tiñe una escisión de tejido extirpado durante la cirugía de Mohs con naranja de acridina durante 20 segundos. En algunas realizaciones, no se desea mejorar el contraste y se omite la etapa 910.

En la etapa 920, se ilumina un punto cercano a la superficie de la muestra con un haz de luz en un microscopio confocal. Por ejemplo, un punto cercano a la superficie en el tejido extirpado teñido con naranja de acridina se ilumina con un haz láser a longitudes de onda cercanas a 488 nm.

En la etapa 930, se detecta la intensidad de emisión desde el punto en un primer intervalo de propiedades ópticas, como la polarización, longitud de onda y fase. Por ejemplo, se mide la intensidad de emisión de fluorescencia desde el punto en un intervalo de longitud de onda por encima de aproximadamente 500 nm.

En la etapa 940, se detecta la intensidad de emisión desde el punto en un segundo intervalo de propiedades ópticas. Por ejemplo, se mide la intensidad de emisión de reflectancia desde el punto en un intervalo de longitud de onda por debajo de aproximadamente 500 nm, p. ej., a 488 nm.

En la etapa 950, un píxel correspondiente al punto se colorea utilizando una combinación de las dos intensidades medidas, tal como una combinación lineal. Por ejemplo, el píxel se colorea para asemejarse al color de una sección histológica congelada para un tejido extirpado durante una cirugía de Mohs, tal como se describe a continuación.

La histopatología con hematoxilina y eosina (H&E) es la herramienta más utilizada para el diagnóstico y la extirpación del cáncer, pero lleva entre media hora y días y requiere recursos costosos. El método descrito en el presente documento emplea imágenes confocales multimodales basadas en luminiscencia para asemejarse a la tinción de absorción con H&E, y es esencialmente libre con las mediciones multimodales y requiere 5 minutos o menos. El ahorro tiempo acorta la exposición de los pacientes a infecciones y otros peligros quirúrgicos, así como los costos hospitalarios asociados.

El experimento descrito anteriormente muestra una sensibilidad equivalente de las dos técnicas para CCB. Hasta este trabajo, las imágenes confocales en escala de grises carecen del contraste de color específico de la estructura que convencionalmente proporciona la utilización de dos tinciones en histopatología: hematoxilina y eosina. La incorporación de la multimodalidad en la microscopía confocal permite mediciones independientes de la morfología celular con respecto a la estructura reflectante del colágeno en la dermis. La combinación de múltiples modos con la microscopía de mosaico en la cirugía de Mohs (MMMMM) demuestra la capacidad de diagnóstico que previamente estaba limitada a la histopatología.

Se combinan dos modos, codificando el contraste de color. El contraste celular/dermis aumenta en las imágenes multimodales en color. Elegir colores como el púrpura y el rosa de la hematoxilina y la eosina desencadena el reconocimiento condicionado por parte de patólogos y médicos, haciendo que el MMMMM sea aceptado amplia y rápidamente. Durante más de 100 años, se ha utilizado la tinción con H&E para marcar de forma independiente los núcleos y el colágeno/citoplasma. Los modos de reflectancia y fluorescencia de esta realización logran la misma tarea de colorante/contracolorante.

En tejidos biológicos, el colágeno y el citoplasma dispersan la luz. En el modo de reflectancia confocal, estos componentes aparecen brillantes, mientras que los núcleos no dispersan la luz y aparecen oscuros. La microscopía confocal del modo de reflectancia no teñida, por lo tanto, cumple la misma función que la Eosina.

Las manchas fluorescentes nucleares (como el naranja de acridina) marcan solo el ADN. Por lo tanto, en modo de fluorescencia los núcleos aparecen brillantes, mientras que el citoplasma y el colágeno (que no tienen ADN) aparecen oscuros. El marcado selectivo de los núcleos en modo de fluorescencia, por lo tanto, desempeña la misma función que la hematoxilina.

El contraste de los tumores que utilizan solo el modo de fluorescencia ahora se ha mejorado para que la microscopía confocal sea paralela a la histopatología convencional. Los tumores nodulares y micro-nodulares se detectan fácilmente, mientras que los pequeños tumores infiltrantes y esclerosantes se detectan con gran aumento. Las realizaciones anteriores que implican solo imágenes confocales de fluorescencia hasta ahora han mostrado una alta sensibilidad y especificidad, pero solo han sido aceptadas por cirujanos de Mohs que tienen un buen conocimiento de la óptica confocal y están acostumbrados a imágenes de fluorescencia en una escala de grises. La realización descrita en esta sección hace que las imágenes confocales puedan ser interpretadas por cualquier persona familiarizada con las imágenes de H&E (p. ej., todos los patólogos y cirujanos de Mohs).

Un microscopio confocal multimodal (p. ej., un microscopio 700 representado en la figura 7A) recolectó mosaicos de fluorescencia y reflectancia corregistrados de muestras de escisiones de cáncer de piel. Las imágenes de los modos de fluorescencia y reflectancia en escala de grises se combinaron mediante una codificación y combinación de colores. Como los patólogos están acostumbrados a interpretar la histopatología con tinción con hematoxilina y eosina, se adaptaron los colores púrpura y rosa de estos dos colorantes para maximizar la asociación con las células y las estructuras no celulares, respectivamente.

Para adquirir los respectivos niveles de rojo, verde y azul (RGB) para producir estos colores, se capturó una imagen digital de un espécimen teñido convencionalmente. El muestreo de la imagen sobre áreas de materia teñida con hematoxilina y materia teñida con eosina produjo brillo en los píxeles RGB en áreas de hematoxilina [Hr Hg Hb] = [0,890,201] y en áreas de eosina [Er Eg Eb] = [10,550,88], respectivamente. Los valores RGB para la hematoxilina se normalizan al nivel azul ya que el tono púrpura del colorante se desplaza más hacia el azul y los valores para la eosina se normalizan al nivel rojo ya que el tono rosado se desplaza hacia el rojo. Adoptando la notación de que los niveles de brillo para el rojo, verde y azul [rgb] corresponden al índice k [k=1 k=2 k=3], respectivamente, y que los índices i y j se refieren al número de columna y al número de fila de una ubicación de píxel, se calcula una imagen confocal que imita una pseudo-coloración con H&E de acuerdo con la Ecuación 1.

imagen^ = l-F /l-H ^ -R y (1-Ek) (1)

Donde F es el brillo de fluorescencia y R es el brillo de reflectancia. La imagen pseudo-coloreada tiene las dimensiones apropiadas para exportarse como un archivo de imagen tal como un mapa de bits, TIF o JPEG.

En una realización ilustrada, las biopsias de tejido se sumergen en naranja de acridina durante 20 segundos y se toman imágenes a los 5 minutos. La figura 10 es una imagen de mosaico 1000 que ilustra el modo de fluorescencia del microscopio, de acuerdo una realización. La figura 11 es una imagen de mosaico 1100 que ilustra el modo de reflectancia individual del microscopio en la misma muestra, de acuerdo una realización. En la figura 10 y la figura 11, no hay color porque cada píxel es una simple medida de intensidad. Estas dos imágenes 1000 y 1100 se toman simultáneamente y se correlacionan espacialmente con respecto a la muestra. La figura 12 es una imagen 1200 que ilustra la coloración de píxeles para asemejarse a la histología, de acuerdo una realización. El color que se muestra es una implementación de la ecuación 1 en los datos de la imagen 1000 y la imagen 1100 para producir una imagen 1200 en color. Se han indicado las áreas púrpuras 1210 y las áreas rosas 1220 ilustrativas. La figura 13 es una imagen 1300 que ilustra un ejemplo de histología. La sección histológica de la imagen 1300, para su comparación con la imagen 1200, es la última sección histológica congelada tomada del tejido extirpado, a pocos milímetros de la superficie de la muestra escaneada en las imágenes 1000 y 1100. Se han indicado las áreas púrpuras 1310 y las áreas rosas 1320 resultantes del colorante convencional con H&E. La figura 14 es una imagen 1400 que ilustra una porción ampliada de una imagen 1200 en color, de acuerdo una realización. Se han indicado las áreas púrpuras 1410 y las áreas rosas 1420 ilustrativas. De las áreas púrpuras, la morfología normal es evidente en la región 1412 y la atipia maligna es evidente en la región 1414.

Esta técnica convierte la información luminosa (reflectancia y fluorescencia) en imágenes basadas en pigmentos (absorbancia). De manera más general, la técnica comprende obtener las propiedades espectrales de las manchas específicas y codificar esa información junto con imágenes confocales multimodales en escala de grises.

La figura 7B es un diagrama de bloques que ilustra un microscopio 702 confocal de reflectancia/fluorescencia multimodal, relacionado con otra realización. El microscopio 702 está configurado para capturar dos imágenes de fluorescencia independientes, además de la imagen de reflectancia. Se utilizan dos fuentes láser para iluminar alternativamente el mismo escáner. La fuente láser 710 es una fuente láser de 488 nm que hace que el colorante de naranja de acridina (NA) sea fluorescente, como en el microscopio 700. La fuente láser 711 es una fuente láser de 532 nm que hace que el tinte de eosina (Eo) sea fluorescente. Los dos haces se introducen alternativamente en el expansor 773 de haz 7X y los subsecuentes componentes ópticos, descritos anteriormente para el microscopio 700, controlando el deflector acústico óptico (DAO) 740, también denominado modulador acústico óptico (MAO). El DAO está controlado por el conmutador 741 que cambia las frecuencias acústicas con cada giro del espejo poligonal 776. Así, cada barrido en dirección x por un láser es seguida inmediatamente por un barrido en dirección x por el otro láser. Para tener en cuenta el doble barrido, el espejo galvo 778 que barre en la dirección perpendicular y se ralentiza por un factor de dos como lo indica el componente 775. La luz de reflectancia de ambos láseres es detectada por el detector de reflectancia (Det R) 742, como APD^r722 y capturada por el capturador de fotogramas 762 y se introduce en el ordenador 760 para su ensamblaje y almacenamiento. De manera similar, la luz para ambos barridos de fluorescencia es capturada por el detector de fluorescencia (Det F) 743, como APD^f738 y capturado por el capturador de fotogramas 763 y se introduce en el ordenador 760 para su ensamblaje y almacenamiento. El divisor de haz dicroico 734 para reflejar solo el haz de fluorescencia en el canal fluorescente hace pasar la luz a longitudes de onda de 532 e inferiores y refleja la luz a longitudes de onda más altas, donde se produce la fluorescencia (aproximadamente 550 nm y superior ambos NA y [para eosina). En otro ejemplo relacionado con una realización, el DAO 740 es controlado por el ordenador 160 en lugar del conmutador 741. Una ventaja es el control preciso y rápido de los haces que ofrece el DAO 740 en comparación con los deflectores mecánicos.

La figura 7C es un diagrama de bloques que ilustra un microscopio 704 confocal de reflectancia/fluorescencia multimodal, relacionado con otra realización. El microscopio 704 se configura de nuevo para capturar dos imágenes de fluorescencia independientes, además de la imagen de reflectancia. Se utilizan las mismas dos fuentes láser 710 y 711 para iluminar alternativamente el mismo barrido que en el microscopio 702 representado en la figura 7B. Los dos haces se introducen alternativamente en el expansor 773 de haz 7X y los subsecuentes componentes ópticos, descritos anteriormente para el microscopio 700, controlando un espejo de barrido 752 con el controlador de espejo 750. El controlador de barrido 750 es controlado por el ordenador 761 basándose en la señal galvo-diente de sierra 779. Así, cada barrido x, y (imagen) por un láser es seguido inmediatamente por un barrido x, y (imagen) por el otro láser. Dado que se recopilan imágenes completas entre los láseres conmutantes, no es necesario separar las líneas de escáner intercaladas, como en la configuración del microscopio 702. Se puede utilizar el APD^fy el APD^rpara recolectar las imágenes, como en el microscopio 700. La luz de reflectancia de ambos láseres es detectada por el detector de reflectancia APD^r722 y capturada por el software de captura de fotogramas 766 en el ordenador 761. De manera similar, la luz para ambos barridos de fluorescencia es capturada por el detector de fluorescencia APD^f738 y capturado por el software de captura de fotogramas 766. Una ventaja de este enfoque es el bajo coste y la amplia disponibilidad actual de espejos de barrido 752. En otro ejemplo relacionado con una realización, un DAO, en lugar de un controlador 750 de espejo de barrido, es controlado por el ordenador 161.

La figura 17 es un gráfico 1700 que ilustra perfiles de absorción para dos tinciones fluorescentes, de acuerdo una realización. El eje horizontal 1702 indica la longitud de onda en nanómetros (nm); y el eje vertical 1704 indica la absorción normalizada a 1 para una máxima absorción. La traza 1710 muestra, con fines comparativos, el nivel de autofluorescencia del tejido sin teñir para el carcinoma de células escamosas (CCS). La traza 720 muestra el espectro de absorción para el tinte de eosina (Eo) en CCS (Fluorescencia Eo a una longitud de onda más larga); y la traza 730 muestra el espectro de absorción para el colorante de naranja de acridina (NA) en CCS (fluorescencia NA a una longitud de onda más larga, aproximadamente 550 nm). La muestra es un tumor fresco de piel humano. Hay una clara separación en las longitudes de onda de absorción, para que cada una puede ser excitada independientemente por las longitudes de onda del láser indicadas por las líneas verticales etiquetadas 488 nm y 532 nm, respectivamente. El colorante NA se excita sustancialmente por el láser a 488 nm, mientras que la Eo no. Por el contrario, la tinción de Eo se excita sustancialmente por el láser a 532 nm, mientras que el NA no. La historia es sustancialmente la misma para la tinción de un tumor fresco de piel humano de carcinoma de células basales (CCB). La traza 740 muestra el espectro de absorción para el colorante de eosina (Eo) en CCB; y la traza 750 muestra el espectro de absorción para el colorante naranja de acridina (NA) en CCB. De nuevo, existe una clara separación en las longitudes de onda de absorción.

Así, utilizando el microscopio 702 o el microscopio 703, se puede generar una útil imagen en color de la siguiente manera. La superficie de la muestra biológica se pone en contacto con una solución de naranja de acridina y eosina. Se ilumina un punto con un primer haz de luz y un segundo haz de luz. El primer haz de luz comprende un haz láser con una longitud de onda de aproximadamente 488 nanómetros, y el segundo haz de luz comprende un haz láser con una longitud de onda de aproximadamente 532 nanómetros. La detección de una primera intensidad de emisión comprende detectar la intensidad de emisión de fluorescencia desde el punto en un intervalo de longitud de onda por encima de aproximadamente 500 nanómetros para detectar núcleos celulares, y la detección una segunda intensidad de emisión comprende detectar la intensidad de emisión de fluorescencia desde el punto en un intervalo de longitud de onda por encima de aproximadamente 532 nanómetros para detectar citoplasmas y colágeno. Se colorea un píxel que corresponde al punto en una imagen utilizando una combinación lineal de la primera intensidad de emisión detectada desde el punto y la segunda intensidad de emisión detectada desde el punto.

La figura 18 es un gráfico que ilustra la coloración de píxeles de dos imágenes de fluorescencia para una asemejarse a la histología, de acuerdo una realización. La figura 18 incluye seis imágenes: imagen 1802, imagen 1804, imagen 1806, imagen 1812, imagen 1814 e imagen 1820, todas ellas proporcionan una vista de campo completo de una región de 0,5 mm por 0,5 mm en un objetivo 30X. La imagen 1802 representa la fluorescencia con NA a partir de una excitación a 488 nm. La imagen 1804 representa la fluorescencia con Eo a partir de una excitación a 532 nm. La imagen 1806 representa la reflectancia a una excitación de 532 nm. La imagen 1812 representa un color falso (tinte azul de diferencia de intensidad con respecto a la imagen 1802) que indica núcleos. La imagen 1814 representa un color falso (tinte rojo de diferencia de intensidad con respecto a la imagen 1804) que indica contratinción. La imagen 1820 muestra una combinación de colores falsos de la imagen 1812 y 1814 para obtener una imagen equivalente al H&E, con áreas púrpuras 1822 que indican núcleos y áreas rosa 1824 que indican colágeno/citoplasma.

7. Descripción del hardware del ordenador

La figura 15 es un diagrama de bloques que ilustra un sistema informático 1500 sobre el que se puede implementar un ejemplo. El sistema informático 1500 incluye un mecanismo de comunicación tal como un bus 1510 para pasar información entre otros componentes internos y externos del sistema informático 1500. La información se representa como señales físicas de un fenómeno mensurable, normalmente, tensiones eléctricas, pero incluyendo, en otros ejemplos, fenómenos tales como las interacciones magnéticas, electromagnéticas, de presión, químicas, atómicas moleculares y cuánticas. Por ejemplo, campos magnéticos norte y sur o una tensión eléctrica cero y no cero, representan dos estados (0, 1) de un dígito binario (bit). Una secuencia de dígitos binarios constituye datos digitales que se utilizan para representar un número o código para un carácter. Un bus 1510 incluye muchos conductores paralelos de información para que la información se transfiera rápidamente entre los dispositivos acoplados al bus 1510. Uno o más procesadores 1502 para procesar información están acoplados al bus 1510. Un procesador 1502 realiza un conjunto de operaciones sobre la información. El conjunto de operaciones incluye traer información desde el bus 1510 y colocar información en el bus 1510. El conjunto de operaciones normalmente también incluye comparar dos o más unidades de información, cambiar posiciones de unidades de información y combinar dos o más unidades de información, tal como por adición o multiplicación. Una secuencia de operaciones a ejecutar por el procesador 1502 constituye instrucciones de informáticas.

El sistema informático 1500 también incluye una memoria 1504 acoplada al bus 1510. La memoria 1504, tal como una memoria de acceso aleatorio (RAM) u otro dispositivo de almacenamiento dinámico, almacena información, incluyendo las instrucciones informáticas. La memoria dinámica permite que el sistema informático 1500 modifique la información almacenada en la misma. La RAM permite que una unidad de información almacenada en una ubicación denominada dirección de memoria se almacene y recupere independientemente de la información en direcciones vecinas. El procesador 1502 también utiliza la memoria 1504 para almacenar valores temporales durante la ejecución de las instrucciones informáticas. El sistema informático 1500 también incluye una memoria de solo lectura (ROM) 1506 u otro dispositivo de almacenamiento estático acoplado al bus 1510 para almacenar información estática, incluyendo instrucciones, esto no es alterado por el sistema informático 1500. También acoplado al bus 1510 hay un dispositivo de almacenamiento no volátil (persistente) 1508, tal como un disco magnético o un disco óptico, para almacenar información, incluyendo instrucciones, que persiste incluso cuando el sistema informático 1500 se apaga o pierde energía.

La información, incluyendo instrucciones, se proporciona al bus 1510 para que el procesador la utilice desde un dispositivo de entrada externo 1512, tal como un teclado que contiene teclas alfanuméricas accionadas por un usuario humano o un sensor. Un sensor detecta condiciones en su vecindad y transforma esas detecciones en señales compatibles con las señales utilizadas para representar información en el sistema informático 1500. Otros dispositivos externos acoplados al bus 1510, utilizados principalmente para interactuar con humanos, incluyen un dispositivo de visualización 1514, tal como un tubo de rayos catódicos (CRT) o una pantalla de cristal líquido (LCD), para presentar imágenes y un dispositivo de puntero 1516, como un ratón o una rueda de desplazamiento o teclas de dirección del cursor, para controlar la posición de una pequeña imagen de cursor presentada en la pantalla 1514 y emitir comandos asociados con elementos gráficos presentados en la pantalla 1514.

En el ejemplo ilustrado, el hardware de propósito especial, tal como un circuito integrado (CI) 1520 de aplicación específica, está acoplado al bus 1510. El hardware de propósito especial está configurado para realizar operaciones que no realiza el procesador 1502 lo suficientemente rápido para fines especiales. Los ejemplos de circuitos integrados de aplicación específica incluyen tarjetas aceleradoras de gráficos para generar imágenes para la pantalla 1514, tableros criptográficos para cifrar y descifrar mensajes enviados a través de una red, reconocimiento de voz e interfaces con dispositivos externos especiales, tales como brazos robóticos y equipos de exploración médica que realizan repetidamente una secuencia compleja de operaciones que se implementan de manera más eficiente en hardware.

El sistema informático 1500 también incluye una o más instancias de una interfaz de comunicaciones 1570 acoplada al bus 1510. La interfaz de comunicación 1570 proporciona un acoplamiento de comunicación bidireccional a varios dispositivos externos que funcionan con sus propios procesadores, tal como impresoras, escáneres y discos externos. En general, el acoplamiento es con un enlace de red 1578 que está conectado a una red local 1580, a la que están conectados varios dispositivos externos con sus propios procesadores. Por ejemplo, la interfaz de comunicación 1570 puede ser un puerto paralelo o un puerto en serie o un puerto de bus universal en serie (USB) en un ordenador personal. En algunos ejemplos, la interfaz de comunicaciones 1570 es una tarjeta de red digital de servicios integrados (RDSI) o una tarjeta de línea de abonado digital (DSL) o un módem telefónico que proporciona una conexión de comunicación de información a un tipo correspondiente de línea telefónica. En algunos ejemplos, una interfaz de comunicación 1570 es un módem por cable que convierte las señales del bus 1510 en señales para una conexión de comunicación a través de un cable coaxial o en señales ópticas para una conexión de comunicación a través de un cable de fibra óptica. En otro ejemplo, la interfaz de comunicaciones 1570 puede ser una tarjeta de red de área local (LAN) para proporcionar una conexión de comunicación de datos a una LAN compatible, tal como Ethernet. También se pueden implementar enlaces inalámbricos. Las ondas portadoras, tales como las ondas acústicas y ondas electromagnéticas, incluyendo ondas de radio, ópticas e infrarrojas viajan a través del espacio sin cables ni hilos. Las señales incluyen variaciones provocadas por el hombre en amplitud, frecuencia, fase, polarización u otras propiedades físicas de las ondas portadoras. Para enlaces inalámbricos, la interfaz de comunicaciones 1570 envía y recibe señales eléctricas, acústicas o electromagnéticas, incluyendo señales infrarrojas y ópticas, que transportan flujos de información, tales como datos digitales.

El término medio legible por ordenador se utiliza en el presente documento para referirse a cualquier medio que participe en el suministro de información al procesador 1502, incluyendo instrucciones para su ejecución. Tal medio puede adoptar muchas formas, incluyendo, pero sin limitación, medios no volátiles, medios volátiles y medios de transmisión. Los medios no volátiles incluyen, por ejemplo, discos ópticos o magnéticos, como dispositivo de almacenamiento 1508. Los medios volátiles incluyen, por ejemplo, una memoria dinámica 1504. Los medios de transmisión incluyen, por ejemplo, cables coaxiales, hilo de cobre, cables de fibra óptica y ondas que viajan por el espacio sin hilos ni alambres, tales como las ondas acústicas y ondas electromagnéticas, incluyendo las ondas radio, ópticas e infrarrojas. El término medio legible por ordenador se utiliza en el presente documento para referirse a cualquier medio que participe en el suministro de información al procesador 1502 excluyendo los medios de transmisión.

Las formas comunes de medios legibles por ordenador incluyen, por ejemplo, un disquete, un disco flexible, un disco duro, una cinta magnética o cualquier otro medio magnético, un disco compacto ROM (CD-ROM), un disco de vídeo digital (DVD) o cualquier otro medio óptico, tarjetas perforadas, cinta de papel o cualquier otro medio físico con patrones de agujeros, una RAM, una ROM programable (PROM), una p Ro M borrable (EPROM), un FLASH-EPROM o cualquier otro chip o cartucho de memoria, una onda portadora o cualquier otro medio desde el cual ordenador pueda leer.

El enlace de red 1578 normalmente proporciona la comunicación de información a través de una o más redes a otros dispositivos que utilizan o procesan la información. Por ejemplo, el enlace de red 1578 puede proporcionar una conexión a través de la red local 1580 a un ordenador anfitrión 1582 o al equipo 1584 operado por un proveedor de servicios de Internet (ISP). El equipo ISP 1584 a su vez proporciona servicios de comunicación de datos a través de la red mundial pública de redes de conmutación de paquetes de comunicación, comúnmente conocida como Internet 1590. Un ordenador denominado servidor 1592 conectado a Internet proporciona un servicio en respuesta a la información recibida a través de Internet. Por ejemplo, el servidor 1592 proporciona información que representa datos de vídeo para su presentación en la pantalla 1514.

Se describe la utilización del sistema informático 1500 para implementar las técnicas descritas en el presente documento. De acuerdo con un ejemplo, estas técnicas las realiza el sistema informático 1500 en respuesta al procesador 1502 ejecutando una o más secuencias de una o más instrucciones contenidas en la memoria 1504. Tales instrucciones, también denominadas software y código de programa, pueden leerse en la memoria 1504 desde otro medio legible por ordenador, como el dispositivo de almacenamiento 1508. La ejecución de las secuencias de instrucciones contenidas en la memoria 1504 hace que el procesador 1502 realice las etapas del método descrito en el presente documento. En ejemplos alternativos, un hardware, tal como el circuito integrado de aplicación específica 1520, puede utilizarse en lugar o en combinación con el software. Así, los ejemplos no se limitan a ninguna combinación específica de hardware y software.

Las señales transmitidas a través del enlace de red 1578 y otras redes a través de la interfaz de comunicaciones 1570, llevan información hacia y desde el sistema informático 1500. El sistema informático 1500 puede enviar y recibir información, incluyendo un código de programa, por las redes 1580, 1590 entre otras, a través del enlace de red 1578 y la interfaz de comunicaciones 1570. En un ejemplo que utiliza Internet 1590, un servidor 1592 transmite el código del programa para una aplicación particular, solicitado por un mensaje enviado desde el ordenador 1500, a través de Internet 1590, el equipo ISP 1584, la red local 1580 y la interfaz de comunicaciones 1570. El código recibido puede ser ejecutado por el procesador 1502 a medida que se recibe o puede almacenarse en el dispositivo de almacenamiento 1508 u otro almacenamiento no volátil para su posterior ejecución, o ambas cosas. De este modo, el sistema informático 1500 puede obtener el código del programa de aplicación en forma de señal en una onda portadora.

Pueden estar involucradas diversas formas de medios legibles por ordenador en el traslado de una o más secuencias de instrucciones o datos o ambas al procesador 1502 para su ejecución. Por ejemplo, las instrucciones y los datos se pueden llevar inicialmente en un disco magnético de un ordenador remoto como el anfitrión 1582. El ordenador remoto carga las instrucciones y los datos en su memoria dinámica y envía las instrucciones y los datos a través de una línea telefónica utilizando un módem. Un módem local para el sistema informático 1500 recibe las instrucciones y los datos por una línea telefónica y utiliza un transmisor de infrarrojos para convertir las instrucciones y los datos en una señal en una onda portadora infrarroja que sirve como enlace de red 1578. Un detector de infrarrojos que sirve como interfaz de comunicaciones 1570 recibe las instrucciones y los datos transportados en la señal infrarroja y coloca la información que representa las instrucciones y los datos en el bus 1510. El bus 1510 lleva la información a la memoria 1504 desde la cual el procesador 1502 recupera y ejecuta las instrucciones utilizando algunos de los datos enviados con las instrucciones. Las instrucciones y los datos recibidos en la memoria 1504 opcionalmente pueden almacenarse en el dispositivo de almacenamiento 1508, antes o después de su ejecución por el procesador 1502.

8. Ampliaciones y alternativa.

En la memoria descriptiva anterior, la invención se ha descrito con referencia a realizaciones específicas de la misma. Sin embargo, será evidente que pueden realizarse diversas modificaciones y cambios en la misma sin desviarse del ámbito de la invención. La memoria descriptiva y los dibujos, en consecuencia, deberán considerarse en un sentido ilustrativo en vez de restrictivo.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para presentar una imagen multimodal desde un microscopio confocal, que comprende:

poner en contacto una superficie de una muestra biológica extirpada con un colorante fluorescente nuclear que marca selectivamente núcleos en modo de fluorescencia;

iluminar un punto en la superficie de la muestra biológica extirpada con un haz de luz utilizando un microscopio confocal;

detectar una primera intensidad de emisión desde el punto en un primer intervalo de propiedades ópticas, en donde la primera intensidad de emisión es del colorante fluorescente nuclear;

detectar una segunda intensidad de emisión desde el punto en un segundo intervalo de propiedades ópticas, en donde la segunda intensidad de emisión es de una reflectancia sin tinción; y

colorear un píxel que corresponde al punto en una imagen utilizando una combinación lineal de la primera intensidad de emisión detectada desde el punto y la segunda intensidad de emisión detectada desde el punto, en donde colorear el píxel comprende la utilización de una combinación lineal de componentes de color de un colorante de hematoxilina púrpura multiplicada por la intensidad de emisión de fluorescencia desde el punto para imitar un colorante de hematoxilina púrpura, y de componentes de color de un colorante de eosina rosa multiplicado por la intensidad de emisión de reflectancia desde el punto para imitar un colorante de eosina rosa.

2. El método según la reivindicación 1, en donde la detección de la primera intensidad de emisión además comprende detectar la intensidad de emisión de fluorescencia desde el punto en un intervalo de longitud de onda diferente de un intervalo de longitud de onda del haz de luz.

3. El método según la reivindicación 1, en donde: el método además comprende poner en contacto la superficie de la muestra biológica extirpada con una solución de naranja de acridina; iluminar el punto además comprende iluminar el punto con un haz láser con una longitud de onda de aproximadamente 488 nanómetros (nm, 1 nm = 10-9 metros); detectar la primera intensidad de emisión además comprende detectar una intensidad de emisión de fluorescencia desde el punto en un intervalo de longitud de onda por encima de aproximadamente 500 nm; y detectar la segunda intensidad de emisión además comprende detectar la intensidad de emisión de reflectancia desde el punto en un intervalo de longitud de onda por debajo de aproximadamente 500 nm.

4. Un método según la reivindicación 3, en donde colorear el píxel además comprende sumar 100 % de intensidad y restar la intensidad de emisión de fluorescencia y restar la intensidad de emisión de reflectancia para cada componente de color del píxel, de modo que un píxel sin reflectancia y sin fluorescencia aparece en blanco.

5. El método según la reivindicación 1, en donde: el método además comprende poner en contacto la superficie de la muestra biológica extirpada con una solución de naranja de acridina y eosina; iluminar el punto además comprende iluminar el punto con un primer haz láser con una longitud de onda de aproximadamente 488 nanómetros (nm, 1 nm = 10-9 metros) y con un segundo haz láser con una longitud de onda de aproximadamente 532 nm; detectar la primera intensidad de emisión además comprende detectar una intensidad de emisión de fluorescencia desde el punto en un intervalo de longitud de onda por encima de aproximadamente 500 nm; y detectar la segunda intensidad de emisión además comprende detectar una intensidad de emisión de fluorescencia desde el punto en un intervalo de longitud de onda por encima de aproximadamente 532 nm.

6. El método según la reivindicación 5, que además comprende detectar una intensidad de emisión de reflectancia desde el punto en un intervalo de longitud de onda que corresponde a un intervalo de longitud de onda de al menos uno del primer haz láser o el segundo haz láser.