ES2731920T3 - Método para el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick - Google Patents

Método para el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick Download PDF

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Abstract

Un método para diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto, en donde el método comprende detectar un biomarcador en una muestra del sujeto, en donde el biomarcador es el compuesto 509, y en donde el compuesto 509 tiene la siguiente estructura:**Fórmula** en donde el grupo OH del grupo COOH puede estar disociado.

Description

DESCRIPCIÓN
Método para el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick
La presente invención hace referencia a un método para diagnosticar la enfermedad de Niemann-pick en un sujeto, a un método para determinar el curso de la enfermedad de Niemann-pick en un sujeto, un método para determinar la efectividad de al menos un tratamiento aplicado a un sujeto, al uso del análisis espectrométrico de masas para la detección de un biomarcador en el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-pick, y a un kit para determinar la presencia de un biomarcador en una muestra de un sujeto.
Las enfermedades de almacenamiento lisosómico, también denominadas en el presente documento como trastornos de almacenamiento lisosómico o TAL, son un grupo de trastornos metabólicos raros hereditarios que se producen a partir de defectos en la función lisosómica. Los TAL se producen cuando un orgánulo específico en las células del organismo - el lisosoma - funciona mal. Algunas de las enfermedades de almacenamiento lisosómico más destacadas son la enfermedad de Gaucher y la enfermedad de Fabry.
Los TAL están causados por la disfunción lisosómica, habitualmente como una consecuencia de la deficiencia de una única enzima requerida para el metabolismo de lípidos, glicoproteínas o los denominados mucopolisacáridos. Individualmente, los TAL tienen lugar con unas frecuencias de aproximadamente 1:10.000 a 1:250.000, sin embargo, como grupo la incidencia es de aproximadamente 1:5.000. La mayoría de estos trastornos son hereditarios autosómicos recesivos; sin embargo, unos pocos son hereditarios ligados al cromosoma X, tales como la enfermedad de Fabry y el síndrome de Hunter (MPS II).
Como otras enfermedades genéticas, los individuos habitualmente heredan las enfermedades de almacenamiento lisosómico de sus padres. Aunque cada trastorno es resultado de diferentes mutaciones genéticas que se traducen en una deficiencia en la actividad enzimática, todos ellos comparten una característica bioquímica común - casi todos los trastornos lisosómicos se originan a partir de una acumulación anormal de sustancias dentro del lisosoma. Las enfermedades de almacenamiento lisosómico afectan principalmente a niños, y estos a menudo mueren a una edad temprana e impredecible, muchos a los pocos meses o años de su nacimiento. Muchos otros niños mueren de esta enfermedad después de años de sufrir diversos síntomas de su trastorno en particular.
Los síntomas de la enfermedad de almacenamiento lisosómico varían, dependiendo del trastorno en particular y de otras variables como la edad de su aparición, y pueden ser de leves a graves. Pueden incluir retraso del desarrollo, trastornos del movimiento, convulsiones, demencia, sordera y/o ceguera. Algunas personas con enfermedad de almacenamiento lisosómico tienen hígados agrandados (hepatomegalia) y bazos agrandados (esplenomegalia), problemas pulmonares y cardiacos, y huesos que se desarrollan de forma anormal.
No hay curas de la causa de las enfermedades de almacenamiento lisosómico y el tratamiento es principalmente sintomático, aunque se ha utilizado el trasplante de médula ósea y la terapia de sustitución enzimática (TSE) para algunas indicaciones con una buena tasa de éxito. Además, se está realizando el trasplante de sangre del cordón umbilical en centros especializados para una serie de estas enfermedades. Además, la terapia de reducción de sustrato (TRS), un método utilizado para disminuir la acumulación del material de almacenamiento, se está evaluando actualmente para algunas de estas enfermedades. Además, la terapia de chaperonas, una técnica utilizada para estabilizar las enzimas defectuosas producidas por los pacientes, se está examinando para ciertos de estos trastornos. La terapia génica constituye una opción adicional para el tratamiento de estas enfermedades. La enfermedad de Niemann-Pick es una enfermedad de un subgrupo de los TAL, denominado esfingolipidosis o trastornos de almacenamiento de lípidos en los que cantidades nocivas de sustancias grasas, o lípidos, se acumulan en el bazo, hígado, pulmones, médula ósea, y cerebro.
La enfermedad de Niemann-Pick se hereda en un patrón autosómico recesivo, lo que significa que ambas copias, o alelos, del gen deben estar mutadas (alteradas de tal manera que su función esté afectada, en contraste con un polimorfismo, en el que la secuencia de nucleótidos está alterada pero no causa ninguna alteración funcional) para que una persona sea afectada por el trastorno. Con mayor frecuencia, los padres de un niño con un trastorno autosómico recesivo no están afectados sino que son portadores de una copia del gen alterado.
En 1961, se introdujo la siguiente clasificación:
Enfermedad de Niemann-Pick de tipo A: infantil clásica;
Enfermedad de Niemann-Pick de tipo B: visceral;
Enfermedad de Niemann-Pick de tipo C: subaguda/juvenil; y
Enfermedad de Niemann-Pick de tipo D: variante Nueva Escocia.
Ahora que la genética se entiende mejor, la condición puede ser clasificada de la siguiente forma:
Enfermedad de Niemann-Pick, asociada a SMPD1, que incluye los tipos A y B; y
Enfermedad de Niemann-Pick, de tipo C, que incluye los tipos C1 y C2 y Enfermedad de Niemann-Pick, de tipo D, que está causada por el mismo gen que el tipo C1.
Las mutaciones en el gen SMPD1 causan los tipos A y B de la enfermedad de Niemann-Pick, y las mutaciones en NPC1 y NPC2 causan la enfermedad de Niemann-Pick, de tipo C, a la que también se hace referencia en el presente documento como NPC.
El tipo D se separó originalmente del tipo C para definir un grupo de pacientes con trastornos por lo demás idénticos que compartían ascendencia común de Nueva Escocia. Se sabe actualmente que los pacientes en este grupo comparten una mutación específica en el gen NPC 1, y ahora se utiliza el término NPC para abarcar ambos grupos. En la variante infantil clásica de tipo A, una mutación de aminoácido (del inglés missense mutation) causa la completa deficiencia de esfingomielinasa. La esfingomielina es un componente de la membrana celular que incluye la membrana organular y de esta manera la deficiencia enzimática bloquea la degradación del lípido, lo que tiene como resultado la acumulación de esfingomielina dentro de los lisosomas en el linaje de fagocitos macrófagomonocito. Las células afectadas se agrandan, hasta 90 micrómetros de diámetro, como consecuencia de la distensión de lisosomas con esfingomielina y colesterol. La histología muestra macrófagos cargados de lípidos en la médula, además de “histiocitos azul marino” en la patología. Se crean numerosas vacuolas pequeñas de tamaño relativamente uniforme, que imparten una apariencia espumosa al citoplasma.
Niemann-Pick de tipo C es una enfermedad de almacenamiento lisosómico asociada con mutaciones en los genes NPC1 y NPC2. La enfermedad de Niemann-Pick de tipo C afecta a una cantidad estimada de 1:150,000 personas. Aproximadamente el 50% de casos se presenta antes de 10 años de edad, pero sus manifestaciones pueden reconocerse por primera vez tan tarde como en la sexta década.
Hasta la fecha, un diagnóstico definitivo de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C puede únicamente realizarse sometiendo unos fibroblastos cultivados a ensayo de esterificación de colesterol y a tinción con filipina para determinar el colesterol no esterificado. Los fibroblastos se cultivan a partir de una pequeña biopsia de piel tomada de un paciente sospechoso de padecer la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C junto con la confirmación genética. Debido a que numerosas mutaciones diferentes pueden ser la causa de una enfermedad de almacenamiento lisosómico en particular, la secuenciación de los genes NPC1 o NPC2 se aplica en la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C para confirmar el diagnóstico.
Aunque hay intentos de aplicar métodos de diagnóstico basados en anormalidades bioquímicas asociadas, hay una necesidad no satisfecha de un ensayo bioquímico sencillo que muestre la detección altamente específica y altamente sensible de dicha enfermedad de almacenamiento lisosómico en una etapa temprana, que monitorice la progresión de la enfermedad y que monitorice de forma temprana la eficacia de las terapias aplicadas.
Por lo tanto, la identificación de biomarcadores para la detección y diagnóstico precoz de la enfermedad de Niemann-Pick, enfermedad de Niemann-Pick de tipo A/B y/o enfermedad de Niemann-Pick de tipo C es muy prometedora para mejorar el resultado clínico de los pacientes. Es especialmente importante para los pacientes con síntomas imprecisos o sin síntomas o para detectar pacientes que no respondan a una terapia.
Un biomarcador debería ser técnicamente viable en muchas manos, fácil de medir; útil, con una magnitud relativa, consistente entre afectados y controles, o tratados y no tratados; fiable, y clínicamente preciso y seguro, y clasificable como fuertemente predictivo o pronóstico.
Actualmente, no se encuentra disponible ningún biomarcador para diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick, más en particular para diagnosticar de forma diferencial la enfermedad de Niemann-Pick de tipo A y B, y la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C.
En la enfermedad de Gaucher, otra EAL, se encontró que algunas enzimas lisosómicas, utilizadas como biomarcadores indirectos, estaban elevadas, incluyendo la fosfatasa ácida resistente al tartrato, la hexosaminidasa y una quitinasa humana, quitotriosidasa. Por tanto, hay intentos de monitorizar la reducción de las células de almacenamiento en tejidos mediante la medición de dichos marcadores de sustitución de las células de Gaucher como quitotriosidasa y CCL18 (C.E. Hollak et al., Marked elevation of plasma chitotriosidase activity. A novel hallmark of Gaucher disease, J. Clin. Invest. 93 (1994) 1288-1292; R.G. Boot et al., Marked elevation of the chemokine CCL18/PARC in Gaucher disease: a novel surrogate marker for assessing therapeutic intervention, Blood 103 (2004) 33-39). Sin embargo, además de otras desventajas en el uso de quitotriosidasa como un biomarcador para la enfermedad de Gaucher, dicha enzima se acumula independientemente de una relación directa con la patología de la enfermedad de Gaucher. Además, hasta el 35% de determinadas etnicidades demuestran un defecto de la codificación genética de la quitotriosidasa que tiene como resultado una actividad de quitotriosidasa reducida de forma artificial o no medible.
Se evaluó el uso de moléculas de almacenamiento primario como biomarcadores para la glucosilceramida (Gb1) en plasma de los pacientes con enfermedad de Gaucher y se comparó con el nivel de Gb1 en individuos sanos (Groener et al. Biochim Biophys Acta. 2008 En-Feb; 1781(1-2):72-8. Epub 5 de diciembre de 2007; Plasma glucosylceramide and ceramide in type 1 Gaucher disease patients: correlations with disease severity and response to therapeutic intervention; Groener JE et al.). No obstante, aunque la Gb1 medida en dicho estudio estaba aumentada en el plasma de dichos pacientes, dicho aumento de Gb1 no fue destacado y por tanto la especificidad y la sensibilidad del método fueron bajas, mostrando que la Gb1 no es aplicable como un biomarcador para la enfermedad de Gaucher.
Ya en 1989 Rosengren et al. (Lysosulfatide (galactosylsphingosine-3-O-sulfate) from metachromatic leukodystrophy and normal human brain, Rosengren B, Fredman P, Mansson JE, Svennerholm L.; J Neurochem. Abril de 1989; 52(4):1035-41) mostró que en las lipidosis no solo está afectado el catabolismo del esfingolípido principal, sino también su liso-compuesto. No obstante, dicho estudio concluyó que los liso-compuestos no juegan un papel clave en los mecanismos patogenéticos en las esfingolipidosis. Por tanto, dichos liso-compuestos no serían biomarcadores adecuados para el diagnóstico de las esfingolipidosis tales como la enfermedad de Gaucher.
Es importante señalar que hasta hoy no está disponible ningún uso de un biomarcador sumamente específico y sumamente sensible, y ningún método para el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick, en particular para el diagnóstico diferencial de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo A y B, enfermedad de Niemann-Pick de tipo C, y portador de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C, además de los métodos descritos anteriormente que muestran un límite de detección, sensibilidad y/o especificidad insatisfactorios, y por tanto demuestran no ser adecuados para la aplicación clínica, y métodos que no permiten el diagnóstico diferencial de diferentes tipos de enfermedad de Niemann-Pick de tipo A y B, y enfermedad de Niemann-Pick de tipo C.
Claire Rodriguez-Lafrasse y Marie T. Vanier (Neurochemical Research, vol. 24, no. 2, 1999, p. 199-205) describen una acumulación de esfingosilfosforilcolina en la enfermedad de Niemann-Pick de tipo A pero no en el tipo B.
Nixon G. F. et al. (Progress in Lipid Research, vol. 47 (2008), p. 62-75) analiza el papel multifuncional de la esfingosilfosforilcolina.
El documento US 2009/286272 A1 está relacionado con métodos para la selección o el diagnóstico de sujetos para determinar trastornos que implican la acumulación de uno o más oxiesteroles, tales como la acumulación citotóxica de oxiesterol, la enfermedad de Niemann-Pick (NPC), enfermedades de almacenamiento lisosómico, enfermedades por tráfico del colesterol y enfermedades neurodegenerativas.
Por consiguiente, hay una necesidad de un método rápido, sencillo y lo que es más importante fiable para el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick, en particular el diagnóstico diferencial de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo A y B, y la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C y portador de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C.
A la luz de lo anterior, el problema que subyace en la presente invención es proporcionar un método para el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick, en particular el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo A y B, y la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C y portador de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C. Un problema adicional que subyace en la presente invención es proporcionar un método para el diagnóstico diferencial de un primer grupo de la enfermedad de Niemann-Pick que consiste en la enfermedad de Niemann-Pick de tipo A y B, un segundo grupo de la enfermedad de Niemann-Pick que consiste en la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C y un tercer grupo de la enfermedad de Niemann-Pick que consiste en portador de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C.
Es aún un problema adicional que subyace en la presente invención, proporcionar un método que permita determinar si el sujeto sufre o no la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C, la enfermedad de Niemann-Pick de tipo A y B y/o es portador de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C, o si el sujeto está o no en riesgo de padecer la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C, la enfermedad de Niemann-Pick de tipo A y B y/o de ser portador de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C.
Un problema adicional que subyace en la presente invención es proporcionar un método para determinar el curso y el pronóstico de la enfermedad de enfermedad de Niemann-Pick de tipo C, en particular el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo A y B, y la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C y portador de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C.
Aún un problema adicional que subyace en la presente invención es proporcionar un método para determinar bastante rápidamente la efectividad de al menos un tratamiento aplicado a un sujeto que da positivo en una prueba para determinar si sufre o está en riesgo de desarrollar la enfermedad de Niemann-Pick, en particular la enfermedad de Niemann-Pick de tipo A y B o enfermedad de Niemann-Pick de tipo C y portador de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C.
Un problema adicional que subyace en la presente invención es proporcionar un método para determinar la efectividad de al menos un tratamiento aplicado a un sujeto que da positivo en una prueba para determinar si sufre o está en riesgo de padecer la enfermedad de Niemann-Pick, en particular la enfermedad de Niemann-Pick de tipo A y B y/o enfermedad de Niemann-Pick de tipo C y portador de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C.
Otro problema que subyace en la presente invención es proporcionar un biomarcador que permita el diagnóstico específico y sensible de la enfermedad de Niemann-Pick, en particular un diagnóstico específico y sensible de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo A y B, y la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C y portador de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C.
Aún otro problema adicional que subyace en la presente invención es un kit que comprende un compuesto que interactúa con un biomarcador que es específico y sensible para la enfermedad de Niemann-Pick, en particular para la enfermedad de Niemann-Pick de tipo A y B y/o la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C y portador de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C.
Estos y otros problemas se resuelven mediante la materia objeto de las reivindicaciones independientes adjuntas. Las realizaciones preferidas pueden tomarse a partir de las reivindicaciones dependientes adjuntas.
Más específicamente, el problema que subyace en la presente invención se resuelve en un primer aspecto mediante un método para diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto, en donde el método comprende detectar un biomarcador en una muestra del sujeto, en donde el biomarcador es el compuesto 509, y en donde el compuesto 509 tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000005_0001
en donde el grupo OH del grupo COOH puede estar disociado.
En una realización del primer aspecto, el método además comprende determinar el nivel del biomarcador presente en la muestra.
En una realización del primer aspecto, el nivel del biomarcador es indicativo de si el sujeto sufre o no de la enfermedad de Niemann-Pick o de si el sujeto está o no en riesgo de padecer la enfermedad de Niemann-Pick. De forma más específica, el problema que subyace en la presente invención se resuelve en un segundo aspecto mediante un método para determinar el curso de la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto, en donde el método comprende determinar en diversos puntos en el tiempo el nivel de un biomarcador presente en una muestra del sujeto, en donde el biomarcador es el compuesto 509, y en donde el compuesto 509 tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000005_0002
en donde el grupo OH del grupo COOH puede estar disociado.
De forma más específica, el problema que subyace en la presente invención se resuelve en un tercer aspecto mediante un método para determinar la efectividad de al menos un tratamiento aplicado a un sujeto que da positivo en cuanto a padecer o estar en riesgo de padecer la enfermedad de Niemann-Pick, en donde el método comprende detectar en diversos puntos en el tiempo el nivel de un biomarcador en una muestra del sujeto, en donde el biomarcador es el compuesto 509, y en donde el compuesto 509 tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000006_0001
en donde el grupo OH del grupo COOH puede estar disociado.
De forma más específica, el problema que subyace en la presente invención se resuelve en un cuarto aspecto mediante el uso de un análisis espectrométrico de masas para la detección de un biomarcador en el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick, en donde el biomarcador es el compuesto 509 que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000006_0002
en donde el grupo OH del grupo COOH puede estar disociado.
De forma más específica, el problema que subyace en la presente invención se resuelve en un quinto aspecto mediante un kit para determinar la presencia de un biomarcador en una muestra de un sujeto, en donde el kit comprende
a) un copartícipe de interacción del biomarcador, en donde el copartícipe de interacción es un anticuerpo;
b) opcionalmente un soporte sólido que comprende al menos un reactivo de captura unido al mismo, en donde el reactivo de captura enlaza el biomarcador; y
c) unas instrucciones para utilizar el soporte sólido para detectar el biomarcador, en donde el biomarcador es el compuesto 509 y en donde el compuesto 509 tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000006_0003
en donde el grupo OH del grupo COOH puede estar disociado.
En una realización del primer, segundo y tercer aspecto, el método comprende detectar al menos un biomarcador adicional en una o en la muestra del sujeto, preferiblemente el método comprende determinar el nivel de el al menos un biomarcador adicional en una o en la muestra del sujeto.
En una realización del primer, segundo y tercer aspecto, el al menos un biomarcador adicional es lisoesfingomielina libre.
En una realización del primer, segundo y tercer aspecto, el método además comprende determinar la relación del nivel del biomarcador en una o en la muestra al nivel del al menos un biomarcador adicional en una o en la muestra, en donde la relación del nivel del biomarcador al nivel del al menos un biomarcador adicional es indicativo de si el sujeto sufre o no de la enfermedad de Niemann-Pick o de si el sujeto está o no en riesgo de padecer la enfermedad de Niemann-Pick.
En una realización del primer, segundo y tercer aspecto, el biomarcador y/o el al menos un biomarcador adicional se detecta por medio de inmunoensayo, análisis espectrométrico de masas, matriz de biochip, ácidos nucleicos funcionales y/o un derivado fluorescente del biomarcador y/o un derivado fluorescente del al menos un biomarcador adicional.
En una realización del primer, segundo y tercer aspecto, el biomarcador es detectado por medio de análisis espectrométrico de masas, preferiblemente el análisis espectrométrico de masas se selecciona del grupo que comprende SELDI, MALDI, MALDI-Q TOF, MS/MS, TOF-TOF y ESI-O-TOF.
En una realización del primer, segundo, tercer y cuarto aspecto, la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que comprende la enfermedad de Niemann-Pick de tipo A y B, enfermedad de Niemann-Pick de tipo C, y portador de enfermedad de Niemann-Pick de tipo C.
En una realización del primer, segundo, tercer y cuarto aspecto el nivel del biomarcador es indicativo de si el sujeto sufre o no de la enfermedad de Niemann-Pick o de si el sujeto está o no en riesgo de padecer la enfermedad de Niemann-Pick.
En una realización del primer, segundo, tercer, cuarto y quinto aspecto, la muestra del sujeto es una muestra de un sujeto que ha sido tratado previamente para la enfermedad de Niemann-Pick o una muestra de un sujeto que ha sido diagnosticado previamente para la enfermedad de Niemann-Pick.
En una realización del primer, segundo, tercer, cuarto y quinto aspecto, la muestra del sujeto es una muestra de un sujeto que no ha sido tratado previamente para la enfermedad de Niemann-Pick o una muestra de un sujeto que no ha sido diagnosticado previamente para la enfermedad de Niemann-Pick.
En una realización del primer, segundo y tercer aspecto, el método comprende una etapa c), en donde la etapa c) comprende decidir aplicar, mantener, reducir, elevar o no aplicar una terapia basada en si el sujeto sufre la enfermedad de Niemann-Pick o está en riesgo de padecer la enfermedad de Niemann-Pick. En una realización del primer, segundo y tercer aspecto, el método comprende una etapa d), en donde la etapa d) comprende detectar el biomarcador en una muestra del sujeto después de que se haya aplicado, mantenido, reducido, elevado o no aplicado una terapia en la etapa c).
En una realización del primer, segundo y tercer aspecto, el método comprende una etapa e), en donde la etapa e) comprende determinar un nivel del biomarcador en la muestra del sujeto después de que una terapia se haya aplicado, mantenido, reducido, elevado o no aplicado en la etapa c).
En una realización del primer, segundo y tercer aspecto, el método comprende una etapa f), en donde la etapa f) comprende determinar si el nivel del biomarcador determinado en la etapa b) es inferior que el nivel del biomarcador determinado en la etapa e).
En una realización del primer, segundo y tercer aspecto, el método comprende una etapa g), en donde la etapa g) comprende decidir si, en base a la etapa f), una terapia va a aplicarse, mantenerse, reducirse, elevarse o no aplicarse.
En una realización del primer, segundo y tercer aspecto, el método comprende detectar al menos un biomarcador adicional en una o en la muestra del sujeto.
En una realización del primer, segundo y tercer aspecto, el método comprende determinar el nivel del al menos un biomarcador adicional en una o en la muestra del sujeto.
En una realización del primer, segundo y tercer aspecto, el al menos un biomarcador adicional es lisoesfingomielina. En una realización del primer, segundo y tercer aspecto, el método comprende determinar el nivel de lisoesfingomielina libre y el compuesto 509 en una o en la muestra.
En una realización del primer, segundo y tercer aspecto, el método comprende una etapa h), en donde la etapa h) comprende determinar la relación del nivel del biomarcador en una o en la muestra al nivel del al menos un biomarcador adicional en una o en la muestra.
En una realización del primer, segundo y tercer aspecto la relación del nivel del biomarcador al nivel del al menos un biomarcador adicional, preferiblemente según se determina en la etapa h), es indicativa de si el sujeto sufre o no la enfermedad de Niemann-Pick o de si el sujeto está o no en riesgo de padecer la enfermedad de Niemann-Pick. En una realización del primer, segundo y tercer aspecto, el método comprende detectar lisoesfingomielina libre y el compuesto 509 en una o en la muestra.
En una realización del primer, segundo y tercer aspecto, el análisis espectrométrico de masas comprende o utiliza MS/MS.
En una realización del primer, segundo y tercer aspecto, el método comprende precipitación de proteínas y/o HPLC. En una realización del primer, segundo y tercer aspecto, el método comprende precipitación de proteínas, HPLC y MS/MS.
En una realización del primer, segundo, tercer, cuarto y quinto aspecto el sujeto es un humano.
En una realización del primer, segundo y tercer aspecto, la etapa d) comprende detectar el biomarcador en una muestra que comprende someter la muestra a una etapa de precipitación de proteínas, precipitar proteínas de la muestra, proporcionar un sobrenadante de la muestra, someter al sobrenadante de la muestra a HPLC y MS/MS y determinar el nivel del biomarcador y/o el al menos un biomarcador adicional que está/están presente(s) en el sobrenadante de la muestra.
En una realización del primer aspecto, el método comprende las siguientes etapas:
i) añadir un patrón interno a una muestra del sujeto, en donde la muestra del sujeto se selecciona del grupo que comprende plasma, suero y sangre;
ii) mezclar opcionalmente la muestra que contiene el patrón interno;
iii) someter la muestra a una etapa de precipitación de proteínas, por la cual la proteína de la muestra se precipita y se proporciona un primer sobrenadante de la muestra;
iv) someter opcionalmente el primer sobrenadante de la muestra o al menos una parte del mismo, a una primera etapa de separación que proporciona un segundo sobrenadante, por lo que preferiblemente la primera etapa de separación es una etapa de centrifugado;
v) someter el primer sobrenadante y/o el segundo sobrenadante, o al menos una parte del mismo, a una segunda etapa de separación, en donde la segunda etapa de separación comprende inyectar al menos una parte del primer sobrenadante y/o al menos una parte del segundo sobrenadante en un sistema HPLC-MS/MS y utilizar una columna de HPLC con un gradiente de agua ácida a acetonitrilo/acetona; en donde la columna de HPLC es preferiblemente una columna de HPLC seleccionada del grupo que comprende una columna de HPLC C8 y una columna de HPLC C18, y en donde la segunda etapa de separación proporciona una muestra separada;
vi) someter la muestra separada a MS/MS, en donde la MS/MS comprende ionización por electrospray y monitorización de reacción múltiple;
y que comprende
una etapa a), en donde la etapa a) comprende detectar un biomarcador en una muestra del sujeto,
y opcionalmente
una etapa b), en donde la etapa b) comprende determinar un nivel del biomarcador presente en la muestra, en donde el biomarcador es el compuesto 509.
En una realización del primer aspecto, el método comprende las siguientes etapas:
i) añadir un patrón interno a una muestra del sujeto, en donde la muestra del sujeto se selecciona del grupo que comprende plasma, suero y sangre;
ii) mezclar opcionalmente la muestra que contiene el patrón interno;
iii) someter la muestra a una etapa de precipitación de proteínas, por la cual la proteína de la muestra se precipita y se proporciona un primer sobrenadante de la muestra;
iv) someter opcionalmente el primer sobrenadante de la muestra o al menos una parte del mismo a una primera etapa de separación que proporciona un segundo sobrenadante, por lo que preferiblemente la primera etapa de separación es una etapa de centrifugado;
v) someter el primer sobrenadante y/o el segundo sobrenadante, o una parte del mismo, a una segunda etapa de separación, en donde la segunda etapa de separación comprende inyectar al menos una parte del primer sobrenadante y/o al menos una parte del segundo sobrenadante en un sistema HPLC-Ms/MS y utilizar una columna de HPLC con un gradiente de agua ácida a acetonitrilo/acetona; en donde la columna de HPLC es preferiblemente una columna de HPLC seleccionada del grupo que comprende una columna de HPLC C8 y una columna de HPLC C18, y en donde la segunda etapa de separación proporciona una muestra separada;
vi) someter la muestra separada a MS/MS, en donde la MS/MS comprende ionización por electrospray y monitorización de reacción múltiple;
y que comprende
una etapa a), en donde la etapa a) comprende detectar un biomarcador en una muestra del sujeto, y detectar al menos un biomarcador adicional en una muestra del sujeto, y
una etapa b), en donde la etapa b) comprende determinar un nivel del biomarcador presente en la muestra y un nivel del al menos un biomarcador adicional presente en la muestra; y
una etapa c), en donde la etapa c) comprende determinar la relación del nivel del al menos un biomarcador adicional al nivel del biomarcador según se determina en la etapa b);
en donde si el nivel del biomarcador es inferior que o tan elevado como 0,031ng/ml esto es indicativo de que el sujeto no padece la enfermedad de Niemann-Pick;
en donde si el nivel del biomarcador es más elevado que 0,031ng/ml y es inferior que o tan elevado como 1,7ng/ml esto es indicativo de que el sujeto padece de ser portador de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C; y en donde si el nivel del biomarcador es más elevado que 1,7ng/ml esto es indicativo de que el sujeto padece la enfermedad de Niemann-Pick seleccionada del grupo que consiste en enfermedad de Niemann-Pick de tipo A o B y enfermedad de Niemann-Pick de tipo C; y
en donde si el nivel del biomarcador es más elevado que 1,7ng/ml, y la relación del nivel del biomarcador al nivel del al menos un biomarcador adicional es más elevada que 0,045 esto es indicativo de que el sujeto padece la enfermedad de Niemann-Pick de tipo A y B; y
en donde si el nivel del biomarcador es más elevado que 1,7ng/ml y la relación del nivel del biomarcador al nivel del al menos un biomarcador adicional es inferior que o tan elevado como 0,045 esto es indicativo de que el sujeto padece la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C; y
en donde el al menos un biomarcador adicional es lisoesfingomielina libre;
en donde el biomarcador es el compuesto 509.
En una realización del primer, segundo y tercer aspecto, el patrón interno comprende propionato de D5-fluticasona y/o liso-Gb2.
En una realización del primer aspecto, la etapa b), la etapa c) y/o la etapa e) comprende comparar el nivel del biomarcador en la muestra y/o el nivel del al menos un biomarcador adicional en la muestra y/o la relación del nivel del biomarcador al nivel del al menos un biomarcador adicional en la muestra del sujeto con un valor de corte.
En una realización del primer aspecto, en donde si el nivel del biomarcador en la muestra del sujeto es más elevado que el valor de corte, esto es indicativo de que el sujeto padece la enfermedad de Niemann-Pick o está en riesgo de padecer la enfermedad de Niemann-Pick.
En una realización del primer aspecto, en donde si la relación del nivel del biomarcador en la muestra del sujeto al nivel del al menos un biomarcador adicional en la muestra del sujeto es más elevado que el valor de corte, esto es indicativo de que el sujeto padece la enfermedad de Niemann-Pick o está en riesgo de padecer la enfermedad de Niemann-Pick.
En una realización del primer aspecto, en donde si la relación del nivel del biomarcador en la muestra es menor que el valor de corte, esto es indicativo de que el sujeto no padece o no está en riesgo de padecer la enfermedad de Niemann-Pick.
En una realización del primer aspecto, en donde si la relación del nivel del biomarcador al nivel del al menos un biomarcador adicional en la muestra del sujeto es inferior que el valor de corte, esto es indicativo de que el sujeto no padece o no está en riesgo de padecer la enfermedad de Niemann-Pick.
En una realización del primer aspecto, el valor de corte se selecciona de tal manera que una o la sensibilidad para diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto es preferiblemente de aproximadamente 98,5% a 100%, más preferiblemente 99,5% a 100%, y/o de tal manera que una o la especificidad para diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C en un sujeto es de 99,4% a 100%, preferiblemente 100%.
En una realización del primer aspecto, la etapa b) y/o la etapa c) comprende o comprenden que
un nivel del biomarcador en dicho sujeto y/o
un nivel del al menos un biomarcador adicional
se compara o se comparan
con un nivel del biomarcador y/o
con el nivel del al menos un biomarcador adicional
detectado en una muestra de un control;
y/o que
la relación del nivel del al menos un biomarcador adicional al nivel del biomarcador se compara
con la relación del nivel del al menos un biomarcador adicional al nivel del biomarcador detectado en una muestra de control.
En una realización del primer aspecto, la muestra de control es una muestra de un sujeto que ha dado un sujeto que no tiene la enfermedad de Niemann-Pick.
En una realización del primer aspecto, en donde si el nivel del biomarcador en la muestra del sujeto es más elevado que el nivel del biomarcador en la muestra de control, esto es indicativo de que el sujeto padece y/o está en riesgo de padecer la enfermedad de Niemann-Pick.
En una realización del primer aspecto, en donde si la relación del nivel del al menos un biomarcador adicional en la muestra del sujeto al nivel del biomarcador en la muestra del sujeto es más elevado que la relación del nivel del al menos un biomarcador adicional en la muestra de control al nivel del biomarcador en la muestra de control, esto es indicativo de que el sujeto padece y/o está en riesgo de padecer la enfermedad de Niemann-Pick.
En una realización del primer, segundo, tercer y cuarto aspecto, la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que comprende Niemann-Pick de tipo A o B, Niemann-Pick de tipo C, y portador de Niemann-Pick de tipo C. En una realización del primer, segundo, tercer, cuarto y quinto aspecto, la muestra del sujeto se selecciona del grupo que comprende sangre, un producto sanguíneo, orina, saliva, líquido cefalorraquídeo, heces, muestra de tejido y linfa.
En una realización del primer, segundo, tercer, cuarto y quinto aspecto, la muestra de la muestra del sujeto se selecciona del grupo que comprende sangre y un producto sanguíneo.
En una realización del primer, segundo, tercer, cuarto y quinto aspecto, el producto sanguíneo se selecciona del grupo que comprende suero y plasma.
En una realización del primer, segundo, tercer, cuarto y quinto aspecto, el método tiene un límite de detección de lisoesfingomielina libre de 0,04 ng/ml.
En una realización del primer aspecto, el método es para el diagnóstico de portador de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C y en donde el al menos un biomarcador adicional es lisoesfingomielina libre y el valor de corte es 6,5 ng/ml, y en donde la muestra del sujeto es preferiblemente suero o plasma.
En una realización del primer aspecto, el método es para el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C y en donde el al menos un biomarcador adicional es lisoesfingomielina libre y el valor de corte es 9,23 ng/ml, y en donde la muestra del sujeto es preferiblemente suero o plasma.
En una realización del primer aspecto, el método es para el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo A o B y en donde el al menos un biomarcador adicional es lisoesfingomielina libre y el valor de corte es 59 ng/ml, y en donde la muestra del sujeto es preferiblemente suero o plasma.
En una realización del primer aspecto, el método es para el diagnóstico de ser portador de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C y en donde el biomarcador es el compuesto 509 y el valor de corte es 0,031 ng/ml, y en donde la muestra del sujeto es preferiblemente suero o plasma.
En una realización del primer aspecto, el método es para el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C y en donde el biomarcador es el compuesto 509 y el valor de corte es 1,7 ng/ml, y en donde la muestra del sujeto es preferiblemente suero o plasma.
En una realización del primer aspecto, el método es para el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo A o B y en donde el biomarcador es el compuesto 509 y el valor de corte es 5,0 ng/ml, y en donde la muestra del sujeto es preferiblemente suero o plasma.
En una realización del primer aspecto, el método es para el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C y en donde la relación del nivel del compuesto 509 en la muestra del sujeto al nivel del biomarcador lisoesfingomielina libre en la muestra del sujeto, se compara con un valor de corte, y en donde el valor de corte es 0,087, y en donde la muestra del sujeto es preferiblemente suero o plasma.
En una realización del primer aspecto, el método es para el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo A o B y en donde la relación del nivel del compuesto 509 en la muestra del sujeto al nivel del biomarcador lisoesfingomielina libre en la muestra del sujeto, se compara con un valor de corte, y en donde el valor de corte es 0,045, y en donde la muestra del sujeto es preferiblemente suero o plasma.
En una realización del primer, segundo, tercer, cuarto y quinto aspecto, la sangre es sangre completa.
En una realización del primer, segundo, tercer, cuarto y quinto aspecto, la sangre completa se recoge en una tarjeta de filtro de sangre seca.
En una realización del segundo aspecto, el método comprende una etapa b), en donde la etapa b) comprende decidir aplicar, mantener, reducir, elevar o no aplicar una terapia en base a si el sujeto padece la enfermedad de Niemann-Pick o está en riesgo de padecer la enfermedad de Niemann-Pick.
En una realización del segundo aspecto, el método comprende una etapa c), en donde la etapa c) comprende detectar el biomarcador en una muestra del sujeto después de que una terapia haya sido aplicada, mantenida, reducida, elevada o no aplicada en la etapa b).
En una realización del segundo aspecto, el método comprende una etapa d), en donde la etapa d) comprende determinar un nivel del biomarcador en la muestra del sujeto después de que una terapia haya sido aplicada, mantenida, reducida, elevada o no aplicada en la etapa b).
En una realización del segundo aspecto, el método comprende una etapa e), en donde la etapa e) comprende determinar si el nivel del biomarcador determinado en la etapa a) es inferior que el nivel del biomarcador determinado en la etapa d).
En una realización del segundo aspecto, el método comprende una etapa f), en donde la etapa f) comprende decidir si en base a la etapa e) una terapia va a ser aplicada, mantenida, reducida, elevada o no aplicada.
En una realización del segundo aspecto,
En una realización del segundo aspecto, el método comprende detectar al menos un biomarcador adicional en la muestra del sujeto.
En una realización del segundo aspecto, el método comprende determinar el nivel del al menos un biomarcador adicional en la muestra del sujeto.
En una realización del segundo aspecto, el al menos un biomarcador adicional es lisoesfingomielina libre.
En una realización del segundo aspecto, el biomarcador es el compuesto 509 y el al menos un biomarcador adicional es lisoesfingomielina libre.
En una realización del segundo aspecto, el método comprende determinar el nivel de lisoesfingomielina libre y del compuesto 509.
En una realización del segundo aspecto, el método comprende
una etapa h), en donde la etapa h) comprende determinar la relación del nivel del biomarcador en la muestra del sujeto al nivel del al menos un biomarcador adicional en la muestra del sujeto.
En una realización del segundo aspecto, la relación del nivel del biomarcador al nivel del al menos un biomarcador adicional según se determina en la etapa h) es indicativa de si el sujeto padece o no la enfermedad de Niemann-Pick o de si el sujeto está o no en riesgo de padecer la enfermedad de Niemann-Pick.
En una realización del segundo aspecto, la etapa d) comprende detectar el biomarcador en una muestra que comprende someter la muestra a una etapa de precipitación de proteínas, precipitar proteínas de la muestra, proporcionar un sobrenadante de la muestra, someter el sobrenadante de la muestra a HPLC y MS/MS y determinar el nivel del biomarcador y/o el al menos un biomarcador adicional que está/están presente o presentes en el sobrenadante de la muestra.
En una realización del tercer aspecto, el método comprende
una etapa b), en donde la etapa b) comprende determinar en diversos puntos en el tiempo un nivel de un biomarcador y/o de al menos un biomarcador adicional presente en una muestra del sujeto.
En una realización del tercer aspecto, el método comprende
una etapa c), en donde la etapa c) comprende determinar la relación del nivel del biomarcador al nivel del al menos un biomarcador adicional según se determina en la etapa b).
En una realización del tercer aspecto, el al menos un biomarcador adicional es lisoesfingomielina libre.
En una realización del tercer aspecto, el biomarcador es el compuesto 509 y en donde el al menos un biomarcador adicional es lisoesfingomielina libre.
En una realización del tercer aspecto, el método comprende
una etapa d), en donde la etapa d) comprende aplicar, mantener, reducir, elevar o no aplicar al menos un tratamiento aplicado al sujeto en base a la reducción en el nivel del biomarcador y/o el al menos un biomarcador adicional según se determina en la etapa b) y/o la relación del nivel del biomarcador al nivel del al menos un biomarcador adicional según se determina en la etapa c).
En una realización del tercer aspecto, el método comprende
una etapa e), en donde la etapa e) comprende detectar el biomarcador y/o el al menos un biomarcador adicional en la muestra del sujeto, en donde la muestra ha sido tomada antes del comienzo del tratamiento después de aplicar, mantener, reducir, elevar o no aplicar al menos un tratamiento en la etapa d) y, opcionalmente determinar un nivel de un biomarcador y/o de al menos un biomarcador adicional presente en una muestra del sujeto, y opcionalmente determinar la relación del nivel del biomarcador al nivel del al menos un biomarcador adicional.
En una realización del tercer aspecto, el tratamiento se selecciona del grupo que comprende terapia de sustitución enzimática, terapia de reducción del sustrato, terapia de chaperonas, terapia génica, trasplante de células madre de saltos de ADN/ARN.
En una realización del tercer aspecto, el método comprende una etapa f), en donde la etapa f) comprende determinar si el nivel del biomarcador determinado en la etapa b) es inferior que el nivel del biomarcador determinado en la etapa e); y/o
determinar si el nivel del al menos un biomarcador adicional determinado en la etapa b) es inferior que el nivel del al menos un biomarcador adicional determinado en la etapa e); y/o determinar si la relación del nivel del biomarcador al nivel del al menos un biomarcador adicional según se determina en la etapa c) es inferior que la relación del nivel del biomarcador al nivel del al menos un biomarcador adicional según se determina en la etapa e).
En una realización del tercer aspecto, el método comprende
una etapa g), en donde la etapa g) comprende determinar, en base a la etapa f), si al menos un tratamiento va a ser aplicado, mantenido, reducido, elevado o no aplicado.
En una realización del tercer aspecto, la etapa de detectar el biomarcador en la muestra del sujeto comprende precipitar proteínas de la muestra del sujeto, en donde precipitar proteínas de la muestra proporciona un sobrenadante de la muestra; someter un volumen del sobrenadante a HPLC y MS/MS y determinar el nivel del biomarcador y/o el al menos un biomarcador adicional que está/están presentes en la muestra del sujeto.
En la realización del cuarto aspecto, la detección comprende el uso de HPLC.
En una realización del cuarto aspecto, el análisis espectrométrico de masas comprende o utiliza MS/MS.
En una realización del quinto aspecto, el kit es para
a) su uso en un método para diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick;
b) su uso en un método para determinar el curso de la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto; y/o
c) su uso en un método para determinar la efectividad de al menos un tratamiento aplicado a un sujeto, en donde preferiblemente el método de a), b) y/o c) es un método de acuerdo con la presente invención según se define en las reivindicaciones.
En una realización del primer, segundo, tercer y cuarto aspecto, en donde si el nivel del biomarcador en la muestra del sujeto es más elevado que 0,031ng/ml esto es indicativo de que el sujeto padece la enfermedad de Niemann-Pick;
en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que consiste en la enfermedad de Niemann-Pick de tipo A y/o B, enfermedad de Niemann-Pick de tipo C y portador de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C. En la realización del primer, segundo, tercer y cuarto aspecto, en donde si el nivel del biomarcador en la muestra del sujeto es más elevado que 0,031ng/ml y es inferior que o tan alto como 1,7ng/ml, esto es indicativo de que el sujeto padece la enfermedad de Niemann-Pick, en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que consiste en portador de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C.
En una realización del primer, segundo, tercer y cuarto aspecto, en donde si el nivel del biomarcador en la muestra del sujeto es más elevado que 1,7ng/ml esto es indicativo de que el sujeto padece la enfermedad de Niemann-Pick; en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Niemann-Pick de tipo A y/o B y enfermedad de Niemann-Pick de tipo C.
En una realización del primer, segundo, tercer y cuarto aspecto, en donde si el nivel del biomarcador en la muestra del sujeto es más elevado que 1,7ng/ml y es inferior que o tan alto como 5,0ng/ml, esto es indicativo de que el sujeto padece la enfermedad de Niemann-Pick, en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Niemann-Pick de tipo C.
En una realización del primer, segundo, tercer y cuarto aspecto, en donde si el nivel del biomarcador en la muestra del sujeto es más elevado que 5,0ng/ml, esto es indicativo de que el sujeto padece la enfermedad de Niemann-Pick; en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que consiste en la enfermedad de Niemann-Pick de tipo A y/o B.
En una realización del primer, segundo, tercer y cuarto aspecto, en donde si el nivel de lisoesfingomielina libre en la muestra del sujeto es más elevado que 6,5ng/ml, esto es indicativo de que el sujeto padece la enfermedad de Niemann-Pick;
en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Niemann-Pick de tipo A y/o B, enfermedad de Niemann-Pick de tipo C y portador de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C.
En una realización del primer, segundo, tercer y cuarto aspecto, en donde si el nivel de lisoesfingomielina libre en la muestra del sujeto es más elevado que 6,5ng/ml y es inferior que o tan alto como 9,23ng/ml, esto es indicativo de que el sujeto padece la enfermedad de Niemann-Pick, en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que consiste en portador de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C.
En una realización del primer, segundo, tercer y cuarto aspecto,
en donde si el nivel de lisoesfingomielina libre en la muestra del sujeto es más elevado que 9,23ng/ml, esto es indicativo de que el sujeto padece la enfermedad de Niemann-Pick;
en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Niemann-Pick de tipo A y/o B y enfermedad de Niemann-Pick de tipo C.
En una realización del primer, segundo, tercer y cuarto aspecto,
en donde si el nivel de lisoesfingomielina libre en la muestra del sujeto es más elevado que 9,23ng/ml y es inferior que o tan alto como 59ng/ml esto es indicativo de que el sujeto padece la enfermedad de Niemann-Pick, en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Niemann-Pick de tipo C. En una realización del primer, segundo, tercer y cuarto aspecto,
en donde si el nivel de lisoesfingomielina libre en la muestra del sujeto es más elevado que 59ng/ml esto es indicativo de que el sujeto padece de la enfermedad de Niemann-Pick;
en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Niemann-Pick de tipo A y/o B.
En una realización del primer, segundo, tercer y cuarto aspecto,
en donde si la relación del nivel del compuesto 509 en la muestra del sujeto al nivel de lisoesfingomielina libre es más elevado que 0,087 esto es indicativo de que el sujeto padece la enfermedad de Niemann-Pick;
en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Niemann-Pick de tipo C.
En una realización del primer, segundo, tercer y cuarto aspecto,
en donde si la relación del nivel del compuesto 509 en la muestra del sujeto al nivel de lisoesfingomielina libre es más elevado que 0,045 esto es indicativo de que el sujeto padece la enfermedad de Niemann-Pick;
en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Niemann-Pick de tipo A y/o B y enfermedad de Niemann-Pick de tipo C.
En una realización del primer, segundo, tercer y cuarto aspecto, en donde si la relación del nivel del compuesto 509 en la muestra del sujeto al nivel de lisoesfingomielina libre es más elevado que 0,045 y es inferior que o tan alto como 0,087, esto es indicativo de que el sujeto padece la enfermedad de Niemann-Pick, en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Niemann-Pick de tipo A y/o B.
Los presentes inventores han observado sorprendentemente que el compuesto 465, también denominado en el presente documento preferiblemente como lisoesfingomielina libre, constituye un biomarcador que permite un método para diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto, más específicamente diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto con alta especificidad y sensibilidad utilizando dicha lisoesfingomielina libre como el biomarcador.
Los presentes inventores también han observado sorprendentemente que el compuesto 509 constituye un biomarcador que permite un método para diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto, más específicamente diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto con alta especificidad y sensibilidad utilizando el compuesto 509 como el biomarcador.
Además, los presentes inventores también han observado sorprendentemente que la relación del nivel del compuesto 509 en una muestra de un sujeto al nivel del compuesto 465 en una, o preferiblemente la muestra del sujeto, ambas preferiblemente determinadas mediante los métodos de la presente invención, son adecuadas para el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C en un sujeto, más específicamente diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C en un sujeto con alta especificidad y sensibilidad.
En otras palabras, el compuesto 465 y el compuesto 509, respectivamente, constituyen biomarcadores que permiten un método para el diagnóstico diferencial de un primer grupo de la enfermedad de Niemann-Pick que consiste en enfermedad de Niemann-Pick de tipo A y B, un segundo grupo de la enfermedad de Niemann-Pick que consiste en enfermedad de Niemann-Pick de tipo C y un tercer grupo de la enfermedad de Niemann-Pick que consiste en ser portador de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C. De acuerdo con lo mismo, es posible distinguir un sujeto que pertenece, o que se supone que pertenece al primer grupo de la enfermedad de Niemann-Pick, de un sujeto que pertenece o se supone que pertenece al segundo grupo de la enfermedad de Niemann-Pick y/o al tercer grupo de la enfermedad de Niemann-Pick. De acuerdo con lo mismo, es también posible distinguir un sujeto que pertenece, o que se supone que pertenece, al segundo grupo de la enfermedad de Niemann-Pick, de un sujeto que pertenece o que se supone que pertenece al primer grupo de la enfermedad de Niemann-Pick y/o al tercer grupo de la enfermedad de Niemann-Pick. De acuerdo con lo mismo, es también posible distinguir un sujeto que pertenece, o que se supone que pertenece, al tercer grupo de la enfermedad de Niemann-Pick de un sujeto que pertenece o que se supone que pertenece al primer grupo de la enfermedad de Niemann-Pick y/o al segundo grupo de la enfermedad de Niemann-Pick.
La relación del nivel del compuesto 509 en una muestra de un sujeto, al nivel del compuesto 465 en una o en la muestra del sujeto permite distinguir la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo A y B. por consiguiente, es posible distinguir un sujeto que padece la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C de un sujeto que padece la enfermedad de Niemann-Pick de tipo A o de la de tipo B. También se encuentra dentro de la presente invención que la relación del nivel del compuesto 509 en una muestra de un sujeto, al nivel del compuesto 465 en una o en la muestra del sujeto permite determinar si un sujeto padece o no o está en riesgo de padecer la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C.
Los presentes inventores también han observado sorprendentemente que hay lisoesfingomielina libre, que puede detectarse por los métodos de la presente invención, circulando en la sangre de un sujeto en una concentración de aproximadamente 1/1000 de esfingomielina total. Más aún, los presentes inventores han observado sorprendentemente que, a diferencia de la esfingomielina total, la lisoesfingomielina libre que está presente en la sangre de un sujeto es útil en un método para diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto que comprende una etapa de detección de un biomarcador en una muestra del sujeto, en donde el biomarcador es lisoesfingomielina libre. Los presentes inventores también han observado sorprendentemente que el nivel de lisoesfingomielina libre determinado en la muestra de un sujeto por los métodos de la presente invención permite diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick con alta sensibilidad y alta especificidad.
En la medida de lo posible la presente invención se aleja de las descripciones de la técnica anterior en que el método de la presente invención comprende determinar el nivel de un liso-compuesto utilizando dicho lisocompuesto como un biomarcador para el diagnóstico de una esfingolipidosis. Más específicamente, los presentes inventores han observado sorprendentemente que determinar el nivel de lisoesfingomielina libre en una muestra de un sujeto permite el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick con alta sensibilidad y alta especificidad.
También es mérito de los presentes inventores el haber reconocido que una fracción de esfingomielina total que se acumula en la enfermedad de Niemann-Pick, está presente como una molécula en una forma liso libre de la misma, es decir lisoesfingomielina libre, y circula en la sangre de un sujeto en dicha forma liso libre además de la esfingomielina.
Además, los presentes inventores también han observado sorprendentemente que el compuesto 509, que puede ser detectado por los métodos de la presente invención, circula en la sangre de un sujeto. Más aún, los presentes inventores han observado sorprendentemente que el compuesto 509 que está presente en la sangre de un sujeto es útil en un método para diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto que comprende una etapa de detectar un biomarcador en una muestra del sujeto, en donde el biomarcador es el compuesto 509. Los presentes inventores también han observado sorprendentemente que el nivel del compuesto 509 determinado en la muestra de un sujeto mediante los métodos de la presente invención permite diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick con alta sensibilidad y alta especificidad.
En relación con la presente invención, se hace referencia a la concentración o el nivel del compuesto 509. Dicha concentración o nivel del compuesto 509 se determina preferiblemente como sigue a continuación. En los ajustes analíticos según se describe en la sección de los ejemplos en más detalle, se añade un patrón interno a la muestra que va a ser analizada. En el trascurso de dicho análisis se obtiene un cromatograma que indica como picos individuales los diversos compuestos detectados en la muestra. Los diversos compuestos incluyen, entre otros, el compuesto 509 y el patrón interno. Para determinar a partir de dicho cromatograma y los picos indicados en el mismo la concentración o el nivel del compuesto 509, se determina el área de pico del pico correspondiente al compuesto 509 y el área de pico del pico correspondiente al patrón interno. La relación del área de pico del pico correspondiente al compuesto 509 y el área de pico del pico correspondiente al patrón interno se determina posteriormente y se normaliza a la concentración del patrón interno añadido a la muestra que va a ser analizada. La concentración obtenida de este modo del compuesto 509 también se denomina en el presente documento como la concentración normalizada del compuesto 509.
En aquellas realizaciones de los métodos de la presente invención en las que se utiliza la concentración o el nivel del compuesto 509, ya sea como tal o cuando se calcula una relación que implica dicha concentración o nivel del compuesto 509, tal como dicha relación de la concentración del compuesto 509 en la muestra del sujeto a la concentración de lisoesfingomielina libre en la muestra del sujeto, la concentración del compuesto 509 es preferiblemente la concentración normalizada del compuesto 509.
El término “trastorno de almacenamiento lisosómico”, también denominado como “enfermedad de almacenamiento lisosómico” o “TAL”, tal como se usa en la presente memoria, preferiblemente hace referencia a enfermedades genéticas y trastornos metabólicos que son el resultado de defectos en la función lisosómica. Los trastornos de almacenamiento lisosómico están causados por una disfunción lisosómica, habitualmente como consecuencia de la deficiencia de una única enzima requerida para el metabolismo de lípidos, las glicoproteínas o los denominados mucopolisacáridos. Como otras enfermedades genéticas, los individuos heredan las enfermedades de almacenamiento lisosómico de sus padres. Aunque cada trastorno es el resultado de diferentes mutaciones genéticas que se traducen en una deficiencia en la actividad enzimática, todos comparten una característica bioquímica común - todos los trastornos lisosómicos se originan a partir de una acumulación anormal de sustancias en el interior del lisosoma.
La enfermedad de Niemann-Pick, también denominada en la presente memoria como NP, pertenece al grupo de enfermedades genéticas hereditarias autosómicas recesivas, que se clasifican en un subgrupo de TAL denominado esfingolipidosis o trastornos de almacenamiento de lípidos en los que cantidades nocivas de sustancias grasas, o lípidos, se acumulan en el bazo, hígado, pulmones, médula ósea, y cerebro. Dependiendo de la mutación de la proteína afectada, la enfermedad de Niemann-Pick se divide habitualmente en cuatro subgrupos, concretamente enfermedad de Niemann-Pick de tipo A, B, C y D, que también se denominan NPA en el caso de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo A, NPB en el caso de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo B, NPC en el caso de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C y NPD NPD en el caso de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo D, respectivamente. Por tanto, la enfermedad de Niemann-Pick tal como se utiliza en el presente documento comprende la enfermedad de Niemann-Pick de tipo A, enfermedad de Niemann-Pick de tipo B, enfermedad de Niemann-Pick de tipo C y enfermedad de Niemann-Pick de tipo D.
Que la enfermedad de Niemann-Pick se herede en un patrón recesivo autosómico significa que ambas copias, o alelos, del gen deben estar mutadas o alteradas de tal forma que su función esté afectada, en contraste con un polimorfismo, en el que la secuencia de nucleótidos está alterada pero no causa ninguna alteración funcional, para que una persona esté afectada por este trastorno. En la mayoría de los casos, los padres de un niño con un trastorno autosómico recesivo no están afectados sino que son portadores de una copia del gen alterado. Dicho portador se denomina en el presente documento como portador de la enfermedad de Niemann-Pick, por ejemplo portador de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C. Si ambos padres son portadores, existe una posibilidad del 25% de un niño afectado con cada embarazo. Se recomienda asesoramiento genético y análisis genético para las familias que pueden ser portadores de Niemann-Pick.
La NPA tiene un pronóstico extremadamente desfavorable con la mayoría de los casos, siendo fatal a la edad de 18 meses. La NPB y NPC poseen habitualmente un mejor pronóstico, con muchos pacientes con estos trastornos que viven hasta la adolescencia o la edad adulta.
La enfermedad de Niemann-Pick de tipo C es bioquímicamente, genéticamente y clínicamente distinta de la enfermedad de Niemann Pick de los tipos A o B.
Las mutaciones en el gen SMPD1 causan la deficiencia completa o parcial de una enzima denominada esfingomielinasa ácida que tiene como resultado la acumulación de la esfingomielina y que conduce a la NPA y NPB, respectivamente.
Aproximadamente el 95% de los casos de enfermedad de Niemann-Pick de tipo C, denominada en el presente documento preferiblemente como tipo C1 o NPC1, están causados por las mutaciones genéticas en el gen NPC1, mientras que el 5%, denominado en el presente documento preferiblemente como tipo 2 o NPC2, están causados por las mutaciones en el gen NPC2 (Mellon SH et al., Marzo de 2008. Brain research reviews 57 (2): 410-20).
En la NPC el producto proteico del principal gen mutado NPC1 no es una enzima, pero parece funcionar como una proteína transmembrana transportadora en el sistema endosómico-lisosómico, que desplaza grandes moléculas no solubles al agua a través de la célula. La proteína codificada por el gen NPC2 es una proteína soluble no enzimática que parece actuar en cooperación con la proteína NPC1 en el transporte de moléculas en la célula. La interrupción de este sistema de transporte da como resultado la acumulación de colesterol y glucolípidos en los lisosomas.
Las manifestaciones clínicas de NPC1 y NPC2 son similares porque los respectivos genes están ambos implicados en la salida de lípidos, en particular colesterol, de endosomas o lisosomas tardíos. El gen NPC1 está localizado en el cromosoma 18 (18q11-q12) (Zhang JR et al., Junio de 2008, The Journal of clinical investigation 118 (6): 2281-90). La NPD se separó originalmente de la NPC para definir un grupo de pacientes con trastornos por lo demás idénticos que compartían ascendencia común de Nueva Escocia. Se sabe actualmente que los pacientes en este grupo comparten una mutación específica en el gen NPC 1. En una realización de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C, la NPC comprende la n Pd . En una realización adicional de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C, la n Pc comprende la NPC1 y la NPC2.
Los individuos afectados por la NPC pueden mostrar síntomas que comprenden esplenomegalia, hepatomegalia o hepatoesplenomegalia, pero este descubrimiento puede estar ausente en casos de aparición más tardía. Puede presentarse ictericia prolongada o bilirrubina elevada en el nacimiento. En algunos casos, sin embargo, el agrandamiento del bazo y/o del hígado no tiene lugar durante meses o años - o nunca. El agrandamiento del bazo y/o del hígado frecuentemente se vuelve menos evidente con el tiempo, en contraste con la progresión de las otras TAL, tal como la NPA y la NPB o la enfermedad de Gaucher's. El alargamiento de un órgano no causa habitualmente complicaciones importantes.
La enfermedad neurológica progresiva es el signo distintivo de la NPC y es responsable de la discapacitación y la muerte prematura en todos los casos por encima de la infancia temprana. Los niños con NPC pueden presentar inicialmente debutan con retrasos en lograr las destrezas habituales de las etapas de desarrollo antes de manifestar deterioro cognitivo, es decir, demencia por ejemplo.
Entre los signos y síntomas neurológicos se incluyen ataxia cerebelosa, disartria, disfagia, tremor, epilepsia tanto parcial como generalizada, parálisis supranuclear vertical que comprende parálisis de la mirada hacia arriba, parálisis de la mirada hacia abajo, parálisis sacádica o parálisis, inversión del sueño, cataplexia gelástica, distonía, comienzan más comúnmente con el giro hacia dentro de un pie al caminar (distonía de acción) y puede extenderse hasta volverse generalizada, espasticidad, hipotonía, ptosis, microcefalia, psicosis, demencia progresiva, pérdida de audición progresiva, trastorno bipolar, depresión profunda y psicótica que puede incluir alucinaciones, delirios, mutismo, o estupor. En los estadios terminales de la NPC, el paciente queda postrado en cama, con oftalmoplejia completa, pérdida de movimientos voluntarios y tiene demencia severa.
Las sustancias acumuladas, colesterol y glucolípidos, tienen diversas funciones en la célula. El colesterol es un componente importante de las membranas plasmáticas de la célula, que define la célula en su conjunto y sus orgánulos. También es el bloque de construcción básico de las hormonas esteroides, incluyendo neuroesteroides. En la NPC, grandes cantidades de colesterol libre o no esterificado se acumulan en los lisosomas, y esto conduce a la relativa deficiencia de esta molécula en múltiples membranas y para la síntesis de esteroides. La acumulación de glucoesfingolípidos en el sistema nervioso ha sido vinculada con cambios estructurales, concretamente con dendritogénesis ectópica y la formación de meganeuritas.
La NPC se diagnostica sometiendo fibroblastos cultivados a ensayo de esterificación de colesterol y a tinción con filipina para determinar el colesterol no esterificado. Los fibroblastos se cultivan a partir de una pequeña biopsia de piel tomada de un paciente del que se sospecha puede tener NPC. El diagnóstico puede confirmarse identificando mutaciones en los genes NPC1 o NPC2.
El pronóstico para los pacientes que tienen NPC se relaciona habitualmente con la edad de aparición. Los niños con aparición prenatal o infantil habitualmente fallecen en los primeros pocos meses o años de vida, mientras que la aparición de formas de NPC en adolescentes y adultos tienen un comienzo más insidioso y una progresión más lenta, y los individuos afectados pueden sobrevivir hasta la séptima década. Se están reconociendo casos de NPC en adultos con mayor frecuencia. Se sospecha que muchos pacientes afectados por la NPC no están diagnosticados, debido a la carencia de conocimiento de la enfermedad y a la ausencia de pruebas de cribado o diagnóstico fácilmente disponibles. Por las mismas razones, el diagnóstico se retrasa a menudo en muchos años. Actualmente, no hay curas de la causa de la NP y el tratamiento es principalmente sintomático y limitado, siendo los cuidados, en su mayor parte, de soporte. Se ha intentado el trasplante de órganos con un éxito limitado. Se ha intentado el trasplante de médula ósea para la NPB. Las perspectivas de futuro incluyen terapia de sustitución enzimática, también denominada en el presente documento como TSE, y terapia génica. Otras diversas estrategias de tratamiento se encuentran bajo investigación en cultivos de células y en modelos animales de la NPC. Estas incluyen ciclodextrina, movilización de colesterol, neuroesteroides y curcumina como antiinflamatorio y agente modulador del calcio (Loyd-Evans E et al., Octubre de 2008, Nature medicine 14 (11): 1247-55).
El fármaco Zavesca que comprende Miglustat como ingrediente activo ha sido aprobado al menos en la Unión Europea para el tratamiento de manifestaciones neurológicas progresivas en pacientes adultos y en pacientes pediátricos con la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C. El Miglustat es un inhibidor de la glucosilceramida sintasa, que inhibe la síntesis de glucoesfingolípidos en las células. Se ha mostrado que retrasa la aparición de la enfermedad en ratones con NPC, y los datos publicados de un ensayo clínico multicéntrico de Miglustat en los Estados Unidos y en Inglaterra, y de los informes de los casos, sugieren que puede mejorar el curso de la NPC en humanos.
La esfingomielina es un esfingolípido que se encuentra en las membranas celulares de las células animales, especialmente en la capa membranosa de mielina que rodea algunos axones de las células nerviosas.
En los humanos, se cree que la esfingomielina es el único fosfolípido de la membrana celular no derivado del glicerol.
Al igual que todos los esfingolípidos, la esfingomielina consiste en un núcleo de ceramida, es decir esfingosina enlazada a un ácido graso a través de un enlace amida. Además, contiene un grupo de cabeza polar, que es fosfocolina, fosforilcolina o bien fosfoetanolamina. Una esfingomielina habitual tiene la fórmula:
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En la NPA y NPB, la deficiencia enzimática tiene como resultado un bloque de degradación lipídica, lo que da como resultado la acumulación de esfingomielina dentro de los lisosomas en el linaje de fagocitos macrófago-monocito. Las células afectadas se agrandan, en ocasiones hasta 90 micrómetros de diámetro, como consecuencia de la distensión de lisosomas con esfingomielina y colesterol.
Se entenderá por un experto en la técnica que el término “lisoesfingomielina libre” tal como se utiliza en el presente documento, preferiblemente en relación con los diversos métodos de la invención, significa preferiblemente que la molécula está presente en su forma amino libre. De forma más precisa, la lisoesfingomielina tal como se utiliza en el presente documento, preferiblemente difiere de la esfingomielina en que ningún resto de ácido graso se une al grupo amino - primario - del resto esfingosina de la molécula. Además, la lisoesfingomielina también se denomina en el presente documento compuesto 465, esfingosilfosforilcolina o esfingosina fosforilcolina. Una lisoesfingomielina habitual tiene la fórmula:
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Se entenderá por un experto en la técnica que el término “lisoesfingomielina libre” tal como se utiliza en el presente documento hace referencia preferiblemente a lisoesfingomielina que está presente como tal en una muestra de un o del sujeto, tal como sangre, y preferiblemente, no es el resultado de una manipulación de la muestra de dicho sujeto. Dicha manipulación de una muestra puede ser la descrita por Groener et al. (Groener et al. Biochimica et Biophysica Acta 1781 (2908)72 ~ 78, 2007). De acuerdo con esto, la lisoesfingomielina libre que está presente como tal en la sangre de un sujeto del que se toma la muestra, no es más particularmente una lisoesfingomielina que se genera mediante tratamiento químico, bioquímico o físico de la muestra contenida en la sangre y la muestra, respectivamente, preferiblemente fuera del cuerpo del paciente. Se entenderá también por un experto en la técnica que la lisoesfingomielina libre tal como se utiliza en el presente documento, está presente además de la esfingomielina y es un compuesto producido por las actividades metabólicas del sujeto. Por consiguiente, la esfingomielina, que es la molécula que se acumula en relación con la enfermedad de Niemann-Pick, tal como enfermedad de Niemann-Pick de tipo A y tipo B, está presente en la muestra del sujeto y se ha comparado con la molécula en una forma liso libre, es decir, lisoesfingomielina libre, presente en la sangre del sujeto con al menos un resto de ácido graso unido al grupo amino - primario - del resto de esfingosina de la lisoesfingomielina.
En una realización del primer, segundo, tercer y quinto aspecto de la presente invención el biomarcador se detecta por medio de inmunoensayo, análisis espectrométrico de masas, matriz de biochip, ácidos nucleicos funcionales y/o un derivado fluorescente del biomarcador. En relación con los mismos, es importante señalar que dicha detección permite la detección selectiva del biomarcador tal como está presente en la sangre de un sujeto como tal, y en particular no es el resultado de una manipulación de la muestra de dicho sujeto que da como resultado un cambio en la concentración del biomarcador, tal como la derivatización de Gb1 en liso-Gbl de acuerdo con el método de la técnica anterior según se ha descrito anteriormente. Dicha manipulación puede tener como resultado la incapacidad de distinguir el biomarcador de la presente invención, tal como lisoesfingomielina libre, y por tanto el biomarcador de la presente invención no puede ser detectado como tal y el nivel de dicho biomarcador no puede ser determinado como tal, respectivamente, sin detectar la sustancia manipulada adicionalmente, p. ej. Gb1 derivatizada en lyso-Gbl de acuerdo con el método de la técnica anterior. A la luz de lo mismo, se entenderá inmediatamente que el biomarcador presente en la sangre del sujeto, tal como la lisoesfingomielina libre presente como tal en la sangre del sujeto, está también presente en la muestra del sujeto como tal y puede, no obstante, ser marcada de forma selectiva con, y/o unida a un medio tal como un colorante fluorescente o una molécula de ácido nucleico que enlaza específicamente el biomarcador. Dicho marcaje selectivo o unión permite detectar y/o determinar el nivel del marcador marcado o unido, sin el marcaje de, la unión a, o sin convertir una sustancia adicionalmente, tal como la liso-Gbl convertida de la técnica anterior, que no puede distinguirse del biomarcador, de forma más precisa del biomarcador marcado o unido. En relación con lo mismo, p. ej. un derivado fluorescente del biomarcador de la presente invención hace referencia a un biomarcador que está marcado con y/o unido a un colorante o molécula fluorescente, es decir que tiene como resultado un derivado fluorescente del biomarcador, lo que permite detectar el derivado fluorescente y/o determinar el nivel del derivado fluorescente del biomarcador de la invención.
La sustancia denominada en el presente documento como compuesto 509, que puede ser detectada por los métodos de la presente invención y que es útil en el método de acuerdo con la presente invención como biomarcador, es una sustancia que tiene un peso del ion cuasimolecular de 509,3 y más específicamente de 509,265 (m/z) (como un ion M+H cuasimolecular monoisotópico), donde la fórmula empírica del compuesto 509 es C24 H50 O7 N2 P (ion M+H cuasimolecular). Se detecta preferiblemente como una transición MRM en modo ESI positivo con 509 m/z a 184 m/z en una muestra de plasma de un sujeto de acuerdo con el método de la presente invención, más particularmente en el Ejemplo 1 y el Ejemplo 2 según se describe en el presente documento.
La fórmula estructural del compuesto 509 como [M+H]+ es
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por lo cual, preferiblemente, el peso molecular del compuesto de la anterior fórmula es 509,265 como ion M+H (m/z) cuasimolecular monoisotópico.
Las condiciones para determinar las formulas estructurales anteriores fueron las siguientes. Una muestra que consiste en una fracción HPLC que contiene el compuesto 509, se sometió a MALDI-RTOF-MS, PSD y CID-TOF/RTOF-MS de alta energía. La muestra y las soluciones matriciales se mezclaron 1:1 (v/v), por lo cual la solución matricial fue de 15 mg de THAP más 1000 ml de metanol, o en caso de sodio que contiene un medio bajo condiciones adecuadas para la asociación sódica, 15 mg de THAP más 1000 ml de metanol saturados con NaCl. Un total de 0,8 ml de la mezcla de la muestra y la solución matricial se aplicó a una diana en acero inoxidable (método de la gota seca). Adicionalmente, una parte de las preparaciones libres de sodio se lavó utilizando 2 ml de una solución acuosa de TFA al 0,1 % v/v. La calibración TOF se realizó utilizando aceite de ricino (ion [M+Na]+ de triricinoleoil glicerol, m/z 955,7, además de diversos iones de la matriz de THAP). Los espectros del refelctrón fueron determinados utilizando 500 a 1000 pulsos de láser, los espectros de PSD y CID fueron determinados utilizando hasta 5000 pulsos de láser. Gas de colisión: He; energía de colisión 20 keV.
Alternativamente, la fórmula estructural del anterior ion [M+H]+ además de los iones [M+Na]+ y [M+2Na-H]+ se obtuvo por análisis espectroscópico de masas utilizando Orbitrap LTQ-XL con CID y HCD siguiendo el anterior protocolo de preparación de la muestra.
El término “muestra” tal como se utiliza preferiblemente en el presente documento significa, preferiblemente, una cantidad limitada de un material del sujeto, en donde dicho material del sujeto es parte de, o se ha tomado de, un sujeto y/o el organismo de un sujeto. Preferiblemente, dicho material se selecciona del grupo que comprende fluidos corporales tales como sangre, un producto sanguíneo, orina, saliva, líquido cefalorraquídeo y linfa, además de heces o cualquier clase de tejido y o material celular que es parte de un sujeto y/o del organismo de un sujeto. Podrá ser reconocido por un experto en la técnica, que la presencia de y/o un nivel de un biomarcador de la invención en dicha muestra pretende ser similar a, y representar la presencia y/o el nivel del biomarcador en una cantidad mayor de la del material del sujeto. De forma más precisa y como un ejemplo ilustrativo no limitativo, el nivel de un biomarcador de la invención determinado en una muestra de, p. ej., algunos ml de sangre de un sujeto, también representa el nivel de dicho biomarcador en la sangre del organismo del sujeto. Además, en una realización del método de la invención para diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto, una muestra del sujeto comprende dicho material del sujeto en una forma, por ejemplo procesada, fija y/o conservada de tal manera que dicha muestra sea adecuada para su uso en el método de la invención, por lo que dicho procesamiento, fijación y/o conservación, preferiblemente, no genera lisoesfingomielina y/o el compuesto 509 que no estaba como tal presente en la sangre del paciente. El material del sujeto en la muestra puede de este modo diluirse, por ejemplo con un disolvente adecuado para el método de la invención tal como metanol y/o agua, puede secarse, por ejemplo en una tarjeta de filtro, puede resolverse después de haberse secado tal como, por ejemplo con un disolvente adecuado para el método de la invención tal como metanol y/o agua, o puede añadirse una sustancia, en donde dicha sustancia evita que la sangre se coagule tal como por ejemplo EDTA o heparina. Se entenderá además por un experto en la técnica que el método de la invención comprende que dicho material del sujeto se separe en los componentes individuales de dicho material del sujeto, y/o que los componentes individuales de dicho material del sujeto se extraigan de dicho material del sujeto, por ejemplo la sangre se separa en plasma o suero y los componentes celulares de la sangre, o se precipita proteína de la muestra. Por consiguiente, en una realización del método de acuerdo con la presente invención en donde el método comprende la precipitación de proteínas y/o HPLC, la precipitación de proteína tiene como resultado, preferiblemente, a) una precipitación de los componentes celulares de la sangre y/o de proteínas, más preferiblemente formando un granulado después de una etapa de centrifugación, y b) que el biomarcador preferiblemente no se precipita y está presente en el sobrenadante después de la etapa de centrifugación. Un experto en la técnica entenderá inmediatamente que en una realización del método de acuerdo con la presente invención, en donde el método comprende HPLC, un sobrenadante que contiene el biomarcador o biomarcadores de la presente invención o una parte del mismo, se somete a HPLC. En relación con lo miso, es importante entender que el sobrenadante o una parte del mismo que está sometido a HPLC comprende el biomarcador que va a ser detectado además de, preferiblemente, un patrón interno. En una realización del método de la invención en donde se añade un patrón interno a la muestra, dicho patrón interno puede añadirse a la muestra antes o después de una etapa de precipitación, es decir, el patrón interno puede ser añadido en la muestra inmediatamente después de que la muestra se tome del sujeto, o puede añadirse al sobrenadante que está sometido a HPLC, además de en medio de estos puntos de tiempo. Un experto en la técnica sabrá, cómo y cuándo es añade preferiblemente un patrón interno a la muestra para lograr una detección y determinación precisas del nivel del biomarcador.
Se entenderá inmediatamente que después de dicho procesamiento, fijación y/o conservación la muestra se somete a los métodos de la invención para detectar y/o determinar el nivel de un biomarcador contenido en dicha muestra, por lo que dicho procesamiento, fijación y/o conservación preferiblemente no genera lisoesfingomielina y/o el compuesto 509 que no estaba presente en la muestra del paciente como tal.
En una realización del método de la presente invención en donde la sangre completa se recoge en una tarjeta de filtro de sangre seca, preferiblemente aproximadamente 3 pl de sangre completa se recogen en un punto de dicha tarjeta de filtro de sangre seca que tiene un diámetro de 3 mm. Un experto en la técnica reconocerá que el volumen exacto recogido de este modo puede variar dependiendo del hematocrito del paciente específico.
Los niveles de glucosilceramida y su precursor ceramida se utilizaron en la técnica anterior para correlacionar su presencia en plasma con la gravedad de la enfermedad de Gaucher de tipo I y la respuesta a la aplicación de la terapia (Groener et al., Biochimica et Biophysica Acta 1781(2908)72 - 78, 2007). Por tanto, se observó que el nivel de Gb1 era diferente, aunque los niveles de ceramida no eran significativamente diferentes en el plasma de los pacientes con enfermedad de Gaucher tipo I tratados y no tratados.
En el estudio presentado por Groener et al. (Groener et al., supra) se utilizó la relación de Gbl/ceramida para distinguir entre los pacientes con enfermedad de Gaucher y los pacientes sanos. La Gb1 y la ceramida se midieron con cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) esencialmente tal como se describe en Groener et al. (J.E.M. Groener et al., Clin. Chem. 53 (2007) 742-747). En relación con esto es importante entender que la Gb1 presente en el plasma consiste principalmente en un resto de azúcar y un resto de ceramida. El resto de ceramida comprende una esfingosina y un resto de ácido graso. De acuerdo con el método de la técnica anterior los lípidos se extraen y la ceramida y la glucosilceramida se desacetilan mediante hidrólisis alcalina, formando de este modo la forma liso, es decir, liso-Gbl (T. Taketomi et al., J. Biochem. (Tokio) 120 (1996) 573-579). Posteriormente, la liso-Gbl producida de este modo es marcada con un colorante fluorescente por derivación con O-ftaldialdehído (OPA) en el grupo amina primaria. Después de esto, las bases esfingoides derivatizadas se separaron por HPLC de fase inversa y se detectaron con un detector de fluorescencia. Por tanto, dicho método de la técnica anterior es capaz de detectar el Gb1 total que consiste en liso-Gbl libre y Gb1 y no es capaz de distinguir el nivel de liso-Gb1 libre del nivel de Gb1 en una muestra de un sujeto. El nivel de dicha Gb1 total después de la escisión de los diversos restos de ácido graso del grupo NH2 de la Gb1 está habitualmente en un intervalo de 5 a 30 pg por ml de plasma o suero. A partir de esto, es evidente que en el método de Groener et al. (Groener et al., supra) la Gb1 total que puede prepararse y obtenerse, respectivamente, de una muestra, preferiblemente una muestra de sangre, de un sujeto se utiliza como un biomarcador en lugar de la liso-Gbl libre contenida en la sangre, y por consiguiente también en la muestra sin realizar una escisión del resto/de los restos de ácido graso, preferiblemente una escisión realizada por un técnico que maneja la muestra. En la medida en que se ha establecido, la presente invención está relacionada con la detección de liso-esfingomielina libre en lugar de con la esfingomielina total.
Aunque la Gb1 total medida como liso-Gbl en dicho estudio de la técnica anterior se vio aumentada en el plasma de dichos pacientes, dicho aumento en la Gb1 total no fue destacado y por tanto la especificidad y la sensibilidad del método fueron bajas, mostrando que la Gb1 no es adecuada como un biomarcador para la enfermedad de Gaucher. Es una realización de los métodos de la presente invención que comprende detectar y/o determinar el nivel de lisoesfingomielina libre en una muestra de un sujeto, que la lisoesfingomielina libre y/o el nivel de lisoesfingomielina libre se determine independientemente de, y/o aparte de, la esfingomielina o el nivel de esfingomielina que pueda estar presente en la sangre de un sujeto. En una realización adicional se detecta/determina esfingomielina y/o el nivel de esfingomielina, además de la detección de, y/o la determinación del nivel de lisoesfingomielina libre.
De forma importante, cada amina primaria que circula en el plasma y que sea suficientemente lipofílica para ser extraída concomitantemente con esfingomielina utilizando un disolvente orgánico de acuerdo con dicho método de la técnica, se marca en consecuencia y por tanto es capaz de perturbar la detección de la lisoesfingomielina escindida. En una realización el biomarcador de acuerdo con la presente invención que ha sido perfilado anteriormente en referencia a la lisoesfingomielina libre, también se aplica a cualquier biomarcador de la presente invención que está presente en una forma liso libre.
En la medida en que se ha establecido, el biomarcador de la presente invención y usos del mismo claramente supera el rendimiento de los métodos para diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick, preferiblemente enfermedad de Niemann-Pick de tipo A y B, enfermedad de Niemann-pick de tipo C y/o portador de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C, conocidos en la técnica anterior, de forma más específica, los intentos de dichos métodos que utilizan biomarcadores. Se podrá entender inmediatamente que un método para diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick análogo al método aplicado por Groener et al. para diagnosticar la enfermedad de Gaucher (Groener et al., supra), es perjudicial en comparación con los métodos de la presente invención a la hora de diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick, en base a que dicho método de la técnica anterior utiliza la esfingomielina total en lugar de la lisoesfingomielina libre, ya que el método de la técnica anterior que utiliza la Gb1 total en lugar de la liso-Gbl no es adecuado para una aplicación clínica fiable del mismo, es decir, el método no tiene la suficiente sensibilidad y especificidad para diagnosticar la enfermedad de Gaucher mediante una predicción fiable estadísticamente segura.
En claro contraste con lo anterior, la presente invención proporciona métodos para el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick y los marcadores utilizados en dichos métodos que permiten el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick con alta sensibilidad y alta especificidad. De forma más importante, los métodos de la presente invención que utilizan el biomarcador/biomarcadores de la presente invención permiten el diagnóstico diferencial de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo A y B; y la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C; y portador de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C en un sujeto. A su mejor entender, los presentes inventores creen que los métodos de la presente invención permiten delimitar por primera vez la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C de la enfermedad de A y B utilizando un biomarcador/biomarcadores de acuerdo con la presente invención en un ensayo adecuado de aplicación clínica rápido, y lo que es más importante, altamente sensible y altamente específico.
El término “estado de la enfermedad de Niemann-Pick” tal como se utiliza en el presente documento, hace referencia preferiblemente al estado de la enfermedad en el sujeto. Entre los ejemplos de tipos de estados de la enfermedad de Niemann-Pick se incluyen, sin limitarse a, el riesgo del sujeto de padecer o desarrollar la enfermedad de Niemann-Pick, la etapa de la enfermedad en un sujeto y la efectividad del tratamiento de la enfermedad. Otros estados y grados de cada estado son conocidos en la técnica. En una realización de la presente invención el estado de la enfermedad de Niemann-Pick comprende un estado de la enfermedad de Niemann-Pick grave, leve o sano.
El término “diagnosticar” tal como se utiliza en el presente documento, significa preferiblemente determinar la presencia o la ausencia de una enfermedad o trastorno en un sujeto y/o determinar si un sujeto está en riesgo de desarrollar una enfermedad, un trastorno o síntomas relacionados con una enfermedad o trastorno, además de predecir el estado de una enfermedad. Los términos “diagnóstico” o “diagnosticar”, tal como se utilizan en el presente documento, también significan preferiblemente que se identifica la causa de los síntomas de una enfermedad que están presentes o que podrán estar presentes.
En relación con lo mismo, es importante señalar que un experto en la técnica, tal como un clínico experto consultado por un sujeto que sufre los síntomas o se sospecha que está enfermo, aplica los métodos de la presente invención y por tanto determina si un sujeto está en riesgo de desarrollar una enfermedad, particularmente la enfermedad de Niemann-Pick y más particularmente la enfermedad de Niemann-Pick de tipo A/B, enfermedad de Niemann-Pick de tipo C y/o portador de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C, si un sujeto padece dicha enfermedad o predice el estado de dicha enfermedad, preferiblemente en base al resultado obtenido mediante la práctica de los métodos de la presente invención.
En base a dicho diagnóstico el experto en la técnica recomendará aplicar, mantener, reducir, elevar o no aplicar una terapia o realizar pruebas diagnósticas adicionales.
En por tanto una realización del método de la presente invención para diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick que el método comprenda dar una recomendación de si se debería aplicar, mantener, reducir, elevar o no aplicar una terapia.
El término “diagnóstico diferencial” tal como se utiliza en el presente documento en relación con el método de la presente invención, significa preferiblemente que el método permite determinar la presencia o ausencia de una enfermedad o trastorno en un sujeto y/o determinar si un sujeto está en riesgo de desarrollar una enfermedad, un trastorno o síntomas relacionados con una enfermedad o trastorno además de predecir el estado de una enfermedad, en donde la enfermedad es cada uno y cualquiera de entre enfermedad de Niemann-Pick de tipo A y B; enfermedad de Niemann-Pick de tipo C; y portador de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C.
El término “detectar” en el contexto de la presente invención significa métodos que incluyen detectar la presencia o ausencia de una sustancia en una muestra y/o cualificar el tipo de dicha sustancia. La detección puede lograrse mediante métodos conocidos en la técnica y aquellos descritos adicionalmente en el presente documento, que incluyen, aunque no se limitan a, la medida directa de la proteína o proteínas afectadas, p. ej. la secuenciación de genes SMPD1, NPC1 y/o NPC2. Cualquier método adecuado puede utilizarse para detectar uno o más de los biomarcadores descritos en el presente documento. Estos métodos incluyen, sin limitación, espectrometría de masas (p. ej., HPLC-MS/MS), fluorescencia (p. ej. inmunoensayo de tipo sándwich), HPLC-fluorescencia o HPLC-UV preferiblemente después de derivatización de lisoesfingomielina libre y/o el compuesto 509.
Un biomarcador tal como se utiliza en el presente documento, es preferiblemente cualquier compuesto biológico, tal como una proteína o un fragmento de la misma, un péptido, un polipéptido, un proteoglicano, una glicoproteína, una lipoproteína, un carbohidrato, un lípido, un ácido nucleico, un compuesto químico orgánico o inorgánico, un polímero natural y una molécula pequeña, que está presente diferencialmente en una muestra de un sujeto de un estado fenotípico (p. ej. que tiene una enfermedad) en comparación con otro estado fenotípico (p. ej. que no tiene la enfermedad) y que puede aislarse de, o medirse en la muestra del sujeto. Además, el biomarcador puede ser la molécula entera intacta, o puede ser una parte de la misma que se detecta preferiblemente por análisis espectrométrico de masas, un anticuerpo, otra proteína que se une de forma específica al biomarcador, ácidos nucleicos funcionales que se unen de forma específica al biomarcador y/o una marca fluorescente. Se considera además que un biomarcador es informativo si un aspecto medible del biomarcador está asociado con un estado dado del paciente, tal como un estado particular de la enfermedad de Niemann-pick de tipo C. Dicho aspecto medible puede incluir, por ejemplo, la presencia, ausencia o el nivel del biomarcador en la muestra del sujeto y/o su presencia como parte de un perfil de biomarcadores. Un aspecto medible puede ser también una relación de dos o más aspectos medibles de los biomarcadores, cuyos biomarcadores pueden ser o no de identidad conocida, por ejemplo. Un perfil de biomarcadores comprende al menos dos de dichos aspectos medibles, donde los aspectos medibles pueden corresponder a las mismas o a diferentes clases de biomarcadores tales como, por ejemplo, un ácido nucleico y un carbohidrato. Un perfil de biomarcador puede comprender también al menos tres, cuatro, cinco, 10, 20, 30 o más aspectos medibles. En una realización, un perfil de biomarcador comprende cientos, o incluso miles, de aspectos medibles. En otra realización, el perfil de biomarcador comprende al menos un aspecto medible de al menos un biomarcador y al menos un aspecto medible de al menos un patrón interno.
En una realización del método de acuerdo con la presente invención se añade un patrón interno a una muestra de un sujeto. Se podrá reconocer que mediante dicha adición de patrón interno, también denominado en este documento como PI, a la muestra, es decir, la adición de la muestra, que va a someterse al método de acuerdo con la presente invención, se conoce la concentración del PI en la muestra y, p. ej., determinando el área debajo del pico, es decir, el área de pico, del patrón interno en, p. ej., un cromatograma de HPLC-espectrometría de masas puede calcularse por tanto la relación entre un área de pico y la concentración de una sustancia, p. ej., del PI y/o el biomarcador de la presente invención, p.ej. lisoesfingomielina libre y/o el compuesto 509, p.ej., calculando la relación del área de pico de la lisoesfingomielina libre y/o el compuesto 509 y el área de pico del P i . Un experto en la técnica sabrá además que pueden utilizarse varias moléculas como un PI. No obstante, es preferible un PI que tiene una estructura química similar en comparación con la molécula tal como el biomarcador, p. ej., lisoesfingomielina libre y/o el compuesto 509. De acuerdo con lo mismo, los presentes inventores han elegido en una realización la liso-Gb2 que no está presente como tal en la naturaleza. En una realización preferida la molécula que es el PI puede distinguirse del biomarcador o de los biomarcadores de la presente invención, p. ej. lisoesfingomielina libre y/o el compuesto 509, en el método de la presente invención. En una realización preferida adicional, el PI se selecciona como una molécula que idealmente no está presente o es rara en la naturaleza. En una realización de la presente invención donde el patrón interno se añade a una muestra de un sujeto, se prefiere que el PI se añada de tal manera que se disuelva en un disolvente, p. ej. etanol, antes de dicha adición a la muestra. En una realización preferida adicional en que el disolvente se selecciona de tal manera que dicho disolvente sea capaz de causar la precipitación de proteínas, preferiblemente sea capaz de causar la etapa de precipitación de proteínas tal como está sujeto al método de la presente invención.
En algunas realizaciones de la presente invención, según se define en las reivindicaciones, una precipitación de proteínas y/o una etapa de precipitación de proteínas es parte del método de la presente invención. Se entenderá que la precipitación tal como se utiliza en el presente documento, preferiblemente significa la formación de un sólido en una solución, es decir, por ejemplo la formación de un precipitado de proteínas en una muestra, por ejemplo, suero, de un sujeto. Cuando tiene lugar la precipitación, p. ej., la precipitación de proteínas, en una muestra, el sólido formado se denomina precipitado, o cuando se compacta mediante una centrífuga, granulado. El líquido que permanece por encima del sólido se denomina, en cualquier caso, el sobrenadante. La presente invención contempla diferentes métodos de precipitación y/o separación de dicho sobrenadante y dicho precipitado o granulado, que comprende, entre otros, deposición o sedimentación y centrifugado. Un experto en la técnica conocerá métodos adicionales para la precipitación de proteínas y/o para la separación de un sobrenadante y un precipitado de proteínas, no obstante dicho experto sabrá que si un método, preferiblemente un método de la invención, se aplica donde las proteínas pueden inutilizar un dispositivo tal como una columna o columna de HPLC utilizada en relación con la presente invención, la proteína precipitada se separa preferiblemente del disolvente y/o de la muestra.
En algunas realizaciones de la presente invención según se define en las reivindicaciones, el nivel de un biomarcador de la presente invención, p. ej., lisoesfingomielina libre, determinado por un método de la presente invención en una muestra se compara con el nivel del mismo o de otro biomarcador de la presente invención determinado por un método de la presente invención en otra muestra, p. ej. del mismo paciente, de otro paciente, de un control y/o pertenecientes a los mismos o diferentes puntos de tiempo, y/o un valor de corte, y/o el nivel de un control y/o el nivel de un PI. En relación con lo mismo, las expresiones “que compara” o “en comparación con” tal como se utiliza en el presente documento, preferiblemente significa la comparación matemática de los dos o de más valores de los niveles del biomarcador o de los biomarcadores. Por tanto, será inmediatamente evidente si uno de dichos valores es más elevado, menor o idéntico si al menos dos de dichos valores se comparan entre sí.
En algunas realizaciones de la presente invención según se define en las reivindicaciones el método comprende una etapa de determinar la relación del nivel de dos biomarcadores determinados por el método de la presente invención. En una realización más preferida la relación se determina dividiendo el nivel de un primer biomarcador, es decir, un biomarcador de la presente invención, por el nivel de un segundo biomarcador, es decir al menos un biomarcador adicional de la presente invención, en donde el nivel de ambos biomarcadores fue determinado por la presente invención. En una realización incluso más preferida, la relación se determina dividiendo el nivel del biomarcador y el nivel del al menos un biomarcador adicional, en donde más preferiblemente el biomarcador es el compuesto 509 y el al menos un biomarcador adicional es lisoesfingomielina libre. Es mérito de los presentes inventores haber observado que dicha relación de los niveles de dos biomarcadores es indicativa de que el sujeto padece o está en riesgo de padecer la enfermedad de Niemann-Pick, más particularmente de padecer una cualquiera de entre la enfermedad de Niemann-Pick de tipo A y B; enfermedad de Niemann-Pick de tipo C; y portador de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C. En una realización más preferida que la relación del nivel del compuesto 509 al nivel de lisoesfingomielina libre sea más elevada que el valor de corte, es indicativo de que el sujeto padece o está en riesgo de padecer la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C. Es importante entender en relación con lo mismo que un valor de corte con el que dicha relación se compara es el valor que permite diagnosticar con la más alta selectividad y sensibilidad.
En una realización del método de acuerdo con la presente invención, según se define en las reivindicaciones, en la que se determina una relación de dos biomarcadores determinados por el método de la presente invención y que es indicativa de que el sujeto padece una enfermedad en particular, p. ej. comparando dicha relación con un valor de corte, se considera combinar el diagnóstico basado en dicha relación con un diagnóstico basado en el nivel de uno o más biomarcadores individuales presentes en la muestra que sea indicativo de que el sujeto padece una enfermedad en particular, p. ej. comparando dicho nivel o niveles con el respectivo o los respectivos valores de corte. En otras palabras, se considera en primer lugar detectar un biomarcador en una muestra del sujeto, determinar el nivel de dicho biomarcador presente en la muestra y comparar dicho nivel de dicho biomarcador con un primer valor de corte, en donde dicho primer valor de corte permite el diagnóstico de una enfermedad, preferiblemente el diagnóstico diferencial de dicha enfermedad; en segundo lugar detectar un biomarcador adicional en una muestra del sujeto, determinar el nivel de dicho biomarcador adicional presente en la muestra y comparar dicho nivel de dicho biomarcador con un segundo valor de corte, en donde dicho segundo valor de corte permite diagnosticar adicionalmente la enfermedad o confirmar el resultado del diagnóstico con el biomarcador utilizado en primer lugar, y/o preferiblemente el diagnóstico diferencial de dicha enfermedad; y en tercer lugar determinar la relación del nivel del biomarcador al nivel del biomarcador adicional y comparar dicha relación con un tercer valor de corte, en donde dicho tercer valor de corte permite diagnosticar adicionalmente la enfermedad o confirmar el resultado del diagnóstico con el biomarcador utilizado en primer lugar y el biomarcador adicional, y/o preferiblemente el diagnóstico diferencial de dicha enfermedad.
El término “valor de corte” tal como se utiliza en el presente documento, hace referencia preferiblemente a un nivel, concentración y/o un título de un biomarcador de la presente invención. En algunas realizaciones donde se considera una relación de dos niveles, concentraciones y/o títulos de los biomarcadores de la presente invención, dicho valor de corte hace referencia al valor de una relación con la que se compara la relación de dos niveles, concentraciones y/o títulos de los biomarcadores, y en donde si dicha relación de dos niveles, concentraciones y/o títulos de los biomarcadores de la presente invención determinados por los métodos de la presente invención, es elevada, aumentada o más elevada en comparación con el valor de corte con la que se compara la relación de dos niveles, concentraciones y/o títulos de los biomarcadores, esto es indicativo de que el sujeto padece o está en riesgo de desarrollar la enfermedad de Niemann-Pick, y/o preferiblemente la enfermedad de Niemann-Pick de tipo A y B, la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C, y/o portador de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C; y/o en donde si dicha relación de dos niveles, concentraciones y/o títulos de los biomarcadores de la presente invención es reducida o inferior en comparación con el valor de corte con el que se compara la relación de dos niveles, concentraciones y/o títulos de los biomarcadores, esto es indicativo de que el sujeto no padece o no está en riesgo de desarrollar la enfermedad de Niemann-Pick.
En una realización en particular del mismo,
utilizar el compuesto 509 como el biomarcador permite
diagnosticar la NP de tipo A y B utilizando un valor de corte para el compuesto 509 de 5 ng/ml con una sensibilidad de 94,4% y una especificidad de 96,1%; y/o
diagnosticar la NP de tipo C utilizando un valor de corte para el compuesto 509 de 1,7 ng/ml con una sensibilidad de 97,2% y una especificidad de 93,3%; y/o
diagnosticar un portador de NP de tipo C utilizando un valor de corte para el compuesto 509 de 0,031 ng/ml con una sensibilidad de 100% y una especificidad de 22,5%;
utilizar lisoesfingomielina libre como el biomarcador adicional permite
diagnosticar la NP de tipo A y B utilizando un valor de corte para la lisoesfingomielina libre de 59 ng/ml con una sensibilidad de 94,4% y una especificidad de 99,3%; y/o
diagnosticar la NP de tipo C utilizando un valor de corte para la lisoesfingomielina libre de 9,23 ng/ml con una sensibilidad de 94,4% y una especificidad de 81,3%; y/o
diagnosticar un portador de la NP de tipo C utilizando un valor de corte para la lisoesfingomielina libre de 6,5 ng/ml con una sensibilidad de 100% y una especificidad de 61,2%; y
utilizar la relación del nivel del compuesto 509 al nivel de lisoesfingomielina libre permite
diagnosticar la NP de tipo A y B utilizando un valor de corte para la relación del nivel del compuesto 509 al nivel de lisoesfingomielina libre de 0,045 con una sensibilidad de 94,4% y una especificidad de 82,1%; y/o
diagnosticar la NP de tipo C utilizando un valor de corte para la relación del nivel del compuesto 509 al nivel de lisoesfingomielina libre de 0,087 con una sensibilidad de 94,4% y una especificidad de 95,5%.
El término “relación” tal como se utiliza en el presente documento significa preferiblemente que entre dos números del mismo tipo, tal como los niveles de dos biomarcadores de la presente invención, tal como los niveles del compuesto 509 y el compuesto 465, existe una relación que habitualmente se expresa como “a a b”, “a:b” o “la relación de a a b”, por ejemplo “la relación de los niveles del compuesto 509 al compuesto 465”. Más preferiblemente, “relación” indica cuantas veces el primer número, es decir “a” contiene el segundo, es decir “b”, en donde dicha relación no es necesariamente un número entero. En otras palabras, si por ejemplo se trata de “la relación del nivel del compuesto 509 al compuesto 465”, el valor que representa el nivel del compuesto 509 se divide por el valor que representa el nivel de 465. En relación con lo mismo, ha de señalarse que es mérito de los presentes inventores haber reconocido que la relación de dos biomarcadores es de valor diagnóstico, la comparación de los cuales con un valor de corte respectivo permite el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick, más particularmente, la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C. Se entenderá por tanto inmediatamente que dicha relación entre los niveles de dos biomarcadores de acuerdo con la presente invención pueden ser expresados y/o procesados mediante diversas operaciones matemáticas y/o diversos modelos matemáticos pueden ser aplicados a un nivel o a ambos niveles de los dos biomarcadores. Por consiguiente, está dentro de la presente invención que unas operaciones matemáticas y/o diversos modelos matemáticos se apliquen a uno o más niveles de biomarcadores determinados de acuerdo con la presente invención. Como un ejemplo el valor recíproco de una relación del nivel de dos biomarcadores puede ser utilizado en lugar de la propia relación.
En algunas realizaciones de la presente invención el nivel del biomarcador se determina también en un control. Tal como se utiliza en el presente documento, un control es preferiblemente una muestra de un sujeto en donde se conoce el estado de la enfermedad de Niemann-Pick de dicho sujeto. En una realización, un control es una muestra de un paciente sano. En una realización adicional una cantidad de dicho biomarcador se añade a dicha muestra de un paciente sano antes de determinar el nivel de dicho biomarcador en dicha muestra de un paciente sano que comprende dicho biomarcador añadido con un método de la presente invención. En una realización adicional el control es una muestra de al menos un sujeto que tiene un estado conocido de la enfermedad de Niemann-Pick, comprendiendo dicho estado conocido de la enfermedad de Niemann-Pick un estado de enfermedad de Niemann-Pick grave, leve o sano, p. ej. un paciente de control. En una realización preferida adicional el estado de la enfermedad de Niemann-Pick también comprende el tipo de enfermedad de Niemann-Pick, que comprende más preferiblemente la enfermedad de Niemann-Pick de tipo A, B, C y en una realización aún más preferida también comprende el estado genético con respecto a mutaciones de los genes, afectados en dichas enfermedades, que comprenden SMPD1, NPC1 y NPC2, es decir que comprende que el sujeto tenga mutaciones homocigotas y/o mutaciones heterocigotas del compuesto, siendo el sujeto un portador de la mutación.
En una realización adicional preferida, el control es una muestra de un sujeto que no está siendo tratado para la enfermedad de Niemann-Pick. En una realización aún más preferida el control es una muestra de un único sujeto o una acumulación de muestras de diferentes sujetos y/o muestras tomadas del sujeto o de los sujetos en diferentes puntos de tiempo.
El término “nivel” o “nivel de un biomarcador” tal como se utiliza en el presente documento, preferiblemente significa la concentración de una sustancia y/o título, preferiblemente de un biomarcador de la invención y más preferiblemente de lisoesfingomielina libre y/o el compuesto 509, en una muestra de un sujeto. Se entenderá por un experto que, en ciertas realizaciones, dicha muestra no está necesariamente sometida a un método de la invención como una muestra no procesada, comprendiendo el método determinar un nivel de dicho biomarcador, es decir dicha muestra puede someterse, p. ej., a una etapa de precipitación de proteínas, separación, p. ej. centrifugado y/o HPLC y posteriormente someterse a una etapa para determinar el nivel del biomarcador, p. ej., utilizando análisis espectrométrico de masas. Debería señalarse además que cuando el término “un” nivel de un biomarcador se utiliza en relación con un nivel del biomarcador de la invención que se va a determinar según la presente invención, se entiende “el” nivel del biomarcador de la presente invención que se va a determinar por los métodos de la presente invención y que está contenido en la muestra sometida al método o los métodos de la invención.
El nivel de un biomarcador es diferente entre diferentes estados de la enfermedad de Niemann-Pick, si la media o nivel medio del biomarcador en los diferentes grupos se calcula para ser estadísticamente significativo. Los ensayos habituales para la significancia estadística incluyen, entre otros, prueba t de Student, ANOVA, Wilcoxon, Mann-Whitney, cociente de probabilidades y Kruskal-Wallis. Los biomarcadores, solos o en combinación, proporcionan medidas de riesgo relativo de que un sujeto pertenezca a un estado fenotípico o a otro. Por lo tanto, los biomarcadores de la presente invención son útiles en una realización de la presente invención como marcadores para una enfermedad, efectividad terapéutica de un fármaco o un tratamiento.
El término “determinar el nivel” de un biomarcador tal como se utiliza en el presente documento, significa preferiblemente métodos que incluyen cuantificar una cantidad de al menos una sustancia en una muestra de un sujeto y/o cuantificar una cantidad de dicha sustancia contenida en una parte del cuerpo del sujeto, tal como saliva, sangre, linfa, suero, plasma o licor y/o cuantificar una cantidad de dicha sustancia en el sujeto, siendo seleccionada la sustancia del grupo que comprende un biomarcador.
Se entenderá por un experto en la técnica que detectar y/o determinar el nivel de lisoesfingomielina libre y/o el compuesto 509 en una muestra del sujeto, por tanto comprende preferiblemente que la esfingomielina presente en la sangre de un sujeto no está químicamente convertida, transformada o derivatizada de tal manera que la lisoesfingomielina libre y/o el compuesto 509 no pueda detectarse y/o el nivel del mismo no pueda ser determinado independientemente de y/o aparte de la esfingomielina. El experto en la técnica reconocerá que la esfingomielina presente en una muestra de un sujeto que está sometida a una etapa de desacetilación, p. ej., por hidrólisis en hidróxido sódico metanólico, dará como resultado la escisión del resto de ácido graso de la esfingomielina y por tanto dará como resultado, de forma indeseable, una forma químicamente convertida, transformada o derivatizada de esfingomielina que no puede diferenciarse de la lisoesfingomielina libre. Es por tanto mérito de los presentes inventores reconocer que la lisoesfingomielina libre y/o el compuesto 509 aparte de la esfingomielina es útil en un método para diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick.
En una realización preferida de los métodos de la presente invención, según se define en las reivindicciones, el método es para detectar y/o determinar el nivel de lisoesfingomielina libre y/o un compuesto 509 en una muestra de un sujeto, en donde la esfingomielina presente en la muestra del sujeto no se somete a una etapa que da como resultado la desacetilación de la esfingomielina, preferiblemente no se somete a una etapa que da como resultado la escisión de un resto de ácido graso de la esfingomielina contenida en la muestra. En una realización preferida adicional del método de la presente invención la esfingomielina presente en la muestra del sujeto no está químicamente convertida, transformada o derivatizada. En una realización aún más preferida del método de la presente invención la lisoesfingomielina libre y/o el compuesto 509 presente en la muestra del sujeto se separa de la esfingomielina presente en la muestra del sujeto antes de una etapa que daría como resultado la escisión de un resto de ácido graso de la esfingomielina y/o antes de una etapa en que la esfingomielina se convierte, transforma o derivatiza químicamente. En una realización aún más preferida se realiza una etapa de detección y/o determinación del nivel de un biomarcador en una muestra del sujeto, en donde el biomarcador es lisoesfingomielina libre y/o el compuesto 509, se realiza posteriormente a la separación utilizando HPLC mediante la aplicación de un análisis espectrométrico de masas.
En una realización de los métodos de la invención, tal como se define en las reivindicaciones, se considerará que un sujeto está sano con respecto a la enfermedad de Niemann-Pick de tipo A o B, si este no presenta ninguna mutación de las partes funcionales del gen SMPD1 y/o ninguna mutación del gen SMPD1 que tenga como resultao una reducción o una deficiencia de la respectiva proteína o de la actividad de la misma, lo que tiene como resultado síntomas asociados con la enfermedad de Niemann-Pick de tipo A o B.
Se considera que un sujeto está sano con respecto a la enfermedad de Niemann-Pick, si dicho sujeto no sufre los síntomas asociados con la enfermedad de Niemann-Pick. Más aún, en una realización de los métodos de la invención se considerará que un sujeto está sano con respecto a la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C, si no tiene ninguna mutación de las partes funcionales de los genes NPC1 y NPC2 y/o ninguna mutación de los genes NPC1 y NPC2 que da como resultado una reducción o la deficiencia de las respectivas proteínas o de la actividad de la misma, lo que tiene como resultado unos síntomas asociados a la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C. En determinadas realizaciones de los métodos de la presente invención, se trata el diagnóstico de portador de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C. En relación con lo mismo, es importante entender que se considera que dicho paciente que es un portador de una mutación tal como se describe anteriormente no es un sujeto sano dentro del significado de la presente invención, aunque dicho portador puede no sufrir los síntomas asociados con la enfermedad de Niemann-Pick. En determinadas realizaciones de los métodos de la presente invención, la enfermedad de Niemann-Pick también comprende portador de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C. El método de la presente invención es adecuado para diagnosticar si un sujeto es o no portador de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C. El método de la presente invención es además adecuado para diferenciar, diagnosticar y/o el diagnóstico diferencial de si un sujeto está sano, es un portador de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C o es un paciente de la enfermedad de Niemann-Pick, más particularmente preferiblemente un paciente de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo A/B y/o un paciente de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C.
Dichas mutaciones, es decir las mutaciones de SMPD1, NPC1 o NPC2, se detectarán si una muestra del sujeto se somete a una prueba genética para determinar dichas mutaciones tal como se describe en el presente documento. En una realización adicional de la presente invención una muestra de un sujeto sano se utiliza como una muestra de control o como una matriz en blanco en los métodos de la presente invención. Una matriz en blanco tal como se utiliza en el presente documento, es preferiblemente una muestra de un sujeto sano. No obstante, se entenderá que dicha matriz en blanco puede contener un nivel nativo de lisoesfingomielina libre y del compuesto 509.
En una realización de la presente invención el nivel de un biomarcador es indicativo de que el sujeto padece o está en riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno. El nivel del biomarcador determinado por el método de acuerdo con la presente invención se compara con un nivel de control del biomarcador, en donde el resultado de dicha comparación permite diagnosticar una enfermedad.
Más específicamente, comparar el nivel del biomarcador en la muestra del sujeto con el nivel de control del biomarcador comprende comparar el nivel del biomarcador en la muestra del sujeto con un valor de corte, en donde si el nivel del biomarcador en la muestra del sujeto está elevado, aumentado o es más elevado en comparación con el valor de corte, esto es indicativo de que el sujeto padece o está en riesgo de desarrollar la enfermedad de Niemann-Pick, y/o preferiblemente la enfermedad de Niemann-Pick de tipo A y B, la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C, y/o portador de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C; y/o en donde si un nivel del biomarcador en la muestra del sujeto está disminuido o es menor en comparación con el valor de corte, esto es indicativo de que el sujeto no padece o no está en riesgo de desarrollar la enfermedad de Niemann-Pick.
Lo mismo se aplica si una relación de dos biomarcadores de acuerdo con la presente invención se compara con un valor de corte, en donde si un nivel del biomarcador en la muestra del sujeto es elevado, aumentado o más elevado en comparación con el valor de corte, esto es indicativo de que el sujeto padece o está en riesgo de desarrollar la enfermedad de Niemann-Pick, y/o preferiblemente la enfermedad de Niemann-Pick de tipo A y B, enfermedad de Niemann-Pick de tipo C, y/o portador de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C, más preferiblemente la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C.
La expresión “que está en riesgo de desarrollar una enfermedad” tal como se utiliza en el presente documento significa que es probable que un sujeto padezca de dicha enfermedad y/o desarrolle dicha enfermedad o síntomas asociados con dicha enfermedad, particularmente si no se aplica ningún tratamiento. En relación con lo mismo, ha de reconocerse que los TAL son trastornos genéticos y por tanto la existencia de familiares, particularmente los padres, que tengan dicha enfermedad o que tengan una mutación que se conozca sea la causa de dicha enfermedad, son indicativos para que un sujeto, p. ej. el hijo de dos pacientes de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C, esté en riesgo de desarrollar dicha enfermedad. Se reconocerá adicionalmente que la progresión de una enfermedad está unida a la existencia de síntomas además de la gravedad de dichos síntomas. Por consiguiente, una persona que no sufre los síntomas en la actualidad, sin embargo, puede estar en riesgo de desarrollar la enfermedad, por ejemplo, porque aunque las mutaciones genéticas de un gen, que se sabe causan una enfermedad, estén presentes, no tiene lugar ningún síntoma grave. No obstante, se entenderá inmediatamente que los métodos y biomarcadores de la presente invención, particularmente si el nivel o niveles de dicho biomarcador o biomarcadores de acuerdo con la presente invención están elevados, permiten diagnosticar que dicho sujeto esté en riesgo de desarrollar la enfermedad independientemente de la presencia o ausencia de síntomas. Por consiguiente, los métodos de acuerdo con la presente invención permiten determinar si un sujeto está en riesgo de padecer la enfermedad de Niemann-Pick. Está también dentro de la presente invención que una terapia va a ser aplicada, mantenida, reducida, elevada o no aplicada en base a si el sujeto está en riesgo de padecer o no la enfermedad de Niemann-Pick.
También está dentro de la presente invención que comparar el nivel del biomarcador en la muestra del sujeto con un nivel de control permite determinar la gravedad de la enfermedad de Niemann-Pick, en donde si un nivel del biomarcador en la muestra del sujeto está elevado, aumentado o es más elevada en comparación con el nivel del control esto es indicativo de que el sujeto padece o está en riesgo de desarrollar la enfermedad de Niemann-Pick de un estado o progresión más grave; y en donde si un nivel del biomarcador en la muestra del sujeto está reducido o es inferior en comparación con el nivel de control, eso es indicativo de que el sujeto padece o está en riesgo de desarrollar la enfermedad de Niemann-Pick de un estado o progresión menos grave. En una realización adicional de la presente invención que compara el nivel del biomarcador en la muestra del sujeto con el nivel de control comprende comparar un nivel del biomarcador en dicho sujeto con un nivel del biomarcador detectado en una muestra de un control, en donde si un nivel del biomarcador en la muestra del sujeto está elevado, aumentado o es más elevado en comparación con la muestra de control, esto es indicativo de que el sujeto padece y/o está en riesgo de desarrollar la enfermedad de Niemann-Pick; y/o un nivel del biomarcador en la muestra del sujeto está elevado, aumentado o es más elevado en comparación con la muestra de control, esto es indicativo de que el sujeto padece o está en riesgo de desarrollar la enfermedad de Niemann-Pick de un estado o progresión más grave. Dicho control se selecciona preferiblemente del grupo que comprende sujetos sanos, sujetos que padecen la enfermedad de Niemann-Pick o están en riesgo de sufrir los síntomas de la enfermedad de Niemann-Pick, sujetos que han dado positivo en una mutación o una combinación de mutaciones de los genes SMPD1, NPC1 y NPC2, en donde la mutación o la combinación de mutaciones de los genes SMPD1, NPC1 y NPC2 son indicativas de una perspectiva de que el sujeto desarrolle la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C de un estado o progresión más grave o menos grave. En una realización adicional de la presente invención ese nivel de control se determina en una muestra de un control, en donde se añade opcionalmente lisoesfingomielina libre y el compuesto 509 a la muestra del control en una cantidad específica antes de determinar el nivel de lisoesfingomielina libre y/o del compuesto 509 en la muestra del control.
Es mérito de los presentes inventores que pudiera establecerse un método para diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto, en donde el método comprende detectar un biomarcador en una muestra de un sujeto, en donde el biomarcador es lisoesfingomielina libre y/o el compuesto 509, preferiblemente que comprende además determinar el nivel del biomarcador en la muestra del sujeto, y más preferiblemente que comprende además comparar dicho nivel del biomarcador en la muestra del sujeto con un valor de corte, que muestra alta sensibilidad, es decir, una sensibilidad de al menos 99,0%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% o 100%. En otras palabras, la sensibilidad, que significa la proporción de positivos reales que están identificados correctamente como tal es elevada, lo que significa que el porcentaje de pacientes con enfermedad de Niemann-Pick identificados correctamente como que tienen la enfermedad, es tan alto como ha sido definido anteriormente. En contraste, en un ensayo estadístico según se ha descrito en el presente documento especificidad significa la proporción de negativos que están identificados correctamente como negativos, en otras palabras el porcentaje de pacientes sanos identificados correctamente como que no tienen la enfermedad de Niemann-Pick. Un experto en la técnica reconocerá que, de este modo, una predicción óptima de una prueba diagnóstica, tal como en algunas realizaciones de los métodos de acuerdo con la presente invención, en general pretende lograr el 100% de sensibilidad, es decir predecir que todos los pacientes que tienen una enfermedad, tal como la enfermedad de Niemann-Pick o que están en riesgo de padecer esa enfermedad, tienen la enfermedad o están en riesgo de padecer esa enfermedad, respectivamente.
En una realización de los métodos de acuerdo con la presente invención se prefiere una especificidad de al menos 80,0%, 85,0%, 90,0%, 97,5%, 99,0%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% o 100%. En una realización adicional de la presente invención, los métodos de acuerdo con la presente invención permiten diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick en el sujeto. Más específicamente, los métodos de la presente invención permiten diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto independientemente del estado de progresión de la enfermedad de Niemann-Pick en el sujeto. Más específicamente, los métodos de la presente invención permiten diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto que tiene un estado temprano de la enfermedad de Niemann-Pick, además de en un sujeto que tiene un estado avanzado o desarrollado de la enfermedad de Niemann-Pick.
El poder de un método para diagnosticar correctamente la enfermedad de Niemann-Pick, más particularmente la enfermedad de Niemann-Pick de tipo A y B o enfermedad de Niemann-Pick de tipo C portador de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C, se mide comúnmente como la sensibilidad del método, la especificidad del método o el área bajo la curva característica operativa del receptor (también denominada en el presente documento como “curva r O c ” ). Una curva ROC es un gráfico de la tasa positiva real frente a la tasa de falsos positivos para los diferentes valores de corte posibles de un método diagnóstico. Una curva ROC muestra la relación entre la sensibilidad y la especificidad. La sensibilidad es el porcentaje de positivos reales que un ensayo predice que son positivos, mientras que la especificidad es el porcentaje de negativos reales que un ensayo predice que son negativos. Una curva ROC proporciona la sensibilidad de un ensayo en función de 1-especificidad. Cuanto mayor es el área bajo la curva ROC más potente es el valor predictivo del ensayo. Por consiguiente, un aumento en la sensibilidad estará acompañado de una disminución de la especificidad. Cuanto más cerca siga la curva el eje izquierdo y después el borde superior del espacio ROC, más preciso será el ensayo. Por el contrario, cuanto más cerca vaya la curva a la diagonal a 45 grados del gráfico ROC, menos preciso será el ensayo. Por lo tanto, el área bajo de la ROC es una medida de la precisión del ensayo. La precisión del ensayo depende de cómo de bien el ensayo separe el grupo que se está sometiendo a ensayo en aquellos con y sin la enfermedad en cuestión. Un área bajo la curva (también denominada en el presente documento como “AUC”, del inglés “Area Under the Curve”) de 1 representa un método perfecto, mientras que un área de 0,5 representa un método menos útil. Por tanto, los métodos diagnósticos preferidos de la presente invención tienen una AUC mayor de 0,50, más preferiblemente los métodos tienen una AUC mayor que 0,9 y lo más preferiblemente los métodos tienen una AUC mayor que 0,97.
Otras medidas útiles y adecuadas para la utilidad de un método son el valor predictivo positivo y el valor predictivo negativo. Un valor predictivo positivo es el porcentaje de los positivos reales que dan positivo en el ensayo. Un valor predictivo negativo es el porcentaje de negativos reales que dan negativo en el ensayo.
Un experto en la técnica reconocerá que aunque la especificidad y/o la sensibilidad de los métodos de acuerdo con la presente invención son tan altas como se describe anteriormente, y se determinaron tal como se describe en los ejemplos de aquí en adelante, no pueden excluirse casos individuales en los que un paciente que tiene la enfermedad de Niemann-Pick da un falso negativo o en los que un paciente que no tiene la enfermedad de Niemann-Pick da un falso positivo con un método de la invención. Un experto en la técnica reconocerá por tanto que de acuerdo con los métodos según la presente invención, en donde un nivel de un biomarcador o una relación de los niveles de dos biomarcadores, se compara con un valor de corte y en donde dicha comparación con dicho valor de corte es para su uso para el diagnóstico diferencial de una enfermedad, que comprende cada uno y cualquiera de entre la enfermedad de Niemann-Pick de tipo A y B, enfermedad de Niemann-Pick de tipo C y portador de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C, dicho valor de corte representa un nivel de dicho biomarcador y/o un valor de dicha relación que distingue una enfermedad en particular de otra, p.ej. que distingue un nivel de un biomarcador indicativo de que el sujeto tiene la enfermedad de Niemann-Pick de tipo A o B, de un nivel de un biomarcador indicativo de que el sujeto tiene la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C, y/o de un nivel y/o un valor en un sujeto sano. Habiendo dicho esto, es obvio para el experto en la técnica que también de acuerdo con los métodos de la presente invención, en donde el método es para el diagnóstico diferencial de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo A y B, la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C y/o portador de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C, no pueden excluirse casos individuales en los que un paciente que tiene la enfermedad de Niemann-Pick da un falso negativo en un ensayo o en los que un paciente que no tiene la enfermedad de Niemann-Pick da un falso positivo en un ensayo, o en los que el tipo y/o el estado es diagnosticado incorrectamente con un método de la invención.
Teniendo en cuenta dichos casos mientras que se determina la especificidad y la sensibilidad del método de acuerdo con la presente invención, la especificidad y la sensibilidad será inferior que los valores descritos anteriormente. No obstante, el experto en la técnica también reconocerá que dicha alta especificidad y dicha alta sensibilidad como se ha definido anteriormente, no ha sido descrito nunca antes para un método para diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick. Por lo tanto, es importante señalar que aunque la sensibilidad y la especificidad del método de la presente invención pueden variar si unos colectivos de pacientes distintos del descrito en las sección de los ejemplos, p. ej. variando el número de pacientes, se someten a los métodos de la presente invención, es una creencia firme de los inventores que ningún método conocido en la técnica anterior que utilice especialmente biomarcadores logra una mayor especificidad y una mayor sensibilidad en comparación con los métodos de acuerdo con la presente invención. Esto es especialmente cierto debido a que el límite de detección de los métodos de la presente invención permite determinar el nivel de lisoesfingomielina libre y el compuesto 509 en sujetos sanos. Por consiguiente, un sujeto enfermo que ha dado falso negativo en un ensayo aplicando los métodos de la presente invención, ha dado falso negativo por la razón de que un nivel del biomarcador en una muestra de dicho sujeto enfermo que ha dado falso negativo es tan alto como el nivel del biomarcador en una muestra de un sujeto sano. En particular, es importante señalar que dicho sujeto que ha dado falso negativo no ha dado negativo por la razón de que el nivel del biomarcador fuera demasiado bajo para ser determinado por el método de la presente invención.
Un “límite de detección” de una sustancia tal como lisoesfingomielina libre y/o el compuesto 509, tal como se utiliza en el presente documento, es preferiblemente un nivel de la sustancia determinada por un método para determinar un nivel de la sustancia, en donde un nivel menor que inferior que dicho límite de detección no puede determinarse por dicho método. Por tanto, queda inmediatamente claro que un “valor de corte” y un “límite de detección”, tal como se utilizan en el presente documento, no son, preferiblemente, necesariamente idénticos, aunque ambos reflejan un cierto nivel de una sustancia, p. ej., de un biomarcador de la presente invención. Se entenderá inmediatamente que en contraste con lo anterior, se seleccionará preferiblemente un valor de corte de tal manera que la selectividad y la sensibilidad del método de manera sean tan altas como sea posible. En contraste con lo anterior, un límite de detección representa un nivel absoluto del biomarcador de la presente invención que refleja el nivel mínimo del biomarcador que puede detectarse con un método para determinar el nivel de dicho biomarcador. Queda por tanto inmediatamente claro que un límite de detección depende del método para determinar un nivel de una sustancia, y de la sustancia cuyo nivel va a ser determinado por dicho método. Un experto entenderá inmediatamente que un alto límite de detección, p. ej., mayor que un valor de corte ideal, posiblemente daría como resultado una baja sensibilidad del método, ya que el porcentaje de positivos reales que un ensayo predice que son positivos también depende de si puede determinarse un nivel del biomarcador para dichos positivos reales. En otras palabras, si el límite de detección es mayor que un valor de corte ideal, los positivos reales que tienen un nivel del biomarcador ligeramente mayor que el valor de corte no pueden distinguirse de los negativos reales que tienen un nivel del biomarcador inferior que el valor de corte ya que ningún nivel del biomarcador puede determinarse tanto para positivos reales que tienen un nivel del biomarcador ligeramente más elevado que el valor de corte como para los negativos que tienen un nivel del biomarcador menor que el valor de corte. Queda por tanto inmediatamente claro que un bajo límite de detección es una ventaja. Es por lo tanto también mérito de los inventores mostrar que un límite de detección menor permite a un método diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto que comprende una etapa para determinar un nivel del biomarcador presente en la muestra con una mayor selectividad y sensibilidad. Un “valor de corte ideal” tal como se utiliza en el presente documento, es preferiblemente el valor de corte tal como se describe en el presente documento; el método que utiliza dicho valor de corte ideal tiene la selectividad y sensibilidad más alta.
Es una realización de los métodos de acuerdo con la presente invención según se define en las reivindicaciones, que dichos métodos comprendan una etapa de validación de dicho método diagnosticando una enfermedad o trastorno, preferiblemente la enfermedad de Niemann-Pick, en un sujeto mediante el método de la presente invención; una etapa de diagnóstico de la enfermedad o trastorno, preferiblemente la enfermedad de Niemann-Pick, en un sujeto mediante una prueba genética, que comprende la secuenciación de un gen, preferiblemente la secuenciación de un gen cuya mutación se conoce por parte del experto en la técnica que causa la enfermedad o trastorno, más preferiblemente la secuenciación de los genes NPC1 y NPC2 en el caso de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C y portador de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C, y el gen SMPD1 en el caso de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo A y B; y comparar los resultados de dicho método y dicha prueba genética. Un sujeto sano tal como se utiliza en el presente documento, preferiblemente se considera que está sano con respecto a una enfermedad o trastorno si dicho sujeto no sufre los síntomas asociados con dicha enfermedad o trastorno, y si el resultado de una prueba genética no revela ninguna mutación de un gen, cuya mutación es conocido por un experto en la técnica que causa la enfermedad o trastorno. También se entiende que un sujeto sano es un sujeto que da positivo en un ensayo en no tener la enfermedad de Niemann-Pick. En una realización preferida, un sujeto sano es un sujeto que no es portador de la enfermedad de Niemann-Pick, más preferiblemente que no es portador de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C.
El término “clasificar el estado de la enfermedad de Niemann-Pick” en un sujeto tal como se utiliza en el presente documento, preferiblemente hace referencia a una clasificación del perfil de un biomarcador del sujeto seleccionado del grupo que comprende identificar o detectar la presencia o ausencia de la enfermedad de Niemann-Pick en el sujeto, predecir la aparición de o el riesgo de desarrollar la enfermedad de Niemann-Pick en el sujeto, determinar el curso de la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto, determinar y/o predecir la gravedad de la enfermedad de Gauche Niemann-Pick en un sujeto, determinar si un sujeto padece un estado temprano de la enfermedad de Niemann-Pick o un estado avanzado o desarrollado de la enfermedad de Niemann-Pick o determinar si un nivel de un biomarcador en un sujeto ha cambiado significativamente con el tiempo.
El término “gestionar el tratamiento del sujeto” o “gestión del sujeto” tal como se utiliza en el presente documento, hace referencia preferiblemente al comportamiento del clínico o médico después de la determinación del estado de la enfermedad de Niemann-Pick. Por ejemplo, si el resultado del método de acuerdo con la presente invención no es concluyente o hay razones por las que la confirmación del estado es necesaria, el médico puede ordenar nuevas pruebas, tales como someter a prueba la función de las proteínas afectadas y/o la secuenciación de los genes SMPD1, NPC1 y NPC2, respectivamente. De forma alternativa, si el estado indica que es apropiado tratar la enfermedad de Niemann-Pick, el médico puede programar que el sujeto sea tratado para la enfermedad de Niemann-Pick de tipo A y B o enfermedad de Niemann-Pick de tipo C. Asimismo, si el estado es negativo o si los resultados muestran que el tratamiento ha tenido éxito, no es necesaria una gestión adicional. No obstante, un experto en la técnica reconocerá inmediatamente que además de la terapia génica puede aplicarse cualquier terapia. Además, es una realización de la presente invención que la gestión del tratamiento del sujeto comprenda la titulación de la dosis de un fármaco aplicado como un tratamiento para la enfermedad de Niemann-Pick, p. ej., unidades de enzima recombinante aplicadas en TSE, administradas a un paciente. En algunas realizaciones de los métodos de la presente invención en donde un nivel de un biomarcador presente en una muestra de un sujeto y/o una relación de los niveles de dos biomarcadores se determina en diversos puntos en el tiempo, o se compara con otros niveles del biomarcador, un valor de corte y/o un nivel de dicho biomarcador en un control y/u otro valor de una relación de los niveles de dos biomarcadores, un experto sugerirá, determinará o decidirá aplicar o no aplicar una terapia, o modificar una terapia ya aplicada para tratar o no tratar, o continuar tratando la enfermedad de Niemann-Pick.
Está dentro de la presente invención que un experto sugiera aplicar una dosis y/o mantener una dosis o modificar una dosis, p. ej., aplicar una dosis o una dosis más elevada, es decir, elevar una dosis, si dicha comparación del nivel de un biomarcador y/o la relación de los niveles de dos biomarcadores muestra p. ej., que el nivel de dicho biomarcador y/o la relación de los niveles de dos biomarcadores es mayor que por ejemplo, un valor de corte, es decir se diagnostica que el paciente tiene la enfermedad de Niemann-Pick; o que un nivel y/o relación determinada en el mismo paciente antes en el tiempo es menor o igual, es decir, una terapia aplicada no es suficiente, es decir no da como resultado una disminución en dicho nivel. Por otro lado el experto sugerirá aplicar o no aplicar una dosis o mantener o reducir una dosis, p. ej. no aplicar ninguna dosis o una dosis inferior, es decir disminuir una dosis, si dicha comparación del nivel y/o la relación del nivel de un/dos biomarcadores muestra p. ej. que el nivel de dicho biomarcador y/o la relación de los niveles de dos biomarcadores es menor que por ejemplo, un valor de corte, es decir se diagnostica que el paciente no tiene la enfermedad de Niemann-Pick; o que un nivel y/o relación determinada en el mismo paciente antes en el tiempo es mayor, es decir una terapia aplicada es suficiente, es decir no da como resultado una disminución de dicho nivel. En una realización de la presente invención un nivel relativamente alto de lisoesfingomielina libre y/o el compuesto 509, basado en dicha comparación es indicativo para que se aplique una alta dosis de enzima recombinante en la TSE, y/o un nivel relativamente bajo de lisoesfingomielina libre y/o del compuesto 509 basado en dicha comparación es indicativo para que se aplique una dosis baja de enzima recombinante en la TSE. No obstante, también se entenderá inmediatamente que un experto considerará la historia de un paciente, es decir un experto que gestiona el tratamiento objeto de un paciente que padece la enfermedad de Niemann-Pick y que está siendo tratado de tal manera que el nivel de un biomarcador y/o la relación de los niveles de dos biomarcadores es menor que un valor de corte, por ejemplo, no decidirá detener el tratamiento en vez de reducir una dosis y aumentar el tiempo entre las aplicaciones adicionales de los métodos de la presente invención.
El curso de la enfermedad de Niemann-Pick puede determinarse por el método de acuerdo con la presente invención, determinando un nivel del biomarcador y/o una relación de los niveles de dos biomarcadores en la muestra del sujeto en diferentes puntos de tiempo en el curso de la enfermedad. Es importante señalar que una única aplicación de un método para diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick de acuerdo con la presente invención permite diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick, y en ciertas realizaciones comprende una etapa de gestión del tratamiento del sujeto en base al diagnóstico de si el sujeto padece o está en riesgo de desarrollar la enfermedad de Niemann-Pick. Si un sujeto, una muestra del cual se somete, por tanto, al método de la presente invención, da positivo en padecer o estar en riesgo de desarrollar la enfermedad de Niemann-Pick, un clínico experto sabrá cómo decidir con respecto a la gestión del tratamiento de dicho sujeto, es decir cómo será tratado el sujeto, p. ej., qué dosis determinada de enzima en relación con una TSE va a ser aplicada. Se entenderá inmediatamente que, independientemente de la decisión de un clínico experto sobre cómo gestionar el tratamiento del sujeto, el clínico experto puede decidir utilizar al menos una aplicación adicional del método de acuerdo con la presente invención en un punto de tiempo posterior. Es por tanto una realización de la presente invención que puedan compararse los niveles del biomarcador y/o la relación de los niveles de dos biomarcadores determinados en los diferentes puntos tiempo, en donde diferentes puntos de tiempo significa al menos dos puntos de tiempo. Sin desear estar sujeto a ninguna teoría, los presentes inventores han observado que el nivel del biomarcador de la presente invención y/o una relación de los niveles de dos biomarcadores en muestras de un paciente en particular, puede correlacionarse con la gravedad de la enfermedad en dicho paciente en el punto de tiempo en el que se toma la muestra del paciente. Se entenderá por tanto de forma inmediata que el nivel elevado del biomarcador y/o la relación elevada de los niveles de dos biomarcadores determinado en la muestra de un punto de tiempo posterior, en comparación con el nivel del biomarcador determinado y/o la relación de los niveles de dos biomarcadores determinado en la muestra de un punto de tiempo anterior, es indicativo de un estado más grave del sujeto en el punto de tiempo posterior en comparación con el estado del sujeto en el punto de tiempo anterior. Un nivel reducido del biomarcador y/o relación de los niveles de dos biomarcadores determinado en la muestra de un punto de tiempo posterior en comparación con el nivel del biomarcador y/o relación de los niveles de dos biomarcadores, del biomarcador determinado en la muestra de un punto de tiempo anterior es indicativo de un estado menos grave del sujeto en el punto de tiempo posterior en comparación con el estado del sujeto en un punto de tiempo anterior. Por consiguiente, en un aspecto la presente invención proporciona un método para determinar el curso de la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto que comprende la etapa de determinar en diversos puntos en el tiempo un nivel de un biomarcador y/o una relación de los niveles de dos biomarcadores presente en una muestra del sujeto, en donde el biomarcador es lisoesfingomielina libre y/o el compuesto 509. En un aspecto adicional la invención hace referencia a un método para determinar la efectividad de al menos un tratamiento aplicado a un sujeto que da positivo en padecer o estar en riesgo de desarrollar la enfermedad de Niemann-Pick que comprende la etapa de determinar en diversos puntos en el tiempo un nivel de un biomarcador y/o una relación de los niveles de dos biomarcadores presente en una muestra del sujeto, en donde el biomarcador es lisoesfingomielina libre y/o compuesto 509. Se entenderá inmediatamente por un experto en la técnica que los métodos de la presente invención permiten por tanto seleccionar una terapia y/o ajustar las dosis y/o la dosificación de una terapia seleccionada en base a los resultados del método de la invención. Si por ejemplo está programado que el sujeto sea tratado de la enfermedad de Niemann-Pick, el método para diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto de acuerdo con la presente invención puede ser aplicado cada 3 meses y los niveles del biomarcador y/o una relación de los niveles de dos biomarcadores determinados de ese modo, se compararán para determinar la efectividad del tratamiento o de los tratamientos y/o terapia/terapias aplicados al sujeto. Si el sujeto alcanza un estado, en donde se mantiene un nivel estable del biomarcador y/o una relación estable de los niveles de dos biomarcadores en el tiempo, la frecuencia de aplicación del método para diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto de acuerdo con la presente invención puede reducirse a cada 6 meses. Si la dosis de la terapia es modificada, p. ej., las unidades de enzima recombinante aplicadas en la TSE se reducen o aumentan, la frecuencia de aplicación del método para diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto de acuerdo con la presente invención puede volver a establecerse en 3 meses. Mediante comparación de los niveles determinados del biomarcador y/o las relaciones de los niveles de dos biomarcadores en las muestras del sujeto, el médico experto reconocerá si el nivel del biomarcador y/o la relación de los niveles de dos biomarcadores aumenta, disminuye o si se mantiene un nivel estable del biomarcador y/o una relación estable de los niveles de dos biomarcadores en el tiempo. Por consiguiente, el médico experto puede decidir reducir la dosis de la terapia, p. ej. las unidades de enzima recombinante aplicadas en la TSE; aumentar la dosis de la terapia; o mantener la dosis de la terapia de acuerdo con la comparación de los niveles del biomarcador y/o las relaciones de los niveles de dos biomarcadores determinados con el método de acuerdo con la presente invención. Una reducción de aproximadamente el 60% del nivel de lisoesfingomielina libre y/o el compuesto 509 dentro de un periodo de 12 meses, es indicativa de una terapia exitosa para la enfermedad de Niemann-Pick, en donde la reducción tal como se utiliza en el presente documento, preferiblemente significa que el nivel de lisoesfingomielina libre y/o el compuesto 509 determinado por el método de la presente invención determinado al final de un periodo de tiempo, se compara con el nivel de lisoesfingomielina libre y/o el compuesto 509 determinado por el método de la presente invención determinado al comienzo de dicho periodo de tiempo. Por consiguiente, el médico experto puede decidir reducir la dosis de la terapia aplicada o mantener la dosificación de la terapia. Si la reducción del nivel de lisoesfingomielina libre y/o el compuesto 509 es significativamente más débil, el médico experto puede decidir aumentar la dosificación de la terapia. Es también un mérito de los presentes inventores el haber reconocido que la reducción del nivel de lisoesfingomielina libre y la reducción del compuesto 509 se correlaciona con la efectividad de una terapia. Cuanto más fuerte sea la reducción del nivel de la lisoesfingomielina libre y/o cuanto más fuerte sea la reducción del compuesto 509 dentro de un periodo de tiempo, p. ej. 12 meses, más exitosa será una terapia, tal como por ejemplo TSE, TRS o la terapia de chaperonas. Es por tanto una realización adicional de la presente invención que el método de la presente invención sea para comparar la efectividad de una terapia o de al menos dos terapias aplicadas a un sujeto.
Un experto en la técnica reconocerá, por tanto, que la progresión, es decir el curso de la enfermedad de Niemann-Pick, además de la efectividad de una terapia en un único sujeto puede monitorizarse mediante determinación frecuente del nivel de lisoesfingomielina libre y/o el compuesto 509 y/o la relación de los niveles de dos biomarcadores en muestras del sujeto.
Un aspecto adicional la invención, según se define en las reivindicaciones, hace referencia a un método para determinar la efectividad de al menos un tratamiento aplicado a un sujeto que da positivo en padecer o estar en riesgo de desarrollar la enfermedad de Niemann-Pick que comprende la etapa de determinar, en diversos puntos en el tiempo, un nivel de un biomarcador y/o una relación de los niveles de dos biomarcadores presente en una muestra del sujeto, en donde el biomarcador es el compuesto 509 y/o lisoesfingomielina libre. En relación con lo que se ha definido anteriormente en relación con la gestión del tratamiento del sujeto, un experto en la técnica entenderá inmediatamente que la efectividad de un tratamiento o la combinación de al menos dos tratamientos puede compararse aplicando los métodos de la presente invención. Por tanto, es posible someter a prueba y comparar diversos nuevos fármacos, formas de dosificación, dosis o tratamientos para la enfermedad de Niemann-Pick mediante el método de la presente invención.
Es una realización de la presente invención que el método para diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick de acuerdo con la presente invención sea independiente de si el sujeto ha sido o no ha sido tratado anteriormente para la enfermedad de Niemann-Pick. Por tanto, la muestra del sujeto puede ser una muestra de un sujeto que ha sido tratado anteriormente para la enfermedad de Niemann-Pick además de una muestra de un sujeto que no ha sido tratado anteriormente para la enfermedad de Niemann-Pick. Es por tanto una realización adicional de la presente invención que el método de la presente invención comprenda una etapa de gestión del tratamiento del sujeto y/o de determinación de un nivel del biomarcador y/o una relación de los niveles de dos biomarcadores en la muestra del sujeto después de la gestión del sujeto. Dicho tratamiento del sujeto puede estar basado en el diagnóstico de si el sujeto padece o está en riesgo de desarrollar la enfermedad de Niemann-Pick; en la detección del biomarcador en una muestra del sujeto después de la gestión del sujeto; o en la determinación del nivel del biomarcador y/o la relación de los niveles de dos biomarcadores en la muestra del sujeto después de la gestión del sujeto. No obstante, un experto en la técnica entenderá que una muestra de algunos pacientes que no tienen la enfermedad de Niemann-Pick o de algunos pacientes que están siendo tratados con éxito para la enfermedad de Niemann-Pick mostrará un nivel de lisoesfingomielina libre y el compuesto 509 menor que el límite de detección.
Sin desear estar sujetos por cualquier teoría, los presentes inventores asumen que el nivel de lisoesfingomielina libre y el nivel del compuesto 509 y la relación del compuesto 509 con el nivel de lisoesfingomielina libre, respectivamente, presente en una muestra de un sujeto correlaciona además con la gravedad de la enfermedad en un sujeto que padece la enfermedad de Niemann-Pick. En relación con lo mismo, los presentes inventores que aunque, en principio, el nivel de lisoesfingomielina libre, el nivel del compuesto 509 y/o la relación del nivel del compuesto 509 al nivel de lisoesfingomielina libre es diferente en individuos en particular, y más específicamente puede ser diferente en individuos en particular que tienen la misma o las mismas mutaciones, que cuanto más elevado es un nivel de lisoesfingomielina libre, un nivel del compuesto 509 y una relación del nivel del compuesto 509 al nivel de lisoesfingomielina libre, respectivamente, mayor es la gravedad del curso de la enfermedad de Niemann-Pick en términos de una media estadística de acuerdo con una valoración clínica. De este modo el nivel de lisoesfingomielina libre, el nivel del compuesto 509 y/o la relación del compuesto 509 al nivel de lisoesfingomielina libre, respectivamente, se correlaciona con la gravedad de la enfermedad de Niemann-Pick en que en los pacientes que dan positivo en distintas mutaciones de los genes SMPD1, NPC1 y NPC2, respectivamente, que se sabe que causa generalmente un curso leve o un curso más grave de la enfermedad de Niemann-Pick, un nivel de lisoesfingomielina libre, un nivel del compuesto 509 y/o una relación del nivel del compuesto 509 al nivel de lisoesfingomielina libre, respectivamente, determinado en dichos pacientes se correlaciona estadísticamente con la gravedad relacionada generalmente con dicha mutación.
Por tanto, también se describe un método para determinar la gravedad de la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto que comprende una etapa de
a) determinar un nivel del biomarcador y/o una relación de los niveles de dos biomarcadores presente en una muestra del sujeto en donde el biomarcador es lisoesfingomielina libre y/o el compuesto 509 y una etapa de b) determinar la gravedad de la enfermedad de Niemann-Pick, p. ej., comparando el nivel de lisoesfingomielina libre y/o el compuesto 509 y/o la relación de los niveles de dos biomarcadores en un sujeto determinado preferiblemente mediante un método de la presente invención con una valoración clínica.
En relación con lo mismo, es importante señalar que si se determina un nivel de lisoesfingomielina libre, el nivel del compuesto 509 y/o la relación del nivel del compuesto 509 al nivel de lisoesfingomielina libre, respectivamente, en muestras de pacientes que padecen la enfermedad de Niemann-Pick que muestran una mutación ligada habitualmente a un curso más grave de la enfermedad de Niemann-Pick tras la secuenciación del gen respectivo (homozigota y un compuesto heterocigota) sometido a un método de la presente invención, un nivel medio de lisoesfingomielina, compuesto 509 y/o la relación del nivel del compuesto 509 al nivel de lisoesfingomielina libre, respectivamente, es más elevado que el nivel medio de la lisoesfingomielina libre, el compuesto 509 y/o la relación del nivel del compuesto 509 al nivel de lisoesfingomielina libre, respectivamente, determinado en muestras de pacientes que padecen la enfermedad de Niemann-Pick que muestran una mutación habitualmente ligada a un curso más grave de la enfermedad de Niemann-Pick tras la secuenciación del gen respectivo, aplicando el mismo método. Una “mutación ligada habitualmente a un curso más grave de la enfermedad de Niemann-Pick” tal como se utiliza en el presente documento preferiblemente se sabe que causa un curso más grave de la enfermedad de Niemann-Pick - esto es especialmente cierto en el caso de que el sujeto sea homocigoto como dicha mutación. En correspondencia con eso, en una realización se determina un nivel medio más alto de lisoesfingomielina libre, compuesto 509 y/o la relación del nivel del compuesto 509 al nivel de lisoesfingomielina libre, respectivamente, en el homocigoto en comparación con la mutación habitualmente ligada a un curso más leve de la enfermedad de Niemann-Pick. Además los pacientes que tienen un compuesto heterocigoto habitualmente ligado a un curso más grave de la enfermedad de Niemann-Pick, tienen un nivel de lisoesfingomielina libre significativamente inferior que los homocigotos. Un experto en la técnica conocerá valores clínicos para categorizar la gravedad de la enfermedad de Niemann-Pick o unos síntomas o una totalidad de síntomas de la misma. Es por tanto una realización del método de la presente invención que se prediga el curso de la enfermedad de Niemann-Pick en un paciente, y más particularmente que la gravedad de la enfermedad de Niemann-Pick se determine en base al nivel del biomarcador determinado de acuerdo con el método de la presente invención.
Un experto en la técnica reconocerá que un nivel del biomarcador de la presente invención determinado en una muestra de un sujeto en donde dicho nivel del biomarcador se correlaciona con la gravedad de la enfermedad de Niemann-Pick, tal como se describe anteriormente, será indicativo para aplicar una determinada terapia y/o dosis o dosificación de dicha terapia. Por ejemplo, si el nivel del biomarcador y/o la relación de los niveles de dos biomarcadores determinado de acuerdo con los métodos de la invención se correlacionan con el estado “grave” o “avanzado” de la enfermedad de Niemann-Pick, se realiza una pauta para el sujeto para el tratamiento de la enfermedad de Niemann-Pick y el método para diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto de acuerdo con la presente invención puede aplicarse cada 3 meses, y los niveles del biomarcador determinado de este modo se compararán para determinar la efectividad del tratamiento o tratamientos y/o terapia/terapias aplicados al sujeto. Si el sujeto alcanza un estado, en donde el nivel del biomarcador y/o la relación de los niveles de dos biomarcadores, respectivamente, se correlacionan con una enfermedad de Niemann-Pick “leve” o en donde se mantiene un nivel estable del biomarcador y/o una relación del biomarcador en el tiempo la frecuencia de la aplicación del método para diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto de acuerdo con la presente invención puede reducirse a cada 6 meses.
También se describe un método para determinar la efectividad de una composición para el tratamiento de la enfermedad de Niemann-Pick. Dicho método puede comprender las etapas de determinar un nivel de lisoesfingomielina libre y/o el compuesto 509 y/o una relación del compuesto 509 al nivel de lisoesfingomielina libre, respectivamente, en un sujeto que tiene la enfermedad de Niemann-Pick; administrar a dicho sujeto dicho compuesto en una cantidad suficiente para determinar la efectividad de dicho compuesto; volver a determinar el nivel de lisoesfingomielina libre y/o el compuesto 509 y/o la relación de los niveles del compuesto 509 al nivel de lisoesfingomielina libre, respectivamente, en dicho sujeto; comparar el nivel de lisoesfingomielina libre y/o el compuesto 509 y/o la relación de los niveles del compuesto 509 al nivel de lisoesfingomielina libre, respectivamente, determinado antes y después de administrar dicha composición, en donde un nivel más bajo de lisoesfingomielina libre y/o el compuesto 509 y/o una relación menor de los niveles del compuesto 509 al nivel de la lisoesfingomielina libre, respectivamente, determinado después de administrar dicha composición en comparación con el nivel de lisoesfingomielina libre y/o el compuesto 509 y/o la relación de los niveles del compuesto 509 al nivel de lisoesfingomielina libre, respectivamente, determinado después de administrar dicha composición indica la efectividad de dicho compuesto para tratar la enfermedad de Niemann-Pick.
La enfermedad de Niemann-Pick afecta en su mayor parte a niños y a menudo fallecen a una edad joven e impredecible, muchos a los pocos meses o años de nacer. Muchos otros niños mueren de esta enfermedad tras años de sufrir diversos síntomas de su trastorno.
Un biomarcador preferible para el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick, preferible la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C, permitiría un diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick, preferiblemente la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C, con alta sensibilidad y alta especificidad independientemente de la edad del sujeto.
Es mérito de los presentes inventores haber observado que los biomarcadores de la presente invención son útiles para el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto independientemente de la edad del sujeto. Es por tanto una realización de la presente invención que el método de la presente invención permita el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto independientemente de la edad. En una realización preferida del método de la presente invención el sujeto es un sujeto de edad joven. Un sujeto de edad joven tal como se utiliza en el presente documento es un sujeto de menos de 30 años de edad, más preferiblemente de menos de 20 años de edad y lo más preferiblemente de menos de 10 años de edad.
La presente invención se ilustra ahora adicionalmente mediante las siguientes figuras y ejemplos a partir de las cuales pueden tomarse características, realizaciones y ventajas adicionales.
Más específicamente,
La Fig. 1 es un diagrama de cajas que indica los niveles del compuesto 465 en ng/ml en plasma;
La Fig. 2 es un diagrama de cajas que indica los niveles del compuesto 509 en ng/ml de plasma;
Las Figs. 4A, 4B y 4C son gráficos que muestran características operativas del receptor (ROC) para el diagnóstico de NP de tipo A y B;
Las Figs. 5A, 5B y 5C son gráficos que muestran curvas características operativas del receptor (ROC) para el diagnóstico de NP de tipo C;
La Fig.6 es un gráfico que muestra curvas características operativas del receptor (ROC) del compuesto 465 y del compuesto 509 para el diagnóstico de portador de NP de tipo;
La Fig.7 es un diagrama que muestra los niveles en plasma de un biomarcador de la presente invención como una función en el tiempo durante un total de 6 pacientes de enfermedad de Niemann-Pick de tipo C y 1 portador de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C;
La Fig. 8A es un cromatograma espectrómetrico de masas-HPLC que muestra la intensidad de picos de la lisoesfingomielina libre, el compuesto 509 y el PI de un sujeto sano;
Las Figs.8B, 8C, 8D y 8E son cromatogramas que muestran la intensidad del pico de la lisoesfingomielina libre, el compuesto 509 y el PI de un paciente con la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C;
Las Figs. 9A, 9B, 9C y 9D son diagramas de cajas o nubes de puntos que indican los niveles del compuesto 465 o el compuesto 509 en ng/ml en plasma dependiendo de la edad de los pacientes.
Ejemplos
En los Ejemplos descritos a continuación se utilizó plasma humano como una muestra de un sujeto. No obstante, un experto en la técnica reconocerá que dependiendo del tipo de muestra utilizada de un sujeto, p. ej., que comprende saliva, licor, plasma, suero, sangre completa, sangre en una tarjeta de filtro de sangre seca u otro producto sanguíneo, el método de la presente invención ha de ser ajustado al tipo de muestra y además un valor de corte tiene que ser determinado para cada tipo de muestra de acuerdo con el método descrito en los siguientes ejemplos. Los presentes inventores han observado que utilizar una muestra de suero humano en el método tal como se describe a continuación, en lugar de una muestra de plasma humano, conducirá a resultados idénticos en términos del nivel de lisoesfingomielina y el compuesto 509, respectivamente, si la muestra de suero humano y la muestra de plasma humano se toman del mismo sujeto, en el mismo punto de tiempo, y si las muestras fueron medidas en paralelo; y, más en particular, conducirán al mismo valor de corte.
Ejemplo 1: Método para la detección de lisoesfingomielina libre y/o el compuesto 509 en suero humano
Equipo
Para detectar la lisoesfingomielina libre y/o una sustancia con peso molecular de 508, detectada como una transición MRM en modo positivo de 509 m/z a 184 m/z, también denominado en el presente documento como compuesto 509 en una muestra de plasma de un sujeto, se utilizó el siguiente equipo.
Aparato / pieza de equipo Tipo / productor
Bomba de HPLC Serie 200, Perkin Elmer, EE.UU.
Inyector de muestra Serie 200, Perkin Elmer, EE.UU.
Horno de columna Serie 200, Perkin Elmer, EE.UU.
Detector selectivo de masa API 4000 Q TRAP, AB SCIEX, EE.UU./Canadá Agitador de tipo vórtex multi-tubo DVX-2500 Henry Troemner LLC, EE.UU.
Agitador de tipo vórtex Vortex Genie 2; Scientific Industries, EE.UU.
Centrífuga Megafuge 1.0; Heraeus, Alemania
Aparato / pieza de equipo Tipo / productor
Multipeta(s), pipeta(s) Eppendorf, Alemania
Baño de agua SW21-C, Julabo, Alemania
Reactivos
Para detectar la lisoesfingomielina libre y/o el compuesto 509 en una muestra de plasma de un sujeto, se utilizaron los siguientes reactivos.
Hasta el punto en que los valores dependen de la temperatura (p. ej., el valor de pH) dichos valores se determinaron a una temperatura de 25°C.
Reactivo Pureza
Acetonitrilo (ACN) Grado HPLC o grado gradiente
Acetona 99,5%
Dimetilsulfóxido (DMSO) Grado HPLC
Etanol (EtOH) p.a., 96 %
Ácido fórmico (FA) p.a., 98 - 100 %
Metanol (MeOH) Gradiente (LiChrosolv)
Ácido trifluoroacético (TFA) Puro > 98 %
Agua ASTM-I
La abreviatura “p.a.” tal como se utiliza en el presente documento significa “pro análisis”.
El término “puro” tal como se utiliza en el presente documento, significa preferiblemente un grado comercial de un compuesto químico que tiene una pureza del valor especificado anteriormente.
ASTM-I tal como se utiliza en el presente documento hace referencia a una pureza estándar de grado de agua lograda por métodos de purificación que comprenden ósmosis inversa y oxidación ultravioleta (UV).
Preparación de los patrones de calibración
Se preparó una solución madre de lisoesfingomielina disolviendo 2,16 mg de lisoesfingomielina (según se distribuye por Matreya, con la pureza establecida como 95,1%) en 5 ml de MeOH/agua (1:4; v/v).
Posteriormente se preparó la solución V1-A como una mezcla de 74 pl de solución madre de lisoesfingomielina y 5 ml de MeOH/agua (1:4; v/v) tal como se representa a continuación:
Marca de Conc. Exp. Volume de solución Volumen de disolvente solución [pg/mL] solución [pL] disolvente [mL]
V1-A 6,0803 74 Lisoesfingomielina- 5 DMSO/MeOH madre (1:4; v/v)
Posteriormente, se prepararon los patrones de calibración adicionando una solución V1-A o patrones de calibración con una concentración más elevada en el disolvente MeOH/agua (1:1; v/v).
Un esquema de adición detallado se representa a continuación.
Marca de solución concentración Volumen Volumen
resultante [ng/mL] solución nte Vol de solución [pL] de disolvente disolve umen [ml] [mL]
Std5A-NPC 200,26 119,2 V1-A 3,5 MeOH/water 3,0303 Volumen
Marca de solución concentración Volumen Volumen resultante [ng/mL] solución
de solución [pL] de disolvente disolvente [ml]
[mL]
(1:1; v/v)
Std4A-NPC 60,002 29,9 V1-A 3 MeOH/water 3,0927
(1:1; v/v)
Std3A-NPC 18,040 297 Std5A- 3 MeOH/agua 3,297 NPC (1:1; v/v)
Std2A-NPC 6,0025 92,7 Std5A- 3 MeOH/agua 3,0299
NPC (1:1; v/v)
Std1A-NPC 2,0024 30,3 Std5A-NPC 3 MeOH/agua 3,6192
(1:1; v/v)
Para la calibración, se utilizaron todos los patrones de calibración mencionados anteriormente que tienen cinco niveles de concentración entre 2,00 y 200 ng/ml.
Preparación de muestras de control
Las muestras de control se prepararon adicionando una solución V1-A en una matriz en blanco.
Un esquema de adición detallado se representa a continuación.
Marca de la solución concentración Volumen de la olumen de la matriz Volumen resultante [ng/ml] solución [pL] Solución V
en blanco [ml] [ml] QC-A1-NPC Concentración 3 *
nativa
QC-B1-NPC 100,07 50,2 V1-A 3 3,0502 * la concentración nativa está por debajo de 10 ng/ml, por lo tanto el nivel de QC-B1-NPC casi no se ve influenciado.
Matriz en blanco
Como una matriz en blanco, se utilizó el plasma humano de un sujeto sano. Un experto en la técnica reconocerá que dicho plasma de un sujeto sano contendrá un nivel nativo de lisoesfingomielina libre y/o un nivel nativo del compuesto 509. Dicho nivel nativo de lisoesfingomielina libre es aproximadamente 3,9 ng/ml de acuerdo con los métodos de la presente invención. Por tanto, es obvio que las muestras de control preparadas por adición de la matriz en blanco, comprendiendo la matriz en blanco dicho nivel nativo de lisoesfingomielina libre y compuesto 509, respectivamente, también comprende dicho nivel nativo de lisoesfingomielina libre y el compuesto 509, además del nivel de lisoesfingomielina libre y/o el compuesto 509 obtenido por adición con una solución concentrada o una muestra de control con una concentración más elevada. Por consiguiente, el nivel de lisoesfingomielina libre en las muestras de control es el siguiente:
QC-B1-NPC 100 ng/ml concentración nativa en matriz en blanco
Un experto en la técnica reconocerá que el plasma humano de un sujeto sano utilizado como matriz en blanco puede ser adquirido en cualquier establecimiento comercial conocido por un experto en la técnica. Es importante señalar que si accidentalmente se utiliza plasma de un sujeto no sano, es decir, de un sujeto que tiene la enfermedad de Niemann-Pick, como la matriz en blanco, esto tendrá como resultado unos niveles inusualmente elevados de lisoesfingomielina libre o compuesto 509 en las muestras de control determinadas por el método de acuerdo con la presente invención, y por tanto se reconocerá inmediatamente, ya que se determina que la tolerancia del método está en un intervalo del 15% por encima o por debajo de los niveles estimados de los controles sometidos al método de acuerdo con la presente invención.
Muestras de estudio
Preparación del patrón interno
La solución madre del patrón interno (PI1) se preparó disolviendo 1,00 mg de liso-Gb2 (tal como se distribuye por Matreya) en 2 ml de DMSO/MeOH (1/1; vol/vol).
Posteriormente se preparó la solución de trabajo del patrón interno como una mezcla de 410 |jl de solución madre de PI1 y 500 ml de etanol. El etanol puede ser adquirido en cualquier establecimiento comercial, en donde el etanol es etanol absoluto que tiene un grado adecuado para los métodos descritos en el presente documento. Un experto en la técnica reconocerá que las proteínas contenidas en 50 j l de una muestra tienen que precipitar si se añaden a la muestra 100 j l de dicha solución de trabajo del patrón interno.
Almacenamiento de muestras y soluciones
Las muestras de control o muestras de estudio o bien se almacenaron inmediatamente por debajo de -20°C de una vez o se transfirieron alícuotas en nuevos viales de cristal antes del almacenamiento en las mismas condiciones. Las soluciones concentradas (soluciones madre, V1-A-534, etc.) además de soluciones madre del patrón interno se congelaron por debajo de -20°C pendientes de la siguiente adición.
Las soluciones de trabajo del patrón interno se almacenaron entre 2°C y 8°C hasta su uso.
Sin desear estar sujetos por ninguna teoría, los presentes inventores asumen que la lisoesfingomielina libre y/o el compuesto 509, respectivamente, son estables en las soluciones mencionadas anteriormente. De forma más precisa, se observa que el nivel de lisoesfingomielina y el nivel del compuesto 509 de una muestra de plasma y/o suero de un paciente con enfermedad de Niemann-Pick determinado por los métodos de acuerdo con la presente invención eran idénticos, si el nivel de lisoesfingomielina libre y, respectivamente, el nivel del compuesto 509 se determinaba en dichas muestras antes y después del almacenamiento a 37°C durante 2 días. Por consiguiente, las soluciones y muestras de la presente invención pueden transportarse en una cantidad de formas bien conocidas por un experto en la técnica, en donde se prefiere el uso de una cadena fría para el transporte del material del paciente, pero no se requiere necesariamente. Un experto en la técnica también conocerá los métodos y sus respectivas condiciones para el apropiado almacenamiento de las soluciones y muestras, en donde, por ejemplo, dichas soluciones y muestras pueden almacenarse durante varias semanas.
Preparación de la muestra para el análisis
Todas las muestras utilizadas en un lote analítico se preparan para su análisis de la siguiente forma:
Las muestras congeladas se descongelaron a aproximadamente 20 a 25°C en un baño de agua tomado en condiciones ambiente. Después de descongelar, se mezclaron las muestras.
Se transfirieron 50 j l de la muestra a un vial de muestra.
Se añadieron a la muestra 100 j l de solución de trabajo del patrón interno (en EtOH).
La mezcla obtenida de este modo se mezcló posteriormente utilizando un dispositivo de tipo vórtex multi-tubo DVX-2500 a 2500 rpm durante aproximadamente 30 segundos.
La mezcla obtenida de este modo se centrifugó por separación de fases a 4000 rpm durante 2 minutos.
Se realizó transferencia de un volumen del sobrenadante adecuado para la finalidad de utilizarse en inyección (aproximadamente 100 jl) en viales automuestreadores apropiados (cónicos).
Métodos
Parámetros cromatográficos y de automuestreador
Las muestras preparadas para el análisis tal como se describe anteriormente, se sometieron posteriormente al método descrito a continuación:
Parámetro Intervalo programado / descripción
Disolvente A de fase móvil FA 50 mM en agua
Disolvente B de fase móvil
Figure imgf000035_0001
Ciclo cromatográfico 0,0 - 4,0 min gradiente lineal: 5 % B ^ (
4,1 - 5,1 min isocrático: 100 % B
5,1 - 5,9 min isocrático: 5 % B
Flujo 0,9 ml/min
Parámetro Intervalo programado / descripción
Volumen de inyección 5 pL
Lavado del inyector 0,1 % TFA en 70 % MeOH
Columna precolumna ACE 3 C8, 50 x 2,1 mm ID Security Guard C8
Temperatura de la columna 60°C
aprox. 3,2 a 3,4 min: lisoesfingomielina y liso-Gb 2 (IS) Tiempo de retención
aprox. 3,6 a 3,9 min: compuesto 509
La columna ACE 3 C8 (columna ACE C8 N° ACE-112-0502) utilizada en el presente documento ha sido adquirida en Advanced Chromatography Technologies, Aberdeen.
Una secuencia tal como se utiliza en el presente documento, preferiblemente, es un lote de números de muestras definidos, preferiblemente 250 como máximo, analizadas secuencialmente, en donde los parámetros que comprenden flujo y temperatura permanecen inalterados. Los ajustes y calibraciones realizados entre secuencias son conocidos por los expertos en la técnica y comprenden el intercambio de la columna.
Estos ajustes dentro de los límites especificados son cambios menores y se graban en los datos en bruto del estudio en la estación de medida.
Detección
Las muestras preparadas de este modo se sometieron posteriormente al método de detección cuyos parámetros se describen a continuación:
Modo de ionización de MS: Ionización por electrospray (IES)
Polaridad de MS: Positivo
Modo de detección de MS: Monitorización de reacción múltiple (MRM) Temperatura del vaporizador: 500°C ± 50°C
Voltaje de ionización: 5,5 kV
Gas de disociación activada por colisión (DAC): Bajo
Gas 1: Presión = 45 psi
Gas 2: Presión = 60 psi
Gas de cortina: Presión = 40 psi
Posición lateral: 5 unidades
Posición vertical: 4 unidades
Resolución del cuadrupolo unidad ^ unidad
Transiciones 465.4 ^ 184,1 m/z lyso-Sphingomyelin
624.5 ^ 282,2 m/z lyso-Gb2 (Internal Standard) 509.5 ^ 184,1 m/z compound 509
Transiciones 462.4 ^ 282,2 m/z lyso-Gb1
624.5 ^ 282,2 m/z lyso-Gb2 (Internal Standard) PD (potencial de desagrupado) 40 V
PSC (potencial de salida de la célula de colisión) 8 V
Un experto en la técnica reconocerá que los métodos para detectar lisoesfingomielina libre y/o el compuesto 509, y/o determinar el nivel de lisoesfingomielina y/o del compuesto 509 libre en una muestra de un sujeto utilizando el análisis espectrométrico de masas pueden también emplear otras transiciones y fragmentos que permitan la detección específica de y/o la cuantificación de lisoesfingomielina libre y/o del compuesto 509 en dicha muestra de un sujeto.
Evaluación y cálculo de los resultados
Para evaluar y para calcular los resultados obtenidos con los métodos especificados anteriormente, se aplicaron los siguientes protocolos.
Procedimiento de redondeo
Los datos de concentración alimentados y recuperados del sistema de datos cromatográficos (SDC) fueron redondeados a cinco dígitos significativos. Se realizaron cálculos adicionales en la hoja de cálculo para una completa precisión computacional y posteriormente se redondearon a los dígitos significativos / decimales que van a ser descritos. Por tanto, pueden ocurrir desviaciones de los resultados intermedios causadas por el redondeo. La precisión y los coeficientes de variación (CV) se describirán con uno y dos decimales, respectivamente.
Nota en referencia al procedimiento de redondeo: el último dígito descrito se redondearía al alza si el dígito posterior fuera igual o mayor que “5”.
Regresión y estadísticas
En base a los patrones de calibración se establecieron los ajustes de la curva de calibración utilizando el software de procesamiento de datos por medio de relaciones de las áreas de los picos (el área de pico de la lisoesfingomielina libre y el compuesto 509, respectivamente, contenida en la muestra del sujeto / área del pico del patrón interno). Las concentraciones de la lisoesfingomielina libre y el compuesto 509 se evaluaron utilizando un método A de regresión cuadrática (y = ax2 b x c) del patrón interno. Un modelo de regresión cuadrática que utilice el factor de ponderación 1/concentración se utilizará para calcular la concentración de cada analito en cada lote que va a ser evaluado. Las concentraciones se calcularon mediante la siguiente fórmula:
Figure imgf000037_0001
En base a la misma se calcularán los valores de media, los resultados de precisión (en términos de CV) y las precisiones (fórmula que se muestra a continuación) utilizando el programa “Lotus 123”.
Figure imgf000037_0002
Los modelos estadísticos apropiados se describen en, p. ej.,
Green, J.R., Statistical Treatment of Experimental Data (Elsevier, Nueva York, 1977), página 210 ff.
Lothar Sachs, Angewandte Statistik - Anwendung statistischer Methoden (Springer, Berlín, Heidelberg, Nueva York, Tokio 1984).
Un experto en la técnica reconocerá que de acuerdo con una sustancia, cuya estructura molecular no se conoce, un elemento de referencia no está sintetizado. La evaluación de dicha sustancia se basa por tanto en la relación del área de pico al patrón interno añadido a cada muestra y en la comparación entre pacientes y personas sanas, respectivamente.
Software
La adquisición de datos, el procesamiento de datos, las estadísticas y los cálculos se realizaron utilizando el software Analyst® 1.4.2 o superior (AB SCIEX, EE.UU./Canadá), además de Lotus 1-2-397 o superior (Lotus Corp, EE.UU.).
Manuales
Manual Arbeiten mit SmartSuite 97 (Lotus Development Corp., 1997)
Documentación
Documentation of Analyst® Software (AB SCIEX, EE.UU./Canadá):
de software utilizada
Manual del operador y apéndice del manual del operador “New Functionality in Analyst 1.2” y ayuda en red del Sistema Analyst 1.4 (o superior)
Ejemplo 2: Prueba genética y clasificación de los participantes del estudio
Después del consentimiento de los pacientes para su participación en el estudio, los pacientes se sometieron a una prueba genética para determinar las mutaciones de los genes SMPD1, NPC1 y NPC2. Por consiguiente, se secuenciaron de 5 a 10 ml de sangre en EDTA, de acuerdo con Seeman et al. (Seeman et al., 1995). Cuando resultara apropiado, se secuenciaron otros genes además los genes SMPD1, NPC1 y NPC2, particularmente en los controles. Dicho ensayo genético fue controlado utilizando muestras de ensayo de pacientes de control agrupados por edad y sexo.
Se analizaron 448 muestras de plasma de 304 sujetos. De forma más precisa, estaban disponibles para 274 pacientes una muestra de plasma, para 14 pacientes dos muestras de plasma, y para 16 pacientes más de dos muestras de plasma.
Según el resultado de la prueba genética descrita anteriormente, los pacientes que participaron en el estudio se clasificaron en los siguientes grupos:
1. ) Pacientes que tienen la enfermedad de Niemann-Pick de tipo A o B: el estándar de oro para el diagnóstico fue la detección de dos mutaciones patogénicas en el gen SMPD1, bien un homocigota o bien un compuesto heterocigoto (el grupo se denomina en las figuras como “Niemann-Pick de tipo A/B”);
2. ) Pacientes que tienen la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C: el estándar de oro para el diagnóstico fue la detección de mutaciones patogénicas en el gen NPC1 o NPC2, bien homocigota o un compuesto heterocigota (el grupo se denomina en las figuras como “Niemann-Pick de tipo C”
3. ) Pacientes que son portadores heterocigotos de una mutación en el gen NPC1 o NPC2 (habitualmente familiares de pacientes afectados) (el grupo se denomina en las figuras como “portador de Niemann-Pick de tipo C”)
4. ) Pacientes con otros trastornos de almacenamiento lisosómico como control (el grupo se denomina en las figuras como “otros TAL”); éste comprende pacientes con la enfermedad de Krabbe entre otras. Los pacientes que dieron positivo para la enfermedad de Gaucher se agruparon por separado; todos los diagnósticos han sido corroborados mediante la detección de dos mutaciones patogénicas.
5. ) Controles sanos agrupados por edad y género (el grupo se denomina en las figuras como “control”).
La distribución del género de los 304 pacientes se representa en la Tabla 1b.
Figure imgf000038_0001
La siguiente tabla 1C muestra la distribución de la edad de los 304 pacientes y la clasificación de dichos pacientes en base a los resultados de la prueba genética descrita anteriormente además del género de dichos pacientes.
Tabla 1c: Características de los pacientes, de 304 sujetos
Figure imgf000039_0001
El nivel de lisoesfingomielina libre y/o el compuesto 509 en las muestras de dichos 304 sujetos se determinó de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 1. La Tabla 1d muestra los niveles de la media y mediana de lisoesfingomielina libre y del compuesto 509, además de la relación del nivel del compuesto 509 al nivel de lisoesfingomielina libre en dichas muestras de dichos 304 sujetos.
Tabla 1d: Valores de la media (y amplitud intercuartilo) en los diferentes grupos
Figure imgf000039_0002
El nivel de la lisoesfingomielina libre en las muestras de dichos pacientes, dependiendo de la clasificación por análisis genético, se muestra en la Fig. 1.
La Fig.1 es un diagrama de cajas que indica los niveles de lisoesfingomielina libre, es decir el compuesto 465. El eje y demuestra los niveles logarítmicos de lisoesfingomielina libre en ng/ml determinados en plasma de pacientes mediante el método de acuerdo con la presente invención, en donde el eje x representa grupos de pacientes (dgn), que han sido agrupados según se describe en el Ejemplo 2. El diagrama de cajas representa el percentil 25 y 75 de cada grupo de pacientes en la parte inferior y la parte superior de la caja, respectivamente; la banda cerca del centro de la caja representa el percentil 50 (es decir, la media) de cada grupo; los bigotes representan una desviación estándar por encima y por debajo de la media de los datos; Cualquier dato no incluido entre los bigotes se muestra como un resultado discrepante con un pequeño círculo o asterisco.
Los casos procesados fueron los siguientes:
Figure imgf000040_0001
El nivel del compuesto 509 en las muestras de dichos pacientes, dependiendo de la clasificación por el análisis genético, se muestra en la Fig. 2.
La Fig.2 es un diagrama de cajas que indica los niveles del compuesto 509; el eje y demuestra los niveles logarítmicos del compuesto 509 en ng/ml determinados en plasma de pacientes mediante el método de acuerdo con la presente invención, en donde el eje x representa grupos de pacientes (dgn), que han sido agrupados según se describe en el Ejemplo 2. El diagrama de cajas representa el percentil 25 y 75 de cada grupo de pacientes en la parte inferior y la parte superior de la caja, respectivamente; la banda cerca del centro de la caja representa el percentil 50 (es decir, la media) de cada grupo; los bigotes representan una desviación estándar por encima y por debajo de la media de los datos; Cualquier dato no incluido entre los bigotes se muestra como un resultado discrepante con un pequeño círculo o asterisco.
Los casos procesados fueron los siguientes:
Figure imgf000040_0002
La relación del nivel del compuesto 509 y el nivel de lisoesfingomielina libre en muestras de dichos pacientes, dependiendo de la clasificación por análisis genético, se muestra en la Fig. 3.
La Fig.3 es un diagrama de cajas que indica la relación del nivel del compuesto 509 al nivel del compuesto 465, ambos determinados en el plasma de los pacientes mediante el método de acuerdo con la presente invención, en donde, el eje x representa grupos de pacientes (dgn), que han sido agrupados según se describe en el Ejemplo 2. El diagrama de cajas representa el percentil 25 y 75 de cada grupo de pacientes en la parte inferior y la parte superior de la caja, respectivamente; la banda cerca del centro de la caja representa el percentil 50 (es decir, la media) de cada grupo; los bigotes representan una desviación estándar por encima y por debajo de la media de los datos; Cualquier dato no incluido entre los bigotes se muestra como un resultado discrepante con un pequeño círculo o asterisco.
Los casos procesados fueron los siguientes:
Figure imgf000040_0003
Figure imgf000041_0002
El tipo de mutación y la distribución de los tipos de mutaciones del gen NPC1 en pacientes clasificados como pacientes de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C de acuerdo con los resultados obtenidos en el ensayo genético según se describe anteriormente se representa en la Tabla 2A a continuación.
Tabla 2A: Distribución de las mutaciones que son detectadas en pacientes con la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C; 48 de 72 mediciones son válidas / 36 individuos (dos mediciones por individuo)
Figure imgf000041_0001
Figure imgf000042_0001
El tipo de mutación y la distribución de los tipos de mutaciones del gen SMPD1 en pacientes clasificados como pacientes con la enfermedad de Niemann-Pick de tipo A/B de acuerdo con los resultados obtenidos en el ensayo genético según se ha descrito anteriormente, se representan en la Tabla 2B a continuación.
Tabla 2B: Distribución de mutaciones que son detectadas en pacientes con la enfermedad de Niemann-Pick de tipo A/B; 34 de 36 mediciones son válidas / 18 individuos (dos mediciones por individuo)
Figure imgf000042_0002
Ejemplo 3: Diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick utilizando lisoesfingomielina libre y/o el compuesto 509 como biomarcador.
Los protocolos descritos en el Ejemplo 1 anterior se utilizaron para generar cromatogramas de HPLC-espectrometría de masas de 448 muestras de plasma obtenidas de los 304 sujetos. Ejemplos de cromatogramas de HPLC-espectrometría de masas que representan la intensidad del pico de lisoesfingomielina libre y del PI de cuatro muestras de cuatro pacientes con enfermedad de Niemann-Pick de tipo C y una persona de control sana, se representan en la Fig. 8A, Fig. 8B, Fig. 8C, Fig. 8D y la Fig. 8E.
Más particularmente, la Fig.8A muestra cromatogramas de HPLC-espectrometría de masas que muestran la intensidad del pico en cps de lisoesfingomielina libre (panel superior), compuesto 509 (panel central) y el PI (panel inferior) de una muestra de un sujeto sano como una función en el tiempo de retención en minutos. La Fig.8B, la Fig.8C, la Fig.8D y la Fig.8E muestran cromatogramas de HPLC-espectrometría de masas que muestran la intensidad del pico en cps de lisoesfingomielina libre (panel superior), compuesto 509 (panel central) y PI (panel inferior) de una muestra de un sujeto sano como una función en el tiempo de retención en minutos. El tiempo de retención de una sustancia tal como se utiliza en el presente documento, se representa preferiblemente en el eje x y es el tiempo transcurrido entre el tiempo de inyección de un soluto, p. ej., un biomarcador de acuerdo con la presente invención y/o un patrón interno, y el tiempo de elución del pico máximo de dicho soluto. Un experto en la técnica reconocerá que el tiempo de retención de una sustancia de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento, es una característica única de dicho soluto y puede ser utilizado para una finalidad de identificación. La solución de trabajo del patrón interno que comprende Liso-Gb2 como patrón interno, se añadió a la muestra tal como se describe en el Ejemplo 1. Es importante entender que mediante dicha adición del PI a la muestra, es decir la adición de la muestra, que va a ser sometida al método de acuerdo con la invención, se conoce la concentración del PI en la muestra, y determinando el área bajo el pico, es decir el área de pico, del patrón interno en dicho cromatograma espectrométrico de masas, la relación entre un área de pico y una concentración de una sustancia, p. ej., de PI y/o un biomarcador, puede, por tanto, ser calculado. De forma más precisa, un experto en la técnica reconocerá que un área de pico de una sustancia representada en un cromatograma espectrométrico de masas, tal como el cromatograma de HPLC-espectrometría de masas representado en la Fig.8A, Fig.8B, Fig.8C, Fig.8D o Fig.8E, representa una medición de una cantidad de dicha sustancia sometida a un análisis de HPLC-espectrometría de masas. Más aún, un experto en la técnica podrá calcular la cantidad de la sustancia en una muestra de un sujeto sometida a un análisis de HPLC-espectrometría de masas, p. ej. la cantidad de lisoesfingomielina libre en una muestra sometida al método de la presente invención, utilizando una relación del área de pico de lisoesfingomielina libre, cuya cantidad va a ser determinada por dicho método y el área de pico del PI, p. ej., liso-Gb2 libre; además de las curvas de calibración generadas con dicho método y dicha lisoesfingomielina libre y/o PI. Por consiguiente, esto permite posteriormente determinar un nivel de lisoesfingomielina libre. Con respecto al compuesto 465<lloq ha sido reemplazado con 0,02, lo que hace referencia a la mitad del límite de detección.
Parar comparar el valor diagnóstico de los diferentes biomarcadores y para el cálculo de las correlaciones entre los biomarcadores, se agregaron en primer lugar los datos utilizando el primer valor medido de cada marcador para cada paciente.
Se utilizaron técnicas estadísticas de muestras emparejadas para la comparación de dos biomarcadores. El método explota la equivalencia matemática de la AUC con la estadística U de Mann-Whitney (Delong E.R., Delong D.M., Clarke-Pearson D.L. (1988) Biometrics, 44, 837-45).
Se evaluó la precisión de los niveles de los diferentes biomarcadores (lisoesfingomielina libre, compuesto 509) obtenida por el método descrito en el Ejemplo 1 anteriormente, además de la precisión de la relación de los dos biomarcadores de acuerdo con la presente invención, para distinguir pacientes con la enfermedad de Niemann-pick de pacientes sin tener la enfermedad de Niemann-Pick, además de para distinguir pacientes con la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C de pacientes con la enfermedad de Niemann-Pick de tipo A/B, utilizando un análisis de la curva característica operativa del receptor (ROC) (Metz C.E. 1978, Semin Nucl Med, 8, 283-98; Zweig M.H., Campbell G., 1993, Clin Chem, 39, 561-77).
Las curvas ROC se calcularon utilizando PASW Statistics 18, versión distribuida 18.0.2 (© SPSS, Inc., 2009, Chicago, IL, www.spss.com). Las comparaciones de las curvas ROC y los modelos mixtos lineales se hicieron utilizando software SAS, versión 9.2 del sistema SAS para Windows. (© 2008 SAS Institute Inc., Cary, NC, EE.UU.). Los resultados representados en las curvas ROC mostradas en la Fig. 4, la Fig. 5 y la Fig. 6 también muestran la especificidad y la sensibilidad del método de acuerdo con la presente invención dependiendo de los diferentes valores de corte de la lisoesfingomielina libre. El área bajo la curva (AUC) y el 95% de límites de confianza para la lisoesfingomielina libre se describen en la Tabla 3.
Las Figs. 4A a C son gráficos que muestran curvas características operativas del receptor (ROC) para el diagnóstico de NP de tipo A y B; el eje x representa “1-especificidad” y el eje y representa la sensibilidad.
La Fig. 4 A muestra curvas ROC del compuesto 465 y el compuesto 509 para el diagnóstico de la NP de tipo A y B, en donde el ensayo para las diferencias entre las curvas ROC dieron como resultado un valor p de 0,363. La curva ROC para el compuesto 465 representada por la línea continua refleja una AUC de 0,9628, mientras que la curva ROC para el compuesto 509 representada por la línea discontinua refleja una AUC de 0,9916. El gráfico está basado en el diagnóstico de 303 pacientes en total, en donde 18 de los mismos dieron positivo en tener NP de tipo A/B mediante ensayo genético, según se describe en el ejemplo 2 del presente documento.
La Fig. 4 B muestra las curvas ROC del compuesto 465 y la relación del nivel del compuesto 509 al nivel del compuesto 465 para el diagnóstico de NP de tipo A y B, en donde el ensayo para determinar las diferencias entre las curvas ROC dieron como resultado un valor p de 0,0083. La curva ROC para el compuesto 465 representado por la línea continua refleja una AUC de 0,9669, mientras que la curva ROC para el compuesto 509 representado por la línea discontinua refleja una AUC de 0,9903. El gráfico está basado en el diagnóstico de 146 pacientes en total, en donde 15 de los mismos dieron positivo en tener NP de tipo A/B mediante ensayo genético según se describe en el ejemplo 2 del presente documento.
La Fig. 4 C muestra curvas ROC del compuesto 509 y la relación del nivel del compuesto 509 al nivel del compuesto 465 para el diagnóstico de NP de tipo A y B de 303 muestras, en donde 18 son positivas en NPC de tipo A/B y en donde la prueba de Wald para las diferencias entre las curvas ROC dieron como resultado un valor p de p < 0,0001. La curva ROC para el compuesto 509 representada por la línea continua refleja una AUC de 0,9916, mientras que la curva ROC para la relación de los niveles del compuesto 509 al nivel del compuesto 465 representado por la línea discontinua refleja una AUC de 0,8520. El gráfico está basado en el diagnóstico de 303 pacientes en total, en donde 18 de los mismos dieron positivo en tener NP de tipo A/B mediante ensayo genético según se describe en el ejemplo 2 del presente documento.
Las Figs. 5A a C son gráficos que muestran curvas características operativas del receptor (ROC) para el diagnóstico de NP de tipo C; el eje x representa “1-especificidad” y el eje y representa la sensibilidad.
La Fig. 5 A muestra curvas ROC del compuesto 465 y el compuesto 509 para el diagnóstico de NP de tipo C, en donde el ensayo para las diferencias entre las curvas ROC dio como resultado un valor p de 0,0003. La curva ROC para el compuesto 465 representado por la línea continua refleja una AUC de 0,8944, mientras que la curva ROC para el compuesto 509 representado por la línea discontinua refleja una AUC de 0,9371. El gráfico está basado en el diagnóstico de 303 pacientes en total, en donde 36 de los mismos dieron positivo en tener NP de tipo C mediante ensayo genético, según se describe en el ejemplo 2 del presente documento.
La Fig. 5 B muestra curvas ROC del compuesto 465 y la relación del nivel del compuesto 509 al nivel del compuesto 465 para el diagnóstico de NP de tipo C, en donde el ensayo para diferencias entre curvas ROC dieron como resultado un valor p de 0,0001. La curva ROC para el compuesto 465 representado por la línea continua refleja una AUC de 0,8685, mientras que la curva ROC para la relación del nivel del compuesto 509 al nivel del compuesto 465 representado por la línea discontinua refleja una AUC de 0,9654. El gráfico está basado en el diagnóstico de 303 pacientes en total, en donde 36 de los mismos dieron positivo en tener NP de tipo C mediante ensayo genético según se describe en el ejemplo 2 en el presente documento.
La Fig. 5 C muestra curvas ROC del compuesto 509 y la relación del nivel del compuesto 509 al nivel del compuesto 465 para el diagnóstico de NP de tipo C, en donde el ensayo para las diferencias entre curvas ROC dieron como resultado un valor p de 0,0065. La curva ROC para el compuesto 509 representado por la línea continua refleja una AUC de 0,9371, mientras que la curva ROC para la relación del nivel del compuesto 509 al nivel del compuesto 465 representado por la línea discontinua refleja una AUC de 0,9800. Los gráficos están basados en el diagnóstico de 303 pacientes en total, en donde 36 de los mismos dieron positivo en tener NP de tipo C mediante ensayo genético según se describe en el ejemplo 2 del presente documento.
La Fig. 6 es un gráfico que muestra curvas características operativas del receptor (ROC) del compuesto 465 y del compuesto 509 para el diagnóstico de portador de NP de tipo C; el gráfico está basado en el diagnóstico de 146 pacientes en total, en donde / de los mismos dieron positivo en ser portadores de NP de tipo C mediante ensayo genético según se describe en el ejemplo 2 del presente documento. El eje x representa “1-especificidad” y el eje y representa la sensibilidad. El ensayo para las diferencias entre las curvas ROC dio como resultado un valor p de 0,5991. La curva ROC para el compuesto 465 representada por la línea continua refleja una AUC de 0,7468, mientras que la curva ROC para el compuesto 509 representada por la línea discontinua refleja una AUC de 0,6984.
Tabla 3: Sensibilidad y especificidad para diferentes biomarcadores con respecto a NPC
Figure imgf000044_0001
La Tabla 4 a continuación muestra, por consiguiente, la sensibilidad y especificidad del método de acuerdo con la presente invención, dependiendo de diferentes valores de corte de la lisoesfingomielina libre.
Comparar el nivel del biomarcador en una muestra de un sujeto determinado por el método de acuerdo con la presente invención con un valor de corte, preferiblemente un valor de corte que permite un diagnóstico que tiene alta especificidad y alta sensibilidad permite por tanto diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick en dicho sujeto, en donde un nivel elevado del biomarcador en la muestra del sujeto en comparación con el valor de corte es indicativo de que el sujeto padece o está en riesgo de desarrollar la enfermedad de Niemann-Pick y en donde un nivel más bajo del biomarcador en la muestra del sujeto en comparación con el valor de corte es indicativo de que el sujeto no padece o no está en riesgo de desarrollar la enfermedad de Niemann-Pick.
Comparar la relación de los niveles de dos biomarcadores en una muestra de un sujeto determinado por el método de acuerdo con la presente invención con un valor de corte, preferiblemente un valor de corte que permita un diagnóstico que tenga alta especificidad y alta sensibilidad, permite por tanto diagnosticar la enfermedad de Niemann-pick en dicho sujeto, en donde una relación elevada de los niveles de dos biomarcadores en la muestra del sujeto en comparación con el valor de corte, es indicativa de que el sujeto padece o está en riesgo de desarrollar la enfermedad de Niemann-pick y en donde una relación más baja de los niveles de dos biomarcadores en la muestra del sujeto en comparación con el valor de corte es indicativa de que el sujeto no padece o no está en riesgo de desarrollar la enfermedad de Niemann-pick.
Por consiguiente, en la tabla 3 la sensibilidad y la especificidad de la lisoesfingomielina libre como biomarcador utilizado en el método para el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-pick, y más en particular diferentes tipos de la enfermedad de Niemann-pick en una muestra de un sujeto se compara utilizando diferentes valores de corte. Se determinó la lisoesfingomielina libre de acuerdo con el método de la presente invención. El valor de corte ideal de los respectivos biomarcadores y enfermedad, puede tomarse de la tabla 3 anterior.
Un experto en la técnica reconocerá que el método de acuerdo con la presente invención, que utiliza lisoesfingomielina libre y/o el compuesto 509 como biomarcador, y/o la relación del nivel del compuesto 509 al nivel de lisoesfingomielina libre, para el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-pick es claramente ventajoso sobre los métodos de la técnica anterior.
Por consiguiente, niveles del compuesto 509 determinados en la muestra de un sujeto de acuerdo con el método de la presente solicitud más altos que 5 ng/ml permiten diagnosticar que el sujeto padece o está en riesgo de desarrollar la NP de tipo A y B con una sensibilidad de 94,4% y una especificidad de 96,1%.
Unos niveles del compuesto 509 determinados en la muestra de un sujeto de acuerdo con el método de la presente solicitud más altos que 1,7 ng/ml permiten diagnosticar que el sujeto padece o está en riesgo de desarrollar la NP de tipo C con una sensibilidad de 97,2% y una especificidad de 93,3%.
Unos niveles del compuesto 509 determinados en la muestra de un sujeto de acuerdo con el método de la presente solicitud más altos que 0,031 ng/ml permiten diagnosticar que el sujeto padece o está en riesgo de desarrollar ser portador de la NP de C con una sensibilidad de 100 % y una especificidad de 22,5%.
Unos niveles de lisoesfingomielina libre determinados en la muestra de un sujeto de acuerdo con el método de la presente solicitud más altos que 59 ng/ml permiten diagnosticar que el sujeto padece o está en riesgo de desarrollar la NP de tipo A y B con una sensibilidad de 94,4% y una especificidad de 99,3%.
Unos niveles de lisoesfingomielina libre determinados en la muestra de un sujeto de acuerdo con el método de la presente solicitud más altos que 9,23 ng/ml permiten diagnosticar que el sujeto padece o está en riesgo de desarrollar la NP de tipo C con una sensibilidad de 94,4% y una especificidad de 81,3%.
Unos niveles de lisoesfingomielina libre determinados en la muestra de un sujeto de acuerdo con el método de la presente solicitud más altos que 6,5 ng/ml permiten diagnosticar que el sujeto padece o está en riesgo de desarrollar ser portador de la NP de tipo C con una sensibilidad de 100% y una especificidad de 61,2%.
La relación del nivel del compuesto 509 al nivel de lisoesfingomielina libre determinada en la muestra de un sujeto de acuerdo con el método de la presente solicitud más alta que 0,045 permite diagnosticar que el sujeto padece o está en riesgo de desarrollar la NP de tipo A y B con una sensibilidad de 94,4% y una especificidad de 82,1%.
La relación del nivel del compuesto 509 al nivel de lisoesfingomielina libre determinada en la muestra de un sujeto de acuerdo con el método de la presente solicitud más alta que 0,087 permite diagnosticar que el sujeto padece o está en riesgo de desarrollar la NP de tipo C con una sensibilidad de 94,4% y una especificidad de 95,5%.
Ejemplo 4: Análisis del cambio de los biomarcadores con el tiempo
El método y los pacientes utilizados en relación con este Ejemplo son los que se describen en los Ejemplos 1 a 3. Para analizar cómo cambió el nivel de los biomarcadores, tal como el compuesto 509, en el tiempo en pacientes que tienen la enfermedad de Niemann-pick se analizaron datos no agregados para aquellos pacientes para los que se analizó más de una muestra de sangre, concretamente seis pacientes con NPC de tipo C y un portador de NPC de tipo C. Se ajustó un punto de tiempo cero a la primera medición bajo terapia para cada paciente. Se utilizaron modelos mixtos lineales para someter a ensayo si tuvo lugar una reducción dependiente del tiempo.
Los niveles del compuesto 509 en el tiempo para pacientes individuales se muestran en la Fig. 7.
Más particularmente, la Fig. 7 es un diagrama que muestra los niveles del compuesto 509 en ng/ml de plasma como una función en el tiempo para un total de 6 pacientes con la enfermedad de Niemann-pick de tipo C y 1 paciente portador de la enfermedad de Niemann-pick de tipo C.
El nivel del respectivo biomarcador fue determinado por el método de acuerdo con la presente invención en una muestra de plasma de pacientes con la enfermedad de Niemann-pick de tipo C que fueron sometidos a terapia durante el curso del estudio. Cada curva y cada número de paciente, respectivamente, representa los niveles determinados en el plasma recogido del mismo paciente en diferentes puntos de tiempo según se indica en el eje x. El eje x representa los puntos de tiempo de recogida del plasma, en donde el punto de tiempo cero indica la primera medición bajo terapia para cada paciente. Para el análisis del cambio del nivel del biomarcador de acuerdo con la presente invención sobre el tiempo en pacientes con la enfermedad de Niemann-pick de tipo C según se describe en el ejemplo 3, se utilizaron datos no agregados para aquellos pacientes para los que se ha analizado más de una muestra de plasma.
En la Fig. 7 el eje y representa niveles del compuesto 509 como una función en el tiempo.
Ejemplo 5: Análisis de los niveles de biomarcadores dependiendo de la edad de los sujetos.
Las enfermedades de almacenamiento lisosómico afectan en su mayor parte a niños y estos con frecuencia fallecen a una edad joven e impredecible, muchos a los pocos meses o años de su nacimiento. Muchos otros niños mueren de esta enfermedad en los años siguientes a sufrir diversos síntomas de su trastorno en particular.
Es por tanto de particular interés someter a ensayo el valor de los biomarcadores de la invención para el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-pick en grupos de pacientes de edad joven.
Un biomarcador preferible para el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-pick, preferiblemente la enfermedad de Niemann-pick de tipo C, permitiría el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-pick, preferiblemente la enfermedad de Niemann-pick de tipo C, con alta sensibilidad y alta especificidad independientemente de la edad del sujeto. Los niveles del compuesto 465 y del compuesto 509, respectivamente, determinados de acuerdo con el método de la presente invención fueron analizados con respecto a la edad del sujeto.
El resultado se muestra en la Tabla 5 y en la Figura 9.
La Tabla 5 a continuación muestra la distribución de edad entre los sujetos sometidos a ensayo.
Tabla 5A: Distribución de edad
Figure imgf000046_0001
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Más particularmente, la Fig. 9A es un diagrama de caja y la Fig. 9B es una nube de puntos que indican los niveles de lisoesfingomielina libre, es decir del compuesto 465; y la Fig. 9C es un diagrama de caja y la Fig. 9D es una nube de puntos que indican los niveles del compuesto 509; el eje y demuestra los niveles logarítmicos de lisoesfingomielina libre y del compuesto 509, respectivamente, en ng/ml determinados en plasma de los pacientes por el método de acuerdo con la presente invención, en donde el eje x representa grupos de pacientes por años de edad. En los diagramas de caja los pacientes han sido agrupados por edad en años según se indica, es decir pacientes que tienen de 0-10, 11-20, 21-30, 31-40, 41-50, 51-60, 61-70 años de edad o que tienen 71 años de edad o mayores. El diagrama de caja representa el percentil 25 y 75 de cada grupo de pacientes en la parte inferior y en la parte superior de la caja, respectivamente; la banda cerca del centro de la caja representa el percentil 50 (es decir, la media) de cada grupo; los bigotes representan una desviación estándar por encima y por debajo de la medida de los datos; Cualquier dato no incluido entre los bigotes se muestra como un resultado discrepante con un pequeño círculo o asterisco.
Puede tomarse inmediatamente de los mismos que el compuesto 509, además del compuesto 465, son biomarcadores que permiten el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick, preferiblemente la enfermedad de Niemann-Pick de tipo A/B y más preferiblemente la enfermedad e Niemann-Pick de tipo C con alta sensibilidad y alta especificidad independientemente de la edad del sujeto.
Además, puede tomarse de ello que el método de la presente invención permite por tanto el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto independientemente de la edad. Más particularmente, el método de la presente invención permite el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto, en donde el sujeto es un sujeto de edad joven, más particularmente de menos de 30 años de edad, menos de 20 años de edad o menos de 10 años de edad.
Ejemplo 6: Liso-Gb3 libre en el cerebelo de ratas transgénicas
El nivel de lisoesfingomielina libre se determinó en el cerebelo de 3 ratas con el transgen NPC1 -/- y se comparó con el nivel en una muestra con el nivel de una muestra de un animal de control (NPC1 /+).
Los resultados se muestra en la tabla 6.
Tabla 6
Figure imgf000047_0001
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Puede tomarse de lo anterior que el nivel de lisoesfingomielina libre es elevado, en aproximadamente un factor de 2 a 3, en el cerebelo en animales con NPC1-/- con respecto a las muestras sin desactivación génica (knock-out), es decir con NPC1 /+.
En otras palabras, en el cerebelo de animales con NOC1- desactivado la concentración de lisoesfingomielina libre es aproximadamente el doble de alta que en los controles de tipo silvestre.
Dicho descubrimiento se correlaciona con la situación patológica en humanos, en donde preferiblemente el cerebelo está afectado.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un método para diagnosticar la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto, en donde el método comprende detectar un biomarcador en una muestra del sujeto, en donde el biomarcador es el compuesto 509, y en donde el compuesto 509 tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000049_0001
en donde el grupo OH del grupo COOH puede estar disociado.
2. El método según la reivindicación 1, en donde el método además comprende determinar un nivel del biomarcador presente en la muestra.
3. El método según la reivindicación 2, en donde el nivel del biomarcador es indicativo de si el sujeto padece o no la enfermedad de Niemann-Pick o de si el sujeto está o no en riesgo de padecer la enfermedad de Niemann-Pick.
4. Un método para determinar el curso de la enfermedad de Niemann-Pick en un sujeto, en donde el método comprende determinar en diversos puntos en el tiempo un nivel de un biomarcador presente en una muestra del sujeto, en donde el biomarcador es el compuesto 509, y en donde el compuesto 509 tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000049_0002
en donde el grupo OH del grupo COOH puede estar disociado.
5. Un método para determinar la eficacia de al menos un tratamiento aplicado a un sujeto que ha dado positivo en padecer o en estar en riesgo de padecer la enfermedad de Niemann-Pick, en donde el método comprende detectar en diversos puntos en el tiempo un nivel de un biomarcador en una muestra del sujeto, en donde el biomarcador es el compuesto 509, y en donde el compuesto 509 tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000049_0003
en donde el grupo OH del grupo COOH puede estar disociado.
6. Uso del análisis de espectrometría de masas para la detección de un biomarcador en el diagnóstico de la enfermedad de Niemann-Pick, en donde el biomarcador es el compuesto 509 que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000049_0004
en donde el grupo OH del grupo COOH puede estar disociado.
7. Un kit para determinar la presencia de un biomarcador en una muestra de un sujeto, en donde el kit comprende a) un copartícipe de interacción del biomarcador, en donde el copartícipe de interacción es un anticuerpo; b) opcionalmente, un soporte sólido que comprende al menos un reactivo de captura unido al mismo, en donde el reactivo de captura enlaza el biomarcador; y
c) instrucciones para utilizar el soporte sólido para detectar el biomarcador.
en donde el biomarcador es el compuesto 509 y en donde el compuesto 509 tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000050_0001
en donde el grupo OH del grupo COOH puede estar disociado.
8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el método comprende detectar al menos un biomarcador adicional en una o en la muestra del sujeto, preferiblemente el método comprende determinar el nivel del al menos un biomarcador adicional en una o en la muestra del sujeto.
9. El método según la reivindicación 8, en donde el al menos un biomarcador adicional es lisoesfingomielina libre.
10. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 9, en donde el método además comprende determinar la relación del nivel del biomarcador en una o en la muestra al nivel del al menos un biomarcador adicional en una o en la muestra, en donde la relación del nivel del biomarcador al nivel del al menos un biomarcador adicional es indicativa de si el sujeto padece o no la enfermedad de Niemann-Pick o de si el sujeto está o no en riesgo de padecer la enfermedad de Niemann-Pick.
11. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y 8 a 10, en donde el biomarcador y/o el al menos un biomarcador adicional se detecta por medio de inmunoensayo, análisis de espectrometría de masas, matriz de biochip, ácidos nucleicos funcionales y/o un derivado fluorescente del biomarcador y/o un derivado fluorescente del al menos un biomarcador adicional.
12. El método según la reivindicación 11, en donde el biomarcador se detecta por medio de análisis de espectrometría de masas, preferiblemente el análisis de espectrometría de masas se selecciona del grupo que comprende SELDI, MALDI, MALDI-Q TOF, MS/MS, TOF-TOF y ESI-O-TOF.
13. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y 8 a 12 y el uso según la reivindicación 6, en donde la enfermedad de Niemann-Pick se selecciona del grupo que comprende enfermedad de Niemann-Pick de tipo A y B, enfermedad de Niemann-Pick de tipo C, y portador de la enfermedad de Niemann-Pick de tipo C.
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