ES2729872T3 - Terapias basadas en la transcriptasa inversa de la telomerasa - Google Patents

Abstract

Un vector de ácido nucleico que comprende una secuencia codificante de la transcriptasa inversa de la telomerasa (TERT) para su uso en el tratamiento de la anemia aplásica.

Description

DESCRIPCIÓN

Terapias basadas en la transcriptasa inversa de la telomerasa

Campo de la invención

Esta invención se inscribe dentro del campo de la biología molecular, la biotecnología y la medicina. Más particularmente, se refiere a composiciones y métodos útiles para el tratamiento de afecciones asociadas con una longitud de telómeros corta. Más particularmente, se refiere a composiciones y métodos útiles para el tratamiento de afecciones asociadas con la anemia aplásica.

Antecedentes de la invención

Los telómeros son estructuras especializadas de los extremos de los cromosomas, que tienen un papel de protección de los extremos de los cromosomas de las actividades de reparación y degradación del ADN (Blackburn, 2001. Cell 106, 661-673; de Lange, 2005. Genes Dev. 19, 2100- 2110). Los telómeros de mamíferos consisten en repeticiones de TTAGGG unidas por un complejo multiproteico conocido como shelterina (de Lange, 2005. Genes Dev. 19, 2100­ 2110). Para la protección de los telómeros se necesita una longitud mínima de repeticiones de TTAGGG y la integridad del complejo de la shelterina (Blackburn, 2001. Cell 106, 661-673; de Lange, 2005. Genes Dev. 19, 2100-2110). La telomerasa es una transcriptasa inversa celular (TERT, transcriptasa inversa de la telomerasa; también conocida como TP2; TRT; EST2; TCS1; hEST2) capaz de compensar el desgaste del telómero mediante la adición de novo de repeticiones de TTAGGG en los extremos del cromosoma utilizando un componente de ARN asociado como plantilla (Terc, componente de ARN de la telomerasa) (Greider y Blackburn, 1985. Cell 43, 405-413). La telomerasa se expresa en la mayoría de los compartimentos de células madre adultas, sin embargo, esto no es suficiente para mantener la longitud de los telómeros, como lo demuestra el hecho de que el acortamiento de los telómeros se produce con la edad en la mayoría de los tejidos humanos y de ratón (Harley et al., 1990. Nature 345, 458-460; Blasco, 2007. Nat Chem Biol. 3, 640-649; Flores et al, 2008. Genes and Dev 22, 654-667).

Los ratones portadores de deleción homocigótica para el gen TERC (el componente de ARN de la telomerasa) carecen de cualquier actividad de telomerasa detectable y mostraron un acortamiento progresivo de los telómeros de una generación a la otra con una tasa comparable a la tasa reportada en las células humanas (Blasco et al., 1997). Los fenotipos típicos graves de ratones TERC - / - de generación tardía (por ejemplo, aplasia de la médula ósea y signos de envejecimiento prematuro) se podrían rescatar reintroduciendo una copia del gen TERC (Samper et al., 2001). La degeneración tisular múltiple que surgió en generaciones posteriores en un modelo de ratón condicional defectuoso para TERT (la subunidad catalítica de la telomerasa) se pudieron revertir con la reactivación de la telomerasa incluso en ratones de edad avanzada (Jaskelioff et al., 2011).

En el contexto de los ratones de tipo salvaje, la introducción de una copia adicional del gen de la telomerasa, que se expresa en una amplia gama de tejidos epiteliales, condujo a un aumento de la capacidad de curación de las heridas de la piel (Gonzalez-Suarez et al., 2001). Cuando este alelo se introdujo en un fondo genético resistente a los tumores (Sp53/Sp16/SArf), se observó una notable demora del envejecimiento en concierto con un incremento del 40% en la mediana de la vida útil en comparación con los ratones que no expresaban el transgén de la telomerasa (Tomas-Loba et al., 2008). El documento EP2402038A1 divulga un vector de ácido nucleico, en concreto un vector basado en el AAV9, que comprende una secuencia codificante de TERT para uso en el tratamiento de alteraciones relacionadas con la edad mediante la disminución de la incidencia de la osteoporosis relacionada con la edad y la tolerancia a la insulina y mejorando el buen estado de los órganos y la duración de la salud. Se descubrió que la terapia génica con la telomerasa basada en virus (AAV) es beneficiosa para extender el período de duración de la salud, en el contexto del envejecimiento fisiológico normal en ratones de tipo salvaje. En el estudio en el que se examinó este beneficio, se sometieron a terapia génica con AAV9-mTERT ratones adultos y de edad avanzada, para expresar ampliamente la subunidad catalítica de la telomerasa de ratón (mTERT). El período de duración de la salud de los ratones tratados con TERT aumentó significativamente y el envejecimiento se desaceleró, tal como lo indicaron varios parámetros fisiológicos (tolerancia a la insulina y la glucosa, osteoporosis, coordinación neuromuscular, ensayos en el cilindro rotatorio, etc.). Además, su promedio de duración de la vida, en comparación con los grupos de control, aumentó en un 24% y un 13% en ratones adultos y viejos, respectivamente. Una sola administración intravenosa de AAV9-TERT en ratones adultos produjo un aumento en la longitud de los telómeros en células de sangre periférica (Bernardes de Jesus et al., 2012).

Los telómeros acortados se han asociado con numerosas enfermedades, como la disqueratosis congénita, anemia aplásica, síndrome mielodisplásico y anemia de Fanconi. Dada la gravedad de estas enfermedades y el mal pronóstico de los pacientes que las padecen, existe la necesidad de terapias novedosas para tratar enfermedades asociadas con la longitud corta de los telómeros.

La anemia aplásica es un trastorno de la sangre poco frecuente, heterogéneo y potencialmente mortal, en el cual la médula ósea no puede producir células sanguíneas nuevas de forma suficiente debido a una marcada reducción de las células madre hematopoyéticas inmaduras (HSC) y de las células progenitoras (Scopes et al., 1994, Maciejewski et al., 1994). En consecuencia, las principales manifestaciones de la enfermedad son pancitopenia e hipoplasia medular que pueden surgir en cualquier etapa de la vida, pero que son más frecuentes en personas jóvenes (10-25 años de edad) y ancianos (> 60 años) (Marsh et al., 2009). La anemia aplásica se puede adquirir o heredar. El tipo adquirido está mediado principalmente por autoinmunidad, pero también puede desencadenarse por factores ambientales como la exposición a la radiación, a toxinas y a virus (Nakao, 1997). La forma congénita es más rara, pero, sin embargo, se han identificado hasta la fecha mutaciones en más de 30 genes con funciones en la reparación del ADN, la biogénesis de los ribosomas y las rutas de mantenimiento de los telómeros (Dokal y Vulliamy, 2010). Se ha informado de la presencia de mutaciones en TERT en los pacientes con anemia aplásica (Yamaguchi et al., 2005). Un rasgo clínico frecuentemente observado de la anemia aplásica es la corta longitud de los telómeros en los leucocitos de sangre periférica, incluso en ausencia de mutaciones en la maquinaria de mantenimiento de los telómeros.

Los telómeros, los extremos de los cromosomas de los vertebrados, son estructuras nucleoproteicas altamente especializadas compuestas de secuencias de repeticiones en tándem de hexanucleótidos (TTAGGG) que están unidas por un complejo de seis proteínas (TRF1, TRF2, TIN2, RAP1, TPP1 y POT1) denominado shelterina (Blackburn, 2001, de Lange, 2005). Estas estructuras son esenciales para la integridad de los cromosomas al prevenir las fusiones de telómeros y la fragilidad de los telómeros. La longitud de los telómeros está controlada por la enzima ribonucleoproteica telomerasa que puede, de novo, agregar secuencias teloméricas a los telómeros. Debido a que la secuencia telomérica se pierde naturalmente en cada división celular (lo que se conoce como el problema del final de la replicación) y las células somáticas expresan la telomerasa en niveles muy bajos o no la expresan en absoluto, los telómeros se acortan a lo largo de la vida. Cuando los telómeros se vuelven extremadamente cortos, pierden su función protectora y se desencadena una respuesta persistente al daño del ADN en los telómeros, lo que posteriormente conduce a una respuesta de senescencia celular (Harley et al., 1990, Flores et al., 2008). Las HSC, a diferencia de la mayoría de las células somáticas, muestran un bajo nivel de actividad de la telomerasa. Sin embargo, esta actividad no es suficiente para detener el desgaste del telómero y, por consiguiente, el potencial de regeneración de las células HSC puede verse limitado durante el proceso de envejecimiento (Hiyama y Hiyama, 2007). De acuerdo con esto, los receptores de trasplantes de médula ósea tienen longitudes de telómeros más cortas que sus donantes, lo que sugiere que la telomerasa no puede hacer frente al aumento de la demanda de proliferación replicativa durante la fase de injerto (Wynn et al., 1998). Además, se ha demostrado que los telómeros se acortan mucho más rápido en pacientes con anemia aplásica en comparación con el desgaste normal relacionado con el envejecimiento encontrado en individuos sanos potencialmente debido a un número de divisiones celulares más alto que lo normal (Ball et al., 1998).

El acortamiento acelerado de los telómeros debido a defectos en los componentes de los telómeros o la propia telomerasa limita prematuramente el potencial de proliferación de las células, lo que afecta particularmente la capacidad de renovación del tejido en los compartimentos de células madre (Harley et al., 1990, Flores et al., 2005). Por lo tanto, los tejidos con un alto índice de proliferación, como el sistema hematopoyético, se ven particularmente afectados por niveles de telomerasa más bajos de lo normal, que en última instancia pueden conducir a trastornos graves como la anemia aplásica (Vulliamy et al., 2002). Por ejemplo, la telomeropatía disqueratosis congénita se ha relacionado con mutaciones en 7 genes con funciones importantes en el mantenimiento de los telómeros (TERT, TERC, DKC1, TIN2, NOP10, NHP2 y TCAB1) y se caracteriza por telómeros muy cortos. La disqueratosis congénita es un síndrome multisistémico que comprende diversas características clínicas, como distrofia ungueal, leucoplasia oral, pigmentación anormal de la piel e hipoplasia cerebelosa (Dokal, 2011). Sin embargo, la complicación más grave es el desarrollo de anemia aplásica en el 80% de los casos, lo que subraya que las características clínicas son causadas por un acortamiento excesivo de los telómeros, lo que eventualmente conduce al agotamiento de la reserva de células madre (Dokal y Vulliamy, 2010).

Se puede encontrar una revisión de la patofisiología y el tratamiento de la anemia aplásica por parte de Neal S Young y colaboradores (Young et al., 2006), revisión en la cual no se menciona un posible tratamiento con TERT. La causalidad entre el potencial de proliferación y la longitud de los telómeros sugiere que una intervención terapéutica con telomerasa, dirigida a prevenir la pérdida de telómeros más allá de una longitud críticamente corta, puede ser una estrategia factible para tratar aquellas formas de anemia aplásica asociada con una capacidad limitada de formación de sangre debido a la presencia de telómeros cortos. El documento WO2010/018731 A2 menciona el uso de un polipéptido TERT en el tratamiento de una lista de enfermedades, de las cuales la anemia aplásica es una de tales enfermedades; en dicha solicitud de patente internacional no se proporciona ningún dato experimental que apoye el uso de un polipéptido TERT contra la anemia aplásica. En este sentido, anteriormente desarrollamos una terapia génica con telomerasa (Tert) utilizando vectores de virus adenoasociados (AAV9). Curiosamente, la terapia génica con telomerasa usando AAV9 Tert en ratones adultos de tipo salvaje atenuó o revirtió la erosión de los telómeros asociada con el envejecimiento en monocitos de sangre periférica (Bernardes de Jesus et al., 2012), lo que sugiere que esta terapia génica puede ser eficaz en el tratamiento de trastornos hematológicos relacionados con telómeros cortos.

Para probar esta hipótesis, utilizamos nuestro modelo de anemia aplásica en ratón recientemente generado, que reproduce el fenotipo de médula ósea observado en pacientes (Beier et al., 2012). En este modelo de ratón, el agotamiento específico en la médula ósea del gen de la shelterina Trf1 causa una pérdida grave de la cobertura del telómero y provoca una respuesta de daño al ADN que a su vez conduce a una rápida eliminación de las células HSC y progenitoras deficientes en Trf1. Sin embargo, en este modelo inducimos la deleción de Trf1 con una frecuencia que no se dirige al 100% de las células HSC y progenitoras. Por lo tanto, las células que conservan el Trf1 intacto se someten a rondas adicionales de proliferación compensatoria que conducen a un rápido desgaste del telómero. De este modo, el agotamiento parcial del compartimento de las células madre y progenitoras por la deleción de Trf1 reproduce la hiperproliferación compensatoria observada después del trasplante de médula ósea o en la anemia aplásica mediada por procesos autoinmunes, así como la presencia de telómeros muy cortos en pacientes debido a mutaciones en los genes de mantenimiento del telómero. Curiosamente, en nuestro modelo de ratón podemos ajustar la tasa de acortamiento de los telómeros a través de la frecuencia de agotamiento de HSCs mediada por la deleción de Trf1, lo que permite controlar la aparición de aplasia en la médula ósea y de pancitopenia (Beier et al., 2012).

En este estudio, empleamos este modelo de ratón de anemia aplásica para investigar si la activación de la telomerasa utilizando vectores de terapia génica del estado de la técnica puede ser un tratamiento eficaz para atenuar el desgaste de los telómeros y el agotamiento de las HSC, y prevenir así el mal funcionamiento de la médula ósea.

Sumario

La presente solicitud describe composiciones y métodos útiles para el tratamiento y prevención de afecciones asociadas con una longitud corta de los telómeros. En algunos casos, la afección asociada con la longitud corta de los telómeros se caracteriza por mutaciones en un gen o genes implicados en el mantenimiento del telómero. En una realización, la afección asociada con la longitud corta de los telómeros se selecciona del grupo que consiste en Disqueratosis congénita, Anemia aplásica, Síndrome de mielodisplasia, Anemia de Fanconi.

La presente invención proporciona un vector de ácido nucleico que comprende una secuencia codificante de la transcriptasa inversa de la telomerasa (TERT) para su uso en el tratamiento de la anemia aplásica. En una realización, la TERT está codificada por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia que es al menos un 90% idéntica a la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3. En una realización, la TERT está codificada por una secuencia de ácido nucleico que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3. En una realización, la TERT está codificado por una secuencia de ácido nucleico que consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3. En una realización, la TERT comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4. En una realización, la TERT comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4. En una realización, la TERT consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4. En una realización, la secuencia de ácido nucleico que codifica TERT está unida operativamente a una secuencia reguladora que dirige la expresión de la secuencia codificante. En una realización, el vector es un vector no integrativo, tal como un vector no integrativo basado en virus adenoasociados. En una realización, el vector es un vector basado en virus adenoasociados derivado de un virus adenoasociado del serotipo 9 (AAV9). En una realización, la cápsida del vector basado en virus adenoasociados está formada por proteínas de la cápsida del virus adenoasociado del serotipo 9 (AAV9), y la secuencia del ácido nucleico contenido en la cápsida está flanqueada en ambos extremos por repeticiones internas terminales que corresponden a virus adenoasociados del serotipo 2. En una realización, el ácido nucleico contenido en la cápsida comprende un fragmento que codifica la secuencia de aminoácidos que codifica la TERT. En una realización, el vector comprende una secuencia reguladora que es un promotor constitutivo. En una realización, la secuencia reguladora es el promotor del citomegalovirus (CMV).

La presente solicitud describe el siguiente conjunto de temas:

1. Un método para tratar a un paciente con una afección asociada con longitud de telómeros corta que comprende administrar al paciente un vector de ácido nucleico que comprende una secuencia codificante de la transcriptasa inversa de la telomerasa (TERT).

2. El método de 1, en el que la TERT está codificada por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia que es al menos un 90% idéntica a la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3.

3. El método de 1 o 2, en el que la TERT está codificada por una secuencia de ácido nucleico que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3.

4. El método de cualquiera de 1 -3, en el que la TERT está codificada por una secuencia de ácido nucleico que consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3.

5. El método de cualquiera de 1 -4, en el que la TERT comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4.

6. El método de cualquiera de 1-5, en el que la TERT comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4.

7. El método de cualquiera de 1-6, en el que la TERT consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4.

8. El método de cualquiera de 1 -7, en el que la secuencia de ácido nucleico que codifica la TERT está unida de forma operativa a una secuencia reguladora que dirige la expresión de la secuencia codificante.

9. El método de cualquiera de 1 -8, en el que el vector es un vector no integrativo.

10. El método de cualquiera de 1-9, en el que el vector es un vector no integrativo basado en virus adenoasociados.

11. El método de cualquiera de 1-10, en el que el vector es un vector basado en virus adenoasociados derivado de virus adenoasociados del serotipo 9 (AAV9).

12. El método de 11, en el que la cápsida del vector basado en virus adenoasociados está formada por proteínas de la cápsida del virus adenoasociado del serotipo 9 (AAV9), y la secuencia de ácido nucleico contenida en la cápsida está flanqueada en ambos extremos por repeticiones internas terminales que corresponden a virus adenoasociados del serotipo 2.

13. El método de 12, en el que el ácido nucleico contenido en la cápsida comprende un fragmento que codifica la secuencia de aminoácidos que codifica la TERT.

14. El método de cualquiera de 1-13, en el que el vector comprende una secuencia reguladora que es un promotor constitutivo.

15. El método de 14, en el que la secuencia reguladora es el promotor del citomegalovirus (CMV).

16. El método de cualquiera de 1-15, en el que la afección asociada con la longitud corta de los telómeros se caracteriza por mutaciones en un gen o genes involucrados en el mantenimiento del telómero.

17. El método de cualquiera de 1 -16, en el que la afección asociada con la longitud corta de los telómeros se selecciona del grupo que consiste en Disqueratosis congénita, Anemia aplásica, Síndrome mielodisplásico, Anemia de Fanconi, y fibrosis pulmonar.

18. Un vector de ácido nucleico que comprende una secuencia codificante de la transcriptasa inversa de la telomerasa (TERT) para su uso en el tratamiento de una afección asociada con la longitud corta de los telómeros.

19. El vector de ácido nucleico de 18, en el que la TERT está codificada por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia que es al menos un 90% idéntica a la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3.

20. El vector de ácido nucleico de 18 o 19, en el que la TERT está codificada por una secuencia de ácido nucleico que comprende la secuencia de la SEQ ID n O: 1 o la SEQ ID NO: 3.

21. El vector de ácido nucleico de cualquiera de 18-20, en el que la TERT está codificada por una secuencia de ácido nucleico que consiste en la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3.

22. El vector de ácido nucleico de cualquiera de 18-21, en el que la TERT comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4.

23. El vector de ácido nucleico de cualquiera de 18-22, en el que la TERT comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4.

24. El vector de ácido nucleico de cualquiera de 18-23, en el que la TERT consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4.

25. El vector de ácido nucleico de cualquiera de 18-24, en el que la secuencia de ácido nucleico que codifica la TERT está unida de forma operativa a una secuencia reguladora que dirige la expresión de la secuencia codificante.

26. El vector de ácido nucleico de cualquiera de 18-25, en el que el vector es un vector no integrativo.

27. El vector de ácido nucleico de cualquiera de 18-26, en el que el vector es un vector no integrativo basado en virus adenoasociados.

28. El vector de ácido nucleico de cualquiera de 18-27, en el que el vector es un vector basado en virus adenoasociados derivado de un virus adenoasociado del serotipo 9 (AAV9).

29. El vector de ácido nucleico de 28, en el que la cápsida del vector basado en virus adenoasociados está formada por proteínas de la cápsida del virus adenoasociado del serotipo 9 (AAV9), y la secuencia de ácido nucleico contenida en la cápsida está flanqueada en ambos extremos por repeticiones internas terminales correspondientes a virus adenoasociados del serotipo 2.

30. El vector de ácido nucleico de 29, en el que el ácido nucleico contenido en la cápsida comprende un fragmento que codifica la secuencia de aminoácidos que codifica la TERT.

31. El vector de ácido nucleico de cualquiera de 18-30, en el que el vector comprende una secuencia reguladora que es un promotor constitutivo.

32. El vector de ácido nucleico de 31, en el que la secuencia reguladora es el promotor del citomegalovirus (CMV).

33. El vector de ácido nucleico de cualquiera de 18-32, en el que la afección asociada con la longitud corta de los telómeros se caracteriza por mutaciones en un gen o genes implicados en el mantenimiento del telómero.

34. El vector de ácido nucleico de cualquiera de 18 a 33, en el que la afección asociada con la longitud corta de los telómeros se selecciona del grupo que consiste en Disqueratosis congénita, Anemia aplásica, Síndrome mielodisplásico, Anemia de Fanconi y fibrosis pulmonar.

35. El vector de ácido nucleico de cualquiera de 18-34, en el que la afección asociada con la longitud corta de los telómeros es la disqueratosis congénita.

Breve descripción de las figuras.

Figura 1: Efectos de AAV9-Tert sobre la supervivencia (A-C) y los recuentos sanguíneos (D-E)

Figura 2: Efectos de AAV9-Tert sobre la longitud de los telómeros en sangre periférica (A-C) y médula ósea (D-E)

Descripción detallada de realizaciones de la invención

La presente solicitud describe composiciones y métodos útiles para el tratamiento y la prevención de afecciones asociadas con una longitud corta de los telómeros que comprende administrar al paciente un agente que incrementa la longitud de los telómeros del paciente. En ciertos casos, el agente previene la degradación de los extremos de los cromosomas. En ciertos casos, el agente incremente la actividad de la transcriptasa inversa de la telomerasa (TERT). En ciertos casos, el método de tratamiento es un método de terapia génica que comprende administrar al paciente un vector de ácido nucleico que comprende una secuencia codificante de la transcriptasa inversa de la telomerasa (TERT).

Una "afección asociada con la longitud corta de los telómeros" es aquella que se caracteriza por una acumulación de telómeros críticamente cortos. En ciertos casos, los sujetos que padecen tal afección muestran un inicio prematuro de patologías que son resultado de una capacidad regenerativa defectuosa de los tejidos.

En ciertos casos, la afección asociada con la longitud corta de los telómeros se caracteriza por mutaciones en un gen o genes implicados en el mantenimiento del telómero. Los ejemplos específicos de dichas afecciones con base genética incluyen, pero no se limitan a, disqueratosis congénita, anemia aplásica, síndrome mielodisplásico, anemia de Fanconi, y fibrosis pulmonar.

La disqueratosis congénita (DKC) es una enfermedad humana genéticamente heterogénea, que es paradigmática de los síndromes de envejecimiento prematuro (Dokal, 2011). La DKC se caracteriza por la presencia de telómeros cortos / disfuncionales debido a mutaciones en genes relacionados con el mantenimiento del telómero, siendo los más frecuentemente mutados aquellos que codifican proteínas del complejo de la telomerasa (es decir, TERT, TERC, NOP10, DKC1, NHP2) (Dokal, 2011; Dokal y Vulliamy, 2010; Mason y Bessler, 2011; Savage y Alter, 2008). Además, un subconjunto de pacientes porta mutaciones en el gen que codifica TIN2 (la proteína que interactúa con TRF1), un componente del complejo de la shelterina, que se une a y protege los telómeros de los mamíferos (Dokal, 2011; Martinez y Blasco, 2011; Walne et al., 2008). Tanto el complejo funcional de la telomerasa como la estructura adecuada de recubrimiento de los telómeros por parte de las proteínas de la shelterina son necesarios para el mantenimiento y el recubrimiento de los extremos de los cromosomas, respectivamente.

Las características clínicas de los pacientes que sufren de DKC incluyen anomalías de la piel (es decir, hiperpigmentación de la piel), signos de envejecimiento prematuro (es decir, encanecimiento del cabello, distrofia ungueal, leucoplasia oral, etc.), predisposición al cáncer y otras varias afecciones que ponen en peligro la vida, incluida la anemia aplásica y la fibrosis pulmonar (Armanios y Blackburn, 2012). En particular, los tejidos con un alto índice de proliferación son los más afectados debido a la pérdida de ADN telomérico que se produce en cada división celular. Esto explica por qué los pacientes con DKC son particularmente vulnerables a la disfunción de la médula ósea que conduce a pancitopenia y, finalmente, a insuficiencia de la médula ósea (BMF) (Armanios y Blackburn, 2012; Blasco, 2007)

La anemia aplásica, es un trastorno de la médula ósea que amenaza la vida y se caracteriza por una médula ósea hipocelular y un recuento bajo de células sanguíneas. Los pacientes con anemia aplásica adquirida presentan leucocitos que tienen telómeros considerablemente más cortos que los individuos sanos de la misma edad (Carroll y Ly, 2009). La anemia aplásica es causada frecuentemente por un ataque mediado por procesos autoinmunes contra las células madre hematopoyéticas. Sin embargo, estudios recientes demostraron que las mutaciones en los componentes centrales de telomerasa TERT y TERC son la causa subyacente en una subpoblación clínicamente relevante (Yamaguchi et al., 2003; Yamaguchi et al., 2005). Las mutaciones en los componentes centrales de telomerasa TERT y TERC, así como en el componente TIN2 de la shelterina, se han relacionado con esta enfermedad (Savage et al., 2006).

El síndrome mielodisplásico (MDS) abarca varias enfermedades de la médula ósea caracterizadas por la producción ineficaz de células sanguíneas de la clase mieloide. Causada por insuficiencia progresiva de la médula ósea, de forma similar a la DKC, los pacientes con MDS a menudo presentan anemia grave y citopenias. En aproximadamente un tercio de los casos, la enfermedad progresa rápidamente y se transforma en leucemia mielógena aguda (AML), que es particularmente resistente al tratamiento. Aunque los telómeros acortados en pacientes con MDS sugieren que el mantenimiento telomérico insuficiente o dificultado es causante del síndrome, solo 3 de cada 210 casos mostraron mutaciones heterocigóticas en TERC en un estudio previo (Yamaguchi et al., 2003). Sin embargo, un estudio publicado recientemente puso claramente de manifiesto la conexión entre mutaciones de la telomerasa humana y el MDS, la anemia aplásica y AML. (Holme et al., 2012) informaron sobre diversas familias con mutaciones en los componentes de la telomerasa TERC y TERT en las que, por ejemplo, el abuelo padecía AML, la hija MDS y el nieto anemia aplásica (Holme et al., 2012) enfatizando la estrecha relación de diferentes manifestaciones clínicas con el mantenimiento deficiente de los telómeros.

La anemia de Fanconi (FA) es una enfermedad genética heterogénea causada por mutaciones en genes implicados en la reparación del ADN. Los individuos afectados presentan múltiples defectos congénitos y deficiencias hematológicas a una edad temprana de inicio (Kee y D Andrea, 2012). Sin embargo, las manifestaciones relacionadas con estas últimas son los síntomas predominantes de este síndrome y, a medida que avanza la enfermedad, pueden desarrollarse los síndromes mencionados anteriormente incluidos anemia aplásica, MDS y AML. Es importante destacar que también se ha demostrado que los pacientes que padecen FA presentan telómeros más cortos de lo normal (Gadalla et al., 2010). Los hechos de que las mutaciones que causan FA muestran una respuesta deficiente al daño del ADN (DDR) y de que los telómeros son particularmente vulnerables al estrés replicativo pueden proporcionar una explicación para la erosión observada de los telómeros. En apoyo de esto Callen et al. (2002) sugirieron que, en pacientes con FA, el aumento de la rotura de los telómeros, en concierto con un acortamiento replicativo, dan cuenta del acortamiento observado en los telómeros.

La fibrosis pulmonar se refiere a una afección caracterizada por la cicatrización del tejido pulmonar. La fibrosis pulmonar puede estar causada por muchos factores, incluidos procesos inflamatorios crónicos, infecciones, compuestos ambientales, radiación ionizante (por ejemplo, radioterapia para tratar tumores del tórax), afecciones médicas crónicas (lupus, artritis reumatoide). La fibrosis pulmonar idiopática (IPF) se refiere a la fibrosis pulmonar sin una causa identificable.

Consecuentemente, la invención proporciona un vector de ácido nucleico que comprende una secuencia codificante de la transcriptasa inversa de la telomerasa (TERT) para su uso en el tratamiento de la anemia aplásica.

En ciertas realizaciones, la secuencia de TERT usada en el vector de terapia génica se deriva de la misma especie que el sujeto. Por ejemplo, la terapia génica en humanos se llevaría a cabo utilizando la secuencia de la TERT humana. La terapia génica en ratones se llevaría a cabo utilizando la secuencia de la TERT de ratón, como se describe en los ejemplos. En una realización, la TERT está codificada por la secuencia de ácido nucleico indicada en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3 (variantes 1 y 2 de la TERT humana), o es un fragmento activo o equivalente funcional de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3. La secuencia de polipéptido codificado por la SEQ ID NO: 1 se expone en la SEQ ID NO: 2. El polipéptido codificado por la SEQ ID NO: 3 se expone en la SEQ ID NO: 4. Tal como se usa en este documento, "equivalente funcional" se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad de TERT o a un polipéptido que tiene actividad de TERT. El equivalente funcional puede mostrar una actividad del 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% o más en comparación con la t ErT codificada por la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3. Los equivalentes funcionales pueden ser artificiales o naturales. Por ejemplo, las variantes naturales de la secuencia de TERT en una población caen dentro del alcance del equivalente funcional. Las secuencias de TERT derivadas de otras especies también caen dentro del alcance del término "equivalente funcional", en particular la secuencia de la TERT murina dada en la SEQ ID NO: 5. En una realización particular, el equivalente funcional es un ácido nucleico con una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75%, 80%>, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% de identidad con la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3. En una realización adicional, el equivalente funcional es un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9 % de identidad con la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4. En el caso de equivalentes funcionales, la identidad de la secuencia debería calcularse a lo largo de la longitud completa del ácido nucleico. Los equivalentes funcionales pueden contener una o más, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30 o más, inserciones, deleciones y/o sustituciones de nucleótidos cuando se les compara con la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3. El término "equivalente funcional" también abarca secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido de la TERT con al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9 % de identidad de secuencia con la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4, pero que muestran poca homología con la secuencia de ácido nucleico dada en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3 debido a la degeneración del código genético.

Tal como se usa en el presente documento, el término "fragmento activo" se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad de TERT o a un polipéptido que tiene actividad de TERT, pero que es un fragmento del ácido nucleico indicado en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3 o la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4. Un fragmento activo puede ser de cualquier tamaño, siempre y cuando retenga la actividad de TERT. Un fragmento tendrá al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 100% de identidad con la SEQ ID NO: 1-4 a lo largo de la longitud de alineamiento entre el fragmento más corto y la SEQ ID NO: 1-4.

Las proteínas de fusión que incluyen estos fragmentos pueden estar comprendidas en los vectores de ácido nucleico necesarios para llevar a cabo la invención. Por ejemplo, se pueden incluir 5, 10, 20, 30, 40, 50 o incluso 100 residuos de aminoácidos adicionales de la secuencia del polipéptido, o de una secuencia homóloga, en cualquiera de los dos extremos C terminal y/o N sin perjudicar la capacidad del fragmento polipeptídico para plegarse correctamente y exhibir actividad biológica.

La identidad de secuencias se puede calcular por cualquiera de los diversos métodos de la técnica, incluyendo por ejemplo BLAST (Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers Ew , Lipman DJ (1990)). "Basic local aligment search tool". J Mol Biol 215 (3): 403-410) y FASTA (Lipman, Dj ; Pearson, WR (1985). "Rapid and sensitive protein similarity searches". Science 227 (4693): 1435-41; http://fasta.bioch. Virginia, edu/ fasta_www2/ fasta_list2.shtml) y variaciones en estos programas de alineamiento.

En una realización, el vector de ácido nucleico utilizado es un vector de terapia génica. Los métodos y vectores de terapia génica son bien conocidos en la técnica y generalmente comprenden administrar a un sujeto un ácido nucleico que codifica una proteína terapéuticamente activa. El ácido nucleico puede administrarse de varias maneras, incluida la administración de ADN desnudo, como plásmidos o mini-círculos, el uso de liposomas o polímeros catiónicos u otras nanopartículas modificadas por ingeniería genética que contienen el ácido nucleico, o vectores virales que encapsidan el ácido nucleico.

En una realización adicional, la terapia génica se logra utilizando la transformación estable de organismos con un sistema de expresión inducible. Los sistemas de expresión inducibles adecuados son conocidos en la técnica e incluyen el sistema basado en recombinasas CRE-LOX que es adecuado para uso en ratones y el regulado por tetraciclina que se puede usar en el tratamiento de sujetos humanos.

En una realización, el vector de terapia génica es un vector viral. Los vectores de terapia génica viral son bien conocidos en la técnica. Los vectores incluyen vectores integrativos y no integrativos, tales como los basados en retrovirus, adenovirus (AdV), virus adenoasociados (AAV), lentivirus, virus de la viruela, alfavirus y virus del herpes.

El uso de vectores virales no integrativos, como los AAV, parece ser particularmente ventajoso. En un aspecto, esto se debe a que los vectores no integrativos no causan ninguna modificación genética permanente. En segundo lugar, los vectores se dirigen a tejidos adultos, evitando que los sujetos estén bajo el efecto de la expresión constitutiva de la telomerasa desde las primeras etapas de desarrollo. Además, los vectores no integrativos incorporan de forma eficaz un mecanismo de seguridad para evitar la proliferación excesiva de células que expresan TERT. Las células perderán el vector (y, como consecuencia, la expresión de la telomerasa) si comienzan a proliferar rápidamente.

Los ejemplos concretos de vectores no integrativos adecuados incluyen aquellos basados en adenovirus (AdV), en particular adenovirus gutless (carentes de secuencias codificantes propias), virus adenoasociados (AAV), lentivirus deficientes en integrasa, virus de la viruela, alfavirus y virus del herpes. Preferiblemente, el vector no integrativo usado en la invención es un vector no integrativo basado en virus adenoasociados, similar a las partículas virales adenoasociadas naturales. Un AAV se dirige preferentemente a los tejidos postmitóticos, que se consideran más resistentes al cáncer que los altamente proliferativos. Los ejemplos de vectores no integrativos basados en virus adenoasociados incluyen vectores basados en cualquier serotipo de AAV, es decir, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, Aa V9, AAV10, AAV11 y pseudotipos de Aa V. La especificidad del tejido está determinada por el serotipo de la cápsida. El pseudotipado de vectores de AAV y la modificación de la cápsida mediante ingeniería genética para alterar su rango de tropismo probablemente serán importantes para su uso en terapia.

Los vectores derivados de virus adenoasociados (AAVs) se han convertido en uno de los vectores de elección para muchas aplicaciones de transferencia de genes debido a sus muchas propiedades deseables, incluida la capacidad de transducir una amplia gama de tejidos con alta eficacia, poca inmunogenicidad y un excelente perfil de seguridad (Merten, Geny-Fiamma et al. 2005; Buning, Perabo et al. 2008), estando ausente la toxicidad en muchos modelos preclínicos (Niemeyer, Herzog et al Blood 2009; Mas, Montane et al Diabetes 2006; Jiang, Lillicrap et al Blood 2006; Ghosh, Yue et al. Molecular therapy 2007; Tafuro, Ayuso et al Cardiovascular research 2009). Los vectores de AAV transducen células postmitóticas y pueden sostener la expresión génica a largo plazo (hasta varios años) en modelos animales tanto grandes como pequeños (Niemeyer, Herzog et al Blood 2009; Mas, Montane et al Diabetes 2006; Jiang, Lillicrap et al Blood 2006; Ghosh, Yue et al Molecular therapy 2007; Tafuro, Ayuso et al Cardiovascular research 2009). La seguridad y la eficacia de la transferencia de genes mediante AAVs se han estudiado ampliamente en humanos con resultados alentadores en hígado, músculo, el SNC y la retina (Manno et al Nat Medicine 2006, Stroes et al ATVB 2008, Kaplitt, Feigin, Lancet 2009; Maguire, Simonelli et al NEJM 2008; Bainbridge et al NEJM 2008).

El AAV2 es el serotipo mejor caracterizado para estudios de transferencia de genes tanto en humanos como en modelos experimentales. El AAV2 presenta un tropismo natural hacia los músculos esqueléticos, neuronas, células del músculo liso vascular y hepatocitos. Por lo tanto, el AAV2 es una buena elección como vector para apuntar con ellos como diana a estos tejidos, en particular cuando se usan los métodos o vectores de la invención para tratar una afección asociada con uno de estos tejidos. Por ejemplo, el tratamiento de la degeneración neuromuscular puede ser dirigido a los músculos esqueléticos y/o a las neuronas de esta manera.

Los serotipos recién aislados, como AAV7, AAV8 y AAV9, se han adoptado con éxito en estudios preclínicos (Gao, Alvira et al. PNAS 2002). Aunque se han detectado respuestas inmunológicas limitadas en sujetos humanos tratados con el AAV2 o el AAV1 contra la cápsida del AAV (Manno et al Nat Med 2006; Mingozzi et al Nat Med 2007; Brantly et al PNAS 2009; Mingozzi et al Blood 2009), es posible la expresión a largo plazo del gen terapéutico dependiendo del tejido diana y la vía de administración (Brantly et al PNAS 2009; Simonelli et al Mol therapy 2010). Además, el uso de serotipos no humanos, como AAV8 y AAV9, podría ser útil para superar estas respuestas inmunológicas en sujetos, y los ensayos clínicos acaban de comenzar (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT00979238). Tomados en conjunto, estos datos alentadores sugieren que los vectores de AAV son herramientas útiles para tratar enfermedades humanas con un alto nivel de seguridad y eficiencia.

La elección de virus adenoasociados de amplio tropismo, como los derivados del virus adenoasociado del serotipo 9 (AAV9) es particularmente ventajosa cuando se tratan afecciones asociadas con la longitud corta de los telómeros. Los virus AAV9 han mostrado una transducción eficiente en una amplia gama de tejidos, con un alto tropismo por el hígado, el corazón y el músculo esquelético (Inagaki et al Molecular Therapy 2006) y, así, los efectos beneficiosos de la terapia génica se pueden lograr en más tejidos. Además, los vectores del AAV9 tienen la capacidad única de cruzar la barrera hematoencefálica y dirigirse al cerebro mediante inyección intravenosa en ratones y gatos adultos (Foust et al Nature biotechnology 2009; Duque et al Molecular therapy et al 2009).

Un aspecto de la invención proporciona un sistema en el que la cápsida (que es la parte del virus que determina el tropismo del virus) del vector basado en virus adenoasociados está formada por proteínas de la cápsida del virus adenoasociado del serotipo 9 (AAV9). En una realización de los vectores virales para su uso en la invención, la secuencia polinucleotídica empaquetada en la cápsida está flanqueada por repeticiones internas terminales (ITR) de un virus adenoasociado, preferiblemente del serotipo 2 que se ha caracterizado ampliamente en la técnica, y presenta una secuencia codificante ubicada entre las ITRs. Como se expuso anteriormente, el ácido nucleico codifica preferiblemente un polipéptido de TERT funcional. En una realización, la secuencia reguladora unida de forma operativa a la secuencia codificante de la TERT es el promotor del citomegalovirus (CMV), aunque los expertos en la técnica conocerán otras secuencias reguladoras adecuadas.

Cuando se tratan afecciones asociadas con una longitud corta de los telómeros, es ventajoso dirigir el tratamiento a los tejidos afectados. La elección del serotipo del AAV para la proteína de la cápsida del vector de terapia génica se puede basar así en el sitio deseado de terapia génica. Si el tejido diana es el músculo esquelético, por ejemplo, para el tratamiento de la pérdida de coordinación neuromuscular, se pueden usar vectores virales basados en AAV1 y AAV6. Ambos serotipos son más eficientes en la transfección del músculo que otros serotipos de AAV. AAV3 es útil para transfectar células hematopoyéticas. Una revisión exhaustiva de los vectores basados en AAVs para la terapia génica se puede encontrar en Shi et al, (2008) " AAV-based targeting gene therapy" Am. J. Immunol. 4:51 - 65.

Alternativamente, pueden usarse otros vectores virales en la presente invención. En la presente invención puede usarse cualquier vector compatible con el uso en terapia génica. Heilbronn y Weger (2010) Handb Exp Pharmacol.

197: 143-70 proporciona una revisión de los vectores virales que son útiles en la terapia génica. De acuerdo con toda la discusión anterior, los vectores que comprenden una secuencia codificante de la transcriptasa inversa de la telomerasa (TERT) adecuados para su uso en terapia génica son un punto importante para poner en práctica la invención. Los vectores de terapia génica adecuados incluyen cualquier tipo de partícula que comprende un fragmento de polinucleótido que codifica la proteína transcriptasa inversa de la telomerasa (TERT), unido de forma operativa a un elemento regulador tal como un promotor, que permita la expresión de una proteína TERT funcional que muestra actividad de transcriptasa inversa de la telomerasa en las células diana. Preferiblemente, la TERT está codificada por la secuencia de ácido nucleico indicada en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3, o es un fragmento activo o equivalente funcional de TERT.

El término vector de terapia génica incluye dentro de su alcance moléculas de ADN desnudo tales como plásmidos o minicírculos, es decir, moléculas de ADN circulares que no contienen secuencias de ADN bacteriano, siempre y cuando la secuencia codificante de TERT y su elemento regulador asociado estén insertados en el plásmido, así como sistemas más complicados, como partículas con estructura de viriones (partículas virales), que comprenden al menos una cápsida y al menos una secuencia polinucleotídica, con un tamaño que permite que la secuencia polinucleotídica quede empaquetada dentro de la cápsida de manera similar a la del genoma nativo del virus de origen de la cápsida. La secuencia polinucleotídica debe incluir una región donde la secuencia codificante de TERT y su elemento regulador asociado estén insertados de tal manera que la proteína transcriptasa inversa de la telomerasa se pueda expresar a partir de esa secuencia de polinucleótidos una vez que la partícula viral haya infectado una célula.

En una realización, el vector de terapia génica adecuado para ser usado en la invención es un vector no integrativo, tal como un vector no integrativo basado en virus adenoasociados. Para los propósitos de la invención, la elección de vectores no integrativos parece ser particularmente ventajosa, porque no causan ninguna modificación genética permanente. Además, como se indicó anteriormente, dichos vectores incorporan un mecanismo de seguridad para evitar la proliferación excesiva de células que expresan TERT que perderán el vector si las células comienzan a proliferar rápidamente.

Se prefieren los vectores basados en virus adenoasociados derivados de un virus adenoasociado del serotipo 9 (AAV9) porque los efectos beneficiosos pueden lograrse en más tejidos (ver arriba). En una realización particularmente preferida, la secuencia reguladora unida de forma operativa a la secuencia codificante de la TERT es el promotor del citomegalovirus (CMV). La secuencia de ácido nucleico que codifica la TERT está unida de forma operativa a una secuencia reguladora que dirige la expresión de la secuencia codificante. Tal como se usa aquí, el término "elemento regulador" significa una secuencia de ácido nucleico que sirve como promotor, es decir, regula la expresión de una secuencia de ácido nucleico unida de forma operativa al promotor. Tales "elementos reguladores" o "promotores" pueden controlar la expresión de secuencias de ácido nucleico unidas a ellos de forma constitutiva o inducible.

La secuencia reguladora puede ser un promotor constitutivo. Un ejemplo de una secuencia reguladora que es un promotor constitutivo es el promotor del citomegalovirus (CMV).

La expresión de la TERT después de la terapia génica según la invención persiste durante un período de varios meses a varios años. En ratones, la expresión de TERT fue detectable después de 5 meses. En el mono, la expresión génica después de la terapia génica con un vector basado en AAVs se ha detectado hasta 6 años después del tratamiento y hasta 8 años en perros (Rivera et al Blood 2005, y Niemeyer et al Blood 2009). Por lo tanto, no es necesaria la repetición frecuente del tratamiento utilizando los métodos y vectores de la invención. En una realización de la invención, el sujeto se trata una vez. En una realización alternativa, el sujeto se trata inicialmente y luego se trata nuevamente una vez que los niveles de expresión de TERT disminuyen en aproximadamente el 50% de los alcanzados inmediatamente después del tratamiento. El tratamiento puede repetirse con el mismo vector o un vector alternativo para mantener la reducción de los trastornos relacionados con la edad si es necesario, por ejemplo, anualmente, o una vez cada 5 años o una vez por década. Cuando se administra una segunda dosis o una dosis posterior, puede ser necesario usar un vector de terapia génica diferente, por ejemplo, cuando se usa un vector basado en AAVs, la segunda administración y las administraciones posteriores pueden ser con un vector con una cápsida derivada de un serotipo diferente al utilizado para la primera administración. Es posible que un sujeto desarrolle anticuerpos neutralizantes para el primer vector de terapia génica, lo que lo haría ineficaz si se administrara una segunda vez o una vez posterior (Amado et al (2010) Science Translational Medicine 2 (21): 21 ral6).

Los métodos de tratamiento de la invención tienen el efecto de tratar y/o prevenir afecciones asociadas con una longitud corta de los telómeros. En un aspecto adicional, por lo tanto, la invención se refiere a un método de terapia génica o al uso de un vector de ácido nucleico como se describió anteriormente, para su uso en el tratamiento o prevención en un sujeto de una afección asociada con una longitud corta de los telómeros, que incluye pero no se limita a afecciones basadas en alteraciones genéticas, como la disqueratosis congénita, la anemia aplásica, el síndrome mielodisplásico, la anemia de Fanconi y la fibrosis pulmonar.

La efectividad del tratamiento de las afecciones asociadas con una longitud corta de los telómeros se puede medir mediante diversos métodos conocidos en la técnica. En una realización, la efectividad del tratamiento se mide por un aumento de la duración de la vida de un paciente tratado que padece una afección asociada con una longitud corta de los telómeros en comparación con la duración de la vida esperada para un paciente no tratado que padece la misma afección. En ciertas realizaciones, la duración de la vida se extiende en un 5%, 10%, 15%, 20% o más, con referencia a la duración de la vida esperada para un paciente que padece la misma afección.

En una realización, la efectividad del tratamiento se mide por el retraso o la prevención de la insuficiencia de la médula ósea en un paciente tratado que padece una afección asociada con una longitud corta de los telómeros en comparación con el momento esperado de aparición de la insuficiencia de la médula ósea en un paciente no tratado que padece la misma afección. En ciertas realizaciones, el retraso en la aparición de la insuficiencia de la médula ósea de un paciente tratado que padece una afección asociada con una longitud corta de los telómeros se extiende en un 5%, 10%, 15%, 20% o más, con referencia al momento esperado de aparición de la insuficiencia de la médula ósea en un paciente no tratado que padece la misma afección.

En una realización, la efectividad del tratamiento se mide por un aumento en un buen estado físico general en un paciente tratado que padece una afección asociada con una longitud corta de los telómeros en comparación con el buen estado físico general de un paciente no tratado que padece la misma afección. El buen estado físico general se puede determinar midiendo los atributos físicos asociados con la afección particular. Los ejemplos de dichos atributos físicos incluyen anomalías de la piel (como hiperpigmentación de la piel), envejecimiento prematuro (como el encanecimiento del cabello, distrofia ungueal, leucoplasia oral) y palidez anémica. Dokal, I.2011. Hematology Am Soc Hematol Educ Program, 480-486. Por lo tanto, un aumento en el buen estado físico general puede determinarse por una disminución en los atributos físicos asociados con la afección particular mostrada por el paciente tratado. El buen estado físico general también se puede medir determinando el recuento sanguíneo del paciente. En una realización, el aumento del buen estado físico general se mide determinando la cantidad de leucocitos, linfocitos, trombocitos en una muestra de sangre periférica. Un mayor recuento sanguíneo indica un aumento del buen estado físico general. En ciertas realizaciones, el recuento sanguíneo en un paciente tratado aumenta en un 5%, 10%, 15%, 20% o más, con referencia al recuento sanguíneo de un paciente no tratado que padece la misma afección.

La eficacia del tratamiento también puede medirse determinando directamente la longitud de los telómeros en una muestra tomada del paciente. La longitud de los telómeros se puede medir, por ejemplo, mediante el uso de técnicas de hibridación estándar, como la hibridación in situ fluorescente (FISH), la hibridación in situ fluorescente cuantitativa (Q-FISH), o la hibridación in situ fluorescente cuantitativa fluorescente de alto rendimiento (HT Q-FISH). (Gonzalez-Suarez, Samper et al. 2001) en una muestra tomada del paciente. Las muestras adecuadas para el análisis de telómeros incluyen tejido de médula ósea y muestras de sangre. La longitud de los telómeros también se puede medir como se describe en Slagboom et al. o Canela et al. (2007, PNAS 104:5300-5305).

En una realización particular, se toman muestras del paciente que está en tratamiento a lo largo del transcurso del tratamiento para que se pueda determinar tanto la longitud absoluta de los telómeros como la velocidad de acortamiento de los telómeros en el transcurso del tratamiento. Se pueden tomar muestras todos los días durante el transcurso del tratamiento o a intervalos más largos. En una realización, las muestras se toman una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada 4 semanas, una vez cada cinco semanas, una vez cada seis semanas o más. La comparación de la longitud de los telómeros se puede medir comparando la proporción de telómeros cortos en una muestra tomada de un paciente. En una realización, la proporción de telómeros cortos es la fracción de telómeros que presentan una intensidad por debajo de la intensidad media de la muestra medida mediante una técnica de hibridación in situ, como FISH o Q-FISH. En la realización, la proporción de telómeros cortos es la fracción de telómeros que presentan una intensidad del 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40% o más por debajo de la intensidad media de la muestra. En una realización particular, la proporción de telómeros cortos es la fracción de telómeros que presentan una intensidad del 50% o más por debajo de la intensidad media de la muestra.

En otras realizaciones, la proporción de telómeros cortos es la fracción de telómeros por debajo de una cierta longitud, por ejemplo. 8 kb, 7 kb, 6 kb, 5 kb o más cortos. En una realización, la proporción de telómeros cortos es la fracción de telómeros de 8 kb o más cortos. En otra realización, la proporción de telómeros cortos es la fracción de telómeros de 7 kb o más cortos. En otra realización, la proporción de telómeros cortos es la fracción de telómeros de 6 kb o más cortos. En otra realización, la proporción de telómeros cortos es la fracción de telómeros de 5 kb o más cortos. En otra realización, la proporción de telómeros cortos es la fracción de telómeros de 4 kb o más cortos. En otra realización, la proporción de telómeros cortos es la fracción de telómeros de 3 kb o más cortos.

En una realización, la efectividad del tratamiento se mide por una disminución en la proporción de telómeros cortos en una muestra tomada de un paciente tratado que padece una afección asociada con la longitud corta de los telómeros en comparación con una muestra de control. En una realización, la proporción de telómeros cortos en una muestra tomada de un paciente tratado disminuye en un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% o más en comparación con una muestra de control. En una realización, la muestra de control es una muestra tomada del mismo paciente antes del tratamiento, o tomada en una etapa anterior del tratamiento. En otra realización, la muestra de control es una muestra tomada de un paciente que padece la misma afección y al que no se le proporcionó el tratamiento.

En una realización adicional, la invención se aplica al sujeto administrando una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de uno cualquiera de los vectores de terapia génica para ser usados según la invención descrita anteriormente.

Una "composición farmacéutica" pretende incluir la combinación de un agente activo con un vehículo, inerte o activo, haciendo que la composición sea adecuada para uso diagnóstico o terapéutico in vitro, in vivo o ex vivo.

"Composición" pretende querer decir una combinación de agente activo y otro compuesto o composición, inerte (por ejemplo, un agente o etiqueta detectable) o activo. Una "cantidad efectiva" es una cantidad suficiente para lograr resultados beneficiosos o deseados. Se puede administrar una cantidad efectiva en una o más administraciones, aplicaciones o dosis.

Por lo general, incluirán componentes adicionales al componente activo (como el vector de terapia génica), p. ej. típicamente incluyen uno o más vehículos y/o excipientes farmacéuticos. Una discusión completa de dichos componentes está disponible en Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20a edición, ISBN:0683306472.

Las composiciones generalmente se administrarán a un sujeto en forma acuosa. Antes de la administración, sin embargo, la composición puede haber estado en una forma no acuosa. Por ejemplo, aunque algunos vectores virales se fabrican en forma acuosa, luego se hace con ellos un llenado y se distribuyen y se administran también en forma acuosa, otros vectores virales se liofilizan durante la fabricación y se reconstituyen en una forma acuosa en el momento de su uso. Por lo tanto, una composición que comprende un vector de ácido nucleico que comprende una secuencia codificante de la TERT para su uso según la invención se puede secar, tal como en una formulación liofilizada. La composición puede incluir conservantes tales como tiomersal o 2-fenoxietanol. Sin embargo, se prefiere que la composición esté sustancialmente libr de (es decir, menos de 5 |jg/ml) material mercurial, p. ej. libre de tiomersal.

Para controlar la tonicidad, se prefiere incluir una sal fisiológica, tal como una sal de sodio. Se prefiere el cloruro de sodio (NaCl), que puede estar presente entre 1 y 20 mg/ml, p. ej. aproximadamente 10 2 mg/ml de NaCl. Otras sales que pueden estar presentes incluyen cloruro de potasio, dihidrógeno fosfato de potasio, fosfato de disodio deshidratado, cloruro de magnesio, cloruro de calcio, etc.

Las composiciones generalmente tendrán una osmolalidad de entre 200 mOsm/kg y 400 mOsm/kg, preferiblemente entre 240-360 mOsm/kg, y más preferiblemente estarán dentro del rango de 290-310 mOsm/kg.

Las composiciones pueden incluir uno o más tampones. Los tampones típicos incluyen: un tampón de fosfato; un tampón de Tris; un tampón de borato; un tampón de succinato; un tampón de histidina (particularmente con un adyuvante de hidróxido de aluminio); o un tampón de citrato. Los tampones se incluirán normalmente en el rango de 5-20 mM.

La composición puede incluir material para una administración única, o puede incluir material para administraciones múltiples (es decir, un kit "multidosis"). En las disposiciones multidosis se prefiere la inclusión de un conservante. Como una alternativa a (o además de) incluir un conservante en composiciones multidosis, las composiciones pueden estar contenidas en un recipiente que tiene un adaptador aséptico para la eliminación de material.

Las composiciones de la invención para uso en seres humanos se administran típicamente en un volumen de dosificación de aproximadamente 0,5 ml, aunque a los niños puede administrarse media dosis (es decir, aproximadamente 0,25 ml).

Además de los métodos de tratamiento descritos en el presente documento, la presente solicitud también describe una secuencia de ácido nucleico que codifica una TERT para su uso en terapia. En particular, la terapia puede ser tratar o prevenir una afección asociada con la longitud corta de los telómeros. La invención proporciona un vector de ácido nucleico que comprende una secuencia codificante de la transcriptasa inversa de la telomerasa (TERT), para su uso en un método de terapia: para su uso en tratar la anemia aplásica. Como se describió para los métodos de tratamiento, la secuencia del ácido nucleico de la TERT puede ser la secuencia que se menciona en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3 o un fragmento o equivalente funcional de la misma. La proteína TERT puede tener una secuencia como se la mencionada en la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4, o un fragmento o equivalente funcional de la misma.

El término "paciente" se refiere a un mamífero. En ciertas realizaciones, el paciente es un roedor, primate, ungulado, gato, perro u otra mascota doméstica o mamífero domesticado. En ciertas realizaciones, el mamífero es un ratón, rata, conejo, cerdo, caballo, oveja, vaca, gato o perro doméstico, o un humano. En una realización preferida, el paciente es un humano.

Aunque la invención anterior se ha descrito con cierto detalle a modo de ilustración y de ejemplo con fines de claridad de comprensión, las descripciones y los ejemplos no deben interpretarse como limitantes del alcance de la invención. Las descripciones de todas las patentes y publicaciones científicas citadas en este documento se incorporan expresamente en su totalidad a modo de referencia.

Ejemplos

Ejemplo 1 Modelo de ratón de disqueratosis congénita

Se utilizarán para probar la eficacia de la terapia génica telomerasa para tratar disqueratosis congénita (DKC) ratones con un fondo genético C57B6 que son portadores homocigóticos de un transgén TRF1 condicional (TRF1flox/flox) y además son transgénicos para la Cre-recombinasa bajo el control del promotor endógeno Mx1 inducible por interferón. Para estudiar exclusivamente los efectos de la ablación de TRF1 en el compartimento hematopoyético, se trasplantará médula ósea de estos ratones a ratones de tipo salvaje irradiados como se describió anteriormente (Beier et al., 2012). Un mes después del trasplante, se inyectarán a los ratones a través de su vena de la cola 4x1012 genomas de AAV9 que portan el ADNc de mTERT bajo el control del potente promotor del citomegalovirus (para la producción de virus, ver a continuación el punto 3.3). Por analogía, el AAV9 vacío que carece del gen de la telomerasa se inyectará en un grupo de control. Además, para seguir el tropismo viral y la expresión del transgén a lo largo del tiempo, se inyectará AAV9-eGFP a un grupo separado de animales. Una semana después de la infección con el virus, se inducirá la deleción de TRF1 en la médula ósea mediante un tratamiento a largo plazo con ácido poliinosínico-policitidílico (pI:pC) con inyecciones intraperitoneales cada tres días. El pI:pC actúa como inmunoestimulante y activa la expresión de Cre, que a su vez conduce a la deleción de TRF1 en aproximadamente el 50% de las células hematopoyéticas (tras cada inyección) con las consecuencias mencionadas anteriormente (ver el punto 2). En contraste con el tratamiento con pI:pC, los grupos de animales previamente infectados con AAV9-mTERT y AAV9-vacío no se someterán a un tratamiento con pI:pC para servir como cohortes de control adicionales.

Con este diseño experimental, se reducirá el acortamiento dramático de los telómeros, debido a la proliferación compensatoria en las células hematopoyéticas restantes que no han perdido TRF1, por la expresión ectópica de la telomerasa. La medida más importante para evaluar la efectividad de la terapia génica es la prolongación de la duración de la vida en virtud del retraso o la prevención de la insuficiencia de la médula ósea (punto final del experimento = muerte de los animales). Además, el tratamiento exitoso con la telomerasa debería mostrar mejoras con respecto al buen estado físico general de los animales, es decir, sin anomalías en la piel y sin palidez anémica. Esto último va de la mano con mayores recuentos sanguíneos (leucocitos, linfocitos, trombocitos), que se determinarán a partir de muestras de sangre periférica. La eficacia de la expresión de la telomerasa a nivel molecular incluirá mediciones de la longitud de los telómeros. Para ello, se realizará un análisis Q-FISH de secciones de tejido de la médula ósea y un análisis de Q-FISH de alto rendimiento de muestras de sangre periférica. Para el segundo, se tomará sangre cada tres o cuatro semanas a lo largo del experimento. De este modo, no sólo se puede determinar la longitud absoluta de los telómeros, sino también la velocidad de acortamiento de los telómeros a lo largo del tiempo. Además, se seguirá la atenuación o la abolición de la senescencia replicativa y el agotamiento de las células madre y progenitoras en el compartimento hematopoyético mediante la evaluación de marcadores de senescencia comunes como la actividad beta-galactosidasa y los niveles de proteína p21. Estos marcadores, así como yH2AX y fosfo-CHK1, marcadores moleculares del estrés replicativo, pueden correlacionarse con la longitud de los telómeros y la supervivencia de los animales.

Ejemplo 2 Producción de virus.

Los vectores virales basados en AAVs para la transducción se generarán por triple transfección de células HEK293T como se describe en (Matsushita et al., 1998). Brevemente, células cultivadas hasta un 80% de confluencia se cotransfectan con plásmidos (1) que portan el casete de expresión flanqueado por las ITR virales del AAV9, (2) un plásmido auxiliar que lleva los genes rep2 y cap9 del AAV, y (3) un plásmido que porta las funciones de adenovirus auxiliar. Los casetes de expresión albergan TERT murino bajo el control del promotor CMV más 3'-UTR (AAV9-mTERT), el promotor CMV (AAV9-vacío) solo y eGFP bajo el control del promotor CMV y la señal de poliA del SV40 (AAV9-eGFP). Los vectores se purifican siguiendo un método optimizado basado en dos gradientes de cloruro de cesio consecutivos (Ayuso et al., 2010). Los títulos de partículas con genomas virales se determinan mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Los virus se pueden mantener estables a -80°C hasta la infección de los animales.

Ejemplo 3 Análisis de telómeros

Análisis de telómeros mediante Q-FISH en secciones de parafina

Para la determinación por Q-FISH en cortes de tejido embebidos en parafina los ratones se hibridan con una sonda telomérica de PNA, y la intensidad de la fluorescencia de los telómeros se determina como se ha descrito (Gonzalez-Suarez, Samper et al. 2001). El análisis cuantitativo de imágenes se realiza utilizando el software Definiens Developer Cell (versión XD 1.2; Definiens AG). Para el análisis estadístico se usa una prueba la t de Student de dos colas para evaluar la significancia (software GraphPad Prism).

RT-PCR cuantitativa en tiempo real

El ARN total de los tejidos se extrae con Trizol (Life Technologies). Las muestras de ARN se tratan con ADNasa I y se utilizan como plantilla para una reacción de transcripción inversa utilizando cebadores aleatorios y la Transcriptasa Inversa de Superscript (Life Technologies), de acuerdo con las directrices del fabricante. La PCR cuantitativa en tiempo real se realiza utilizando un ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems), utilizando la mezcla DNA Master SYBR Green I (Applied Biosystems).

Los cebadores:

Actin-For: GGCACCACACCTCTTACAATG (SEQ ID NO: 7);

Actin-Rev: GTGGTGGTGAAGCTGTAG (SEQ ID NO: 8);

TERT-For: GGATTGCCACTGGCTCCG (SEQ ID NO: 9);

TERT-Rev: TGCCTGACCTCCTCTTGTGAC (SEQ ID NO: 10).

p16-For: CGTACCCCGATTCAGGTGAT (SEQ ID NO: 11)

p16-Rev: TTGAGCAGAAGAGCTGCTACGT (SEQ ID NO: 12)

Axin2-For: GGCAAAGTGGAGAGGATCGAC (SEQ ID NO: 13)

Axin2-Rev: TCGTGGCTGTTGCGTAGG (SEQ ID NO: 14)

Cyclin D1 - For: TGCGCCCTCCGTATCTTAC (SEQ ID NO: 15)

Cyclin D1 - Rev: ATCTTAGAGGCCACGAACATGC (SEQ ID NO: 16)

CD44 - For: CAGCCTACTGGAGATCAGGATGA (SEQ ID N2: 17)

CD44 - Rev: GGAGTCCTTGGATGAGTCTCGA (SEQ ID NO: 18)

Klf4 - For: GCGAACTCACACAGGCGAGAAACC (SEQ ID N2: 19)

Klf4 - Rev: TCGCTTCCTCTTCCTCCGACACA (SEQ ID N2: 20)

Tieg1 - For: CCCATTGCCCCTGCTCCTG (SEQ ID NO: 21)

Tieg 1 - Rev: TGTGTCCGCCGGTGTCTGG (SEQ ID NO: 22)

Los análisis estadísticos (prueba de la t de Student) se realizan con los valores de Ct como se ha descrito anteriormente (Muñoz, Blanco et al. 2005).

Ejemplo 4 Terapia génica con telomerasa en la anemia aplásica

Ratones y procedimientos animales.

Los ratones eran de fondo puro C57/BL6 y se produjeron y se alojaron en el alojamiento específico de animales libres de patógenos (SPF) del c NiO en Madrid, España. Se generaron ratones Trfllox/lox Mx1-Crey Trfllox/lox Mx1-wtdescritos previamente (Martinez et al., 2009). Para el trasplante de médula ósea, se utilizaron ratones Trfllox/lox Mx1-Cre de 10 semanas de edad como donantes de médula ósea para el trasplante en ratones de tipo salvaje letalmente irradiados (12 Gy) de 8 semanas de edad como se describió anteriormente (Beier et al., 2012, Samper et al., 2002). Se trasplantaron un total de 2 millones de células mediante una inyección en la vena de la cola en una relación donante:receptor de 1:8 y los ratones se dejaron durante un período de latencia de 30 días para permitir la reconstitución de la médula ósea. Para inducir la expresión de Cre, a los ratones se les inyectó por vía intraperitoneal ácido poliinosínico-policitidílico (pI:pC; Sigma-Aldrich) (15 ug/g de peso corporal) 3 veces por semana durante un total de 5 semanas. Los ratones se dejaron durante una semana adicional antes de que se asignaran aleatoriamente a dos grupos para el tratamiento con los vectores de terapia génica AAV9-vacío o AAV9-Tert. Los vectores se administraron mediante inyección en la vena de la cola a una concentración de 4x10E12 genomas virales por ratón.

Producción de vectores de terapia génica

Los vectores virales se generaron como se describió anteriormente (Matsushita et al., 1998) y se purificaron como se describe en (Ayuso et al., 2010). Brevemente, los vectores se produjeron mediante triple transfección de HEK293T. Las células se cultivaron en botellas cilíndricas rotatorias (Corning, NY, EE.UU.) en medio Eagle modificado por Dulbecco complementado con FBS (10% v/v) hasta el 80% de confluencia y luego se cotransfectaron con: plásmido-1 que lleva el casete de expresión del gen de interés flanqueado por las ITRs del virus AAV2; plásmido-2 que lleva los genes de AAV rep2 y cap9; plásmido-3 que lleva las funciones del adenovirus auxiliar (los plásmidos fueron proporcionados amablemente por K.A. High, Hospital Infantil de Filadelfia). Los casetes de expresión estaban bajo el control del promotor del citomegalovirus (CMV) y contenían una señal de poliA de SV40 para el EGFP y el promotor CMV y la UTR de 3 'del gen Tert como señal de poliA para Tert. Las partículas de AAV9 se purificaron siguiendo un método optimizado utilizando dos gradientes de cloruro de cesio, se dializaron contra PBS, se filtraron y se almacenaron a -80 ° C hasta su uso (Ayuso et al., 2010). Los títulos de los genomas virales títulos se determinaron mediante un método estandarizado de PCR cuantitativa en tiempo real (Ayuso et al, 2014) y los cebadores específicos para la secuencia de CMV:

CMV-Directo: 5 '-CAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGC (SEQ ID NO: 23);

CMV-Inverso: 5 '- AGATGTACTGCCAAGTAGGAATACGT (SEQ ID NO: 24).

Histología

Las muestras de médula ósea (esternón o hueso de la tibia) fueron fijadas en formaldehído al 4% tamponado con fosfato y los huesos se embebieron en parafina después de la descalcificación. Se tiñeron secciones de tejido de 5 pm con hematoxilina-eosina para la evaluación histológica de la médula ósea. La inmunohistoquímica se realizó en secciones de tejidos desparafinados. Después de la recuperación de los antígenos las muestras se procesaron con los anticuerpos anti-EGFP (anti-EGFP de conejo, 1:200; Abcam, ab290). Las células positivas para EGFP se contaron de forma semiautomática utilizando el software ImageJ.

Clasificación por FACS

Para la clasificación de las HSCs se extrajeron de los huesos largos (fémur y tibia) células de médula ósea entera tal como se ha descrito previamente (Samper et al., 2002). Los eritrocitos se lisaron incubando las células durante 10 minutos en 10 ml de tampón de lisis de eritrocitos (Roche), se lavaron una vez con 10 ml de PBS y se resuspendieron en tampón FACS (PBS, EDTA 2 mM, BSA al 0,3%) que contenía Fc-block (1:400) a una concentración de 5-10x10A6 células / 100 pl. Las células se incubaron durante 10 minutos y se lavaron una vez en tampón FACS. Las células se resuspendieron luego en tampón FACS a 20-25 x10A6 células / ml y el cóctel de anticuerpos se agregó como sigue: Anti-sca-1-PerCP-Cy5.5 (1:200), cóctel lin-eFluor450 (1:50) (todo de eBioscience), y anti-c-kit-APC-H7 (1:100) (BD Pharmingen). Las células se incubaron durante 30 min. Después de lavar las células dos veces con PBS, se agregaron 2 L de DAPI (200 g/ml) y las células se clasificaron posteriormente en un FACS ARIA IIu (Becton Dickinson, San Jose, CA) en HSCs (negativas para lin, positivas para sca1 y c-kit) y fracciones de linaje positivo (positivas para lin).

Ensayo de formación de colonias

El ensayo de formación de colonias a corto plazo (CFA) se realizó colocando en placas 1x104 y 2x104 células de médula ósea mononucleadas recién aisladas (los eritrocitos se lisaron como se describió anteriormente) en placas de 35 mm (StemCell Technologies) que contenían medio Methocult (basado en metilcelulosa) (StemCell Technologies) como se describe en el protocolo del fabricante. Todos los experimentos se realizaron por duplicado y los números de colonias formadas se contaron después de 12 días de incubación a 37 °C.

Recuentos sanguíneos

Se extrajo sangre periférica de la vena facial (-50 pl) y se recogió en tubos anticoagulantes (EDTA). Los recuentos sanguíneos se determinaron utilizando un analizador de hematología veterinaria Abacus Junior Vet.

PCR cuantitativa en tiempo real y transferencias Western

Se aisló el ARN total de extractos de médula ósea completa o de células de médula ósea clasificadas por FACS utilizando el mini kit RNeasy de Qiagen de acuerdo con el protocolo del fabricante. Siempre se realizó la digestión opcional con DNasal. La PCR cuantitativa en tiempo real se realizó utilizando un ABI PRISM 7700 o QuantStudio 6 Flex (ambos de Applied Biosystems). Las secuencias de los cebadores para Tert y los genes de referencia Act1 y TBP son las siguientes:

Tert-Directo 5 'GGATTGCC ACTGGCTCCG (SEQ ID NO: 9);

Tert-Inverso 5'TGCTGACCTCCTCTTGTGAC (SEQ ID NO: 10);

Actina-Directo 5'GGCACCACACCTCTTACAATG (SEQ ID NO: 7);

Actina-Inverso 5 'GTGGTGGTGAAGCTGTAG (SEQ ID NO: 8);

TBP-Directo 5'CTTCCTGCCACAATGTCACAG (SEQ ID NO: 25);

TBP-Inverso 5 'CCTTTCTC ATGCTTGCTTCTCTTG (SEQ ID NO: 26).

Análisis de los telómeros por Q-FISH

El análisis por Q-FISH en secciones de tejidos de la médula ósea se realizó como se describió anteriormente (Samper et al., 2000). Brevemente, las secciones de tejidos se fijaron posteriormente en formaldehído al 4% durante 5 minutos, se lavaron 3 x 5 minutos en PBS y se incubaron a 37 °C durante 15 minutos en solución de pepsina (0,1% de pepsina porcina, Sigma; HCl 0,01M, Merck). Se repitieron los lavados y la fijación y se deshidrataron los portaobjetos en una serie de etanol al 70% -90% -100% (5 min cada uno). Los portaobjetos se secaron al aire durante 10 min y se agregaron 30 pl de la mezcla con sonda de telómeros a cada portaobjetos (TrisCl 10 mM, pH 7, MgCl² 25 mM, ácido cítrico 9 mM, Na2HPO482 mM, formamida desionizada al 70% (Sigma), reactivo bloqueante al 0,25% y 0,5 mg/ml de sonda telomérica de PNA (Panagene), se agregó un cubreobjetos y se incubaron los portaobjetos durante 3 minutos a 85 °C y 2 horas a temperatura ambiente en una cámara húmeda en la oscuridad. Los portaobjetos se lavaron 2 x 15 min en TrisCl 10 mM, pH 7, BSA al 0,1% en formamida al 70% con agitación vigorosa, luego 3 x 5 min en TBS de Tween 20 0,08%, y luego se incubaron en un baño de 40,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (4 mg/ml 1 DAPI (Sigma) en PBS). Las muestras se montaron en Vectashield (VectorTM). La imagen confocal se adquirió como pilas de secciones cada 0,5 pm hasta un total de 1,5 pm utilizando un microscopio confocal Leica SP5-MP y se realizaron proyecciones máximas con el software LAS-AF. La intensidad de la señal de los telómeros se cuantificó utilizando el software Definiens.

La Q-FISH de alto rendimiento (HT) en leucocitos de sangre periférica se realizó como se ha descrito (Canela et al., 2007a). Brevemente, se extrajeron 120-150 pl de sangre de la vena facial. Los eritrocitos se lisaron (tampón de lisis de eritrocitos, Qiagen) y se sembraron en placas 30-90 k leucocitos por duplicado en placas de 96 pocillos de paredes negras de fondo transparente recubiertas previamente durante 30 minutos con 0,001% de poli-L-lisina. Las placas se incubaron a 37 °C durante 2 h y se fijaron con metanol/ácido acético (3:1, v/v) 2 x 10 min y durante la noche a -20 °C. Se retiró el fijador, las placas se secaron durante al menos 1 hora a 37 °C y las muestras se rehidrataron en PBS. Las placas se sometieron luego a un protocolo estándar de Q-FISH (ver más arriba) usando una sonda de PNA-CY3 específica de telómeros; se utilizó DAPI para teñir los núcleos. Se capturaron sesenta imágenes por pozo utilizando el sistema de cribado de alto contenido OPERA (Perkin Elmer). Los valores de TL se analizaron utilizando puntos de telómeros individuales (>10.000 puntos de telómeros por muestra). Las intensidades de fluorescencia promedio de cada muestra se convirtieron en kilobases utilizando células L5178-R y L5178-S como estándares de calibración, que tienen TLs estables de 79,7 y 10,2 kb, respectivamente. Las muestras fueron analizadas por duplicado.

AAV9-Tert se dirige a la médula ósea y células madre hematopoyéticas

Primero, nos propusimos abordar la capacidad de los vectores AAV9 para transducir la médula ósea tras la inyección intravenosa utilizando tanto el virus reportero AAV9-EGFP, que permite la determinación de la ubicación y el porcentaje de células transducidas con AAV9, como la determinación de la expresión del ARNm de Tert in vivo en diferentes poblaciones de células de médula ósea después del tratamiento con AAV9-Tert. Con este fin, primero inyectamos a ratones de tipo salvaje partículas de AAV9-EGFP a una concentración de 3,5E12 genomas virales por ratón a través de inyecciones en la vena de la cola. El análisis inmunohistoquímico de la sección de la médula ósea con anticuerpos anti-EGFP específicos reveló un 2% de células positivas con expresión de EGFP en las secciones del medio del hueso y esto se incrementó hasta un 10% en las regiones adyacentes a las articulaciones, que fueron las que mostraron la mayor transducción de AAV9. Luego, inyectamos a ratones de tipo salvaje la misma cantidad de partículas de AAV9-Tert y determinamos la expresión del ARNm de Tert mediante RT-PCR en aislados de médula ósea completa a las dos semanas y 8 meses después de la inyección del virus. Apenas dos semanas después del tratamiento con los vectores AAV9, encontramos un aumento de la expresión del ARNm de Tert en los ratones tratados con AAV9-Tert en comparación con los tratados con el vector AAV9 vacío y esta diferencia se mantuvo todavía 8 meses después del tratamiento inicial. Luego estudiamos la expresión del ARNm de Tert específicamente en las células formadoras de sangre de la médula ósea. Con este fin, realizamos la clasificación por FACS de células HSC positivas para Sca-1 y c-kit y células encaminadas hacia su linaje lin-positivas. Encontramos un aumento significativo tanto en las HSCs (10 veces) como en las células de la médula ósea encaminadas hacia su linaje (3,5 veces) en el ARNm de Tert en ratones tratados con AAV9-Tert en comparación con los ratones tratados con el vector vacío, lo que demuestra que las células de la médula ósea, incluidas las células HSC, son alcanzadas por la terapia génica con Tert. Dado que logramos incrementar la expresión de Tert en las HSC, a continuación abordamos si esto afectó su potencial de células madre.

Con este fin, realizamos un ensayo de células formadoras de colonias (MethoCult). Curiosamente, observamos un número significativamente mayor de colonias en los ratones AAV9-Tert en comparación con los controles de vector vacío.

En resumen, estos datos sugieren que el AAV9 administrado en una dosis alta puede alcanzar las células hematopoyéticas y que esto aumenta la capacidad de proliferación de esas células.

El tratamiento con AAV9-Tert en un modelo de ratón de anemia aplásica rescata la supervivencia

A continuación, probamos si el tratamiento con AAV9-Tert es eficaz para aumentar la supervivencia tras la inducción de anemia aplásica letal debido a telómeros extremadamente cortos (Beier et al., 2012). En particular, utilizamos un modelo condicional de ratón Trf1 recientemente desarrollado por nosotros en el que irradiamos letalmente ratones de tipo salvaje y se les trasplanta médula ósea aislada de ratones Trf1lox/lox Mx1-Cre para estudiar exclusivamente los efectos sobre la médula ósea. La deleción de Trf1 se puede inducir mediante la administración de pl:pC y la expresión subsiguiente de la recombinasa Cre (Beier et al., 2012). Las células en las que se ha producido el agotamiento de Trf1 mueren y se eliminan rápidamente de la médula ósea, mientras que las células que permanecen con Trf1 intacto se someten a rondas compensatorias de división celular que conducen a un rápido acortamiento de los telómeros, seguido de senescencia replicativa y finalmente da como resultado insuficiencia de la médula ósea. En los ajustes experimentales específicos para este caso, indujimos la deleción de Trf1 inyectando a ratones 3 veces por semana pI:pC durante un período total de 5 semanas, momento en el que estos ratones comienzan a mostrar signos de anemia aplásica (Beier et al., 2012). Una semana después de que detuviéramos la inducción de la deleción de Trf1, los ratones se sometieron a tratamiento de terapia génica con vectores AAV9-Tert o de control AAV9-vacío. Supervisamos la supervivencia de estos ratones durante 100 días después del tratamiento con los vectores AAV9. Sorprendentemente, el tratamiento con AAV9-Tert mejoró drásticamente la supervivencia (87%) en comparación con los ratones tratados con el vector vacío (55%) (Figura 1A). En particular, mientras que solo 4 ratones inyectados con AAV9-Tert desarrollaron anemia aplásica durante este tiempo (13%), 16 ratones del grupo de control (44%) murieron con signos claros de anemia aplásica (Fig. 1B,C). De acuerdo con la apariencia anémica, el análisis del recuento sanguíneo de estos ratones (sangre extraída de ratones tratados con AAV9-vacío y AAV9-Tert al sacrificarlos) mostró una caída drástica en el recuento de plaquetas y el nivel de hemoglobina en comparación con los ratones sin signos de anemia aplásica (Fig. 1D, E). El análisis histopatológico post-mortem de las secciones de médula ósea de ratones que murieron durante los primeros 100 días confirmó aún más el fenotipo de anemia aplásica. En particular, los ratones presentaron hipoaplasia y aplasia severa de la médula ósea en 2 o en los 3 linajes sanguíneos. Si bien el diagnóstico en el momento de la muerte en ambos grupos fue insuficiencia de la médula ósea y aplasia, el fenotipo pareció más leve en el grupo de AAV9-Tert en comparación con el grupo de AAV9-vacío, como se observó por la mayor celularidad de la médula ósea.

Nuestros resultados sugieren que la terapia génica con AAV9-Tert reduce significativamente la mortalidad por anemia aplásica al prevenir la pérdida de células hematopoyéticas que forman la sangre.

El tratamiento con telomerasa conduce al alargamiento de los telómeros en la sangre periférica y la médula ósea

Debido a que el fenotipo de anemia aplásica en nuestro modelo de ratón está causado por la pérdida de telómeros, a continuación comparamos la longitud de los telómeros en ratones tratados con telomerasa con ratones que recibían el vector de control. Primero utilizamos la tecnología de HT-Q-FISH (Canela et al., 2007b) para seguir la longitud de los telómeros en monocitos de sangre periférica en forma longitudinal. Para ello, extrajimos sangre en 4 momentos diferentes; después del injerto de médula ósea (1), después del tratamiento pI:pC (2), 2 meses después de la inyección de AAV9 (3) y 4 meses después de la inyección de AAV9 (4). Como se esperaba, encontramos que la longitud de los telómeros entre los momentos 1 y 2 en ambos grupos se reduce aproximadamente en 10 kb, lo que se debe al tratamiento con pI:pC. Si bien la longitud de los telómeros en el grupo de AAV9-vacío entre el momento 2 y el momento 4 continúa acortándose ligeramente, el tratamiento con AAV9-Tert llevó a un aumento neto en el promedio de los telómeros de 10 kb (Figura 2A, B). En el transcurso de este experimento, los ratones tratados con AAV9-vacío mostraron una pérdida media de longitud de los telómeros de 12 kb, mientras que en los ratones tratados con AAV9-Tert, los telómeros se volvieron a alargar hasta niveles similares a los previos al tratamiento con pI:pC (Figura 2C). A continuación, realizamos un análisis de Q-FISH en secciones transversales de médula ósea. En consonancia con la mayor longitud de los telómeros en la sangre periférica, encontramos que los ratones tratados con AAV9-Tert tenían telómeros significativamente más largos en comparación con los ratones tratados con el vector vacío (Figura 2D, E).

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Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un vector de ácido nucleico que comprende una secuencia codificante de la transcriptasa inversa de la telomerasa (TERT) para su uso en el tratamiento de la anemia aplásica.

2. El vector de ácido nucleico para su uso según la reivindicación 1, en el que la TERT está codificada por una secuencia de ácido nucleico que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3.

3. El vector de ácido nucleico para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que la TERT comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 o s Eq ID NO: 4.

4. El vector de ácido nucleico para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la secuencia de ácido nucleico que codifica la TERT está unida de forma operativa a una secuencia reguladora que dirige la expresión de la secuencia codificante.

5. El vector de ácido nucleico para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el vector es un vector no integrativo.

6. El vector de ácido nucleico para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el vector es un vector no integrativo basado en virus adenoasociados.

7. El vector de ácido nucleico para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el vector es un vector basado en virus adenoasociados derivado de un virus adenoasociado del serotipo 9 (AAV9).

8. El vector de ácido nucleico para su uso según la reivindicación 7, en el que la cápsida del vector basado en virus adenoasociados está formada por proteínas de la cápsida del virus adenoasociado del serotipo 9 (AAV9), y la secuencia del ácido nucleico contenido en la cápsida está flanqueada en ambos extremos por repeticiones internas terminales que corresponden al virus adenoasociado del serotipo 2.

9. El vector de ácido nucleico para su uso según la reivindicación 8, en el que el ácido nucleico contenido en la cápsida comprende un fragmento que codifica la secuencia de aminoácidos que codifica TERT.

10. El vector de ácido nucleico para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que el vector comprende una secuencia reguladora que es un promotor constitutivo.

11. El vector de ácido nucleico para su uso según la reivindicación 10, en el que la secuencia reguladora es el promotor del citomegalovirus (CMV).