ES2709549T3 - Métodos y composiciones farmacéuticas para el tratamiento de carcinomas hepatocelulares - Google Patents

Métodos y composiciones farmacéuticas para el tratamiento de carcinomas hepatocelulares Download PDF

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Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite de Versailles Saint Quentin en Yvelines
Universite Paris Diderot Paris 7
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Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite de Versailles Saint Quentin en Yvelines
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Abstract

Un agonista de OX1R para uso en el tratamiento del carcinoma hepatocelular en un sujeto que lo necesite.

Description

DESCRIPCION
Metodos y composiciones farmaceuticas para el tratamiento de carcinomas hepatocelulares
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a metodos y composiciones farmaceuticas para el tratamiento de carcinomas hepatocelulares.
Antecedentes de la invencion
El carcinoma hepatocelular (CHC) es el quinto cancer mas comun en todo el mundo y la tercera causa mas comun de muertes relacionadas con el cancer. La enfermedad a menudo se diagnostica tarde en el curso de la manifestacion clmica. Como resultado, solo el 10-15% de los pacientes son candidatos para cirugfa curativa. Para la mayona de los pacientes con CHC, las quimioterapias sistemicas o las terapias de soporte son las opciones de tratamiento principales. Sin embargo, la mayona de los agentes quimioterapeuticos muestran una eficacia limitada y no han podido mejorar la supervivencia del paciente. El curso clmico adverso de la mayona de los pacientes con CHC subraya la gran necesidad de quimioterapias mas eficaces y el desarrollo de estrategias de focalizacion.
Las orexinas (hipocretinas) comprenden dos neuropeptidos producidos en el hipotalamo: la orexina A (OX-A) (un peptido de 33 aminoacidos) y la orexina B (OX-B) (un peptido de 28 aminoacidos) (Sakurai T. et al., Cell, 1998, 92, 573-585). Se encontro que las orexinas estimulan el consumo de alimentos en ratas, que sugiere un papel fisiologico para estos peptidos como mediadores en el mecanismo de retroalimentacion central que regula el comportamiento alimentario. Las orexinas regulan los estados de sueno y vigilia que abren enfoques terapeuticos potencialmente novedosos para los pacientes narcolepticos o insomnes. Tambien se ha indicado que las orexinas desempenan un papel en la excitacion, la recompensa, el aprendizaje y la memoria. Se han clonado y caracterizado dos receptores de orexina en mairnferos. Pertenecen a la superfamilia de receptores acoplados a protema G (receptor transmembrana de 7 dominios) (Sakurai T. et al., Cell, 1998, 92, 573-585): el receptor de orexina-1 (OX1R o HCTRl) es mas selectivo para OX-A que para OX-B y el receptor de orexina-2 (OX2R o HCTR2) se une a OX-A asf como a OX-B. Un estudio reciente muestra que la activacion de OX1R por orexina puede promover una apoptosis in vitro e in vivo fuerte en celulas cancerosas de colon, incluso cuando son resistentes al farmaco mas utilizado en quimioterapia de cancer de colon (Voisin T, El Firar A, Fasseu M, Rouyer-Fessard C, Descatoire V, Walker F, Paradis V, Bedossa P, Henin D, Lehy T, Laburthe M. Aberrant expression of OX1 receptors for orexins in colon cancers and liver metastases: an openable gate to apoptosis. Cancer Res. 2011 May 1;71(9):3341-51).
Sorprendentemente, todos los tumores colorrectales primarios, independientemente de su localizacion y de los estadios de Dukes expresaron OX1R, mientras que los colonocitos adyacentes normales asf como los tejidos control normales fueron negativos. Por lo tanto, este estudio apoya que OX1R es un talon de Aquiles de los canceres de colon (incluso con quimiorresistencia) y sugiere que los agonistas de OX1R podnan ser nuevos candidatos para la terapia de cancer de colon.
Compendio de la invencion
La presente invencion se refiere a metodos y composiciones farmaceuticas para el tratamiento de carcinomas hepatocelulares. En particular, la presente invencion se define mediante las reivindicaciones.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion se refiere a un agonista de OX1R para uso en el tratamiento del carcinoma hepatocelular en un sujeto que lo necesite.
Como se utiliza en la presente memoria, el termino "OX1R" tiene su significado general en la tecnica y se refiere al receptor transmembrana de 7 dominios OX1R para orexinas. Segun la invencion, OX1R promueve la apoptosis en la lmea celular de cancer prancreatico humano a traves de un mecanismo que no esta relacionado con la activacion de la fosfolipasa C mediada por Gq ni con el calcio celular transitorio. Las orexinas inducen la fosforilacion de tirosina de 2 motivos basados en tirosina en OX1R, ITIM e ITSM, que da como resultado el reclutamiento de la fosfotirosina fosfatasa SHP-2, cuya activacion es responsable de la apoptosis mitocondrial (Voisin T, El Firar A, Rouyer-Fessard C, Gratio V, Laburthe M. A hallmark of immunoreceptor, the tyrosine-based inhibitory motif ITIM, is present in the G protein-coupled receptor OX1R for orexins and drives apoptosis: a novel mechanism. FASEB J. 2008 Jun;22(6): 1993-2002.;El Firar A, Voisin T, Rouyer-Fessard C, Ostuni MA, Couvineau A, Laburthe M. Discovery of a functional immunoreceptor tyrosine-based switch motif in a 7-transmembrane-spanning receptor: role in the orexin receptor OX1R-driven apoptosis. FASEB J. 2009 Dec;23(12):4069-80. doi: 10.1096/fj.09-131367. Epub 2009 Aug 6.). Una secuencia de aminoacidos ilustrativa de OX1R se muestra como SEQ ID NO:1.
Receptor de orexina 1 OX1R (SEQ ID NO:1)
1 mepsatpgaq mgvppgsrep spvppdyede flrylwrdyl ypkqyewvli aayvavfwa
61 lvgntlvcla vwrnhhmrtv tnyflvnlsl advlvtaicl pasllvdite swlfghalck
121 vipylqavsv svavltlsfi aldrwyaich pllfkstarr argsilgiwa vslaimvpqa
181 avmecssvlp elanrtrlfs vcderwaddl ypkiyhscff ivtylaplgl mamayfqifr
241 klwgrqipgt tsalvmwkr psdqlgdleq glsgepqprg raflaevkqm rarrktakml
301 mwllvfalc ylpisvlnvl krvfgmfrqa sdreavyacf tfshwlvyan saanpiiynf
361 lsgkfreqfk aafscclpgl gpcgslkaps prssashksl slqsrcsisk isehwltsv
421 ttvlp
En consecuencia, como se utiliza en la presente memoria, el termino "agonista de OX1R" se refiere a cualquier compuesto que sea capaz de unirse a OX1R y promueva la actividad de OX1R que consiste en la activacion de vias de transduccion de senales que involucran el reclutamiento de SHP-2 y la induction de la apoptosis de la celula, independientemente de la liberation transitoria de calcio.
En alguna realization, el agonista de OX1R es un anticuerpo de OX1R o una portion del mismo.
Como se utiliza en la presente memoria, "anticuerpo" incluye tanto anticuerpos naturales como no naturales. Espetificamente, "anticuerpo" incluye anticuerpos policlonales y monoclonales, y fragmentos monovalentes y divalentes de los mismos. Ademas, "anticuerpo" incluye anticuerpos quimericos, anticuerpos totalmente sinteticos, anticuerpos de cadena unica y fragmentos de los mismos. El anticuerpo puede ser un anticuerpo humano o no humano. Un anticuerpo no humano puede ser humanizado mediante metodos recombinantes para reducir su inmunogenicidad en el hombre.
En algunas realizaciones de los anticuerpos o porciones de los mismos descritos en la presente memoria, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones de los anticuerpos o porciones de los mismos descritos en la presente memoria, el anticuerpo es un anticuerpo policlonal. En algunas realizaciones de los anticuerpos o porciones de los mismos descritos en la presente memoria, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. En algunas realizaciones de los anticuerpos o porciones de los mismos descritos en la presente memoria, el anticuerpo es un anticuerpo quimerico. En algunas realizaciones de los anticuerpos o porciones de los mismos descritos en la presente memoria, la porcion del anticuerpo comprende una cadena ligera del anticuerpo. En algunas realizaciones de los anticuerpos o porciones de los mismos descritos en la presente memoria, la porcion del anticuerpo comprende una cadena pesada del anticuerpo. En algunas realizaciones de los anticuerpos o porciones de los mismos descritos en la presente memoria, la porcion del anticuerpo comprende una porcion Fab del anticuerpo. En algunas realizaciones de los anticuerpos o porciones de los mismos descritos en la presente memoria, la porcion del anticuerpo comprende una porcion F(ab')2 del anticuerpo. En algunas realizaciones de los anticuerpos o porciones de los mismos descritos en la presente memoria, la porcion del anticuerpo comprende una porcion Fc del anticuerpo. En algunas realizaciones de los anticuerpos o porciones de los mismos descritos en la presente memoria, la porcion del anticuerpo comprende una porcion Fv del anticuerpo. En algunas realizaciones de los anticuerpos o porciones de los mismos descritos en la presente memoria, la porcion del anticuerpo comprende un dominio variable del anticuerpo. En algunas realizaciones de los anticuerpos o porciones de los mismos descritos en la presente memoria, la porcion del anticuerpo comprende uno o mas dominios CDR del anticuerpo.
Los anticuerpos se preparan segun la metodologia convencional. Los anticuerpos monoclonales se pueden generar utilizando el metodo de Kohler y Milstein (Nature, 256:495, 1975). Para preparar anticuerpos monoclonales utiles en la invention, se inmuniza un raton u otro animal hospedador apropiado a intervalos adecuados (p. ej., dos veces a la semana, semanalmente, dos veces al mes o mensualmente) con formas antigenicas de OX1R. Al animal se le puede administrar un "refuerzo" final de antigeno en el plazo de una semana desde el sacrificio. A menudo es deseable utilizar un adyuvante inmunologico durante la inmunizacion. Los adyuvantes inmunologicos adecuados incluyen adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, alumbre, adyuvante de Ribi, Titermax de Hunter, adyuvantes de saponina tales como QS21 o Quil A, u oligonucleotidos inmunoestimulantes que contienen CpG. Otros adyuvantes adecuados son bien conocidos en el campo. Los animales se pueden inmunizar por via subcutanea, intraperitoneal, intramuscular, intravenosa, intranasal u otras. Un animal dado se puede inmunizar con multiples formas del antigeno por multiples vias. Brevemente, el OX1R recombinante se puede proporcionar mediante expresion con lmeas celulares recombinantes. En particular, OX1R se puede proporcionar en forma de celulas humanas que expresan OX1R en su superficie. Despues del regimen de inmunizacion, los linfocitos se aislan del bazo, ganglio linfatico u otro organo del animal y se fusionan con una lmea celular de mieloma adecuada utilizando un agente tal como el polietilenglicol para formar un hidridoma. Despues de la fusion, las celulas se colocan en medios permisivos para el crecimiento de hibridomas pero no para los de fusion utilizando metodos estandar, como se describe (Coding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice: Production and Application of Monoclonal Antibodies in Cell Biology, Biochemistry and Immunology, 3rd edition, Academic Press, New York, 1996). Despues del cultivo de los hibridomas, se analizan los sobrenadantes celulares para determinar la presencia de anticuerpos de la especificidad deseada, es decir, que se unen selectivamente al antigeno. Las tecnicas analdicas adecuadas incluyen ELISA, citometria de flujo, inmunoprecipitacion y transferencia Western. Otras tecnicas de cribado son bien conocidas en el campo. Las tecnicas preferidas son aquellas que confirman la union de anticuerpos a antigenos plegados de forma nativa e intactos conformacionalmente, tal como el ELISA no desnaturalizante, la citometna de flujo y la inmunoprecipitacion.
Significativamente, como es bien sabido en la tecnica, solo una pequena porcion de una molecula de anticuerpo, el paratopo, esta involucrada en la union del anticuerpo a su epftopo (vease, en general, Clark, W. R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology Wiley & Sons, Inc., New York; Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford). Las regiones Fc' y Fc, por ejemplo, son efectores de la cascada del complemento pero no estan involucradas en la union del antigeno. Un anticuerpo a partir del cual la region pFc' se ha escindido enzimaticamente, o que se ha producido sin la region pFc', designada como un fragmento F (ab')2, retiene ambos de los sitios de union al antfgeno de un anticuerpo intacto. De manera similar, un anticuerpo del que la region Fc se ha escindido enzimaticamente, o que se ha producido sin la region Fc, designada como fragmento Fab, retiene uno de los sitios de union al antfgeno de una molecula de anticuerpo intacta. A continuacion, los fragmentos Fab consisten en una cadena ligera de anticuerpo unida covalentemente y una porcion de la cadena pesada del anticuerpo conocida como Fd. Los fragmentos Fd son el principal determinante de especificidad del anticuerpo (un solo fragmento Fd se puede asociar con hasta diez cadenas ligeras diferentes sin alterar la especificidad del anticuerpo) y los fragmentos Fd conservan la capacidad de union al epftopo de forma aislada.
Dentro de la porcion de union a antfgeno de un anticuerpo, como es bien conocido en la tecnica, existen regiones determinantes de complementariedad (CDR, por sus siglas en ingles), que interaction directamente con el epftopo del antfgeno, y regiones marco (FR, por sus siglas en ingles), que mantienen la estructura terciaria del paratopo (vease, en general, Clark, 1986; Roitt, 1991). Tanto en el fragmento Fd de la cadena pesada como en la cadena ligera de las inmunoglobulinas IgG, existen cuatro regiones marco (FR1 a FR4) separadas respectivamente por tres regiones determinantes de complementariedad (CDR1 a CDRS). Las CDR, y en particular las regiones CDRS, y mas particularmente las CDRS de cadena pesada, son en gran parte responsables de la especificidad del anticuerpo.
Ahora esta bien establecido en la tecnica que las regiones no CDR de un anticuerpo de mamfero se pueden reemplazar con regiones similares de anticuerpos espedficos o heteroespedficos mientras se mantiene la especificidad epitopica del anticuerpo original. Esto se manifiesta mas claramente en el desarrollo y uso de anticuerpos "humanizados" en los que las CDR no humanas se unen covalentemente a las regiones FR y/o Fc/pFc' humanas para producir un anticuerpo funcional.
Esta invencion proporciona en deltas realizaciones composiciones y metodos que incluyen formas humanizadas de anticuerpos. Como se utiliza en la presente memoria, "humanizado" describe anticuerpos en donde algunos, la mayona o todos los aminoacidos fuera de las regiones CDR se reemplazan con aminoacidos correspondientes obtenidos a partir de moleculas de inmunoglobulina humana. Los metodos de humanizacion incluyen, pero no se limitan a, los descritos en las Patentes de EE.UU. n° 4.816.567, 5.225.539, 5.585.089, 5.693.761, 5.693.762 y 5.859.205. Las patentes de EE.UU. anteriores n° 5.585.089 y 5.693.761, y el documento WO90/07861 tambien proponen cuatro criterios posibles que se pueden utilizar en el diseno de anticuerpos humanizados. La primera propuesta fue para un aceptor, utilizar un marco de una inmunoglobulina humana particular que sea inusualmente homologa a la inmunoglobulina del donante para ser humanizado, o utilizar un marco de consenso de muchos anticuerpos humanos. La segunda propuesta fue que si un aminoacido en el marco de la inmunoglobulina humana es inusual y el aminoacido donante en esa posicion es tfpico de las secuencias humanas, entonces se puede seleccionar el aminoacido donante en lugar del aceptor. La tercera propuesta fue que en las posiciones inmediatamente adyacentes a las 3 CDR en la cadena de inmunoglobulina humanizada, se puede seleccionar el aminoacido donante en lugar del aminoacido aceptor. La cuarta propuesta fue utilizar el aminoacido donante que reside en las posiciones marco en las que se predice que el aminoacido tendra un atomo de cadena lateral dentro de 3A de las CDR en un modelo tridimensional del anticuerpo y se predice que sera capaz de interactuar con las CDR. Los metodos anteriores son meramente ilustrativos de algunos de los metodos que un experto en la tecnica podna emplear para preparar anticuerpos humanizados. Un experto en la tecnica estara familiarizado con otros metodos para la humanizacion de anticuerpos.
En algunas realizaciones de las formas humanizadas de los anticuerpos, algunos, la mayona o todos los aminoacidos fuera de las regiones CDR se han reemplazado con aminoacidos de moleculas de inmunoglobulina humana pero donde algunos, la mayona o todos los aminoacidos dentro de una o mas regiones CDR estan sin alterar. Se permiten pequenas adiciones, deleciones, inserciones, sustituciones o modificaciones de aminoacidos, siempre y cuando no detengan la capacidad del anticuerpo para unirse a un antfgeno dado. Las moleculas de inmunoglobulina humana adecuadas incluinan las moleculas IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgM. Un anticuerpo "humanizado" conserva una especificidad antigenica similar al anticuerpo original. Sin embargo, utilizando ciertos metodos de humanizacion, la afinidad y/o especificidad de union del anticuerpo se puede incrementar utilizando metodos de "evolucion dirigida", como lo describen Wu et al., /.Mol. Biol. 294:151, 1999.
Los anticuerpos monoclonales completamente humanos tambien se pueden preparar inmunizando ratones transgenicos para grandes porciones de loci de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina humana. Vease, p. ej., las patentes de EE.UU. n° 5.591.669, 5.598.369, 5.545.806, 5.545.807, 6.150.584, y las referencias citadas en los mismos. Estos animales se han modificado geneticamente de modo que hay una eliminacion funcional en la produccion de anticuerpos endogenos (p. ej., murinos). Los animales se modifican adicionalmente para contener todo o una parte del locus del gen de inmunoglobulina de lmea germinal humana de modo que la inmunizacion de estos animales dara como resultado la produccion de anticuerpos completamente humanos contra el antigeno de interes. Despues de la inmunizacion de estos ratones (p. ej., XenoMouse (Abgenix), ratones HuMAb (Medarex/GenPharm)), se pueden preparar anticuerpos monoclonales segun la tecnologfa de hibridoma estandar. Estos anticuerpos monoclonales tendran secuencias de aminoacidos de inmunoglobulina humana y, por lo tanto, no provocaran respuestas de anticuerpos anti-raton humanos (KAMA) cuando se administren a humanos.
Tambien existen metodos in vitro para producir anticuerpos humanos. Estos incluyen la tecnologfa de visualizacion de fagos (patentes de EE.UU. n° 5.565.332 y 5.573.905) y la estimulacion in vitro de celulas B humanas (patentes de EE.UU. n° 5.229.275 y 5.567.610).
Por lo tanto, como sera evidente para un experto en la tecnica, la presente invencion tambien proporciona los fragmentos F(ab') 2 Fab, Fv y Fd; anticuerpos quimericos en los que las regiones Fc y/o FR y/o CDR1 y/o CDR2 y/o CDR3 de cadena ligera se han reemplazado por secuencias humanas o no humanas homologas; anticuerpos quimericos del fragmento F(ab')2 en los que las regiones FR y/o CDR1 y/o CDR2 y/o CDR3 de cadena ligera se han reemplazado por secuencias humanas o no humanas homologas; anticuerpos quimericos del fragmento Fab en los que las regiones FR y/o CDR1 y/o CDR2 y/o CDR3 de cadena ligera se han reemplazado por secuencias humanas o no humanas homologas; y anticuerpos quimericos del fragmento Fd en los que las regiones FR y/o CDR1 y/o CDR2 se han reemplazado por secuencias humanas o no humanas homologas. La presente invencion tambien incluye los denominados anticuerpos de cadena unica.
Las diversas moleculas y fragmentos de anticuerpos se pueden obtener a partir de cualquiera de las clases de inmunoglobulinas conocidas comunmente, que incluyen pero no se limitan a, IgA, IgA secretora, IgE, IgG e IgM. Las subclases de IgG tambien son bien conocidas por los expertos en la tecnica e incluyen pero no se limitan a IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humanas.
En otra realizacion, el anticuerpo segun la invencion es un anticuerpo de dominio sencillo. El termino "anticuerpo de dominio unico" (sdAb) o "VHH" se refiere al dominio variable de cadena pesada unica de anticuerpos del tipo que se pueden encontrar en mairnferos camelidos que estan naturalmente desprovistos de cadenas ligeras. Tales VHH tambien se llaman "nanobody®". Segun la invencion, sdAb puede ser particularmente sdAb de llama.
En algunas realizaciones de los agentes descritos en la presente memoria, el agente es un polipeptido. En una realizacion particular, el polipeptido es un equivalente funcional de Orexina-A u Orexina-B.
Como se utiliza en la presente memoria, el termino "orexina-A" tiene su significado general en la tecnica y se refiere a la secuencia de aminoacidos como se muestra en la SEQ ID NO:2.
Orexina-A (SEQ ID NO:2): peplpdccrqk tcscrlyell hgagnhaagi ltl en donde pe significa piroglutamato.
Como se utiliza en la presente memoria, el termino "orexina-B" tiene su significado general en la tecnica y se refiere a la secuencia de aminoacidos como se muestra en la SEQ ID NO:3.
Orexina-B (SEQ ID NO:3): rsgppglqgr lqrllqasgn haagiltm.
Como se utiliza en la presente memoria, tambien se incluye un polipeptido que es capaz de unirse a OX1R, promoviendo asf una actividad OX1R segun la invencion. El termino "equivalente funcional" incluye fragmentos, mutantes y mutemas de Orexina-A y Orexina-B. El termino "funcionalmente equivalente" incluye, por lo tanto, cualquier equivalente de orexinas (es decir, Orexina-A u Orexina-B) obtenido mediante alteracion de la secuencia de aminoacidos, por ejemplo, mediante una o mas deleciones, sustituciones o adiciones de aminoacidos, de modo que el analogo de la protema retiene la capacidad para unirse a OX1R y promover una actividad de OX1R segun la invencion (p. ej., aoptosis de la celula cancerosa). Las sustituciones de aminoacidos se pueden realizar, por ejemplo, mediante mutacion puntual del ADN que codifica la secuencia de aminoacidos.
En algunas realizaciones, el equivalente funcional es al menos 80% homologo (es decir, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100% homologo) a la protema correspondiente. En algunas realizaciones, el equivalente funcional es al menos 90% homologo (es decir, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% homologo) segun se evalua mediante cualquier algoritmo de analisis convencional tal como por ejemplo, el software de analisis de secuencias Pileup (Program Manual for the Wisconsin Package, 1996). El termino "un fragmento funcionalmente equivalente" como se utiliza en la presente memoria tambien puede significar cualquier fragmento o conjunto de fragmentos de Orexina que se une a OX1R y promueve la actividad de OX1R segun la invencion. En consecuencia, la presente invencion proporciona un polipeptido que comprende aminoacidos consecutivos que tienen una secuencia que corresponde a la secuencia de al menos una porcion de Orexina-A u Orexina-B, cuya porcion se une a OX1R y promueve la actividad OX1R segun la invencion. Los fragmentos funcionalmente equivalentes pueden pertenecer a la misma familia de protemas que las Orexinas humanas identificadas en la presente memoria. Por "familia de protemas" se entiende un grupo de protemas que comparten una funcion comun y exhiben una homologfa de secuencia comun. Las protemas homologas se pueden obtener a partir de especies no humanas. En particular, la homologfa entre secuencias de protemas funcionalmente equivalentes es al menos del 80% en toda la secuencia. Mas en particular, la homologfa es superior a 90% en toda la secuencia. Mas en particular, la homologfa es superior a 95% en toda la secuencia.
En algunas realizaciones, el ultimo resto de la SEQ ID NO:3, es dedr, el resto de metionina en la posicion 28 esta amidado. Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "amidacion" tiene su significado general en la tecnica y se refiere al metodo que consiste en producir un resto amida.
Los polipeptidos de la invencion se pueden producir mediante cualquier medio adecuado, como sera evidente para los expertos en la tecnica. Con el fin de producir cantidades suficientes de polipeptidos o equivalentes funcionales de los mismos para su uso segun la presente invencion, la expresion se puede lograr convenientemente cultivando bajo condiciones apropiadas celulas hospedadoras recombinantes que contienen el polipeptido de la invencion. En particular, el polipeptido se produce por medios recombinantes, meidante expresion a partir de una molecula de acido nucleico codificante. Los sistemas para la clonacion y expresion de un polipeptido en una variedad de diferentes celulas hospedadoras son bien conocidos. Cuando se expresa en forma recombinante, el polipeptido se genera en particular mediante la expresion de un acido nucleico codificante en una celula hospedadora. Se puede utilizar cualquier celula hospedadora, dependiendo de los requisitos individuales de un sistema en particular. Las celulas hospedadoras adecuadas incluyen bacterias, celulas de mairnferos, celulas de plantas, levaduras y sistemas de baculovirus. Las lmeas celulares de mamnfero disponibles en la tecnica para la expresion de un polipeptido heterologo incluyen celulas de ovario de hamster chino. Celulas HeLa, celulas de rinon de cnas de hamster y muchas otras. Las bacterias tambien son hospedadores preferidos para la produccion de protemas recombinantes, debido a la facilidad con que las bacterias se pueden manipulary crecer. Un hospedador bacteriano preferido es E coli.
Los metodos para producir polipeptidos amidados son bien conocidos en la tecnica y normalmente implican el uso de enzimas de amidacion. Como se utiliza en la presente memoria, el termino "enzima de amidacion" se define como las enzimas que pueden convertir el grupo carboxilo de un polipeptido en un grupo amida. Las enzimas capaces de la amidacion C-terminal de peptidos se conocen desde hace mucho tiempo (Eipper et al. Mol. Endocrinol. 1987 November; 1 (11): 777). Los ejemplos de enzimas de amidacion incluyen peptidilglicina a-monooxigenasa (EC 1.14.17.3), denominada en la presente memoria PAM, y peptidilamidoglicolato liasa (EC 4.3.2.5), denominada en la presente memoria PGL. La preparacion y purificacion de tales enzimas PAM es familiar para el experto y se ha descrito en detalle (M. Nogudi et al. Prot. Expr. Purif. 2003, 28: 293). Una alternativa a la amidacion "in vitro" por medio de PAM surge cuando la enzima se coexpresa en la misma celula hospedadora con la protema precursora a amidar (es decir, SEQ ID NO:3). Esto se logra mediante la introduccion de una secuencia de genes que codifica una actividad PAM en la celula hospedadora bajo el control de una secuencia reguladora espedfica del hospedador. Esta secuencia de expresion se puede incorporar de manera estable en la secuencia de a Dn cromosomica respectiva, o estar presente en un segundo plasmido paralelo al plasmido de expresion para la protema diana (es decir, SEQ ID NO:3), o se puede integrar como segundo casete de expresion en el mismo vector, o se puede clonar en un enfoque de expresion policistronica en fase con la secuencia del gen que codifica la protema diana (es decir, SEQ ID NO:3) bajo el control de la misma secuencia promotora. Un metodo adicional para la amidacion se basa en el uso de mecanismos de autoescision espedficos de protemas (Cottingham et al. Nature Biotech. Vol. 19, 974-977, 2001). Los metodos de amidacion descritos anteriormente parten de un extremo C del peptido diana que se extiende mediante al menos un aminoacido glicina o alternativamente un peptido provisional. Metodos alternativos, tambien se describen en el documento WO2007036299. Por consiguiente, en algunas realizaciones, la secuencia de acido nucleico que codifica el polipeptido de orexina (es decir, la SEQ ID NO:3) se elige para permitir la amidacion de dicho polipeptido de orexina y, por lo tanto, puede comprender codones adicionales que codificaran un precursor extendido con glicina. Normalmente, el precursor extendido con glicina se parece a YGXX, donde Y representa el aminoacido que debe estar amidado y X representa cualquier aminoacido de modo que la enzima de amidacion (p. ej., PAM) catalice la produccion del polipeptido amidado a partir de dicho precursor extendido con glicina. En algunas realizaciones, el precursor extendido con glicina es MGRR.
En algunas realizaciones el polipeptido de la invencion es una inmunoadhesina.
Como se utiliza en la presente memoria, el termino "inmunoadhesina" designa moleculas similares a anticuerpos que combinan la especificidad de union de una protema heterologa (una "adhesina" que se puede unir a OX1R) con las funciones efectoras de los dominios constantes de inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusion de una secuencia de aminoacidos con la especificidad de union deseada a OX1R (es decir, es "heterologa"), y una secuencia del dominio constante de inmunoglobulina. La parte de adhesina de una molecula de inmunoadhesina normalmente es una secuencia de aminoacidos contigua que comprende al menos el sitio de union para OX1R. En algunas realizaciones, la adhesina comprende los polipeptidos caracterizados por la SEQ ID NO:2 o la SEQ ID NO:3. La secuencia del dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina se puede obtener a partir de cualquier inmunoglobulina, tales como los subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3 o IgG-4, IgA (que incluye IgA-1 e IgA-2), IgE, IgD o IgM.
La secuencia de inmunoglobulina normalmente, pero no necesariamente, es un dominio constante de inmunoglobulina (region Fc). Las inmunoadhesinas pueden poseer muchas de las valiosas propiedades qrnmicas y biologicas de los anticuerpos humanos. Dado que las inmunoadhesinas se pueden construir a partir de una secuencia de protema humana con una especificidad deseada unida a una region bisagra de inmunoglobulina humana apropiada y a una secuencia de dominio constante (Fc), la especificidad de union de interes se puede lograr utilizando componentes completamente humanos. Tales inmunoadhesinas son mmimamente inmunogenicas para el paciente y son seguras para el uso cronico o repetido.
En algunas realizaciones, la region Fc es una region Fc de secuencia nativa. En algunas realizaciones, la region Fc es una region Fc variable. En otra realizacion mas, la region Fc es una region Fc funcional. Como se utiliza en la presente memoria, el termino "region Fc" se utiliza para definir una region C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina, que incluye regiones Fc de secuencia nativa y regiones Fc variables. Aunque los lfmites de la region Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina pueden variar, la region Fc de la cadena pesada de IgG humana generalmente se define para extenderse desde un resto aminoacido en la posicion Cys226, o desde Pro230, hasta el extremo carboxilo de la misma. La porcion de adhesion y la porcion de secuencia de inmunoglobulina de la inmunoadhesina pueden estar unidas mediante un conector mmimo. La secuencia de inmunoglobulina normalmente, pero no necesariamente, es un dominio constante de inmunoglobulina. El resto de inmunoglobulina en las quimeras de la presente invencion se puede obtener a partir de los subtipos IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, IgA, IgE, IgD o IgM, pero normalmente de IgG1 o IgG3.
Los polipeptidos de la invencion, fragmentos de los mismos y protemas de fusion (p. ej., inmunoadhesina) segun la invencion pueden exhibir modificaciones postraduccionales, que incluyen, pero no se limitan a glicosilaciones (p. ej., glicosilaciones ligadas a N o ligadas a O), miristilaciones, palmitilaciones, acetilaciones y fosforilaciones (p. ej., serina/treonina o tirosina).
En realizaciones espedficas, se contempla que los polipeptidos utilizados en los metodos terapeuticos de la presente invencion se pueden modificar para mejorar su eficacia terapeutica. Dicha modificacion de los compuestos terapeuticos se puede utilizar para disminuir la toxicidad, aumentar el tiempo circulatorio o modificar la biodistribucion. Por ejemplo, la toxicidad de compuestos terapeuticos potencialmente importantes se puede disminuir significativamente mediante la combinacion con una variedad de vehmulos portadores de farmacos que modifican la biodistribucion. En el ejemplo que anade dipeptidos puede mejorar la penetracion de un agente circulante en el ojo a traves de la barrera hemato retiniana mediante el uso de transportadores endogenos.
Una estrategia para mejorar la viabilidad del farmaco es la utilizacion de polfmeros solubles en agua. Se ha demostrado que varios polfmeros solubles en agua modifican la distribucion biologica, mejoran el modo de captacion celular, cambian la permeabilidad a traves de barreras fisiologicas; y modifican la velocidad de aclaramiento del cuerpo. Para lograr un efecto de direccionamiento o de liberacion sostenida, se han sintetizado polfmeros solubles en agua que contienen restos de farmacos como grupos terminales, como parte de la cadena principal, o como grupos colgantes en la cadena del polfmero.
El polietilenglicol (PEG) se ha utilizado ampliamente como portador de farmacos, dado su alto grado de biocompatibilidad y facilidad de modificacion. Se ha demostrado que la union a varios farmacos, protemas y liposomas mejora el tiempo de residencia y disminuye la toxicidad. El PEG se puede acoplar a agentes activos a traves de los grupos hidroxilo en los extremos de la cadena y mediante otros metodos qrnmicos; sin embargo, el propio PEG se limita como mucho a dos agentes activos por molecula. En un enfoque diferente, los copolfmeros de PEG y aminoacidos se exploraron como nuevos biomateriales que retendnan las propiedades de biocompatibilidad de PEG, pero que tendnan la ventaja anadida de numerosos puntos de union por molecula (proporcionando una mayor carga de farmaco), y que podnan estar sinteticamente disenados para adaptarse a una variedad de aplicaciones.
Los expertos en la tecnica estan al tanto de las tecnicas de PEGilacion para la modificacion eficaz de farmacos. Por ejemplo, VectraMed (Plainsboro, N.J.) ha utilizado polfmeros para la liberacion de farmacos que consisten en polfmeros alternos de PEG y monomeros trifuncionales, tal como la lisina. Las cadenas de PEG (normalmente 2000 daltons o menos) estan unidas a los grupos a- y e-amino de la lisina a traves de enlaces estables de uretano. Tales copolfmeros retienen las propiedades deseables de PEG, mientras proporcionan grupos colgantes reactivos (los grupos de acido carboxflico de la lisina) a intervalos estrictamente controlados y predeterminados a lo largo de la cadena del polfmero. Los grupos colgantes reactivos se pueden utilizar para la derivatizacion, reticulacion o conjugacion con otras moleculas. Estos polfmeros son utiles para producir profarmacos estables de larga circulacion variando el peso molecular del polfmero, el peso molecular de los segmentos de PEG y el enlace escindible entre el medicamento y el polfmero. El peso molecular de los segmentos de PEG afecta el espaciamiento del complejo farmaco/grupo de enlace y a la cantidad de farmaco por peso molecular del conjugado (los segmentos de PEG mas pequenos proporcionan una mayor carga de farmaco). En general, aumentar el peso molecular total del conjugado de copolfmero de bloque aumentara la vida media circulatoria del conjugado. Sin embargo, el conjugado debe ser facilmente degradable o tener un peso molecular por debajo de la filtracion glomular lfmite umbral (p. ej., menos de 60 kDa).
Ademas, dado que la cadena principal del polfmero es importante para mantener la semivida circulatoria y la biodistribucion, se pueden utilizar conectores para mantener el agente terapeutico en forma de profarmaco hasta ser liberado de la cadena principal del polfmero por un desencadenante espedfico, normalmente la actividad enzimatica en el tejido diana. Por ejemplo, este tipo de liberacion de farmaco activado por tejido es particularmente util cuando se requiere la liberacion a un sitio espedfico de biodistribucion y el agente terapeutico se libera en o cerca del sitio de la patologfa. Las colecciones de grupos de enlace para uso en la liberacion de farmacos activados son conocidas por los expertos en la tecnica y se pueden basar en la cinetica de enzimas, la prevalencia de enzimas activas y la especificidad de escision de las enzimas espedficas de enfermedades seleccionadas. Tales conectores se pueden utilizar para modificar la protema o el fragmento de la protema descrita en la presente memoria para la administracion terapeutica.
En algunas realizaciones, el agonista de OX1R es un aptamero. Los aptameros son una clase de molecula que representa una alternativa a los anticuerpos en terminos de reconocimiento molecular.
Los aptameros son oligonucleotidos o secuencias de oligopeptidos con la capacidad de reconocer virtualmente cualquier clase de moleculas diana con alta afinidad y especificidad. Tales ligandos pueden estar aislados a traves de la Evolucion Sistematica de los Ligandos por Enriquecimiento Exponencial (SELEX, por sus siglas en ingles) de una coleccion de secuencias aleatorias. La coleccion de secuencias aleatorias se puede obtener mediante smtesis qmmica combinatoria de ADN. En esta coleccion, cada miembro es un oligomero lineal, eventualmente modificado qmmicamente, de una secuencia unica. Los aptameros peptfdicos consisten en una region variable de anticuerpo conformacionalmente limitada mostrada mediante una protema de plataforma, tal como la tiorredoxina A de E. coli, que se seleccionan de colecciones combinatorias mediante dos metodos hubridos.
Como se utiliza en la presente memoria, el termino "carcinoma hepatocelular" tiene su significado general en la tecnica y se refiere al cancer desarrollado en los hepatocitos. En general, el cancer de hugado indica carcinoma hepatocelular en general. El CHC puede ser causado por un agente infeccioso como el virus de la hepatitis B (el VHB, en lo sucesivo, denominado VHB) o virus de la hepatitis C (VHC, en lo sucesivo, denominado VHC). En algunas realizaciones, el CHC es debido a esteatohepatitis alcoholica o esteatohepatitis no alcoholica (en lo sucesivo se puede abreviar como "NASH", por sus siglas en ingles). El termino tambien incluye micro-metastasis hepatica digestiva.
En algunas realizaciones, el CHC es CHC en etapa temprana, CHC no metastasico, CHC primario, CHC avanzado, CHC localmente avanzado, CHC metastasico, CHC en remision o CHC recurrente. En algunas realizaciones, el CHC es extirpable localizado (es decir, tumores que estan confinados a una porcion del hugado que permite la extirpacion quirurgica completa), inextirpable localizado (es decir, los tumores localizados pueden ser inextirpables debido a que estan involucradas estructuras de vasos sangumeos cruciales o debido a que el hugado esta danado), o inextirpable (es decir, los tumores afectan a todos los lobulos del hugado y/o se han diseminado a otros organos (p. ej., pulmon, ganglios linfaticos, huesos). En algunas realizaciones, el CHC es, segun las clasificaciones TNM, un tumor en estadio I (un solo tumor sin invasion vascular), un tumor en estadio II (un solo tumor con invasion vascular o multiples tumores, ninguno superior a 5 cm), un tumor en estadio III (multiples tumores, mayores de 5 cm, o tumores que involucran la rama principal de venas portales o hepaticas), un tumor en estadio IV (tumores con invasion directa de organos adyacentes distintos de la vesmula biliar o perforacion del peritoneo visceral), tumor N1 (metastasis en los ganglios linfaticos regionales) o tumor M1 (metastasis a distancia). En algunas realizaciones, el CHC es, segun los criterios de estadificacion de la AJCC (American Joint Commission on Cancer), estadios de CHC T1, T2, T3 o T4.
Como se utiliza en la presente memoria, "tratamiento" o "que trata" es un enfoque para obtener resultados beneficiosos o deseados, que incluye los resultados clmicos. Para los fines de esta invencion, los resultados clmicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, uno o mas de los siguientes: aliviar uno o mas smtomas resultantes de la enfermedad, disminuir la extension de la enfermedad, estabilizar la enfermedad (p. ej., prevenir o retrasar el empeoramiento de la enfermedad), prevenir o retrasar la propagacion (p. ej., metastasis) de la enfermedad, prevenir o retrasar la recurrencia de la enfermedad, retrasar o ralentizar la progresion de la enfermedad, mejorar el estado de la enfermedad, proporcionar una remision (parcial o total) de la enfermedad, disminuir la dosis de uno o mas medicamentos necesarios para tratar la enfermedad, retrasar la progresion de la enfermedad, aumentar la calidad de vida, y/o prolongar la supervivencia. Por "tratamiento" tambien se abarca una reduccion de las consecuencias patologicas de CHC. Los metodos de la invencion contemplan uno o mas de estos aspectos del tratamiento.
En algunas realizaciones, el agonista de OX1R de la invencion se administra al sujeto con una cantidad terapeuticamente eficaz.
Por "cantidad terapeuticamente eficaz" se entiende una cantidad suficiente de OX1R para tratar el carcinoma hepatocelular a una relacion razonable de beneficio/riesgo aplicable a cualquier tratamiento medico. Se entendera que el uso diario total de los compuestos y composiciones de la presente invencion sera decidido por el medico asistente dentro del alcance de un buen juicio medico. El nivel de dosis terapeuticamente eficaz espedfico para cualquier sujeto en particular dependera de una variedad de factores que incluyen el trastorno que se esta tratando y la gravedad del trastorno; la actividad del compuesto espedfico empleado; la composicion espedfica empleada, la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo y la dieta del sujeto; el tiempo de administracion, la via de administracion y la tasa de excrecion del compuesto espedfico empleado; la duracion del tratamiento; farmacos utilizados en combinacion o coincidentes con el polipeptido espedfico empleado; y como factores bien conocidos en las tecnicas medicas. Por ejemplo, esta bien dentro de la experiencia de la tecnica empezar con dosis del compuesto a niveles mas bajos que los requeridos para lograr el efecto terapeutico deseado y aumentar gradualmente la dosis hasta que se logra el efecto deseado. Sin embargo, la dosis diaria de los productos puede variar en un amplio intervalo de 0,01 a 1.000 mg por adulto por dfa. En particular, las composiciones contienen 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, 50,0, 100, 250 y 500 mg del ingrediente activo para el ajuste sintomatico de la dosis al sujeto a ser tratado. Un medicamento contiene normalmente de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 500 mg del ingrediente activo, en particular de 1 mg a aproximadamente 100 mg del ingrediente activo. Generalmente, una cantidad eficaz del farmaco se suministra a un nivel de dosis de 0,0002 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal por dfa, especialmente de aproximadamente 0,001 mg/kg a 7 mg/kg de peso corporal por dfa.
Un objeto adicional de la invencion se refiere a metodos para disminuir el tamano de un carcinoma hepatocelular establecido en un paciente que lo necesite. Los metodos comprenden una etapa de administrar al paciente una cantidad terapeuticamente eficaz de un agonista de OX1R, siendo la cantidad suficiente para disminuir el tamano del tumor. Los metodos tambien pueden incluir una etapa de identificar a un paciente que padece o tiene un carcinoma hepatocelular, p. ej. un tumor detectable, establecido. Un tumor "establecido" es un tumor con un tamano suficiente para ser detectado utilizando metodos de deteccion habituales, p. ej. normalmente, el tumor tiene un tamano de al menos aproximadamente 0,5 cm o mas en al menos una dimension y es detectable, p. ej. mediante palpacion, mediante visualizacion (p. ej., rayos X, tomograffa por emision de positrones-tomograffa computarizada (p Et /CT, por sus siglas en ingles), visualizacion por resonancia magnetica (MRI, por sus siglas en ingles), ultrasonidos, etc.), o mediante algun otro medio. Se pueden utilizar mediciones de 1-, 2- y/o 3- dimensiones para determinar el tamano y/o volumen del tumor. La administracion de al menos un agonista de OX1R da como resultado una disminucion en el tamano del tumor, p. ej. al menos aproximadamente 10%, y generalmente aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100%, comparado con el tamano de un tumor no tratado equivalente (p. ej., control). Una disminucion de 100% indica la erradicacion completa del tumor detectable.
Un objeto adicional de la invencion se refiere a metodos para prevenir o ralentizar el crecimiento del carcinoma hepatocelular en un paciente que lo necesite, que comprende administrar a dicho paciente una cantidad terapeuticamente eficaz de un agonista de OX1R, siendo la cantidad suficiente para prevenir o ralentizar el crecimiento de al menos un carcinoma hepatocelular. La tasa de crecimiento del tumor (aumento de tamano) se reduce, por ejemplo, al menos en aproximadamente 10%, y generalmente en aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100%, comparado con la tasa de crecimiento de un tumor no tratado comparable (p. ej., control). Una disminucion de 100% en el crecimiento del tumor significa que el tumor deja de crecer (el crecimiento del tumor se detiene), y el tumor puede incluso disminuir en tamano (tasa de crecimiento negativa) en respuesta a la administracion del agonista.
El agonista de OX1R de la invencion se puede combinar con excipientes farmaceuticamente aceptables y, opcionalmente, matrices de liberacion sostenida, tales como polfmeros biodegradables, para formar composiciones terapeuticas.
"Farmaceuticamente" o "farmaceuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reaccion adversa, alergica u otra reaccion inadecuada cuando se administran a un mairnfero, especialmente a un ser humano, segun corresponda. Un portadoro excipiente farmaceuticamente aceptable se refiere a un relleno solido, semisolido o lfquido no toxico, diluyente, material de encapsulacion o coadyuvante de formulacion de cualquier tipo.
En las composiciones farmaceuticas de la presente invencion para administracion oral, sublingual, subcutanea, intramuscular, intravenosa, transdermica, local o rectal, el principio activo, solo o en combinacion con otro principio activo, se puede administrar en una forma unitaria de administracion, como una mezcla con soportes farmaceuticos convencionales, para animales y seres humanos. Las formas unitarias de administracion adecuadas comprenden formas de via oral tales como comprimidos, capsulas de gel, polvos, granulos y suspensiones o soluciones orales, formas de administracion sublingual y bucal, formas de administracion en aerosoles, implantes, subcutaneas, transdermicas, topicas, intraperitoneales, intramusculares, intravenosas, subdermicas, transdermicas, intratecales e intranasales y formas de administracion rectal.
En particular, las composiciones farmaceuticas contienen vehnculos que son farmaceuticamente aceptables para una formulacion apta para ser inyectada. Estas pueden ser en particular soluciones salinas isotonicas, esteriles (fosfato monosodico o disodico, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio y similares o mezclas de tales sales), o composiciones secas, especialmente liofilizadas que, tras la adicion, dependiendo del caso, de agua esterilizada o solucion salina fisiologica, permite la constitucion de soluciones inyectables.
Las formas farmaceuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas esteriles; formulaciones que incluyen aceite de sesamo, aceite de cacahuete o propilenglicol acuoso; y polvos esteriles para la preparacion extemporanea de soluciones o dispersiones inyectables esteriles. En todos los casos, la forma debe ser esteril y debe ser fluida en la medida en que exista una facil jeringabilidad. Debe ser estable bajo las condiciones de fabricacion y almacenamiento y se debe conservar contra la accion contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos.
Las soluciones que comprenden compuestos de la invencion como base libre o sales farmacologicamente aceptables se pueden preparar en agua adecuadamente mezclada con un agente tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones tambien se pueden preparar en glicerol, polietilenglicoles lfquidos y mezclas de los mismos y en aceites. Bajo condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos.
El agonista de OX1R de la invencion se puede formular en una composicion en forma neutra o salina. Las sales farmaceuticamente aceptables incluyen las sales de adicion acidas (formadas con los grupos amino libres de la protema) y que se forman con acidos inorganicos tales como, por ejemplo, acidos clorhndrico o fosforico, o acidos organicos tales como acetico, oxalico, tartarico, mandelico, y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres tambien se pueden obtener a partirde bases inorganicas tales como, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, calcio o hidroxidos ferricos, y bases organicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procama y similares.
El portador tambien puede ser un disolvente o medio de dispersion que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol lfquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de partfcula requerido en el caso de la dispersion y mediante el uso de surfactantes. La prevencion de la accion de microorganismos puede ser provocada por diversos agentes antibacterianos y antifuCASK, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, acido sorbico, timerosal y similares. En muchos casos, sera preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares o cloruro de sodio. La absorcion prolongada de las composiciones inyectables se puede provocar mediante el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorcion, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Las soluciones inyectables esteriles se preparan incorporando los polipeptidos activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con varios de los otros ingredientes enumerados anteriormente, segun se requiera, seguido de una esterilizacion por filtracion. En general, las dispersiones se preparan incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehfculo esteril que contiene el medio de dispersion basico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos esteriles para la preparacion de soluciones inyectables esteriles, los metodos preferidos de preparacion son las tecnicas de secado al vacfo y liofilizacion que producen un polvo del ingrediente activo mas cualquier ingrediente deseado adicional de una solucion previamente esterilizada por filtracion del mismo.
Tras la formulacion, las soluciones se administraran de una manera compatible con la formulacion farmaceutica y en una cantidad que sea terapeuticamente eficaz. Las formulaciones se administran facilmente en una variedad de formas farmaceuticas, tales como el tipo de soluciones inyectables descritas anteriormente, pero tambien se pueden emplear capsulas de liberacion de farmacos y similares.
Para la administracion parenteral en una solucion acuosa, por ejemplo, la solucion debera estar adecuadamente tamponada si es necesario y el diluyente lfquido primero se hara isotonico con suficiente solucion salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administracion intravenosa, intramuscular, subcutanea e intraperitoneal. A este respecto, los medios acuosos esteriles que se pueden emplear seran conocidos por los expertos en la tecnica teniendo en cuenta la presente descripcion. Por ejemplo, una dosis se podna disolver en 1 ml de solucion isotonica de NaCl y anadir a 1000 ml de fluido de hipodermoclisis o inyectar en el sitio de infusion propuesto. Alguna variacion en la dosificacion ocurrira necesariamente dependiendo de la afeccion del sujeto que esta siendo tratado. La persona responsable de la administracion, en cualquier caso, determinara la dosis adecuada para el sujeto individual.
El agonista de OX1R de la invencion se puede formular dentro de una mezcla terapeutica para comprender aproximadamente 0,0001 a 1,0 miligramos, o aproximadamente 0,001 a 0,1 miligramos, o aproximadamente 0,1 a 1,0 o incluso aproximadamente 10 miligramos por dosis aproximadamente. Tambien se pueden administrar dosis multiples.
Ademas de los compuestos de la invencion formulados para administracion parenteral, tales como inyeccion intravenosa o intramuscular, otras formas farmaceuticamente aceptables incluyen, p. ej., comprimidos u otros solidos para administracion oral; formulaciones liposomales; capsulas de liberacion prolongada; y cualquier otra forma actualmente utilizada.
En algunas realizaciones, el agonista de OX1R de la invencion se utiliza en combinacion con un agente quimioterapeutico. Los agentes quimioterapeuticos incluyen, pero no se limitan a agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclosfosfamida; sulfonatos de alquilo tales como busulfan, improsulfan y piposulfan; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas que incluyen altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolmelamina; acetogeninas (especialmente bullatacina y bullatacinona); una camptotecina (que incluye el topotecan analogo sintetico); briostatina; callistatina; CC-1065 (que incluye sus analogos sinteticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (que incluye los analogos sinteticos, KW-2189 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; espongistatina; mostazas nitrogenadas, tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de oxido de mecloretamina, melfalano, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; antibioticos tales como los antibioticos enedina (p. ej., caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gamma 11 y caliqueamicina omega 11; dinemicina, que incluye dinemicina A; bifosfonatos, tal como clodronato; una esperamicina; asf como el cromoforo de neocarzinostatina y cromoforos antibioticos enedimicos cromoproteicos relacionados, aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, caminomicina, carzinofilina, cromomicina, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina (que incluye morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina y deoxidoxorubicina), epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, acido micofenolico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); analogos de acido folico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; analogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; analogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; androgenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reponedor de acido folico, tal como acido folmico; aceglatona; glucosido de aldofosfamida; acido aminolevulmico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina demecolcina; diaziquona; eflornitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglucido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; acido podofilmico; 2-etilhidrazida; procarbazina; complejo de polisacaridos (PSK, por sus siglas en ingles); razoxano; rizoxina; sizofurano; espirogermanio; acido tenuazonico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; mannomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, p. ej., paclitaxel y doxetaxel; clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; complejos de coordinacion de platino tales como cisplatino, oxaliplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etoposido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; novantrona; teniposido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; irinotecan (p. ej., CPT-1 1); inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tales como acido retinoico; capecitabina; y sales farmaceuticamente aceptables, acidos o derivados de cualquiera de los anteriores.
Otro objeto de la invencion se refiere a un metodo para tratar un carcinoma hepatocelular en un sujeto de la misma que comprende las etapas que consisten en i) determinar el nivel de expresion de OX1R en una muestra de tejido tumoral obtenida del sujeto, ii) comparar el nivel de expresion determinado en la etapa i) con un valor de referencia y iii) administrar al sujeto una cantidad terapeuticamente eficaz de un agonista de o X lR cuando el nivel determinado en la etapa i) es mayor que el valor de referencia.
El nivel de expresion de OX1R se puede determinar mediante cualquier metodo bien conocido en la tecnica. Por ejemplo, los metodos para determinar la cantidad de ARNm son bien conocidos en la tecnica. Normalmente, el acido nucleico contenido en las muestras (p. ej., celulas o tejidos preparados del paciente) se extrae primero segun los metodos estandar, por ejemplo, utilizando enzimas lfticas o soluciones qmmicas o se extrae mediante resinas de union a acidos nucleicos siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARNm extrafdo se detecta despues mediante hibridacion (p. ej., analisis de transferencia Northern) y/o amplificacion (p. ej., RT-PCR). Preferiblemente se prefiere la RT-PCR cuantitativa o semicuantitativa. La RT-PCR cuantitativa o semicuantitativa en tiempo real es particularmente ventajosa. Alternativamente, se puede utilizar un metodo de inmunohistoqmmica (IHC). IHC proporciona espedficamente un metodo para detectar dianas en una muestra o muestra de tejido in situ. La integridad celular general de la muestra se mantiene en IHC, lo que permite la deteccion tanto de la presencia como de la ubicacion de las dianas de interes (es decir, OX1R). Normalmente, una muestra se fija con formalina, se embebe en parafina y se corta en secciones para la tincion y su posterior inspeccion con microscopfa optica. Los metodos actuales de IHC utilizan un marcaje directo o un marcaje secundario basado en anticuerpos o basado en hapteno. Los ejemplos de sistemas IHC conocidos incluyen, por ejemplo, EnVision™(DakoCytomation), Powervision® (Immunovision, Springdale, AZ), el kit NBA™ (Zymed Laboratories Inc., Sur de San Francisco, CA), HistoFine® (Nichirei Corp, Tokio, Japon). En una realizacion particular, una seccion de tejido tumoral se puede montar en un portaobjetos u otro soporte despues de la incubacion con anticuerpos dirigidos contra OX1R. Despues, se pueden realizar inspecciones microscopicas en la muestra montada sobre un soporte solido adecuado. Para la produccion de fotomicrograffas, las secciones que comprenden muestras se pueden montar sobre un portaobjetos de vidrio u otro soporte plano, para resaltar mediante tincion selectiva la presencia de las protemas de interes.
Un "valor de referencia" puede ser un "valor umbral" o un "valor de corte". Normalmente, un "valor umbral" o "valor de corte" se puede determinar experimentalmente, empmcamente o teoricamente. Un valor umbral tambien se puede seleccionar arbitrariamente basandose en las condiciones experimentales y/o clmicas existentes, como lo reconocena un experto en la tecnica. El valor umbral se debe determinar para obtener la sensibilidad y especificidad optimas segun la funcion del ensayo y el balance beneficio/riesgo (consecuencias clmicas de falso positivo y falso negativo). Normalmente, la sensibilidad y especificidad optimas (y, por lo tanto, el valor de umbral) se pueden determinar utilizando una curva de caractenstica de funcionamiento del receptor (ROC) basada en datos experimentales. Normalmente, el valor umbral se obtiene a partir del nivel de expresion de OX1R (o proporcion, o puntuacion) determinado en una muestra de tejido tumoral obtenida a partir de uno o mas sujetos que tienen una cantidad suficiente de nivel de OX1R para obtener un tratamiento eficaz con el agonista de OX1R. Ademas, se puede utilizar la medicion retrospectiva de los niveles de expresion de OX1R (o proporcion, o puntuaciones) en muestras historicas de sujetos almacenadas correctamente para establecer estos valores umbral.
Un objeto adicional de la invencion se refiere a un metodo para seleccionar un farmaco para el tratamiento de carcinoma hepatocelular que comprende las etapas de i) proporcionar una pluralidad de sustancias de ensayo ii) determinar si las sustancias de ensayo son agonistas de OX1R y iii) seleccionar positivamente las sustancias de ensayo que son agonistas de OX1R.
Normalmente, el metodo de seleccion de la invencion implica proporcionar celulas apropiadas que expresen el receptor de orexina-1 en su superficie. Tales celulas incluyen celulas de mairnferos, levaduras, Drosophila o E. coli. En particular, se utiliza un polinucleotido que codifica el receptor de orexina-1 para transfectar celulas para expresar el receptor. El receptor expresado despues se pone en contacto con una sustancia de ensayo y un ligando del receptor de orexina-1 (p. ej., orexinas), segun sea apropiado, para observar la activacion de una respuesta funcional tal como el reclutamiento de SHP-2 y la induccion de la apoptosis celular de la celula. Los ensayos funcionales se pueden realizar como se describe en El Firar A, Voisin T, Rouyer-Fessard C, Ostuni MA, Couvineau A, Laburthe M. Discovery of a functional immunoreceptor tyrosine-based switch motif in a 7-transmembrane-spanning receptor: role in the orexin receptor OXIR-driven apoptosis. FASEB J. 2009 Dec;23(12):4069-80. doi: 10.1096/fj.09-131367. Epub 2009 Aug 6. En particular, las etapas de comparacion pueden implicar comparar la actividad inducida por la sustancia de ensayo y la actividad inducida por un agonista OX1R bien conocido, tal como orexina. En particular, se seleccionan positivamente sustancias capaces de tener una actividad similar o incluso mejor que un agonista de OX1R bien conocido.
Normalmente, el metodo de seleccion de la invencion tambien puede implicar la seleccion de sustancias de ensayo capaces de unirse al receptor de orexina-1 presente en la superficie celular. Normalmente, la sustancia de ensayo se marca (p. ej., con un marcador radiactivo) y la union se compara con un agonista de OX1R bien conocido tal como la orexina. La preparacion se incuba con OX1R marcado y los complejos de sustancias de ensayo unidos a NGAL se afslan y se caracterizan segun los metodos de rutina conocidos en la tecnica. Alternativamente, el OX1R se puede unir a un soporte solido de modo que las moleculas de union solubilizadas de las celulas se unen a la columna y despues se eluyen y caracterizan segun los metodos de rutina. En otra realizacion, un compartimento celular se puede preparar a partir de una celula que expresa una molecula que se une a NGAL tal como una molecula de una via de senalizacion o reguladora modulada por NGAL. La preparacion se incuba con NGAL marcado en ausencia o en presencia de un compuesto candidato. La capacidad del compuesto candidato para unirse a la molecula de union se refleja en la disminucion de la union del ligando marcado.
Normalmente, el compuesto candidato se selecciona del grupo que consiste en pequenas moleculas organicas, peptidos, polipeptidos u oligonucleotidos.
Las sustancias de ensayo que se han seleccionado positivamente se pueden someter a etapas de seleccion adicionales con el fin de ensayar sus propiedades para el tratamiento del carcinoma hepatocelular. Por ejemplo, los compuestos candidatos que se han seleccionado positivamente se pueden someter a etapas de seleccion adicionales con el fin de ensayar mas a fondo sus propiedades en modelos animales para el carcinoma hepatocelular.
Los ensayos anteriores se pueden realizar utilizando tecnicas de deteccion de alto rendimiento para identificar sustancias de ensayo para desarrollar farmacos que puedan ser utiles para el tratamiento del carcinoma hepatocelular. Las tecnicas de deteccion de alto rendimiento se pueden llevar a cabo utilizando placas de multiples pocillos (p. ej., placas de 96, 389 o 1536 pocillos), para llevar a cabo multiples ensayos utilizando un sistema robotico automatizado. Por lo tanto, las colecciones grandes de sustancias de ensayo se pueden ensayar de una manera altamente eficiente. Mas particularmente, las celulas transfectadas de manera estable que crecen en pocillos de placas de microtitulacion (96 pocillos o 384 pocillos) se pueden adaptar a la seleccion de alto rendimiento de colecciones de compuestos. Los compuestos en la coleccion se aplicaran a la vez de forma automatizada a los pocillos de las placas de microtitulacion que contienen las celulas transgenicas descritas anteriormente. Una vez que se identifican las sustancias de ensayo que activan las senales apoptoticas, se pueden seleccionar positivamente para una caracterizacion adicional. Estos ensayos ofrecen varias ventajas. La exposicion de la sustancia de ensayo a una celula completa permite la evaluacion de su actividad en el contexto natural en el que puede actuar la sustancia de ensayo. Debido a que este ensayo se puede realizar facilmente en un formato de placa de microtitulacion, los ensayos descritos se pueden realizar mediante un sistema robotico automatizado, que permite ensayar grandes cantidades de muestras de ensayo dentro de un marco de tiempo razonablemente corto. Los ensayos de la invencion se pueden utilizar como un cribado para evaluar la actividad de un compuesto o extracto no ensayado previamente, en cuyo caso se ensaya una concentracion unica y se compara con los controles. Estos ensayos tambien se pueden utilizar para evaluar la potencia relativa de un compuesto ensayando un intervalo de concentraciones, en un intervalo de 100 pM a 1 nM, por ejemplo, y calculando la concentracion a la cual la apoptosis es maxima.
La presente invencion tambien se refiere a un metodo para visualizar el carcinoma hepatocelular y/o la metastasis hepatica digestiva en un sujeto que lo necesite, que comprende las etapas de i) administrar al sujeto una cantidad de ligando OX1R marcado con una sustancia detectable y ii) detectar la presencia del ligando en el sujeto.
Como se utiliza en la presente memoria, el termino "ligando OX1R" tiene su significado general en la tecnica y se refiere a cualquier molecula (natural o no) que tiene la capacidad de unirse a OX1R. Normalmente, los ligandos de OXR incluyen, pero no se limitan a, polipeptidos que son equivalentes funcionales de Orexina-A u Orexina-B, y anticuerpos de OX1R.
Como se utiliza en la presente memoria, el termino "marcado", con respecto al ligando OX1R, pretende abarcar el marcado directo del ligando de OX1R mediante acoplamiento (es decir, la union ffsica) de una sustancia detectable.
Las sustancias detectables normalmente incluyen, pero no se limitan a, agentes de visualizacion radiologica, agentes de visualizacion optica, agentes de visualizacion PET, agentes de contraste MRI, agentes de contraste CT y agentes de visualizacion FRET.
La sustancia detectable puede ser un ion metalico radiactivo, es decir, un radiometal. Los radiometales adecuados pueden ser emisores de positrones tales como 64Cu, 48V, 52Fe, 55Co, 94mTc o 68Ga; emisores gamma tales como 99mTc 111In 113mIn o 67Ga o emisores beta tales como 67Cu, 89Sr, 90Y, 153Sm, 136Re, 188Re o 192Ir. En esta realizacion particular, los quelantes de poliamino policarboxilato tales como el acido dietilentriaminopentaacetico (DTPA) o el acido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N',N",N'"-tetraacetico (DOTA) tambien se desarrollaron para marcar radiometales. Estos quelantes permiten marcar con radioisotopos adecuados para la visualizacion, tales como 111In para tomograffa computarizada por emision de foton unico (SPECT, por sus siglas en ingles) y 68Ga para tomograffa por emision de positrones (PET). Los poliamino policarboxilatos tambien son quelantes adecuados para los isotopos 90Y y 177Lu.
La sustancia detectable puede ser un ion metalico paramagnetico, tales iones metalicos adecuados incluyen: Gd(III), Mn(II), Cu(II), Cr(III), Fe(III), Co(II)1 Er(II)1 Ni(II), Eu(III) o Dy(III).
La sustancia detectable puede ser un halogeno radiactivo gamma. El radiohalogeno se elige adecuadamente entre 123I, 1311 o 77Br.
La sustancia detectable puede ser un no metal emisor de positrones radioactivo. Tales emisores de positrones adecuados incluyen: 11C, 23N, 150, 17F, 18F, 75Br, 76Br o 124I.
La sustancia detectable puede ser un nucleo activo de RMN hiperpolarizado. Tales nucleos activos de RMN pueden tener un espm nuclear distinto de cero, e incluyen 13C, 15N, 19F, 29Si y 31P. Por el termino "hiperpolarizado" se entiende el aumento del grado de polarizacion del nucleo activo de RMN sobre su polarizacion de equilibrio. La abundancia natural de 13C (en relacion a 12C) es aproximadamente 1%, y los compuestos marcados con 13C adecuados se enriquecen adecuadamente a una abundancia de al menos 5%, preferiblemente de al menos 50%, mas preferiblemente de al menos 90% antes de ser hiperpolarizados. Al menos un atomo de carbono del agente de visualizacion de la invencion esta enriquecido adecuadamente con 13C, que posteriormente se hiperpolariza.
La sustancia detectable puede ser un indicador adecuado para visualizacion optica in vivo, el indicador es cualquier resto capaz de ser detectado directa o indirectamente en un procedimiento de visualizacion optica. El indicador puede ser un dispersor de luz (p. ej., una parffcula de color o sin color), un absorbedor de luz o un emisor de luz. Mas preferiblemente, el indicador es un colorante tal como un cromoforo o un compuesto fluorescente. El colorante puede ser cualquier colorante que interactue con la luz en el espectro electromagnetico con longitudes de onda desde la luz ultravioleta hasta el infrarrojo cercano. Mas preferiblemente, el incicador tiene propiedades fluorescentes. Los indicadores fluoroforicos y cromoforicos organicos ffpicos incluyen grupos que tienen un extenso sistema de electrones deslocalizados, p. ej. cianinas, merocianinas, indocianinas, ftalocianinas, naftalocianinas, trifenilmetinas, porfirinas, colorantes de pirilio, colorantes de tiapirilio, colorantes de escuarilio, colorantes de croconio, colorantes de azulenio, indoanilinas, colorantes de benzofenoxazinio, colorantes de benzotiafenotiazinio, antraquinonas, naftoquinonas, indatrenos, ftaloilacridonas, trisfenoquinonas, colorantes azo, colorantes de transferencia de carga intramolecular e intermolecular y complejos de colorantes, troponas, tetrazinas, complejos bis (ditioleno), complejos bis(bencenoditiolato), colorantes yodoanilina, complejos bis(S,O-ditioleno). Las protemas fluorescentes, tal como la protema fluorescente verde (GFP, por sus siglas en ingles) y las modificaciones de GFP que tienen diferentes propiedades de absorcion/emision tambien son utiles. Los complejos de ciertos metales de tierras raras (por ejemplo, europio, samario, terbio o disprosio) se utilizan en ciertos contextos, al igual que los nanocristales fluorescentes (puntos cuanticos).
Ejemplos particulares de cromoforos que se pueden utilizar incluyen: fluorescema, sulforodamina 101 (rojo Texas), rodamina B, rodamina 6G, rodamina 19, verde de indocianina, Cy2, Cy3, Cy3,5, Cy5, Cy5,5, Cy7, azul Marino, azul Pacifico, verde Oregon 88, verde Oregon 514, tetrametilrodamina y fluor Alexa 350, fluor Alexa 430, fluor Alexa 532, fluor Alexa 546, fluor Alexa 555, fluor Alexa 568, fluor Alexa 594, fluor Alexa 633, fluor Alexa 647, fluor Alexa 660, fluor Alexa 680, fluor Alexa 700 y fluor Alexa 750.
Los colorantes que tienen maximos de absorcion en la region visible o infrarroja cercana (NIR), entre 400 nm y 3 pm, particularmente entre 600 y 1300 nm son particularmente preferidos. Las modalidades de visualizacion optica y las tecnicas de medicion incluyen, pero no se limitan a: visualizacion por luminiscencia; endoscopia; endoscopia de fluorescencia; tomograffa de coherencia optica, visualizacion por transmitancia; visualizacion por transmitancia resuelta en el tiempo; visualizacion confocal; microscopia no lineal; visualizacion fotoacustica; visualizacion acusticaoptica; espectroscopia; espectroscopia de reflectancia; interferometna; interferometna de coherencia; tomograffa optica difusa y tomograffa optica difusa mediada por fluorescencia (onda continua, sistemas de dominio de tiempo y de dominio de frecuencia), y medicion de dispersion de luz, absorcion, polarizacion, luminiscencia, vida util de fluorescencia, rendimiento cuantico y extincion.
Las sustancias detectables preferidas son aquellas que se pueden detectar externamente de una manera no invasiva despues de la administracion in vivo. Los restos visualizables mas preferidos son los radiactivos, especialmente los iones metalicos radiactivos, los halogenos radiactivos emisores gamma y los no metales radiactivos emisores de positrones, particularmente aquellos adecuados para visualizacion utilizando tomograffa computarizada por emision de foton unico (SPECT) o tomograffa por emision de positrones (PET).
Las tecnicas para conjugar moleculas detectables a polipeptidos y, en particular, anticuerpos, son bien conocidas en la tecnica (vease, p. ej., Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy,” en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy (Reisfeld et al. eds., Alan R. Liss, Inc., 1985); Hellstrom et al, “Antibodies For Drug Delivery,” en Controlled Drug Delivery (Robinson et al. eds., Marcel Deiker, Inc., 2nd ed. 1987); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,” en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications (Pinchera et al. eds., 1985); “Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy,” en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy (Baldwin et al. eds., Academic Press, 1985); y Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58. Vease tambien, p.ej., la publicacion PCT n°WO 89/12624.). Normalmente, la molecula de acido nucleico se une covalentemente a lisinas o cistemas en el anticuerpo, a traves de la funcionalidad ester de N-hidroxisuccinimida o maleimida, respectivamente. Se ha dado a conocer los metodos de conjugacion utilizando cistemas modificadas geneticamente o la incorporacion de aminoacidos no naturales para mejorar la homogeneidad del conjugado (Axup, J.Y., Bajjuri, K.M., Ritland, M., Hutchins, B.M., Kim, C.H., Kazane, S.A., Halder, R., Forsyth, J.S., Santidrian, A.F., Stafin, K., et al. (2012). Synthesis of site-specific antibody-drug conjugates using unnatural amino acids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109, 16101-16106.; Junutula, J.R., Flagella, K.M., Graham, R.A., Parsons, K.L., Ha, E., Raab, H., Bhakta, S., Nguyen, T., Dugger, D.L., Li, G., et al. (2010). Engineered thio-trastuzumab-DM1 conjugate with an improved therapeutic index to target human epidermal growth factor receptor 2-positive breast cancer. Clin. Cancer Res. 16, 4769-4778.). Junutula et al. (2008) desarrollaron una conjugacion espedfica de sitio basada en cistema llamada "THIOMABs" (TDC) que se reivindica que muestra un mdice terapeutico mejorado en comparacion con los metodos de conjugacion convencionales. La conjugacion con aminoacidos no naturales que se han incorporado al anticuerpo tambien se esta explorando para ADC; sin embargo, la generalidad de este enfoque aun no se ha establecido (Axup et al., 2012). En particular, el experto en la tecnica tambien puede prever un polipeptido que contiene Fc modificado geneticamente con una etiqueta que contiene glutamina donadora de acilo (p. ej., etiquetas de peptidos que contienen Gin o etiquetas Q) o una glutamina endogena que se hace reactiva mediante modificacion genetica de polipeptidos (p. ej., mediante la eliminacion, insercion, sustitucion o mutacion de aminoacidos en el polipeptido). Despues, una transglutaminasa, se puede entrecruzar covalentemente con un agente donador de amina (p. ej., una molecula pequena que comprende o se une a una amina reactiva) para formar una poblacion estable y homogenea de un conjugado polipepffdico que contiene Fc modificado geneticamente con el agente donador de aminas estando conjugado espedficamente en el sitio al polipeptido que contiene Fc a traves de la etiqueta que contiene glutamina donadora de acilo o la glutamina endogena accesible/expuesta/reactiva (el documento WO 2012059882).
La cantidad del ligando marcado utilizado en el metodo de visualizacion descrito en la presente memoria dependera de una variedad de factores, que incluye la identidad del ligando diana, la identidad de la sustancia detectable, los medios disponibles para detectar el agente de visualizacion, los medios utilizados para administrar el ligando al sujeto, y el peso del sujeto. En general, los ligandos se administraran a un sujeto en un metodo de visualizacion en una cantidad de entre aproximadamente 0,1 mg y aproximadamente 50 mg. Los ejemplos particulares incluyen aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 10 mg, y desde aproximadamente 1 mg a aproximadamente 5 mg. En ejemplos no limitantes, aproximadamente 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg o 10 mg de un ligando de la invencion puede ser una cantidad adecuada de ligando para administrarse a un sujeto para uso en los metodos de visualizacion descritos en la presente memoria.
Normalmente, el ligando se administra al sujeto por via parenteral, p. ej., por via intradermica, subcutanea, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa o intratecal. Sin embargo, el experto en la materia entendera que, en algunos casos, la administracion puede ser oral, sublingual, intranasal, intraocular, rectal, transdermica, mucosa, pulmonar o topica.
Ademas de detectar los ligandos, el experto en la materia entendera que la cantidad de senal detectada se puede comparar con otros valores, como los valores de control de un sujeto que se sabe que no tiene carcinoma hepatocelular y/o micrometasis hepaticas digestivas, o con valores obtenidos en una fecha anterior del mismo sujeto. En algunas realizaciones, el metodo comprende ademas medir la cantidad del ligando en el sujeto, y opcionalmente comparar adicionalmente la cantidad medida con un valor control o con un valor obtenido en un tiempo anterior en el mismo sujeto.
Los medios adecuados para detectar un ligando de la invencion que comprende un agente de visualizacion radiologica incluyen, pero no se limitan a sistemas de visualizacion radiologica, visualizacion MRI, SPECT-CT y PET. Los medios adecuados para detectar un ligando que comprende un agente de visualizacion optica incluyen, pero no se limitan a citometffa de flujo, microscopfa confocal, clasificadores de celulas activadas por fluorescencia y sistemas de visualizacion por fluorescencia como Lumina II.
Una vez que se detectan el carcinoma hepatocelular y/o la micrometastasis hepatica digestiva, el sujeto se puede tratar con un agonista de OX1R segun la invencion.
La invencion se ilustrara adicionalmente mediante las siguientes figuras y ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos y figuras no se deben interpretar de ninguna manera como limitantes del alcance de la presente invencion.
Figuras
Figura 1. Panel A: el inhibidor NSC-87877 de la protema tirosina fosfatasa SHP bloquea el crecimiento inhibitorio de SK-HEP-1 inducido por orexina. Las celulas SK-HEP-1 se estimularon con (negro) o sin (blanco) orexina-A 1 pM durante 48 h en ausencia (sin) o presencia de NSC-87877 (50 pM). Al final del tratamiento, las celulas adherentes se tripsinizaron y las celulas que exclman el azul de tripano se contaron para medir el crecimiento de las celulas SK-HEP-1. Panel B: Efecto de la inoculacion de orexina-A en el crecimiento de tumores desarrollados mediante xenoinjerto de celulas SK-HEP-1 cancerosas CHC humanas en ratones desnudos. Las celulas SK-HEP-1 se inocularon en el flanco de ratones desnudos en el dfa 0. Los ratones se inyectaron 2 veces a la semana por via intraperitoneal con 100 pl de soluciones de orexina-A (0,23 pmol/kg) a partir del dfa 0 (drculo blanco) o el dfa 22 (triangulo) o con 100 ml de PBS (drculo negro) para los controles.
Ejemplo
Las orexinas son peptidos hipotalamicos involucrados en el control sueno/vigilia. Hemos demostrado que las orexinas promueven la apoptosis robusta en celulas de cancer colorrectal (Voisin T, El Firar A, Fasseu M, Rouyer-Fessard C, Descatoire V, Walker F, Paradis V, Bedossa P, Henin D, Lehy T, Laburthe M. (2011) Aberrant expression of OX1 receptors for orexins in colon cancers and liver metastases: an openable gate to apoptosis. Cancer Res. 71:3341-51.). La muerte celular esta mediada por el receptor de orexina 1 (OX1R) a traves de un mecanismo original que implica la presencia de dos ITIM (motivo inhibidor del inmunoreceptor de tirosina) en la secuencia de OX1R y el reclutamiento y activacion de la tirosina fosfatasa SHP-2 (Voisin T, El Firar A, Rouyer-Fessard C, Gratio V, Laburthe M. (2008) A hallmark of immunoreceptor, the tyrosine-based inhibitory motif ITIM, is present in the G protein-coupled receptor OX1R for orexins and drives apoptosis: a novel mechanism. FASEB J. 22:1993-2002.). El OX1R, un g Pc R de clase A, se expresa de forma aberrante en tumores colorrectales primarios, adenocarcinoma pancreatico y metastasis hepaticas. El CHC es una neoplasia maligna primaria del tngado y representa la tercera causa de muerte por cancer en todo el mundo. El pilar del tratamiento es la extirpacion y la quimioterapia, pero muchos tumores son inextirpables en la presentacion. Hemos demostrado la expresion de OX1R mediante inmunohistoqmmica en CHC utilizando una micromatriz de tejido (TMA, por sus siglas en ingles) que sugiere la expresion ectopica de OX1R. Los objetivos de este estudio fueron: 1/ investigar la presencia de OX1R en lmeas celulares de CHC humanas y analizar los efectos de la orexina-A en relacion con la apoptosis; 2/ desarrollar un modelo de xenoinjerto heterotopico in vivo a partir de las lmeas celulares que expresan OX1R, para el estudio del crecimiento tumoral en respuesta a Orexina-A. La expresion de OX1R se estudio en ARNm (RT-PCR), protemas (inmunocitoqmmica) y niveles funcionales en 4 lmeas celulares de CHC (Hep G2, SK-HEP-1, HuH-7 y Hep 3B). Solo la lmea celular s K-HEP-1 expresa OX1R. El tratamiento con Orexina-A promovio una inhibicion del crecimiento celular del 62% promoviendo una apoptosis mitocondrial (Figura 1, panel A). Utilizando el inhibidor NSC-87877 de SHP, demostramos la capacidad del inhibidor para revertir la apoptosis inducida por orexina en celulas SK-HEP-1 (Figura 1, panel A). La inyeccion de Orexina-A en ratones desnudos xenoinjertados con celulas SK-HEP-1, ha disminuido el 80% de la progresion tumoral en los casos tratados (Figura 1, panel B). La induccion de apoptosis se observo en tumores tratados con Orexina-A (caspasa-3 activada).
Este trabajo ha demostrado los efectos antitumorales y proapoptoticos de las orexinas en el CHC. En este contexto, los receptores de orexina representan un nuevo objetivo prometedor en el tratamiento antineoplasico del carcinoma hepatocelular y/o del diagnostico preclmico.
Referencias bibliograficas
A lo largo de esta solicitud, varias referencias describen el estado de la tecnica a la que pertenece esta invencion.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un agonista de OX1R para uso en el tratamiento del carcinoma hepatocelular en un sujeto que lo necesite.
2. El agonista de OX1R para uso segun la reivindicacion 1, en donde el agonista de OX1R es un anticuerpo, tal como un anticuerpo quimerico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo monoclonal humano completo.
3. El agonista de OX1R para uso segun la reivindicacion 1, en donde el agonista de OX1R es un polipeptido.
4. El agonista de OX1R para uso segun la reivindicacion 1, en donde el agonista de OX1R es un polipeptido que tiene al menos 80% de identidad con la SEQ ID NO:2 o 3.
5. El agonista de OX1R para uso segun la reivindicacion 1, en donde el agonista de OX1R es una inmunoadhesina.
6. El agonista de OX1R para uso segun la reivindicacion 1, en donde el OX1R es un aptamero.
7. El agonista OX1R para uso segun la reivindicacion 1, en donde el carcinoma hepatocelular se selecciona del grupo que consiste en carcinoma hepatocelular en estadio temprano, carcinoma hepatocelular no metastatico, carcinoma hepatocelular primario, carcinoma hepatocelular avanzado, carcinoma hepatocelular localmente avanzado, carcinoma hepatocelular metastasico, carcinoma hepatocelular en remision, o carcinoma hepatocelular recurrente.
8. El agonista de OX1R para uso segun la reivindicacion 1, en donde el carcinoma hepatocelular es extirpable localizado, inextirpable localizado o inextirpable.
9. El agonista de OX1R para uso segun la reivindicacion 1, en donde tambien se administra al sujeto un agente quimioterapeutico.
10. Un agonista de OX1R para uso en un metodo para tratar un carcinoma hepatocelular en un sujeto que lo necesite, en donde dicho metodo comprende las etapas que consisten en i) determinar el nivel de expresion de OX1R en una muestra de tejido tumoral obtenida del sujeto, ii) comparar el nivel de expresion determinado en la etapa i) con un valor de referencia y iii) administrar al sujeto una cantidad terapeuticamente eficaz del agonista de OX1R cuando el nivel determinado en la etapa i) es mayor que el valor de referencia.
11. Un agonista de OX1R para uso en un metodo para visualizar el carcinoma hepatocelular y/o la micrometastasis hepatica digestiva en un sujeto que lo necesite, en donde dicho metodo comprende las etapas de i) administrar al sujeto una cantidad del ligando de OX1R marcado con una sustancia detectable y ii) detectar la presencia del ligando de OX1R marcado con una sustancia detectable en el sujeto.
12. Un agonista de OX1R para uso en un metodo para disminuir el tamano de un carcinoma hepatocelular establecido en un paciente que lo necesite, dicho metodo comprende una etapa de administrar al paciente una cantidad terapeuticamente eficaz del agonista de OX1R, siendo la cantidad suficiente para disminuir el tamano del tumor.
13. Un agonista de OX1R para uso en un metodo para prevenir o ralentizar el crecimiento del carcinoma hepatocelular en un paciente que lo necesite, dicho metodo comprende administrar a dicho paciente una cantidad terapeuticamente eficaz del agonista de OX1R, siendo la cantidad suficiente para prevenir o ralentizar el crecimiento de al menos un carcinoma hepatocelular.
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