ES2733377T3 - Vacunas con interleucina-33 como adyuvante - Google Patents

Vacunas con interleucina-33 como adyuvante Download PDF

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Daniel Villarreal
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Inovio Pharmaceuticals Inc
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Abstract

Una vacuna que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno y una secuencia de ácido nucleico que codifica IL-33, en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica IL-33 comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: una secuencia de nucleótidos como se expone en la SEQ ID NO: 1 y una secuencia de nucleótidos como se expone en la SEQ ID NO: 3

Description

DESCRIPCIÓN
Vacunas con interleucina-33 como adyuvante
Campo técnico
La presente invención se refiere a vacunas que comprenden una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno y una secuencia de ácido nucleico que codifica IL-33, en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica IL-33 comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: una secuencia de nucleótidos como se expone en la SEQ ID NO: 1 y una secuencia de nucleótidos como se expone en la SEQ ID NO: 3 y el uso de dichas vacunas.
Antecedentes
Las vacunas se utilizan para estimular una respuesta inmunitaria en un individuo para proporcionar protección y/o tratamiento para una enfermedad en particular. Algunas vacunas incluyen un antígeno para inducir la respuesta inmunitaria. Algunos antígenos provocan una fuerte respuesta inmunitaria, mientras que otros antígenos provocan una respuesta inmunitaria débil. Una respuesta inmunitaria débil a un antígeno puede fortalecerse al incluir un adyuvante en la vacuna. Los adyuvantes se presentan en muchas formas diferentes, por ejemplo, sales de aluminio, emulsiones oleosas, constituyentes estériles de bacterias u otros patógenos, citocinas y así sucesivamente.
Las citocinas son proteínas producidas por células que afectan el comportamiento de otras células y, a diferencia de muchos adyuvantes, pueden modular respuestas inmunitarias específicas. Una de estas citocinas es la interleucina-33 (IL-33). La IL-33 es una señal o alarma endógena que alerta al sistema inmunitario ante una lesión o infección tisular. En particular, IL-33 de longitud completa se libera en el espacio extracelular y activa su receptor ST2. La activación de ST2 provoca a respuestas inmunitarias inflamatorias y de tipo 2.
Las vacunas también se administran de muchas maneras diferentes (por ejemplo, inyección, por vía oral, etc.) en muchos tejidos diferentes (por ejemplo, intramuscular, nasal, etc.). Sin embargo, no todos los métodos de administración son iguales. Algunos métodos de administración permiten un mayor cumplimiento dentro de una población de individuos, mientras que otros métodos de administración pueden afectar a la inmunogenicidad y/o seguridad de la vacuna. Por consiguiente, sigue existiendo una necesidad en la técnica para el desarrollo de adyuvantes seguros y más eficaces que aumenten las respuestas inmunitarias al antígeno.
Los documentos WO 2008/066443, W o 2012/113927 y WO 2008/132709 describen composiciones que comprenden IL-33 o fragmentos de la misma o anticuerpos dirigidos contra IL-33.
Sumario
La materia objeto para la cual se busca protección es como se define en las reivindicaciones.
La presente invención se refiere a una vacuna que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno y una secuencia de ácido nucleico que codifica IL-33, en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica IL-33 comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: una secuencia de nucleótidos como se expone en la SEQ ID NO: 1 y una secuencia de nucleótidos como se expone en la SEQ ID NO: 3.
El antígeno puede estar codificado por un primer ácido nucleico y la IL-33 puede estar codificada por un segundo ácido nucleico. El segundo ácido nucleico puede comprender además un vector de expresión. La vacuna puede comprender además un antígeno peptídico con la misma secuencia de ácido nucleico codificada que el antígeno anterior y un péptido de IL-33 con la misma secuencia de ácido nucleico codificada que la IL-33 anterior.
La IL-33 puede seleccionarse entre el grupo que consiste en: proIL-33 y mtrIL-33. IL-33 puede ser proIL-33. ProIL-33 puede estar codificada por una secuencia de nucleótidos como se expone en la SEQ ID NO: 3. IL-33 puede ser mtrIL-33. MtrIL-33 puede estar codificada por una secuencia de nucleótidos como se expone en la SEQ ID NO: 1.
El antígeno puede seleccionarse entre el grupo que consiste en: un antígeno del virus del papiloma humano (VPH), un antígeno del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), un antígeno de la gripe, un antígeno de Plasmodium falciparum, un antígeno de Mycobacterium tuberculosis, un antígeno de coriomeningitis linfocítica (LCMV) y un fragmento de los mismos. El antígeno de VPH puede seleccionarse entre el grupo que consiste en: antígeno E6 de VPH16, antígeno E7 de VPH16 y una combinación de los mismos. El antígeno de VIH puede seleccionarse entre el grupo que consiste en: Env A, Env B, Env C, Env D, B Nef-Rev, Gag y cualquier combinación de los mismos. El antígeno de la gripe puede seleccionarse entre el grupo que consiste en: H1 HA, H2 HA, H3 HA, H5 HA, antígeno BHA y cualquier combinación de los mismos. El antígeno de Plasmodium falciparum puede incluir un antígeno de circumesporocito (CS). El antígeno de Mycobacterium tuberculosis puede seleccionarse entre el grupo que consiste en: Ag85A, Ag85B, EsxA, EsxB, EsxC, EsxD, EsxE, EsxF, EsxH, EsxO, EsxQ, EsxR, EsxS, EsxT, EsxU, EsxV, EsxW y cualquier combinación de los mismos. El antígeno de LCMV puede seleccionarse entre el grupo que consiste en: nucleoproteína (NP), glucoproteína (GP) y una combinación de los mismos.
La vacuna puede comprender además un excipiente farmacéuticamente aceptable.
La presente invención también se refiere a las vacunas de la invención para su uso en un método para aumentar una respuesta inmunitaria en un sujeto que lo necesite. El método puede comprender administrar una vacuna que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno y una secuencia de ácido nucleico que codifica IL-33, en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica IL-33 comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: una secuencia de nucleótidos como se expone en la SEQ ID NO: 1 y una secuencia de nucleótidos como se expone en la SEQ ID NO: 3, al sujeto.
La administración de la vacuna puede incluir electroporación. La respuesta inmunitaria en el sujeto se puede aumentar al menos aproximadamente 2 veces. La respuesta inmunitaria en el sujeto se puede aumentar al menos aproximadamente 4 veces. El aumento de la respuesta inmunitaria en el sujeto puede incluir el aumento de una respuesta inmunitaria celular en el sujeto.
La presente invención se refiere además a las vacunas de la invención para su uso en un método para tratar el cáncer en un sujeto que lo necesite. El método puede comprender administrar una vacuna que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno y una secuencia de ácido nucleico que codifica IL-33, en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica IL-33 comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: una secuencia de nucleótidos como se expone en la SEQ ID NO: 1 y una secuencia de nucleótidos como se expone en la SEQ ID NO: 3, al sujeto.
El método para tratar el cáncer puede comprender además reducir el tamaño del tumor en el sujeto. El método para tratar el cáncer puede comprender además un aumento de la regresión tumoral en el sujeto. El cáncer puede seleccionarse entre el grupo que consiste en: un cáncer asociado con el VPH, un cáncer asociado con el v Hb , un cáncer de ovario, un cáncer de próstata, un cáncer de mama, un cáncer de cerebro, un cáncer de cabeza y cuello, un cáncer de garganta, un cáncer de pulmón, un cáncer de hígado, un cáncer del páncreas, un cáncer de riñón, un cáncer de hueso, un melanoma, un cáncer metastásico, un cáncer asociado a hTERT, un cáncer asociado al antígeno FAP, un cáncer de pulmón no microcítico, un cáncer hematológico, un carcinoma escamocelular del esófago, un cáncer de cuello uterino, un cáncer de vejiga, un cáncer colorrectal, un cáncer gástrico, un cáncer de ano, un carcinoma sinovial, un cáncer de testículo, una papilomatosis respiratoria recurrente, un cáncer de piel, un glioblastoma, un hepatocarcinoma, un cáncer de estómago, una leucemia mieloide aguda, un cáncer de mama triple negativo y linfoma primario de linfocitos T cutáneos. El cáncer puede ser el cáncer asociado al VPH.
La presente invención se refiere además a una molécula de ácido nucleico que comprende una o más secuencias de nucleótidos seleccionadas entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 y cualquier combinación de los mismos. La molécula de ácido nucleico puede ser un plásmido. La molécula de ácido nucleico puede ser uno o más plásmidos.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 muestra en (A) una representación esquemática de las construcciones de proIL-33 de ratón y mtrIL-33 de ratón; (B) detección por transferencia de Western de proIL-33 y mtrIL-33; (C) detección por ELISA de proIL-33 y mtrIL-33 secretadas; y (D) localización celular de proIL-33 y mtrIL-33.
La FIG. 2 muestra en (A) un esquema de inmunización con vacunas de ADN; (B) ELISpot de IFN-y; y (C) ELISpot de IL-4.
La FIG. 3 muestra en (A) la estrategia de clasificación para el análisis por citometría de flujo; (B) linfocitos T CD4+ específicos de E6/E7 que liberan IFN-y; (C) linfocitos T CD4+ específicos de E6/E7 que liberan TNF-a; (D) linfocitos T CD4+ específicos de E6/E7 que liberan IFN-y y TNF-a; y (E) subpoblaciones de linfocitos T CD4+ positivos sencillos y dobles positivos.
La FIG. 4 muestra en (A) linfocitos T CD8+ específicos de E6/E7 que liberan IFN-y; (B) linfocitos T CD8+ específicos de E6/E7 que liberan TNF-a; (C) linfocitos T CD8+ específicos de E6/E7 que liberan IFN-y y TNF-a; (D) subpoblaciones de linfocitos T CD8+ positivos sencillos y dobles positivos; (E) CTL específicos de E6/E7 que expresan el marcador de desgranulación CD107a; y (F) subpoblaciones de linfocitos T CD8+ positivos sencillos y dobles y triples positivos.
La FIG. 5 muestra en (A) la cinética de la expresión Ly5.1 y (B) la distribución de linfocitos T CD8+ efectores de memoria.
La FIG. 6 muestra gráficas representativas de la intensidad de fluorescencia de linfocitos T CD8+ específicos para GP33/ly5.1.
La FIG. 7 muestra en (A) anticuerpos IgG totales específicos contra E7 de VPH16; (B) anticuerpos IgE totales específicos contra E7 de VPH16; y (C) anticuerpos IgE totales detectados en suero.
La FIG. 8 muestra en (A) una ilustración esquemática de la línea de tiempo del régimen terapéutico; y (B) el tamaño medio del tumor a lo largo del tiempo después de la exposición a células tumorales.
La FIG. 9 muestra el porcentaje de supervivencia de ratones después de la exposición a células tumorales.
La FIG. 10 muestra una representación esquemática de las construcciones de proIL-33 humana y mtrIL-33 humana.
La FIG. 11 muestra en (A) una ilustración esquemática de la línea de tiempo para los experimentos que examinan la exposición a LCMV; (B) el porcentaje de supervivencia de ratones expuestos i.c. con 20xDL50 de Armstrong LCMV; y (C) el porcentaje de supervivencia de ratones expuestos i.c. con 40xDL50 de Armstrong LCMV.
La FIG. 12 muestra en (A) la capacidad de los linfocitos T CD8+ para producir IFN-y en respuesta al epítopo DbNP396 según se determina mediante el ensayo ELISpot de IFN-y; (B) las frecuencias de citocinas totales (es decir, IFN-y, TNF-a e IL-2) de linfocitos T CD8+ específicos para DbNP396 medidas mediante citometría de flujo; (C) subpoblaciones de linfocitos T CD8+ positivos sencillos, dobles y triples positivos que liberan las citocinas IFN-Y, TNF-a e IL-2; (D) el porcentaje de linfocitos T de desgranulación citolíticos específicos de antígeno que producen IFN-y, en los que se identificó la desgranulación de linfocitos T mediante el marcador de desgranulación CD107a y las gráficas de puntos fueron representativas de cada grupo de ratones; (E) el porcentaje de proliferación de linfocitos T CD8+ estimulados con péptido DbNP396, anti-CD3 y anti-CD28 medido por el marcador celular violeta y citometría de flujo; y (F) el porcentaje de linfocitos T CD8+ efectores de memoria tras la estimulación con péptido DbNP396, en los que las gráficas de puntos fueron representativas de linfocitos T CD62L'CD44+CD8+ tras la estimulación.
La FIG. 13 muestra en (A) la cinética de linfocitos T CD8 específicos para DbGp33 (Tet+) en la sangre después de la vacunación con ADN con un cebado en el día 0 y un refuerzo con GP solo (flecha) en el día 21 después de la vacunación (dpv); (B) la frecuencia de linfocitos T CD8+ DbGP33 a los 21 dpv; (C) linfocitos T específicos de GP que producen IFN-y a los 21 dpv según se mide mediante el ensayo ELISpot de IFN-y; (D) la frecuencia de linfocitos T IFN-Y+CD8+ específicos de GP a los 21 dpv; (E) la frecuencia de linfocitos T CD107a+CD8+ T específicos de GP a los 21 dpv; y (F) la frecuencia de linfocitos T T-bet+CD8+ específicos de GP a los 21 dpv.
La FIG. 14 muestra en (A) un esquema que ilustra un calendario de inmunización con vacunas; y (B) la cinética de la población de linfocitos T CD8+KLRG1+ después de la vacunación con ADN.
La FIG. 15 muestra en (A) la cinética del desarrollo de linfocitos T DbGP33+CD8+CD122+ después de la vacunación con ADN con un cebado en el día 0 y un refuerzo solo con GP (flecha) en el día 21, así como gráficas de contorno representativas que indican la expresión en la superficie celular de CD122 en linfocitos T CD8+ específicos para el tetrámero DbGP33+ en sangre periférica en el día 21 y el día 31; (B) producción de IFN-y por linfocitos T CD8+CD122+ después de la reestimulación ex vivo con cúmulo de péptido antigénico GP en el día 21 dpv de bazos de ratón recogidos (n = 4); y (C) producción de IFN-y representativa por subconjuntos de linfocitos T CD8 (es decir, CD8+KLRG1+, CD8+CD122+, CD8+KLRG1 y CD8+c D122‘) después de la reestimulación ex vivo con péptido DbNP396 en el día 21 dpv de bazos de ratón recogidos (n = 4).
La FIG. 16 muestra en (A) un esquema del calendario de inmunización de la administración de la vacuna de ADN con mAb anti-CD 122; (B) una evaluación de linfocitos T que expresan CD8 y CD122 en ratones no tratados y tratados con anti-CD122; y (C) la frecuencia de linfocitos T CD8+ específicos para tetrámero DbGP33 en el bazo después del tratamiento con mAb anti-CD 122 y gráficas de contorno representativas que representan linfocitos T CD8+ para DbGP33 después del tratamiento.
La FIG. 17 muestra en (A) la detección de células específicas de antígeno que secretan IFN-y después de la vacunación según se mide por el ensayo ELISpot de IFN-y; (B) el porcentaje de linfocitos T CD4+ polifuncionales, determinado mediante citometría de flujo de múltiples parámetros, en el que el diagrama de barras representa el porcentaje de linfocitos T específicos para VIH presentados como células triple positivas, doble positivas y positivas sencillas que secretan las citocinas IFN-y, IL-2 y TNF-a y el diagrama de sectores representa la proporción relativa de cada subpoblación de citocinas; y (C) el porcentaje de linfocitos T CD8+ polifuncionales, determinado mediante citometría de flujo de múltiples parámetros, en el que el diagrama de barras representa el porcentaje de linfocitos T específicos para VIH presentados como células triple positivas, doble positivas y positivas sencillas que secretan las citocinas iFN-y, IL-2 y TNF-a y el diagrama de sectores representa la proporción relativa de cada subpoblación de citocinas.
La FIG. 18 muestra en (A) la detección de células específicas de antígeno que secretan IFN-y después de la vacunación según se mide por el ensayo ELISpot de IFN-y; (B) el porcentaje de linfocitos T CD4+ polifuncionales, determinado mediante citometría de flujo de múltiples parámetros, en el que el diagrama de barras representa el porcentaje de linfocitos T específicos para TB presentados como células triple positivas, doble positivas y positivas sencillas que secretan las citocinas IFN-y, IL-2 y TNF-a y el diagrama de sectores representa la proporción relativa de cada subpoblación de citocinas; y (C) el porcentaje de linfocitos T CD8+ polifuncionales, determinado mediante citometría de flujo de múltiples parámetros, en el que el diagrama de barras representa el porcentaje de linfocitos T específicos para TB presentados como células triple positivas, doble positivas y positivas sencillas que secretan las citocinas iFN-y, IL-2 y TNF-a y el diagrama de sectores representa la proporción relativa de cada subpoblación de citocinas.
Descripción detallada
La presente invención se refiere a una vacuna que puede usarse para aumentar una respuesta inmunitaria a un antígeno en un sujeto utilizando IL-33 como adyuvante. Cuando se usa como adyuvante, la IL-33 aumenta de forma inesperada las respuestas inmunitarias de T colaborador 1 (Th1) y no de T colaborador 2 (Th2). Esto contrasta drásticamente con la función biológica de IL-33 en la activación de las respuestas inmunitarias innatas de y de Th2. En algunos casos, la IL-33 puede aumentar los niveles de las citocinas antivirales interferón-gamma (IFN-y) y factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a). La IL-33 también puede aumentar el nivel de la citocina IL-2. Por consiguiente, la IL-33 puede aumentar las subpoblaciones de linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+ polifuncionales para promover la respuesta inmunitaria celular.
La IL-33 puede inducir la expansión y diferenciación adicional de los linfocitos T efectores de memoria para promover la respuesta inmunitaria celular. Los linfocitos T reguladores CD122+CD8+ pueden reducir la efectividad de una vacuna y, por lo tanto, la supresión de estas células por IL-33 puede promover adicionalmente la respuesta inmunitaria celular inducida por la vacuna.
La IL-33 puede aumentar la respuesta inmunitaria celular a antígenos tales como antígenos víricos y bacterianos, por ejemplo, un antígeno del virus del papiloma humano (VPH), un antígeno del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), un antígeno de Mycobacterium tuberculosis y un antígeno del virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV). Como tal, la IL-33 puede promover una protección significativa contra dichos patógenos.
La vacuna de la presente invención puede prevenir el cáncer o la formación de tumores. La vacuna también puede causar regresión del cáncer o de tumores establecidos. La regresión puede ser una regresión del 90% o mayor. La regresión del cáncer puede ser completa. La vacuna puede además prevenir y causar la regresión de los cánceres asociados con virus, por ejemplo, cáncer asociado con el VPH. Por consiguiente, en el presente documento también se proporciona un método para el tratamiento del cáncer mediante la administración de la vacuna a un sujeto que lo necesite.
1. Definiciones
Salvo que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el significado que el comúnmente entendido por una persona normalmente versada en la materia. En caso de conflicto, prevalecerá el presente documento, incluyendo las definiciones. Se describen métodos y materiales preferidos a continuación, aunque pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o ensayo de la presente documento. Los materiales, métodos y ejemplos divulgados en el presente documento son solamente ilustrativos y no pretenden ser limitantes.
Los términos "comprende(n)", "incluye(n)" "que tiene", "tiene", "puede", "contiene(n)" y variantes de los mismos, como se usan en el presente documento, pretenden ser frases, términos o palabras transicionales abiertas que no anulan la posibilidad de actos o estructuras adicionales. Las formas del singular "un", "una" y "el" o "la" incluyen referencias al plural, a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. La presente divulgación también contempla otras realizaciones que "comprenden", "que consisten en" y "que consisten esencialmente en", las realizaciones o elementos presentados en el presente documento, ya se expongan explícitamente o no.
"Adyuvante", como se usa en el presente documento, significa cualquier molécula añadida a la vacuna descrita en el presente documento para potenciar la inmunogenicidad de los antígenos.
"Fragmento", como se usa en el presente documento, significa una secuencia de ácido nucleico o una porción de la misma, que codifica un polipéptido capaz de provocar una respuesta inmunitaria en un mamífero. Los fragmentos pueden ser fragmentos de ADN seleccionados entre al menos una de las diversas secuencias de nucleótidos que codifican fragmentos de proteínas que se exponen a continuación.
"Respuesta inmunitaria", como se usa en el presente documento, significa la activación del sistema inmunitario de un hospedador, por ejemplo, el de un mamífero, en respuesta a la introducción de antígeno. La respuesta inmunitaria puede ser en forma de una respuesta celular o humoral, o ambas.
Los "ácidos nucleicos", como se usa en el presente documento, pueden ser monocatenarios o bicatenarios o pueden contener porciones de secuencia tanto bicatenaria como monocatenaria. El ácido nucleico puede ser ADN, tanto genómico como ADNc, ARN o un híbrido, donde el ácido nucleico puede contener combinaciones de desoxirribo y ribonucleótidos y combinaciones de bases que incluyen uracilo, adenina, timina, citosina, guanina, inosina, xantina hipoxantina, isocitosina e isoguanina. Los ácidos nucleicos pueden obtenerse mediante métodos de síntesis clínica o mediante métodos recombinantes.
"Unido operativamente", como se usa en el presente documento, significa que la expresión de un gen se encuentra bajo el control de un promotor, con el que está espacialmente conectado. Un promotor puede posicionarse en 5' (cadena arriba) o en 3' (cadena abajo) de un gen bajo su control. La distancia entre el promotor y un gen puede ser aproximadamente la misma que la distancia entre dicho promotor y el gen que controla en el gen del que procede el promotor. Tal como se conoce en la técnica, puede acomodarse una variación en esta distancia sin pérdida de la función promotora.
Un "péptido", "proteína" o "polipéptido", como se usa en el presente documento, puede significar una secuencia de aminoácidos enlazada y puede ser natural, sintética o una modificación o combinación de natural y sintética.
"Promotor", como se usa en el presente documento, significa una molécula de origen natural o sintético que es capaz de conferir, activar o potenciar la expresión de un ácido nucleico en una célula. Un promotor puede comprender una o más secuencias reguladoras de la transcripción específicas para mejorar aún más la expresión y/o para alterar la expresión espacial y/o la expresión temporal del mismo. Un promotor también puede comprender elementos potenciadores o represores distales, que pueden encontrarse tan distantes como a varios miles de pares de bases desde el sitio de inicio de la transcripción. Un promotor puede proceder de fuentes que incluyen virus, bacterias, hongos, plantas, Insectos y animales. Un promotor puede regular la expresión de un componente génico de forma constitutiva o diferencial con respecto a la célula, el tejido u órgano en el que se produce la expresión o, con respecto a la etapa de desarrollo en la que se produce la expresión o en respuesta a estímulos externos como estrés fisiológico, patógenos, iones metálicos o agentes inductores. Los ejemplos representativos de promotores incluyen el promotor T7 de bacteriófago, el promotor T3 de bacteriófago, el promotor SP6, el operador-promotor lac, el promotor tac, el promotor tardío de SV40, el promotor temprano de SV40, el promotor de RSV-LTR, el promotor IE de CMV, el promotor temprano de SV40 o el promotor tardío de SV40 y el promotor IE de CMV.
"Tratamiento" o "tratar", como se usa en el presente documento, puede significar protección de un animal frente a una enfermedad previniendo, suprimiendo, reprimiendo o eliminando completamente la enfermedad. Prevenir la enfermedad implica administrar una vacuna de la presente invención a un animal antes de la aparición de la enfermedad. La supresión de la enfermedad implica administrar una vacuna de la presente invención a un animal después de la inducción de la enfermedad, pero antes de su aparición clínica. La represión de la enfermedad implica administrar una vacuna de la presente invención a un animal después de la aparición clínica de la enfermedad.
"Sujeto" tal como se usa en el presente documento puede significar un mamífero que quiere o necesita ser inmunizado con la vacuna descrita en el presente documento. El mamífero puede ser un ser humano, chimpancé, perro, gato, caballo, vaca, ratón o rata.
"Variante", como se usa en el presente documento con respecto a un ácido nucleico significa (i) una porción o fragmento de una secuencia de nucleótidos citada; (ii) el complemento de una secuencia de nucleótidos citada o una porción de la misma; (iii) un ácido nucleico que es sustancialmente idéntico a un ácido nucleico citado o su complemento; o (iv) un ácido nucleico que se hibrida en condiciones rigurosas al ácido nucleico citado, el complemento de la misma o una secuencia sustancialmente idéntica al mismo.
La variante puede definirse además como un péptido o polipéptido que difiere en la secuencia de aminoácidos por la inserción, supresión o sustitución conservativa de aminoácidos, pero que conserva al menos una actividad biológica. Los ejemplos representativos de "actividad biológica" incluyen la capacidad de unirse a un anticuerpo específico o de promover una respuesta inmunitaria. Variante también puede significar una proteína con una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a una proteína citada con una secuencia de aminoácidos que retiene al menos una actividad biológica. Se reconoce que una sustitución conservativa de un aminoácido, es decir, que reemplaza un aminoácido por un aminoácido diferente con propiedades similares (por ejemplo, hidrofilia, grado de distribución de regiones cargadas) normalmente implica un cambio menor. Estos cambios menores pueden identificarse, en parte, tomando en consideración el índice hidropático de los aminoácidos, como se entiende en la técnica. Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982). El índice hidropático de un aminoácido se basa en una consideración de su hidrofobia y carga. Se sabe en la técnica que pueden sustituirse aminoácidos con índices hidropáticos similares y aun así conservar la función de la proteína. En un aspecto, se sustituyen aminoácidos que tienen índices hidropáticos de ±2. También puede usarse la hidrofilia de los aminoácidos para revelar sustituciones que darán como resultado proteínas que retienen la función biológica. Una consideración de la hidrofilia de los aminoácidos en el contexto de un péptido permite el cálculo de la mayor hidrofilia promedio local de ese péptido, una medida útil que se ha informado que se correlaciona bien con la antigenicidad y la inmunogenicidad. La sustitución de aminoácidos con valores de hidrofilia similares puede dar como resultado péptidos que conservan la actividad biológica, por ejemplo inmunogenicidad, como se entiende en la técnica. Las sustituciones pueden realizarse con aminoácidos que tienen valores de hidrofilia dentro de ±2 entre sí. Tanto el índice de hidrofobia como el valor de hidrofilia de los aminoácidos están influenciados por la cadena lateral particular de ese aminoácido. De acuerdo con esa observación, se entiende que las sustituciones de aminoácidos que son compatibles con la función biológica dependen de la similitud relativa de los aminoácidos y en particular, las cadenas laterales de esos aminoácidos, como se revela por la hidrofobia, hidrofilia, carga, tamaño y otras propiedades.
Una variante puede ser una secuencia de ácido nucleico que es sustancialmente idéntica a lo largo de la longitud completa de la secuencia génica completa o un fragmento de la misma. La secuencia de ácido nucleico puede ser un 80 %, un 81 %, un 82 %, un 83 %, un 84 %, un 85 %, un 86 %, un 87 %, un 88 %, un 89 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % idéntica, a lo largo de la longitud completa de la secuencia génica o un fragmento de la misma. Una variante puede ser una secuencia de aminoácido que es sustancialmente idéntica a lo largo de la longitud completa de la secuencia de aminoácidos o un fragmento de la misma. La secuencia de aminoácidos puede ser un 80 %, un 81 %, un 82 %, un 83 %, un 84 %, un 85 %, un 86 %, un 87 %, un 88 %, un 89 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % idéntica, a lo largo de la longitud completa de la secuencia de aminoácidos o un fragmento de la misma.
"Vector", como se usa en el presente documento, significa una secuencia de ácido nucleico que contiene un origen de replicación. Un vector puede ser un vector vírico, bacteriófago, cromosoma bacteriano artificial o cromosoma artificial de levadura. Un vector puede ser un vector de ADN o ARN. Un vector puede ser un vector extracromosómico autorreplicante y preferentemente, es un plásmido de ADN.
Para la cita de los intervalos numéricos en el presente documento, se contempla explícitamente cada número intermedio con el mismo grado de precisión. Por ejemplo, para el intervalo de 6-9, se contemplan los números 7 y 8, además de 6 y 9 y para el intervalo 6,0-7,0, se contemplan explícitamente los números 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 y 7,0.
2. Vacuna
En el presente documento se proporciona una vacuna que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno y una secuencia de ácido nucleico que codifica un adyuvante, IL-33, en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica IL-33 comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: una secuencia de nucleótidos como se expone en la SEQ ID NO: 1 y una secuencia de nucleótidos como se expone en la SEQ ID NO: 3. La vacuna puede aumentar la presentación de antígenos y la respuesta inmunitaria general al antígeno en un sujeto. La combinación de antígeno y adyuvante induce el sistema inmunitario de manera más eficiente que una vacuna que comprende solo el antígeno. Esta respuesta inmunitaria más eficiente proporciona mayor eficacia en el tratamiento y/o prevención de cualquier enfermedad, patógeno o virus, incluyendo el cáncer, como se describe con más detalle a continuación.
La vacuna de la presente invención puede tener características necesarias de vacunas eficaces, tales como ser seguras, de tal forma que la vacuna en sí no provoca enfermedad o muerte; se protectoras contra la enfermedad como resultado de la exposición a patógenos vivos, tales como virus o bacterias; inducir anticuerpos neutralizantes para prevenir la infección de células; inducir respuesta protectora de linfocitos T contra patógenos intracelulares; y proporcionar facilidad de administración, pocos efectos secundarios, estabilidad biológica y bajo coste por dosis. La vacuna puede lograr algunas o todas estas características combinando el antígeno con el adyuvante como se explica más adelante.
La vacuna puede modificar adicionalmente la presentación de epítopos en el antígeno para inducir una mayor respuesta inmunitaria contra el antígeno que una vacuna que solo comprende el antígeno. Además, la vacuna puede inducir una respuesta inmunitaria cuando se administra a tejidos diferentes, tales como el músculo o la piel.
a. Adyuvante
La vacuna comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un adyuvante. El adyuvante puede ser una secuencia de ácido nucleico, una secuencia de aminoácidos o una combinación de los mismos. La secuencia de ácido nucleico puede ser ADN, ARN, ADNc, una variante del mismo, un fragmento del mismo o una combinación de los mismos. La secuencia de ácido nucleico también puede incluir secuencias adicionales que codifican secuencias enlazadoras o marcadoras que se unen al adyuvante mediante un enlace peptídico. La secuencia de aminoácidos puede ser una proteína, un péptido, una variante del mismo, un fragmento del mismo o una combinación de los mismos.
(1) IL-33
El adyuvante es interleucina-33 (IL-33) o fragmentos de la misma. La IL-33 es un miembro de la familia de citocinas de interleucina-1 (IL-1), que están implicadas en respuestas inmunitarias e inflamatorias tempranas después de la lesión o infección tisular. Los miembros de la familia de IL-1 también coordinan respuestas inmunitarias adaptativas posteriores, a saber, respuestas inmunitarias de T colaborador 2 (Th2). Se ha relacionado la desregulación de esta familia con muchas enfermedades, por ejemplo, asma, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, periodontitis y septicemia. En particular, los niveles de IL-33 se encuentran elevados en las enfermedades inflamatorias, asma y artritis reumatoide e IL-33 promueve la patogénesis de enfermedades relacionadas con Th2, tales como asma, dermatitis atópica y anafilaxia. Por el contrario, la IL-33 tiene efectos protectores en enfermedades cardiovasculares, tales como ateroesclerosis, obesidad, diabetes de tipo 2 y remodelación cardíaca y contribuye a la defensa del hospedador frente a infecciones parasitarias y bacterianas.
La IL-33 de longitud completa se expresa de forma constitutiva en el núcleo de las células endoteliales y epiteliales, donde se asocia con la heterocromatina y la cromatina mitótica. El extremo amino de la IL-33 de longitud completa incluye un dominio o motivo de unión a cromatina (CBD) y una señal de localización nuclear (NLS). En particular, el CDB es un motivo de hélice-giro-hélice similar a homeodominio, que actúa como un represor transcripcional.
La IL-33 de longitud completa, sin embargo, también se libera en el espacio extracelular después de una lesión tisular o de una infección a modo de alarma. La IL-33 extracelular se une al receptor de superficie celular ST2 para activar a las células del sistema inmunitario innato, por ejemplo, mastocitos y eosinófilos, para señalar peligro (es decir, lesión o infección) e inducir una respuesta inflamatoria. Los mediadores proinflamatorios inducidos incluyen factor de necrosis tumoral (TNF), IL-1p e interferón-gamma (IFN-y). La IL-33 también induce a células inmunitarias innatas descubiertas más recientemente, a saber, células linfoides innatas de tipo 2 (ILC2). Las ILC2 son células no B no T y producen citocinas de tipo Th2, por ejemplo, interleucina-4, -5 y -13 (IL-4, IL-5 e IL-13, respectivamente ).
Adicionalmente, la IL-33 extracelular se escinde mediante proteasas, uniéndose los fragmentos resultantes a ST2 y amplificando la señal de "peligro" inicial. ST2 también se expresa en muchos otros tipos de células (aunque en su mayoría hematopoyéticas), por ejemplo, diferentes subconjuntos de linfocitos T CD4+, basófilos, monocitos, macrófagos, linfocitos citolíticos naturales, linfocitos T citolíticos naturales invariantes y neutrófilos activados, permitiendo así que la IL-33 induzca la producción de varias citocinas y quimiocinas y la activación, la diferenciación, la polarización o la quimiotaxis celular. ST2 es un marcador selectivo para células de tipo Th2 y existe como una forma unida a la membrana y una forma soluble. La forma de ST2 unida a la membrana, cuando está unida a IL-33, desencadena las vías del factor nuclear (NF)-kB y de la proteína cinasa activada por mitógeno (por ejemplo, p38, JNK, ERK1 y ERK2) para iniciar la señalización celular. ST2 soluble también se une a IL-33, pero es una molécula señuelo, inhibiendo de este modo a la IL-33.
Además, la IL-33 puede existir en una forma madura o truncada que carece de CDB y NLS. La IL-33 madura puede actuar como una citocina proinflamatoria para modular las respuestas inmunitarias.
La IL-33 puede aumentar o aumentar la respuesta inmunitaria al antígeno en el sujeto. El antígeno se analiza con más detalle a continuación. En algunos casos, la IL-33 puede aumentar la respuesta inmunitaria contra el antígeno de aproximadamente un 75 % a aproximadamente un 200 %. Como alternativa, la IL-33 puede aumentar la respuesta inmunitaria contra el antígeno de aproximadamente un 90 % a aproximadamente un 130 %. En otras realizaciones alternativas más, la IL-33 puede aumentar la respuesta inmunitaria al antígeno en aproximadamente un 60%, un 65 %, un 70 %, un 75 %, un 80 %, un 81 %, un 82 %, un 83 %, un 84 %, un 85 %, un 86 %, un 87 %, un 88 %, un 89 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 %, un 100 %, un 101 %, un 102 %, un 103 %, un 104 %, un 105 %, un 106 %, un 107 %, un 108 %, un 109 %, un 110 %, un 111 %, un 112 %, un 113 %, un 114 %, un 115 %, un 116 %, un 117 %, un 118 %, un 119 %, un 120 %, un 121 %, un 122 %, un 123 %, un 124 %, un 125 %, un 126 %, un 127 %, un 128 %, un 129 % o un 130 %.
En otras realizaciones, la IL-33 puede aumentar o reforzar la respuesta inmunitaria contra el antígeno en al menos aproximadamente 1,5 veces, al menos aproximadamente 2,0 veces, al menos aproximadamente 2,5 veces, al menos aproximadamente 3,0 veces, al menos aproximadamente 3,5 veces, al menos aproximadamente 4,0 veces, al menos aproximadamente 4,5 veces, al menos aproximadamente 5,0 veces, al menos aproximadamente 5,5 veces, al menos aproximadamente 6,0 veces, al menos aproximadamente 6,5 veces, al menos aproximadamente 7,0 veces, al menos aproximadamente 7,5 veces, al menos aproximadamente 8,0 veces, al menos aproximadamente 8,5 veces, al menos aproximadamente 9,0 veces, al menos aproximadamente 9,5 veces o al menos aproximadamente 10,0 veces.
Cuando la IL-33 aumenta o refuerza la respuesta inmunitaria al antígeno en el sujeto, no se aumentan los niveles de interleucina-4 (IL-4) (secreción) y de inmunoglobulina E (IgE) en el sujeto. Inesperadamente, la IL-33 como adyuvante no aumenta ni estimula la respuesta inmunitaria de Th2 al antígeno en el sujeto. La IL-33 como adyuvante, en cambio, puede aumentar o reforzar la respuesta inmunitaria Th1 o celular al antígeno en el sujeto.
La respuesta inmunitaria Th1 implica la activación de las respuestas de linfocitos T. Estas respuestas de linfocitos T pueden incluir respuestas de linfocitos T CD4+ y CD8+ y la secreción de interferón gamma, factor de necrosis tumoral alfa y/o interleucina (IL-2). El interferón gamma y el factor de necrosis tumoral alfa tienen propiedades antivíricas, inmunorreguladoras y antitumorales y pueden alterar la transcripción en múltiples genes para producir una variedad de respuestas fisiológicas y celulares. Algunos efectos del interferón gamma incluyen promover la actividad de los linfocitos citolíticos naturales (células NK), haciendo que las células normales aumenten la expresión de moléculas del MHC de clase I, aumentando la presentación de antígenos y la actividad de los lisosomas en macrófagos, induciendo la sintasa de óxido nítrico (iNOS) y promoviendo la diferenciación Th1 en la inmunidad celular con respecto a linfocitos T CD8+ citotóxicos, a la vez que suprime la diferenciación de Th2 en inmunidad humoral (anticuerpo).
Los linfocitos T CD8+ citotóxicos (linfocitos T citotóxicos (CTL)) son un subgrupo de linfocitos T que inducen la muerte de células infectadas con virus y otros patógenos. Tras la activación, los c Tl se someten a expansión clonal para producir células efectoras que son específicas de antígeno. Los CTL efectores liberan mediante un proceso de exocitosis dirigida (es decir, desgranulación) moléculas que eliminan células infectadas o diana, por ejemplo, perforina, granulisina y granzima. Cuando dejan de ser necesarios, muchos CTL efectores mueren, pero algunas células efectoras se conservan como células de memoria, de tal forma que cuando se encuentra nuevamente el antígeno, las células de memoria se diferencian en células efectoras para armar una respuesta inmunitaria más rápidamente.
Cuando la IL-33 aumenta o refuerza la respuesta inmunitaria de Th1 o celular, aumentan los niveles de interferón gamma (IFN-y) (secreción). En algunos casos, la IL-33 puede aumentar la respuesta inmunitaria de Th1 o celular frente al antígeno en de aproximadamente 1,5 veces a aproximadamente 10,0 veces, de aproximadamente 1,5 veces a aproximadamente 8,0 veces, de aproximadamente 1,5 veces a aproximadamente 6,0 veces, de aproximadamente 1,5 veces a aproximadamente 4,0 veces, de aproximadamente 2,0 veces a aproximadamente 10,0 veces, de aproximadamente 2,0 veces a aproximadamente 8,0 veces, de aproximadamente 2,0 veces a aproximadamente 6,0 veces, de aproximadamente 2,0 veces a aproximadamente 4,0 veces, de aproximadamente 2,5 veces a aproximadamente 4,0 veces, de aproximadamente 4,0 veces a aproximadamente 10,0 veces, de aproximadamente 6.0 veces a aproximadamente 10,0 veces o de aproximadamente 8,0 veces a aproximadamente 10,0 veces. La IL-33 también aumenta la respuesta inmunitaria de Th1 o celular contra el antígeno en al menos aproximadamente 2,5 veces, al menos aproximadamente 2,6 veces, al menos aproximadamente 2,7 veces, al menos aproximadamente 2,8 veces, al menos aproximadamente 2,9 veces, al menos aproximadamente 3,0 veces, al menos aproximadamente 3,1 veces, al menos aproximadamente 3,2 veces, al menos aproximadamente 3,3 veces, al menos aproximadamente 3,4 veces, al menos aproximadamente 3,5 veces, al menos aproximadamente 3,6 veces, al menos aproximadamente 3,7 veces, al menos aproximadamente 3,8 veces, al menos aproximadamente 3,9 veces, al menos aproximadamente 4,0 veces, al menos aproximadamente 4,1 veces, al menos aproximadamente 4,2 veces, al menos aproximadamente 4,3 veces, al menos aproximadamente 4,4 veces, al menos aproximadamente 4,5 veces, al menos aproximadamente 4,6 veces, al menos aproximadamente 4,7 veces, al menos aproximadamente 4,8 veces, al menos aproximadamente 4,9 veces, al menos aproximadamente 5,0 veces, al menos aproximadamente 6,0 veces, al menos aproximadamente 7,0 veces, al menos aproximadamente 8,0 veces, al menos aproximadamente 9,0 veces o al menos aproximadamente 10.0 veces. La IL-33 puede aumentar además la respuesta inmunitaria de Th1 o celular en aproximadamente 3,5 veces o 4,0 veces.
El aumento o la respuesta inmunitaria potenciada al antígeno también puede incluir un aumento de la respuesta de linfocitos T CD4+. El aumento de la respuesta de linfocitos T CD4+ puede incluir aumentar en el sujeto la población o la frecuencia de linfocitos T CD4+ que secretan IFN-y, factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), IL-2 o tanto IFN-y como TNF-a o alguna combinación de IFN-y, TNF-a e IL-2 (por ejemplo, células triple positivas que expresan IFN-y, TNF-a e IL-2). Por consiguiente, el aumento de la respuesta de linfocitos T CD4+ puede incluir el aumento de subpoblaciones de linfocitos T CD4+ polifuncionales.
El aumento o la respuesta inmunitaria potenciada al antígeno puede incluir además un aumento de la respuesta de linfocitos T CD8+. El aumento de la respuesta de linfocitos T CD8+ puede incluir aumentar en el sujeto la población o la frecuencia de linfocitos T CD8+ que secretan IFN-y, TNF-a, IL-2 o tanto IFN-y como TNF-a o alguna combinación de IFN-y, TNF-a e IL-2 (por ejemplo, células triple positivas que expresan IFN-y, TNF-a e IL-2). Por consiguiente, el aumento de la respuesta de linfocitos T CD8+ puede incluir el aumento de subpoblaciones de linfocitos T CD8+ polifuncionales.
El aumento de la respuesta de linfocitos T CD8+ también puede incluir un aumento de la respuesta de linfocitos T CD8+ citotóxicos (CTL). El aumento de la respuesta CTL puede incluir aumentar en el sujeto la población o la frecuencia de linfocitos T CD8+ que sufren desgranulación. El aumento de la respuesta de CTL puede incluir además el aumento en el sujeto de la población o frecuencia de linfocitos T CD8+ que expresan CD107a. El aumento de la respuesta de CTL puede incluir además el aumento en el sujeto de la población o frecuencia de linfocitos T CD8+ que coexpresan CD107a, IFN-y y TNF-a.
La respuesta inmunitaria aumentada o reforzada al antígeno puede incluir además la expansión y diferenciación de linfocitos T CD8+ en el sujeto. Dicha expansión puede producirse en la periferia. Adicionalmente, se aumenta el recuerdo de los linfocitos T CD8+ establecidos en el sujeto. Como tal, la IL-33 puede aumentar la respuesta inmunitaria celular al expandir las poblaciones de linfocitos T CD8+ tanto efectores como efectores de memoria que son específicos para el antígeno. Las poblaciones expandidas de linfocitos T CD8+ efectores y efectores de memoria pueden tener una frecuencia aumentada de células que expresan KLRG1.
La respuesta inmunitaria aumentada o reforzada al antígeno puede incluir además la supresión de linfocitos T CD122+CD8+ reguladores, por ejemplo, previniendo la expansión de estas células. Los linfocitos T CD122+CD8+ reguladores pueden suprimir la respuesta inmunitaria inducida por una vacuna y por lo tanto, la eficacia de una vacuna. Al suprimir a los linfocitos T CD122+CD8+ reguladores, la IL-33 aumenta la respuesta inmunitaria al antígeno y por lo tanto, la eficacia (es decir, la protección) proporcionada por la vacuna.
Un 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %,
96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de tasa de supervivencia contra una enfermedad asociada con el antígeno.
(a) ProIL-33
La IL-33 puede ser una proIL-33. ProIL-33 es IL-33 de longitud completa o no escindida. Por consiguiente, la proIL-33 incluye tanto el dominio o motivo de unión a cromatina (CBD) como una señal de localización nuclear (NLS). La proIL-33 puede localizarse tanto en el núcleo como en el citoplasma. En particular, la proIL-33 puede localizarse sustancialmente en el núcleo.
Como se ha descrito anteriormente para IL-33, la proIL-33 no aumenta los niveles de IgE cuando se aumenta la respuesta inmunitaria. La proIL-33, a diferencia de mtrIL-33 que se describe más adelante, puede aumentar en el sujeto los niveles de inmunoglobulina G (IgG) específica para el antígeno. La proIL-33 puede aumentar los niveles de
IgG específica para el antígeno de aproximadamente 1,5 veces a aproximadamente 10,0 veces, de aproximadamente
2,0 veces a aproximadamente 6,0 veces o de aproximadamente 2,0 veces a aproximadamente 4,0 veces. La proIL-33 también puede aumentar los niveles de IgG específica para el antígeno en al menos aproximadamente 1,5 veces, al menos aproximadamente 2,0 veces, al menos aproximadamente 2,5 veces, al menos aproximadamente 3,0 veces, al menos aproximadamente 3,5 veces, al menos aproximadamente 4,0 veces, al menos aproximadamente 4,5 veces, al menos aproximadamente 5,0 veces, al menos aproximadamente 5,5 veces, al menos aproximadamente 6,0 veces, al menos aproximadamente 6,5 veces, al menos aproximadamente 7,0 veces, al menos aproximadamente 7,5 veces, al menos aproximadamente 8,0 veces, al menos aproximadamente 8,5 veces, al menos aproximadamente 9,0 veces, al menos aproximadamente 9,5 veces o al menos aproximadamente 10,0 veces.
Un ácido nucleico que codifica proIL-33 puede proceder de cualquier número de organismos, por ejemplo, ratón (Mus musculus) y ser humano (Homo sapiens). El ácido nucleico que codifica proIL-33 puede optimizarse con respecto al uso de codones y a los transcritos de ARN correspondientes. El ácido nucleico que codifica proIL-33 puede optimizarse a nivel de codones y de ARN para la expresión. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica proIL-33 puede incluir una secuencia Kozak (por ejemplo, GCC ACC) para aumentar la eficiencia de la traducción. El ácido nucleico que codifica proIL-33 puede incluir múltiples codones de parada (por ejemplo, TGA TGA) para aumentar la eficiencia de la terminación de la traducción. El ácido nucleico que codifica proIL-33 también puede incluir una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia líder de inmunoglobulina E (IgE). La secuencia líder de IgE se puede ubicar en 5' respecto de proIL-33 en el ácido nucleico. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica proIL-33 está libre o no contiene una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia líder de IgE.
En el presente documento se describe la secuencia de ácido nucleico de proIL-33 de ratón, SEQ ID NO: 5, que codifica la SEQ ID NO: 6. En el presente documento se divulgan secuencias de ácido nucleico de proIL-33 de ratón que tienen al menos aproximadamente un 80 %, un 81 %, un 82 %, un 83 %, un 84 %, un 85 %, un 86 %, un 87 %, un 88 %, un
89 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % de identidad a lo largo de una longitud completa de la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO: 5. En el presente documento se divulgan secuencias de ácido nucleico de proIL-33 de ratón que codifican secuencias de aminoácidos que tienen al menos aproximadamente un 80 %, un 81 %, un 82 %, un 83 %, un 84 %, un 85 %, un 86 %, un 87 %, un 88 %, un 89 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un
99 % o un 100 % de identidad a lo largo de una longitud completa de la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO: 6. La proIL-33 de ratón puede ser la secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un
80 %, un 81 %, un 82 %, un 83 %, un 84 %, un 85 %, un 86 %, un 87 %, un 88 %, un 89 %, un 90 %, un 91 %, un
92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % de identidad de secuencia a lo largo de la longitud completa de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 6.
La proIL-33 humana puede ser la secuencia de ácido nucleico optimizada de SEQ ID NO: 3, que codifica la SEQ ID NO: 4. También se divulgan secuencias de ácido nucleico de proIL-33 humanas que tienen al menos aproximadamente un 80 %, un 81 %, un 82 %, un 83 %, un 84 %, un 85 %, un 86 %, un 87 %, un 88 %, un 89 %, un 90 %, un 91 %, un
92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad a lo largo de una longitud completa de la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO: 3. También se divulgan secuencias de ácido nucleico de proIL-33 humanas que codifican secuencias de aminoácidos que tienen al menos aproximadamente un
80 %, un 81 %, un 82 %, un 83 %, un 84 %, un 85 %, un 86 %, un 87 %, un 88 %, un 89 %, un 90 %, un 91 %, un
92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %o un 99 % de identidad a lo largo de una longitud completa de la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO: 4. La proIL-33 humana puede ser la secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 80 %, un 81 %, un 82 %, un 83 %, un 86 %, un 87 %, un 88 %, un 89 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un
98 % o un 99 % de identidad de secuencia a lo largo de la longitud completa de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4.
En el presente documento se describen fragmentos de SEQ ID NO: 3 y/o SEQ ID NO: 5. Los fragmentos pueden comprender al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos
99 % de la SEQ ID NO: 3 y/o la SEQ ID NO: 5. Los fragmentos pueden incluir secuencias que codifican una secuencia líder, por ejemplo, una secuencia líder de inmunoglobulina, tal como la secuencia líder de IgE. En algunas realizaciones, los fragmentos están libres de secuencias codificantes que codifican una secuencia líder.
En el presente documento se divulgan fragmentos de ácido nucleico con secuencias de nucleótidos que tienen identidad respecto de los fragmentos de SEQ ID NO: 3 y/o SEQ ID NO: 5. Dichos fragmentos pueden comprender al menos un 60%, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de ácidos nucleicos que tienen un 95 % o más de identidad respecto de la SEQ ID NO: 3 y/o la SEQ ID NO: 5. En el presente documento se divulgan fragmentos que tienen un 96 % o más de identidad respecto de fragmentos de secuencias de ácido nucleico de proIL-33. En el presente documento se divulgan fragmentos que tienen un 97 % o más de identidad respecto de fragmentos de secuencias de ácido nucleico de proIL-33. En el presente documento se divulgan fragmentos que tienen un 98 % o más de identidad respecto de fragmentos de secuencias de ácido nucleico de proIL-33. En el presente documento se divulgan fragmentos que tienen un 99 % o más de identidad respecto de fragmentos de secuencias de ácido nucleico de proIL-33. Los fragmentos pueden incluir secuencias que codifican una secuencia líder, por ejemplo, una secuencia líder de inmunoglobulina, tal como la secuencia líder de IgE. Los fragmentos pueden estar libres de secuencias codificantes que codifican una secuencia líder.
En el presente documento se describen fragmentos de SEQ ID NO: 4 y/o SEQ ID NO: 6. Los fragmentos pueden comprender al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos 99 % de la SEQ ID NO: 4 y/o la SEQ ID NO: 6. Los fragmentos pueden incluir una secuencia líder, por ejemplo, una secuencia líder de inmunoglobulina, tal como la secuencia líder de IgE. Los fragmentos pueden estar libres de una secuencia líder.
En el presente documento se divulgan fragmentos de proteínas con secuencias de aminoácidos que tienen identidad respecto de los fragmentos de SEQ ID NO: 4 y/o SEQ ID NO: 6. Dichos fragmentos pueden comprender al menos un 60%, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de proteínas que tienen un 95 % o más de identidad respecto de la SEQ ID NO: 4 y/o la SEQ ID NO: 6. En el presente documento se divulgan fragmentos que tienen un 96 % o más de identidad respecto de fragmentos de secuencias de proteínas de proIL-33. En el presente documento se divulgan fragmentos que tienen un 97 % o más de identidad respecto de fragmentos de secuencias de proteínas de proIL-33. En el presente documento se divulgan fragmentos que tienen un 98 % o más de identidad respecto de fragmentos de secuencias de proteínas de proIL-33. En el presente documento se divulgan fragmentos que tienen un 99 % o más de identidad respecto de fragmentos de secuencias de proteínas de proIL-33. Los fragmentos pueden incluir una secuencia líder, por ejemplo, una secuencia líder de inmunoglobulina, tal como la secuencia líder de IgE. Los fragmentos pueden estar libres de una secuencia líder.
(b) MtrIL-33
IL-33 puede ser mtrIL-33. MtrIL-33 es IL-33 madura o truncada y carece de CBD y NLS. MtrIL-33 se localiza en el citosol.
MtrIL-33 puede aumentar o reforzar la respuesta inmunitaria como se describe anteriormente para IL-33. MtrIL-33 también puede aumentar o reforzar la respuesta inmunitaria celular contra el antígeno en el sujeto, como se ha descrito anteriormente para IL-33.
Un ácido nucleico que codifica mtrIL-33 puede ser de cualquier número de organismos, por ejemplo, ratón (Mus musculus) y ser humano (Homo sapiens). El ácido nucleico que codifica mtrIL-33 puede optimizarse con respecto al uso de codones y a los transcritos de ARN correspondientes. El ácido nucleico que codifica mtrIL-33 también puede optimizarse a nivel de codones y de ARN para la expresión. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica mtrIL-33 puede incluir una secuencia Kozak (por ejemplo, GCC ACC) para aumentar la eficiencia de la traducción. El ácido nucleico que codifica mtrIL-33 puede incluir múltiples codones de parada (por ejemplo, TGA TGA) para aumentar la eficiencia de la terminación de la traducción. El ácido nucleico que codifica mtrIL-33 también puede incluir una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia líder de IgE. La secuencia líder de IgE se puede ubicar en 5' respecto de mtrIL-33 en el ácido nucleico. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica mtrIL-33 está libre o no contiene una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia líder de IgE.
En el presente documento se divulga la secuencia de ácido nucleico de mtrIL-33 de ratón de SEQ ID NO: 7, que codifica la SEQ ID NO: 8. La mtrIL-33 de ratón puede ser la secuencia de ácido nucleico que tiene al menos aproximadamente un 80 %, un 81 %, un 82 %, un 83 %, un 84 %, un 85 %, un 86 %, un 87 %, un 88 %, un 89 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % de identidad de secuencia a lo largo de la longitud completa de la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO: 7. La mtrIL-33 de ratón puede ser la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 %, un 81 %, un 82 %, un 83 %, un 84 %, un 85 %, un 86 %, un 87 %, un 88 %, un 89 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % a lo largo de la longitud completa de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 8. La mtrIL-33 de ratón puede ser la secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 80 %, un 81 %, un 82 %, un 83 %, un 84 %, un 85 %, un 86 %, un 87 %, un 88 %, un 89 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % a lo largo de la longitud completa de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 8.
La mtrIL-33 humana puede ser la secuencia de ácido nucleico optimizada de SEQ ID NO: 1, que codifica la SEQ ID NO: 2. En el presente documento se divulgan secuencias de ácido nucleico de mtrIL-33 humanas que tienen al menos aproximadamente un 80 %, un 81 %, un 82 %, un 83 %, un 84 %, un 85 %, un 86 %, un 87 %, un 88 %, un 89 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad a lo largo de una longitud completa de la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO: 1. En el presente documento se divulgan secuencias de ácido nucleico de mtrIL-33 humanas que codifican secuencias de aminoácidos que tienen al menos aproximadamente un 80 %, un 81 %, un 82 %, un 83 %, un 84 %, un 85 %, un 86 %, un 87 %, un 88 %, un 89 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %o un 99 % de identidad a lo largo de una longitud completa de la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO: 2. En el presente documento se divulgan secuencias de aminoácidos de mtrIL-33 humanas que tienen al menos aproximadamente un 80 %, un 81 %, un 82 %, un 83 %, un 84 %, un 85 %, un 86 %, un 87 %, un 88 %, un 89 %, un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de identidad a lo largo de una longitud completa de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2.
En el presente documento se describen fragmentos de SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 7. Los fragmentos pueden comprender al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos 99 % de la SEQ ID NO: 1 y/o la SEQ ID NO: 7. Los fragmentos pueden incluir secuencias que codifican una secuencia líder, por ejemplo, una secuencia líder de inmunoglobulina, tal como la secuencia líder de IgE. Los fragmentos pueden estar libres de secuencias codificantes que codifican una secuencia líder.
En el presente documento se divulgan fragmentos de ácido nucleico con secuencias de nucleótidos que tienen identidad respecto de fragmentos de SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 7. Dichos fragmentos pueden comprender al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de ácidos nucleicos que tienen un 95 % o más de identidad respecto de la SEQ ID NO: 1 y/o la SEQ ID NO: 7. En el presente documento se divulgan fragmentos que tienen un 96 % o más de identidad respecto de fragmentos de secuencias de ácido nucleico de mtrIL-33. En el presente documento se divulgan fragmentos que tienen un 97 % o más de identidad respecto de fragmentos de secuencias de ácido nucleico de mtrIL-33. En el presente documento se divulgan fragmentos que tienen un 98 % o más de identidad respecto de fragmentos de secuencias de ácido nucleico de mtrIL-33. En el presente documento se divulgan fragmentos que tienen un 99 % o más de identidad respecto de fragmentos de secuencias de ácido nucleico de mtrIL-33. Los fragmentos pueden incluir secuencias que codifican una secuencia líder, por ejemplo, una secuencia líder de inmunoglobulina, tal como la secuencia líder de IgE. Los fragmentos pueden estar libres de secuencias codificantes que codifican una secuencia líder.
En el presente documento se describen fragmentos de SEQ ID NO: 2 y/o SEQ ID NO: 8. Los fragmentos pueden comprender al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos 99 % de la SEQ ID NO: 2 y/o la SEQ ID NO: 8. Los fragmentos pueden incluir una secuencia líder, por ejemplo, una secuencia líder de inmunoglobulina, tal como la secuencia líder de IgE. Los fragmentos pueden estar libres de una secuencia líder.
En el presente documento se divulgan fragmentos de proteínas con secuencias de aminoácidos que tienen identidad respecto de los fragmentos de SEQ ID NO: 2 y/o SEQ ID NO: 8. Dichos fragmentos pueden comprender al menos un 60%, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de proteínas que tienen una identidad del 95 % o mayor respecto de la SEQ ID NO: 2 y/o la SEQ ID NO: 8. En el presente documento se divulgan fragmentos que tienen un 96 % o más de identidad respecto de fragmentos de secuencias de proteína de mtrIL-33. En el presente documento se divulgan fragmentos que tienen un 97 % o más de identidad respecto de fragmentos de secuencias de proteínas de mtrIL-33. En el presente documento se divulgan fragmentos que tienen un 98 % o más de identidad respecto de fragmentos de secuencias de proteínas de mtrIL-33. En el presente documento se divulgan fragmentos que tienen un 99 % o más de identidad respecto de fragmentos de secuencias de proteínas de mtrIL-33. Los fragmentos pueden incluir una secuencia líder, por ejemplo, una secuencia líder de inmunoglobulina, tal como la secuencia líder de IgE. Los fragmentos pueden estar libres de una secuencia líder.
b. Antígeno
La vacuna también puede comprender un antígeno o fragmento o variante del mismo y el adyuvante como se analizó anteriormente. El antígeno puede ser cualquier cosa que induzca una respuesta inmunitaria en un sujeto. Los antígenos purificados normalmente no son fuertemente inmunogénicos por sí mismos y por lo tanto, se combinan con el adyuvante como se ha descrito anteriormente. La respuesta inmunitaria inducida por el antígeno puede aumentarse o reforzarse cuando se combina con el adyuvante. Dicha respuesta inmunitaria puede ser una respuesta inmunitaria humoral y/o una respuesta inmunitaria celular. En algunas realizaciones, la combinación del adyuvante y el antígeno puede reforzar o aumentar una respuesta inmunitaria celular en el sujeto.
El antígeno puede ser una secuencia de ácido nucleico, una secuencia de aminoácidos o una combinación de los mismos. La secuencia de ácido nucleico puede ser ADN, ARN, ADNc, una variante del mismo, un fragmento del mismo o una combinación de los mismos. La secuencia de ácido nucleico también puede incluir secuencias adicionales que codifican secuencias enlazadoras o marcadoras que se unen al antígeno mediante un enlace peptídico. La secuencia de aminoácidos puede ser una proteína, un péptido, una variante del mismo, un fragmento del mismo o una combinación de los mismos.
El antígeno puede estar contenido en una proteína, un ácido nucleico o un fragmento del mismo o una variante del mismo o una combinación de los mismos de cualquier número de organismos, por ejemplo, un virus, un parásito, una bacteria, un hongo o un mamífero. El antígeno puede estar asociado con una enfermedad autoinmunitaria, alergia o asma. En otras realizaciones, el antígeno puede estar asociado con el cáncer, herpes, gripe, hepatitis B, hepatitis C, virus del papiloma humano (VPH) o virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Preferentemente, el antígeno puede asociarse con la gripe o el VIH.
Algunos antígenos pueden inducir una fuerte respuesta inmunitaria. Otros antígenos pueden inducir una débil respuesta inmunitaria. El antígeno puede provocar una mayor respuesta inmunitaria cuando se combina con el adyuvante como se ha descrito anteriormente.
(1) Antígenos virales
El antígeno puede ser un antígeno viral o un fragmento del mismo o una variante del mismo. El antígeno viral puede ser de un virus de una de las siguientes familias: Adenoviridae, Arenaviridae, Bunyaviridae, Caliciviridae, Coronaviridae, Filoviridae, Hepadnaviridae, Herpesviridae, Orthomyxoviridae, Papovaviridae, Paramyxoviridae, Parvoviridae, Picornaviridae, Poxviridae, Reoviridae, Retroviridae, Rhabdoviridae o Togaviridae. El antígeno viral puede ser de virus del papiloma, por ejemplo, virus del papiloma humano (VPH), virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la polio, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, virus de la viruela (Variola mayor y menor), virus vaccinia, virus de la gripe, rinovirus, virus de la fiebre del dengue, virus de la encefalitis equina, virus de la rubeola, virus de la fiebre amarilla, virus de Norwalk, virus de la hepatitis A, virus de la leucemia de linfocitos T humana (HTLVI), virus de la tricoleucemia (HTLV-II), virus de la encefalitis de California, hantavirus (fiebre hemorrágica), virus de la rabia, virus de la fiebre del Ébola, virus de Marburgo, virus del sarampión, virus de las paperas, virus sincitial respiratorio (VSR), herpes simple 1 (herpes oral), herpes simple 2 (herpes genital), herpes zoster (varicela-zoster, también conocido como varicela), citomegalovirus (CMV), por ejemplo, CMV humano, virus de Epstein Barr (EBV), flavivirus, virus de la fiebre aftosa, virus Chikunguña, virus de Lassa, arenavirus, virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV) o virus causante de cáncer.
(a) Antígeno de la hepatitis
La IL-33 puede asociarse o combinarse con un antígeno del virus de la hepatitis (es decir, antígeno de la hepatitis) o un fragmento del mismo o una variante del mismo. El antígeno de la hepatitis puede ser un antígeno o inmunógeno del virus de la hepatitis A (VHA), virus de la hepatitis B (VHB), virus de la hepatitis C (VHC), virus de la hepatitis D (VHD) y/o virus de la hepatitis E (VHE). En algunas realizaciones, el antígeno heterólogo puede ser moléculas de ácido nucleico heterólogas, tales como plásmidos, que codifican uno o más de los antígenos de VHA, VHB, VHC, VHD y VHE. El antígeno de la hepatitis puede ser de longitud completa o fragmentos inmunogénicos de proteínas de longitud completa.
El antígeno de la hepatitis puede comprender secuencias consenso y/o una o más modificaciones para una expresión mejorada. Pueden incluirse en las secuencias consenso modificadas modificaciones genéticas, incluyendo optimización de codones, optimización de ARN y la adición de una secuencia líder de inmunoglobulina altamente eficaz para aumentar la inmunogenicidad de las construcciones. El antígeno consenso de la hepatitis puede comprender un péptido de señal, tal como un péptido de señal de inmunoglobulina, tal como un péptido de señal de IgE o IgE y en algunas realizaciones, puede comprender un marcador de HA. Los inmunógenos pueden diseñarse para generar respuestas inmunitarias celulares más fuertes y amplias que los inmunógenos correspondientes con codones optimizados.
El antígeno de la hepatitis puede ser un antígeno de VHA. El antígeno de la hepatitis puede ser una proteína de la cápside del VHA, una proteína no estructural del VHA, un fragmento del mismo, una variante del mismo o una combinación de los mismos.
El antígeno de la hepatitis puede ser un antígeno del VHC. El antígeno de la hepatitis puede ser una proteína de la nucleocápside del VHC (es decir, proteína core), una proteína de la envuelta del VHC (por ejemplo, E1 y E2), una proteína no estructural del VHC (por ejemplo, NS1, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a y NS5b), un fragmento de la misma, una variante de la misma o una combinación de las mismas.
El antígeno de la hepatitis puede ser un antígeno del VHD. El antígeno de la hepatitis puede ser un antígeno delta del VHD, un fragmento del mismo o una variante del mismo.
El antígeno de la hepatitis puede ser un antígeno del VHE. El antígeno de la hepatitis puede ser una proteína de la cápside del VHE, un fragmento de la misma o una variante de la misma.
El antígeno de la hepatitis puede ser un antígeno del VHB. El antígeno de la hepatitis puede ser una proteína core del VHB, una proteína de superficie del VHB, una ADN polimerasa del VHB, una proteína del VHB codificada por el gen X, fragmentos de las mismas, variantes de las mismas o una combinación de las mismas. El antígeno de la hepatitis puede ser una proteína core de genotipo A del VHB, una proteína core del genotipo B del VHB, una proteína core del genotipo C del VHB, una proteína core del genotipo D del VHB, una proteína core del genotipo E del VHB, una proteína core del genotipo F del VHB, una proteína core del genotipo G del VHB, una proteína core del genotipo H del VHB, una proteína de superficie del genotipo A del VHB, una proteína de superficie del genotipo B del VHB, una proteína de superficie del genotipo C del VHB, una proteína de superficie del genotipo D del VHB, una proteína de superficie del genotipo E del VHB, una proteína de superficie del genotipo F del VHB, una proteína de superficie del genotipo G del VHB, una proteína de superficie del genotipo H del VHB, fragmentos de las mismas, variantes de las mismas o combinaciones de las mismas. El antígeno de la hepatitis puede ser una proteína core del VHB consenso o una proteína de la superficie del VHB consenso.
En algunas realizaciones, el antígeno de la hepatitis puede ser una construcción de secuencia de ADN de core consenso del genotipo A del VHB, una secuencia líder de IgE ligada a una secuencia consenso para la proteína core del genotipo A del VHB o una secuencia de proteína core consenso del genotipo A del VHB.
En otras realizaciones, el antígeno de la hepatitis puede ser una construcción de secuencia de ADN de core consenso del genotipo B del VHB, una secuencia líder de IgE ligada a una secuencia consenso para la proteína core del genotipo B del VHB o una secuencia de proteína core consenso del genotipo B del VHB.
En otras realizaciones más, el antígeno de la hepatitis puede ser una construcción de secuencia de ADN de core consenso del genotipo C del VHB, una secuencia líder de IgE ligada a una secuencia consenso para la proteína core del genotipo C del VHB o una secuencia de proteína core consenso del genotipo C del VHB.
En algunas realizaciones, el antígeno de la hepatitis puede ser una construcción de secuencia de ADN de core consenso del genotipo D del VHB, una secuencia líder de IgE ligada a una secuencia consenso para la proteína core del genotipo D del VHB o una secuencia de proteína core consenso del genotipo D del VHB.
En otras realizaciones, el antígeno de la hepatitis puede ser una construcción de secuencia de ADN de core consenso del genotipo E del VHB, una secuencia líder de IgE ligada a una secuencia consenso para la proteína core del genotipo E del VHB o una secuencia de proteína core consenso del genotipo E del VHB.
En algunas realizaciones, el antígeno de la hepatitis puede ser una construcción de secuencia de ADN de core consenso del genotipo F del VHB, una secuencia líder de IgE ligada a una secuencia consenso para la proteína core del genotipo F del VHB o una secuencia de proteína core consenso del genotipo F del VHB.
En otras realizaciones, el antígeno de la hepatitis puede ser una construcción de secuencia de ADN de core consenso del genotipo G del VHB, una secuencia líder de IgE ligada a una secuencia consenso para la proteína core del genotipo G del VHB o una secuencia de proteína core consenso del genotipo G del VHB.
En algunas realizaciones, el antígeno de la hepatitis puede ser una construcción de secuencia de ADN de core consenso del genotipo H del VHB, una secuencia líder de IgE ligada a una secuencia consenso para la proteína core del genotipo H del VHB o una secuencia de proteína core consenso del genotipo H del VHB.
En otras realizaciones más, el antígeno de la hepatitis puede ser una construcción de secuencia de ADN de superficie consenso del genotipo A del VHB, una secuencia líder de IgE ligada a una secuencia consenso para la proteína de superficie del genotipo A del VHB o una secuencia de proteína de superficie consenso del genotipo A del VHB.
En algunas realizaciones, el antígeno de la hepatitis puede ser una construcción de secuencia de ADN de superficie consenso del genotipo B del VHB, una secuencia líder de IgE ligada a una secuencia consenso para la proteína de superficie del genotipo B del VHB o una secuencia de proteína de superficie consenso del genotipo B del VHB.
En otras realizaciones, el antígeno de la hepatitis puede ser una construcción de secuencia de ADN de superficie consenso del genotipo C del VHB, una secuencia líder de IgE ligada a una secuencia consenso para la proteína de superficie del genotipo C del VHB o una secuencia de proteína de superficie consenso del genotipo C del VHB.
En otras realizaciones más, el antígeno de la hepatitis puede ser una construcción de secuencia de ADN de superficie consenso del genotipo D del VHB, una secuencia líder de IgE ligada a una secuencia consenso para la proteína de superficie del genotipo D del VHB o una secuencia de proteína de superficie consenso del genotipo D del VHB.
En algunas realizaciones, el antígeno de la hepatitis puede ser una construcción de secuencia de ADN de superficie consenso del genotipo E del VHB, una secuencia líder de IgE ligada a una secuencia consenso para la proteína de superficie del genotipo E del VHB o una secuencia de proteína de superficie consenso del genotipo E del VHB.
En otras realizaciones, el antígeno de la hepatitis puede ser una construcción de secuencia de ADN de superficie consenso del genotipo F del VHB, una secuencia líder de IgE ligada a una secuencia consenso para la proteína de superficie del genotipo F del VHB o una secuencia de proteína de superficie consenso del genotipo F del VHB.
En otras realizaciones más, el antígeno de la hepatitis puede ser una construcción de secuencia de ADN de superficie consenso del genotipo G del VHB, una secuencia líder de IgE ligada a una secuencia consenso para la proteína de superficie del genotipo G del VHB o una secuencia de proteína de superficie consenso del genotipo G del VHB.
En otras realizaciones, el antígeno de la hepatitis puede ser una construcción de secuencia de ADN de superficie consenso del genotipo H del VHB, una secuencia líder de IgE ligada a una secuencia consenso para la proteína de superficie del genotipo H del VHB o una secuencia de proteína de superficie consenso del genotipo H del VHB.
(b) Antígeno del virus del papiloma humano (VPH)
La IL-33 puede asociarse o combinarse con un antígeno del virus del papiloma humano (VPH) o un fragmento del mismo o una variante del mismo. El antígeno del VPH puede ser de los tipos 16, 18, 31, 33, 35, 45, 52 y 58 del VPH que causan cáncer de cuello de útero, cáncer de recto y/u otros cánceres. El antígeno del VPH puede ser de los tipos 6 y 11 del VPH, que causan verrugas genitales y se sabe que son causas de cáncer de cabeza y cuello.
Los antígenos de VPH pueden ser los dominios E6 o E7 del VPH de cada tipo de VPH. Por ejemplo, para el VPH de tipo 16 (VPH16), el antígeno de VPH16 puede incluir el antígeno E6 de VPH16, el antígeno E7 de Vp h 16, fragmentos, variantes o combinaciones de los mismos. De forma similar, el antígeno de VPH puede ser E6 y/o E7 de VPH 6, E6 y/o E7 de VPH 11, E6 y/o E7 de VPH 18, E6 y/o E7 de VPH 31, E6 y/o E7 de VPH 33, E6 y/o E7 de VPH 52 o E6 y/o E7 de VPH 58, fragmentos, variantes o combinaciones de los mismos.
(c) Antígeno de RSV
La IL-33 también puede asociarse o combinarse con un antígeno de RSV o un fragmento del mismo o una variante del mismo. El antígeno del RSV puede ser una proteína de fusión de RSV (también citada en el presente documento como "RSV F", "proteína F de RSV" y "proteína F") o un fragmento o variante de la misma. La proteína de fusión de RSV puede estar conservada entre los subtipos A y B de RSV. El antígeno de RSV puede ser una proteína F de RSV o un fragmento o variante de la misma, procedente de la cepa larga de RSV (GenBank AAX23994.1). El antígeno de RSV puede ser una proteína F de RSV de la cepa A2 de r Sv (GenBank AAB59858.1) o un fragmento o variante de la misma. El antígeno de RSV puede ser un monómero, un dímero o trímero de la proteína F de RSV o un fragmento o variante de la misma. El antígeno de RSV puede ser una secuencia de aminoácidos de F de RSV optimizada o un fragmento o variante de la misma.
La forma postfusión de F de RSV genera un alto título de anticuerpos neutralizantes en animales inmunizados y protege a los animales frente a la exposición a RSV. La presente invención utiliza esta respuesta inmunitaria en las vacunas reivindicadas. De acuerdo con la invención, la proteína F de RSV puede encontrarse en una forma prefusión o una forma postfusión.
El antígeno de RSV también puede ser una glucoproteína de acoplamiento de RSV (también citada en el presente documento como "RSV G", "proteína G de RSV" y "proteína G") o un fragmento o variante de la misma. La proteína G de RSV humano difiere de los subtipos A y B de RSV. El antígeno puede ser la proteína G de RSV o un fragmento o variante de la misma, procedente de la cepa larga de RSV (GenBank AAX23993). El antígeno de RSV puede ser la proteína G de RSV de: el aislado H5601 del subtipo B de Rs V, el aislado H1068 del subtipo B de RSV, el aislado H5598 del subtipo B de RSV, el aislado H1123 del subtipo B de RSV o un fragmento o variante del mismo. El antígeno de RSV puede ser una secuencia de aminoácidos de G de RSV optimizada o un fragmento o variante de la misma.
En otras realizaciones, el antígeno de RSV puede ser una proteína no estructural 1 de RSV ("proteína NS1") o un fragmento o variante de la misma. Por ejemplo, el antígeno de RSV puede ser la proteína NS1 de RSV o un fragmento o variante de la misma, procedente de la cepa larga de RSV (GenBank AAX23987.1). el antígeno de RSV humano también puede ser la proteína no estructural 2 de RSV ("proteína NS2") o un fragmento o variante de la misma. Por ejemplo, el antígeno de RSV puede ser la proteína NS2 de RSV o un fragmento o variante de la misma, procedente de la cepa larga de RSV (GenBank AAX23988.1). El antígeno de RSV puede ser además la proteína de una nucleocápside ("N") de RSV o un fragmento o variante de la misma. Por ejemplo, el antígeno de RSV puede ser la proteína N de RSV o un fragmento o variante de la misma, procedente de la cepa larga de RSV (GenBank AAX23989.1). El antígeno de RSV puede ser la fosfoproteína ("P") de RSV humano o un fragmento o variante de la misma. Por ejemplo, el antígeno de RSV puede ser la proteína P de RSV o un fragmento o variante de la misma, procedente de la cepa larga de RSV (GenBank AAX23990.1). El antígeno de RSV también puede ser una proteína de matriz ("M") de RSV humano o un fragmento o variante de la misma. Por ejemplo, el antígeno de RSV puede ser la proteína M de RSV o un fragmento o variante de la misma, procedente de la cepa larga de RSV (GenBank AAX23991.1).
En otras realizaciones más, El antígeno de RSV puede ser la proteína hidrófoba pequeña ("SH") del RSV humano o un fragmento o variante de la misma. Por ejemplo, el antígeno de RSV puede ser la proteína SH de RSV o un fragmento o variante de la misma, procedente de la cepa larga de RSV (GenBank AAX23992.1). El antígeno de RSV también puede ser la proteína de matriz 2-1 ("M2-1") de RSV humano o un fragmento o variante de la misma. Por ejemplo, el antígeno de RSV puede ser la proteína M2-1 de RSV o un fragmento o variante de la misma, procedente de la cepa larga de RSV (GenBank AAX23995.1). El antígeno de RSV puede ser además la proteína de matriz 2-2 ("M2-2") de RSV humano o un fragmento o variante de la misma. Por ejemplo, el antígeno de RSV puede ser la proteína M2-2 de RSV o un fragmento o variante de la misma, procedente de la cepa larga de RSV (GenBank AAX23997.1). El antígeno de RSV humano puede ser la proteína polimerasa L ("L") de RSV o un fragmento o variante de la misma. Por ejemplo, el antígeno de RSV puede ser la proteína L de RSV o un fragmento o variante de la misma, procedente de la cepa larga de RSV (GenBank AAX23996.1).
En realizaciones adicionales, el antígeno de RSV puede tener una secuencia de aminoácidos optimizada de la proteína NS1, NS2, N, P, M, SH, M2-1, M2-2 o L. El antígeno de RSV puede ser una proteína o antígeno recombinante de RSV, tal como una cualquiera de las proteínas codificadas por el genoma de RSV humano.
En otras realizaciones, el antígeno de RSV puede ser, pero sin limitación, la proteína F de RSV de la cepa larga de RSV, la proteína G de RSV de la cepa larga de RSV, la secuencia de aminoácidos optimizada de RSV G, el genoma de RSV humano de la cepa larga de RSV, la secuencia de aminoácidos optimizada de F de RSV, la proteína NS1 de RSV de la cepa larga de RSV, la proteína NS2 de RSV de la cepa larga de RSV, la proteína N de RSV de la cepa larga de RSV, la proteína P de RSV de la cepa larga de RSV, la proteína M de RSV de la cepa larga de RSV, la proteína SH de RSV de la cepa larga de RSV, la proteína M2-1 de RSV de la cepa larga de RSV, la proteína M2-2 de RSV de la cepa larga de RSV, la proteína L de r Sv de la cepa larga de RSV, la proteína G de RSV del aislado H5601 del subtipo B de RSV, la proteína G de RSV del aislado H1068 del subtipo B de Rs V, la proteína G de RSV del aislado H5598 del subtipo B de RSV, la proteína G de RSV del aislado H1123 del subtipo B de RSV, o un fragmento de la misma o una variante de la misma.
(d) Antígeno la gripe
La IL-33 también puede asociarse o combinarse con un antígeno de la gripe o un fragmento del mismo o una variante del mismo. Los antígenos de la gripe son aquellos capaces de generar una respuesta inmunitaria en un mamífero contra uno o más serotipos de la gripe. El antígeno puede comprender el producto de transcripción de longitud completa HA0, subunidad HA1, subunidad HA2, una variante del mismo, un fragmento del mismo o una combinación de los mismos. El antígeno hemaglutinina de la gripe puede ser una secuencia consenso derivada de múltiples cepas del serotipo H1 de la gripe A, una secuencia consenso derivada de múltiples cepas del serotipo H2 de la gripe A, una secuencia híbrida que contiene porciones de dos secuencias consenso diferentes procedentes de diferentes conjuntos de múltiples cepas del serotipo H1 de la gripe A o una secuencia consenso procedente de múltiples cepas de gripe B. El antígeno hemaglutinina de la gripe puede ser de la gripe B.
El antígeno de la gripe también puede contener al menos un epítopo antigénico que puede ser eficaz contra inmunógenos de la gripe particulares, contra los que puede inducirse una respuesta inmunitaria. El antígeno puede proporcionar un repertorio completo de sitios y epítopos inmunogénicos presentes en un virus de la gripe intacto. El antígeno puede ser una secuencia de antígeno de hemaglutinina consenso que puede proceder de secuencias de antígeno de hemaglutinina procedentes de una pluralidad de cepas de virus de la gripe A de un serotipo, tal como una pluralidad de cepas del virus de la gripe A de serotipo H1 o H2. El antígeno puede ser una secuencia de antígeno hemaglutinina híbrido consenso que puede proceder de la combinación de dos secuencias de antígeno de hemaglutinina consenso diferentes o porciones de las mismas. Cada una de las dos secuencias de antígeno de hemaglutinina consenso diferentes pueden proceder de un conjunto diferente de una pluralidad de cepas de la gripe A de un serotipo, tal como una pluralidad de cepas del virus de la gripe A de serotipo H1. El antígeno puede ser una secuencia de antígeno de hemaglutinina consenso que puede proceder de secuencias de antígeno de hemaglutinina de una pluralidad de cepas del virus de la gripe B.
En algunas realizaciones, el antígeno de la gripe puede ser H1 HA, H2 HA, H3 HA, H5 HA o un antígeno BHA. Como alternativa, el antígeno de la gripe puede ser un antígeno de hemaglutinina consenso que comprende una secuencia de aminoácidos consenso H1 o una secuencia de aminoácidos H2 consenso. El antígeno de hemaglutinina consenso puede ser una secuencia de H1 consenso híbrida sintética que comprende porciones de dos secuencias de H1 consenso diferentes, cada una de las cuales procede de un conjunto distinto de secuencias de la otra. Un ejemplo de un antígeno HA consenso que es una proteína H1 consenso híbrida sintética es una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos U2. El antígeno de hemaglutinina consenso puede ser una proteína hemaglutinina consenso procedente de secuencias de hemaglutinina de cepas de la gripe B, tal como una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de BHA consenso.
El antígeno de hemaglutinina consenso puede comprender uno o más elementos de secuencia de aminoácidos adicionales. El antígeno de hemaglutinina consenso puede comprender además en su extremo N-terminal una secuencia de aminoácidos líder de IgE o IgG. El antígeno de hemaglutinina consenso puede comprender además un marcador inmunogénico, que es un epítopo inmunogénico único que puede detectarse mediante anticuerpos fácilmente disponibles. Un ejemplo de dicho marcador inmunogénico es el marcador de HA de la gripe de 9 aminoácidos que puede ligarse al extremo C-terminal de hemaglutinina consenso. En algunas realizaciones, el antígeno de hemaglutinina consenso puede comprender además en su extremo N-terminal una secuencia de aminoácidos líder de IgE o IgG y en su extremo C-terminal, un marcador de HA.
El antígeno de hemaglutinina consenso puede ser una proteína hemaglutinina consenso que consiste en secuencias de aminoácidos de gripe consenso o fragmentos y variantes de las mismas. El antígeno de hemaglutinina consenso puede ser una proteína hemaglutinina consenso que comprende secuencias de proteína no de gripe y secuencias de proteína de gripe o fragmentos y variantes de las mismas.
Los ejemplos de una proteína H1 consenso incluyen aquellos que pueden consistir en la secuencia de aminoácidos de H1 consenso o aquellos que comprende además elementos adicionales, tales como una secuencia líder de IgE o un marcador HA o tanto una secuencia líder de IgE como un marcador de HA.
Los ejemplos de proteínas H2 consenso incluyen aquellos que pueden consistir en la secuencia de aminoácidos de H2 consenso o aquellos que pueden comprender adicionalmente una secuencia líder de IgE o un marcador HA o tanto una secuencia líder de IgE y un marcador de HA.
Los ejemplos de proteínas H1 híbridas consenso incluyen aquellos que pueden consistir en la secuencia de aminoácidos de U2 consenso o aquellos que pueden comprender adicionalmente una secuencia líder de IgE o un marcador HA o tanto una secuencia líder de IgE y un marcador de HA.
Los ejemplos de proteínas hemaglutinina de la gripe B consenso incluyen aquellas que pueden consistir en la secuencia de aminoácidos de BHA consenso o puede comprender una secuencia líder de IgE o un marcador de HA o tanto una secuencia líder de IgE y un marcador de HA.
La proteína hemaglutinina consenso puede estar codificada por un ácido nucleico de hemaglutinina consenso, una variante de la misma o un fragmento de la misma. A diferencia de la proteína hemaglutinina consenso, que puede ser una secuencia consenso procedente de una pluralidad de diferentes secuencias de hemaglutinina de diferentes cepas y variantes, el ácido nucleico de hemaglutinina consenso se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de proteína consenso y la secuencia codificante usada puede diferir de las usadas para codificar las secuencias de aminoácidos particulares en la pluralidad de diferentes secuencias de hemaglutinina de las que procede la secuencia de proteína hemaglutinina consenso. Pueden optimizarse los codones y/o el ARN de la secuencia de ácido nucleico consenso. La secuencia de ácido nucleico de hemaglutinina consenso puede comprender una secuencia de Kozak en la región 5' no traducida. La secuencia de aminoácidos de hemaglutinina consenso puede comprender secuencias de ácido nucleico que codifican una secuencia líder. La secuencia codificante de una secuencia líder N-terminal se encuentra en 5' respecto de la secuencia codificante de hemaglutinina. El líder N-terminal puede facilitar la secreción. El líder N-terminal puede ser un líder de IgE o un líder de IgG. La secuencia de ácido nucleico de hemaglutinina consenso puede comprender secuencias de ácido nucleico que codifican un marcador inmunogénico. El marcador inmunogénico puede encontrarse en el extremo C-terminal de la proteína y la secuencia que lo codifica se encuentra en 3' de la secuencia codificante de HA. El marcador inmunogénico proporciona un epítopo único para el que hay anticuerpos fácilmente disponibles, de tal forma que dichos anticuerpos pueden usarse en ensayos para detectar y confirmar la expresión de la proteína. El marcador inmunogénico puede encontrarse en un marcador de HA en el extremo C-terminal de la proteína.
(e) Antígeno del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)
La IL-33 también puede asociarse o combinarse con un antígeno del HIV o un fragmento del mismo o una variante del mismo. Los antígenos del VIH pueden incluir secuencias consenso modificadas para inmunógenos. Pueden incluirse en las secuencias consenso modificadas modificaciones genéticas, incluyendo optimización de codones, optimización de ARN y la adición de una secuencia líder de inmunoglobulina altamente eficaz para aumentar la inmunogenicidad de las construcciones. Los nuevos inmunógenos pueden diseñarse para generar respuestas inmunitarias celulares más fuertes y amplias que los inmunógenos correspondientes con codones optimizados.
En algunas realizaciones, el antígeno del VIH puede ser una construcción de secuencia consenso de ADN de la envuelta del subtipo A, una secuencia líder de IgE ligada a una secuencia consenso para la proteína de la envuelta del subtipo A o una secuencia consenso de la proteína de la envuelta del subtipo A.
En otras realizaciones, el antígeno del VIH puede ser una construcción de secuencia consenso de ADN de la envuelta del subtipo B, una secuencia líder de IgE ligada a una secuencia consenso para la proteína de la envuelta del subtipo B o una secuencia consenso de la proteína de la envuelta del subtipo B.
En otras realizaciones más, el antígeno del VIH puede ser una construcción de secuencia consenso de ADN de la envuelta del subtipo C, una secuencia líder de IgE ligada a una secuencia consenso para la proteína de la envuelta del subtipo C o una secuencia consenso de la proteína de la envuelta del subtipo C.
En realizaciones adicionales, el antígeno del VIH puede ser una construcción de secuencia consenso de ADN de la envuelta del subtipo D, una secuencia líder de IgE ligada a una secuencia consenso para la proteína de la envuelta del subtipo D o una secuencia consenso de la proteína de la envuelta del subtipo D.
En algunas realizaciones, el antígeno del VIH puede ser una construcción de secuencia consenso de ADN de Nef-Rev de la envuelta del subtipo B, una secuencia líder de IgE ligada a una secuencia consenso para la proteína Nef-Rev del subtipo B o una secuencia de proteína consenso de Nef-Rev del subtipo B.
En otras realizaciones, el antígeno del VIH puede ser una construcción de secuencia de ADN de la secuencia de ADN consenso de Gag del subtipo A, B, C y D, una secuencia líder de IgE ligada a una secuencia consenso para la proteína Gag consenso del subtipo A, B, C y D o una secuencia de proteína Gag consenso del subtipo A, B, C y D.
En otras realizaciones más, el antígeno del VIH puede ser una secuencia de ADN de MPol o una secuencia de proteína de MPol. El antígeno del VIH puede ser una secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos de Env A, Env B, Env C, Env D, B Nef-Rev, Gag o cualquier combinación de las mismas.
(f) Antígeno del virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV)
La IL-33 también puede asociarse o combinarse con un antígeno del LCMV o un fragmento del mismo o una variante del mismo. El antígeno del LCMV puede comprender secuencias consenso y/o una o más modificaciones para una expresión mejorada. Pueden incluirse en las secuencias modificadas modificaciones genéticas, incluyendo optimización de codones, optimización de ARN y la adición de una secuencia líder de inmunoglobulina altamente eficaz para aumentar la inmunogenicidad de las construcciones. El antígeno de LCMV puede comprender un péptido de señal, tal como un péptido de señal de inmunoglobulina (por ejemplo, un péptido de señal de IgE o IgE) y en algunas realizaciones, puede comprender un marcador de HA. Los inmunógenos pueden diseñarse para generar respuestas inmunitarias celulares más fuertes y amplias que el inmunógeno correspondiente con codones optimizados.
El antígeno de LCMV puede ser un antígeno de LCMV Armstrong. El antígeno de LCMV puede ser un antígeno del clon 13 de LCMV. El antígeno de LCMV puede ser una nucleoproteína (NP) de LCMV, una glucoproteína (GP; por ejemplo, GP-1, GP-2 y GPC) de LCMV, una proteína L de LCMV, un polipéptido Z de LCMV, un fragmento del mismo, una variante del mismo o una combinación de los mismos.
(2) Antígenos de parásito
El antígeno puede ser un antígeno parasitario o un fragmento o variante del mismo. El parásito puede ser un protozoo, helminto o ectoparásito. El helminto (es decir, gusano) puede ser un platelminto (por ejemplo, trematodos y tenias), un gusano acantocéfalo o un gusano redondo (por ejemplo, lombrices intestinales). El ectoparásito puede ser piojos, pulgas, garrapatas y ácaros.
El parásito puede ser cualquier parásito que provoque las siguientes enfermedades: queratitis por Acanthamoeba, amebiasis, ascariasis, babesiosis, balantidiasis, bailisascariasis, enfermedad de Chagas, clonorquiasis, cochliomyia, criptosporidiosis, difilobotriasis, dracunculiasis, equinococosis, elefantiasis, enterobiasis, fascioliasis, fasciolopsiasis, filariasis, giardiasis, gnatostomiasis, himenolepiasis, isosporiasis, fiebre de Katayama, leishmaniasis, enfermedad de Lyme, Malaria, metagonimiasis, miasis, oncocercosis, pediculosis, sarna, esquistosomiasis, enfermedad del sueño, estrongiloidiasis, teniasis, toxocariasis, toxoplasmosis, triquinosis y tricuriasis.
El parásito puede ser Acanthamoeba, Anisakis, Ascaris lumbricoides, moscardón, Balantidium coli, chinches, Cestoda (tenia), niguas, Cochliomyia hominivorax, Entamoeba histolytica, Fasciola hepatica, Giardia lamblia, anquilostoma, Leishmania, Linguatula serrata, duelas hepáticas, Loa loa, Paragonimus - duela pulmonar, lombriz intestinal, Plasmodium falciparum, esquistosoma, Strongyloides stercoralis, ácaros, platelmintos, Toxoplasma gondii, Trypanosoma, tricocéfalo o Wuchereria bancrofti.
(a) Antígeno de la malaria
La IL-33 puede asociarse o combinarse con un antígeno de la malaria (es decir, antígeno PF o inmunógeno PF) o un fragmento del mismo o variante del mismo. El antígeno puede ser de un parásito causante de la malaria. El parásito causante de la malaria puede ser Plasmodium falciparum. El antígeno de Plasmodium falciparum puede incluir el antígeno de circumesporocito (CS).
En algunas realizaciones, el antígeno de la malaria puede ser moléculas de ácido nucleico, tales como plásmidos, que codifican uno o más de los inmunógenos de P. falciparum, CS, LSA1, TRAP, CelTOS y Amal. Los inmunógenos pueden de longitud completa o fragmentos inmunogénicos de proteínas de longitud completa. Los inmunógenos comprenden secuencias consenso y/o modificaciones para una expresión mejorada.
En otras realizaciones, el antígeno de la malaria puede ser una secuencia consenso de TRAP, que también se conoce como SSP2, diseñada a partir de una compilación de secuencias de TRAP/SSP2 de longitud completa de Plasmodium falciparum en la base de datos de GenBank (28 secuencias en total). Los inmunógenos TRAP consenso (es decir, el inmunógeno ConTRAP) pueden comprender un péptido de señal, tal como un péptido de señal de inmunoglobulina, tal como un péptido de señal de IgE o IgG y en algunas realizaciones, puede comprender un marcador de HA.
En otras realizaciones más, el antígeno de la malaria puede ser CeITOS, que también se conoce como Ag2 y es un antígeno altamente conservado de Plasmodium. Los antígenos CeITOS consenso (es decir, el inmunógeno ConCeITOS) pueden comprender un péptido de señal, tal como un péptido de señal de inmunoglobulina, tal como un péptido de señal de IgE o IgG y en algunas realizaciones, puede comprender un marcador de HA.
En realizaciones adicionales, el antígeno de la malaria puede ser Ama1, que es un antígeno de Plasmodium altamente conservado. El antígeno de la malaria también puede ser una secuencia consenso de Ama1 (es decir, inmunógeno ConAmaI) que comprende en algunos casos, un péptido de señal, tal como un péptido de señal de inmunoglobulina, tal como un péptido de señal de IgE o IgG y en algunas realizaciones, puede comprender un marcador de HA.
En algunas realizaciones, el antígeno de la malaria puede ser un antígeno CS consenso (es decir, inmunógeno CS consenso) que comprende en algunos casos, un péptido de señal, tal como un péptido de señal de inmunoglobulina, tal como un péptido de señal de IgE o IgG y en algunas realizaciones, puede comprender un marcador de HA.
En otras realizaciones, el antígeno de malaria puede ser una proteína de fusión que comprende una combinación de dos o más de las proteínas PF expuestas en el presente documento. Por ejemplo, las proteínas de fusión pueden comprender dos o más de los inmunógenos CS consenso, el inmunógeno ConLSA1, el inmunógeno ConTRAP, el inmunógeno ConCelTOS y el inmunógeno ConAma1 ligados directamente entre sí o ligados con un enlazador o uno o más aminoácidos entre medias. En algunas realizaciones, la proteína de fusión comprende dos inmunógenos PF; en algunas realizaciones, la proteína de fusión comprende tres inmunógenos PF; en algunas realizaciones, la proteína de fusión comprende cuatro inmunógenos PF; y en algunas realizaciones, la proteína de fusión comprende cinco inmunógenos Pf . Las proteínas de fusión con dos inmunógenos PF consenso pueden comprender: CS y LSA1; CS y TRAP; CS y CelTOS; CS y Amal; LSA1 y TRAP; LSA1 y CelTOS; LSA1 y Amal; TRAP y CelTOS; TRAP y Amal; o CelTOS y Amal. Las proteínas de fusión con tres inmunógenos PF consenso pueden comprender: CS, LSA1 y TRAP; CS, LSA1 y CelTOS; CS, LSA1 y Amal; LSA1, TRAP y CelTOS; LSA1, TRAP y Amal; o TRAP, CelTOS y Amal. Las proteínas de fusión con cuatro inmunógenos PF consenso pueden comprender: CS, LSA1, TRAP y CelTOS; CS, LSA1, TRAP y Amal; CS, LSA1, CelTOS y Amal; CS, TRAP, CelTOS y Amal; o LSA1, TRAP, CelTOS y Amal. Las proteínas de fusión con cinco inmunógenos PF consenso pueden comprender CS o CS-alt, LSA1, TRAP, CelTOS y Amal.
En algunas realizaciones, las proteínas de fusión comprenden un péptido de señal unido al extremo N. En algunas realizaciones, las proteínas de fusión comprenden péptidos de señal múltiples unidos al extremo N de cada inmunógeno PF consenso. En algunas realizaciones, puede incluirse un espaciador entre los inmunógenos PF de una proteína de fusión. En algunas realizaciones, el espaciador entre los inmunógenos PF de una proteína de fusión puede ser un sitio de escisión proteolítica. En algunas realizaciones, el espaciador puede ser un sitio de escisión proteolítica reconocido por una proteasa que se encuentra en las células a las que se pretende administrar y/o que capten la vacuna. En algunas realizaciones, puede incluirse un espaciador entre los inmunógenos PF de una proteína de fusión, el espaciador puede ser un sitio de escisión proteolítica reconocido por una proteasa que se encuentra en las células a las que se pretende administrar y/o que capten la vacuna y la proteína de fusión comprende múltiples péptidos de señal ligados al extremo N de cada uno de los inmunógenos Pf consenso, de tal forma que tras la escisión, el péptido de señal de cada inmunógeno PF consenso transloca el inmunógeno PF consenso al exterior de la célula.
(3) Antígenos bacterianos
El antígeno puede ser un antígeno bacteriano o un fragmento o variante del mismo. La bacteria puede ser de uno cualquiera de los siguientes filos: Acidobacterias, Actinobacterias, Aquificae, Bacteroidetes, Caldiserica, Chlamydiae, Chlorobi, Chloroflexi, Chrysiogenetes, Cyanobacteria, Deferribacteres, Deinococcus-Thermus, Dictyoglomi, Elusimicrobia, Fibrobacteres, Firmicutes, Fusobacteria, Gemmatimonadetes, Lentisphaerae, Nitrospira, Planctomycetes, Proteobacteria, Spirochaetes, Synergistetes, Tenericutes, Thermodesulfobacteria, Thermotogae y Verrucomicrobia.
La bacteria puede ser una bacteria grampositiva o una bacteria gramnegativa. La bacteria puede ser una bacteria aerobia o una bacteria anaerobia. La bacteria puede ser una bacteria autótrofa o una bacteria heterótrofa. La bacteria puede ser un mesófilo, un neutrófilo, un extremófilo, un acidófilo, un alcalifilo, un termófilo, un psicrofilo, un halófilo o un osmófilo.
La bacteria puede ser una bacteria del ántrax, una bacteria resistente a los antibióticos, una bacteria causante de enfermedades, una bacteria de intoxicación alimentaria, una bacteria infecciosa, bacteria de la salmonela, bacteria estafilocócica, bacteria estreptocócica o bacteria tetánica. La bacteria puede ser una micobacteria, Clostridium tetani, Yersinia pestis, Bacillus anthracis, Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA) o Clostridium difficile. La bacteria puede ser Mycobacterium tuberculosis.
(a) Antígenos de Mycobacterium tuberculosis
La IL-33 puede asociarse o combinarse con un antígeno de Mycobacterium tuberculosis (es decir, antígeno TB o inmunógeno TB) o un fragmento del mismo o una variante del mismo. El antígeno TB puede ser de la familia de antígenos TB Ag85, por ejemplo, Ag85A y Ag85B. El antígeno TB puede ser de la familia Esx de antígenos TB, por ejemplo, EsxA, EsxB, EsxC, EsxD, EsxE, EsxF, EsxH, EsxO, EsxQ, EsxR, EsxS, EsxT, EsxU, EsxV y EsxW.
En algunas realizaciones, el antígeno TB puede ser moléculas de ácido nucleico, tales como plásmidos, que codifican uno o más de los inmunógenos de Mycobacterium tuberculosis de la familia Ag85 y la familia Esx. Los inmunógenos pueden ser fragmentos de longitud completa o inmunogénicos de proteínas de longitud completa. Los inmunógenos pueden comprender secuencias consenso y/o modificaciones para una expresión mejorada. Los inmunógenos consenso pueden comprender un péptido de señal, tal como un péptido de señal de inmunoglobulina, tal como un péptido de señal de IgE o IgG y, en algunas realizaciones, puede comprender un marcador de HA.
(4) Antígenos fúngicos
El antígeno puede ser un antígeno fúngico o un fragmento o variante del mismo. El hongo puede ser una especie de Aspergillus, Blastomyces dermatitidis, levaduras Candida (por ejemplo, Candida albicans), Coccidioides, Cryptococcus neoformans, Cryptococcus gattii, dermatofito, especies de Fusarium, Histoplasma capsulatum, Mucoromycotina, Pneumocystis jirovecii, Sporothrix schenckii, Exserohilum o Cladosporium.
c. Vector
La vacuna puede comprender uno o más vectores que incluyen un ácido nucleico que codifica el antígeno y el adyuvante. Los uno o más vectores pueden ser capaces de expresar el antígeno y el adyuvante. Los uno o más vectores pueden ser una construcción de expresión, que generalmente es un plásmido que se usa para introducir un gen específico en una célula diana. Una vez que el vector de expresión se encuentra dentro de la célula, se produce la proteína codificada por el gen mediante la de transcripción celular y los complejos ribosómicos de la maquinaria de traducción. El plásmido se modifica por ingeniería genética con frecuencia para que contenga secuencias reguladoras que actúan como regiones potenciadoras y promotoras y conducen a una transcripción eficaz del gen portado en el vector de expresión. Los vectores de la presente invención expresan grandes cantidades de ARN mensajero estable y por lo tanto proteínas.
Los vectores pueden tener señales de expresión tales como un promotor fuerte, un codón de terminación fuerte, ajuste de la distancia entre el promotor y el gen clonado y la inserción de una secuencia de terminación de la transcripción y una PTIS (secuencia de iniciación de la traducción portable).
(1) Vectores de expresión
El vector puede ser un plásmido circular o un ácido nucleico lineal. El plásmido circular y el ácido nucleico lineal son capaces de dirigir la expresión de una secuencia de nucleótidos particular en una célula sujeto adecuada. El vector puede tener un promotor unido operativamente a la secuencia de nucleótidos que codifica el antígeno o la secuencia de nucleótidos que codifica adyuvante, que puede estar unida operativamente a señales de terminación. El vector también puede contener secuencias necesarias para una traducción adecuada de la secuencia de nucleótidos. El vector que comprende la secuencia de nucleótidos de interés puede ser quimérico, lo que significa que al menos uno de sus componentes es heterólogo con respecto a al menos uno de sus otros componentes. La expresión de la secuencia de nucleótidos en el casete de expresión puede estar bajo el control de un promotor constitutivo o de un promotor inducible, que inicia la transcripción solo cuando la célula hospedadora está expuesta a algún estímulo externo particular. En el caso de un organismo multicelular, el promotor también puede ser específico para un tejido u órgano o estadio del desarrollo particular.
(2) Vectores circulares y lineales
El vector puede ser un plásmido circular, que puede transformar una célula diana mediante integración en el genoma celular o existir de manera extracromosómica (por ejemplo, plásmido de replicación autónoma con un origen de replicación).
El vector puede ser pVAX, pcDNA3.0 o provax o cualquier otro vector de expresión capaz de expresar el ADN que codifica el antígeno o el adyuvante y permitir que una célula traduzca la secuencia para un antígeno que es reconocido por el sistema inmunitario o el adyuvante.
T ambién se proporciona en el presente documento una vacuna de ácido nucleico lineal o un casete de expresión lineal ("LEC"), que puede administrarse eficazmente a un sujeto mediante electroporación y expresando uno o más antígenos deseados o uno o más adyuvantes deseados. El LEC puede ser cualquier ADN lineal desprovisto de cualquier cadena principal de fosfato. El ADN puede codificar uno o más antígenos o uno o más adyuvantes. El LEC puede contener un promotor, un intrón, un codón de terminación y/o una señal de poliadenilación. La expresión del antígeno o el adyuvante puede estar controlada por el promotor. El LEC puede no contener genes de resistencia a antibióticos y/o una cadena principal de fosfato. El LEC puede no contener otras secuencias de ácido nucleico no relacionadas con la expresión del gen de antígeno deseado o con la expresión del adyuvante deseado.
El LEC puede proceder de cualquier plásmido que pueda linealizarse. El plásmido puede ser capaz de expresar el antígeno o el adyuvante. El plásmido puede ser capaz de expresar el adyuvante, IL-33. El plásmido puede ser pNP (Puerto Rico/34) o pM2 (Nueva Caledonia/99). El plásmido puede ser WLV009, pVAX, pcDNA3.0 o provax o cualquier otro vector de expresión capaz de expresar el ADN que codifica el antígeno o que codifica el adyuvante y permitir que una célula traduzca la secuencia para un antígeno que es reconocido por el sistema inmunitario o el adyuvante.
El LEC puede ser pcrM2. El LEC puede ser pcrNP. pcrNP y pcrMR pueden proceder de pNP (Puerto Rico/34) y pM2 (Nueva Caledonia/99), respectivamente.
(3) Promotor, intrón, codón de parada y señal de poliadenilación
El vector puede tener un promotor. Un promotor puede ser cualquier promotor que pueda dirigir la expresión génica y regular la expresión del ácido nucleico aislado. Dicho promotor es un elemento de secuencia de acción en cis necesario para la transcripción mediante ARN polimerasa dependiente de ADN, que transcribe la secuencia de antígeno o la secuencia de adyuvante descrita en el presente documento. La selección del promotor usado para dirigir la expresión de un ácido nucleico heterólogo depende de la aplicación particular. El promotor puede estar posicionado a aproximadamente la misma distancia desde el inicio de la transcripción en el vector que del sitio de inicio de la transcripción en su configuración natural. Sin embargo, puede acomodarse una variación en esta distancia sin pérdida de la función promotora.
El promotor puede estar unido operativamente a la secuencia de ácido nucleico que codifica el antígeno y a señales necesarias para una poliadenilación eficaz del transcrito, sitios de unión a ribosomas y terminación de la traducción. El promotor puede estar unido operativamente a la secuencia de ácido nucleico que codifica el adyuvante y a señales necesarias para una poliadenilación eficaz del transcrito, sitios de unión a ribosomas y terminación de la traducción.
El promotor puede ser un promotor de CMV, el promotor temprano de SV40, el promotor tardío de SV40, promotor de metalotioneína, promotor del virus del tumor mamario murino, promotor del virus del sarcoma de Rous, promotor de poliedrina u otro promotor que se demuestre eficaz para la expresión en células eucariotas.
El vector puede incluir un potenciador y un intrón con sitios donantes y aceptores de corte y empalme. El vector puede contener una región de terminación de la transcripción cadena abajo del gen estructural para proporcionar una terminación eficaz. La región de terminación se puede obtener del mismo gen que la secuencia promotora o se puede obtener de diferentes genes.
d. Excipientes y otros componentes de la vacuna
La vacuna puede comprender además un excipiente farmacéuticamente aceptable. El excipiente farmacéuticamente aceptable puede ser moléculas funcionales, tales como vehículos, adyuvantes distintos de IL-33, portadores o diluyentes. El excipiente farmacéuticamente aceptable puede ser un agente que facilita la transfección, que puede incluir agentes tensioactivos, tales como complejos inmunoestimulantes (ISCOMS), adyuvante incompleto de Freund, un análogo de LPS incluyendo monofosforil lípido A, péptidos de muramilo, análogos de quinona, vesículas, tales como escualano y escualeno, ácido hialurónico, lípidos, liposomas, iones de calcio, proteínas víricas, polianiones, policationes o nanopartículas u otros agentes que facilitan la transfección.
El agente que facilita la transfección es un polianión, un policatión, incluyendo poli-L-glutamato (LGS) o un lípido. El agente que facilita la transfección es poli-L-glutamato y el poli-L-glutamato puede estar presente en la vacuna a una concentración menor de 6 mg/ml. El agente que facilita la transfección también puede incluir agentes tensioactivos, tales como complejos inmunoestimulantes (ISCOMS), adyuvante incompleto de Freund, un análogo de LPS incluyendo monofosforil lípido A, péptidos de muramilo, análogos de quinona y vesículas tales como escualeno y escualeno y también se puede usar ácido hialurónico administrado junto con la construcción genética. Las vacunas de ADN plasmídico también pueden incluir un agente que facilita la transfección, tal como lípidos, liposomas, incluyendo liposomas de lecitina u otros liposomas conocidos en la técnica, como una mezcla de ADN-liposoma (véase, por ejemplo, el documento WO9324640), iones de calcio, proteínas víricas, polianiones, policationes o nanopartículas u otros agentes que facilitan la transfección. El agente que facilita la transfección es un polianión, un policatión, incluyendo poli-L-glutamato (LGS) o un lípido. La concentración del agente de transfección en la vacuna es menor de 4 mg/ml, menor de 2 mg/ml, menor de 1 mg/ml, menor de 0,750 mg/ml, menor de 0,500 mg/ml, menor de 0. 250 mg/ml, menor de 0,100 mg/ml, menor de 0,050 mg/ml o menor de 0,010 mg/ml.
El excipiente farmacéuticamente aceptable puede ser un adyuvante, además de IL-33. El adyuvante adicional puede ser otros genes que se expresan en un plásmido alternativo o se administran como proteínas en combinación con el plásmido anterior en la vacuna. El adyuvante puede seleccionarse entre el grupo que consiste en: interferón a (IFN-a), interferón f3 (IFN-f3), interferón y, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), TNFa, TNFf3, GM-CSF, factor de crecimiento epidérmico (e Gf ), quimiocina atrayente de linfocitos T cutáneos (CTACK), quimiocina epitelial expresada en timo (TECK), quimiocina epitelial asociada a mucosas (MEC), IL-12, IL-15, MHC, CD80, CD86, incluyendo IL-15, que tiene la secuencia señal eliminada y que incluye opcionalmente el péptido de señal de IgE. El adyuvante puede ser IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), TNFa, TNFp, GM-CSF, factor de crecimiento epidérmico (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18 o una combinación de los mismos.
Otros genes que pueden ser útiles como adyuvantes además de IL-33 incluyen aquellos que codifican: MCP-1, MIP-1a, MIP-1p, IL-8, RANTES, L-selectina, P-selectina, E-selectina, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, p150.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, formas mutantes de IL-18, CD40, CD40L, factor de crecimiento vascular, factor de crecimiento de fibroblastos, IL-7, IL-22, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento endotelial vascular, Fas, receptor de TNF, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, Caspasa ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, NIK inactiva, SAP K, SAP-1, JNK, genes de respuesta al interferón, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, LIGANDO DE RANK, Ox40, LIGANDO DE Ox40, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 y fragmentos funcionales de los mismos.
La vacuna puede comprender además un agente facilitador de vacuna genética, como se describe en el n.° de serie de los Estados Unidos 021.579, presentado el 1 de abril de 1994.
La vacuna puede formularse de acuerdo con el modo de administración que vaya a usarse. Una composición farmacéutica de vacuna inyectable puede ser estéril, apirógena y libre de partículas. Se puede usar una formulación o solución isotónica. Los aditivos para la isotonicidad pueden incluir cloruro de sodio, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa. La vacuna puede comprender un agente de vasoconstricción. Las soluciones isotónicas pueden incluir solución salina tamponada con fosfato. La vacuna puede comprender además estabilizantes que incluyen gelatina y albúmina. Los estabilizantes pueden permitir que la formulación sea estable a temperatura ambiente o ambiental durante largos períodos de tiempo, Incluyendo LGS o policationes o polianiones.
3. Método de vacunación
La presente invención un 93%, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 %, un 100 %, un 101 %, un 102 %, un 103 %, un 104 %, un 105 %, un 106 %, un 107 %, un 108 %, un 109 %, un 110 %, un 111 %, un 112 %, un 113 %, un 114 %, un 115 %, un 116 %, un 117 %, un 118 %, un 119 %, un 120 %, un 121 %, un 122 %, un 123 %, un 124 %, un 125 %, un 126 %, un 127 %, un 128 %, un 129 % o un 130 %.
En otras realizaciones, puede aumentarse la respuesta inmunitaria en el sujeto al que se administra la vacuna en al menos aproximadamente 1,5 veces, al menos aproximadamente 2,0 veces, al menos aproximadamente 2,5 veces, al menos aproximadamente 3,0 veces, al menos aproximadamente 3,5 veces, al menos aproximadamente 4,0 veces, al menos aproximadamente 4,5 veces, al menos aproximadamente 5,0 veces, al menos aproximadamente 5,5 veces, al menos aproximadamente 6,0 veces, al menos aproximadamente 6,5 veces, al menos aproximadamente 7,0 veces, al menos aproximadamente 7,5 veces, al menos aproximadamente 8,0 veces, al menos aproximadamente 8,5 veces, al menos aproximadamente 9,0 veces, al menos aproximadamente 9,5 veces o al menos aproximadamente 10,0 veces.
La dosis de la vacuna puede ser de entre 1 |jg a 10 mg de componente activo/kg de peso corporal/vez y puede ser de 20 jg a 10 mg de componente/kg de peso corporal/vez. La vacuna se puede administrar cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o 31 días. El número de dosis de vacuna para un tratamiento eficaz puede ser de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10.
a. Tratamiento y prevención del cáncer
La presente invención también se refiere al uso de las vacunas de la invención en un método para tratar el cáncer. El sujeto al que se administra la vacuna puede tener una respuesta inmunitaria aumentada o reforzada en comparación con un sujeto al que solo se administra el antígeno. Puede usarse la respuesta inmunitaria aumentada para tratar y/o prevenir una enfermedad en el sujeto. La enfermedad puede ser cáncer, por ejemplo, un cáncer asociado con el VPH, cáncer asociado a VHB, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de cerebro, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de garganta, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de riñón, cáncer de hueso, melanoma, cáncer metastásico, cáncer asociado con hTERT, cáncer asociado al antígeno FAP, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer hematológico, carcinoma escamocelular del esófago, cáncer de cuello uterino, cáncer de vejiga, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, cáncer de ano, carcinoma sinovial, cáncer de testículo, papilomatosis respiratoria recurrente, cáncer de piel, glioblastoma, hepatocarcinoma, cáncer de estómago, leucemia mieloide aguda, cáncer de mama triple negativo y linfoma primario de linfocitos T cutáneos. El cáncer puede ser cáncer asociado al VPH.
El método puede incluir además reducir el tamaño de un tumor o lesión establecido en el sujeto. El tumor puede reducirse de tamaño de aproximadamente un 50 % a aproximadamente un 100%, de aproximadamente un 60 % a aproximadamente un 100 %, de aproximadamente un 70 % a aproximadamente un 100 %, de aproximadamente un 80 % a aproximadamente un 100 %, de aproximadamente un 90 % a aproximadamente un 100 %, de aproximadamente un 50 % a aproximadamente un 95 %, de aproximadamente un 60 % a aproximadamente un 95 %, de aproximadamente un 70 % a aproximadamente un 95 %, de aproximadamente un 80 % a aproximadamente un 95 %, de aproximadamente un 90 % a aproximadamente un 95 %, de aproximadamente un 50 % a aproximadamente un 90 %, de aproximadamente un 60 % a aproximadamente un 90 %, de aproximadamente un 70 % a aproximadamente un 90 % o de aproximadamente un 80 % a aproximadamente un 90 %. Puede reducirse el tamaño del tumor en aproximadamente un 80 %, en aproximadamente un 81 %, en aproximadamente un 82 %, en aproximadamente un 83 %, en aproximadamente un 84 %, en aproximadamente un 85 %, en aproximadamente un 86 %, en aproximadamente un 87 %, en aproximadamente un 88 %, en aproximadamente un 89 %, en aproximadamente un 90 %, en aproximadamente un 91 %, en aproximadamente un 92 %, en aproximadamente un 93 %, en aproximadamente un 94 %, en aproximadamente un 95 %, en aproximadamente un 96 %, en aproximadamente un 97 %, en aproximadamente un 98 %, en aproximadamente un 99 % o en aproximadamente un 100 %.
El método puede incluir además un aumento de la regresión tumoral en el sujeto en comparación con el sujeto al que se administró el antígeno solo. La administración de la vacuna puede aumentar la regresión tumoral de aproximadamente un 40 % a aproximadamente un 60 %, de aproximadamente un 45 % a aproximadamente un 55 % o aproximadamente un 50 %. La administración de la vacuna también puede aumentar la tasa de regresión tumoral. La administración de la vacuna puede lograr adicionalmente una regresión tumoral en el sujeto de aproximadamente un 80 % a aproximadamente un 100 %, de aproximadamente un 85 % a aproximadamente un 100 %, de aproximadamente un 90 % a aproximadamente un 100 %, de aproximadamente un 95 % a aproximadamente un 100 %, de aproximadamente un 80 % a aproximadamente un 95 %, de aproximadamente un 85 % a aproximadamente un 95 %, de aproximadamente un 90 % a aproximadamente un 95 %, de aproximadamente un 80 % a aproximadamente un 90 % o de aproximadamente un 85 % a aproximadamente un 90 %. La regresión tumoral puede ser de aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 81 %, aproximadamente un 82 %, aproximadamente un 83 %, aproximadamente un 84 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 86 %, aproximadamente un 87 %, aproximadamente un 88 %, aproximadamente un 89 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 91 %, aproximadamente un 92 %, aproximadamente un 93 %, aproximadamente un 94 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 %, aproximadamente un 99 % o aproximadamente un 100 % en el sujeto al que se administra la vacuna. La regresión tumoral en el sujeto al que se administró la vacuna puede ser de aproximadamente un 90 % o de aproximadamente un 100 %.
El método puede incluir además prevenir el cáncer o el crecimiento de tumores en el sujeto al que se administra la vacuna. Esta prevención puede permitir que el sujeto al que se administra la vacuna sobreviva a un cáncer futuro. En otras palabras, la vacuna proporciona protección contra el cáncer al sujeto al que se administra la vacuna. El sujeto al que se administra la vacuna puede tener de aproximadamente un 90 % a aproximadamente un 100 % de supervivencia del cáncer. El sujeto al que se administra la vacuna puede tener aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 91 %, aproximadamente un 92 %, aproximadamente un 93 %, aproximadamente un 94 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 %, aproximadamente un 99 % o aproximadamente un 100 % de supervivencia del cáncer.
b. Administración
La vacuna puede formularse de acuerdo con técnicas convencionales bien conocidas por los expertos en la técnica farmacéutica. Dichas composiciones pueden administrarse en dosis y mediante técnicas bien conocidas por los expertos en las técnicas médicas, tomando en consideración factores tales como la edad, sexo, peso y condición del paciente particular y la vía de administración. El sujeto puede ser un mamífero, tal como un ser humano, un caballo, una vaca, un cerdo, una oveja, un gato, un perro, una rata o un ratón.
La vacuna puede administrarse de manera profiláctica o terapéutica. En la administración profiláctica, Las vacunas pueden administrarse en una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmunitaria. En aplicaciones terapéuticas, las vacunas son para administración a un sujeto que las necesite en una cantidad suficiente para provocar un efecto terapéutico. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como una "dosis terapéuticamente eficaz". Las cantidades eficaces para este uso dependerán, por ejemplo, de la composición particular del régimen vacunal administrado, el modo de administración, el estadio y la gravedad de la enfermedad, el estado general de salud del paciente y el criterio del médico prescriptor.
La vacuna puede administrarse mediante métodos bien conocidos en la técnica, como se describe en Donnelly et al. (Ann. Rev. Immunol. 15: 617-648 (1997)); Felgner et al. (Patente de los Estados Unidos n.° 5.580.859, concedida el 3 de diciembre de 1996); Felgner (Patente de los Estados Unidos n.° 5.703.055, concedida el 30 de diciembre de 1997); y Carson et al. (Patente de los Estados Unidos n.° 5.679.647, concedida el 21 de octubre de 1997). El ADN de la vacuna puede complejarse a partículas o perlas que pueden administrarse a un individuo, por ejemplo, utilizando una pistola de vacuna. Un experto en la materia sabría que la elección de un vehículo farmacéuticamente aceptable, incluyendo un compuesto fisiológicamente aceptable, depende, por ejemplo, de la vía de administración del vector de expresión.
La vacuna puede ser para su suministro por diversas vías. Las vías de administración típicas incluyen administración parenteral, por ejemplo, administración intradérmica, intramuscular o subcutánea. Otras vías incluyen las vías de administración oral, intranasal e intravaginal. Para el ADN de la vacuna en particular, la vacuna puede administrarse a los espacios intersticiales de los tejidos de un individuo (Felgner et al., Patentes de los Estados Unidos n.° 5.580.859 y 5.703.055). La vacuna también puede ser para administración al músculo o para administración mediante inyecciones intradérmicas o subcutáneas o por vía transdérmica, tal como por iontoforesis. También puede emplearse la administración epidérmica de la vacuna. La administración epidérmica puede implicar una irritación mecánica o química de la capa más externa de la epidermis para estimular una respuesta inmunitaria al irritante (Carson et al., Patente de los Estados Unidos n.° 5.679.647).
La vacuna también puede formularse para su administración a través de los conductos nasales. Las formulaciones adecuadas para la administración nasal, en las que el vehículo es un sólido, pueden incluir un polvo grueso que tiene un tamaño de partícula, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 10 a aproximadamente 500 micrómetros que se toma de la manera en que se administra el rapé, es decir, mediante inhalación rápida a través de las fosas nasales a partir de un envase con el polvo sujetado cerca de la nariz. La formulación puede ser un spray nasal, gotas nasales o mediante la administración de aerosol por nebulizador. La formulación puede incluir soluciones acuosas u oleosas de la vacuna.
La vacuna puede ser una preparación líquida, tal como una suspensión, jarabe o elixir. La vacuna también puede ser una preparación para administración parenteral, subcutánea, intradérmica, intramuscular o intravenosa (por ejemplo, administración inyectable), tal como una suspensión o emulsión estéril.
La vacuna puede incorporarse en liposomas, microesferas u otras matrices poliméricas (Felgner et al., Patente de los Estados Unidos n.° 5.703.055; Gregoriadis, Liposome Technology, Vol. I a III (2.a ed. 1993)). Los liposomas pueden consistir en fosfolípidos u otros lípidos y pueden ser vehículos no tóxicos fisiológicamente aceptables y metabolizables que son relativamente sencillos de preparar y de administrar.
La vacuna puede ser para administración mediante electroporación, tal como mediante un método descrito en la Patente de los Estados Unidos n.° 7.664.545. La electroporación puede ser mediante un método y/o aparato descrito en las Patentes de los Estados Unidos n.° 6.302.874; 5.676.646; 6.241.701; 6.233.482; 6.216.034; 6.208.893; 6.192.270; 6.181.964; 6.150.148; 6.120.493; 6.096.020; 6.068.650; y 5.702.359. La electroporación puede llevarse a cabo mediante un dispositivo mínimamente invasivo.
El dispositivo de electroporación mínimamente invasivo ("MID") puede ser un aparato para inyectar la vacuna descrito anteriormente y el fluido asociado en tejido corporal. El dispositivo puede comprender una aguja hueca, casete de ADN y medios para el suministro de fluidos, en donde el dispositivo está adaptado para accionar los medios de suministro de fluidos para inyectar concurrentemente (por ejemplo, de manera automática) el ADN en el tejido corporal durante la inserción de la aguja en dicho tejido corporal. Esto tiene la ventaja de que la capacidad para inyectar el ADN y el fluido asociado de manera gradual a medida que se inserta la aguja da lugar a una distribución más uniforme del fluido por el tejido corporal. Puede reducirse el dolor experimentado durante la inyección debido a que el ADN que se está inyectando se distribuye por un área mayor.
El MID puede inyectar la vacuna en el tejido sin necesidad de agujas. El MID puede inyectar la vacuna como una corriente o chorro pequeño con una fuerza tal que la vacuna perfora la superficie del tejido y entra en el tejido y/o el músculo subyacente. La fuerza que impulsa la corriente o el corro pequeño puede proporcionarse mediante la expansión de un gas comprimido, tal como dióxido de carbono, a través de un orificio microscópico en una fracción de segundo. Los ejemplos de dispositivos de electroporación mínimamente invasivos y los métodos para usarlos, se divulgan en la Solicitud de Patente publicada de los Estados Unidos n.° 20080234655; la Patente de los Estados Unidos n.° 6.520.950; la Patente de los Estados Unidos n.° 7.171.264; la Patente de los Estados Unidos n.° 6.208.893; la Patente de los Estados Unidos n.° 6.009.347; la Patente de los Estados Unidos n.° 6.120.493; la Patente de los Estados Unidos n.° 7.245.963; la Patente de los Estados Unidos n.° 7.328.064; y la patente de los Estados Unidos n.° 6.763.264.
El MID puede comprender un inyector que crea un chorro de líquido a alta velocidad que penetra el tejido de manera indolora. Dichos inyectores sin aguja están disponibles comercialmente. Los ejemplos de inyectores sin aguja que pueden utilizarse en el presente documento incluyen los descritos en las patentes los Estados Unidos n.° 3.805.783; 4.447.223; 5.505.697; y 4.342.310.
Puede introducirse (por ejemplo, inyectarse) una vacuna deseada en una forma adecuada para el electrotransporte directo o indirecto, usando un inyector sin aguja en el tejido que se va a tratar, generalmente poniendo en contacto la superficie del tejido con el inyector, a fin de activar el suministro de un chorro del agente, con una fuerza suficiente para provocar la penetración de la vacuna en el tejido. Por ejemplo, en caso de que el tejido que se va a tratar sea una mucosa, piel o músculo, el agente se proyecta hacia la superficie mucosa o de la piel con una fuerza suficiente para provocar la penetración del agente a través del estrato córneo al interior de las capas dérmicas o al interior del tejido y el músculo subyacente, respectivamente.
Los inyectores sin agujas son adecuados para administrar vacunas a todos los tipos de tejidos, particularmente a la piel y mucosas. Puede usarse un inyector sin aguja para impulsar un líquido que contiene la vacuna hacia la superficie y al interior de la piel o mucosa del sujeto. Los ejemplos de los diversos tipos de tejidos que pueden tratarse usando los métodos de la invención incluyen páncreas, laringe, nasofaringe, hipofaringe, orofaringe, labio, garganta, pulmón, corazón, riñón, músculo, mama, colon, próstata, timo, testículos, piel, tejido de mucosa, ovario, vasos sanguíneos o cualquier combinación de los mismos.
El MID puede tener electrodos de aguja que electroporan el tejido. Mediante la pulsación entre múltiples pares de electrodos en una matriz de múltiples electrodos, por ejemplo, dispuestos en patrones rectangulares o cuadrados, se proporcionan resultados mejorados respecto de los de pulsar entre un par de electrodos. En la Patente de los Estados Unidos n.° 5.702.359, titulada "Needle Electrodes for Mediated Delivery of Drugs and Genes (Electrodos de aguja para la administración mediada de fármacos y genes)" se divulga una matriz de agujas en donde puede pulsarse una pluralidad de pares de agujas durante el tratamiento terapéutico. En esa solicitud, las agujas se dispusieron en una matriz circular, pero tienen conectores y un aparato de interconexión que posibilita el pulsado entre pares opuestos de electrodos de aguja. Puede usarse un par de electrodos de aguja para administrar vectores de expresión recombinante a células. Dicho dispositivo y sistema se describe en la Patente de los Estados Unidos n.° 6.763.264. Como alternativa, puede usarse un solo dispositivo de aguja que permite la inyección del ADN y la electroporación con una sola aguja que se asemeja a una aguja para inyección normal y que aplica pulsos de menor voltaje que los administrados por los dispositivos usados en la actualidad, reduciendo de este modo la sensación eléctrica percibida por el paciente.
El MID puede comprender una o más matrices de electrodos. Las matrices pueden comprender dos o más agujas del mismo diámetro o de diámetros diferentes. Las agujas pueden estar espaciadas de manera uniforme o desigual. Las agujas pueden encontrarse a entre 0,005 pulgadas y 0,03 pulgadas (0,127 mm y 0,762 mm), entre 0,01 pulgadas y 0,025 pulgadas (0,254 mm y 0,635 mm); o entre 0,015 pulgadas y 0,020 pulgadas (0,381 mm y 0,508 mm). La aguja puede tener un diámetro de 0,0175 pulgadas (0,44 mm). Las agujas pueden estar espaciadas a 0,5 mm, 1,0 mm, 1,5 mm, 2,0 mm, 2,5 mm, 3,0 mm, 3,5 mm, 4,0 mm o más.
El MID puede consistir en un generador de pulsos y dos o más inyectores de vacuna con aguja que administran los pulsos de vacuna y electroporación en un solo paso. El generador de pulsos puede permitir una programación flexible de los parámetros de pulso e inyección mediante un ordenador personal dotado de una tarjeta flash, así como el registro y almacenamiento exhaustivo de los datos de electroporación y paciente. El generador de pulsos puede administrar una variedad de pulsos de voltaje durante cortos periodos de tiempo. Por ejemplo, el generador de pulsos puede suministrar pulsos de 15 v con una duración de 100 ms. Un ejemplo de dicho MID es el sistema Elgen 1000, de Inovio Biomedical Corporation, que se describe en la Patente de los Estados Unidos n.° 7.328.064.
El MID puede ser un dispositivo y sistema CELLECTRA (Inovio Parmaceuticals, Blue Bell, PA), que es un sistema de electrodo modular, que facilita la introducción de una macromolécula, tal como ADN, en las células de un tejido seleccionado en un cuerpo o planta. Los sistemas de electrodos modulares pueden comprender una pluralidad de electrodos de aguja; una aguja hipodérmica; un conector eléctrico que proporciona un enlace conductor desde un controlador de pulsos de corriente constante programable hasta la pluralidad de electrodos de aguja; y una fuente de alimentación. Un operario puede sujetar la pluralidad de electrodos de aguja que están montados en una estructura de soporte e insertarlos firmemente en el tejido seleccionado en un cuerpo o planta. Después, las macromoléculas se suministran a través de la aguja hipodérmica en el tejido seleccionado. El controlador de pulsos de corriente constante programare se activa y el pulso eléctrico de corriente constante se aplica a la pluralidad de electrodos de aguja. El pulso eléctrico de corriente constante aplicado facilita la introducción de la macromolécula en la célula entre la pluralidad de electrodos. La muerte celular debida al sobrecalentamiento de las células se minimiza al limitar la disipación de energía en el tejido en virtud de pulsos de corriente constante. El dispositivo y el sistema Cellectra se describen en la Patente de los Estados Unidos n.° 7.245.963.
El MID puede ser un sistema Elgen 1000 (Inovio Pharmaceuticals). El sistema Elgen 1000 puede comprender un dispositivo que proporciona una aguja hueca; y medios de suministro de fluidos, en donde el aparato está adaptado para accionar los medios de suministro de fluido en uso de modo que inyecte fluido concurrentemente (por ejemplo, automáticamente), la vacuna descrita en el presente documento, en el tejido corporal durante la inserción de la aguja en dicho tejido corporal. La ventaja es que la capacidad para inyectar gradualmente el tejido a medida que se inserta la aguja da lugar a una distribución más uniforme del fluido por el tejido corporal. También se cree que se reduce el dolor experimentado durante la inyección debido a que el volumen de fluido que se inyecta se distribuye en un área mayor.
Además, la inyección automática de fluido facilita la monitorización automática y el registro de una dosis real de fluido inyectada. Estos datos pueden almacenarse por una unidad de control con una finalidad de documentación, en caso de que se desee.
Se apreciará que la velocidad de inyección puede ser lineal o no lineal y que la inyección puede llevarse a cabo después de que las agujas se hayan insertado a través de la piel del sujeto a tratar y mientras se insertan más en el tejido corporal.
Los tejidos adecuados en los que se puede inyectar fluido por el aparato de la presente invención incluyen tejido tumoral, piel o tejido hepático, pero puede ser tejido muscular.
El aparato comprende además medios de inserción de aguja para guiar la inserción de la aguja en el tejido corporal. La velocidad de inyección del fluido se controla mediante la velocidad de inserción de la aguja. Esto tiene la ventaja de que tanto la inserción de la aguja como la inyección de fluido pueden controlarse de tal manera que la velocidad de inserción se puede ajustar a la velocidad de inyección según se desee. T ambién hace que el aparato sea más fácil de manejar por el usuario. Si se desea, se podrían proporcionar medios para insertar automáticamente la aguja en el tejido corporal.
Un usuario puede elegir cuándo comenzar la inyección de fluido. Idealmente sin embargo, la inyección comienza cuando la punta de la aguja ha alcanzado el tejido muscular y el aparato puede incluir medios para detectar cuándo se ha insertado la aguja a una profundidad suficiente para que comience la inyección del líquido. Esto significa que se puede solicitar que la inyección de líquido comience automáticamente cuando la aguja haya alcanzado la profundidad deseada (que normalmente será la profundidad a la que comienza el tejido muscular). La profundidad a la que comienza el tejido muscular podría tomarse, por ejemplo, como una profundidad de inserción de aguja preestablecida, tal como un valor de 4 mm, que se consideraría suficiente para que la aguja pase a través de la capa de la piel.
Los medios de detección pueden comprender una sonda de ultrasonidos. Los medios de detección pueden comprender un medio para detectar un cambio en la impedancia o resistencia. En este caso, los medios en sí no detectan la profundidad de la aguja en el tejido corporal, sino que están adaptados para percibir un cambio en la impedancia o resistencia a medida que la aguja se mueve desde un tipo de tejido corporal diferente al músculo. Cualquiera de estas alternativas proporciona un medio relativamente preciso y simple de emplear para detectar que la inyección puede comenzar. Además, puede registrarse la profundidad de inserción de la aguja si se desea y se podría usar para controlar la inyección de fluido, de manera que el volumen de fluido a inyectar se determine a medida que se registra la profundidad de inserción de la aguja.
El aparato puede comprender además: una base para soportar la aguja; y una carcasa para recibir la base en el mismo, en donde la base se puede mover con relación a la carcasa, de modo que la aguja se retrae dentro de la carcasa cuando la base está en una primera posición hacia atrás con respecto a la carcasa y la aguja se extiende fuera de la carcasa cuando la base está en una segunda posición hacia adelante dentro de la carcasa. Esto es ventajoso para un usuario, ya que la carcasa se puede alinear sobre la piel de un paciente y las agujas se pueden insertar en la piel del paciente moviendo la carcasa con respecto a la base.
Como se ha indicado anteriormente, es deseable lograr una velocidad de inyección de fluido controlada, de modo que el fluido se distribuya uniformemente a lo largo de la longitud de la aguja a medida que se inserta en la piel. Los medios de suministro de fluido pueden comprender medios de accionamiento de pistón adaptados para inyectar fluido a una velocidad controlada. Los medios de accionamiento de pistón podrían, por ejemplo, activarse por un servomotor. Sin embargo, los medios de accionamiento de pistón pueden accionarse por la base que se mueve en la dirección axial con respecto a la carcasa. Se apreciará que pueden proporcionarse medios alternativos para el suministro de fluidos. Por lo tanto, por ejemplo, en lugar de un sistema de jeringa y pistón, podría proporcionarse un envase cerrado que puede presionarse para el suministro de fluidos a una velocidad controlada o no controlada.
El aparato descrito anteriormente podría usarse para cualquier tipo de inyección. Sin embargo, se prevé que sea particularmente útil en el campo de la electroporación y, por lo tanto, puede comprender además medios para aplicar un voltaje a la aguja. Esto permite que la aguja se use no solo para inyección sino también como electrodo durante la electroporación. Esto es particularmente ventajoso ya que significa que el campo eléctrico se aplica a la misma área que el fluido inyectado. Tradicionalmente, ha habido un problema con la electroporación, ya que es muy difícil alinear con precisión un electrodo con un fluido previamente inyectado y, por lo tanto, los usuarios han tendido a inyectar un mayor volumen de fluido que el requerido en un área más grande y aplicar un campo eléctrico sobre un mayor área para intentar garantizar una superposición entre la sustancia inyectada y el campo eléctrico. Utilizando la presente invención, pueden reducirse tanto el volumen de fluido inyectado como el tamaño del campo eléctrico aplicado, a la vez que se logra un buen ajuste entre el campo eléctrico y el fluido.
La presente invención tiene múltiples aspectos, ilustrados mediante los siguientes ejemplos no limitantes.
4. Ejemplos
Ejemplo 1
Materiales y métodos para los ejemplos 2-10
Construcción del plásmido. Se usó la secuencia NM_001164724.1 de GenBank de IL-33 de ratón para sintetizar construcciones de ADN plasmídico de IL-33 de longitud completa (proIL-33) y madura (mtrIL-33) (aa 109-266) (véase la FIG. 1A para una ilustración esquemática de las construcciones de proIL-33 de ratón y mtrIL-33 de ratón). También se usó la secuencia para IL-33 humana para sintetizar construcciones de ADN plasmídico de longitud completa (proIL-33) y maduras (mtrIL-33) (aa 112-270) (véase la FIG. 10 para una ilustración esquemática de las construcciones de proIL-33 humana y de mtrIL-33 humana). Cada construcción tenía una secuencia líder de inmunoglobulina E (IgE) altamente eficaz insertada en el extremo 5' del gen. Cada construcción se sintetizó comercialmente y se optimizó. La secuencia de ácido nucleico optimizada, SEQ ID NO: 5, codificó proIL-33 de ratón (SEQ ID NO: 6). La secuencia de ácido nucleico optimizada, SEQ ID NO: 7, codificó mtrIL-33 de ratón (SEQ ID NO: 8). La secuencia de ácido nucleico optimizada, SEQ ID NO: 1, codificó mtrIL-33 humana (SEQ ID NO: 2). La secuencia de ácido nucleico optimizada, SEQ ID NO: 3, codificó proIL-33 humana (SEQ ID NO: 4). En cada una de estas cuatro construcciones, los primeros dieciocho aminoácidos (es decir, los restos 1-18) fueron la secuencia líder de IgE. También se prepararon plásmidos que expresan ConE6E7 de VPH 16 y la construcción GP33.
Transfección y expresión de plásmidos. Se confirmó la expresión de la construcción de proIL-33 y mtrIL-33 mediante transferencia de Western e inmunofluorescencia. Se cultivaron líneas celulares de rabdomiosarcoma humano (RD), se transfectaron y se recogieron. Brevemente, se cultivaron células RD en placas de 6 pocillos y se transfectaron con las construcciones (pVAX como control) usando LIPOFECTAMINE 2000 (Invitrogen) siguiendo el protocolo del fabricante. Cuarenta y ocho horas después, se lisaron las células usando tampón de lisis RIPA modificado y se recogió un lisado celular. El análisis por transferencia de Western se llevó a cabo con un anticuerpo monoclonal anti-IL-33 (R&D Systems) y se visualizó con anticuerpo anti-IgG de rata conjugado a peroxidasa de rábano picante (HRP) (Cell Signaling) usando un sistema de análisis de transferencia de Western e Cl (GE Amersham). Además, también se recogieron los sobrenadantes 48 horas después de la transfección y se examinó la secreción de citocinas mediante el kit de ELISA Quantikine para IL-33 de ratón/rata (R&D Systems) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Además, también se utilizó un ensayo inmunofluorescente indirecto para confirmar la expresión de proIL-33 y mtrIL-33. Brevemente, Las células RD se colocaron en placas de dos pocillos (BD Biosciences) y se cultivaron hasta un 70 % de confluencia durante una noche en una incubadora a 37 grados centígrados con CO2 al 5 %. Las células se transfectaron con 1 |jg de construcciones de IL-33 y el plásmido de control pGX0001 (1 ug/pocillo) utilizando el reactivo de transfección TURBOFECTION 8.0 (OriGene) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cuarenta y ocho horas después, se fijaron las células en portaobjetos usando metanol enfriado en hielo durante 10 minutos. Las células se tiñeron con anticuerpo monoclonal de ratón anti-IL-33 (R&D Systems, Minneapolis, MN) y posteriormente se incubaron con el anticuerpo secundario anti-rata conjugado con Alexa 555 (Cell Signaling). Las imágenes se analizaron mediante microscopía de fluorescencia (Leica DM4000B, Leica Microsystems Inc., EE. UU.) y la cuantificación se realizó con el programa informático SPOT Advanced (SPOT Diagnostic Instruments, Inc).
Animales. Se compraron ratones C57BL/6 (B6) hembra de 8 semanas de edad de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, EE. UU.). Los ratones P14 que portaban el receptor específico de linfocitos T DbGP33 se obtuvieron de la Universidad de Pennsylvania (laboratorio del Dr. John Wherry). Para generar los ratones "P14 quimera", se transfirieron de manera adoptiva 1,6x105 linfocitos T transgénicos para el receptor de linfocitos T en ratones B6 no expuestos previamente.
Inmunización y electroporación de ratones. Los ratones se inmunizaron tres veces a intervalos de tres semanas en el músculo tibial anterior. La electroporación (EP) in vivo, con el dispositivo de EP de corriente constante adaptativa CELLECTRA (Inovio Pharmaceuticals, Blue Bell, PA), se produjo en el mismo sitio inmediatamente después de las vacunaciones. Se inmunizó a los ratones (n=4) con 5 jg de pVAX1 o 5 jg de ConE6E7 solo o con diversas cantidades de construcciones de proIL-33 y mtrIL-33, dependiendo del experimento (por ejemplo, 5 .tg y 7 .tg). La construcción de GP33 se administró a 5 |jg.
Ensayos ELISPOT. En primer lugar, se recogieron los bazos 8 días después de la inmunización final. Tras recogerse y procesarse los bazos, se llevaron a cabo ensayos ELISPOT para IFN-y e IL-4 para determinar la secreción de citocinas específica de antígeno de ratones inmunizados. Se sintetizó por GenScript un conjunto de péptidos (15 restos de aminoácidos solapantes con 8 aminoácidos) que representan la secuencia consenso de la proteína de fusión E6/E7 consenso de VPH16. Este conjunto de péptidos se agrupó en dos grupos, que abarcaban la longitud de los antígenos E6 y E7. Como control positivo, se usó concavalina A (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) a 5 jg/m l y como control negativo se usó medio de cultivo completo. Los puntos se enumeraron usando un lector ELISPOT automatizado (Cellular Technology, Shaker Heights, OH).
Tinción de citocina intracelular para citometría de flujo. Se aislaron linfocitos de bazo y sangre periférica. Se usó la relación tetrámero de péptido de clase I del complejo mayor de histocompatibilidad a LCMV-GP33. Específicamente, se agregaron esplenocitos a una placa de 96 pocillos (1x105/pocillo) y se estimularon con péptido combinado E6/E7 de VPH-16 durante 5-6 horas a 37 °C/5% de CO2 en presencia de un cóctel inhibidor del transporte de proteínas (brefeldina A y monensina) (Ebioscience) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El cóctel de estimulación celular (más inhibidores del transporte de proteínas) (12-miristato 13-acetato de forbol (PMA), ionomicina, brefeldina A y monensina (Ebioscience) se utilizaron como control positivo y los medios R10 como control negativo. En cultivos utilizados para medir la desgranulación, se añadió en ese momento anti-CD107a (FITC, clone 1D4B; Biolegend) para potenciar la tinción.
Todas las células se tiñeron para proteínas superficiales e intracelulares. Brevemente, las células se lavaron en tampón FACS (PBS que contenía azida sódica al 0,1% y FCS al 1%) antes de teñir la superficie con anticuerpos conjugados con fluorocromo. Las células se lavaron con tampón fijador de FACS y se permeabilizaron usando BD CYTOFIX/CYTOPERM (BD, San Diego, CA, EE. UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante, seguido de la tinción intracelular.
Se usaron los siguientes anticuerpos para la tinción superficial: kit de tinción de células muertas fijable violeta LIVE/DEAD (Invitrogen), CD19 (V50; clon 1D3; BD Biosciences), CD4 (V500; clon RM4-5; BD Biosciences), CD8 (PE-TexasRed; clon 53-6.7; Abcam), CD44 (A700; clon IM7; Biolegend); KLRG1 (FITC; clon 2F1; eBioscience); y PD-1 (PeCy7; clon RMP1-30; Biolegend). Se usó la relación tetrámero de péptido de clase I del complejo mayor de histocompatibilidad a LCMV-GP33. Para la tinción intracelular, se usaron los siguientes anticuerpos: iFN-y (APC; clon XMG1.2; Biolegend), TNF-a (PE; clon MP6-XT22; Ebioscience) y CD3 (PerCP/Cy5.5; clon 145-2C11; Biolegend).
Todos los datos se recopilaron con un citómetro de flujo LSRII (BD Biosciences) y se analizaron con el software FlowJo (Tree Star, Ashland, o R) y SPICE v5.2 (disponible en los Institutos Nacionales de la Salud (NIH), específicamente, Los Institutos Nacionales de Alergias y Enfermedades Infecciosas (NIAID)). La selección booleana se realizó utilizando el software FlowJo para examinar la polifuncionalidad de los linfocitos T de los animales vacunados. Las células muertas se eliminaron mediante selección en un kit de tinción de células muertas violeta fijable LIVE/DEAD (Invitrogen) frente a la dispersión frontal (FSC-A).
Determinación de anticuerpos específicos de Ag. La medición de anticuerpos IgG específicos para los genes virales E6 y E7 se realizó mediante ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) en ratones tanto inmunizados como controlados. Las placas se recubrieron con 1 jg/m l de cada proteína (ProteinX Lab) y se incubaron durante la noche a 4 grados centígrados. Tras el lavado, las placas se bloquearon con suero bovino fetal (FBS) al 10 % en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se volvieron a lavar y se añadió suero a una dilución 1:25 en FBS PBS al 1% Tween-20 al 0,05% y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de otro lavado, se añadió anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón-HRP (Santa Cruz) a una dilución de 1:5000 a cada pocillo y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de un lavado final, se reveló la reacción con el sustrato 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (Sigma-Aldrich) y se detuvo con 100 j l de ácido sulfúrico 2N/pocillo. Las placas se leyeron a 450 nm en el sistema de detección múltiple Glomax (Promega). Todas las muestras se ensayaron por duplicado.
También se determinó la cantidad de IgE específica para el antígeno utilizando un protocolo ELISA similar usando el anticuerpo secundario de rata anti-IgE de ratón-HRP (Southern Biotech). La IgE total se determinó utilizando el kit para IgE de ratón de GenWay. El protocolo del fabricante fue seguido con diluciones de suero a 1:50. Todas las muestras se ensayaron por duplicado.
Línea celular tumoral. La línea celular TC-1 expresa de forma constitutiva E6 y E7 y es altamente tumorigénica. Se cultivaron células TC-1, se prepararon y se mezclaron con Matrigel (BD Biosciences) antes del implante subcutáneo (s.c.) de tumores.
Estudio de tratamiento (regresión) de tumores in vivo. Se separaron ratones hembra B6 en cuatro grupos de 10 ratones cada uno y se implantaron por vía s.c. 5 x 104 células TC-1 en los flancos de cada ratón B6 hembra de tipo silvestre. En el día 4, (después de la implantación del tumor y cuando los tumores alcanzaron los 3 mm), se inmunizó por vía intramuscular a cada grupo de ratones mediante electroporación (i.m./EP; descrito anteriormente) con pVAX, ConE6E7, ConE6E7 proIL-33 y ConE6E7 mtrIL-33, respectivamente y se les administró un refuerzo en los días 11 y 18. Los ratones se controlaron dos veces por semana para determinar el crecimiento del tumor mediante la medición de los tumores. Los animales fueron sacrificados cuando el diámetro del tumor alcanzó 20 mm.
Análisis Estadístico. Se aplicó la prueba de la t de Student para la comparación de los datos cuantitativos de la respuesta inmunitaria celular y los diámetros tumorales. En este estudio, se consideró que p < 0,05 era estadísticamente significativa.
Ejemplo 2
Construcción y expresión de isoformas de IL-33
Para examinar si la IL-33 puede funcionar como un adyuvante en la vacunación con ADN, se diseñaron y generaron las construcciones de proIL-33 y mtrIL-33 como se ilustra en la FIG. 1A y se ha descrito anteriormente. Cada construcción se encontraba bajo el control de un promotor de citomegalovirus (CMV) y contenía una secuencia líder de IgE.
Para determinar la expresión de las formas proIL-33 y mtrIL-33, se transfectaron células de rabdomiosarcoma (RD) humano por separado con cada construcción. Las células RD transfectadas con el vector de expresión pVAX sirvieron como control negativo. Los lisados celulares se recogieron 48 horas (h) después de la transfección. La expresión de proIL-33 y mtrIL-33 se detectó en los lisados celulares respectivos mediante inmunotransferencia de Western utilizando un anticuerpo monoclonal (mAb) anti-IL-33. No se detectó proteína IL-33 en el carril correspondiente al control negativo de pVAX (FIG. 1B). En el carril correspondiente a mrtIL-33, se observó el tamaño de banda esperado (aproximadamente 20 kiloDalton (kDA)). En el carril correspondiente a proIL-33, se observaron una banda más grande (aproximadamente 30 kDA) y una banda más pequeña (aproximadamente 20 kDA) que correspondían a los tamaños esperados para proIL-33 y mtrIL-33, respectivamente. Por consiguiente, estos datos indicaron que proIL-33 y mtrIL-33 se expresaron a partir de las construcciones.
Para examinar la secreción de las formas proIL-33 y mtrIL-33, Los sobrenadantes celulares se obtuvieron 48 horas después de la transfección de células RD. La detección de la secreción de proteínas en el entorno extracelular se llevó a cabo mediante ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA). Tal como se muestra en la FIG. 1C, los sobrenadantes de células RD transfectadas con mtrIL-33 y proIL-33 contenían mtrIL-33 y proIL-33 en concentraciones de aproximadamente 20.000 pg/ml y 600 pg/ml, respectivamente. Los sobrenadantes celulares de células RD transfectadas con el vector de expresión pVAX sirvieron como control negativo y no se secretó IL-33 por estas mismas células. Los datos mostrados en la FIG. 1C son las medias con el error estándar de la media (EEM) para dos ensayos replicados.
La expresión tanto de proIL-33 como de mtrIL-33 se confirmó adicionalmente usando tinción inmunofluorescente. El anticuerpo primario fue un mAb de ratón anti-IL-33 y el anticuerpo secundario fue un anticuerpo anti-rata conjugado con Alexa 555. Se utilizó DAPI para teñir los núcleos. En las células RD transfectadas transitoriamente con la construcción de proIL-33, se observó una alta expresión nuclear con cierto grado de expresión citoplásmica de proIL-33, lo que indica que proIL-33 se localiza principalmente en el núcleo (FIG. 1D, panel inferior). En las células RD transfectadas transitoriamente con la construcción de mtrIL-33, solo se observó una alta expresión citoplásmica de mtrIL-33, lo que indica que mtrIL-33 está localizada en el citoplasma (FIG. 1D, panel central). Las células RD transfectadas transitoriamente con el vector de expresión pVAX sirvieron como control negativo y no se detectó IL-33 en estas mismas células (FIG. 1D, panel superior). Estos datos de tinción reflejaron una diferencia estructural entre proIL-33 y mtrIL-33, a saber, la señal de localización nuclear presente en proIL-33 y no en mtrIL-33.
Ejemplo 3
IL-33 potenció la respuesta inmunitaria celular a una vacuna de ADN
Como se ha descrito anteriormente, IL-33 induce y soporta una respuesta inmunitaria de Th2. La respuesta inmunitaria de Th2 incluye la inducción de la citocina interleucina-4 (IL-4). Por consiguiente, las construcciones de proIL-33 y mtrIL-33 descritas anteriormente se examinaron adicionalmente para determinar si IL-33 podría aumentar la inducción de la respuesta inmunitaria de Th2 contra un antígeno, por ejemplo, un antígeno de fusión de E6/E7 de VPH 16 (ConE6E7) basado en consenso. También se estudió la respuesta inmunitaria de Th1 a ConE6E7 examinando la secreción de IFN-y. En particular, se administró un plásmido que codifica el antígeno ConE6E7 (construcción de ConE6E7) a ratones solo o en combinación con las construcciones de proIL-33 o mtrIL-33. La administración de las construcciones fue seguida de electroporación.
La FIG. 2A muestra el calendario de vacunación de la vacuna de ADN. Se administró a ratones C57BL/6 (B6) (n=4 para cada grupo) una dosis intramuscular (i.m.) de 5 |jg de la construcción ConE6E7 sola o en combinación con construcción de mtrIL-33 o proIL-33 a diversas dosis (es decir, 5 jg y 7 jg ). Al cuarto grupo de ratones se le administró por vía i.m. una dosis de 5 jg de pVAX. La administración intramuscular de las construcciones fue seguida de electroporación. La inmunización se produjo en las semanas 0, 3 y 6. Una semana después de la inmunización final (es decir, semana 7) se sacrificó a los ratones para recoger los bazos. Se aislaron linfocitos de los bazos y se analizaron las respuestas inmunitarias de cada grupo de ratones usando un ensayo ELISpot cuantitativo.
El ensayo ELISpot se utilizó para determinar el número de células secretoras de IFN-y o IL-4 específicas de antígeno en respuesta a la estimulación con el conjunto de péptidos E6 y E7 (descrito anteriormente en el ejemplo 1). Como se muestra en la FIG. 2B, la IL-33 impulsó respuestas inmunitarias polarizadas de Th1. La inducción de la respuesta inmunitaria de Th1 se muestra por la frecuencia de unidades formadoras de puntos (UFP) de IFN-y específicas para E6 y E7 de HPV 16 por millón de esplenocitos. La co-inmunización con plásmido que codifica proIL-33 o mtrIL-33 indujo mayores números de linfocitos T secretores de IFN-y específicos para E6 y e 7 en todas las dosis (es decir, 5 jg y 7 jg ) en comparación con los ratones vacunados solo con construcción de ConE6E7 (aproximadamente 500 UFP por millón de esplenocitos). La dosis de 7 jg de mtrIL-33 o proIL-33 dio como resultado un aumento total de 4 o 3,5 veces en la magnitud del ELISpot de IFN-y, respectivamente.
Tal como se muestra en la FIG. 2C, ni proIL-33 ni mtrIL-33 dieron lugar a una secreción robusta de IL-4. La inducción de la respuesta inmunitaria de Th2 se muestra por la frecuencia de unidades formadoras de puntos (UFP) de IL-4 específicas para E6 y E7 de HPV 16 por millón de esplenocitos.
Como se ha señalado anteriormente, se pensó que IL-33 inducía y apoyaba una respuesta inmunitaria de Th2. En cambio, tanto proIL-33 como mtrIL-33 como adyuvantes estaban sesgadas hacia respuestas inmunitarias asociadas con citocinas de Th1 y no de Th2. Por consiguiente, estos datos son inesperados y sorprendentes, ya que IL-33 (tanto la forma proIL-33 como la forma mtrIL-33) aumentaron la inducción de Th1 (respuesta inmunitaria celular según lo evidenciado por IFN-y), pero no aumentó la inducción de Th2 (respuesta inmunitaria humoral como lo demuestra la IL-4) para la vacuna de ADN. Estos datos mostraron que tanto proIL-33 como mtrIL-33 son adyuvantes efectivos que inducen una respuesta inmunitaria celular.
Ejemplo 4
Inmunidad de linfocitos T CD4+ específicos para antígeno de VPH potenciada por IL-33
Como se ha demostrado anteriormente, tanto proIL-33 como mtrIL-33 amplificaron la respuesta inmunitaria de IFN-y específica de antígeno (Ag) mediante vacunación. Esta respuesta inmunitaria se examinó adicionalmente caracterizando el fenotipo y el perfil de citocinas de los linfocitos T efectores generados por la respuesta inmunitaria. En particular, se examinó la inmunidad de linfocitos T CD4+ y CD8+ (analizados más adelante en el ejemplo 5) mediante la secreción de IFN-y y TNF-a, ya que la inmunidad multifuncional de linfocitos T CD4+ y CD8+ facilita la eliminación de células infectadas por VPH16.
Se inmunizó a ratones B6 mediante inyección intramuscular (i.m.) con una dosis de 5 jg de la construcción ConE6E7 con o sin 7 jg de la construcción mtrIL-33 o proIL-33, seguido de electroporación. A un cuarto grupo de ratones se le administró por vía i.m. una dosis de 5 jg de pVAX. La administración intramuscular de las construcciones fue seguida de electroporación. La inmunización se produjo en las semanas 0, 3 y 6. Una semana después de la inmunización final (es decir, semana 7) se sacrificó a los ratones para recoger los bazos. Por consiguiente, la inmunización se produjo a intervalos de 3 semanas y los esplenocitos se recogieron una semana después de la inmunización final. Los esplenocitos se estimularon con péptidos E6 y E7 combinados para determinar la capacidad de las poblaciones de linfocitos T específicos de Ag inducidos por la vacuna para secretar IFN-y y TNF-a en respuesta a la estimulación. Tras la estimulación, se analizaron los esplenocitos mediante citometría de flujo después de la tinción intracelular con anticuerpos contra IFN-y y TNF-a. La estrategia de selección para analizar la frecuencia de linfocitos T CD4+ positivos para las citocinas IFN-y y TNF-a se muestran en la FIG. 3A.
Las figuras 3B-3E muestran los datos del análisis de linfocitos T CD4+ positivos para IFN-y, TNF-a o tanto IFN-y como TNF-a. Los datos representan la media ± EEM de cuatro ratones por grupo. **P < 0,01, *P < 0,05 en comparación con ConE6E7 (prueba de la t de Student). En comparación con el control negativo pVAX y la vacunación solo con ConE6E7, ConE6E7 coadministrado con mtrIL-33 o proIL-33 provocó una mayor frecuencia de linfocitos T CD4+ específicos para VPH que producen o bien IFN-y total (mtrIL-33: 0,21 %; proIL-33: 0,25 %), TNF-a total (mtrIL-33: 0,25 %; proIL-33: 0,39 %) y IFN-Y/TNF-a dual (mtrIL-33: 0,12 %; proIL-33: 0,15 %) (FIG. 3B-3D). Se observó una tendencia similar con la frecuencia de linfocitos T CD4+ específicos de Ag que producen únicamente IFN-y y únicamente TNF-y (FIG. 3E). En la FIG. 3E, los diagramas de barras muestran subpoblaciones plurifuncionales de linfocitos T CD4+ dobles positivos que liberan las citocinas IFN-y y/o TNF-a. Los linfocitos T CD4+ monopositivos son aquellas células que liberan IFN-y o TNF-a mientras que los linfocitos T CD4+ dobles positivos son aquellas células que liberan tanto IFN-y como TNF-a. Los diagramas de sectores en la FIG. 3E muestran la proporción relativa de cada subpoblación de citocinas respecto de la estimulación con Ag específico.
Los datos anteriores demostraron que las frecuencias de linfocitos T CD4+ que producen IFN-y, TNF-a y IFN-Y/TNF-a dual aumentaron significativamente cuando proIL-33 o mtrIL-33 era un adyuvante en la vacuna. Las altas frecuencias de linfocitos T efectores que secretan citocinas antivíricas, tales como IFN-y y TNF-a son indicativas de los efectos adyuvantes de proIL-33 y mtrIL-33 para mejorar la potencia de la vacuna. Estos datos indicaron además la capacidad tanto de proIL-33 como de mtrIL-33 para actuar como adyuvantes eficaces, a saber, induciendo inmunidad de linfocitos T CD4+ y secreción de las citocinas IFN-y y TNF-a.
Ejemplo 5
Inmunidad de linfocitos T CD8+ específicos para antígeno de VPH potenciada por IL-33
De manera similar a la inmunidad de linfocitos T CD4+, la inmunidad de linfocitos T CD8+ multifuncionales también facilita la eliminación de células infectadas con VPH16. Por consiguiente, también se examinó la secreción de IFN-y y TNF-a en respuesta a la vacunación para linfocitos T CD8+.
Específicamente, Se inmunizó a ratones B6 mediante inyección intramuscular (i.m.) con una dosis de 5 |jg de la construcción ConE6E7 con o sin 7 jg de la construcción mtrIL-33 o proIL-33, seguido de electroporación. A un cuarto grupo de ratones se le administró por vía i.m. una dosis de 5 jg de pVAX. La administración intramuscular de las construcciones fue seguida de electroporación. La inmunización se produjo en las semanas 0, 3 y 6. Una semana después de la inmunización final (es decir, semana 7) se sacrificó a los ratones para recoger los bazos. Por consiguiente, la inmunización se produjo a intervalos de 3 semanas y los esplenocitos se recogieron una semana después de la inmunización final. Los esplenocitos se estimularon con péptidos E6 y E7 combinados para determinar la capacidad de las poblaciones de linfocitos T específicos de Ag inducidos por la vacuna para secretar IFN-y y TNF-a en respuesta a la estimulación. Tras la estimulación, se analizaron los esplenocitos mediante citometría de flujo después de la tinción intracelular con anticuerpos contra IFN-y y TNF-a. La estrategia de selección para analizar la frecuencia de linfocitos T CD8+ positivos para las citocinas IFN-y y TNF-a se muestran en la FIG. 3A.
Las figuras 4A-D muestran los datos del análisis de linfocitos T CD8+ positivos para IFN-y, TNF-a o tanto IFN-y como TNF-a. Los datos representan la media ± EEM de cuatro ratones por grupo. *P < 0,05 en comparación con la construcción de ConE6E7 (prueba de la t de Student). En comparación con el control negativo pVAX y la vacunación solo con ConE6E7, ConE6E7 coadministrado con mtrIL-33 o proIL-33 provocó una frecuencia sustancialmente mayor de linfocitos T CD8+ específicos para VPH que producen IFN-y total (mtrIL-33: 3,68 %; proIL-33: 3,50 %), TNF-a total (mtrIL-33: 3,11 %; proIL-33: 3,13 %) y IFN-Y/TNF-a dual (mtrIL-33: 2,83 %; proIL-33: 2,75 %) (FIG. 4A-4C).
Se observó la misma tendencia con la frecuencia de linfocitos T CD8+ específicos de Ag que secretan únicamente IFN-y y únicamente TNF-a (FIG. 4D). En la FIG. 4D, el diagrama de barras muestra subpoblaciones plurifuncionales de linfocitos T CD8+ monopositivos y dobles positivos que liberan las citocinas IFN-y y/o TNF-a. Los linfocitos T CD8+ monopositivos son aquellas células que liberan IFN-y o TNF-a mientras que los linfocitos T CD8+ dobles positivos son aquellas células que liberan tanto IFN-y como TNF-a. Los diagramas de sectores en la FIG. 4D muestran la proporción relativa de cada subpoblación de citocinas respecto de la estimulación con Ag específico. Las gráficas de puntos en la FIG. 4D son representativas de cuatro ratones y representan los linfocitos T c D8+ dobles positivos después de la estimulación con péptido E6/E7 agrupado.
El orden proporcional de subpoblaciones de linfocitos T CD8+ efectores en respuesta a la estimulación con E6E7 fue mayor con células dobles positivas para ambas citocinas, IFN-Y+/TNF-a+, seguido de IFN-y solo, que a su vez fue mayor que las células que solo secretan TNFa+ (FIG. 4D).
Los datos anteriores demostraron que las frecuencias de linfocitos T CD8+ que producen IFN-y, TNF-a y IFN-Y/TNF-a dual aumentaron significativamente cuando proIL-33 o mtrIL-33 era un adyuvante en la vacuna. La administración conjunta con proIL-33 y mtrIL-33 produjo cantidades similares de linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+ específicos de Ag que producen IFN-y, TNF-a y IFN-Y/TNF-a dual, en tanto que la producción de citocinas estaba mediada principalmente por linfocitos T c D8+. Las altas frecuencias de los linfocitos T efectores que secretan citocinas antivirales, tales como IFN-y y TNF-a son indicativas de los efectos adyuvantes de IL-33 para mejorar la potencia de la vacuna. Estos datos indicaron además la capacidad tanto de proIL-33 como de mtrIL-33 para actuar como adyuvantes eficaces, a saber, induciendo inmunidad de linfocitos T CD8+ y secreción de las citocinas IFN-y y TNF-a.
Ejemplo 6
Linfocitos T CD8+ citotóxicos (CTL) inducidos por IL-33
Los linfocitos T CD8+ citotóxicos (CTL) también proporcionan inmunidad sometiéndose a desgranulación. CD107a es un marcador de desgranulación. Se examinó si los linfocitos T CD8+ se inducen para sufrir desgranulación cuando la IL-33 era un adyuvante en la vacuna para comprender mejor el potencial citotóxico de la vacuna.
Se inmunizó a ratones B6 mediante inyección intramuscular (i.m.) con una dosis de 5 jg de la construcción ConE6E7 con o sin 7 jg de la construcción mtrIL-33 o proIL-33, seguido de electroporación. A un cuarto grupo de ratones se le administró por vía i.m. una dosis de 5 jg de pVAX. La administración intramuscular de las construcciones fue seguida de electroporación. La inmunización se produjo en las semanas 0, 3 y 6. Una semana después de la inmunización final (es decir, semana 7) se sacrificó a los ratones para recoger los bazos. Por consiguiente, la inmunización se produjo a intervalos de 3 semanas y los esplenocitos se recogieron una semana después de la inmunización final. Los esplenocitos se estimularon con péptidos E6 y E7 combinados para determinar la capacidad de las poblaciones de linfocitos T específicos de Ag inducidos por la vacuna para secretar IFN-y y TNF-a en respuesta a la estimulación. También se examinó la capacidad de las poblaciones de linfocitos T específicos de Ag inducidos por la vacuna para expresar CD107a en respuesta a la estimulación. Tras la estimulación, se analizaron los esplenocitos mediante citometría de flujo después de la tinción intracelular con anticuerpos contra IFN-y,
TNF-a y CD107a. La estrategia de selección para analizar la frecuencia de linfocitos T CD8+ positivos para IFN-y, TNF-a y CD107a se muestran en la FIG. 3A.
Las FIG. 4E y 4F muestran la desgranulación citolítica específica de antígeno de los linfocitos T, medida por el marcador de desgranulación CD107a y el perfil de citocinas del fenotipo citolítico, respectivamente. Los datos representan la media ± EEM de cuatro ratones por grupo. *P < 0,05 en comparación con la construcción de ConE6E7 (prueba de la t de Student).
Los linfocitos T CD8+ aislados de ratones vacunados con proIL-33 o mtrIL-33 como adyuvante mostraron una mayor frecuencia del marcador de desgranulación, CD107a (mtrIL-33: 4,4 %; proIL-33: 4,9 %), en comparación con los ratones que recibieron solo la construcción de ConE6E7 (FIG. 4E). Una proporción sustancial de células efectoras específicas del VPH eran plurifuncionales, expresando el marcador de desgranulación CD107a y expresando simultáneamente IFN-y y TNF-a en varias combinaciones (FIG. 4F). Las vacunas que incluyen proIL-33 o mtrIL-33 como adyuvante provocaron frecuencias sustancialmente más altas de linfocitos T CD8+ efectores que expresan CD107a/IFN-Y/TNF-a (mtrIL-33: 2,5%; proIL-33: 2,5 %). Estos resultados indicaron el potencial adyuvante de proIL-33 y mtrIL-33 para inducir CTL citotóxicos efectores funcionales, que tienen un fenotipo que indica la capacidad de las células para eliminar las células infectadas con VPH16. Estos datos indicaron además la capacidad tanto de proIL-33 como de mtrIL-33 para actuar como adyuvantes eficaces, a saber, induciendo inmunidad de linfocitos T CD8+ y secreción de las citocinas IFN-y y TNF-a.
Conjuntamente, los datos de los ejemplos 4-6 demostraron que la coinmunización con la construcción ConE6E7 de VPH con la construcción de mtrIL-33 o proIL-33 como adyuvante dio como resultado una inmunidad celular específica de VPH más fuerte. Por consiguiente, las vacunas que incluyen proIL-33 y mtrIL-33 como adyuvantes mostraron potencial terapéutico.
Ejemplo 7
Expansión de linfocitos T CD8+ inducida por proIL-33
La respuesta de linfocitos T CD8+ inducida mediante la inclusión de proIL-33 como adyuvante en la vacuna se examinó adicionalmente para determinar si proIL-33 podría inducir la expansión de linfocitos T CD8+. Puede efectuarse un seguimiento de subconjuntos de poblaciones de linfocitos T usando el modelo de ratón P14 (receptor de linfocitos T (TCR) específico para DbGP33), permitiendo de este modo el seguimiento de la expansión de linfocitos T CD8+ en respuesta a la vacunación. Como se describe con mayor detalle a continuación, la expansión de linfocitos T CD8+ específicos para GP33/ly5.1+se monitorizó en respuesta a la inmunización con una vacuna que incluía o no proIL-33 como adyuvante.
Específicamente, se transfirieron aproximadamente 150.000 linfocitos T CD8+ transgénicos para TCR de P14 no expuestos previamente Ly5.1+ a receptores no expuestos previamente de tipo silvestre para producir "ratones quiméricos P14". Los ratones quiméricos P14 se vacunaron posteriormente dos veces con GP33 solo o GP33 en combinación con la construcción de proIL-33 en el día 0 (cebado) y en el día 41 (refuerzo). Se controló la frecuencia de la respuesta de linfocitos T CD8+ específicos de Ag en la sangre durante el transcurso del cebado y la vacunación con ADN de refuerzo con o sin adyuvante de proIL-33 (FIG. 5A y 6). En particular, la FIG. 5A muestra la cinética de la expresión de Ly5.1 en linfocitos T CD8+ específicos de P14 en células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Para la FIG. 5A, las barras de error representaron la media ± EEM de cuatro ratones por grupo mientras que *** P <0,001, ** P <0,01 y * P <0,05 en comparación con GP33 solo (prueba de la t de Student). La FIG. 6 muestra gráficas de intensidad de fluorescencia representativas de linfocitos T CD8+ específicos para GP33/Ly5.1 en la sangre de ratones vacunados en los días 14, 21 y 31 después de la primera vacunación y en el día 48 (día 7 después de la segunda vacunación). Los números en la FIG. 6 indican el porcentaje de linfocitos T CD8+ específicos de Ag dentro de las poblaciones totales de linfocitos T CD8+.
Los datos en las FIG. 5A y 6 indicaron que los ratones a los que se les administraron construcciones de GP33 y proIL-33 tenían una frecuencia significativamente mayor de linfocitos T CD8+Ly5.1+ P14 en la sangre en comparación con ratones a los que se administró solo la construcción de GP33. Esta frecuencia significativamente aumentada (aproximadamente de 5 veces) de linfocitos T Ly5.1+ CD8+ en los ratones vacunados con construcciones de GP33 y proIL-33 alcanzó un máximo aproximadamente a los 14 dpv (días después de la vacunación) en comparación con el grupo inmunizado con GP33. Específicamente, el aumento en la frecuencia para el grupo vacunado con GP33 y proIL-33 alcanzó su punto máximo 7 días antes de que el grupo vacunado solo con GP33 alcanzara su máximo aproximadamente a los 21 dpv. Estos datos indicaron que la inclusión de proIL-33 como adyuvante en la vacuna aumentó significativamente la magnitud de la respuesta de linfocitos T CD8+ específicos de Ag.
Además, siete días después del refuerzo homólogo (48 días después de la vacunación inicial), el inmunoadyuvante proIL-33 aumentó significativamente la frecuencia de linfocitos T CD8+ específicos de Ag en comparación con los ratones que recibieron la vacuna de GP33 solamente (FIG. 5A). Este aumento en la frecuencia de linfocitos T CD8+ específicos de Ag después del refuerzo indicó el recuerdo del grupo de linfocitos T CD8+ de memoria establecidos. Estos datos indicaron además que la inclusión de proIL-33 como adyuvante en la vacuna no solo aumentó significativamente la magnitud de la respuesta de linfocitos T CD8+ específicos de Ag después de la vacunación de cebado, sino que también aumentó significativamente la respuesta de linfocitos T CD8+ después de la vacunación de refuerzo. Por consiguiente, estos datos demostraron además la capacidad de proIL-33 para funcionar como adyuvante en una vacuna potenciando significativamente la respuesta de linfocitos T CD8+ específicos de Ag expandiendo las respuestas de linfocitos T CD8+ específicos de Ag tanto efectores como efectores de memoria.
Ejemplo 8
ProIL-33 generó linfocitos T efectores de memoria CD62L'KLRG1
Los linfocitos T CD8+ efectores (por ejemplo, linfocitos T efectores de memoria CD62L'KLRG1+) proporcionan inmunidad protectora y control de patógenos y los datos anteriores indicaron que como adyuvante, proIL-33 aumentó la frecuencia de linfocitos T CD8+ específicos de Ag en respuesta a vacunaciones tanto de cebado como de refuerzo. Para determinar adicionalmente la eficacia de las vacunas que incluían proIL-33 como adyuvante, se examinó el modelo de ratón P14 respecto a la respuesta de linfocitos T efectores de memoria CD62L'KLRG1+.
Específicamente, puede efectuarse un seguimiento de subconjuntos de poblaciones de linfocitos T usando el modelo de ratón P14 (receptor de linfocitos T (TCR) específico para DbGP33). Se transfirieron aproximadamente 150.000 linfocitos T CD8+ transgénicos para TCR de P14 no expuestos previamente Ly5.1+ a receptores no expuestos previamente de tipo silvestre para producir "ratones quiméricos P14". Los ratones quiméricos P14 se vacunaron posteriormente dos veces con GP33 solo o GP33 en combinación con la construcción de proIL-33 en el día 0 (cebado) y en el día 41 (refuerzo).
La FIG. 5B muestra la distribución de linfocitos T CD8+ efectores de memoria de ratones inmunizados en el día 14, 21, 31 después de la primera vacunación y el día 48 (día 7 después de la segunda vacunación). Las barras de error representaron la media ± EEM de cuatro ratones por grupo, mientras que * P <0,05 en comparación con GP33 solo (prueba de la t de Student).
En particular, se examinó el fenotipo de los linfocitos T CD8+ efectores dentro de la población de linfocitos T CD8+ específicos de P14 inducidos por la vacuna, comenzando a los 14 dpv. Se examinaron los siguientes marcadores de expresión de la superficie celular: Ly5.1, CD62L y KLRG1 (FIG. 5B). Como se muestra en la FIG. 5B, los porcentajes de células efectoras de memoria c D62L'KLRG1 fue significativamente mayor en el grupo de adyuvante de proIL-33 en comparación con el grupo vacunado únicamente con GP33. Aunque se observó que la frecuencia de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno comenzó a reducirse gradualmente a los 14 dpv (FIG. 5A), la población efectora en ambos grupos vacunados permaneció invariable durante 3 semanas (FIG. 5B). Conjuntamente, estos datos indicaron que la alta expresión de KLRG1 por linfocitos T CD8+ se asoció con la estimulación repetitiva con antígenos. Estos datos también indicaron la capacidad de proIL-33 para potenciar la exposición persistente continua al Ag.
Adicionalmente, las células de memoria secundarias mostraron una población aumentada en gran medida de linfocitos T KLRG1+ en ambos grupos (es decir, solo GP33 y GP33 y proIL-33) después del refuerzo con ADN homólogo, lo que se produjo 48 días después de la inmunización inicial. Las respuestas efectoras de memoria permanecieron significativamente más elevadas en el grupo adyuvado con proIL-33, en comparación con el grupo de solo GP33 (FIG.
5B). Conjuntamente, los datos de las FIG. 5A, 5B y 6 como se describen aquí en los ejemplos 7 y 8 indicaron que proIL-33 aumentó la formación de linfocitos T CD8+ específicos de Ag y la expansión clonal mejorada del conjunto de efector de memoria. Estos datos respaldaron adicionalmente que proIL-33 es un adyuvante eficaz.
Ejemplo 9
ProIL-33 indujo respuesta humoral de IgG
Como se describe en el ejemplo 3, proIL-33 y mtrIL-33 no indujeron la secreción de IL-4, que es parte de la respuesta inmunitaria de Th2 o humoral. Por consiguiente, se examinó más a fondo la respuesta humoral a las vacunas que incluyen proIL-33 o mtrIL-33.
Se inmunizó a los grupos respectivos de ratones (n=4) con la construcción ConE6E7 solo, la construcción ConE6E7 con la construcción mtrIL-33 y la construcción ConE6E7 con la construcción proIL-33. Como control negativo, se vacunó a un grupo de ratones (n=4) con pVAX. Específicamente, la vacunación incluyó la inyección intramuscular de las construcciones, seguida de electroporación. La inmunización se produjo en las semanas 0, 3 y 6. Se recogió sangre de cada grupo de ratones una vez a la semana después de la última inmunización. Se llevaron a cabo ELISA para medir los niveles de anticuerpos IgG e IgE específicos para E6 y E7 de VPH.
Como se muestra en la FIG: 7A, solo la inmunización conjunta con proIL-33 indujo significativamente la IgG total específica para E7, en comparación con otros grupos inmunizados. ***P < 0,001 en comparación con la construcción de ConE6E7 sola (prueba de la t de Student). No se indujeron o detectaron anticuerpos específicos contra E6 (datos no mostrados).
Además, se ha relacionado la IL-33 con respuestas alérgicas, que implican anticuerpos IgE. Por consiguiente, se midieron las respuestas de IgE específicas de E7 y de IgE total en sueros mediante ELISA. Como se muestra en las FIG. 7B y 7C, mtrIL-33 y proIL-33 no potenciaron los niveles de IgE en comparación con los grupos vacunados de control. El cambio de clase de IgE está impulsado por IL-4 y por lo tanto, esta falta de mejora fue consistente con la baja inducción de IL-4 que se muestra en la FIG. 2C y se describe en el ejemplo 3. Adicionalmente, una evaluación cuidadosa del sitio de vacunación con ADN no mostró una reacción cutánea alérgica detectable. Estos resultados respaldaron que los efectos del adyuvante de IL-33 en una situación de vacunación de ADN no indujeron respuestas asociadas con Th2.
En resumen, la combinación de antígeno y proIL-33 aumentó las respuestas humorales de IgG específicas de Ag, lo que resalta el papel de proIL-33 como adyuvante eficaz para potenciar las respuestas inmunitarias tanto mediadas por células como humorales específicas de Ag.
Ejemplo 10
Inmunidad antitumoral inducida por IL-33 y regresión de tumores establecidos
Dados los datos anteriores de que tanto proIL-33 como mtrIL-33 son adyuvantes eficaces que generaron respuestas inmunitarias de linfocitos T específicas para Ag de VPH sesgadas a Th1 y CD8, se usó un estudio de terapia para tumores in vivo para determinar la eficacia terapéutica de los adyuvantes de IL-33. En particular, el estudio de terapia para tumores in vivo examinó la capacidad de las vacunas que incluían o proIL-33 o mtrIL-33 como adyuvante para eliminar tumores o lesiones asociados con el VPH establecidos y para proteger frente a la formación de nuevos tumores o lesiones asociados con el VPH.
Para examinar la eliminación de tumores o lesiones establecidos, se implantaron células de tumores TC-1 que expresan E6/E7 de VPH16 (5x104) en ratones receptores B6 no expuestos previamente. Cuatro días después del implante de células TC-1, se midieron los tumores (los tumores habían alcanzado un tamaño medio de 3 mm) y se inmunizó a los grupos de ratones (n=10) con pVAX (5 1tg), ConE6E7 (5 pg) solo o ConE6E7 (5 1 tg) coadministrado con 7 pg de mtrIL-33 o proIL-33, seguido de dos refuerzos a intervalos de una semana como se describe en la FIG.
8A. Los ratones inmunizados con pVAX sirvieron como control negativo. Posteriormente, se midieron los tumores dos veces a la semana en dos dimensiones con calibres electrónicos y se representaron los datos con la media de estos valores con el paso del tiempo para cada ratón individual. Se sacrificó a los ratones cuando el diámetro tumoral alcanzó aproximadamente 2,0 cm.
La FIG. 8B muestra el tamaño medio del tumor en milímetros (mm) a lo largo del tiempo. Solo se muestran las mediciones del tumor para cada punto de tiempo para los ratones supervivientes. Se realizaron comparaciones por pares para los grupos de ratones en los días 7, 14, 21, 28 y 35 después del implante inicial del tumor y los valores de p se muestran a continuación en la tabla 1. 9 de los 10 ratones en los grupos con adyuvante de mtrIL-33 se encontraron libres de tumores a los 42 días después del implante inicial del tumor, mientras que los ratones vacunados con ConE6E7-proIL-33 (es decir, 10 de cada 10 ratones) indujeron la regresión completa de los tumores TC-1 establecidos (FIG. 8B).
Figure imgf000034_0001
continuación
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NS es no significativo.
Paralelamente, solo seis ratones en el grupo vacunado con pConE6E7 se encontraron libres de tumores después de 42 días y en el grupo de control, todos los ratones murieron antes del día 21. De manera significativa, los animales vacunados con ConE6E7 coinmunizados con mtrIL-33 o proIL-33 comenzaron a mostrar regresión de los tumores establecidos, antes de 10 días después de la primera inmunización, encontrándose la mayoría libres de tumores 17 días después de la primera inmunización (FIG. 8B). Por el contrario, los ratones que se trataron solo con ConE6E7 mostraron una regresión más lenta del tumor y solo 4 de cada 10 ratones se encontraban libres de tumor a los 17 días de la vacunación inicial. Los grupos de IL-33 permanecieron libres de tumores hasta el día 42, con la excepción de un ratón en el grupo de adyuvante de mtrIL-33. Además, el grupo de adyuvante de proIL-33 mostró una regresión tumoral completa a los 17 días después de la vacunación, que se correlacionó con el pico de expansión de linfocitos T CD8+ (14 días después de la vacunación) mediada por proIL-33 descrita anteriormente y en las FIG. 5A y 6. Estos datos indicaron que la inmunidad celular de linfocitos T CD8+ inducida por los adyuvantes mtrIL-33 y proIL-33 facilitó la regresión tumoral.
Para examinar la protección o la profilaxis contra nuevos tumores o lesiones, se inmunizó a grupos respectivos de ratones B6 (10 ratones por grupo) tres veces a intervalos de tres semanas con pVAX, solo construcción ConE6E7, la construcción ConE6E7 con la construcción proIL-33 y la construcción ConE6E7 con la construcción mtrIL-33. La inmunización con pVAX sirvió como control negativo. La dosificación de las construcciones mtrIL-33 y proIL-33 fue de 7 pg. Se expuso a los ratones a 5x104 células TC-1 una semana después de la última inmunización para evaluar la eficacia antitumoral o profiláctica de las vacunas. Como se muestra en la FIG. 9, las vacunas previnieron el crecimiento tumoral tras su implante, pero los ratones inmunizados con pVAX (el control negativo) murieron antes de 40 días después del implante. Tanto proIL-33 como mtrIL-33 mantuvieron y generaron respuestas de memoria antituomoral similares a ConE6E7.
Estos datos mostraron que ConE6E7 previno el crecimiento del tumor E6/E7, pero no causó la regresión tumoral tan eficazmente como cuando mtrIL-33 o proIL-33 era un adyuvante en la vacuna. Como adyuvante en la vacuna, mtrIL-33 y proIL-33 previnieron el crecimiento del tumor y causaron una regresión del 90 % y completa del tumor establecido, respectivamente. Aunque solo proIL-33 indujo inmunidad humoral (es decir, niveles de IgG aumentados, como se ha descrito anteriormente), tanto mtrIL-33 como proIL-33 indujeron (aumentaron) la inmunidad de linfocitos T CD4+, la inmunidad de linfocitos T CD8+ y los linfocitos T CD8+ citolíticos efectores que sufren desgranulación. Por consiguiente, estos datos juntos indicaron que debido a que tanto mtrIL-33 como proIL-33 proporcionaron niveles significativos de regresión tumoral, la protección antitumoral se proporciona por la inmunidad de linfocitos T inducida por la inclusión de proIL-33 y mtrIL-33 como adyuvantes en vacunas. En resumen, la inmunidad de linfocitos T específica del VPH inducida por los adyuvantes proIL-33 y mtrIL-33 proporcionó una inmunidad antitumoral protectora sustancial al retrasar e inducir rápidamente la regresión completa de los tumores TC-1 establecidos.
Ejemplo 11
Materiales y métodos para los ejemplos 12-15
Construcciones. La construcción de ADN que codifica IL-33 madura (mtrIL-33) se ha descrito anteriormente en el ejemplo 1. Las construcciones de ADN también incluyeron una construcción de VIH (ConC), una construcción de LCMV-GP y una construcción de TB Ag85B. Todas las construcciones tenían una secuencia líder de inmunoglobulina E (IgE) altamente eficaz insertada en el extremo 5' del gen. Las construcciones se sintetizaron y optimizaron.
Animales. Se adquirieron ratones C57BL/6 (H-2b) hembra de 8 semanas de edad de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).
Inmunizaciones de animales y tratamiento anti-CD122. Los ratones se inmunizaron una vez por vía intramuscular (i.m.) en el músculo tibial anterior. La electroporación (EP) in vivo se administró con el dispositivo de EP de corriente constante adaptativa CELLECTRA (Inovio Pharmaceuticals) en el mismo sitio inmediatamente después de la vacunación.
Los ratones se inmunizaron con 10 jtg de pVAX1 o 10 jtg de pLCMV-NP con o sin 11 jtg de la construcción de mtrIL-33. Tres semanas después de la inmunización inicial, se sacrificó a los ratones y se recogieron los esplenocitos para medir las respuestas inmunitarias.
La construcción de LCMV-GP (GP) se administró a 10 jtg. El agotamiento de las células CD122 se logró mediante la inyección s.c. de 20 jtg de anticuerpo monoclonal (mAb) anti-CD122 (AbD Serotec).
Para las inmunizaciones con VIH y TB, se inmunizó a los ratones tres veces a intervalos de dos semanas con 10 jtg de cada construcción (ConC, Ag85B) con o sin 11 jtg de mtrIL-33. Una semana después de la inmunización, se sacrificó a los ratones y se recogieron los esplenocitos para monitorizar las respuestas inmunitarias.
Todos los estudios se repitieron al menos dos veces.
Exposición a virus LCMV. Para los estudios de exposición letal, se expuso a ratones inmunizados, es decir, 21 días después de la vacunación inicial, con 20xDL50 o 40xDL50 de LCMV Armstrong en 30 pl de diluyente de virus (PBS con FBS al 20 % y 1X Anti-Anti (Invitrogen, Carlsbad, CA). Todos los ratones expuestos a LCMV se alojaron en una instalación de BSL-2 y se observaron diariamente durante 21 días.
Ensayo ELISPOT. Para ratones vacunados con ADN, se procesaron todos los bazos y se realizaron ensayos de ELISpot de IFN-y para determinar la secreción de citocinas específicas de antígeno. Los bazos se recogieron en medio RPMI 1640 (complementado con FBS al 10%, antibiótico-antimicótico 1X y p-ME 1X) y se aislaron los esplenocitos por rotura mecánica del bazo utilizando una máquina Stomacher (Seward Laboratory Systems, Bohemia, NY). Los bazos triturados resultantes se filtraron usando un colador de células de 40 pm, se trataron con tampón de lisis ACK durante 5 minutos para lisar los RBC, se lavaron en PBS y después se resuspendieron en medio RPMI para su uso en el ensayo de ELISpot o de citometría de flujo.
La medición de linfocitos T específicos de LCMV se evaluó estimulando esplenocitos con epítopo de LCMV inmunodominante del origen génico H-2b (DbNP396-404 (NP396)) o (DbGP33-41 (Gp 33)) (Invitrogen). Las respuestas de linfocitos T específicos de VIH se midieron usando péptidos agrupados (15 meros que se solapan en 9 aminoácidos; 2,5 pg/ml final). Las respuestas de linfocitos T específicos de Ag85B se midieron utilizando péptidos combinados (11 meros que se solapan en 8 aminoácidos; 2,5 pg/ml final) que abarca todo el antígeno Ag85B de TB. Todos los péptidos se sintetizaron por GenScript. Como control positivo, se usó concavalina A (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y como control negativo se usó medio de cultivo completo. Los puntos se enumeraron usando un lector ELISPOT automatizado (Cellular Technology, Shaker Heights, OH).
Citometría de flujo. Se aislaron y procesaron linfocitos de sangre periférica. Las células se tiñeron con CD8, CD44, CD62L, KLRG1, CD122 y tetrámero peptídico de MHC de clase I para LCMV-GP33 (KAVYNFATC (SEQ ID NO: 9)) (Beckman Coulter). La tinción intracelular de citocinas se realizó después de 5 horas (h) de estimulación ex vivo con cualquiera de los epítopos peptídicos de LCMV Dbnp396-404 o Dbgp33-41, péptidos agrupados de VIH y péptidos agrupados de Ag85B, dependiendo del estudio.
Se usaron los siguientes anticuerpos para la tinción superficial: kit de tinción de células muertas fijable violeta LIVE/DEAD (Invitrogen), CD4 (FIt C; clon RM4-5; eBioscience), CD8 (APC-Cy7; clon 53-6.7; BD Biosciences); CD44 (A700; clon IM7; Biolegend). Para la tinción intracelular, se usaron los siguientes anticuerpos: IFN-y (APC; clon XMG1.2; Biolegend), TNF-a (PE; clon MP6-XT22; eBioscience), CD3 (PerCP/Cy5.5; clon 145-2C11; Biolegend); IL-2 (PeCy7; clon JES6-SH4; eBioscience).
Todos los datos se recopilaron con un citómetro de flujo LSRII (BD Biosciences) y se analizaron con el software FlowJo (Tree Star, Ashland, OR) y SPICE v5.2 (disponible en los Institutos Nacionales de la Salud (NIH), específicamente, Los Institutos Nacionales de Alergias y Enfermedades Infecciosas (NIAID)). La selección booleana se realizó utilizando el software FlowJo para examinar la polifuncionalidad de los linfocitos T de los animales vacunados.
Ensayo de proliferación de linfocitos T. Se marcaron esplenocitos aislados de ratones B6 inmunizados 21 días después de la inmunización inicial con Cell Tracer Violet (Molecular Probes) y se pulsaron con péptido 10 pM durante 5 días. Se determinó la proliferación de linfocitos T CD8 usando citometría de flujo para evaluar la dilución de Cell T race Violet.
Análisis Estadístico. Los análisis de grupo se completaron mediante la prueba de t desapareada de dos colas emparejada y las curvas de supervivencia se analizaron mediante la prueba de rangos logarítmicos de Mantel-Cox. Para las muestras no igualmente distribuidas, se realizó una prueba no paramétrica de Mann-Whitney (FIG. 12E y 12F). Todos los valores son medias ± EEM y los análisis estadísticos se realizaron con GraphPad Prism (La Jolla, CA).
Ejemplo 12
IL-33 generó protección contra una exposición letal a LCMV
Como se ha descrito anteriormente, la IL-33 indujo respuestas de linfocitos T CD8+ tanto antivíricos como antitumorales cuando se administró en una vacuna y por lo tanto, la IL-33 sirvió como adyuvante en esta vacuna. Para seguir estudiando la protección proporcionada por la IL-33, cuando está presente en una vacuna, se usó el modelo de infección de LCMV (también conocido en el presente documento como el "modelo de exposición a LCMV i.c."). El modelo de infección de LCMV fue un modelo para respuestas de linfocitos T CD8+ específicos de virus en el contexto de protección provocada por la vacuna. La proteína estructural NP de LCMV era un componente y una diana para la inmunidad protectora contra LCMV debido a que no era una diana para anticuerpos neutralizantes.
En particular, se vacunó a tres grupos de ratones C57BL/6 (B6) (n=10/grupo) mediante electroporación (EP) una vez por vía intramuscular (i.m.) con l0 pg de plásmido de control de vector vacío (pVAX) o 10 pg de construcción de pLCMV-NP (NP) con o sin 11 pg de construcción de IL-33 madura (mtrIL-33). El vector vacío pVAX se usó como control negativo.
Se expuso a todos los animales 21 días después de la vacunación (dpv) por vía i.c. a una dosis 20xDL50 letal o de 40xDL50 letal de LCMV Armstrong (FIG. 11A). Se monitorizó la supervivencia animal 21 días después de la exposición. Los experimentos se realizaron al menos dos veces en experimentos independientes y los datos mostrados en la FIG.
11 fueron representativos del resultado.
Los animales vacunados con NP más mtrIL-33 mostraron protección completa, mientras que el grupo de solo NP logró tan solo un 60 % de protección (FIG. 11B). En la FIG. 11B, * < 0,05. Por el contrario, todos los animales vacunados con el control de pVAX sucumbieron a la infección. Por consiguiente, estos datos mostraron que los ratones inmunizados con la vacuna usando mtrIL-33 como adyuvante mostraron una tasa de supervivencia del 100 % para la exposición a LCMV.
Se completaron estudios adicionales para determinar si los ratones vacunados, que había recibido el adyuvante de mtrIL-33, estarían protegidos contra una dosis letal aún mayor de exposición a LCMV. Por lo tanto, se expuso a los ratones a una dosis de 40xDL50 de LCMV Armstrong, 21 días después de una sola vacunación (FIG. 11C). Los animales que recibieron una inmunización de NP más mtrIL-33 produjeron una protección significativa del 80 %, mientras que el grupo de solo NP solo confirió un 10 % de protección contra esta dosis altamente letal de LCMV (FIG.
11C). En la FIG. 11C, ** < 0,01.
En resumen, los datos anteriores demostraron que IL-33, cuando se incluye en la vacuna, proporcionó protección contra una exposición letal a LCMV.
Ejemplo 13
La IL-33 aumentó las respuestas de linfocitos T CD8+ específicos de LCMV
Para determinar si la protección descrita anteriormente contra la exposición a LCMV estaba mediada por la inducción de linfocitos T CD8+, se examinaron las respuestas de linfocitos T específicos de antígeno mediante el ensayo ELISPOT en ratones inmunizados. En particular, se inmunizó a grupos de ratones C57BL/6 (n = 4-5) por vía i.m. una vez con 10 pg de nucleoproteína (NP) con o sin 11 pg de mtrIL-33, seguido de electroporación. Los ratones que recibieron solo 10 pg de pVAX sirvieron como control negativo. Se recogieron esplenocitos 21 días después de la vacunación para evaluar las respuestas inmunitarias celulares. Específicamente, se midió la magnitud de respuestas inmunitarias específicas de NP 21 días después de la vacunación (dpv) en respuesta a la reestimulación con péptido usando el epítopo inmunodominante en el fondo genético de H-2b: DbNP396-40 (NP396). Los resultados de estos experimentos se muestran en la FIG. 12 como se describe con más detalle a continuación. En la FIG. 12, los datos se mostraron como el error estándar de la media (EEM) de dos experimentos independientes repetidos al menos de dos a tres veces. En la FIG. 12, *, P < 0,05; **, P < 0,01; y ***, P <0,001 en comparación con NP.
En comparación con los ratones vacunados solo con NP, la co-inmunización con el plásmido que codifica mtrIL-33 provocó respuestas de linfocitos T específicos de NP más fuertes en más de 2,5 veces (FIG. 12A). Los recuentos de ELISPOT de IFN-y fueron aproximadamente 2.500 células formadoras de puntos (SFC) por 106 esplenocitos en los ratones vacunados con IL-33 frente a aproximadamente 980 SFC/106 esplenocitos para el grupo de solo NP.
También se evaluó el perfil fenotípico y funcional de linfocitos T CD8+ inducidos por la vacuna en respuesta a la reestimulación con péptido NP396. Veintiún días después de la vacunación, se observó una diferencia significativa entre los grupos de vacuna en la frecuencia de linfocitos T CD8+ productores de citocinas efectoras (FIG. 12B y 12C). La vacuna NP coadministrada con mtrIL-33 provocó un mayor porcentaje de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno (Ag) que producen las tres citocinas (es decir, interferón-gamma (IFN-y), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a) e interleucina-2 (IL-2) (FIG. 12B) y un número significativo de estos linfocitos T CD8+ eran polifuncionales (FIG. 12C). En comparación con el grupo vacunado solo con NP, el grupo vacunado con NP+mtrIL-33 produjo frecuencias sustancialmente mayores de linfocitos T CD8+ específicos de NP que producían o solo IFN-y (NP, 1,3 %; NP+mtrIL-33, 2,3 %), IFN-Y+TNF-a+ dual (NP, 0,76 %; NP+mtrIL-33, 1,63 %), IFN-Y+TNF-a+IL-2+ triple positivos (NP, 0,20 %; NP+mtrIL-33, 0,43 %) en los bazos a los 21 dpv (FIG. 12C). En conjunto, la respuesta de linfocitos T CD8+ específicos de Ag potenciada inducida por IL-33 era indicativa de la capacidad de IL-33 para proporcionar una protección sustancial contra la exposición a LCMV.
También se examinó en estos estudios el potencial citotóxico de los linfocitos T CD8+ inducidos por la vacuna. Los linfocitos T CD8+ aislados de ratones vacunados con mtrIL-33 mostraron una frecuencia significativamente mayor de desgranulación específica de antígeno (IFN-Y+CD107a+: 2,5%) en comparación con los ratones vacunados solo con NP (IFN-Y+CD107a+: 1,2%) (FIG. 12D).
Adicionalmente, se evaluó la capacidad proliferativa de los linfocitos T CD8+ monitorizando la dilución de Cell Trace Violet en esplenocitos aislados de ratones a los 21 dpv y se les volvió a exponer in vitro a reestimulación con péptido NP396. La FIG. 12E muestra que los ratones vacunados con mtrIL-33 experimentaron una mayor proliferación de linfocitos T CD8+ específicos de Ag, que era aproximadamente 2 veces mayor que el grupo de control de NP. También hubo un enriquecimiento de linfocitos T CD8+ efectores de memoria (CD44+CD62L') en el grupo vacunado con adyuvante (FIG. 12F). Tomados en conjunto, la inclusión de mtrIL-33 provocó niveles robustos de inmunidad de linfocitos T específicos para NP y potenció las respuestas inmunitarias de linfocitos T CD8+.
Para examinar más a fondo la inducción de linfocitos T CD8+ específicos de Ag durante el transcurso de la vacunación, se estudió la capacidad de mtrIL-33 para expandir la población de linfocitos T CD8+ efectores de memoria específicos de Ag. En estos estudios, se empleó el tetrámero de clase I del MHC DbGP33-41 para efectuar un seguimiento de los linfocitos T CD8+ específicos de Ag a medida que se desarrollaron después del cebado inicial. En particular, Los ratones C57BL/6 (n = 4-8) se vacunaron una vez con 10 |jg de una vacuna de ADN de glucoproteína LCMV-GP (GP) de LCMV con o sin mtrIL-33. La población de linfocitos T CD8 específicas de antígeno se monitorizó durante el transcurso de la vacunación. En particular, la frecuencia de linfocitos T CD8+ específicos para DbGP33 se monitorizó en la sangre periférica durante el transcurso de la vacunación con o sin mtrIL-33 (FIG. 14A). En el día 21, se recogieron los bazos (n = 4) y se monitorizaron las respuestas específicas de antígeno ex vivo con péptido GP33. Los resultados de estos experimentos se muestran en la FIG. 13 como se describe más adelante en más detalle. En la FIG. 13, los datos se mostraron como el EEM de dos experimentos independientes repetidos al menos dos veces. En la FIG. 13, *, P < 0,05 y **, P < 0,01.
La inclusión de mtrIL-33 en la vacuna resultó en una expansión del número linfocitos T CD8+ específicos de tetrámero DbGP33 en la sangre periférica (FIG. 13A). En la FIG. 13A, las células se clasificaron en linfocitos T CD9+CD44+ vivos. En los linfocitos de sangre periférica (PBL), la frecuencia de linfocitos T CD8+ específicos de GP33 fue 2 veces mayor a los 18 y 21 dpv en comparación con el grupo no adyuvado (FIG. 13A). La inclusión de mtrIL-33 en la vacuna también aumentó el número de linfocitos T CD8+ específicos de GP33 en el bazo a los 21 dpv (FIG. 13B) y de linfocitos T CD8+ específicos de Ag que secretan IFN-y, que sufren desgranulación y que expresan el factor de transcripción T-bet (FIG. 13C, 13D, 13E y 13F).
Adicionalmente, se reforzó a todos los ratones con la construcción de GP solo (21 días después de la inmunización inicial) para cuantificar las respuestas de recuerdo específicas de Ag. En comparación con el grupo de control, el grupo vacunado con mtrIL-33 aumentó significativamente los linfocitos T CD8+ específicos de Ag. En el grupo inmunizado con mtrIL-33, los linfocitos T específicos de tetrámero GP33 fueron aproximadamente 3 veces mayores comenzando a los 3 días después de la vacunación de refuerzo (d24) en comparación con el grupo vacunado con NP (FIG. 13A). Esta diferencia en la amplificación de los linfocitos T CD8+ específicos de GP33 se siguió observando 10 días después del refuerzo con ADN (d31). De acuerdo con la FIG. 12, estos datos confirmaron además la capacidad de la IL-33 para inducir una rápida expansión y proliferación de linfocitos T CD8+ específicos de Ag. Por consiguiente, la IL-33 aumentó significativamente la inmunidad de linfocitos T CD8+ específicos de LCMV contra dos proteínas víricas separadas, es decir, NP y GP.
En resumen, los datos anteriores demostraron que la frecuencia de la respuesta de linfocitos T CD8+ aumentó significativamente cuando mtrIL-33 era un adyuvante en la vacuna. Esta respuesta de linfocitos T CD8+ aumentada era específica de antígeno y dio como resultado una producción aumentada de las citocinas IFN-y, TNF-a e IL-2. Adicionalmente, se observaron frecuencias aumentadas de linfocitos T CD8+ polifuncionales (es decir, IFN-Y+TNF-a+ e IFN-y+TNF -a+IL-2+) cuando mtrIL-33 era un adyuvante en la vacuna. Esta respuesta aumentada de linfocitos T CD8+ también indujo una frecuencia significativamente mayor de desgranulación específica de antígeno cuando mtrIL-33 era un adyuvante en la vacuna. Los datos anteriores también demostraron que la expansión de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno, incluyendo linfocitos T CD8+ efectores de memoria, aumentó cuando mtrIL-33 era un adyuvante en la vacuna. Conjuntamente, estos datos indicaron además la capacidad de mtrIL-33 para actuar como un adyuvante eficaz, a saber, induciendo inmunidad de linfocitos T CD8+.
Ejemplo 14
IL-33 impulsó la diferenciación de un subconjunto de linfocitos T CD8+ KLRG1 y previno la diferenciación de linfocitos T CD8+CD122+ reguladores
La inmunidad protectora contra patógenos invasores puede estar mediada por linfocitos T CD8+ efectores de memoria. Los linfocitos T de memoria de fenotipo efector (Teff) pueden mediar la eliminación de patógenos transportador por la sangre. CD44 y KLRG1 son marcadores de expresión de diferenciación celular de Teff y por lo tanto, se expresan en linfocitos T CD8+ activados y de memoria, pero no en linfocitos T CD8+ vírgenes. Como se ha descrito anteriormente, la inclusión de IL-33 en la vacuna indujo la expansión y proliferación de linfocitos T CD8+ específicos de antígeno. Como se detalla a continuación, se realizaron estudios para examinar la capacidad de IL-33 para promover la diferenciación de la memoria en los subconjuntos de linfocitos T CD8+ específicos de Ag inducidos durante el transcurso de la vacunación (FIG. 14 y 15). En particular, se examinaron en primer lugar los marcadores CD44 y KLRG1 para determinar si la inclusión de IL-33 en la vacuna indujo la diferenciación de células Teff (FIG. 14A).
Se inmunizó a ratones C57BL/6 (n = 4-8) una vez con 10 |jg de plásmido de GP con o sin 11 |jg de construcción de mtrIL-33 y se les reforzó solo con GP a los 21 días después de la vacunación inicial. Las respuestas específicas de antígeno en la sangre se monitorizaron como se indica en la FIG. 14A. En la FIG. 14, los experimentos se repitieron dos veces. En la FIG. 14, *, P < 0,05; **, P < 0,01; y ***, P < 0,001.
La administración de mtrIL-33 dio como resultado una expansión significativa en los porcentajes de células CD8+KLRG1+Teff en los PBL, en comparación con el grupo vacunado con solo GP (FIG. 14b ). En la FIG. 14B, la población se clasificó para DbGp33+CD8+CD44+KLRG1+. La respuesta de recuerdo de linfocitos T CD8+KLRG1 específicos para tetrámero DbGP33 después del refuerzo con a DN-GP también se evaluó 21 días después de la inmunización inicial. Se observó una expansión marcada de linfocitos T CD8+KLRG1+ de memoria específicos para GP33 en ambos grupos después del refuerzo; sin embargo, la proporción de linfocitos T CD8+KLRG1+ se mantuvo significativamente mayor en el grupo de adyuvante de mtrIL-33 (FIG. 14B).
Se examinó la capacidad de mtrIL-33 para alterar la diferenciación del subconjunto de linfocitos T CD8+CD122+ porque esta población puede tener una función reguladora y suprimir las respuestas inmunitarias inducidas por la vacuna. Como tal, la expansión de dicha población supresora de linfocitos T CD8+ puede ser un inconveniente para las estrategias de vacunación.
La cinética del subconjunto de linfocitos T específicos DbGP33+CD8+CD122+ inducidos por la vacuna durante el transcurso de la vacunación en PBL reveló una diferencia sorprendente (FIG. 15A). Los ratones vacunados solo con GP indujeron mayores respuestas de linfocitos T CD8+CD122+ específicos para tetrámero de DbGP33 durante el transcurso de la vacunación, en comparación con el grupo tratado con GP+mtrIL-33. Cada grupo tenía 4-8 ratones. La frecuencia de linfocitos T CD8+CD122+ específicos para GP33 en el grupo de GP fue aproximadamente 3 veces mayor partiendo del día 14 dpv en comparación con el grupo tratado con mtrIL-33 (FIG. 15A). La inclusión de mtrIL-33 en la vacuna mantuvo niveles bajos relativamente constantes del subconjunto de linfocitos T CD8+CD122+ específicos de tetrámero durante el transcurso de la vacunación. Como tal, La inclusión de mtrIL-33 en la vacuna suprimió la expansión de linfocitos T reguladores CD122+CD8+, lo que a su vez, aumentó la respuesta inmunitaria inducida por la vacuna.
En la FIG. 15, los datos mostrados fueron los resultados de tres experimentos independientes repetidos dos veces. En la FIG. 15, *, P < 0,05; **, P < 0,01; y ***, P < 0,001.
Cuando se examinó la funcionalidad de este subconjunto de linfocitos T CD8+CD122+ específicos para GP a los 21 dpv en el bazo, los linfocitos T CD8+CD122+ específicos de Ag no fueron capaces de producir IFN-y (FIG. 15B) tras la reestimulación con péptido GP33. De forma similar, los linfocitos T CD8+CD122+ específicos de NP secretaron poca cantidad de IFN-y en comparación con el subconjunto de linfocitos T CD8+KLRG1+ específicos de NP u otros linfocitos T CD8+ específicos de Ag no caracterizados (FIG. 15C). Como tal, los linfocitos T CD8+KLRG1+ específicos de NP indujeron IFN-y, pero no los linfocitos T CD8+CD122+ reguladores. Por consiguiente, la inclusión de mtrIL-33 en la vacuna alteró significativamente la población reguladora CD8+CD122+. Por lo tanto, la modulación de la población CD8+CD122+ reguladora fue un mecanismo mediante el cual mtrIL-33 aumentó las respuestas de linfocitos T CD8+ inducidos por la vacuna.
Para examinar más a fondo esta modulación, se llevaron a cabo estudios para determinar si el agotamiento de linfocitos T reguladores CD8+CD122+ podría potenciar las respuestas específicas de Ag en el grupo vacunado con GP de un modo similar a la administración de mtrIL-33. En particular, se vacunó a dos grupos de ratones C57BL/6 (n=4 por grupo) con ADN que codificada solo el antígeno GP. Se inyectó anticuerpo monoclonal (mAb) anti-CD 122 (20 |jg) por vía intraperitoneal (i.p.) en un grupo de ratones en los días 3, 6, 9 y 12 después de una sola vacunación (FIG. 16A). El mAb anti-CD122 se usó para agotar CD122. El otro grupo de ratones no recibió el mAb anti-CD 122 y, por lo tanto, sirvió como control. Se sacrificó a los ratones a los 14 dpv y se recogieron los bazos para evaluar la expresión de CD8 y CD122. Los resultados de estos experimentos se muestran en la FIG. 16 y se describen más adelante en más detalle. En la FIG. 16, los datos se mostraron como los resultados de un representante de cada dos.
El agotamiento de CD122 dio como resultado la eliminación de los linfocitos T CD8+CD122 en ratones tratados con mAb anti-CD 122 (FIG. 16B). En la semana 2 después de la vacunación, los ratones en los que se agotó CD122 mostraron un aumento pronunciado en el número de linfocitos T CD8 específicos para DbGP33+ en el bazo, en comparación con linfocitos T CD8+ específicos de Ag en el grupo de control (FIG. 16C). Como tal, el agotamiento de linfocitos T CD8+CD122+ reguladores mediante la administración in vivo del mAb anti-CD 122 dio como resultado un aumento en las respuestas inmunitarias inducidas por la vacuna, de un modo similar a la coadministración del adyuvante de mtrIL-33, como se muestra en la FIG. 13.
En resumen, estos datos indicaron la capacidad de mtrIL-33 para prevenir la diferenciación o expansión de estos linfocitos T reguladores, es decir, el subconjunto de linfocitos T CD8+CD122+. Dicha reducción fue otro mecanismo mediante el cual mtrIL-33 facilitó la inmunidad antivírica.
Los ejemplos 12, 13 y 14 demostraron que la coadministración de la construcción de mtrIL-33 no solo aumentó la magnitud de la formación de linfocitos T CD8+ específicos de NP396 formadores de puntos de IFN-y, sino que también mejoró su funcionalidad, aumentó el fenotipo citolítico de los linfocitos T CD8+ y su diferenciación efectora de memoria. Como se midió mediante ELISpot para IFN-y para el epítopo DbNP396-40 específico de linfocitos T CD8, la inclusión de mtrIL-33 indujo una respuesta 2,5 veces mayor en comparación con la inmunización solo con NP. Además, estos ejemplos demostraron que mtrIL-33 potenció las poblaciones de linfocitos T CD8+ polifuncionales que secretan IFN-Y+TNF-a+IL2+, IFN-Y+TNF-a+ e IFN-Y+ y provocaron una mayor desgranulación citolítica de CD8+ específica de Ag (FIG.
12). Estos datos concordaron con los estudios de los ejemplos 1-10 acerca de que IL-33 (de las formas tanto proIL-33 como mtrIL-33) aumentaron la respuesta inmunitaria mediada por células específicas de Ag cuando se coadministraron con una vacuna de ADN.
Además, de acuerdo con los estudios de los ejemplos 1-10, se demostró en los estudios de los ejemplos 12-14 que mtrIL-33, al igual que proIL-33, inducen una amplificación significativa de respuestas de linfocitos T GP33+CD8+ en la sangre en respuesta a la vacunación. Como tal, la IL-33 moduló la expresión de linfocitos T CD8+.
Estos estudios de los ejemplos 12-14 también demostraron que las respuestas de recuerdo secundario después del refuerzo provocaron una rápida expansión de linfocitos T CD8+KLRG1+ específicos de tetrámero en comparación con el grupo vacunado solo con GP (FIG. 13A). Esta diferencia y la rápida respuesta de recuerdo de los linfocitos T CD8+ efectores de memoria específicos de Ag 8 días después del refuerzo concordaron con la capacidad de IL-33 para proporcionar un efecto adyuvante y mediar la protección antivírica, como se muestra en la FIG. 11. En general, estos resultados demostraron que la inclusión de IL-33 como adyuvante promovía la inmunidad antiviral mediante la inducción de linfocitos T efectores de memoria que iniciaron la función efectora inmediata.
Adicionalmente, estos ejemplos demostraron que el agotamiento de los linfocitos T reguladores CD8+CD122+ aumentó las respuestas de linfocitos T CD8+ específicos de tetrámero (FIG. 16C), lo que indicó que el aumento en la expansión de linfocitos T CD8+ específicos de Ag y la función en los ratones vacunados con IL-33 estaban relacionados con la prevención de la expansión de linfocitos T reguladores CD8+CD122+.
Ejemplo 15
Respuestas mediadas por linfocitos T específicas de VIH y TB aumentadas por IL-33
Para determinar si el adyuvante mtrIL-33 potenciaba la potencia vacunar para otros patógenos que requieren respuestas de linfocitos T tanto TH1 como CD8+, se evaluaron las respuestas mediadas por linfocitos T específicos de Ag de mtrIL-33 coadministrado con un antígeno de ADN de VIH o TB (FIG. 17 y 18). Se vacunó a ratones C57BL/6 (n = 4-5) tres veces por vía intramuscular (i.m.) a intervalos de dos semanas con 10 jg del clado C de VIH consenso (ConC) o el antígeno 85B de TB (Ag85B) proporcionado solo o en combinación con 11 jg de mtrIL-33, seguido de EP. Una semana después de la inmunización final, se sacrificó a los ratones y se procesaron los bazos. Las respuestas inmunitarias específicas de antígeno se midieron usando células procedentes de estos bazos.
De manera coherente con los hallazgos en el modelo de LCMV (FIG. 12A, 12B y 12C), la inclusión de mtrIL-33 en la vacuna mejoró el número de linfocitos T secretores de IFN-y específicos para VIH y TB (ConC, aproximadamente 3.800 SFC; Ag85B, aproximadamente 1.062 SFC) cuando se comparó con los grupos sin adyuvante (ConC, aproximadamente 2.300 SFC; Ag85B, aproximadamente 333 SFC), respectivamente (FIG. 17A y 18A).

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Una vacuna que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno y una secuencia de ácido nucleico que codifica IL-33, en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica IL-33 comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: una secuencia de nucleótidos como se expone en la SEQ ID NO: 1 y una secuencia de nucleótidos como se expone en la SEQ ID NO: 3.
2. La vacuna de la reivindicación 1, en donde el antígeno está codificado por un primer ácido nucleico y la IL-33 está codificada por un segundo ácido nucleico, que comprende además opcionalmente un péptido antigénico con la misma secuencia de ácido nucleico codificada y un péptido de IL-33 con la misma secuencia de ácido nucleico codificada que la IL-33.
3. La vacuna de la reivindicación 1, en donde la IL-33 se selecciona entre el grupo que consiste en proIL-33 y mtrIL-33, opcionalmente en donde proIL-33 se codifica por una secuencia de nucleótidos como se expone en la SEQ ID NO: 3 o en donde mtrIL-33 está codificada por una secuencia de nucleótidos como se expone en la SEQ ID NO: 1.
4. La vacuna de la reivindicación 1, en donde el antígeno se selecciona entre el grupo que consiste en: un antígeno del virus del papiloma humano (VPH), un antígeno del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), un antígeno de la gripe, un antígeno de Plasmodium falciparum, un antígeno de Mycobacterium tuberculosis, un antígeno de coriomeningitis linfocítica (LCMV) y un fragmento de los mismos, opcionalmente en donde el antígeno de VPH se selecciona entre el grupo que consiste en: antígeno E6 de VPH16, antígeno E7 de VPH16 y una combinación de los mismos o en donde el antígeno del VIH se selecciona entre el grupo que consiste en: Env A, Env B, Env C, Env D, B Nef-Rev, Gag y cualquier combinación de los mismos,
o en donde el antígeno de la gripe se selecciona entre el grupo que consiste en: H1 HA, H2 HA, H3 HA, H5 HA, el antígeno BHA y cualquier combinación de los mismos o en donde el antígeno de Plasmodium falciparum incluye un antígeno de circumesporocito (CS) o en donde el antígeno de Mycobacterium tuberculosis se selecciona entre el grupo que consiste en: Ag85A, Ag85B, EsxA, EsxB, EsxC, EsxD, EsxE, EsxF, EsxH, EsxO, EsxQ, EsxR, EsxS, EsxT, EsxU, EsxV, EsxW y cualquier combinación de los mismos,
o en donde el antígeno de LCMV se selecciona entre el grupo que consiste en: nucleoproteína (NP), glucoproteína (GP) y una combinación de los mismos.
5. La vacuna de la reivindicación 1, que además comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable.
6. La vacuna de la reivindicación 2, en donde el segundo ácido nucleico comprende además un vector de expresión.
7. La vacuna de la reivindicación 1 para su uso en un método para aumentar una respuesta inmunitaria en un sujeto que lo necesite.
8. La vacuna para el uso de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la vacuna es para su administración por electroporación.
9. La vacuna para el uso de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la respuesta inmunitaria en el sujeto aumenta en al menos aproximadamente 2 veces o al menos aproximadamente 4 veces.
10. La vacuna para el uso de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el aumento de la respuesta inmunitaria en el sujeto incluye aumentar una respuesta inmunitaria celular en el sujeto.
11. La vacuna de la reivindicación 1 para su uso en un método para tratar el cáncer en un sujeto que lo necesite.
12. La vacuna para el uso de acuerdo con la reivindicación 11, que además comprende reducir el tamaño tumoral en el sujeto o que además comprende aumentar la regresión tumoral en el sujeto.
13. La vacuna para el uso de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el cáncer se selecciona entre el grupo que consiste en: un cáncer asociado con el VPH, un cáncer asociado con el VHB, un cáncer de ovario, un cáncer de próstata, un cáncer de mama, un cáncer de cerebro, un cáncer de cabeza y cuello, un cáncer de garganta, un cáncer de pulmón, un cáncer de hígado, un cáncer del páncreas, un cáncer de riñón, un cáncer de hueso, un melanoma, un cáncer metastásico, un cáncer asociado a hTERT, un cáncer asociado al antígeno FAP, un cáncer de pulmón no microcítico, un cáncer hematológico, un carcinoma escamocelular del esófago, un cáncer de cuello uterino, un cáncer de vejiga, un cáncer colorrectal, un cáncer gástrico, un cáncer de ano, un carcinoma sinovial, un cáncer de testículo, una papilomatosis respiratoria recurrente, un cáncer de piel, un glioblastoma, un hepatocarcinoma, un cáncer de estómago, una leucemia mieloide aguda, un cáncer de mama triple negativo y un linfoma primario de linfocitos T cutáneos.
14. Una molécula de ácido nucleico que comprende una o más secuencias de nucleótidos seleccionadas entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 y una combinación de las mismas, opcionalmente en donde la molécula de ácido nucleico es un plásmido o uno o más plásmidos.
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