ES2709823T3 - Anticuerpo contra el complejo de toxina HT-2-anticuerpo de toxina HT-2 - Google Patents

Abstract

Pareja de unión que reconoce un complejo inmunitario entre la toxina HT-2 y el anticuerpo anti-toxina HT-2 y que comprende las CDR1-3 de cadena ligera que comprenden los aminoácidos 24-37, 53-59 y 92-102 de la SEC ID nº: 7, respectivamente y las CDR1-3 de cadena pesada que comprenden los aminoácidos 31-35, 50-65 y 99- 107 de la SEC ID nº: 8, respectivamente.

Description

DESCRIPCION

Anticuerpo contra el complejo de toxina HT-2-anticuerpo de toxina HT-2.

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a inmunodiagnosticos. Especialmente, la invencion se refiere a un inmunoensayo mejorado para detectar la presencia de toxina HT-2. En particular, la invencion se refiere a una pareja de union apta para reconocer un complejo inmunitario entre la toxina HT-2 y el anticuerpo anti-toxina HT-2. La invencion se refiere asimismo a un kit de ensayo que comprende dicha pareja de union para detectar la toxina HT-2. Ademas, la invencion se refiere a un procedimiento y a un inmunoensayo en los que se utiliza dicha pareja de union. Ademas, la invencion se refiere a un polinucleotido que codifica dicha pareja de union y a una celula hospedadora apta para expresar dicha pareja de union.

Antecedentes

Las micotoxinas son metabolitos secundarios toxicos de hongos y uno de los principales contaminantes de los productos agncolas. La FAO ha estimado que las micotoxinas afectan a una cuarta parte de los cultivos alimentarios del mundo. No todos los factores que inducen la produccion de micotoxinas son conocidos y, por lo tanto, dicha produccion no es predecible.

Las micotoxinas son moleculas organicas pequenas resistentes a diversos procedimientos de devastacion. La contaminacion de micotoxinas en alimentos, piensos y materias primas (tales como trigo, cebada, centeno y mafz) es un problema cada vez mayor en todo el mundo. Las micotoxinas tambien son perjudiciales para los microbios utilizados en procesos alimentarios. Se conocen mas de 300 micotoxinas con diferentes modos de accion toxicos para seres humanos y animales.

Las micotoxinas contaminan los alimentos y los piensos desde el campo hasta los productos de consumo. Se deben muestrear enormes cantidades de materia prima antes de aceptar su uso posterior. Las micotoxinas tambien causan enfermedades en los seres humanos y los animales que ingieren alimentos y piensos contaminados con micotoxinas. Las toxinas HT-2 y T-2 son metabolitos secundarios de los hongos Fusanum spp que contaminan cereales ya en los campos. Estas toxinas inhiben la smtesis tanto de ADN como de protemas. Los tricotecenos HT-2 pueden causar, por ejemplo, hemorragia, vomitos, funcion inmunitaria alterada, fiebre y cefalea.

La Union Europea, por ejemplo, ha establecido recomendaciones de lfmites maximos permisibles para aproximadamente diez micotoxinas o derivados de las mismas en materias primas y determinados productos. El muestreo, la preparacion de la muestra y el analisis son de una importancia capital, dado que el hecho de no poder realizar un analisis verificado satisfactorio puede hacer que se acepten envfos inaceptables o que se rechacen innecesariamente cargamentos satisfactorios. Se ha informado de avances en procedimientos cromatograficos, cromatograffa de lfquidos y gases, integrada con espectrometna de masas (Li et al., Revision 2013). Estos procedimientos son sensibles y precisos, aunque es necesaria una preparacion tediosa de la muestra. Ademas, se requieren equipos costosos y personal altamente cualificado que trabaje en entornos de laboratorio.

Se necesitan procedimientos rapidos y sencillos in situ adecuados para un formato de ensayo de alto rendimiento. Los inmunoensayos actuales para determinar la toxina HT-2 no son satisfactorios. Estan basados en anticuerpos y son inmunoensayos competitivos que son sensibles a las moleculas de reaccion cruzada presentes en una muestra. Cuando se utiliza un ensayo competitivo, la presencia de moleculas de reaccion cruzada en la muestra proporciona una sobreestimacion del analito real. Los ensayos ELISA competitivos cuantitativos requieren un procedimiento de varias etapas complejo con varias etapas de lavado.

En el inmunoensayo de tipo sandwich abierto solo se necesita un anticuerpo y la amplificacion de la senal se obtiene por medio de una enzima conjugada (Ueda et al. 1996, Hara et al. 2013). Las etapas de recubrimiento, bloqueo, varias etapas de incubacion y lavado, no obstante, precisan tanto tiempo como los ELISA de tipo sandwich convencionales. Los ensayos basados en un unico anticuerpo son sensibles a otros analitos relacionados debido a la reactividad cruzada.

El ensayo de complejo inmunitario de fagos del que informaron Gonzales-Techera et al. (2007) tiene el potencial para el tipo de ensayo ELISA o la amplificacion por PCR de la senal. Los fagos como tales no son cuerpos de deteccion preferidos en diagnosticos rapidos ni en el uso in situ.

La extincion de la fluorescencia intrmseca de anticuerpos debida a la union de un analito pequeno se ha utilizado en un desarrollo de ensayo no competitivo para las micotoxinas aflatoxina, ocratoxina A y zearalona por Li et al. (2013). El procedimiento utiliza un anticuerpo cuya especificidad determina la especificidad del ensayo. La union de moleculas de reaccion cruzada puede inducir la extincion del agente fluorescente, asf como del analito diana.

Otro enfoque utiliza el fenomeno FRET entre el anticuerpo y un analito pequeno unido (Li et al. 2011). Este procedimiento se puede aplicar a una cantidad limitada de moleculas organicas como analito diana.

Se utilizan ampliamente ensayos de flujo lateral sencillos en diversas areas de aplicacion debido a su facilidad de uso y su rapida respuesta, pero solo permiten resultados cualitativos o semicuantitativos (revision de Dzantiev et al., 2014). Vanrell et al. (2013) han desarrollado tambien un ensayo de flujo lateral de analito pequeno utilizando peptidos anti-complejo inmunitario insertados en el nucleo de estreptavidina/avidina.

El documento EP 1579222B1 divulga un inmunoensayo no competitivo para analizar analitos pequenos. El documento CN 102766208A divulga un anticuerpo monoclonal capaz de identificar toxinas T-2 y HT-2. Tambien se divulga un procedimiento de enzimoinmunoensayo de adsorcion y un kit para detectar toxinas T-2 y HT-2, y la aplicacion del mismo a la deteccion de toxinas HT-2 y T-2.

Yanshen et al. (2014) divulgan la creacion de un anticuerpo monoclonal (mAb) anti-toxina T-2 espedfico que se une a la toxina T-2 con un valor de CR insignificante para la mayor parte de las micotoxinas, incluida la toxina HT-2. Se divulga, utilizando este anticuerpo espedfico, un procedimiento ELISA para la determinacion de la toxina T-2.

Turner et al. (2009) describen micotoxinas, tales como ocratoxinas y aflatoxinas. Turner et al. describen que debido a la diversidad de estructuras de estas toxinas, es imposible utilizar una tecnica estandar para el analisis y/o la deteccion y que los requisitos practicos para el analisis de alta sensibilidad y la necesidad de un laboratorio especializado plantean dificultades para el analisis rutinario. Turner et al. tambien divulgan varias tecnicas analfticas, que ofrecen procedimientos de analisis y, en algunos casos, de deteccion, flexibles y de amplia base. Por lo tanto, todavfa existe la necesidad de un ensayo sencillo, rapido y fiable para someter a ensayo la toxina HT-2, que se pueda utilizar, por ejemplo, para el cribado de grandes cantidades de muestras.

Sumario de la invencion

La presente invencion proporciona nuevos enfoques de diagnosticos rapidos para el cribado de la presencia de micotoxinas en modo de alto rendimiento a partir de abundantes cantidades de muestra.

La presente invencion se refiere a un nuevo reactivo para la deteccion rapida y fiable de micotoxinas HT-2. El reactivo es capaz de reconocer un complejo inmunitario formado entre la toxina HT-2 y el anticuerpo anti-toxina HT-2. Especialmente, la presente invencion se refiere a una pareja de union que comprende las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo, en la que dichas regiones de cadena ligera tienen las secuencias de aminoacidos de los aminoacidos 24-37, 53-59 y 92-102 de la SEC ID n°: 7, respectivamente, y dichas regiones de cadena pesada tienen las secuencias de aminoacidos de los aminoacidos 31-35, 50-65 y 99-107 de la SEC ID n°: 8, respectivamente.

La invencion se refiere asimismo a un kit de ensayo que comprende dicha pareja de union y que comprende ademas otra pareja de union que comprende las CDR1-3 de cadena ligera que comprenden los aminoacidos 24­ 34, 50-56 y 89-97 de la SEC ID n°: 3, respectivamente, y las CDR1-3 de cadena pesada que comprenden los aminoacidos 31-36, 51-66 y 99-105 de la SEC ID n°: 4, respectivamente.

La invencion se refiere asimismo al uso de las parejas de union para detectar toxina HT-2 en una muestra. Las parejas de union son especialmente adecuadas para un inmunoensayo homogeneo no competitivo que se puede utilizar, por ejemplo, para analizar una gran cantidad de muestras.

Ademas, la invencion proporciona un procedimiento para detectar un analito en una muestra, con el que se hace reaccionar la muestra con un par de reactivos que comprende una primera pareja de union que se une espedficamente al analito y una segunda pareja de union que se une espedficamente al complejo del analito y la primera pareja de union, y determinar la union de la segunda pareja de union a dicho complejo, indicando asf la presencia del analito en la muestra, en el que dicho analito es una toxina HT-2 y dicha primera pareja de union comprende las CDR1-3 de cadena ligera que comprenden los aminoacidos 24-34, 50-56 y 89-97 de la SEC ID n°: 3, respectivamente, y las CDR1-3 de cadena pesada que comprenden los aminoacidos 31-36, 51-66 y 99-105 de la SEC ID NO : 4, y dicha segunda pareja de union comprende las CDR1-3 de cadena ligera que comprenden los aminoacidos 24-37, 53-59 y 92-102 de la SEC ID n°: 7, respectivamente, y las CDR1-3 de cadena pesada que comprenden los aminoacidos 31-35, 50-65, y 99-107 de la SEC ID n°: 8, respectivamente. Ademas, la invencion proporciona un polinucleotido que codifica la pareja de union, y una celula hospedadora capaz de expresar la pareja de union. El polinucleotido es ADN.

Ademas, la invencion proporciona la utilizacion de la pareja de union para detectar un analito en una muestra de alimento o de pienso para animales, en una muestra tomada de un ser humano o un animal expuesto a una toxina HT-2, o en una muestra ambiental.

La presente descripcion describe un inmunoensayo sencillo de una etapa para la toxina HT-2.

En las reivindicaciones dependientes se exponen unas formas de realizacion ventajosas de la invencion. Otros objetos, detalles y ventajas de la invencion se pondran mas claramente de manifiesto a partir de los dibujos, la descripcion detallada y los ejemplos siguientes.

Breve descripcion de los dibujos

La figura 1a representa la secuencia de nucleotidos de la cadena ligera de Fab HT2-10 (SEC ID NO: 1). La figura 1b representa la secuencia de nucleotidos de la cadena pesada de Fab HT2-10 (SEC ID NO: 2). La figura 2a representa la secuencia de aminoacidos de la cadena ligera de Fab HT2-10 (SEC ID NO: 3). Las regiones CDR estan subrayadas y marcadas en negrita. Se muestran las tres regiones de complementariedad LCDR1 (aminoacidos 24-34, segun Kabat 24-34), LCDR2 (aminoacidos 50-56, segun Kabat 50-56) y LCDR3 (aminoacidos 89-97, segun Kabat 89-97) de cada cadena de inmunoglobulina.

La figura 2b representa la secuencia de aminoacidos de la cadena pesada de Fab HT2-10 (SEC ID NO: 4). Las regiones CDR estan subrayadas y marcadas en negrita. Se muestran las tres regiones de complementariedad HCDR1 (aminoacidos 31-36, segun Kabat 31-35), HCDR2 (aminoacidos 51-66, segun Kabat 50-65) y HCDR3 (aminoacidos 99-105, segun Kabat 95-102) de cada cadena de inmunoglobulina. La figura 3a representa la secuencia de nucleotidos de la cadena ligera HT2-10 (H5) anti-IC (SEC ID NO: 5). La figura 3b representa la secuencia de nucleotidos de la cadena pesada de HT2-10 (H5) anti-IC (SEC ID NO: 6).

La figura 4a representa la secuencia de aminoacidos de la cadena ligera de HT2-10 (H5) anti-IC (SEC ID NO: 7). Las regiones CDR estan subrayadas y marcadas en negrita. Se muestran las tres regiones de complementariedad LCDR1 (aminoacidos 24-37, segun Kabat 24-34), LCDR2 (aminoacidos 53-59, segun Kabat 50-56) y LCDR3 (aminoacidos 92-102, segun Kabat 89-97) de cada cadena de inmunoglobulina.

La figura 4b representa la secuencia de aminoacidos de la cadena pesada de HT2-10 (H5) anti-IC (SEC ID NO: 8). Las regiones CDR estan subrayadas y marcadas en negrita. Se muestran las tres regiones de complementariedad HCDR1 (aminoacidos 31-35, segun Kabat 31-35), HCDR2 (aminoacidos 50-65, segun Kabat 50-65) y HCDR3 (aminoacidos 99-107, segun Kabat 95-102) de cada cadena de inmunoglobulina. La figura 5 representa la secuencia de nucleotidos de la fusion AP del anticuerpo secundario scFv HT2-10 (H5)-AP anti-IC. Las regiones variables pesadas y ligeras estan marcadas en negrita. La region variable pesada y la region variable ligera estan conectadas con un enlazador. La fosfatasa alcalina se encuentra al final del fragmento de anticuerpo.

La figura 6 representa la secuencia de aminoacidos de la fusion AP del anticuerpo secundario scFv HT2-10 (H5)-AP anti-IC. Las regiones variables pesadas y ligeras estan marcadas en negrita. La region variable pesada y la region variable ligera estan conectadas con un enlazador. La fosfatasa alcalina se encuentra al final del fragmento de anticuerpo, seguida de una etiqueta de histidina.

La figura 7 representa la especificidad del ensayo de toxina HT-2. Se proporcionan los resultados de ensayo del ensayo FRET de la toxina HT-2 en PBS, fondo de toxina T-2, tiempo de ensayo de 5 min. El HT2-10 (H5) anti-complejo inmunitario se selecciono a partir de la biblioteca virgen humana VTT. El anticuerpo primario HT-210 tiene una reactividad cruzada del 100% para las toxinas HT2 y T-2. El anticuerpo secundario anti-IC hace que el ensayo sea espedfico para HT-2.

La figura 8 representa la especificidad del ensayo de toxina HT-2 en un ensayo ELISA simple en PBS, 50 min, fondo de toxina T-2, promedio de 3 repeticiones.

La figura 9 representa el ensayo FRET de toxina HT-2 en PBS, tiempo de ensayo de 10 min, promedio de 6 repeticiones. Se presenta una curva estandar.

La figura 10 representa los resultados del ensayo FRET de toxina HT-2 en metanol al 10%/agua, promedio de 6 repeticiones, tiempo de ensayo de 10 min. Se presenta una curva estandar. Una situacion en la que la toxina HT-2 esta en MeOH al 70%/agua y se diluye 1:7.

La figura 11 representa los resultados del ensayo FRET de toxina HT-2. La reaccion se llevo a cabo en PBS con reactivos de anticuerpos secos. La TR-FRET se midio despues de 10 min. Promedio de 6 repeticiones.

La figura 12 representa el ensayo FRET de la toxina HT-2 de 10 min en metanol al 10%/agua, reactivos de anticuerpos secos, promedio de 6 repeticiones.

La figura 13 representa los resultados del ensayo de la curva estandar ELISA simple de toxina HT-2 en PBS con un promedio de 6 repeticiones, 60 min.

La figura 14 representa un ensayo ELISA simple en MeOH al 10%, 60 min, 6 repeticiones.

La figura 15 representa el ensayo de flujo lateral para toxina HT-2, en el que la muestra sin toxina no presenta fondo (izquierda), se obtiene una banda clara con la muestra de toxina HT-2 (medio) y no se observa ninguna banda con la muestra de toxina T-2 (derecha) .

Listado de secuencias

Secuencias primarias de anticuerpos HT2-10

SEC ID NO: 1: Secuencia de nucleotidos de la cadena ligera de Fab HT2-10

SEC ID NO: 2: Secuencia de nucleotidos de la cadena pesada de Fab HT2-10

SEC ID NO: 3: Secuencia de aminoacidos de la cadena ligera de Fab HT2-10

SEC ID NO: 4: Secuencia de aminoacidos de la cadena pesada de Fab HT2-10

Secuencias de anticuerpos secundarios anti-IC HT2-10 (H5)

SEC ID NO: 5: secuencia de nucleotidos de la cadena ligera de HT2-10 (H5) anti-IC

SEC ID NO: 6: secuencia de nucleotidos de la cadena pesada de HT2-10 (H5) anti-IC

SEC ID NO: 7: secuencia de aminoacidos de la cadena ligera de HT2-10 (H5) anti-IC

SEC ID NO: 8: secuencia de aminoacidos de la cadena pesada de HT2-10 (H5) anti-IC

SEC ID NO: 9: Secuencia de nucleotidos de fusion AP del anticuerpo secundario anti-IC scFv HT2-10 (H5)-AP SEC ID NO: 10: Secuencia de aminoacidos de fusion AP del anticuerpo secundario anti-IC scFv HT2-10 (H5)-AP

Descripcion detallada de la invencion

La HT-2 y la T-2 son micotoxinas, que son metabolitos secundarios de hongos Fusarium spp. La HT-2 es una forma hidrolizada de la toxina T-2. Las toxinas HT-2 y T-2 se encuentran en la avena, la cebada, el trigo, el centeno, el mafz, el arroz y en productos producidos a partir de los mismos, tales como fideos, cerveza y alimentos para bebes basados en cereales.

Las micotoxinas HT-2 y T-2 pertenecen a las micotoxinas tricoteceno, que presentan varios problemas relacionados con la salud: los tricotecenos causan hemorragia, vomitos, alteracion de la funcion inmunitaria, fiebre, cefalea e incluso la muerte.

La presente invencion se refiere a un ensayo rapido y sencillo para el analisis de micotoxinas. Especialmente, la presente invencion se refiere a un inmunoensayo para la deteccion de toxina HT-2. El analisis de una sola etapa rapido y fiable es adecuado para analitos pequenos. El ensayo de tipo sandwich para analitos pequenos proporciona unas mejores especificidad y sensibilidad. Se lleva a cabo el desarrollo de anticuerpos anti-complejo inmunitario.

Algunas ventajas de la presente invencion son una mejora en la especificidad del inmunoensayo de la toxina HT-2 y una simplificacion significativa del procedimiento de ensayo en comparacion con los ensayos actuales. Esto reduce la cantidad de trabajo y por lo tanto el tiempo necesario.

El inmunoensayo de la presente invencion es rapido y puede aplicarse a ensayos de alto rendimiento para un gran numero de muestras. La presente invencion mejora la especificidad del ensayo.

El par de reactivos para el inmunoensayo no competitivo de la invencion comprende una primera pareja de union y una segunda pareja de union. La primera pareja de union se une al analito para formar un complejo entre la primera pareja de union y el analito. La segunda pareja de union se une al complejo formado por la primera pareja de union y el analito. Las parejas de union son generalmente protemas tales como anticuerpos, incluidos fragmentos de anticuerpos que tienen las propiedades de union deseadas.

Una "pareja de union", tal como se usa en la presente memoria, es generalmente una protema o un polipeptido, tal como anticuerpos, incluidos fragmentos de anticuerpos que tienen las propiedades de union deseadas. Un anticuerpo es una molecula de inmunoglobulina y puede pertenecer a cualquiera de las clases IgG, IgM, IgE, IgA o IgD, siendo IgG e IgM las utilizadas mas frecuentemente. Preferentemente, las parejas de union son fragmentos de anticuerpo que comprenden el sitio de union al ligando, tales como fragmentos Fab o scFv. El fragmento conocido como el fragmento Fab (fragmento de union a antigeno) consiste en el dominio variable y constante de una cadena ligera de inmunoglobulina unido covalentemente por un puente disulfuro al dominio variable y el primer dominio constante de una cadena pesada de inmunoglobulina. Fv (dominio variable) significa las regiones variables de la molecula de inmunoglobulina que son responsables de la union al ligando. scFv (Fv monocatenario) significa una molecula en la que los dominios variables de la cadena pesada y ligera de un anticuerpo estan unidos por un peptido formando una sola cadena polipeptfdica sintetizada a partir de una unica molecula de ARNm. Las regiones variables de una cadena pesada y una cadena ligera de inmunoglobulina son responsables conjuntamente de la union al ligando. El ligando es la sustancia a la que se une la pareja de union, con respecto a anticuerpos es un antfgeno o un hapteno.

La primera pareja de union de la presente invencion comprende las CDR1-3 de la cadena ligera que comprenden los aminoacidos 24-34, 50-56 y 89-97 de la SEC ID n°: 3, respectivamente, y las CDR1-3 de la cadena pesada que comprenden los aminoacidos 31-36, 51-66, y 99-105 de la SEC ID n°: 4. La primera pareja de union Fab anti-HT2 (10) tambien se divulga en la presente descripcion con denominaciones tales como anticuerpo primario HT2-10, anticuerpo anti-toxina HT-2, anticuerpo primario HT2-10, Fab HT2-10, Fab anti-toxina HT2, anticuerpo primario Fab HT2-10 y Fab anti-HT2/T2 (10).

La segunda pareja de union de la presente invencion comprende las CDR1-3 de la cadena ligera que comprenden los aminoacidos 24-37, 53-59 y 92-102 de la SEC ID n°: 7, respectivamente, y las CDR1-3 de la cadena pesada que comprenden los aminoacidos 31-35, 50-65, y 99-107 de la SEC ID n°: 8, respectivamente. La seguna pareja de union Fab HT2 (H5) anti-IC tambien se divulga en la presente descripcion con denominaciones tales como HT2-10 (H5) anti-IC, anticuerpo secundario HT2-10 (H5) anti-IC, HT2-10 (H5) anticomplejo inmunitario, anticuerpo secundario anti-IC, HT2-10 (H5) anti-IC, anticuerpo secundario H5, anticuerpo H5 anti-complejo inmunitario y Fab HT2 (H5) anti-IC.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresion "region hipervariable" se refiere a los residuos de aminoacidos de un anticuerpo que son responsables de la union al antfgeno. La region hipervariable comprende residuos de aminoacidos de una "region determinante de la complementariedad" o "CDR" (por ejemplo, los residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) del dominio variable de la cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) del dominio variable de cadena pesada segun Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) y/o aquellos residuos de un "bucle hipervariable". Los residuos de "region estructural" o "FR" son aquellos residuos de dominio variable distintos de los residuos de la region hipervariable tal como se define en la presente memoria. Tal como se utiliza en la presente memoria, las expresiones "dominio variable de cadena pesada", "dominio V^h" y/o "V^h" se usan indistintamente y se refieren a la region hipervariable (que abarca los dominios CDR y estructurales) de la cadena pesada de un anticuerpo; los terminos" dominio variable de cadena ligera", "dominio V^l" y/o "V^l" se usan indistintamente y se refieren a la region hipervariable (que abarca los dominios CDR y estructurales) de la cadena pesada de un anticuerpo.

En la presente invencion, la primera pareja de union, es decir, el anticuerpo primario HT2-10 comprende las CDR1-3 de cadena ligera que comprenden los aminoacidos 24-34, 50-56 y 89-97 de la SEC ID n°: 3, respectivamente, y las CDR1-3 de cadena pesada que comprenden los aminoacidos 31-36, 51-66 y 99-105 de la SEC ID n°: 4, respectivamente.

En la presente invencion, la segunda pareja de union, es decir, el anticuerpo secundario HT2-10 anti-IC comprende las CDR1-3 de cadena ligera que comprenden los aminoacidos 24-37, 53-59 y 92-102 de la SEC ID n°: 7, respectivamente, y CDR1-3 de pesada cadena que comprenden los aminoacidos 31-35, 50-65 y 99-107 de la SEC ID n°: 8, respectivamente.

Las primeras y segundas parejas de union pueden formar fragmentos de anticuerpos Fab, scFv y anticuerpos monoclonales recombinantes.

La biblioteca de parejas de union recombinantes es convenientemente una biblioteca de expresion, que es tipicamente una biblioteca de presentacion. El principio general de las bibliotecas de parejas de union recombinantes de presentacion es que presentan la pareja de union como una protema de fusion en la superficie, que puede ser la superficie de una celula microbiana tal como una celula bacteriana o de levadura, o un bacteriofago. La biblioteca de parejas de union recombinantes de presentacion tambien puede ser una biblioteca de presentacion, en la que se producen complejos estables de protemas emergentes y ARNm en un sistema de expresion in vitro. Las bibliotecas de presentacion en fagos son las utilizadas mas frecuentemente.

La primera pareja de union puede ser un anticuerpo monoclonal convencional o un fragmento del mismo, pero preferentemente es uno recombinante, como lo es la segunda pareja de union.

La pareja de union de la invencion se puede utilizar en un ensayo de tipo sandwich para detectar la toxina HT-2 en una muestra, con el que la muestra se hace reaccionar con un par de reactivos que comprende una primera pareja de union que se une espedficamente a la toxina HT-2 y una segunda pareja de union, que es capaz de reconocer espedficamente un complejo inmunitario entre la toxina HT-2 y el anticuerpo anti-toxina HT-2, y que es la pareja de union de la invencion. La union de la segunda pareja de union al complejo inmunitario entre la primera pareja de union y la toxina HT-2 indica la presencia de toxina HT-2 en la muestra.

Las parejas de union se preparan convenientemente utilizando una biblioteca de parejas de union de presentacion en fagos recombinantes, por ejemplo tal como se describe en el documento WO 2004/046733. Cuando se ha seleccionado la primera pareja de union, se compleja con su ligando y este complejo se utiliza para seleccionar la segunda pareja de union a partir de una biblioteca de anticuerpos recombinantes. La primera pareja de union sin el ligando se utiliza como contraseleccion. La segunda pareja de union solo debera reconocer los complejos, no la primera pareja de union libre ni el antfgeno libre en una medida significativa.

Se puede construir una biblioteca de anticuerpos de presentacion en fagos mediante la clonacion de dominios de inmunoglobulina que codifican los ADNc en un vector de presentacion en fagos apropiado.

El ADN que codifica millones de variantes de fragmentos de anticuerpos se clona por lotes en el vector como parte de la protema de la cubierta del fago. Se pueden obtener bibliotecas grandes que contienen millones de fragmentos de anticuerpos con diferentes especificidades transformando los vectores en bacterias. El cultivo de las bacterias conduce a la expresion de fagos que muestran fragmentos de anticuerpos en su superficie. El gen del anticuerpo presentado se porta en el plasmido fagemido empaquetado dentro del fago, vinculando asf el genotipo con el fenotipo. El enlace ffsico entre la protema presentada y su ADN permite el cribado de un vasto numero de variantes de la protema, cada una asociada a su ADN correspondiente, mediante un procedimiento de seleccion in vitro sencillo denominado cribado.

En su forma mas sencilla, el cribado se lleva a cabo incubando el conjunto de fagos que presentan variantes con el ligando de interes que se ha inmovilizado en un soporte, eliminando por lavado el fago no unido y eluyendo el fago unido espedficamente mediante la rotura de su union al ligando. El fago eluido, a continuacion, se amplifica in vivo.

El proceso se repite varias veces, lo que da como resultado un enriquecimiento gradual del conjunto de fagos a favor de las secuencias con la union mas estrecha. Despues de aproximadamente 3 a 6 rondas de seleccion y amplificacion, los mejores clones se secuencian y se transforman en una celula hospedadora para su expresion posterior. La celula hospedadora puede ser una celula eucariotica o procariotica, por ejemplo una celula de levadura, animal, vegetal o de insecto o una celula bacteriana. Puede ser incluso una celula de mairnfero, que despues de la transformacion produce un anticuerpo monoclonal recombinante. La pareja de union recombinante o al menos parte del mismo tambien puede producirse sinteticamente.

La presente invencion se refiere a nuevas parejas de union espedficas de micotoxinas. Mas particularmente, la invencion se refiere a anticuerpos recombinantes espedficos de micotoxinas. Los beneficios de los anticuerpos recombinantes incluyen un tamano reducido, una inmovilizacion eficaz y una produccion bacteriana barata. Las bibliotecas de anticuerpos permiten una seleccion rapida in vitro de nuevos anticuerpos. Se efectua la utilizacion de antfgenos para provocacion. Las bibliotecas de anticuerpos contienen ~108 clones diferentes.

La seleccion de bibliotecas de anticuerpos recombinantes se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante un procesador automatizado de perlas magneticas. Se pueden utilizar diversos procedimientos de seleccion diferentes para seleccionar anticuerpos espedficos. Se criban clones de anticuerpos recombinantes individuales, por ejemplo, mediante una estacion robotica de alto rendimiento. Se pueden cribar miles de clones por dfa. La caracterizacion preliminar de los anticuerpos candidatos se lleva a cabo, por ejemplo, mediante ELISA y comparacion de secuencias.

Un subconjunto de cepas que contienen anticuerpos se ha depositado segun el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Deposito de Microorganismos para los Fines del Procedimiento de Patentes, 1977, en la VTT Culture Collection, direccion de oficina postal 1000, FI-02044 VTT, FINLANDIA (http://culturecollection.vtt.fi), con los codigos siguientes (numero E):

HT2-10 Fab/pKKtac/RV308; E-143342

Anti-IC HT-10 (H5) Fab/pjExpress401/RV308; E-143343

El par de reactivos que comprende una primera pareja de union que reconoce las toxinas HT-2 y T-2 y una segunda pareja de union que reconoce un complejo inmunitario entre la toxina HT-2 y dicha primera pareja de union posibilita un ensayo de tipo sandwich no competitivo para la toxina HT-2. El sandwich puede detectarse mediante todos los procedimientos estandar de inmunoensayo. Una pareja puede inmovilizarse sobre un soporte, tal como un pocillo de microvaloracion, un sistema p-fluidic, una tira o una perla. Se forma un sandwich en presencia del analito y la otra pareja de union. El sandwich puede detectarse, por ejemplo, utilizando anticuerpos secundarios o marcando por lo menos una de las parejas de union.

La marca puede ser cualquier marca convencional, tal como una marca radioactiva, una enzima, una secuencia de nucleotidos o un compuesto fluorescente. El ensayo puede ser, por ejemplo, ELISA, immunoPCR o FIA. El modo de deteccion puede ser colorimetrico, fluorescente (ya sea FRET o fluorescente de superficie), paramagnetico, electroqmmico o sin marca (por ejemplo, resonancia de plasmon superficial y microbalanza de cristal de cuarzo) Tambien se pueden aplicar otros tipos de ensayos, tales como el ensayo de aglutinacion, el ensayo de flujo lateral, electroforesis capilar, matrices de anticuerpos, micropalancas y sistemas de ensayo de microfluidos.

Una gran ventaja de un par de reactivos que comprende la pareja de union de la presente invencion es que permite un inmunoensayo homogeneo, es decir, un inmunoensayo que se lleva a cabo en solucion. Al evitar las etapas de inmovilizacion y lavado se hace el ensayo extremadamente sencillo. El ensayo homogeneo proporciona una herramienta excelente y conveniente para ensayos in situ, por ejemplo, para su utilizacion por la aduana para inspeccionar materias primas exportadas, bienes, etc. La muestra que se va a analizar puede ser cualquier muestra de alimento, muestra de pienso, muestra de materia prima de alimento, muestra de materia prima de pienso o una muestra procedente de un ser humano o un animal que ha consumido alimentos o piensos contaminados con toxina HT-2. La muestra puede proceder, por ejemplo, de avena, cebada, trigo, centeno, mafz, arroz y productos fabricados a partir de los mismos, tales como fideos, cerveza y alimentos para bebes basados en cereales.

Un inmunoensayo homogeneo preferido es uno basado en transferencia de energfa de resonancia de fluorescencia (FRET). En la FRET, la energfa de un fluoroforo molecular (donante) se excita a un estado de alta energfa y se transfiere a otro fluoroforo (aceptor) mediante un acoplamiento dipolo-dipolo intermolecular. Esto es posible solo si la distancia entre el donante y el aceptor es corta (1-10 nm) y el espectro de fluorescencia del donante y el espectro de absorcion del aceptor se superponen parcialmente. La transferencia de energfa se detecta entonces como un cambio en la fluorescencia. A menudo se utiliza fluorescencia resuelta en el tiempo (Hemmila I. et al., 1988, Clin. Chem. 34: 2320-2322).

La FRET se puede aplicar a la presente invencion marcando las dos parejas de union, que preferentemente son fragmentos de anticuerpos, con fluoroforos que forman un par donante-aceptor de FRET. Cuando las parejas de union y el analito son pequenos, los fluoroforos se acercan mucho y se obtiene una senal de FRET medible. Como alternativa, el inmunoensayo para su uso con la toxina HT-2 puede ser, por ejemplo, un ensayo de tipo sandwich convencional en pocillos de microvaloracion o un ensayo de flujo lateral.

La pareja de union de la invencion puede estar incluida en un kit de ensayo, que puede contener ademas cualesquiera otros reactivos necesarios para el ensayo junto con las instrucciones de uso. Preferentemente, el kit de ensayo contiene tambien una primera pareja de union para su union al analito. De forma mas preferida, dicha pareja de union comprende las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de una cadena ligera y una cadena pesada de un anticuerpo, en el que dichas regiones de cadena ligera tienen las secuencias de aminoacidos de los aminoacidos 24-34, 50-56 y 89-97 de la SEC ID n°: 3, y dichas regiones de cadena pesada tienen las secuencias de aminoacidos de los aminoacidos 31-36, 51-66 y 99-105 de la SEC ID n°: 4. Preferentemente, el kit de ensayo comprende reactivos para llevar a cabo un ensayo homogeneo no competitivo tal como, por ejemplo, reactivos necesarios para un ensayo TR-FRET. El kit puede comprender ademas soluciones de reaccion, tampones, soluciones de lavado y medios de deteccion, tales como marcas y, opcionalmente, un fluorometro.

La realizacion del ensayo puede llevarse a cabo disponiendo los reactivos en el pocillo de una placa de microvaloracion y anadiendo series de dilucion de la muestra. En un modo preferido, por ejemplo para su utilizacion en el campo, los reactivos se encuentran en forma seca en un recipiente.

Se anade la muestra, que disuelve los reactivos, y el resultado se puede leer sin procesos adicionales.

En ese caso, el kit de ensayo puede comprender multiples pares de reactivos ffsicamente separados entre sf, por ejemplo en forma de una micromatriz, por lo que se pueden analizar multiples analitos simultaneamente a partir a partir de una muestra. La presente invencion puede aplicarse a ensayos de alto rendimiento para un gran numero de muestras.

La pareja de union de la invencion comprende tres CDR de una cadena ligera de anticuerpo que tiene las secuencias expuestas en la SEC ID n°: 7, y tres CDR de una cadena pesada de anticuerpo que tiene las secuencias expuestas en la SEC ID n°: 8. Segun una forma de realizacion de la invencion, la pareja de union comprende la region variable completa, es dedr, la porcion de union al ligando de dicha cadena ligera (VL) y cadena pesada (VH). Por lo tanto, puede contener los aminoacidos 1-107 de la SEC ID n°: 7 y los aminoacidos 1-118 de la SEC ID n°: 8. En particular, dicha pareja de union comprende las secuencias de aminoacidos de la SEC ID n°: 7 y la SEC ID n°: 8. Correspondientemente, la primera pareja de union puede comprender la region variable completa de la SEC ID n°: 3 y la SEC ID n°: 4, es decir, los aminoacidos 1-107 de la SEC ID n°: 3 y los aminoacidos 1-116 de la SEC ID n°: 4 . Especialmente comprende las secuencias de aminoacidos de la SEC ID n°: 3 y la SEC ID n°: 4.

El desarrollo de anticuerpos de complejos inmunitarios es diffcil. La presente invencion proporciona por primera vez un anticuerpo de complejo inmunitario para HT-2. La segunda pareja de union que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR) con regiones de cadena ligera que tienen los aminoacidos 24-37, 53-59 y 92-102 de la SEC ID n°: 7 y regiones de cadena pesada que tienen las secuencias de aminoacidos de los aminoacidos 31 -35, 50-65 y 99-107 de la SEC ID n°: 8 de la presente invencion son espedficos para HT-2. La primera pareja de union comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR) que tienen las secuencias de aminoacidos de los aminoacidos 24-34, 50-56 y 89-97 de la SEC ID n°: 3, y dichas regiones de cadena pesada que tienen las secuencias de aminoacidos de aminoacidos 31-36, 51-66 y 99-105 de la SEC ID n°: 4.

La presente invencion se puede aplicar en el diagnostico rapido de la toxina HT-2 en alimentos, piensos y materiales relacionados con alimentos y piensos. Otras areas de aplicacion incluyen, por ejemplo, el diagnostico de la exposicion de seres humanos y animales a la toxina HT-2, o su utilizacion como herramienta de investigacion.

Segun la recomendacion de la UE 2013/165/EU:

En caso de utilizar una tecnica de cribado analftica, el lfmite de deteccion preferentemente no debe ser superior a 25 |jg/kg para la suma de toxinas T-2 y HT-2, de forma mas preferida no superior a 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 jg/kg para la suma de toxinas T-2 y HT-2.

El uso de materias primas requiere etapas de tratamiento previo y los tratamientos pueden variar segun el material.

Los anticuerpos de la presente invencion se pueden utilizar en sensores basados en inmunoensayos. Un experto en la materia puede seleccionar los sensores adecuados para su utilizacion.

Las variaciones o modificaciones secundarias de cualquiera de las secuencias o subsecuencias expuestas en la descripcion y las reivindicaciones se encuentran aun dentro del alcance de la invencion siempre que no afecten a la actividad de union de las protemas.

En la forma de realizacion 1, la presente invencion proporciona una pareja de union que comprende las CDR1-3 de cadena ligera que comprenden los aminoacidos 24-37, 53-59 y 92-102 de la SEC ID n°: 7, respectivamente, y las CDR1-3 de cadena pesada que comprenden los aminoacidos 31-35, 50-65 y 99-107 de la SEC ID n°: 8, respectivamente.

En la forma de realizacion 2 se proporciona la pareja de union segun la forma de realizacion 1, en la que la pareja de union es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo.

En la forma de realizacion 3, se proporciona la pareja de union segun la forma de realizacion 1 o 2, en la que la pareja de union forma un fragmento de anticuerpo Fab, scFv, o un anticuerpo monoclonal recombinante. La pareja de union segun la forma de realizacion 1 o 2 puede comprender un anticuerpo purificado que comprende las CDR1-3 de cadena ligera y las CDR1-3 de cadena pesada.

En la forma de realizacion 4 se proporciona la pareja de union segun cualquiera de las formas de realizacion 1 o 3, en la que la pareja de union comprende secuencias de aminoacidos de la SEC ID n°: 7 y la SEC ID n°: 8.

Segun una forma de realizacion de la descripcion, la pareja de union comprende la region variable completa, es decir, la porcion de union al ligando de dicha cadena ligera (VL) y cadena pesada (VH). Por lo tanto, puede contener los aminoacidos 1-107 de la SEC ID n°: 7 y los aminoacidos 1-118 de la SEC ID n°: 8. En particular, dicha pareja de union comprende las secuencias de aminoacidos de la SEC ID n°: 7 y la SEC ID n°: 8.

En la forma de realizacion 5 se proporciona la pareja de union segun cualquiera de las formas de realizacion 1 a 4, que reconoce espedficamente un complejo inmunitario entre toxina HT-2 y antitoxina HT-2.

En la forma de realizacion 6, se proporciona un kit de ensayo que comprende la pareja de union segun cualquiera de las formas de realizacion 1 a 5.

En la forma de realizacion 7, se proporciona el kit de ensayo segun la forma de realizacion 6, que comprende ademas otra pareja de union que comprende las CDR1-3 de cadena ligera que comprenden los aminoacidos 24-34, 50-56 y 89-97 de la SEC ID n°: 3, respectivamente, y las CDR1-3 de cadena pesada que comprenden los aminoacidos 31-36, 51-66 y 99-105 de la SEC ID n°: 4, respectivamente.

En la forma de realizacion 8 se proporciona el kit de ensayo segun la forma de realizacion 7, en el que dicha otra pareja de union es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo.

En una forma de realizacion, otra pareja de union puede comprender la region variable completa de la SEC ID n°: 3 y la SEC ID n°: 4, es decir, los aminoacidos 1-107 de la SEC ID n°: 3 y los aminoacidos 1-116 de la SEC ID n°: 4. Especialmente, comprende las secuencias de aminoacidos de la SEC ID n°: 3 y la SEC ID n°: 4.

En la forma de realizacion 9 se proporciona el kit de ensayo segun la forma de realizacion 7 a 8, en el que dicha otra pareja de union forma un fragmento de anticuerpo Fab, scFv, o un anticuerpo monoclonal recombinante.

En la forma de realizacion 10 se proporciona el kit de ensayo segun cualquiera de las formas de realizacion 7 a 9, en el que dicha otra pareja de union reconoce espedficamente la toxina HT-2, o tanto la toxina HT-2 como la toxina T-2.

En la forma de realizacion 11 se proporciona el kit de ensayo segun cualquiera de las formas de realizacion 7 a 10, que comprende reactivos para un inmunoensayo homogeneo no competitivo.

En la forma de realizacion 12, se proporciona el kit de ensayo segun cualquiera de las formas de realizacion 7 a 11, que comprende reactivos para el ensayo de transferencia de energfa de resonancia fluorescente resuelta en el tiempo (TR-FRET).

En la forma de realizacion 13 se proporciona un polinucleotido que codifica la pareja de union segun cualquiera de las formas de realizacion 1 a 5.

Un polinucleotido puede ser ADN que comprende ADNc que codifica un polipeptido que comprende la pareja de union segun cualquiera de las formas de realizacion 1 a 5.

En la forma de realizacion 14 se proporciona un polinucleotido que codifica dicha otra pareja de union mencionado en una cualquiera de las formas de realizacion 7 a 12.

En la forma de realizacion 15 se proporciona una celula hospedadora aislada que se ha transformado con un polinucleotido que codifica la pareja de union segun cualquiera de las formas de realizacion 1 a 5 y que es capaz de expresar la pareja de union segun cualquiera de las formas de realizacion 1 a 5.

En la forma de realizacion 16 se proporciona una celula hospedadora aislada que se ha transformado con un polinucleotido segun la forma de realizacion 15.

En la forma de realizacion 17 se proporciona el uso de la pareja de union segun cualquiera de las formas de realizacion 1 a 5 para detectar un analito en una muestra de alimento o pienso para animales.

En la forma de realizacion 18 se proporciona el uso de la pareja de union segun cualquiera de las formas de realizacion 1 a 5 para detectar un analito en una muestra tomada de un ser humano o un animal expuesto a una toxina HT-2.

En la forma de realizacion 19, se proporciona el uso de la pareja de union segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para detectar un analito en una muestra ambiental.

En la forma de realizacion 20 se proporciona un procedimiento para detectar toxina HT-2 en una muestra, que comprende

- hacer reaccionar la muestra con un par de reactivos que comprende una primera pareja de union que se une a una toxina HT-2 o una toxina T-2 presente en la muestra para formar un complejo, y una segunda pareja de union que se une espedficamente a dicho complejo; y

- determinar la union de la segunda pareja de union al complejo, indicando asf la presencia de la toxina HT-2 en la muestra,

en el que dicha pareja de union comprende las CDR1-3 de cadena ligera que comprenden los aminoacidos 24-34, 50-56 y 89-97 de la SEC ID n°: 3, respectivamente, y las CDR1-3 de cadena pesada que comprenden los aminoacidos 31-36, 51- 66, y 99-105 de la SEC ID n°: 4, respectivamente, y

dicha segunda pareja de union comprende las CDR1-3 de cadena ligera que comprenden los aminoacidos 24-37, 53-59 y 92-102 de la SEC ID n°: 7, respectivamente, y las CDR1-3 de cadena pesada que comprenden los aminoacidos 31-35, 50-65 y 99-107 de la SEC ID n°: 8, respectivamente.

En la forma de realizacion 21 se proporciona el procedimiento segun la forma de realizacion 20, en el que la presencia de toxina HT-2 se determina utilizando un inmunoensayo.

En la forma de realizacion 22 se proporciona el procedimiento segun la forma de realizacion 21, en el que el inmunoensayo es un inmunoensayo homogeneo no competitivo.

En la forma de realizacion 23, se proporciona el procedimiento segun la forma de realizacion 22, en el que el inmunoensayo homogeneo no competitivo es un ensayo de transferencia de energfa de resonancia fluorescente resuelta en el tiempo (TR-FRET).

En la forma de realizacion 24, se proporciona el procedimiento segun cualquiera de las formas de realizacion 20 a 23, en el que dicho inmunoensayo se selecciona del grupo que consiste en un radioinmunoensayo, un enzimoinmunoensayo de adsorcion, un ensayo de flujo lateral, un ensayo de aglutinacion de partfculas, un ensayo de tipo sandwich , un ensayo de micromatriz de protemas, un inmunoensayo enzimatico, un inmunoensayo de captura de antfgeno, un inmunoensayo de fluorescencia y un inmunoensayo luminiscente. En la forma de realizacion 25, se proporciona el procedimiento segun cualquiera de las formas de realizacion 21 a 24, en el que dicho inmunoensayo esta en un formato de ensayo directo.

En la forma de realizacion 26 se proporciona el procedimiento segun cualquiera de las formas de realizacion 20 a 25, en el que la muestra se selecciona del grupo de una muestra de alimento, una muestra de pienso, una muestra de materia prima de alimento, una muestra de materia prima de pienso, una muestra ambiental y una muestra procedente de un ser humano o de un animal o de un microbio.

En la forma de realizacion 27 se proporciona el procedimiento segun cualquiera de las formas de realizacion 21 a 26, en el que el inmunoensayo se utiliza en un sensor.

En la forma de realizacion 28 se proporciona el uso de la pareja de union segun cualquiera de las formas de realizacion 1 a 5 en un sensor.

En la forma de realizacion 29 se proporciona un clon de anticuerpo, que comprende un anticuerpo segun la forma de realizacion 2 y esta depositado en la VTT Culture Collection con el numero de acceso VTT E-143343.

En la forma de realizacion 30 se proporciona un clon de anticuerpo, que comprende un anticuerpo segun la forma de realizacion 8 y esta depositado en la VTT Culture Collection con el numero de acceso VTT E-143342.

Ejemplos

Ejemplo 1

Construccion de la biblioteca de genes de anticuerpos.

Los ratones se inmunizaron con el conjugado de toxina HT-2 (Sigma Aldrich) - protema azul (Thermo Fisher Scientific) proporcionado por Verifin (Finnish Institute for Verification of the Chemical Weapons Convention (Instituto Finlandes para la Verificacion de la Convencion de Armas Qmmicas)) en coadyuvante de Freund. El raton que mostro la mejor respuesta inmunitaria se selecciono para ser la fuente para la construccion de la biblioteca de genes de anticuerpos presentada en bacteriofagos.

La homogeneizacion del bazo del raton se realizo utilizando un homogeneizador Kinematica AG Polytron PT 1200 esterilizado. El ARN total se extrajo de bazo homogeneizado utilizando un kit comercial Qiagen RNeasy® Midi/Maxi segun las instrucciones del fabricante. Ademas, la digestion con DNasa en columna se llevo a cabo utilizando un conjunto de DNasa exento de RNasa (Qiagen).

Se sintetizo ADN complementario (ADNc) a partir de la plantilla totRNA utilizando el kit Phusion® RT-PCR (Finnzymes) con cebado oligo-dT.

La cadena ligera y la cadena pesada de IgG de raton se clonaron por separado a partir de la plantilla de ADNc. Tanto los dominios variables ligeros como los pesados se amplificaron mediante PCR utilizando cebadores espedficos para cadenas variables pesadas y ligeras y regiones constantes. Las secuencias del cebador eran tal como se describen en el documento WO2004/046733. Se construyo una biblioteca de presentacion en fagos de fragmentos de anticuerpos (Fab) tal como se describe en el documento WO2004/046733.

La electrotransformacion se realizo con 1 |jg de ADN de biblioteca de fagemidos validada y 200 j l de celulas azules XL-1 (Stratagene). Se agregaron 3 x 1 ml de solucion de SOC a 37°C para recolectar las celulas transformadas de las cubetas de electroporacion y las celulas transformadas se incubaron durante 1 hora a 37°C con rotacion. Se anadieron 7 ml de medio SB a 37°C con 20 jg/ml de carbenicilina y 10 jg/ml de tetraciclina y se incubaron un total de 10 ml de cultivo durante 1 hora a 37°C con agitacion. Se anadio carbenicilina a una concentracion final de 50 jg/ml y se continuo con la incubacion durante 1 hora a 37°C con agitacion. Se anadio 1 ml de fago auxiliar VCS M13 (Stratagene) con un tftulo de 7 x 1011 ufp/ml al cultivo de azul XL1 y se incubo durante 15-30 minutos a 37°C sin agitacion para permitir la infeccion. El cultivo se transfirio a 90 ml de medio SB que inclma 50 mg/ml de carbenicilina y 10 jg/ml de tetraciclina y se incubo durante 2 horas a 37°C con agitacion. Finalmente, se anadio kanamicina (Sigma-Aldrich) a una concentracion final de 70 jg/ml y se incubo a 34°C con agitacion durante la noche.

Los fagos se aislaron mediante centrifugacion de las celulas a 4000 rpm durante 15 minutos a 4°C, seguida de la adicion de 25 ml de PEG6000 al 20% - NaCl 2,5 M enfriado previamente. Los fagos se precipitaron en hielo durante 30 minutos, se centrifugaron (9000 rpm) durante 20 minutos a 4°C y se descarto el sobrenadante. El sedimento que contema los fagos se volvio a suspender en 2 ml de PBS y se centrifugo en dos porciones de 1 ml durante 5 minutos a 14.000 rpm. La precipitacion se repitio anadiendo 250 j l de PEG6000 al 20% - NaCl 2,5 M enfriado previamente/1 ml de sobrenadante, se precipito en hielo durante 30 minutos, se centrifugo a 11000 rpm durante 10 minutos, se descarto el sobrenadante y se volvio a suspender el sedimento en 1 ml de PBS. La biblioteca se agrupo despues de la precipitacion.

Ejemplo 2

Desarrollo de anticuerpos antitoxina HT-2.

Las perlas magneticas (Invitrogen, M-270 Epoxy Dynabeads®) se recubrieron con el conjugado de protema fosfatasa alcalina HT-2 (proporcionado por Verifin) segun las instrucciones del fabricante. Las perlas se incubaron durante 24 h en un dispositivo giratorio (Biosan Biorotator RS-multi). Despues del recubrimiento, las perlas se lavaron cuatro veces con PBS y se volvieron a suspender en 50 j l de PBS. La cantidad de conjugado de protema HT-2 unido se determino mediante el protocolo Micro-BCA (Thermo Scientific, kit de ensayo de protema Pierce® BCA). Las perlas magneticas se bloquearon con solucion en PBS de leche al 1% (pH 7.3) y se incubaron durante una hora en un dispositivo giratorio. Despues de lavar y volver a suspender en PBS, las perlas estaban listas para su uso en la seleccion.

La seleccion de los anticuerpos anti-toxina HT-2 se realizo con un procesador de perlas magneticas (KingFisher, ThermoFisher Scientific) utilizando el siguiente protocolo: se anadieron 200 j l de biblioteca de fagos a las perlas magneticas recubiertas con toxina HT-2-protema AP junto con 20 jg de protema AP soluble y 100 j l de PBS-Tween20 (0,05%). La solucion de perlas se incubo durante la noche en un dispositivo giratorio y despues se lavo 5-6 veces durante 20 segundos con PBS-Tween20 (0.05%). Los fagos unidos se eluyeron con tampon TEA (trietilamina, Sigma-Aldrich), pH 11.75, y se neutralizaron con 6.9 j l de HCl 1 M antes de infectar con 900 j l de celulas azules bacterianas XL-1. Los anticuerpos que presentaron fagos durante la segunda ronda se prepararon tal como se ha mencionado anteriormente. Se realizaron en total cuatro rondas de seleccion con este protocolo, con la excepcion de que la cantidad de perlas se redujo en 1 j l en cada ronda. El ADN que codifica los fragmentos Fab de cada ronda se clono en un vector de produccion pKKTac (tal como se describe en el documento WO2004/046733) y los clones individuales se cultivaron en placas de 96 pocillos y los fragmentos Fab producidos se cribaron con respecto a sus propiedades de union mediante ELISA.

Se recogieron colonias y se transfirieron a medios de crecimiento (100 j l de SB que incluyen 100 jg/ml de ampicilina, 10 jg/ml de tetraciclina y 1% de glucosa/pocillo) de placas LB-amp utilizando el selector de colonias robotico Genetix QPix. Las placas se incubaron durante la noche con agitacion a 37°C y 80% de humedad. Se dispensaron 200 j l de medio de induccion (SB que inclma 100 jg/ml de ampicilina, 10 jg/ml de tetraciclina, el 0.1% de glucosa e IPTG 1 mM) en placas de 96 pocillos y se inocularon 9 j l de cultivo celular reciente en placas de induccion. Las placas se incubaron de nuevo durante la noche con agitacion a 37°C y 80% de humedad. Las placas MaxiSorp (NUNC) se recubrieron con 100 ng de conjugados de toxina HT2-protema azul en 100 j l de tampon de bicarbonato de sodio 0.1 M (pH 9.6) en cada pocillo durante la noche a 4°C. Las placas se bloquearon con tampon de bloqueo Superblock (Thermo Scientific) con Tween 20 al 0.05% (Sigma Life Sciences). Se aplicaron 100 j l de sobrenadantes de cultivo a cada pocillo y se incubaron durante una hora. Despues de 3 x 200 j l de lavado de PBS, se anadieron a cada pocillo 100 j l del anticuerpo de deteccion (fosfatasa alcalina de cabra anti-IgG kappa de raton, Southern Biotech) que estaba diluido 1:2000 en solucion Super Block al 50%. La solucion de deteccion fue 2 mg de PNNP en 1 ml de tampon de dietanolamina-MgCh y despues de 30 minutos de tiempo de incubacion se midio A⁴⁰⁵.

Los mejores clones del cribado primario se sometieron a un ELISA competitivo y se selecciono el Fab HT2-10 para un analisis posterior. El ELlSA competitivo se realizo tal como se ha descrito anteriormente, excepto la preincubacion de 1 hora con toxinas HT-2 y T-2 libres en concentraciones finales de 1 j M, 100 nM, 10 nM, 1 nM y 100 pM, as ^ como 0 pM como muestra de control). El clon HT2-10 mostro una inhibicion similar para ambas toxinas HT-2 y T-2.

La secuencia de nucleotidos de la cadena ligera de Fab HT2-10 se establece como la SEC ID n°: 1 (figura 1a), y la secuencia de aminoacidos de la cadena ligera de Fab HT2-10 se establece como la SEC ID n°: 3. Las CDR LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de la cadena ligera de Fab HT2-10 corresponden a los aminoacidos 24-34, 50-56 y 89­ 97 de la SEC ID n°: 3 (figura 2a).

La secuencia de nucleotidos de la cadena pesada de Fab HT2-10 se establece como SEC ID n°: 2 (figura 1b), y la secuencia de aminoacidos de la cadena pesada de Fab HT2-10 se establece como la SEC ID n°: 4. Las CDR HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de la cadena pesada de Fab HT2-10 corresponden a los aminoacidos 31-36, 51-66 y 99-105 de la SEC ID n°: 4 (figura 2b).

La secuencia de aminoacidos de la cadena pesada de Fab HT2-10 (SEC ID NO: 4) es con una etiqueta de 6 His.

Ejemplo 3

Desarrollo del anticuerpo anti-complejo inmunitario para anticuerpo HT2-10 y toxina HT-2

Los anticuerpos del complejo inmunitario se seleccionaron de la biblioteca de presentacion en fagos scFv humanos vfrgenes VTT (la biblioteca se construyo tal como se describe en el documento WO2004/046733). La biblioteca se presento en la superficie de hiperfagos M13 (Progen).

Se cargaron perlas magneticas modificadas con BcMag IDA (Bioclon, N° de catalogo FF-106, 300 mg) con cobalto (Co+2) y los fragmentos de Fab HT2-10 purificados se inmovilizaron por medio de la etiqueta de seis histidinas de manera orientada sobre las perlas. La inmovilizacion se llevo a cabo segun las instrucciones del fabricante, seguida de oxidacion con H²O². (Hale 1995). La concentracion final fue de 3.7 mg de Fab/30 mg de perlas magneticas.

La seleccion se realizo utilizando un procesador automatico de perlas magneticas (King Fisher). En primer lugar se incubaron las perlas magneticas que conteman el clon Fab 10 anti-toxina HT2 (HT2-10) durante 60 minutos con una solucion 25 j M de toxina HT-2 libre en DMSO-PBST al 1%. Despues de la incubacion, las perlas se lavaron durante 2 segundos y a continuacion se incubaron durante 1 hora con la biblioteca de anticuerpos. Despues de la incubacion, las perlas se lavaron 3 veces con PBST al 0.05% (30 s) y se eluyeron durante 30 minutos con glicina-HCl, pH 1.5. Los fagos eluidos se neutralizaron con 15 j l de Tris 1 M y se usaron para la infeccion en la siguiente ronda de seleccion.

Para las siguientes rondas, los fagos de salida de la primera ronda se diluyeron a una concentracion de 2.5 x 1010 fagos/400 j l de PBST. Se utilizo la misma cantidad de hapteno libre en cada ronda. Los fagos de presentacion multivalente se utilizaron en las primeras tres rondas, mientras que la presentacion monovalente se utilizo en la ultima ronda de seleccion. En la segunda ronda se utilizo un Fab antihapteno soluble para agotar los aglutinantes para la region constante comun de los fragmentos Fab. La tercera y cuarta ronda de seleccion se agotaron con un clon anti-HT2-10 inmovilizado sin toxina HT-2.

Despues de la incubacion, las perlas se lavaron tres veces con tampon PBST (2 min) y se eluyeron 30 min con glicina-HCl, pH 1.5.

Se utilizo un ELISA en fagos para elegir la mejor ronda de seleccion que tuviera la mayor relacion entre los pocillos que contienen el hapteno y los pocillos en blanco. Se analizaron clones de fagos individuales de la mejor ronda de seleccion y se secuenciaron los mejores clones. El mejor HT2-10 (H5) anti-IC se sintetizo como un fragmento Fab (DNA 2.0). El anticuerpo monocatenario (scFv) correspondiente se clono en un vector de produccion que contema la fosfatasa alcalina como pareja de fusion.

Los anticuerpos y la protema de fusion de fosfatasa alcalina contienen seis etiquetas de histidina para propositos de purificacion e inmovilizacion. Se produjeron en bacterias Escherichia coli (anti HT2-10 en el plasmido pKKTac en la cepa RV308 (ATCC 31608), HT2-10 (H5) anti-IC en el plasmido pJExpress (DNA 2.0) en la cepa RV308, fusion HT2-10 (scFv H5)-AP anti-IC en plasmido pJExpress en la cepa RV308 Todos los anticuerpos se purificaron mediante cromatograffa de afinidad metalica segun las instrucciones del fabricante (GE Healthcare).

La secuencia de nucleotidos de la cadena ligera de HT2-10 (H5) anti-IC se establece como la SEC ID n°: 5 (Fig. 3a), y la secuencia de aminoacidos de la cadena ligera de HT2-10 (H5) anti-IC se establece como la SEC ID n°: 7. Las CDR CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de HT2-10 (H5) anti-IC corresponden a los aminoacidos 24-37, 53-59, 92-102 de la SEC ID n°: 7 (Fig. 4a).

La secuencia de nucleotidos de la cadena pesada de HT2-10 (H5) anti-IC se establece como la SEC ID n°: 6 (Fig. 3b), y la secuencia de aminoacidos de la cadena pesada de HT2-10 (H5) anti-IC se establece como la SEC ID n°: 8. Las CDR CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de HT2-10 (H5) anti-IC corresponden a los aminoacidos 31-35, 50-65 y 99-107 de la SEC ID n°: 8 (Fig. 4b).

La secuencia de aminoacidos de la cadena pesada del Fab HT2-10 anti-IC (SEC ID NO: 8) esta con una etiqueta de 6 His.

Ejemplo 4

Ensayo de complejo inmunitario de una unica etapa (FRET)

El par de anticuerpos del complejo inmunitario se marco con diferentes marcadores fluorescentes. El anticuerpo primario HT2-10 se marco con quelato de europio (Kaivogen Loisto615). Se disolvieron 0.1 mg de quelato de europio ITC en DDIW, se mezclaron con 0.3 mg de anticuerpo primario HT2-10 y se hicieron girar durante la noche a 4°C. El tampon de la mezcla de conjugacion se cambio a Tris 50 mM, pH 7.8; NaCl al 0.9% utilizando columnas NAP5 (GE Healthcare). El nivel de conjugacion se determino utilizando patron de europio (Perkin Elmer) segun las instrucciones del fabricante (kit Perkin Elmer Lance®).

El anticuerpo anti-complejo inmunitario H5 se marco con la marca Alexa Fluor 647 utilizando el kit de marcado de protemas Alexa Fluor segun las instrucciones del fabricante (Molecular probes Inc.)

Principio de ensayo

Se anadio 1 |jg de ambos anticuerpos marcados a los pocillos de microvaloracion en un volumen de 10 j l (diluido en PBS) y se pipetearon 80 j l de muestra en los reactivos. La especificidad se determino mediante la adicion de PBS pH 7.4 con toxina HT-2 y concentraciones de toxina T-2 de 0, 5, 10, 50 y 100 ng/ml (figura 7). La linealidad del ensayo se determino anadiendo PBS o metanol al 10%/agua con concentraciones de 0, 0.25, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0 y 10 ng/ml de toxina HT-2 (figuras 9 y 10 para PBS y metanol al 10%/agua, respectivamente). Despues de anadir la muestra, la placa se agito brevemente y se sometio a medicion utilizando un fluorometro Victor V (Perkin Elmer Wallac) despues de 5 minutos (excitacion a 340 nm y deteccion a 665 nm).

Los anticuerpos marcados tambien se pueden secar en la parte inferior de la placa de ensayo. En este formato mas rapido y simple, el usuario solo anade la muestra y somete la placa a medicion despues de unos minutos (figura 11 y 12).

Ejemplo 5

Ensayo ELISA simple (AP)

El Fab anti-HT2/T2 (10) se biotinilo anadiendo 3 x exceso molar de sulfo-NHS-SS-biotina en PBS y se incubo durante 30 minutos con rotacion segun las instrucciones del fabricante (Thermo Scientific Pierce). El Fab anti-HT2/T2 biotinilado (10) se purifico mediante Econopac (Bio-Rad). Las concentraciones de protema se midieron a partir de las fracciones de elucion mediante Nanodrop 1000 (Thermo Scientific) y las fracciones que teman mas de 0.3 mg/ml de protema se agruparon. El exito de la biotinilacion se verifico inmovilizando 500 ng/pocillo del anticuerpo primario biotinilado a la placa de estreptavidina (Kaivogen) y anadiendo 500 ng de conjugado toxina HT-2 AP. Como control, se utilizo Fab anti-HT2/T2 no biotinilado (10). Despues de lavar tres veces con PBS, al sustrato AP se anadieron 2 mg/ml de PNPP (Sigma) en tampon de dietanolamina-MgCh (Reagena) y se detecto la cantidad de HT2-AP unido midiendo el A405.

El vector pJExpress401 con protema de fusion de fosfatasa alcalina se encargo de DNA2.0.

El clon del complejo anti-inmunitario HT2-10 (H5) anti-IC se clono en el vector AP digiriendo el constructo monocatenario completo del vector fagemido (NcoI/NotI) y uniendolo al vector pJExpress401 AP digerido con 2 x NcoI/NotI.

La fusion scFv-AP se produjo en celulas bacterianas en cultivo en frascos a pequena escala y se purifico mediante cromatograffa de afinidad metalica segun las instrucciones del fabricante (GE Healthcare) Principio de ensayo:

El anticuerpo primario biotinilado HT2-10 se inmoviliza en la superficie de las placas de microvaloracion de 96 pocillos recubiertas con estreptavidina (Kaivogen Kaisa96) durante 30 minutos. Se utilizaron 200 j l de 0.2 jg/ml de biotina libre como solucion de bloqueo. La muestra de 50 j l que incluye la toxina HT-2 del analito se mezcla con 50 j l de anticuerpo secundario H5 y se pipetea en el pocillo al mismo tiempo y se incuba durante 1 hora a temperature ambiente con agitacion suave. Despues de tres lavados con 200 j l de tampon PBS, se anade el sustrato para AP (2 mg/ml de PNPP (Sigma) en etanolamina-MgCh (Reagena)) y se mide la absorbancia A405. El ensayo de AP es espedfico para la toxina HT-2 sin reactividad cruzada detectable con la toxina T-2. (Figura 13). El ensayo Elisa simple que utiliza la fusion scFv-AP se puede aplicar tambien a muestras que contienen metanol al l0% (Figura 14).

Ejemplo 6

Ensayo de flujo lateral para la toxina HT-2

El Fab anti-HT2-10 se acoplo a nanopartfculas de oro de 40 nm mediante la adicion de 2.5 jg/ml de Fab a una solucion de oro coloidal (soluciones B^b I) con el 3% de BSA (Sigma). Despues de 20 minutos de incubacion a temperatura ambiente en rotacion, el anticuerpo no unido se separo de los fragmentos Fab conjugados centrifugando durante 15 minutos a 8000 g y lavando el conjugado una vez con agua destilada esteril (MilliQ). Las nanopartfculas de oro que conternan Fab anti-HT2-10 se resuspendieron en BSA al 1% en agua despues de otra centrifugacion durante 15 minutos a 8000 g.

Para la lmea de ensayo, el anticuerpo Fab HT2-10 (H5) anti-IC (1 mg/ml) y para la lmea de control, el anticuerpo de cabra anti-IgG de raton (espedfico de Fab) (Sigma) (1 mg/ml) se pulverizaron sobre una membrana de nitrocelulosa prebloqueada (MDl Membrane Technologies) (300 mm x 20 mm) utilizando los instrumentos ZX1000 y Air Jet Quanti (BioDot).

Las membranas pulverizadas se secaron durante la noche a 24°C y se montaron en una tarjeta de apoyo con una mecha de muestra (300 mm x 27 mm, Whatman CF5) que se superporna 1 mm. Las tiras de ensayo de 4.5 mm se cortaron utilizando un cortador de guillotina CM4000 (BioDot).

El anticuerpo primario Fab anti-HT2-10 marcado con oro coloidal se mezclo en un pocillo de microvaloracion no tratado con el tampon de procesamiento y la muestra. La tira de LFA se introdujo en un pocillo de microvaloracion y el resultado se leyo despues de 10 minutos. El color rojo en las lrneas de ensayo y de control indica una muestra positiva. La lmea de control roja solo indica una muestra negativa y que la tira de ensayo es valida. Estos resultados muestran que el ALF es espedfico para la toxina HT-2 y no reacciona de forma cruzada con la toxina T-2 (Figura 15).

Referencias

Dzantiev, B.B., Byzova, N.A., Urusov, A.E. y Zherdev, A.V. (2014) Trends in Analytical Chemistry 55: 81-93. Gonzales-Techera, A., Vanrell, L., Hammock, B.D. y Gonzales-Sapienza, G. (2007) Anal. Chem 79: 7799­ 7806.

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Hara et al. (2013) Analytica Chimica Acta 793: 107-113.

Hemmila I. et al, (1988), Clin. Chem. 34: 2320-2322.

Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.

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Ueda et al. (1996) Vanrell, L., Gonzales-Techera, A., Hammock, B.D. y Gonzalez-Sapienza, G. (2013) Analytical Chemistry 85: 1177-1182.

Recomendacion de la Comision de 27 de marzo de 2013 sobre la presencia de toxina T-2 y HT-2 en cereales

Claims (27)

REIVINDICACIONES

1. Pareja de union que reconoce un complejo inmunitario entre la toxina HT-2 y el anticuerpo anti-toxina HT-2 y que comprende las CDR1-3 de cadena ligera que comprenden los aminoacidos 24-37, 53-59 y 92-102 de la SEC ID n°: 7, respectivamente y las CDR1-3 de cadena pesada que comprenden los aminoacidos 31-35, 50-65 y 99­ 107 de la ^s E^c ID n°: 8, respectivamente.

2. Pareja de union segun la reivindicacion 1, en la que la pareja de union es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo.

3. Pareja de union segun la reivindicacion 1 o 2, en la que la pareja de union forma un fragmento de anticuerpo Fab, scFv, o un anticuerpo monoclonal recombinante.

4. Pareja de union segun cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3, en la que la pareja de union comprende las secuencias de aminoacidos de la SEC ID n°: 7 y la SEC ID n°: 8.

5. Kit de ensayo que comprende la pareja de union segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Kit de ensayo segun la reivindicacion 5, que comprende ademas otra pareja de union que comprende las CDR1-3 de cadena ligera que comprenden los aminoacidos 24-34, 50-56 y 89-97 de la SEC ID n°: 3, respectivamente, y las CDR1-3 de cadena pesada que comprenden los aminoacidos 31-36, 51-66 y 99-105 de la SEC ID n°: 4, respectivamente.

7. Kit de ensayo segun la reivindicacion 6, en el que dicha otra pareja de union es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo.

8. Kit de ensayo segun las reivindicaciones 6 a 7, en el que dicha otra pareja de union forma un fragmento de anticuerpo Fab, scFv, o un anticuerpo monoclonal recombinante.

9. Kit de ensayo segun cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que dicha otra pareja de union reconoce espedficamente la toxina HT-2, o tanto la toxina HT-2 como la toxina T-2.

10. Kit de ensayo segun cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, que comprende unos reactivos para un inmunoensayo homogeneo no competitivo.

11. Kit de ensayo segun cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, que comprende unos reactivos para el ensayo de transferencia de energfa de resonancia fluorescente resuelta en el tiempo (TR-FRET).

12. Polinucleotido que codifica la pareja de union segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

13. Celula hospedadora aislada que ha sido transformada con un polinucleotido que codifica la pareja de union segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y que resulta apta para expresar la pareja de union segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

14. Utilizacion de la pareja de union segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para detectar un analito en una muestra de alimento o pienso para animales.

15. Utilizacion de la pareja de union segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para detectar un analito en una muestra tomada de un ser humano o un animal expuesto a una toxina HT-2.

16. Utilizacion de la pareja de union segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para detectar un analito en una muestra ambiental.

17. Procedimiento para detectar la toxina HT-2 en una muestra, que comprende

- hacer reaccionar la muestra con un par de reactivos que comprende una primera pareja de union que se une a una toxina HT-2 o una toxina T-2 en la muestra para formar un complejo, y una segunda pareja de union que se une espedficamente a dicho complejo; y

- determinar la union de la segunda pareja de union al complejo, indicando asf la presencia de la toxina HT-2 en la muestra,

en el que dicha primera pareja de union comprende las CDR1-3 de cadena ligera que comprenden los aminoacidos 24-34, 50-56 y 89-97 de la SEC ID n°: 3, respectivamente, y las CDR1-3 de cadena pesada que comprenden los aminoacidos 31-36, 51-66 y 99-105 de la s Ec ID n°: 4, respectivamente, y

dicha segunda pareja de union comprende las CDR1-3 de cadena ligera que comprenden los aminoacidos 24­ 37, 53-59 y 92-102 de la SEC ID n°: 7, respectivamente, y las CDR1-3 de cadena pesada que comprenden los aminoacidos 31-35, 50-65 y 99-107 de la ^s E^c ID n°: 8, respectivamente.

18. Procedimiento segun la reivindicacion 17, en el que la presencia de la toxina HT-2 se determina utilizando un inmunoensayo.

19. Procedimiento segun la reivindicacion 18, en el que el inmunoensayo es un inmunoensayo homogeneo no competitivo.

20. Procedimiento segun la reivindicacion 19, en el que el inmunoensayo homogeneo no competitivo es un ensayo de transferencia de energfa de resonancia fluorescente resuelta en el tiempo (TR-FRET).

21. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, en el que dicho inmunoensayo se selecciona de entre el grupo que consiste en un radioinmunoensayo, un ensayo enzimoinmunoensayo de adsorcion, un ensayo de flujo lateral, un ensayo de aglutinacion de partfculas, un ensayo de tipo sandwich, un ensayo de micromatriz de protemas, un inmunoensayo enzimatico, un inmunoensayo de captura de antfgeno, un inmunoensayo de fluorescencia y un inmunoensayo de luminiscencia.

22. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, en el que dicho inmunoensayo esta en un formato de ensayo directo.

23. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22, en el que la muestra se selecciona de entre el grupo de una muestra de alimento, una muestra de pienso, una muestra de materia prima de alimentos, una muestra de materia prima de piensos, una muestra ambiental y una muestra procedente de un ser humano o de un animal o de un microbio.

24. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en el que el inmunoensayo se utiliza en un sensor.

25. Utilizacion de la pareja de union segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en un sensor.

26. Anticuerpo segun la reivindicacion 2 producido en un clon de bacteria Escherichia coli depositado en la VTT Culture Collection con el numero de acceso VTT E-143343.

27. Kit de ensayo segun la reivindicacion 7, en el que dicho anticuerpo se produce en un clon de bacteria Escherichia coli depositado en la VTT Culture Collection con el numero de acceso VTT E-143342.