ES2712575T3 - Variantes del factor VIII que tienen una absorción celular disminuida - Google Patents

Abstract

Una variante de FVIII recombinante que tiene actividad de FVIII, en el que dicha variante comprende 2-10 sustituciones de residuos de aminoácidos cargados positivamente accesibles desde la superficie en el pie C1 y/o el pie C2 de FVIII, en el que dichos residuos de aminoácidos cargados accesibles desde la superficie están sustituidos con alanina o glutamina y en el que las sustituciones dan como resultado una disminución de la absorción celular de dicha variante de FVIII, y en el que dicha variante comprende una sustitución R2215 combinada con una sustitución K2092.

Description

DESCRIPCION

Variantes del factor VIII que tienen una absorcion celular disminuida

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a factores de coagulacion modificados. La presente invencion se refiere mas espedficamente a factores de coagulacion modificados que tienen una absorcion celular disminuida que da como resultado una tasa de eliminacion/absorcion celular disminuida y/o inmunogenicidad reducida. La invencion se refiere ademas al uso de tales moleculas, asf como a metodos para producir dichas moleculas.

Antecedentes de la invencion

La hemofilia A es un trastorno hemorragico hereditario provocado por una deficiencia o disfuncion de la actividad del factor VIII de coagulacion (FVIII). La manifestacion clmica no se encuentra en la hemostasia primaria, ya que la formacion del coagulo de sangre inicial ocurre normalmente. Mas bien, el coagulo es inestable debido a la falta de formacion de trombina secundaria y la estabilizacion de la fibrina del coagulo primario. La enfermedad se trata con una inyeccion intravenosa de FVIII que se afsla de la sangre o se produce de forma recombinante. El desarrollo de anticuerpos neutralizantes (inhibidores) contra FVIII ocurre en aproximadamente el 20-40% de los pacientes con hemofilia A grave despues de la administracion de FVIII, lo que hace que el tratamiento adicional con FVIII sea inefectivo. La induccion de inhibidores por lo tanto proporciona una complicacion importante en el cuidado de la hemofilia.

Las recomendaciones de tratamiento actuales estan pasando del tratamiento tradicional a pedido a la profilaxis. La vida media circulatoria del FVIII endogeno unido al factor de Von Willebrand (vWF) es de 12 a 14 horas y, por lo tanto, el tratamiento profilactico se realiza varias veces a la semana para obtener una vida virtualmente sin smtomas para los pacientes. La administracion intravenosa para muchos, especialmente los ninos y los jovenes, se asocia con un gran inconveniente y/o dolor.

Se han empleado varios metodos en el desarrollo de una variante de FVIII con vida media circul atoria significativamente prolongada. Varios de estos metodos se relacionan con la conjugacion de FVIII con polfmeros hidrofilos como, por ejemplo, PEG (polietilenglicol). El documento WO03031464 divulga un enfoque enzimatico en el que los grupos PEG pueden unirse a los glucanos presentes en el polipeptido.

Tambien se ha sugerido modular la eliminacion de FVIII mediada por el receptor de lipoprotemas de baja densidad (LRP) para obtener una variante de FVIII con una tasa reducida de eliminacion/absorcion celular y, por lo tanto, un aumento de la vida media circulatoria in vivo, pero este enfoque ha sido obstaculizado por redundancia masiva evidente de posibles sitios de union de LRP presentes en la superficie del FVIII y la incertidumbre sobre la funcion de estos. Ademas, algunos de estos sitios se encuentran cerca de regiones cnticas para la actividad de FVIII: C, y una menor union de LRP puede ir acompanada de una perdida sustancial de actividad que hace que la variante de FVIII sea menos atractiva como agente terapeutico. Se piensa que la interaccion de la l Rp y los receptores relacionados con sus ligandos involucra residuos de lisina en la superficie del acoplamiento del ligando en un “collar” acido en el receptor (Mol Cell 2006; 22: 277-283). Ademas, se ha sugerido que los residuos hidrofobos, en combinacion con los residuos de lisina, pueden participar en la interaccion con los miembros de la familia LRP (FEBS J 2006; 273: 5143­ 5159, J Mol Biol 2006; 362: 700-716) y podna por lo tanto, especularse si la modificacion de estos residuos hidrofobos, ademas de los residuos cnticos de lisina u otros residuos cargados positivamente, podna resultar en una interaccion disminuida con los miembros de la familia LRP y una eliminacion potencialmente prolongado y/o disminuido.

Para ser de interes terapeutico, las variantes del FVIII deben conservar la funcion procoagulante del FVIII. Por lo tanto, se deduce que existe una necesidad en la tecnica de variantes espedficas de FVIII con actividad de FVIII mantenida y una vida media circulatoria in vivo significativamente prolongada y/o inmunogenicidad reducida.

Resumen de la invencion

La presente invencion se relaciona asf con una variante de FVIII recombinante que tiene actividad de FVIII, en el que dicha variante comprende 2-10 sustituciones de residuos de aminoacidos cargados positivamente accesibles en la superficie en el pie C1 y/o el pie C2 de FVIII, en el que dichos residuos de aminoacidos cargados accesibles desde la superficie estan sustituidos con alanina o glutamina, y en el que las sustituciones producen una disminucion de la absorcion celular de dicha variante de FVIII, en el que dicha variante de FVIII comprende una sustitucion R2215 combinada con una sustitucion K2092A.

Las variantes de FVIII de acuerdo con la presente invencion tienen una absorcion celular reducida asociada con una vida media circulatoria aumentada. Las variantes de FVIII de acuerdo con la invencion pueden ademas tener la ventaja de tener una union de LRP reducida. Las variantes de FVIII de acuerdo con la invencion pueden ademas tener la ventaja de tener inmunogenicidad reducida en comparacion con las moleculas de FVIII sin este tipo de mutaciones. La explicacion de la inmunogenicidad reducida puede ser que los residuos cargados positivamente estan sustituidos en los pies C1 y/o C2 de FVIII, lo que resulta en una menor absorcion en las celulas responsables de presentar FVIII al sistema inmunologico.

Breve descripcion de los dibujos

Figura 1: Modelo de superficie de la estructura cristalografica de rayos X de FVIII (codigo de entrada pdb 3cdz) que se muestra en las orientaciones anterior y posterior. Se indican las posiciones de los dominios A1, A2, A3, C1 y C2. Los residuos de lisina y arginina estan en negro.

Figura 2: Modelo de superficie de la estructura cristalografica de rayos X de FVIII (codigo de entrada pdb 3cdz) que destaca los dominios C1 y C2 de FVIII. La parte inferior de los dominios C1 y C2 estan en blanco, representan sus regiones de union a la membrana putativas denotadas el pie C1 y el pie C2, respectivamente. Los residuos de lisina y arginina estan en negro.

Figura 3: Figura 1. El intercambio de hidrogeno (HX) controlado por espectrometna de masas identifica las regiones de FVIII involucradas en (A) los espectros de masa/carga de union 4F30 y KM33 correspondientes al fragmento de peptido 2078-2095, ([M+H]+ = 672.3818, z = 3), identificado como parte del epttopo de la union de 4F30 y KM33 a FVIII. (B) Espectros de masa/carga correspondientes al fragmento 2148-2161 peptfdico, (m/z = 565.6554, z = 3), identificados como parte del epftopo de la union tanto de 4F30 como de KM33 a FVIII. Para todos los espectros, los paneles superiores muestran los controles no deuterados; en segundo lugar, el panel muestra el peptido despues de 10 segundos de intercambio con D2O en el ligando de ausencia, los paneles tercero y cuarto muestran el peptido despues de 10 segundos de intercambio con D2O en presencia de 4F30 y KM33, respectivamente.

Figura 4: graficos de tiempo de intercambio de hidrogeno de peptidos representativos de FVIII en presencia de 4F30 y KM33. La incorporacion de deuterio (Da) de los peptidos del FVIII se representa en funcion del tiempo en una escala logantmica en ausencia (cuadrado solido) o la presencia de 4F30 (triangulo abierto) o KM33 (cuadrado abierto). Los peptidos que cubren los residuos aa 2062-2073 y 2163-2168 representan regiones de FVIII que no se ven afectadas por la formacion de complejos con 4F30 y KM33. Los peptidos que cubren los residuos aa 2078-2095, y 2148-2161 representan regiones de FVIII que son parte del epitope de union de 4F30 y KM33.

Figura 5: La secuencia de cobertura de HX analizo los peptidos de FVIII en presencia de KM33 y 4F30. La secuencia primaria (utilizando una numeracion madura; panel horizontal A: aa 2062-2100 y panel horizontal B: aa 2139-2168) se muestra sobre los peptidos analizados HX (mostrados como barras horizontales). Los peptidos que muestran patrones de intercambio similares tanto en presencia como en ausencia de 4F30 y KM33 se muestran sin rellenos (barras abiertas), mientras que los peptidos que muestran una incorporacion reducida de deuterio en ambos enlaces de 4F30 y KM33 se rellenan en negro (barras cerradas).

Descripcion de la invencion

Definiciones:

Moleculas del factor VIII: FVIII/El factor VIII es una glicoprotema grande y compleja que se produce principalmente por los hepatocitos. El FVIII humano consta de 2351 aminoacidos, incluido el peptido senal, y contiene varios dominios distintos, segun lo define la homologfa. Hay tres dominios A, un dominio B unico y dos dominios C. El orden del dominio se puede enumerar como NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-COOH. El FVIII circula en plasma como dos cadenas, separadas en el borde B-A3. Las cadenas estan conectadas por enlaces de iones metalicos bivalentes. La cadena A1-A2-B se denomina cadena pesada (HC), mientras que la A3-C1-C2 se denomina cadena ligera (LC).

“Pie C1” y “pie C2”: En el contexto de la presente invencion, el “pie C1” se define como la region del dominio C1 que tiene la capacidad de anclar no covalentemente la variante de la molecula de FVIII/FVIII a las membranas anionicas que comprende fosfatidil-L-serina encontrado por ejemplo sobre las plaquetas. En la Figura 1 se muestra un modelo de superficie de la estructura cristalografica de rayos X de FVIII (codigo de entrada pdb 3cdz) en las orientaciones anterior y posterior. Se indican las posiciones de los dominios A1, A2, A3, C1 y C2. Los residuos de lisina y arginina estan en negro, mostrando su amplia distribucion. El pie C1 se muestra en blanco en el modelo de FVIII que se muestra en la FIGURA 2. Mas espedficamente, los siguientes aminoacidos C1 probablemente estan anclados en la membrana de fosfolfpidos, en relacion con, por ejemplo, union a las plaquetas, y por lo tanto son una parte del pie C1: 2029-2035 2043-2069 2090-2100 2130-2136 2156-2163. Los inventores de la presente invencion han demostrado sorprendentemente que la mutacion de cada uno de los residuos 2065, 2090 y 2092 dara como resultado variantes del FVIII biologicamente activas que tienen una menor union de LRP, en particular cuando estos residuos estan sustituidos, pero no se limitan a, cualquiera de las dos glutamina o un residuo de alanina, dependiendo del area de superficie accesible del residuo.

En el contexto de la presente invencion, el “pie C2” se define como la region del dominio C2 que probablemente tenga la capacidad de anclar la variante de la molecula de FVIII/FVIII a las membranas anionicas que comprenden fosfatidil-L-serina encontrada, por ejemplo, sobre las plaquetas. El pie C2 se muestra en blanco en el modelo de FVIII que se muestra en la FIGURA 2. Mas espedficamente, los siguientes aminoacidos C2 estan anclados en la capa de fosfolfpidos, en relacion con, por ejemplo, union de plaquetas, y por lo tanto son una parte del pie C2: 2195-2227 2248-2258 2287-2291 2313-2320. Los inventores de la presente invencion han demostrado que la mutacion de uno de los residuos de lisina o arginina expuestos en la superficie en el pie C2 (ya sea R2215 o K2249) dara como resultado variantes del FVIII biologicamente activas que tienen una union de LRP disminuida, en particular cuando estos residuos estan sustituidos con, pero no limitado a, ya sea un residuo de glutamina o un residuo de alanina, dependiendo de la accesibilidad a la superficie del residuo. Los inventores han demostrado ademas que una variante de FVIII que comprende una sustitucion en el pie C1 y una en el pie C2 muestra una disminucion de la union de LRP y mantiene la actividad del FVMI:C.

Residuos cargados accesibles desde la superficie/residuos cargados positivamente/residuos de lisina o arginina en el FVIII C1 y/o el pie C2: el area de la superficie accesible (AAS) es el area de la superficie de una biomolecula o partes de una superficie biomolecular (por ejemplo, una sola cadena lateral de aminoacido) que es accesible a un solvente. El ASA se suele citar en angstrom cuadrado (una unidad de medida estandar en biolog^a molecular). El ASA fue descrito por primera vez por Lee & Richards en 1971 y a veces se le llama la superficie molecular de Lee-Richards [B. Lee and F.M. Richards, “The Interpretation of Protein Structures: Estimation of Static Accessibility” J. Mol. Biol. 55, 379-400 (1971)]. Las accesibilidades de la superficie se pueden calcular con el programa de ordenador Quanta 2005 de Accelrys Inc. usando las coordenadas atomicas que se originan de, por ejemplo, Estructuras de rayos x. La accesibilidad relativa a la superficie de una cadena lateral de aminoacidos es el area accesible real de la superficie dividida por el area de superficie maxima accesible determinada para el aminoacido unico. El ASA se calcula a partir de la estructura cristalografica de rayos X de FVIII con el codigo de entrada pdb 3cdz. Si la accesibilidad relativa a la superficie es inferior al 20%, el residuo se muta a glutamina para evitar el colapso local de la superficie de la protema. Los residuos de aminoacidos accesibles en la superficie cargada, preferiblemente los residuos de aminoacidos cargados positivamente, preferiblemente los residuos de lisina y/o arginina en el pie C1 y/o C2 pueden seleccionarse para la sustitucion de aminoacidos con el fin de llegar a una variante de FVIII que tenga una absorcion celular disminuida y opcionalmente tambien disminuyo la union de LRP/eliminacion mediado por LRP.

“Factor VIII” o “FVIII”, como se usa en el presente documento, se refiere a una glucoprotema plasmatica humana que es un miembro de la via de coagulacion intrmseca y es esencial para la coagulacion de la sangre. “FVIII nativo” es la molecula de FVIII humano de longitud completa como se muestra en la SEQ ID NO. 1 (aminoacido 1-2332). El dominio B abarca los aminoacidos 741-1648 en la SEQ ID NO 1.

SEQ ID NO 1 (wt human FVIII):

ATRRYYLGAVELSW DYMQSDLGELPVDARFPPRVPKS-FPFNTSW YKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPW M G LLG PTIQ AEVYDTW ITLKNM ASH-PVSLHAVGVSYW KASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGG-SHTYVW QVLKENGPMASDPLCLTYSYLSH-VDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVF-□ EGKSW HSETKNSLMQDRDAASARAW PKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVY-W HVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQ-TLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLT

DSEMDWRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAP-DDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLI-IFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKS-DPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSW-YLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTD-FLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRG-MTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPSTRQKQFNATTI-PENDIEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDP-SPGAIDSNNSLSEMTHFRPQLHHSGDMVFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLD-FKVSSTSNNLISTIPSDNLAAGTDNTSSLGPPSMPVHYDSQLDTTLFGKKSSPLTESGG-PLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESS-WGKNVSSTESGRLFKGKRAHGPALLTKDNALFKVSISLLKTNKTSNNSATNRKTHIDGPSLLI ENSPSVWQNILESDTEFKKVTPLIHDRM-LMDKNATALRLNHMSNKTTSSKNMEMVQQKKEGPIPPDAQNPDMSFFKMLFLPESAR-WIQRTHGKNSLNSGQGP-SPKQLVSLGPEKSVEGQNFLSEKNKVWGKGEFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTNLD-NLHENNTHNQEKKIQEEIEKKETLIQENWLPQIHTVTGTKNFMKNLFLLSTRQNVEGSYD-GAYAPVLQDFRSLNDSTNRTKKHTAHFSKKGEEENLEGLGNQTKQIVEKYACTTRISP-NTSQQNFVTQRSKRALKQFRLPLEETELEKRIIVDDTSTQWSKNMKHLTPSTLTQI-DYNEKEKGAITQSPLSDCLTRSHSIPQANRSPLPIAKVSS-FPSIRPIYLTRVLFQDNSSHLPAASYRK-KDSGVQESSHFLQGAKKNNLSLAILTLEMTGDQREVGSLGTSATNSVTYKKVENTVLPKPDL PKTSGKVELLPKVHIYQKDLFPTETSNGSPGHLDLVEGSLLQGTEGAIK-WNEANRPGKVPFLRVATESSAKTPSKLLDPLAWDNHYGTQIPKEEWKSQEKSPEKTAF-KKKDTILSLNACESNHAIAAINEGQNKPEIEVTWAKQGRTERLCSQNPPVLKRHQREITRT-TLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFI-AAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEH-LGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETK-TYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVOLEKDVHSGLIG-PLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERN-CRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNE-NIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEM-LPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAP-KLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLD-GKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLR-

MELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFAT-WSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKE-FLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRI-HPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY

Las moleculas/variantes de FVIII de acuerdo con la presente invencion pueden ser moleculas de FVIII truncadas en el dominio B borradas o con eliminacion del dominio B, en las que los dominios restantes se corresponden estrechamente con la secuencia expuesta en el aminoacido No. 1-740 y 1649-2332 en la SEQ ID NO. 1. Sin embargo, las moleculas truncadas en el dominio B de acuerdo con la invencion pueden diferir ligeramente de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO 1, lo que significa que los dominios restantes (es decir, los tres dominios A y los dos dominios C) pueden diferir ligeramente, por ejemplo. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 aminoacidos de la secuencia de aminoacidos que se indica en SEQ ID NO 1 (aminoacidos 1-740 y 1649-2332) debido al hecho de que se pueden introducir mutaciones para, por ejemplo, reducir la capacidad de enlace vWF. Ademas, se introducen una o dos sustituciones de aminoacidos en el pie C1 y/o C2 para modificar la capacidad de union de FVIII para LRP. Sin embargo, es posible que las variantes de FVIII de acuerdo con la presente invencion comprendan ademas sustituciones de lisina en otros lugares en la superficie de la molecula para modificar adicionalmente la union de LRP. Tambien se pueden introducir sustituciones, eliminaciones o adiciones adicionales de aminoacidos para modular las propiedades de la variante de FVIII de acuerdo con la invencion. Finalmente, se pueden introducir sustituciones de aminoacidos en las variantes de FVIII de acuerdo con la presente invencion para aumentar la estabilidad intramolecular de la molecula.

Las moleculas de FVIII de acuerdo con la presente invencion tienen actividad de FVIII tambien denominada actividad de FVIII: C o FVIII: C, lo que significa la capacidad de funcionar en la cascada de coagulacion de una manera funcionalmente similar o equivalente a FVIII, inducir la formacion de FXa a traves de la interaccion con FIXa en una plaqueta activada, y favorece la formacion de un coagulo sangumeo. La actividad se puede evaluar in vitro mediante tecnicas bien conocidas en la tecnica, como, por ejemplo, medicion de la activacion de FX en un ensayo cromogenico, analisis de coagulos utilizando plasma deficiente en FVIII, ensayos de generacion de trombina, tromboelastograffa, etc. Las moleculas de FVIII segun la presente invencion tienen una actividad de FVIII de al menos aproximadamente el 10%, al menos el 20%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos 90%, y 100% o incluso mas del 100% de la del FVIII humano nativo.

Estabilidad intramolecular de FVIII (estabilidad intrmseca):

La “estabilidad intrmseca” de las variantes del FVIII de acuerdo con la invencion a veces puede denominarse la “estabilidad”, la “estabilidad ffsica”, la “estabilidad inherente”, la “estabilidad estructural”, la “estabilidad qmmica”, la “estabilidad intrmseca”, la “estabilidad in vitro”, la “estabilidad termodinamica”, la “estabilidad termica”, la “estabilidad de plegado”, etc., y depende de las condiciones ambientales de forma compleja. El tema comun para estos terminos es que se refieren a la estabilidad in vitro del polipeptido y esta estabilidad in vitro puede verse como la suma de las fuerzas en el polipeptido que estabilizan el conjunto relativamente pequeno de conformaciones plegadas. Existen diferencias significativas entre la estabilidad in vivo del FVIII y la estabilidad in vitro porque el FVIII esta sujeto a un gran numero de mecanismos de eliminacion in vivo. Hasta ahora no ha sido posible obtener una vida media circulatoria in vivo prolongada con variantes de FVIII que tengan una estabilidad in vitro mejorada. La estabilidad in vitro de las variantes de FVIII segun la invencion se puede mejorar, por ejemplo, por insercion de puentes disulfuro estabilizadores, insercion de aminoacidos hidrofobos adicionales que pueden formar interacciones hidrofobas intramoleculares, insercion de aminoacidos positivos y negativos que formaran interacciones electrostaticas, etc.

La conjugacion de FVIII con varias cadenas laterales se conoce en la tecnica como un medio para obtener una vida media circulatoria prolongada de FVIII. Se ha demostrado previamente que la vida media circulatoria se puede aumentar aproximadamente 2 veces, es decir, hasta aproximadamente 24 horas, por ejemplo, por conjugacion de la molecula de FVIII. La estabilidad intrmseca del FVIII wt, determinada por una vida media en el plasma anticoagulante TAP/hirudina a 37°C, es de aproximadamente 30 horas, lo que coincide con la vida media circulatoria mas larga informada para una variante de FVIII.

Sin embargo, puede haber un efecto inesperado de sinergia en la combinacion de sustituciones de lisina o arginina en el pie C1 y/o C2, por ejemplo, aumentando la estabilidad in vitro de FVIII y/o, por ejemplo, conjugando la variante del FVIII con una cadena lateral. Un sorprendente efecto de sinergia adicional que se puede obtener con las moleculas de acuerdo con la presente invencion es que las variantes resultantes del FVIII pueden ademas poseer una actividad espedfica significativamente mayor que resulta en una molecula mas potente.

Molecula de FVIII truncada/eliminada del dominio B: el dominio B en FVIII abarca los aminoacidos 741-1648 en la SEQ ID NO 1. El dominio B se divide en varios sitios diferentes, generando una gran heterogeneidad en las moleculas de FVIII en plasma circulante. La funcion exacta del dominio B altamente glicosilado es desconocida. Lo que se sabe es que el dominio es prescindible para la actividad del FVIII en la cascada de coagulacion. Por lo tanto, el FVIII recombinante se produce frecuentemente en forma de variantes B eliminadas/truncadas del dominio B.

El FVIII endogeno de longitud completa se sintetiza como una molecula precursora de cadena unica. Antes de la secrecion, el precursor se divide en la cadena pesada y la cadena ligera. El FVIII con eliminacion del dominio B recombinante se puede producir a partir de dos estrategias diferentes. O bien la cadena pesada sin el dominio B y la cadena ligera se sintetizan individualmente como dos cadenas polipeptfdicas diferentes (estrategia de dos cadenas) o el FVIII con eliminacion del dominio B se sintetiza como una cadena polipeptfdica precursora unica (estrategia de cadena unica) que se divide en las cadenas pesada y ligera de la misma manera que el precursor de FVIII de longitud completa.

En un polipeptido precursor de FVIII con eliminacion del dominio B preparado por la estrategia de cadena unica, los restos de cadena pesada y ligera estan normalmente separados por un enlazador. Para minimizar el riesgo de introduccion de epftopos inmunogenicos en el FVIII con eliminacion del dominio B, la secuencia del enlazador es preferible derivada del dominio B del FVIII. Como mmimo, el enlazador debe comprender un sitio de reconocimiento para la proteasa que divide el polipeptido precursor del FVIII eliminado en el dominio B en la cadena pesada y ligera. En el dominio B del FVIII de longitud completa, el aminoacido 1644-1648 constituye este sitio de reconocimiento. El sitio de trombina que conduce a la eliminacion del enlazador en la activacion del FVIII con eliminacion del dominio B se encuentra en la cadena pesada. Por lo tanto, es poco probable que el tamano y la secuencia de aminoacidos del enlazador influyan en su eliminacion de la molecula de FVIII restante mediante la activacion de la trombina. La eliminacion del dominio B es una ventaja para la produccion de FVIII. Sin embargo, partes del dominio B pueden incluirse en el enlazador sin reducir la productividad. El efecto negativo del dominio B en la productividad no se ha atribuido a ningun tamano o secuencia espedficos del dominio B.

El dominio B truncado puede comprender solo un sitio potencial de O-glicosilacion y uno o mas grupos/fracciones laterales estan conjugados covalentemente a este sitio de O-glicosilacion, preferiblemente a traves de un enlazador.

Los oligosacaridos enlazados a O en las moleculas truncadas en el dominio B de acuerdo con la invencion pueden unirse a sitios de O-glicosilacion que se crearon artificialmente por medios recombinantes y/o por generacion de nuevos sitios de O-glicosilacion por truncamiento del dominio B. Un ejemplo de un dominio B de FVIII truncado en O glicosilado es: SFSQNSRHPSQNPPVLKRHQR (SEQ ID NO 2). Dichas moleculas pueden prepararse disenando una secuencia de aminoacidos de FVIII truncada en el dominio B y subsecuentemente sometiendo la secuencia de aminoacidos a un analisis in silico que predice la probabilidad de sitios de O-glicosilacion en el dominio B truncado. Las moleculas con una probabilidad relativamente alta de tener tales sitios de glicosilacion se pueden sintetizar en una celula huesped adecuada, seguido del analisis del patron de glicosilacion y la seleccion subsiguiente de moleculas que tienen glicosilacion unida a O en el dominio B truncado.

La molecula de FVIII tambien contiene una serie de oligosacaridos enlazados a N y cada uno de estos puede servir como un ancla para la union de un grupo/fraccion lateral que se extiende a la vida media.

La longitud maxima del dominio B en la molecula de FVIII wt es de aproximadamente 907 aminoacidos. La longitud del dominio B truncado en las moleculas de acuerdo con la presente invencion puede variar de aproximadamente 10 a aproximadamente 800 aminoacidos, tal como, por ejemplo, desde aproximadamente 10 aminoacidos hasta aproximadamente 700 acidos, tal como, por ejemplo, aproximadamente 12-500 aminoacidos, 12-400 aminoacidos, 12-300 aminoacidos, 12-200 aminoacidos, 15-100 aminoacidos, 15-75 aminoacidos, 15-50 aminoacidos, 15-45 aminoacidos, 20 -45 aminoacidos, 20-40 aminoacidos, o 20-30 aminoacidos. El dominio B truncado puede comprender fragmentos de la cadena pesada y/o la cadena ligera y/o una secuencia introducida artificialmente que no se encuentra en la molecula de FVIII wt. Los terminos “dominio B truncado” y “dominio B eliminado” se pueden usar indistintamente en este documento.

Vida media circulatoria modificada: las moleculas segun la presente invencion pueden tener una vida media circulatoria in vivo modificada en comparacion con la molecula de FVIII de tipo silvestre, preferiblemente una vida media circulatoria aumentada. La vidas media circulatoria se incrementa preferiblemente al menos el 10%, preferiblemente al menos el 15%, preferiblemente al menos el 20%, preferiblemente al menos el 25%, preferiblemente al menos el 30%, preferiblemente al menos el 35%, preferiblemente al menos el 40%, preferiblemente al menos 45%, preferiblemente al menos 50%, preferiblemente al menos 55%, preferiblemente al menos 60%, preferiblemente al menos 65%, preferiblemente al menos 70%, preferiblemente al menos 75%, preferiblemente al menos 80%, preferiblemente al menos 85%, preferiblemente al menos el 90%, preferiblemente al menos el 95%, preferiblemente al menos el 100%, mas preferiblemente al menos el 125%, mas preferiblemente al menos el 150%, mas preferiblemente al menos el 175%, mas preferiblemente al menos el 200%, y lo mas preferiblemente Al menos 250% o 300%. Incluso mas preferiblemente, tales moleculas tienen una vida media circulatoria que se incrementa al menos 400%, 500%, 600% o incluso 700%. Se puede usar el siguiente metodo para medir la vida media circulatoria in vivo: el FVIII se administra por via intravenosa a ratones deficientes en FVIII, por ejemplo, ratones transgenicos (KO) FVIII Exon 16 con cnas originales c57bl/6 en Taconic M&B, o ratones con deficiencia de vWF, por ejemplo, ratones KO VWF exon 4 5 con SV129 mezclado y cnas originales c57bl/6 en Charles River, Alemania. Los ratones con vWF-KO teman un 13% de FVIII: C normal, mientras que los ratones con FVIII-KO no teman FVIII: C detectable. Los ratones reciben una unica inyeccion intravenosa de rFVIII (280 UI/kg) en la vena de la cola. La sangre se extrae del plexo orbital en puntos de tiempo hasta 64 horas despues de la dosificacion utilizando tubos de vidrio capilar no recubiertos. Se toman tres muestras de cada raton y se recogen de 2 a 4 muestras en cada punto de tiempo. La sangre se estabiliza inmediatamente con citrato de sodio y se diluye en cuatro volumenes de tampon (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, BSA al 1%, pH 7.3, con conservante) antes de centrifugacion a 5 min a 4000 * g. El plasma obtenido a partir de sangre diluida se congela en hielo seco y se mantiene a -80°C. El FVIII:C se determina en un ensayo cromogenico esencialmente como se describe en el ejemplo 3. El antfgeno FVIII se puede medir por ELISA, por ejemplo, Asserachrom® VIIIC: Ag de Diagnostica Stago. El analisis farmacocinetico se puede llevar a cabo, por ejemplo, metodos no compartimentales (NCA) que utilizan el software winnonlin pro version 4.1.

Anticuerpos: el termino “anticuerpo” en este documento se refiere a una protema, derivada de una secuencia de inmunoglobulina de la lmea germinal, capaz de unirse espedficamente a un antfgeno o una porcion del mismo. El termino incluye anticuerpos de longitud completa de cualquier isotipo (es decir, IgA, IgE, IgG, IgM y/o IgY) y cualquier cadena unica de los mismos. El sitio en el antfgeno al que se une un anticuerpo se llama epttopo.

Los anticuerpos de longitud completa generalmente comprenden al menos cuatro cadenas polipeptfdicas: es decir, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) que estan interconectadas por enlaces disulfuro. El anticuerpo puede diseccionarse en los fragmentos Fab de union a antfgeno y el dominio Fc que se une a varios receptores Fc. Los fragmentos de anticuerpo “Fv de cadena unica” o “scFv” comprenden los dominios VH y VL de un anticuerpo, donde estos dominios estan presentes en una unica cadena polipeptfdica.

Inmunogenicidad del FVIII: los pacientes con hemofilia A grave tienen menos del 1% de FVIII y, por lo tanto, su sistema inmunitario puede responder a la administracion terapeutica de FVIII como un antfgeno extrano, en particular en relacion con el tratamiento de alta intensidad despues de hemorragias importantes. Los anticuerpos neutralizantes del FVIII (inhibidores) generalmente se asignan a ciertas areas dentro del dominio A2 y la cadena ligera, en particular el dominio C2 (J Thromb Haemost 2004; 2: 1082-1095; Blood 2007; 110: 4234-4242). Se cree que la absorcion por celulas dendnticas y macrofagos es el paso inicial para presentar el FVIII al sistema inmunitario en (J Thromb Haemost 2009; 7: 1816-1823). Se ha sugerido que los receptores de manosa de macrofagos estan involucrados en la absorcion de FVIII por estas celulas presentadoras de antigenos (Proc Natl Acad Sci USA 2007; 104: 8965-8970) mientras que el LRP parece no estar involucrado (Haematologica 2008; 93: 83-89). El desarrollo posterior de los inhibidores es una respuesta inmunitaria dependiente de las celulas T. Se ha identificado y confirmado un solo epftopo de celulas T CD4+ dentro de un peptido que abarca el aminoacido 2098-2112 en el dominio C1, mientras que ningun otro peptido de 15 mer que abarque la totalidad de los dominios A1-A2-A3-C1-C2 se confirmo como positivo (J Thromb Haemost 2005; 3: 991-1000). Mutaciones de dos aminoacidos en el peptido, es decir, M2104 y L2107, dieron como resultado una disminucion en la proliferacion de celulas T. En otro estudio, los epftopos de celulas T se analizaron dentro de los dominios A2, C1 y C2 y se encontro que los residuos de aminoacidos R2220, F2196, N2198, M2199, L2200 y R2215 en C2 son de particular importancia para provocar una respuesta de celulas T (WO 2011/060372). Ademas, un epitope de celulas B en el dominio A2 puede tener una funcion en la generacion de una respuesta inmunitaria, ya que FVIII-R484A/R489A/P492A indujo un nivel mas bajo de anticuerpos anti-FVIII inhibidores en un modelo de ratones con hemofilia A que wt FVIII (Blood 2004; 104 : 704-710). Por lo tanto, se deduce que diferentes investigadores han identificado diferentes epftopos en el FVIII que estan involucrados en la respuesta inmunitaria al FVIII, y que no hay un acuerdo comun sobre donde en el FVIII introducir sustituciones para generar una molecula de FVIII menos inmunogenica. La inmunogenicidad del FVIII se evalua tfpicamente en modelos de ratones con heamofilia A que llevan el murino nativo (Thromb Haemost 1999; 81: 240-244) o (parte de) el repertorio del MHC de clase II (Haemophilia 2010; 16 suppl 5: 47-53), en modelos animales en los que se ha inducido tolerancia a FVIII humano (Haemophilia 2010; 16 suppl 5: 47-53), o en ensayos de respuesta de celulas T humanas (Thromb Haemost 2000; 84: 643-652; WO 2011/060372), aunque no se sabe si alguno de estos modelos es predictivo para la cftnica humana.

Absorcion celular/eliminacion de FVIII mediado por LRP: las variantes de FVIII de acuerdo con la invencion tienen preferiblemente una absorcion celular disminuida. Una menor absorcion celular puede asociarse con una vida media circulatoria in vivo prolongada. La absorcion celular se puede medir utilizando el ensayo divulgado en el ejemplo 7. Los miembros de la familia LRP y LRP se han implicado en la eliminacion del FVIII a traves de la eliminacion de endocitosis de FVIII por celulas que expresan LRP en la superficie de, por ejemplo, hepatocitos. La infusion de una RAP (protema asociada al receptor) de antagonista de LRP en ratones inhibio completamente la fase inicial de la eliminacion de FVIII en ratones BALB/c y prolongo la vida media de 125I-FVIII 3.3 veces (J Biol Chem 1999; 274: 37685­ 37692). En ratones deficientes en LRP condicional, se observo un aumento del nivel plasmatico de FVIII (Blood 2003; 101: 3933-3939) y en un raton combinado deficiente en LRP y LDLR (receptor de lipoprotemas de baja densidad) tiene un tiempo de residencia medio 4.8 veces mayor de FVIII inducido (Blood 2005; 106: 906-912). Si bien estas publicaciones demuestran la funcion de los miembros de la familia LRP y LRP en la eliminacion de FVIII in vivo, las posiciones exactas en FVIII responsables de la interaccion con LRP siguen sin estar claras. Un sitio de union LRP que comprende el aminoacido 484-509 se ha identificado previamente en A2 (J Biol Chem 1999; 274: 37685-37692; Biochemistry 2006; 45: 1829-1840; Blood Coagul Fibronolysis 2008; 19: 543-555). Sin embargo, la union de mAb413 a esta region solo afecto la union de LRP a A2 aislada y no a FVIII intacto, ya que el sitio LRP en A2 solo se expone en FVIII activado (FVIIIa) (J Thromb Heamost 2006; 4: 1487-1493). Ademas, el FVIII con sustituciones de alanina unicas o multiples dentro del aminoacido 376-556 mostro una union de LRP comparable a FVIII sin sustituciones en esta region, y el tiempo de residencia en plasma en ratones de las moleculas de FVIII mutado no aumento con respecto a la vida media de los de tipo silvestre FVIII (resumen PT-035, ISTH 2007). Se ha sugerido que existan sitios de union de LRP en la cadena ligera de FVIII (J Biol Chem 1999; 274: 23734-23739, WO 00/28021) y se identifico un sitio que involucra a Glu1811-Lys1818 en el dominio A3 en base a un efecto inhibitorio de un anticuerpo asf como peptidos sinteticos que cubren esta region y la falta de union de LRP de las quimeras FVIII-FV donde esta region en FVIII se reemplazo con la secuencia correspondiente en FV (J Biol Chem 2003; 278: 9370-9377). Esta region esta cerca o superpuesta con un sitio de interaccion del factor IXa y, por consiguiente, las mutaciones dentro de este sitio pueden afectar la actividad del cofactor del FVIII. Ademas, se ha sugerido un sitio en el dominio C2 basado en la capacidad del mAb ESH4 anti C2 para inhibir la union de LRP de FVIII (J Biol Chem 1999; 274: 23734-23739). Se han sugerido varios epftopos para ESH4 dentro del dominio C2 de FVIII. Un epitope para ESH4 dentro del aminoacido 2248-2285 se observa en J Biol Chem 1997; 272: 18007-18014), mientras que 2173-2222 se identifico mas tarde como esencial para la union de ESH4 a FVIII (Thromb Haemost 2003; 89: 795-802). En la hoja de datos del anticuerpo (American Diagnostica) y en J Mol Recognit 2009; 22: 301-306 se anota un epitope dentro de 2303-2322 de FVIII. Por lo tanto, los datos disponibles para la localizacion del epftopo de ESH4 en FVIII son contradictorios y no estan lo suficientemente detallados como para permitir la prediccion de los aminoacidos individuales esenciales para la union de LRP. Ademas, incluso a altas concentraciones de C2 (500 nM) solo se observo una asociacion modesta con LRP (J Biol Chem 1999; 274: 23734-23739), lo que sugiere que la afinidad del sitio LRP en C2 es baja y que no esta claro si este sitio desempena cualquier funcion dominante en FVIII intacto. Un importante sitio de union a fosfoftpidos esta presente en el dominio C2 de FVIIIa. Esto se identifico originalmente debido a la capacidad de los peptidos sinteticos que abarcan el dominio C2 para inhibir la union del FVIII a la fosfatidil serina inmovilizada (Blood 1990; 75: 1999-2004). De esta manera, se sugirieron los residuos 2303-2332 para mediar la union a fosfoftpidos. Ademas, el anticuerpo monoclonal ESH-8 redujo la afinidad de FVIIIa a las vesfculas de fosfoftpidos que contienen fosfatidil-L-serina (Blood 1995; 86: 1811-1819; J Biol Chem 1998; 273: 27918-27926). El epftopo de ESH8 incluye el aminoacido 2248-2285 (Blood 1995; 86: 1811-1819). Sin embargo, en una publicacion posterior, ESH8 y un peptido que consiste en el aminoacido 2248-2285 no pudieron inhibir la union de FVIIIa a las plaquetas activadas, mientras que el anticuerpo ESH4 y un peptido que cubren el aminoacido 2303-2332 inhibieron la union de FVIIIa a las plaquetas activadas (Biochemistry 200544: 13858-13865).

Por lo tanto, aunque se ha especulado durante mucho tiempo en la tecnica que las variantes de FVIII que tienen una union de LRP disminuida podnan tener una vida media circulatoria in vivo incrementada, no tienen sitios de union de LRP espedficos en los dominios C1 y C2 de FVIII dando como resultado una vida media circulatoria prolongada que hasta ahora se ha identificado.

Se cree que los motivos de union a LRP involucran residuos de lisina pareados con una distancia de aproximadamente 20 A cada acoplamiento en un “collar acido” (Mol Cell 2006; 22: 277-286). Sin embargo, la distancia entre los sitios de union de LRP puede desviarse un poco de los 20 A (por ejemplo, al menos 15 A) debido a la flexibilidad en las cadenas laterales de aminoacidos, la flexibilidad en la estructura del FVIII, etc. Del mismo modo, la distancia entre dos sitios de union de LRP tambien puede ser de aproximadamente 40 A, 60 A o incluso 80 A. La arginina puede sustituir a la lisina, ya que la cadena lateral de la arginina es mas voluminosa que la lisina y es posible que no encaje en el collar acido, lo que disminuye la union de la LRP. El FVIII comprende un gran numero de posibles motivos de union a LRP, es decir, los inventores de la presente invencion han definido 140 lisinas o argininas expuestas en la superficie (Figura 1 y tabla 1). Por lo tanto, se deduce que una persona experta en la tecnica no podna identificar variantes de FVIII con una, dos, tres, o solo un numero limitado de sustituciones con la union de LRP sustancialmente reducida. Ademas, el experto en la materia podna esperar que un gran numero de residuos de lisina y/o arginina se deban mutar para reducir significativamente la union de LRP y la depuracion de FVIII mediada por LRP. Un gran numero de sustituciones de lisina y/o arginina, para reducir la union de LRP, dana como resultado una molecula que tiene poca o ninguna actividad biologica y/o una molecula que no se puede expresar en cantidades suficientes. Esto se ejemplifica mediante varios de los mutantes de FVIII que se muestran en la tabla 1. Sin embargo, los inventores de la presente invencion han demostrado sorprendentemente que la sustitucion de un residuo de lisina o arginina accesible en la superficie ya sea en el pie C1 o C2, o con una sustitucion tanto en el pie C1 como en el pie C2 del FVIII, da como resultado una variante FVIII que tiene una reduccion significativa de la union de LRP mientras retiene la actividad completa.

La absorcion de FVIII por parte de las celulas que presentan antfgeno, como celulas dendnticas y macrofagos, que pasan por alto a la familia del receptor LRP (Haematologica 2008; 93: 83-98). En su lugar, la union del receptor de la manosa macrofaga a los glucanos de alta manosa se ha relacionado con la absorcion de FVIII por estas celulas (Proc Natl Acad Sci USA 2007; 104: 8965-8970). Sin embargo, los inventores de la presente invencion han demostrado que las mutaciones del FVIII que dan como resultado una union disminuida a la LRP tambien muestran una absorcion disminuida en celulas dendnticas y macrofagos. En un modelo murino de formacion de anticuerpos contra el FVIII humano, estas sustituciones en el FVIII sorprendentemente dieron como resultado un nivel mas bajo de anticuerpos anti-FVIII totales, asf como anticuerpos neutralizantes (inhibidores) medidos en el ensayo Bethesda generalmente utilizado para monitorear el desarrollo de inhibidores en pacientes con hemofilia. Por lo tanto, se puede especular si las variantes de FVIII con disminucion de la absorcion celular podnan tener un beneficio terapeutico en relacion con un menor riesgo de desarrollar inhibidores.

Mutaciones de FVIII adecuadas para modular la absorcion celular/union de LRP:

Se sabe en la tecnica que el anticuerpo KM33 tiene la capacidad de inhibir la union del FVIII a LRP (J Biol Chem 2003; 278: 9370-9377 y WO 03/093313). La administracion conjunta de KM33 scFv con FVIII a ratones deficientes en vWF dio como resultado un mayor nivel de actividad de FVIII 15 y 30 minutos despues de la administracion en comparacion con los ratones de control que recibieron solo FVIII (documento WO 03/093313). Como KM33 se une a la region K2092-52094 (Blood 2009; 114: 3938-3946 y el resumen P-M-040, presentado en ISTH, 2007), se ha sugerido que K2092 podna formar parte de un posible sitio de union de LRP, que puede comprender ademas K2065 (resumen O­ M-041 presentado en ISTH, 2007). Estas sustituciones individuales afectaron a la union de LRP, pero no a la interaccion con el factor IXa (resumen O-M-041, ISTH, 2007). Sin embargo, no se ha sugerido que la sustitucion de solo dos o mas (hasta aproximadamente diez) de estos residuos de aminoacidos con alanina disminuya significativamente la union de LRP y/o la absorcion celular.

Las variantes de FVIII que comprenden una sustitucion K2092A y/o una sustitucion F2093A se describen en Blood 2009; 114: 3938-3946. Se encontro que estas mutaciones tienen una reduccion de 3 a 10 veces en la afinidad a membranas que comprenden 4% de fosfatidil-L-serina y una reduccion de mas del 95% de la actividad del factor Xasa a un nivel bajo de fosfatidil-L-serina, por ejemplo, 4%.

Teniendo en cuenta la gran redundancia de los posibles sitios de union de LRP y el hecho de que solo se pueden realizar unas pocas sustituciones de aminoacidos de los residuos de lisina (o arginina) expuestas en la superficie sin perder actividad biologica y/o reducir significativamente el rendimiento de FVIII, hasta ahora no ha sido posible proporcionar variantes de FVIII biologicamente activas que tienen una o dos o unas pocas sustituciones de aminoacidos que dan como resultado una disminucion significativa de la union de LRP. Sin embargo, los inventores de la presente invencion llegaron a seleccionar sustituciones de aminoacidos en el pie C1 y/o C2 del FVIII que mantuvieron la actividad biologica y mostraron una reduccion significativa en la union de la LRP (tabla 1 y 2). No se esperaba que la combinacion de sustituciones dentro de los sitios LRP en el pie C1 con las sustituciones dentro de los sitios en el pie C2 dana lugar a moleculas de FVIII con un efecto mayor en la union de LRP y estas moleculas de FVIII al mismo tiempo mantendnan FVIII:C, como los sitios estan cerca de los sitios de union a fosfolfpidos.

Los ejemplos de variantes de FVIII que tienen union de LRP modulada/absorcion celular de acuerdo con la presente invencion incluyen:

Cadena lateral/grupo lateral/fraccion: las variantes de FVIII de acuerdo con la presente invencion pueden conjugarse covalentemente con un grupo lateral (resto de vida media) mediante una modificacion postraduccional o en forma de una protema de fusion. Una o mas de las siguientes modificaciones de grupo lateral de FVIII pueden llevarse a cabo de este modo: alquilacion, acilacion, formacion de ester, disulfuro o formacion de amida o similares. Esto incluye FVIII PEGilado, FVIII pEGilado con cistema y variantes del mismo. Las variantes de FVIII de acuerdo con la invencion tambien pueden conjugarse con acidos grasos biocompatibles y derivados de los mismos, polfmeros hidrofilos (hidroxietil etil almidon, polietilenglicol, acido hialuronico, pokmeros de heparosan, pokmeros a base de fosforilcolina, flexfmeros, dextrano, acidos poliiselicos), polipeptidos (anticuerpos, fragmentos de union a antigeno de anticuerpos, dominios Fc, transferrina, albumina, peptidos similares a Elastina (MacE-wan SR, Chilkoti A. Biopokmeros. 2010; 94:60), Polfmeros XTEN (Schellenberger V et al, Nat Biotechnol. 2009; 27:1186), PASilacion o HAPilacion (Schlapschy M et al. Protein Eng Des Sel. 2007; 20:273) peptidos de union a albumina (Dennis M S et al. J Biol Chem. 2002, 277: 35035)), etc.

El FVIII de acuerdo con la presente invencion se puede acilar mediante una o mas vidas medias que extienden los grupos/fracciones laterales hidrofobos, opcionalmente a traves de un enlazador. Los compuestos que tienen una fraccion -(CH2) i2- son posibles aglutinantes de albumina en el contexto de la presente invencion. Los grupos laterales hidrofobos a veces pueden denominarse “aglutinantes de albumina” debido al hecho de que dichos grupos laterales pueden ser capaces de formar complejos no covalentes con albumina, promoviendo asf la circulacion de la variante de FVIII acilado en la corriente sangumea, debido a hecho de que los complejos de la variante de FVIII acilado y la albumina se desintegran lentamente para liberar la variante de FVIII. El FVIII se puede acilar utilizando metodos qrnmicos, asf como metodos enzimaticos de “glicoacilacion” siguiendo esencialmente los procesos descritos en el documento WO03031464. Los metodos enzimaticos tienen las ventajas de evitar el uso de cualquier solvente organico, ademas de ser muy especfficos del sitio en general.

El termino “FVIII PEGilado” significa FVIII, conjugado con una molecula de PEG. Debe entenderse que la molecula de PEG puede unirse a cualquier parte de FVIII, incluyendo cualquier resto de aminoacido o fraccion de hidrato de carbono. El termino “FVIII PEGilado con cistema” significa FVIII que tiene una molecula de PEG conjugada a un grupo sulfhidrilo de una cistema introducida en FVIII.

El PEG es una molecula de poKmero adecuada, ya que solo tiene pocos grupos reactivos capaces de entrecruzamiento en comparacion con polisacaridos como el dextrano. En particular, PEG monofuncional, por ejemplo, el metoxipolietilenglicol (mPEG) es interesante ya que su qmmica de acoplamiento es relativamente simple (solo un grupo reactivo esta disponible para conjugar con los grupos de union en el polipeptido). En consecuencia, se elimina el riesgo de entrecruzamiento, los conjugados polipeptfdicos resultantes son mas homogeneos y la reaccion de las moleculas de polfmero con el polipeptido es mas facil de controlar.

Para efectuar la union covalente de la o las moleculas de polfmero al polipeptido, los grupos terminales hidroxilo de la molecula de polfmero se proporcionan en forma activada, es decir, con grupos funcionales reactivos. La PEGilacion puede dirigirse hacia la conjugacion con todos los grupos de union disponibles en el polipeptido (es decir, dichos grupos de union que estan expuestos en la superficie del polipeptido) o puede dirigirse hacia uno o mas grupos de union espedficos, por ejemplo, el grupo amino N-terminal (Patente de Estados Unidos No. 5,985,265), glicanos ligados a N y/u O, etc. Ademas, la conjugacion se puede lograr en una etapa o de manera gradual (por ejemplo, como se describe en el documento WO 99/55377). Un enfoque enzimatico para acoplar grupos/fracciones laterales a glicanos ligados en O y/o N se divulga en el documento WO03031464.

Protema de fusion: las protemas de fusion/protemas quimericas, son protemas creadas a traves de la union de dos o mas genes que originalmente codificaron protemas separadas. La traduccion de este gen de fusion da como resultado un unico polipeptido con propiedades funcionales derivadas de cada una de las protemas originales. La cadena lateral de las variantes de FVIII segun la presente invencion puede, por lo tanto, estar en forma de un polipeptido fusionado a FVIII. El FVIII de acuerdo con la presente invencion puede asf fusionarse con peptidos que pueden conferir una vida media prolongada al FVIII tal como, por ejemplo, anticuerpos y “derivados de fusion de Fc” o “protemas de fusion de Fc”.

La protema de fusion Fc en este documento pretende abarcar FVIII fusionado con un dominio Fc que puede derivarse de cualquier isotipo de anticuerpo, aunque a menudo se preferira un dominio Fc de IgG debido a la vida media circulatoria relativamente larga de los anticuerpos IgG. Ademas, el dominio Fc puede modificarse para modular ciertas funciones efectoras como, por ejemplo, complemento de union y/o union a ciertos receptores Fc. La fusion de FVIII con un dominio Fc, que tiene la capacidad de unirse a los receptores FcRn, generalmente dara como resultado una vida media circulatoria prolongada de la protema de fusion en comparacion con la vida media de la protema WVIFVI. Las mutaciones en las posiciones 234, 235 y 237 en un dominio Fc de IgG generalmente daran como resultado una union reducida al receptor FcyRI y posiblemente tambien a los receptores FcYRIIa y FcyRIII. Estas mutaciones no alteran la union al receptor FcRn, que promueve una larga vida media circulatoria mediante una via de reciclaje endodtico. Preferiblemente, un dominio Fc de IgG modificado de una protema de fusion de acuerdo con la invencion comprende una o mas de las siguientes mutaciones que daran como resultado una afinidad disminuida a ciertos receptores Fc (L234A, L235E y G237A) y una fijacion del complemento mediada por C1q reducida (A330S y P331S), respectivamente.

Factor Von Willebrand (vWF): el vWF es una glicoprotema mono/multimerica grande presente en el plasma sangumeo y producida de forma constitutiva en el endotelio (en los cuerpos de Weibel-Palade), megacariocitos (a -granulos de plaquetas) y tejido conectivo subendotelial. Su funcion principal es la union a otras protemas, particularmente el FVIII y es importante en la adhesion de las plaquetas a los sitios de la herida.

FVIII esta ligado a vWF mientras esta inactivo en circulacion; El FVIII se degrada rapidamente o se borra cuando no esta vinculado a vWF. Por lo tanto, se deduce que la reduccion o supresion de la capacidad de union de vWF en FVIII se considerana un enfoque altamente indeseable para obtener variantes de FVIII con vida media circulatoria prolongada. Sin embargo, puede ser posible reducir o anular el vWF mediante mutagenesis dirigida al sitio si la molecula se conjuga con una fraccion/grupo lateral de vida media protectora.

La region en FVIII responsable de la union a vWF es la region que abarca los residuos 1670-1684 como se describe en el documento EP0319315. Se preve que los mutantes de eliminacion y puntos del FVIII que involucran esta area modificaran la capacidad de unirse a vWF. Los ejemplos de mutaciones puntuales particularmente preferidas de acuerdo con la presente invencion incluyen variantes que comprenden una o mas de las siguientes mutaciones puntuales: Y1680F, Y1680R, Y1680N-E1682T, y Y1680C.

Glicoprotema: el termino “glicoprotema” pretende abarcar peptidos, oligopeptidos y polipeptidos que contienen uno o mas oligosacaridos (glicanos) unidos a uno o mas residuos de aminoacidos de la secuencia de aminoacidos de la “estructura principal”. Los glicanos pueden estar ligados a N o ligados a O.

El termino “acido sialico terminal” o, “acido neurammico terminal” intercambiable pretende abarcar los residuos de acido sialico unidos como el residuo de azucar terminal en una cadena de glicano u oligosacarido, es decir, el azucar terminal de cada antena es acido N-acetilneurammico unido a galactosa a traves de un enlace a2->3 o a2->6.

El termino “galactosa o derivado de la misma” significa un residuo de galactosa, tal como D-galactosa natural o un derivado de la misma, tal como un residuo de N-acetilgalactosamina.

El termino “galactosa terminal o derivado de la misma” significa la galactosa o derivado de la misma unido como el residuo de azucar terminal en una cadena de glicano u oligosacarido, por ejemplo, el azucar terminal de cada antena es galactosa o N-acetilgalactosamina.

El termino “glicoprotema asialo” pretende incluir glucoprotemas en las que se han eliminado uno o mas residuos de acido sialico terminales, por ejemplo, mediante tratamiento con una sialidasa o por tratamiento qmmico, exponiendo al menos un residuo de galactosa o N-acetilgalactosamina de la “capa” subyacente de galactosa o N-acetilgalactosamina (“residuo de galactosa expuesto”).

En general, los glicanos unidos a N, que no son parte del FVIII de tipo silvestre, pueden introducirse en las moleculas de FVIII de la invencion, introduciendo mutaciones de aminoacidos para obtener motivos N-X-S/T. Las moleculas de FVIII de la presente invencion contienen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, o mas, glicanos unidos a N. La estructura de los glicanos unidos a N es de forma alta o compleja. Los glicanos de alto contenido de manosa contienen residuos terminales de manosa en el extremo no reductor del glicano. Los N-glicanos complejos contienen acido sialico terminal, galactosa o N-acetilglucosamina en el extremo no reductor. Los sitios de glicosilacion unidos a N pueden insertarse en las variantes de FVIII de acuerdo con la presente invencion usando tecnicas recombinantes.

Sialiltransferasa: las sialiltransferasas son enzimas que transfieren un acido sialico a un oligosacarido naciente. Cada sialiltransferasa es espedfica para un sustrato donante de nucleotidos de azucar particular. Las sialiltransferasas agregan acido sialico a la galactosa terminal en glicolfpidos (gangliosidos), o glicanos de glucoprotemas unidos a N u O. La sialiltransferasa es adecuada para su uso en la conjugacion enzimatica de grupos/fracciones laterales a glicanos presentes en la molecula de FVIII.

Composicion farmaceutica. Una composicion farmaceutica en este documento significa preferiblemente abarcar composiciones que comprenden moleculas de FVIII de acuerdo con la presente invencion adecuadas para administracion parenteral, tal como, por ejemplo, Composiciones acuosas esteriles listas para usar o composiciones esteriles secas que pueden reconstituirse, por ejemplo, agua o un tampon acuoso. Las composiciones de acuerdo con la invencion pueden comprender diversos excipientes, estabilizantes, etc. farmaceuticamente aceptables.

Los ingredientes adicionales en tales composiciones pueden incluir agentes humectantes, emulsionantes, antioxidantes, agentes de carga, modificadores de tonicidad, agentes quelantes, iones metalicos, vehmulos oleaginosos, protemas (por ejemplo, albumina de suero humano, gelatina o protemas) y un zwitterion (por ejemplo, un aminoacido), tales como betama, taurina, arginina, glicina, lisina e histidina). Tales ingredientes adicionales, por supuesto, no debenan afectar adversamente a la estabilidad general de la formulacion farmaceutica de la presente invencion. La administracion parenteral se puede realizar mediante inyeccion subcutanea, intramuscular, intraperitoneal o intravenosa por medio de una jeringa, opcionalmente una jeringa similar a una pluma. Alternativamente, la administracion parenteral se puede realizar por medio de una bomba de infusion.

Las celulas hospedadoras adecuadas para producir la protema FVIII recombinante de acuerdo con la invencion son preferiblemente de origen marnffero para garantizar que la molecula se procese adecuadamente durante el plegado y la modificacion postraduccional, por ejemplo, glicosilacion, sulfatacion, etc. Al poner en practica la presente invencion, las celulas son celulas de mamffero, mas preferiblemente una estirpe celular de mamffero establecida, que incluye, sin limitacion, estirpes celulares CHO, COS-1, rinon de hamster bebe (BHK) y HEK293. Una celula preferida es la estirpe celular BHK tk-ts13, en lo sucesivo denominada celulas BHK 570. Una estirpe celular CHO preferida es la estirpe celular CHO K1, asf como las estirpes celulares CHO-DXB11 y CHO-DG44. Otras estirpes celulares adecuadas incluyen, sin limitacion, Rata Hep I, Rata Hep II, TCMK, NCTC 1469; Celulas DUKX (estirpe celular CHO) y DG44 (estirpe celular CHO). Tambien son utiles las celulas 3T3, celulas Namalwa, mielomas y fusiones de mielomas con otras celulas. Las celulas actualmente preferidas son celulas HEK293, COS, ovario de hamster chino (CHO), celulas de rinon de hamster bebe (BHK) y celulas de mieloma, en particular celulas de ovario de hamster chino (CHO).

El termino “tratamiento”, como se usa en este documento, se refiere a la terapia medica de cualquier sujeto humano o animal que lo necesite. Se espera que dicho sujeto haya sido sometido a un examen ffsico por parte de un medico que haya dado un diagnostico provisional o definitivo que indicana que el uso de dicho tratamiento espedfico es beneficioso para la salud de dicho sujeto humano o animal. El tiempo y el proposito de dicho tratamiento pueden variar de un individuo a otro, de acuerdo con el estado actual de la salud del sujeto. Por lo tanto, dicho tratamiento puede ser profilactico, paliativo, sintomatico y/o curativo.

En un primer aspecto, la presente invencion se relaciona asf con una variante de FVIII recombinante que tiene actividad de FVIII, en el que dicha variante comprende 2-10, sustituciones de residuos de aminoacidos cargados positivamente accesibles en la superficie, por ejemplo Los residuos de lisina y/o arginina, en el pie de C1 y/o el pie de C2 de FVIII, en los que los residuos de aminoacidos cargados accesibles en la superficie estan sustituidos con alanina o glutamina, y en el que las sustituciones resultan en una absorcion celular reducida de dicha variante FVIII, y en el que dicha variante comprende una sustitucion R2215 combinada con una sustitucion K2092.

En una realizacion, la variante de FVIII de acuerdo con la invencion comprende ademas una sustitucion K2092A.

En otra realizacion, la variante de FVIII recombinante de acuerdo con la invencion comprende ademas una sustitucion R2215A.

En otra realizacion, la variante de FVIII de acuerdo con la invencion comprende ademas una sustitucion de R2090.

En otra realizacion, la variante de FVIII de acuerdo con la invencion comprende una sustitucion de K2065.

En otra realizacion, la variante de FVIII de acuerdo con la invencion comprende una sustitucion K2065 combinada con una sustitucion de R2215.

En otra realizacion, la variante de FVIII segun la invencion comprende una sustitucion K2065 combinada con una sustitucion de K2249.

En otra realizacion, la variante de FVIII de acuerdo con la invencion ha disminuido la union de LRP.

En otra realizacion, la variante de FVIII de acuerdo con la invencion tiene una inmunogenicidad disminuida.

En otra realizacion, la variante de FVIII de acuerdo con la invencion se conjuga con una fraccion que prolonga la vida media.

En otra realizacion, la variante de FVIII segun la invencion comprende ademas la mutacion F2093A.

Otro aspecto se refiere a una composicion farmaceutica que comprende una variante de FVIII de acuerdo con la invencion.

Un aspecto final se relaciona con el uso de una variante de FVIII de acuerdo con la invencion, o una composicion farmaceutica de acuerdo con la invencion, para uso en el tratamiento de la hemofilia.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Generacion de variantes de FVIII

Se inserto un fragmento que codifica la etiqueta cMyc en el terminal C de la cadena pesada en el constructo de expresion que codifica FVIII con un enlazador de dominio B de 21 aminoacidos (Haemophilia 2010; 16: 349-48). El nivel de expresion y la actividad de este FVIII-cMyc2 fueron similares a los del FVIII sin etiquetar. FVIII-cMyc2 se uso como plantilla para las variantes y como control en los ensayos descritos en el ejemplo 3-5. Se agregaron sitios de restriccion adicionales al constructo de expresion FVIII-cMyc2 para facilitar el intercambio de dominios entre variantes. El dominio A1 esta flanqueado por Sa/I y PshAI/MfeI, A2 esta flanqueado por PshAI/MfeI y AvrII/NruI, A3 esta flanqueado por AgeI/MluI y BstZ17I/BstAPI, C1 por BstZ17I/BstAPI y SwaI/sphI y C2 por Swa/SphI y SfiI. La mutagenesis dirigida de los aminoacidos basicos expuestos (lisina o arginina) fue realizada por Geneart AG (Regensburg, Alemania).

Los mutantes con afinidad reducida a LRP1 se localizaron especialmente en los pies de los dominios C1 y C2 (ver la Figura 2 y la tabla 1 y 2). Las combinaciones de mutantes C1 y C2 se clonaron transfiriendo fragmentos SphI/SfiI de 520 pb de R2215A, R2220Q, K2249A y R2320Q a los mutantes C1 K2065A, R2090A y K2092A (tabla 2).

Ejemplo 2: Expresion de los mutantes de FVIII

La transfeccion sin suero se realizo utilizando celulas HKB11 (Cho M-S et al. J Biomed Sci 2002; 9: 631-63) y 293fectin (Invitrogen) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Las celulas en suspension HKB11 se cultivaron en medio de expresion comercial Freestyle 293 (Invitrogen # 12338-018) suplementado con 50 U mL-1 de penicilina y 50 ug ml' 1 de estreptomicina. Las celulas se cultivaron como celulas en suspension en agitadores y se incubaron a 37°C con 5% de CO2 y 95% de humedad relativa. Las celulas se sembraron a una densidad de 3x105 celulas mL-1 y se pasaron cada 3 a 4 dfas. Las concentraciones de celulas viables y totales se evaluaron mediante el analisis de Cedex (Innovatis) utilizando un software de analisis de imagenes para el conteo automatico de celulas. Las celulas viables se destacaron por su capacidad para excluir el colorante azul de tripano. Las celulas se recogieron 96 horas despues de transfeccion y el sedimento celular se aislo mediante centrifugacion suave. Posteriormente, el sedimento celular se resuspendio en el medio de expresion Freestyle 293 que contema NaCl 0.5M. Despues de una centrifugacion suave, los sobrenadantes que conteman FVIII se recolectaron y almacenaron a -80°C hasta su posterior analisis.

Ejemplo 3: FVIII: C medida en ensayo cromogenico

La actividad de FVIII (FVIII: C) del compuesto rFVIII se evaluo en un ensayo de FVIII cromogenico utilizando reactivos Coatest SP (Chromogenix) de la siguiente manera: muestras de FVIII y un estandar de FVIII (plasma de calibracion humano, Chromogenix) se diluyeron en tampon de ensayo Coatest (50 Tris mM, NaCl 150 mM, BSA al 1%, pH 7.3, con conservante). Cincuenta |jL de muestras (sobrenadante de cultivo o variantes de FVIII purificadas) diluidas previamente de 100, 400, 1600 y 6400 veces, se anadieron estandares y control de tampon negativo a las placas de microtitulacion Spectramax de 96 pozos por duplicado. El reactivo factor IXa/factor X, el reactivo fosfolfpido y el CaCl2 del kit Coatest Sp se mezclaron 5:1:3 (vol:vol:vol) y se agregaron 75 j L a los pozos. Despues de 15 minutos de incubacion a temperatura ambiente, se agregaron 50 j l de la mezcla I-2581 del inhibidor de trombina/S-2765 del sustrato Xa del factor y la reaccion se incubo durante 5 minutos a temperatura ambiente antes de agregar 25 j l de acido cftrico 1 M, pH 3. La absorbancia a 405 nm se midio en un lector de placas Envision (Perkin Elmer) con una absorbancia a 620 nm utilizada como longitud de onda de referencia. El valor para el control negativo se resto de todas las muestras y se preparo una curva de calibracion mediante regresion lineal de los valores de absorbancia de los estandares trazados vs. concentracion de FVIII. La actividad espedfica se calculo dividiendo la actividad de las muestras con la concentracion de protema determinada por ELISA (ejemplo 4). La actividad relativa a la plantilla FVIII-cMyc2 se calculo dividiendo la actividad espedfica para la variante FVIII con la actividad espedfica para la plantilla FVIII. Los datos en la tabla 1 demuestran una gran variacion en la actividad de FVIII: C entre las diferentes variantes de FVIII. Los datos en la tabla 2 demuestran que la actividad de FVIII: C se mantuvo en las variantes de FVIII seleccionadas.

Ejemplo 4: Antigeno total de FVIII medido en ELISA

La cantidad de variantes de FVIII se evaluo en un ELISA de Affinity Biologicals (# F8C-EIA) de la siguiente manera: las placas de microtitulacion (Nunc) se recubrieron con 100 pL/pozo de anticuerpo de recubrimiento en PBS (fosfato de sodio 0.10 M; NaCl 0.145 M, pH 7.2). Las placas se sellaron y se incubaron durante la noche a 4°C. Las placas se lavaron 5 veces en tampon de lavado (fosfato sodico 0.01 M, NaCl 0.145 M, Tween 20 al 0.05%, pH 7.2) y se bloquearon en tampon de lavado durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las muestras se diluyeron en tampon de ensayo (Hepes 0.1 M; NaCl 0.1 M; BSA 10 g/l; Tween 20 al 0.1%, pH 7.2) y se transfirieron muestras diluidas 10 pl (o calibrador/control diluido) a cada pozo. Se anadio anticuerpo de deteccion (100 pL) a la placa y se incubo 11^ horas en un agitador a temperatura ambiente. Las placas se lavaron y se agregaron 100 pL de sustrato (sustrato monocomponente TMB, Kem-en-Tec) y se incubaron en un agitador hasta que se desarrollo un color suficiente. La reaccion se detuvo agregando 100 pL de tampon de parada (4M H3PO4). La absorbancia a 450 nm se midio en un lector de placas Envision (PerkinElmer) con una absorbancia a 620 nm utilizada como longitud de onda de referencia.

Ejemplo 5: Union de LRP en ELISA

Las variantes de FVIII se evaluaron adicionalmente para determinar su capacidad para unirse a LRP de la siguiente manera: todas las muestras se diluyeron 40 veces y 80 veces en tampon sin NaCl (Hepes 0.1 M, 10 g/L BSA; Tween 20 al 0.1%, pH 7.2) . El estandar (FVIII-cMyc2) se diluyo a 3000; 1000; 333; 111; 37; 12.3; 4.12 y 0 ng/mL. Las placas de microtitulacion se recubrieron con LRP (1 ug/ml, BioMac, Leipzig, Alemania) en PBS (100 pL/pozo) y se sellaron y se incubaron durante al menos 72 horas a 4°C. Las placas se lavaron 5 veces en tampon sin NaCl, y se bloquearon en el tampon durante al menos 15 min. La muestra estandar/diluida (50 pL/pozo) y el tampon (150 pL/pozo) se agregaron a las placas y se incubaron durante la noche a temperatura ambiente en una camara humeda. Las placas se lavaron y se agregaron 100 pl/pozo de 1 pg/ml de anticuerpo anti-FVIII A2 biotinilado (BDD-FVIII-1F5*biotina, preparado en casa utilizando tecnicas estandar) y se incubaron 1 hora a temperatura ambiente en un agitador. Las placas se lavaron 5 veces y 100 pL/pozo de Streptavidin*HRP (KPL, Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.) diluidas 1:20000 en tampon y las placas se incubaron 1 hora a temperatura ambiente en un agitador. Las placas se lavaron 5 veces y se agregaron 100 pL/pozo de monosustrato TMB (Kem-en-Tec) y las placas se incubaron en un agitador hasta obtener el color suficiente. La reaccion se detuvo con 100 pL/pozo de H3PO44M antes de medir la absorbancia a 450 nm en un lector de placas Envision (PerkinElmer) con absorbancia a 620 nm utilizada como longitud de onda de referencia. La union espedfica a LRP se calculo dividiendo la union a LRP de las variantes con la concentracion de protema determinada por ELISA (ejemplo 4). La union de LRP en relacion con la plantilla de FVIII-cMyc2 se calculo dividiendo la union de LRP espedfica para las variantes con la union de LRP espedfica para la plantilla de FVIII-cMyc2. La Tabla 1 muestra el nivel de expresion, la actividad de FVIII: C y la union a LRP de las variantes de FVIII donde se mutaron los residuos de lisina o arginina expuestos en la superficie. Para algunas de las variantes de FVIII, la actividad y la union de LRP no pudieron detectarse debido al bajo nivel de expresion. Estos estan marcados “low conc” en la tabla. La mayona de las variantes de FVIII en las que el nivel de expresion era lo suficientemente alto como para permitir el analisis de la union de LRP mostro una union de LRP cercana a la del “plantilla FVIII” de control de FVIII sin sustituciones. Algunas variantes de FVIII, por ejemplo, K523A y K1972Q mostraron una disminucion de la union de LRP concomitante con una reduccion de la actividad. Sin embargo, algunas de las variantes de FVIII con sustituciones en el dominio C1 y C2, es decir, K2065A, R2090A, K2092A, R2215A, R2220Q y K2249A habfan reducido la union de LRP (<0.53 con relacion al control con FVIII) mientras que la actividad se mantuvo (>0.78 con relacion al control con FVIII). Estas mutaciones estan ubicadas en el pie C1 y en el pie C2 descritos anteriormente. Cuando se combino una mutacion dentro de esta region del dominio C1 con una mutacion del dominio C2 (tabla 2), se observo una reduccion adicional de la union de LRP para las mutaciones dobles donde se incluyo R2215A. Tambien el mutante doble R2090A-K2249A mostro una mayor reduccion de la union de LRP que la observada para las mutaciones unicas. Para algunas de las mutaciones en las que el nivel de expresion fue inferior a “ 350 ng/ml, no fue posible analizar la union de LRP utilizando el ensayo descrito. La union a LRP de variantes de FVIII purificadas seleccionadas, incluidas las sustituciones de lisina y argina combinadas con F2093A, se analizaron adicionalmente aplicando un rango de concentraciones (hasta 18 nM) en el ensayo, y los valores de Kd se calcularon mediante regresion no lineal de las curvas de union usando la ecuacion para un enlace total de sitio en Prism version 5.01 Software. La Tabla 3 muestra el aumento de veces en Kd en relacion con FVIII sin las mutaciones insertadas. Cuanto mayor sea el aumento de veces en Kd, mas se reduce la union de LRP. Los datos muestran que si dos o mas, es decir, hasta cuatro, de los residuos de aminoacidos en el C1 (K2065, R2090, K2092, F2093) y C2 pies (R2215, R2220 y K2249) fueron sustituidos, una reduccion sustancial de la union de LRP fue observado.

Tabla 1. Union y actividad de los mutantes unicos del FVIII

Tabla 2. Mutantes individuales y dobles del FVIII seleccionados con union LRP reducida

Tabla 3. Union a LRP relativa a FVIII tipo silvestre determinada por titulaciones en ELISA

Ejemplo 6: Estudios de union de LRP por analisis de resonancia de plasmon superficial (SPR)

El analisis de SPR se realizo empleando un sistema biosensor BIAcore™ 3000 (Biacore AB, Uppsala, Suecia). El LRP de longitud completa (BioMac, Leipzig, Alemania) se acoplo covalentemente (10 fmol/mm2) a la superficie de dextrano de un chip de sensor CM5 activado a traves de grupos amino primarios, utilizando el kit de acoplamiento de amina segun lo prescrito por el proveedor. Los derivados de FVIII FVIII-YFP, FVIII-YFP-K2092A, FVIII-YFP-F2093A y FVIII-YFP-K2092A-F2093A se construyeron y expresaron como se describe (Blood 2009; 114: 3938-3945), excepto que el anticuerpo anti-FVIII CLB-CAg l l 7 fue reemplazado por el fragmento de anticuerpo de cadena simple VK34 (Blood 2000; 96: 540-545) que se construyo en el anticuerpo monoclonal IgG de longitud completa VK34 como se describe (Br J Haematol 2008; 142: 644-652). El FVIII se cargo en la columna VK34 Sepharose en imidazol 50 mM (pH 6.7), CaCl250 mM, NaCl 0.8 M. Despues de cargar, la columna se lavo posteriormente con imidazol 50 mM (pH 6.7), CaCl2 50 mM, NaCl 0.8 M e imidazol 50 mM (pH 6.4), CaCh 40 mM, tampon de etilenglicol al 5% (v/v). A continuacion, el FVIII se eluyo de la columna de VK34 Sefarosa en imidazol 50 mM (pH 6.4), CaCl240 mM, etilenglicol al 55% (v/v). Las fracciones que conteman FVIII se diluyeron en Tris 50 mM (pH 8.0), NaCl 100 mM, glicerol al 10% (v/v) de CaCl0 5 mM y se absorbieron a Q Sepharose FF (Amersham Biosciences, Belgica). Posteriormente, la columna de Q Sepharose se lavo con Tris 50 mM (pH 8.0), NaCl 100 mM, CaCl05 mM 10% (v/v) glicerol. El FVII se eluyo de la columna Q Sepharose en Tris 50 mM (pH 7.4), CaCl25 mM, NaCl 0.8 M, 50% (v/v) de glicerol y se almaceno a -20°C. Las variantes de FVIII purificadas mantuvieron la actividad completa segun lo evaluado por la relacion de 0.92-1.03 entre la actividad (metodo de prueba FVIII Coatest, Chromogenix, Milan, Italia) y el antfgeno (ELISA FVIII, ver Blood 2009; 114: 3938-3945). Los derivados de FVIII (60 nM) se pasaron sobre LRP inmovilizado, y la respuesta de union en unidades de resonancia (RU), corregida por la union no espedfica, se registro durante 360 segundos de asociacion. La Tabla 4 muestra que la union de LRP de FVIII-K2092A disminuyo aproximadamente 100 RU en comparacion con FVIII-YFP sin sustituciones, mientras que la union de FVIII-F2093A se redujo solo ligeramente (17 RU). Sin embargo, al combinar las dos sustituciones en el pie C1 se observo una disminucion sustancial en la union de LRP (aproximadamente 200 RU).

Tabla 4. Union LRP de FVIII-YFP y variantes medidas por SPR

Ejemplo 7: Union LRP de variante de cadena ligera de FVIII

Las mutaciones puntuales K2065R, K2065A, K2092R y K2092A y las mutaciones dobles K2065R-K2092R y K2065A-K2092A se introdujeron en la cadena ligera del FVIII mediante Quick Change Mutagenesis™ (Stratagene, La Jolla, California, EE. UU.) Utilizando cebadores apropiados segun lo indica el artfculo. La transfeccion sin suero de las variantes de la cadena ligera del FVIII se realizo utilizando celulas FreeStyle™ 293-F (Invitrogen, Carlsbad, California, EE. UU., No. R790-07) y 293fectin (Invitrogen) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Las celulas en suspension FreeStyle™ 293-F se cultivaron en un Medio de Expresion comercial Freestyle 293 (Invitrogen # 12338­ 018). Las celulas se cultivaron como celulas en suspension en agitadores y se incubaron a 37°C con 8% de CO2 y 95% de humedad relativa. Las celulas se sembraron a una densidad de 3x105 celulas mL-1 y se pasaron cada 3 a 4 dfas. Las celulas se recogieron 120 horas despues de la transfeccion y el sedimento celular se aislo mediante centrifugacion suave. Posteriormente, el sedimento celular se resuspendio en el medio de expresion Freestyle 293 que contema NaCl 0.55 M. Despues de una centrifugacion suave, la cadena ligera de FVIII que contema los sobrenadantes se recogio y almaceno a -20°C hasta su posterior analisis. El grupo II de LRP se expreso en celulas de rinon de hamster bebe (BHK) y se purifico como se describe (J Biol Chem. 2003; 278:9370-7). La asociacion y la disociacion de Grupo II Lr P a las variantes de la cadena ligera de FVIII K2065A, K2092A, K2065A-K2092A, K2065R, K2092R y K2065R-K2092R se evaluaron mediante un analisis de SPR utilizando un biosensor BIAcore 3000 (Biacore AB, Uppsala, Suecia). El anticuerpo anti-C2 CLB-EL14 IgG4 (Br J Haematol 2008; 142: 644-652) se inmovilizo en un chip sensor CM5 a una densidad de 27 fmol/mm2 utilizando el metodo de acoplamiento de amina segun las instrucciones del fabricante. Posteriormente, las variantes de cadena ligera de FVIII K2065A, K2092A, K2065A-K2092A, K2065R, K2092R y K2065R-K2092R se unieron al anticuerpo anti-C2 a una densidad de 17 fmol/mm2. Se pasaron concentraciones variables (0.2-200 nM) de grupo II LRP sobre las variantes de cadena ligera de FVIII K2065A, K2092A, K2065A-K2092A, K2065R, K2092R y K2065R-K2092R en un tampon que contiene 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 0.005% (v/v) Tween 20 y 20 mM Hepes (pH 7.4) a 25°C con un caudal de 20 pl/min. La superficie del chip sensor se regenero tres veces despues de cada concentracion de grupo LRP II usando el mismo tampon que contema NaCI 1M. La union a las variantes de la cadena ligera de FVIII K2065A, K2092A, K2065A-K2092A, K2065R, K2092R y K2065R-K2092R se registro durante 240 segundos de asociacion y se corrigio para determinar la union no espedfica. Los datos de union durante la fase de asociacion se ajustaron en un modelo de asociacion exponencial de una fase. Las respuestas en el equilibrio se representaron en funcion de la concentracion de Grupo II l Rp . Las respuestas en equilibrio se ajustaron mediante regresion no lineal utilizando una hiperbola estandar para obtener valores Kd (software GraphPad Prism 4, San Diego, California, EE. UU.). La Tabla 5 muestra que la union del Grupo II LRP a la variante de la cadena ligera del FVIII que porta dos reemplazos de lisina en el dominio C1 en las posiciones K2065 y K2092 esta mas deteriorada que una variante de la cadena ligera del FVIII que porta un reemplazo de la lisina en el dominio C1 en la posicion K2065 o K2092.

Tabla 5. Afinidad de las variantes C1 de la cadena ligera de FVIII para el grupo II de LRP medido por SPR.

Ejemplo 8: Absorcion celular de FVIII

Una variedad de celulas esta expresando LRP y receptores endocfticos relacionados. Estas incluyen las celulas de la estirpe celular de glioblastoma humano U87 MG que se sabe que expresan altos niveles de LRP (Cancer Res 2000; 60: 2300-2303). Estas celulas son particularmente utiles para estudiar la absorcion celular mediada por LRP de ligandos de union de LRP tales como como FVIII. Las celulas U87 MG se obtuvieron de ATCC (HTB-14). Las celulas se cultivaron en placas de 24 pozos durante 48 horas en EMEM complementado con un 10% de FCS inactivado por calor a 37°C en un 5% de CO2. Las celulas se lavaron con un tampon que contema HEPES 10 mM (pH 7.4), NaCl 135 mM, KCl 10 mM, CaCh 5 mM MgSO42 mM y se incubaron durante 15 minutos a 37°C con FVIII-Y^f P 40 nM, FVIII-YFP K2092A, FVIII-YFP-F2093A y FVIII-YFP-K2092A-F2093A (variantes preparadas como se describe en el ejemplo 6). Posteriormente, las celulas se lavaron respectivamente con el mismo tampon HEPES y TBS (Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM). Las celulas se recogieron empleando tripsina, se neutralizaron con EMEM complementado con FCS inactivado por calor al 10%, se lavaron con TBS y se resuspendieron en TBS BSA al 0.5% (p/v). La absorcion de FVIII se determino mediante analisis de citometna de flujo. Para los estudios de union celular, las celulas se incubaron durante 15 minutos a 4°C con HEPES 10 mM (pH 7.4), NaCl 135 mM, KCl 10 mM, CaCh 5 mM MgSO42 mM. A continuacion, las celulas se incubaron durante 45 minutos a 4°C con FVIII-YFP 40 nM, FVIII-YFP-K2092A, FVIII-YFP-F2093A y FVIII-YFP-K2092A-F2093A. Las celulas se lavaron posteriormente con TBS en hielo y luego con TBS en hielo que contema BSA al 0.5% (p/v). Las celulas se rasparon y se resuspendieron en TBS b Sa al 0.5% (p/v). La union y absorcion de FVIII se midio utilizando un clasificador de celulas activadas por fluorescencia (citometro de flujo Becton Dickinson LSR II). El ruido se redujo durante el analisis al eliminar eventos con valores de dispersion frontal y lateral diferentes de los caractensticos de las celulas U87MG. Los datos de citometna de flujo se recopilaron utilizando FacsDiva version 5.0.3 (Becton Dickinson) y se descargaron en el programa FlowJo para su analisis. La Tabla ± muestra la intensidad de fluorescencia media de las celulas U87 MG en presencia de FVIII-YFP-K2092A, FVIII-YFP-F2093A y FVIII-YFP-K2092A-F2093A a 4°C (union celular) y a 37°C (absorcion celular). Los datos muestran que la union celular y la absorcion de FVIII-YFP-K2092A, FVIII-YFP-F2093A y FVIII-YFP-K2092A-F2093A mediante celulas que expresan LRP se redujeron en comparacion con FVIII-YFP sin mutaciones.

Tabla 6. Union y absorcion de FVIII-YFP y variantes del mismo por celulas que expresan LRP

Ejemplo 9: Actividad espedfica mantenida de mutantes de FVIII C1 dobles y triples

Las variantes de FVIII FVIII-R2090A, FVIII-K2092A-F2093A y FVIII-R2090A-K2092A-F2093A se prepararon como se describe en el ejemplo 6. La actividad de FVIII se midio en un ensayo de FVIII cromogenico como se describe en el ejemplo 6. Las concentraciones de protema se midieron utilizando el metodo de Bradford (Anal Biochem 1976; 72: 248-254). Las propiedades de las protemas purificadas se enumeran en la Tabla 7. La actividad espedfica se calculo dividiendo la actividad con la concentracion de protema o el antigeno. FVIII con las mutaciones K2092A-F2093A y R2090A-K2092A-F2093A mantuvo la actividad.

Tabla 7. Actividad de FVIII-K2092A-F2093A y FVIII-R2090A-K2092A-F2093A.

Ejemplo 10: Absorcion celular del mutante FVIII C1 doble y triple

Se analizaron las endocitosis de los mutantes FVIII-K2092A-F2093A y FVIII-R2090A-K2092A-F2093A sin el companero de fusion YFP (protema de fluorescencia amarilla) en celulas U87MG (ver ejemplo 8). Las celulas se incubaron durante 15 minutos a 37°C con HEPES 10 mM (pH 7,4), NaCl 135 mM, KCl 10 mM, CaCl25 mM, MgSO42 mM. A continuacion, las celulas se incubaron durante 45 minutos con diferentes cantidades de FVIII de tipo silvestre, FVIII-K2092A-F2093A o FVIII-R2090A-K2092A-F2093A. Las celulas se lavaron posteriormente con TBS enfriado con hielo (Tris-HCl 50 mM, pH 7,6, NaCl 150 mM), se rasparon, se resuspendieron en TBS enfriado con hielo y se lavaron una vez con TBS enfriado con hielo. Posteriormente, las celulas se fijaron con paraformaldehndo libre de metanol ultrapuro recien disuelto al 1% (Polysciences, Eppelheim, Alemania) y se incubaron con anticuerpo monoclonal anti-FVIII CLB-CAg117 conjugado con FITC en presencia de 0.05% de saponina en TBS que contiene 0.5% de HSA. Las intensidades medias de fluorescencia se determinaron mediante citometna de flujo utilizando LSRII (BD Biosciences, Uppsala, Suecia). Los resultados se resumen en la Tabla 8. El FVIII es endocitado de manera dependiente de la dosis por las celulas U87MG. La absorcion de FVIII-K2092A-F2093A se vio gravemente afectada. La evaluacion de la absorcion de FVIII-R2090A-K2092A-F2093A revelo que la absorcion de esta variante fue aun mas reducida en comparacion con la de FVIII-K2092A-F2093A. Estos resultados muestran que el reemplazo de R2090, K2092 y F2093 dio como resultado una molecula de FVIII con una absorcion reducida en las celulas que expresan LRP.

Tabla 8. Absorcion de FVIII-K2092A-F2093A y FVIII- R2090A-K2092A-F2093A en celulas U87MG

Ejemplo 11: Absorcion celular de mutantes dobles FVIII C1 y C2

Se sembraron placas de 24 pozos recubiertas con colageno (Blood 2002; 99: 457-462) con celulas U87MG en DMEM-F12 suplementado con FCS al 10% inactivado por calor a 37°C en CO2 al 5%. Las celulas se cultivaron hasta la confluencia, se lavaron con un tampon que contema HEPES 10 mM (pH 7,4), NaCl 135 mM, KCl 10 mM, CaCh 2 mM MgSO42 mM y se incubaron durante 30 minutos a 37°C con FVIII 40 nM. K2065A, FVIII-K2249A, FVIII-K2065A-K2249A, FVIII-K2092A, FVIII-R2215A, o FVIII-K2092A-R2215A (ver ejemplos 1 y 2). Las celulas se recogieron mediante raspado en TBS (Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM) suplementado con BSA al 0.5%. Las celulas se resuspendieron y se fijaron durante 15 minutos a temperatura ambiente en un 0.4% de paraformaldel'ndo libre de metanol ultrapuro (Polysciences, Eppelheim, Alemania). Las celulas fijas se incubaron durante 60 minutos a temperatura ambiente con el anticuerpo anti-cMyc de raton 9E10 (Sigma, M4439) que se diluyo 500 veces en TBS, BSA al 1%, saponina al 0.3%. Las celulas se lavaron con TBS, BSA al 0.5% y luego se incubaron durante 45 minutos a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario Anti-raton de cabra Alexa Flo 488 (Invitrogen, A-11001) que se diluyo 200 veces en TBS, BSA al 1%, 0.3% de saponina. Las celulas se lavaron y se resuspendieron en TBS, BSA al 0.5% y se analizaron empleando un clasificador de celulas activadas por fluorescencia (citometro de flujo Becton Dickinson LSR II) como se describe en el ejemplo 8. La tabla 9 muestra la intensidad media de fluorescencia de las celulas. Las sustituciones individuales muestran una absorcion reducida en comparacion con WT FVIII. Sin embargo, el defecto mas fuerte en la absorcion celular se observa para las variantes que llevan una sustitucion tanto en el dominio C1 como en el C2.

Tabla 9. Absorcion celular de variantes de FVIII (40 nM) con sustituciones en el dominio C1 y/o el dominio C2.

Ejemplo 12: Absorcion celular de FVIII por las celulas dendnticas

Las celulas dendnticas median la absorcion de FVIII ante la presentacion al sistema inmunitario y potencialmente provocan una respuesta inmunitaria (Blood 2007; 109: 610-612, J Thromb Haemost 2009; 7: 1816-1823). Las celulas dendnticas expresan LRP, asf como otros receptores endocfticos. La absorcion celular de variantes de FVIII se investigo mas a fondo utilizando celulas dendnticas derivadas de monocitos humanos, macrofagos derivados de monocitos humanos y celulas dendnticas derivadas de medula osea murina. Se aislaron monocitos de celulas mononucleares de sangre periferica a partir de muestras de aferesis usando microperlas CD14, un separador de celulas magnetico y un sistema de separacion de celulas Elutra™ como se describio anteriormente (Vaccine 2007; 25: 7145-52). Los monocitos se diferenciaron en celulas dendnticas en medio CellGro DC suplementado con 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina, 1000 U/ml de GM-CSF humano recombinante y 800 U/ml de IL-4 humana recombinante. Despues de 4-6 dfas de cultivo celular, se evaluo el fenotipo inmaduro de las celulas determinando los marcadores de superficie celular CD14, CD80, CD83 y CD86. Para controlar la absorcion de variantes de FVIII mediante citometna de flujo, se lavaron primero una vez con 2 x 105 de DC inmaduras una vez con medio sin suero y se incubaron con FVIII en 120 pl de medio Cell-Gro DC sin suero durante 30 minutos a 37°C. Despues de la absorcion de FVIII, las celulas se lavaron con TBS enfriado con hielo, se fijaron con paraformaldel'ndo recien preparado al 1% y se incubaron con anticuerpo anti-FVIII monoclonal conjugado con FITC CLB-CAg117 en presencia o ausencia de saponina 0.05% en TBS que contema 0.5% de albumina de suero humano. Las intensidades medias de fluorescencia y el porcentaje de celulas positivas se determinaron mediante citometna de flujo utilizando LSRII (BD Biosciences, Uppsala, Suecia). Los resultados de los experimentos de absorcion que emplean FVIII de tipo silvestre purificado, FVlII-K2092A-F2093A y FVIII-R2090A-K2092A-F2093A se muestran en la Tabla 10. Los resultados muestran una absorcion dependiente de la dosis de FVIII de tipo silvestre por celulas dendnticas humanas. La variante FVIII-K2092A-F2093A muestra una absorcion fuertemente reducida por las celulas dendnticas, mientras que FVIII-R2090A-K2092A-F2093A revela una disminucion aun mas pronunciada en su absorcion por las celulas dendnticas. Estos resultados muestran que el reemplazo de R2090, K2092 y F2093 reduce considerablemente la absorcion de FVIII por las celulas dendnticas.

Tabla 10. Absorcion de la absorcion de FVIII, FVIII-K2092A-F2093A y FVIII-R2090A- K2092A-F2093A en celulas dendnticas derivadas de monocitos humanos.

Ejemplo 13: Absorcion celular de FVIII en macrofagos

Los macrofagos tambien pueden absorber FVIII en tugado y bazo y presentar FVIII al sistema inmunitario (Blood 2008; 112: 1704-1712, J Thromb Haemost 2009; 7: 1816-1823) y, por lo tanto, la absorcion de las variantes del FVIII se evaluo posteriormente utilizando macrofagos derivados de monocitos humanos. Los monocitos se aislaron como se describe en el ejemplo 10 y se diferenciaron en macrofagos incubando durante 5 dfas en medio RPMI 1640 suplementado con FCS al 10%, 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina y 50 ng/ml de M-CSF humano recombinante. Para controlar la absorcion de variantes de FVIII mediante citometna de flujo, se lavaron primero 2 * 105 de macrofagos una vez con medio sin suero y se incubaron con FVIII 15 nM en 120 pl de medio CellGro DC sin suero durante 30 minutos a 37°C. Despues de la absorcion de FVIII, las celulas se lavaron con TBS enfriado con hielo, se fijaron con paraformaldehudo recien preparado al 1% y se incubaron con anticuerpo anti-FVIII monoclonal conjugado con FITC CLB-CAg117 en presencia o ausencia de saponina 0.05% en TBS que contiene 0.5% de albumina de suero humano. Las intensidades medias de fluorescencia y el porcentaje de celulas positivas se determinaron mediante citometna de flujo utilizando LSRII (BD Biosciences, Uppsala, Suecia). Los resultados de los experimentos de absorcion que emplean FVIII de tipo silvestre, FVIII-R2090A, FVIII-K2092A-F2093A y FVIII-R2090A-K2092A-F2093A se muestran en la Tabla 11. Los resultados revelan que la absorcion de FVIII-R2090A se reduce ligeramente, mientras que se observa una fuerte disminucion en la absorcion de FVIII-K2092A-F2093A. Se observa una reduccion aun mas pronunciada en la absorcion para FVIII-R2090A-K2092A-F2093A. Estos resultados muestran que la sustitucion de R2090, K2092 y F2093 reduce la absorcion de FVIII tambien por los macrofagos.

Tabla 11. Absorcion de la absorcion de FVIII, FVIII-K2092A-F2093A, y FVIII-R2090A-K2092A-F2093A (15 nM) en macrofagos derivados de monocitos humanos.

Ejemplo 14: Absorcion celular de FVIII por celulas dendnticas derivadas de medula osea murina

Posteriormente, las variantes de absorcion de FVIII se abordaron utilizando celulas dendnticas derivadas de la medula osea murina. Las celulas de la medula osea se aislaron enjuagando los femures de ratones E17 KO hemofflicos con PBS suplementado con 2% de FCS. La suspension de medula osea se incubo en Tris-NH4Cl a temperatura ambiente durante 2 minutos para lisar eritrocitos. Finalmente, las celulas se resuspendieron a 1x106 celulas/ml que conteman 20 ng/ml de GM-CSf recombinante de raton y se cultivaron durante 7-9 dfas en medio RPMI 1640 suplementado con HEPES 2.5 mM, 2-mercaptoetanol 55 mM, 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina, glutamina 5 mM y FCS al 10%. La expresion de CD11c, CD11b, CD80, CD86 y Gr-1 se midio en el dfa 7-9. La absorcion de FVIII se estudio como se describio anteriormente para celulas dendnticas y macrofagos derivados de monocitos humanos. Los resultados de los experimentos de absorcion de FVIII se presentan en la Tabla 12. Los resultados muestran que el FVIII-R2090A se endocita a un nivel ligeramente reducido en comparacion con el FVIII de tipo silvestre, mientras que la endocitosis del FVIII-K2092A-F2093A esta mas gravemente danada. La endocitosis de FVIII-R2090A-K2092A-F2093A esta mas severamente danada en comparacion con FVIII-K2092A-F2093A. Estos resultados muestran que el reemplazo de R2090, K2092 y F2093 reduce la absorcion de FVIII tambien por celulas dendnticas derivadas de la medula osea murina.

Tabla 12. Absorcion de wt FVIII, FVIII-R2090A, FVIII-K2092A- F2093A, y FVIII-R2090A-K2092A-F2093A (15 nM) en celulas dendnticas derivadas de medula osea de murino.

En general, los hallazgos reportados en los ejemplos 8 y 10-14 ensenan como definir los residuos que contribuyen a las superficies interactivas en FVIII que median su endocitosis por una variedad de celulas que expresan LRP, incluyendo celulas dendnticas humanas y macrofagos, asf como celulas dendnticas murinas.

Ejemplo 15: Anti FVIII C1 y C2 anticuerpos que bloquean la absorcion celular de FVIII

Como un enfoque alternativo para definir los residuos que contribuyen a la absorcion celular de FVIII, se aplico un panel de anticuerpos con epftopos dentro de todos los dominios de FVIII en estudios de union de celulas de FVIII que emplean celulas U87MG (ver ejemplo 8), hepatocitos primarios de rata y macrofagos derivados de monocitos humanos. Los anticuerpos ESH-2, Es H-4, ESH-5 y Es H-8 (Thromb Haemost 1986; 55: 40-46) estan disponibles comercialmente en American Diagnostica. KM33 se describe en J Biol Chem 2003; 278: 9370-9377 y WO 03/093313. CLB-CAg117 se describe en Blood 1998; 91: 2347-2352. Los anticuerpos restantes se prepararon en casa despues de la inmunizacion de ratones con FVIII utilizando tecnicas estandar para la preparacion de anticuerpos monoclonales. Se utilizaron hepatocitos primarios de ratas recien aislados, preparados en casa o adquiridos de Biopredic International (Rennes, Francia). Brevemente, se abrieron ratas Sprague Dawley anestesiadas y se canalizo la vena porta mientras se ataba la vena cava y luego se cortaba despues del comienzo de la perfusion con tampon Hepes (25 mM hepes, Na2HPO40.38 mM, KH2PO40.35 mM, KCl 2.31 mM, 0.3 K M NaCl 22 mM de glucosa, pH 7.4). El tejido se digirio con 120 mg de colagenasa (Sigma C-5138) en tampon hepes y posteriormente se enjuago con CaCh 5 mM en tampon Hepes. La capsula de tejido alrededor del fngado se desprendio para liberar las celulas en el tampon de lavado (D MEM/F12 con L-glutamina y 15 mM hepes (Gibco) suplementado con BSA al 1% y hemisuccinato de hidrocortisona 0.1 mM (Sigma) e insulina 1 nM (Sigma)). Las celulas se centrifugaron a 50 x g y se desecho el sobrenadante. El sedimento celular se resuspendio en medio E de William (Biopredic International, Rennes, Francia) suplementado con L-glutamina 2 mM, 100 UI/mL de insulina, 100 pg/mL de estreptomicina y hemisuccinato de hidrocortisona 5 pM. Los hepatocitos se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 24 pozos a una densidad de 2.5 * 105 celulas/pozo durante un total de 48 h. Los monocitos se aislaron mediante separacion magnetica utilizando perlas magneticas anti-CD14 (Miltenyi) y una columna MACS (Miltenyi) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los monocitos (0.5 x 106 celulas/ml) se sembraron en matraces de cultivo de tejidos T-75 y se anadieron 3.3 ng/ml de M-CSF (R&D Systems). Se agregaron 3.3 ng/ml adicionales de M-CSF despues de tres dfas de cultivo celular. Despues de seis dfas, los macrofagos se lavaron con PBS y se incubaron 10-20 min a 4°C con EDTA 2.5 mM en PBS con 5% de FCS. Las celulas se sembraron en placas de cultivo tisular de 48 pozos a una densidad de 3.5 x 105 celulas/pozo y se incubaron durante la noche. Las celulas U87 y los macrofagos se lavaron cuidadosamente con tampon A (HEPES 100 mM, NaCl 150 mM, 4 KCl, glucosa 11 mM, pH 7.4) y se incubaron durante 15 min con tampon B (tampon A complementado con CaCl2 5 mM y 1 mg/ml BSA). Se agregaron anticuerpos anti FVIII (concentracion final 10 pg/ml) a 125I -FVIII (concentracion final 1 nM) y se incubaron 10 min antes de agregarlos a las celulas e incubar durante la noche a 4°C. Posteriormente, las celulas se lavaron dos veces con tampon B helado y lisado con NaOH 200 mM, SDS al 1%, EDTA 10 mM. Se uso un protocolo similar para los hepatocitos primarios de rata, excepto que se uso medio en lugar de tampon. 125I en el lisado se conto en un contador y (Cobra). El lfmite 125I en ausencia de anticuerpos anti FVIII se establecio en 100%. La Tabla 13 muestra el efecto de los anticuerpos anti FVIII sobre la union de 125I -FVIII a celulas U87MG, macrofagos y hepatocitos. Los datos muestran que son solo los anticuerpos anti C1 KM33 y 4F30 y algunos de los anticuerpos anti C2, es decir, ESH-4, 4F161 y CLB-CAg117, que inhiben la union del FVIII a las celulas. Notablemente, el panel de anticuerpos tiene un efecto similar en los tres tipos de celulas analizadas, lo que indica que son los mismos epftopos en FVIII los que estan involucrados en la absorcion celular independientemente del tipo de celula.

Tabla 13. Inhibicion de la union de las celulas del FVIII por los anticuerpos anti C1 y anti C2

Ejemplo 163: Los anticuerpos anti FVIII C1 y C2 prolongan la vida media de FVIII in vivo

El FVIII preparado como se describe (Haemophilia 2010, 16; 349-359) se mezclo con scFv o fragmentos fab de anticuerpos anti C1 y/o anti C2 en una cantidad que garantiza una saturacion inicial del >98% de FVIII in vivo usando valores de Kd de experimentos de resonancia de plasmones de superficie y suponiendo una dilucion de 20 veces de la sustancia de ensayo in vivo. Esta dilucion de 20 veces se baso en un volumen de distribucion de 70 ml/kg obtenido para FVIII cuando se administro solo, un peso estimado de los ratones de 28.6 g y un volumen de la sustancia de prueba de 0.1 ml. FVIII solo (280 UI/kg) o mezclado con anticuerpos/anticuerpos se administro por via intravenosa a ratones con deficiencia de FvW (n = ± por grupo). Se extrajo sangre del plexo orbital t = 0.08; 1, 2, 3, 4 y 5 h. Se tomaron tres muestras de cada raton y se recolectaron 3 muestras en cada punto de tiempo. La sangre se estabilizo inmediatamente con citrato de sodio y se diluyo en cuatro volumenes de tampon (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, BSA al 1%, pH 7.3, con conservante) antes de la centrifugacion a 5 min a 4000 * g. El plasma se congelo en hielo seco y se mantuvo a -80°C antes del analisis del antfgeno FVIII. Los valores medios se utilizaron para las estimaciones de los parametros farmacocineticos, utilizando un enfoque no compartimental (Phoenix WinNonlin Pro 6.1). Los valores de PK resultantes se muestran en la Tabla 14. Si bien el FVIII solo tiene una eliminacion relativamente rapido en los ratones con deficiencia de VWF, el bloqueo de C1 o C2 produjo una eliminacion disminuido y una vida media prolongada (T / ) y un tiempo de residencia promedio. El bloqueo tanto de un epftopo en C1 como de un epftopo en C2 dio como resultado una eliminacion mas reducida y un T / prolongado y un tiempo de residencia promedio en comparacion con la adicion de solo uno de los anticuerpos. Esto muestra que los anticuerpos KM33 y 4F161 protegen los epftopos del FVIII implicados en la absorcion celular y, por lo tanto, prolongan la vida media del FVIII.

Tabla 14. Farmacocinetica de FVIII coadministrado con fragmentos de anticuerpos anti C1 y/o anticuerpos C2 en ratones deficientes en VWF

Ejemplo 17: Epftopos de los anticuerpos FVIII C1 y C2 que bloquean la absorcion celular y se prolongan en la eliminacion in vivo

Los epftopos de los anticuerpos que bloquean la absorcion celular descritos en el Ejemplo 13 se mapearon mediante espectrometna de masas de intercambio de hidrogeno (HX-MS). La tecnologfa HX-MS explota que el intercambio de hidrogeno (HX) de una protema puede ser seguido facilmente por espectrometna de masas (MS). Al reemplazar el solvente acuoso que contiene hidrogeno con solvente acuoso que contiene deuterio, la incorporacion de un atomo de deuterio en un sitio dado en una protema dara lugar a un aumento en la masa de 1 Da. Este aumento de masa puede controlarse como una funcion del tiempo por espectrometna de masas en muestras apagadas de la reaccion de intercambio. La informacion de etiquetado de deuterio puede ser sub-localizada a regiones en la protema por digestion con pepsina en condiciones de enfriamiento y despues del aumento de masa de los peptidos resultantes. Un uso de HX-Ms es explorar sitios involucrados en interacciones moleculares identificando regiones de intercambio reducido de hidrogeno en la formacion de complejos protema - protema. Por lo general, las interfaces de union se revelaran por reducciones marcadas en el intercambio de hidrogeno debido a la exclusion esterica del disolvente. La formacion del complejo protema - protema puede detectarse por HX-MS simplemente midiendo la cantidad total de deuterio incorporada en cualquiera de los miembros de la protema en presencia y ausencia de la pareja de union respectiva en funcion del tiempo. La tecnica HX-MS utiliza los componentes nativos, es decir, protemas y anticuerpos o fragmentos Fab, y se realiza en solucion. Por lo tanto, HX-Ms brinda la posibilidad de imitar las condiciones in vivo (Mass Spectrom. Rdo. 25, 158 (2006). El FVIII (Haemophilia 2010, 16; 349-359) y los anticuerpos KM33 y 4F30, (ver ejemplo 14) se intercambiaron en tampon con imidazol 20 mM, CaCl210 mM, NaCl 150 mM, pH 7.3, antes del analisis. Los experimentos de HX fueron automatizados por un robot Leap (H/Dx PAL; Leap Technologies Inc.) operado por el software LeapShell (Leap Technologies Inc.), que realizo el inicio de la reaccion de intercambio de deuterio, el control del tiempo de reaccion, la reaccion de apagado, la inyeccion en el sistema de UPLC y el control del tiempo de digestion. El robot Leap estaba equipado con dos pilas de temperatura controlada mantenidas a 20°C para almacenamiento de tampon y reacciones de HX y mantenidas a 2°C para almacenamiento de protema y solucion de enfriamiento, respectivamente. Ademas, el robot Leap contema una unidad Trio VS enfriada (Leap Technologies Inc.) que contiene las columnas de pepsina, pre y analftica, y las valvulas de conmutacion y de tubena LC a 1°C. Las valvulas de conmutacion se han actualizado de HPLC a Microbore UHPLC valvulas de conmutacion (Cheminert, VICI AG). Para la digestion de pepsina en lmea, se cargaron 100 pL de la muestra apagada que contema 0.15 pmol de FVIII y se pasaron sobre un cartucho de pepsina inmovilizado Poroszyme® (2.1 * 30 mm, Applied Biosystems) utilizando un caudal isocratico de 200 pL/min (0.1% acido formico: CH3OH 95:5). Los peptidos resultantes se atraparon y desalaron en una precolumna VanGuard BEH C18 de 1.7 pm (2.1 * 5 mm, Waters Inc.). Posteriormente, las valvulas se cambiaron para colocar la precolumna en lmea con la columna analftica, UPLC-BEH C18 1.7 pm (2.1 * 100 mm, Waters Inc.), y los peptidos se separaron usando un gradiente de 9 min de 15-40% de B entregado a 150 pl/min desde un sistema a Qu ITY UPLC (Waters Inc.). Las fases moviles consistieron en A: acido formico al 0.1% y B: acido formico al 0.1% en CH3CN. Los datos de ESI MS y los experimentos de energfa elevada (MSE) se adquirieron en modo de ion positivo utilizando un Q-T de Premier MS (Waters Inc.). Se utilizo leucina-encefalina como masa de bloqueo ([M+H]+ iones a m/z 556.2771) y los datos se recopilaron en modo continuo. Los peptidos pepticos se identificaron en experimentos separados utilizando metodos de MSE (Waters Inc.). Los datos de m Se se procesaron utilizando Biopharma-Lynx 1.2 (version 017). Los archivos de datos en bruto de HX-MS se sometieron a una correccion de bloqueo continua. El analisis de datos, es decir, la determinacion del centroide de peptidos deuterados y el trazado de curvas en intercambio, se realizo utilizando HX-Express (Version Beta; J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2006; 17: 1700).

El intercambio de amida hidrogeno/deuterio (HX) se inicio mediante la preparacion de soluciones de FVIII en una concentracion de 30 pM en ausencia o presencia de 4F30 o KM33 en el correspondiente tampon deuterado, es decir, imidazol 20 mM, CaCl210 mM, 150 mM NaCl, preparado en D2O, 98% D2O final, pH 7.3 (valor no corregido)). Todas las reacciones de HX se llevaron a cabo a 20°C y conteman 3 pM de FVIII en ausencia o presencia de exceso de mAbs de FVIII (4.5 uM) para asegurar la saturacion de FVIII con el anticuerpo. En intervalos de tiempo apropiados que oscilaron entre 10 y 2 horas y 46 minutos y 40 segundos (10.000 s), se enfriaron partes aftcuotas de la reaccion de HX con un volumen igual de tampon de extincion enfriado con hielo TCEP 1.35 M clorhidrato de (Tris(2-Carboxietil)-Fosfina (Calbiochem®, EMD Chemicals inc.)) que resulta en un pH final de 2.6 (valor no corregido).

El mapa de peptidos de la digestion con pepsina de FVIII contema 653 peptidos (>20 puntos de iones), que cubnan el 82% de la secuencia de N8.

La tasa de incorporacion de deuterio (curso temporal de HX) de 653 peptidos, que cubren el 82% de la secuencia primaria de FVIII, se monitorizo en presencia y ausencia de KM33 en 4 puntos de tiempo, es decir, 10 s, 100 s, 1,000 s, y 10,000 s (figuras 3A, 4, 5).

El patron de intercambio observado en presencia o ausencia de KM33 se puede dividir en dos grupos: un grupo de peptidos muestra un patron de intercambio que no se ve afectado por la union de 4F30 y KM33 (Figura 4 [aa 2062­ 2073 y 2163-2168 ]), que comprende el 99.2% de los peptidos. En contraste, otro grupo de peptidos pepticos del FVIII muestra proteccion frente al intercambio tanto con 4F30 como con KM33 (Figura 4), que incluye el 0.8% de los peptidos pepticos. Por ejemplo, a 100 segundos de intercambio con D2O, aproximadamente 1 amida esta protegida del intercambio en la region aa 2148-2161 en ambos enlaces 4F30 y KM33 (Figura 4). La region que muestra proteccion en la union de KM33 incluye 4 peptidos pepticos que cubren los residuos aa 2075-2095, 2077-2095, 2078-2095 y 2148-2161. Por lo tanto, el epftopo de 4F30 y KM33 se encuentran dentro de las secuencias lineales aa 2075-2095 y 2148-2161 (usando numeracion madura). El mapeo de epftopos de 4F30 y KM33 a FVIII revelo que los dos ligandos tienen epftopos identicos. Si bien anteriormente se ha descrito que K2092-S2094 esta involucrado en el epftopo de KM33 (ver referencias en la tabla 13), la parte restante del epitope no se ha identificado.

Ejemplo 18: Introduccion de un glucano en el bloque FVIII-R2159N que se une a un anticuerpo anti-C1 (KM33) que prolonga la absorcion celular del FVIII y la vida media in vivo

El reemplazo de R2159 por asparagina en la region del dominio C1 2157-SIRST-2161 introduce una secuencia de consenso para la glicosilacion ligada a N (es decir, N-X-S/T, vea la pagina 22) en la posicion 2159 que esta involucrada en el epftope de KM33 (vea el ejemplo 17). FVIII-R2159N se construyo empleando la mutagenesis QuickChange utilizando el ADN de wt FVIII como plantilla (Blood 2009; 133: 3102-3109). FVIII-R2159N y wt FVIII se expresaron como se describe (Plos One 2011;DD(8): e24163. Doi: 10.1371/journal.pone.0024163). La introduccion del glicano unido a N adicional en la cadena ligera de FVIII se confirmo mediante SDS-PAGE, donde se observo una movilidad reducida de la cadena ligera de FVIII. La actividad de FVIII se midio en un ensayo de FVIII cromogenico como se describe en el ejemplo 3. El antigeno FVIII se midio en un ELISA utilizando CLB-EL14 IgG4 (Br J Haematol 2008; 142: 644-652) como anticuerpo de captura, CLB-CAg69 marcado con peroxidasa (Biochem J 1989; 263: 187-94) como un anticuerpo de deteccion y plasma combinado humano de 40 donantes como estandar. La asociacion del anticuerpo KM33 (ver ejemplo 15) a wt FVIII y FVIII-R2159N se evaluo mediante analisis SPR empleando un biosensor BIAcore 3000 (Biacore AB, Uppsala, Suecia). El anticuerpo anti-C2 CLB-EL14 IgG4 se inmovilizo en un chip sensor CM5 a una densidad de 33 fmol/mm2 empleando el metodo de acoplamiento de amina segun las instrucciones del fabricante. Posteriormente, FVIII-R2159N o wt FVIII se unieron a EL14 IgG4 a una densidad de 3 fmol/mm2. KM33 (100 nM) se paso sobre FVIII-R2159N o wt FVIII en un tampon que contema NaCl 150 mM, CaCh 5 mM, Tween 20 al 20% (v/v) y Hepes 20 mM (pH 7,4) a 25°C con caudal de 20 pL/min. La respuesta de union se registro durante 240 segundos de asociacion y se corrigio para la union no espedfica. La Tabla 15 muestra la respuesta de union despues de 235 segundos de asociacion, asf como la actividad y la concentracion de antigeno de FVIII wt y FVIII-R2159N. Los resultados muestran que la introduccion del glicano suprime completamente la union del FVIII al KM33, mientras que la actividad del FVIII no se ve afectada por la introduccion del glicano. Dado que la union de KM33 a FVIII reduce la absorcion celular y prolonga la vida media in vivo, es probable que el FVIII-R2159N que muestra una union a KM33 abolida tambien presente una absorcion celular reducida y una vida media in vivo prolongada.

Tabla 15. Actividad y union de KM33 con wt FVIII y FVIII-R2159N

Ejemplo 19: Prolongacion de la depuracion hepatica de FVIII K2062A-F2093A

La eliminacion hepatica de FVIII-K2092A-F2093F se evaluo en un modelo de fngado perfundido (Thromb Haemost 2010; 104, 243-251). En resumen, los fngados de ratas Sprague Dawley anestesiadas se canularon a traves de la vena porta y la vena cava y se perfundieron con tampon de bicarbonato de Krebs-Henseleit (NaCl 115 mM, NaHCO3 25 mM, KCl 5.9 mM, MgCl 4.2 mM, KH2PO4, 2.5 mM CaCh) a 25 ml/min. Antes de ingresar al fngado, el perfusato fluye a traves de un fiberdialyser (Gambro® Scandidact Hemophan® Fiber Dialyzer 100HG, Secon, Dransfeld, Alemania) que esta saturado con una mezcla de oxfgeno: dioxido de carbono (95:5). FVIII (Haemophilia 2010, 16; 349­ 359) o FVIII-K2092A-F2093A se agregaron al tampon y se mezclaron antes de tomar muestras de la perfusion de recirculacion en puntos de tiempo de 0 a 80 min. El FVIII: C en el perfundido se analizo mediante un ensayo cromogenico como se describe en el ejemplo 3. El T / de FVIII-K2092A-F2093A se prolongo en comparacion con el de FVIII de tipo silvestre (Tabla 16) que demuestra una disminucion de la eliminacion hepatica de FVIII-K2092A-F2093A en comparacion con FVIII sin sustituciones C1.

Tabla 16. Eliminacion de FVIII y FVIII-K2092A- F2093A en fngados de rata perfundidos.

Ejemplo 20: Prolongacion de la vida media in vivo de FVIII-K2092A-F2093A

La farmacocinetica in vivo del mutante K2093A-F2093A se evaluo adicionalmente en ratones deficientes en FvW. El FVIII tipo silvestre (Haemophilia 2010, 16; 349-359) y FVIII-K2092A-F2093A fueron 40K-PEGilados espedficos en un glicano unido a O en el dominio B como se describe en el documento WO09108806. Se administraron FVIII, K2092-F2093A y FVIII PEGilado (40K-PEG-FVIII) y mutante (40K-PEG-K2092A-F2093A) a ratones con deficiencia de FVW a una dosis de 280 UI/kg (n = 3-6 por grupo)) como se describe en el ejemplo 16. Se tomaron muestras de sangre en tres puntos de tiempo de cada raton, es decir, en t = 0.5, 1.25 y 2 h despues de la administracion de FVIII y K2092-F2093A y 4, 7 y 24 horas despues de la administracion de las protemas PEGiladas, y se analizaron para detectar FVIII: C como se describe en el ejemplo 3. Las mutaciones de C1 K2092A-F20963A dieron como resultado aproximadamente una duplicacion de T /ta n to para las protemas FVIII PEGiladas como para las protemas de FVIII no PEGiladas (Tabla 17), lo que confirma que la sustitucion de K2092-F2093 en FVIII dio como resultado una prolongada vida media in vivo.

Tabla 17. Influencia de la mutacion K2092-F2093A en la vida media in vivo.

Ejemplo 18: Respuesta reducida de celulas T de FVIII-R2090A-K2092A-F2093A

Esta bien establecido que la interaccion del FVIII con las celulas presentadoras de antigenos proporciona un paso crucial en la formacion de celulas T CD4+ espedficas para el FVIII que, posteriormente, estimulan la produccion de anticuerpos dirigidos hacia el FVIII. Las respuestas de celulas T CD4+ de esplenocitos de ratones inyectados con FVIII de tipo silvestre (FVIII wt) y FVIII-R2090A-K2092A-F2093A se analizaron de la siguiente manera: los bazos recogidos despues de inyecciones semanales de FVIII se agruparon dentro de los grupos. Los eritrocitos se eliminaron y las celulas CD8+ se agotaron mediante la separacion de perlas magneticas utilizando perlas recubiertas con el anticuerpo CD8 anti-raton Lyt 1.2 (eBioscience). Las celulas CD8- restantes se cultivaron en placas de 96 pozos de fondo redondo durante 72 o 96 horas en medio X-VIVO 15 suplementado con 100 U/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina (todas de BioWhittaker; Walkersville, Md.) y p-mercaptoetanol 55 pM (Sigma-Aldrich, Irvine, Reino Unido) en presencia de una concentracion de FVIII en aumento (0, 0.1, 0.5 o 1 pg/ml) para generar una proliferacion de celulas T espedfica de antfgeno o concanavalina A (1 pg/ml) para generar una proliferacion inespedfica. La proliferacion se analizo mediante la adicion de 1 pCi/pozo de [3H]timidina (ICN Pharmaceuticals, Irvine, California) durante las ultimas 18-20 horas. Los resultados mostrados en la Tabla 18 se expresan en valores por recuento por minuto (CPM) (media ± SD) o como el mdice de estimulacion (SI: CPM de celulas incubadas con antfgeno dividido por CPM de celulas con medio solo). La inyeccion de ratones con FVIII-R2090-K2092A-F2093A condujo a una proliferacion reducida de celulas T CD4+ esplenicas tras la reestimulacion in vitro con FVIII cuando se comparo con el FVIII wt, lo que demuestra que la absorcion reducida de FVIII-R2090A-K2092A-F2093A en antfgeno la presentacion de celulas se traduce en una reduccion de las respuestas de las celulas T CD4+ en ratones.

Tabla 18. Respuestas de celulas T CD4+ de esplenocitos derivados de ratones tratados con 5 inyecciones intravenosas de FVIII WT y FVIII-R2090A-K2092A-F2093A.

Ejemplo 22: Nivel reducido de anticuerpos en ratones que reciben FVIII-R2090A-K2092A-F2093A

La consecuencia de la reduccion de la absorcion de variantes de FVIII por parte de las celulas presentadoras de antigeno en la inmunogenicidad de estas variantes se evaluo ademas en un modelo murino para la formacion de inhibidores en la hemofilia A. FVIII tipo silvestre y FVIII-R2090A-K2092A-F2093A se diluyeron a 10 pg/ml en PBS esteril y una dosis de 100 pl (1 pg) se administro por v^a intravenosa (iv) en 17 ratones KO (n = 8) machos FVIII exon cinco veces por semana. Una semana despues de la ultima inyeccion, se sacrificaron los animales y se recogieron muestras de sangre. La presencia de anticuerpos anti-FVIII en muestras de plasma de ratones tratados con FVIII-KO se determino mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y un ensayo de Bethesda que mide la capacidad del plasma de los ratones para inhibir la actividad del FVIII. Para el ELISA, se inmovilizo FVIII derivado de plasma (5 pg/ml) en un tampon que contema NaHCO350 mM, pH 9.8, en pozos de microtitulacion. Las placas se bloquearon con gelatina al 2% en PBS. Las diluciones de plasma de raton se prepararon en Tris 50 mM, NaCl 150 mM, BSA al 2%, pH 7.4. Se utilizo el anticuerpo monoclonal de raton anti-FVIII CLB-CAg9 como estandar. Se detectaron anticuerpos anti-FVIII con IgG-HRP anti-raton de cabra. La concentracion de anticuerpos anti-FVIII en plasma murino se muestra en unidades arbitrarias (UA), donde 1 UA corresponde a la senal obtenida por 1 pg de CLB-CAg9. El ensayo Bethesda se realizo esencialmente como se describe (Thromb Diath Haemorrh 1975; 34: 612). Los datos se analizaron utilizando la prueba U de Mann-Whitney no parametrica. Los tftulos de anticuerpos observados en el plasma de raton despues de 5 inyecciones semanales de FVIII y FVIII-R2090A-K2092A-F2093A se muestran en la Tabla 19. Los resultados muestran que la infusion de FVIII da como resultado la formacion de anticuerpos dirigidos hacia FVIII. Se observa una reduccion significativa en los tftulos de anticuerpos en ratones tratados con FVIII-R2090A-K2092A-F2093A (p <0.05). Ademas, el tftulo de Bethesda que refleja la presencia de anticuerpos anti-FVIII neutralizantes se redujo significativamente (p <0.05). Estos hallazgos muestran que la absorcion reducida de FVIII-R2090A-K2092A-F2093A en las celulas presentadoras de antfgeno y la respuesta reducida de las celulas T se traduce en una reduccion de los tftulos de inhibidores en un modelo murino para el desarrollo de inhibidores en la hemofilia A. En conjunto, estos resultados muestran que la modificacion espedfica de FVIII que conduce a la reduccion de su endocitosis por las celulas presentadoras de antfgenos, es una forma efectiva de reducir la inmunogenicidad de FVIII in vivo. Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que las variantes de FVIII que muestran una absorcion celular reducida conllevan un riesgo reducido de desarrollo de inhibidores en pacientes con hemofilia A.

Tabla 19. Tftulos de anticuerpos en plasma de ratones tratados con 5 inyecciones intravenosas de FVIII y FVIII-

R2090A-K2092A-F2093A.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Una variante de FVIII recombinante que tiene actividad de FVIII, en el que dicha variante comprende 2-10 sustituciones de residuos de aminoacidos cargados positivamente accesibles desde la superficie en el pie C1 y/o el pie C2 de FVIII, en el que dichos residuos de aminoacidos cargados accesibles desde la superficie estan sustituidos con alanina o glutamina y en el que las sustituciones dan como resultado una disminucion de la absorcion celular de dicha variante de FVIII, y en el que dicha variante comprende una sustitucion R2215 combinada con una sustitucion K2092.

2. Una variante de FVIII recombinante de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que dicha variante de FVIII comprende una sustitucion K2092A.

3. Una variante de FVIII recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en la que dicha variante comprende una sustitucion R2215A.

4. Una variante de FVIII recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicha variante comprende ademas una sustitucion de R2090.

5. Una variante de FVIII recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicha variante comprende ademas una sustitucion de K2065.

6. Una variante de FVIII recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicha variante comprende ademas una sustitucion K2065 combinada con una sustitucion de K2249.

7. Una variante de FVIII recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicha variante tiene una union a LRP disminuida.

8. Una variante de FVIII recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicha variante tiene inmunogenicidad disminuida.

9. Una variante de FVIII recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la variante de FVIII se conjuga con una fraccion que se extiende en la vida media.

10. Una variante de FVIII recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicha variante ademas comprende la mutacion F2093A.

11. Una composicion farmaceutica que comprende una variante de FVIII recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

12. Una variante de FVIII recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 o una composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 11 para uso en el tratamiento de hemofilia.