ES2706382T3 - Eliminación dirigida por oligonucleótidos antisentido de los sitios de escisión proteolítica de proteínas - Google Patents

Abstract

Un método para eliminar un sitio de escisión de caspasa o un sitio de escisión de secretasa de una proteína que comprende proporcionar una célula que expresa el pre-ARNm que codifica dicha proteína ex vivo con un oligonucleótido antisentido que induce a omitir la secuencia exónica que codifica dicho sitio de escisión de caspasa o sitio de escisión de secretasa, comprendiendo además el método permitir la traducción del ARNm producido a partir de dicho pre-ARNm, caracterizado el método porque la proteína no es distrofina.

Description

DESCRIPCIÓN

Eliminación dirigida por oligonucleótidos antisentido de los sitios de escisión proteolítica de proteínas

La invención se refiere al campo de las enfermedades genéticas y adquiridas. La invención en particular se refiere a la alteración del procesamiento del ARNm de un pre-ARNm específico para eliminar un sitio de escisión proteolítica de una proteína codificada por dicho pre-ARNm.

El procesamiento proteolítico es una forma importante de modificación posterior a la traducción que se produce cuando una proteasa escinde uno o más enlaces en una proteína diana para modificar su actividad. Este procesamiento puede llevar a la activación, inhibición, alteración o destrucción de la actividad de la proteína. Muchos procesos celulares están controlados por procesamiento proteolítico. La proteasa atacante puede eliminar un segmento peptídico de cualquiera de los extremos de la proteína diana, pero también puede escindir enlaces internos en la proteína lo que conduce a cambios importantes en la estructura y función de la proteína.

El procesamiento proteolítico es un proceso altamente específico. El mecanismo del procesamiento proteolítico varía según la proteína que se procesa, la ubicación de la proteína y la proteasa.

El procesamiento proteolítico puede tener varias funciones. Por ejemplo, la proteólisis de proteínas precursoras regula muchos procesos celulares, incluida la expresión génica, la embriogénesis, el ciclo celular, la muerte celular programada, la focalización de proteínas intracelulares y las funciones endocrinas/neurales. En todos estos procesos, es necesaria la escisión proteolítica de proteínas precursoras. La proteólisis a menudo se realiza mediante serina proteasas en las vías secretoras. Estas proteasas son endoproteasas serinas dependientes de calcio y están relacionadas con las proteasas de levadura y subtilisina y, por lo tanto, se denominan convertasas de proproteína similares a subtilisina (PCP) o PC. Se han identificado y caracterizado siete miembros de esta familia y cada uno ha conservado péptidos de señalización, prorregiones, catalíticos y dominios P, pero difieren en sus dominios C-terminales en los mamíferos. La escisión autocatalítica de un propéptido N-terminal activa estas proteasas, que se requieren para el plegamiento y también para la liberación de la producción de prodominio. Otros ejemplos de funciones asociadas con el procesamiento proteolítico son las cascadas de coagulación sanguínea, las metaloendopeptidasas, las secretasas y las caspasas. Otros ejemplos más son las proteasas virales que procesan específicamente las poliproteínas virales.

El arte describe varias estrategias para inhibir las diversas proteasas. Por ejemplo, actualmente se están desarrollando inhibidores de gamma-secretasa para el tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda de células T (Nature Medicine 2009: 15, 50-58). Los inhibidores de caspasa se están desarrollando para una variedad de aplicaciones diferentes (The Journal of Biological Chemistry 1998: 273, 32608-32613), por ejemplo, en el tratamiento de la sepsis (Nature Immunology 2000: 1, 496-501).

Un problema con el uso de inhibidores de proteasa es que estas proteínas tienen típicamente un rango de dianas en el cuerpo humano y se asocian con un rango de efectos. La inhibición de una proteasa en el cuerpo humano a través de la acción de un inhibidor de la proteasa no solo inhibe el efecto deseado, sino que también tiene un rango de otros efectos que pueden afectar o no a la utilidad del inhibidor de la proteasa para la enfermedad indicada. Otro problema asociado con los inhibidores de la proteasa es que no siempre es fácil producir un inhibidor que sea suficientemente específico para la proteasa diana y, por lo tanto, también puede inhibir otras proteasas.

La presente invención proporciona un enfoque alternativo para interferir con el procesamiento proteolítico de proteínas diana. En lugar de diseñar inhibidores de las proteasas, se modifica la propia proteína diana. En la técnica, es conocido modificar un sitio de escisión de proteasa en una proteína diana. Esto se hace normalmente mediante la introducción de mutaciones puntuales en la región de codificación de una proteína. Estas mutaciones típicamente rompen la secuencia de reconocimiento de la proteasa. Estos tipos de modificación generalmente se introducen en una copia de ADNc del gen y esta copia alterada se inserta en el ADN de las células mediante tecnología de ADN recombinante. Aunque esto se puede hacer en el laboratorio, es difícil implementar tales estrategias en la clínica, aunque solo sea porque las aplicaciones de terapia génica que se basan en la introducción de un gen completo no son, en la actualidad, muy eficaces y el gen original asociado con el problema no se elimina.

El presente documento proporciona un método para eliminar un sitio de escisión proteolítica de una proteína que comprende proporcionar una célula que expresa un pre-ARNm que codifica dicha proteína con un oligonucleótido antisentido (AON) que induce la omisión de la secuencia del exón que codifica dicho sitio de escisión proteolítica, comprendiendo el método además permitir la traducción del ARNm producido a partir de dicho pre-ARNm. Un método de la invención es particularmente útil para eliminar sitios de escisión proteolítica de proteínas. No requiere la eliminación o modificación del gen en sí, sino que evita la incorporación del código genético para el sitio de escisión proteolítica en la región de codificación de la proteína en el ARNm maduro. De esta manera el proceso es reversible. El oligonucleótido tiene una vida útil finita en la célula y, por lo tanto, tiene un efecto finito en la eliminación. Otra ventaja es que la eliminación no es absoluta. Por lo general, no todos los pre-ARNm que codifican la proteína diana generada por la célula están dirigidos. Es posible lograr altos niveles de omisión. La eficiencia de omisión depende, por ejemplo, del objetivo particular, la secuencia de exón particular a omitir, el diseño de AON particular y/o la cantidad de AON utilizada. Los porcentajes de omisión se expresan típicamente como la proporción de ARNm que no tiene la parte codificante del sitio de escisión proteolítica (ARNm omitido) frente a la suma de ARNm omitido y ARNm no modificado que codifica la proteína diana no modificada (ARNm no modificado). La posibilidad de adaptar el porcentaje de omisiones es ventajosa. Por ejemplo, cuando la proteína no modificada está asociada con un fenotipo tóxico, pero también tiene una función positiva que desempeñar que la proteína modificada no realiza (también). Al eliminar el sitio de escisión proteolítica solo de una fracción de la proteína formada, es posible reducir la propiedad tóxica mientras se deja la función positiva o deseada de la proteína no modificada al menos parcialmente intacta.

La presente invención modula el empalme de un pre-ARNm en un ARNm de tal manera que una secuencia de exones que codifica un sitio de escisión proteolítica que está presente en los exones codificados por el pre-ARNm no se incluye en el ARNm maduro producido a partir del pre-ARNm. La proteína que posteriormente se traduce a partir de este ARNm no contiene el sitio de escisión proteolítica. Por lo tanto, la invención no elimina realmente un sitio de escisión proteolítica de una proteína que ya se ha formado. Más bien promueve la producción de una nueva proteína que no contiene el sitio de escisión proteolítica. Sin embargo, cuando se considera una célula como una entidad en la que la síntesis y la degradación de proteínas se encuentran en equilibrio, el resultado de un método de la invención puede verse como la eliminación de un sitio de escisión proteolítica de una proteína. La proteína diana no modificada se reemplaza gradualmente por la proteína diana que no contiene el sitio de escisión proteolítica. Por lo tanto, la divulgación también proporciona un método para producir una célula que contiene una proteína modificada que carece de un sitio de escisión proteolítica cuando se compara con la proteína no modificada codificada en el genoma, el método comprende proporcionar una célula que expresa un ARNm previo que codifica dicha proteína con un AON que induce la omisión de la secuencia del exón o parte de la secuencia del exón que codifica dicho sitio de escisión proteolítica, comprendiendo además el método permitir la traducción del ARNm producido a partir de dicho ARNmp previo en dicha célula. El nuevo ARNm del que se elimina la secuencia de codificación para el sitio de escisión proteolítica es una secuencia de codificación acortada o más pequeña que codifica una versión más corta o más pequeña de la proteína no modificada. A menudo, la proteína modificada es una versión eliminada internamente de la proteína no modificada en la que la eliminación interna se rompe al menos y, preferiblemente, elimina el sitio de escisión proteolítica.

Los oligonucleótidos antisentido son conocidos en la técnica. El documento WO2007/089584 describe la disminución de la expresión del gen Huntingtina con oligonucleótidos. El documento WO2008/018795 describe oligonucleótidos que se dirigen a secuencias repetitivas.

La modulación de empalme antisentido (también conocida como omisión de exón) es uno de los campos donde los AON han sido capaces de cumplir con sus expectativas. En este enfoque, los AON se implementan para facilitar el empalme críptico, para cambiar los niveles de genes empalmados alternativamente o, en el caso de distrofia muscular de Duchenne (DMD), para omitir un exón con el fin de restaurar un marco de lectura interrumpido. Esta última permite la generación de proteínas distrofínicas eliminadas internamente, pero en gran parte funcionales, y convertiría una DMD grave en un fenotipo de distrofia muscular Becker más leve. De hecho, la omisión de exón es actualmente una de las herramientas terapéuticas más prometedoras para la DMD, y recientemente se ha completado un exitoso ensayo en primera persona. La omisión de exón se ha descrito en los documentos WO02/24906, WO2004/083432, WO2004/083446, WO2007/123402, David et al. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 2010 95: 3542­ 3546, y Rossi et al. ed., "Oligonucleotide Therapeutics". Annals of the New Your Academy of Sciences 2009.

La modulación mediada por antisentido del empalme se ha diversificado desde su primera introducción y ahora son posibles muchos tipos diferentes de manipulaciones. Aparte de la omisión de exón clásica, donde típicamente se omite un exón completo del ARNm maduro, es posible, por ejemplo, omitir una parte de un exón y también es posible la inclusión de exones. Esto último ocurre cuando los AON dirigidos a las secuencias de intrones apropiadas se acoplan al extremo comercial de las proteínas SR.

La omisión de exón se ha usado para restaurar el empalme críptico, para cambiar los niveles de genes empalmados alternativamente, y para restaurar los marcos de lectura abiertos interrumpidos. Este enfoque se ha empleado con varios genes que incluyen apolipoproteína B, Bcl-X, colágeno tipo 7, distrofina, disferlina, antígeno de membrana específico de la próstata, receptor de IL-5 alfa, MyD88, Tau, receptor de TNFalpha2, Titin, WT1, beta-globulina, y CFTR. Por consiguiente, en realizaciones preferidas, se proporcionan métodos para eliminar un sitio de escisión proteolítica de una proteína, en la que la proteína no es apolipoproteína B, Bcl-X, colágeno tipo 7, distrofina, disferlina, antígeno de membrana específico de la próstata, receptor de IL-5 alfa, MyD88, Tau, receptor de TNFalpha2, Titin, WT1, beta-globulina o CFTR, más preferiblemente es la proteína no la distrofina.

En contraste con los usos anteriores para la omisión de exón, la presente invención proporciona un método para eliminar un sitio de escisión proteolítica con el fin de tratar a un individuo, restaurar la función de una proteína o reducir la toxicidad de una proteína. Los métodos y oligonucleótidos descritos en el presente documento son particularmente útiles para eliminar sitios de escisión proteolítica de una proteína, en la que la proteína está implicada en un trastorno neurogenerador.

La prevención de la inclusión de una parte codificante para un sitio de escisión proteolítica en ARNm maduro se logra en la presente invención típicamente mediante omisión de exón. Los oligonucleótidos antisentido para la omisión de exón generalmente permiten la omisión de un exón o la parte 5' o 3' de la misma. Los oligonucleótidos antisentido pueden dirigirse hacia el sitio de empalme 5', el empalme 3', a ambos sitios de empalme, a uno o más sitios internos de exón y a secuencias de intrones, por ejemplo, específicos para el punto de ramificación. Este último permite omitirse el exón corriente arriba.

La omisión de los nucleótidos que codifican para el sitio de escisión proteolítica se logra típicamente saltándose el exón que contiene los nucleótidos que codifican para el sitio de escisión proteolítica. El sitio de escisión proteolítica comprende la secuencia de reconocimiento para la proteasa específica y los dos aminoácidos entre los que la proteasa escinde el enlace peptídico. El sitio de escisión proteolítica puede superponerse al límite de dos exones adyacentes o, si se omite una parte del exón, se superpone la secuencia del exón que contiene la secuencia aceptora/donante de empalme críptica. En esta realización, se prefiere omitir la secuencia de exones que codifica el enlace peptídico que se escinde por la proteasa. El hecho de que una secuencia de reconocimiento de una proteasa se use o no en la naturaleza depende no solo de la presencia de la secuencia de reconocimiento en sí, sino también de la ubicación del sitio en la proteína plegada. Un sitio de reconocimiento ubicado internamente no suele utilizarse en la naturaleza. En la presente invención, un sitio de escisión proteolítica es un sitio de escisión proteolítica activa que se utiliza realmente en la naturaleza.

La omisión del exón que contiene los nucleótidos que codifican el sitio de escisión proteolítica se logra preferiblemente por medio de un AON que se dirige hacia una secuencia interna del exón. Se dice que un oligonucleótido se dirige hacia una secuencia interna del exón si la región de complementariedad que contiene la identidad de la secuencia con el complemento inverso del pre-ARNm objetivo está dentro del límite del exón. Actualmente, todos los exones que han sido dirigidos por medio de omisión de exón pueden ser inducidos a omitirse del ARNm maduro. A menudo con un AON y en algún momento con dos AON dirigidos hacia el exón. Sin embargo, no todos los AON que pueden diseñarse inducen cantidades detectables de omisiones. La mayor experiencia con la omisión de exón se ha adquirido en el sistema DMD. Por ejemplo, tanto Wilton et al. Molecular Therapy 2007 15: 1288-1296 y Spitali et al., Human Mutation 200930: 1527-1534 describen la omisión de exones para eliminar los exones que contienen una mutación sin sentido o de cambio de marco en la distrofina.

Mediante el uso de AON dirigido hacia secuencias internas de exones, se ha demostrado que todos los exones pueden omitirse (con la excepción, por supuesto, del primero y el último exón). Sin embargo, no todos los AON diseñados contra una secuencia interna de exón inducen realmente cantidades detectables de omisión del exón objetivo. La frecuencia de AON interno a exón seleccionado al azar que induce a omitir es de alrededor del 30%, dependiendo del exón real al que se dirige. Sin embargo, desde los primeros ensayos, la experiencia obtenida de AON que indujo con éxito a omitir se ha traducido en una mejora significativa de la relación de éxito de un AON diseñado (PMID: 18813282 Aartsma-Rus et al Mol Ther 17(3): 548 (2009) Los factores que mejoran la relación de éxito incluyen, entre otros: la estructura predicha del ARN del exón en el sitio objetivo, la secuencia exacta dirigida y la presencia o ausencia pronosticada de sitios de unión a proteínas SR específicas en el sitio objetivo (ibídem).

La omisión de una secuencia de exones que codifica para un sitio de escisión proteolítica es preferiblemente tal que los aminoácidos corriente abajo de la proteína diana están presentes en la proteína recién formada. De esta manera, el sitio de escisión proteolítica se elimina y deja intacta gran parte de la proteína corriente abajo. En esta realización, la funcionalidad de la proteína modificada es al menos parte de la funcionalidad de la proteína presente en individuos normales. Así, preferiblemente, la proteína modificada contiene una eliminación "en marco" del sitio de escisión proteolítica. Preferiblemente, dicha proteína eliminada "en marco" tiene al menos un 20%, preferiblemente al menos un 50% de la funcionalidad de la proteína no modificada en un individuo normal. Por lo tanto, en una realización preferida, el número de nucleótidos que se omite se puede dividir en tres. La omisión de una secuencia de exones que codifica un sitio de escisión proteolítica se logra típicamente al omitir el exón que contiene esta secuencia. La omisión del exón objetivo es suficiente si este exón contiene una cantidad de nucleótidos que es divisible por tres. Si el exón contiene otro número, se prefiere también omitir un exón adyacente, de manera que el número total de nucleótidos omitidos sea nuevamente divisible entre tres. En la mayoría de los casos, la omisión de un exón adyacente es suficiente, sin embargo, si esto tampoco resulta en un número de nucleótidos omitidos que es divisible en tres, puede ser necesario omitir otro exón adicional, adyacente a los dos mencionados. Es posible omitirse cuatro o más exones, pero a menudo no produce mucha de la proteína correcta. A veces es posible omitir solo una parte de un exón. Esta es la parte 5' de la parte 3' del exón. Esto ocurre cuando el exón contiene un sitio de empalme de 3' o 5' críptico que se puede activar.

El término pre-ARNm se refiere a un ARNm precursor no procesado o parcialmente procesado que se sintetiza a partir de una plantilla de ADN en el núcleo de la célula mediante transcripción. En el contexto de la invención, inducir y/o promover la omisión de una secuencia de exones que codifica un sitio de escisión proteolítica como se indica aquí significa que al menos el 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más del ARNm que codifica la proteína diana en una célula no contendrá la secuencia de exón omitida (ARNm modificado (modificado+no modificado)). Esto se evalúa preferiblemente mediante PCR como se describe en los ejemplos.

Un AON de la invención que induce la omisión de una secuencia de exón que codifica un sitio de escisión proteolítica, comprende preferiblemente una secuencia que es complementaria a dicho exón. En algunas realizaciones, el AON induce a omitir un exón en su totalidad. En otras realizaciones, el AON induce la omisión de una parte de un exón, preferiblemente, dicha parte codifica un sitio de escisión proteolítica. Preferiblemente, la AON contiene un estiramiento continuo de entre 8-50 nucleótidos que es complementario al exón. Un AON de la invención comprende preferiblemente un tramo de al menos 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 nucleótidos que es complementario de dicho exón. En una realización preferida, dicha AON contiene un tramo continuo de entre 12-45 nucleótidos que es complementario al exón. Más preferiblemente un tramo de entre 15-41 nucleótidos. Dependiendo de la modificación química introducida en el AON, el estiramiento complementario puede estar en el lado más pequeño del rango o en el lado más grande. Un oligonucleótido antisentido preferido de acuerdo con la invención comprende un oligonucleótido antisentido de fosforotioato de alquilo T-O, tal como ribosa modificada con 2'-O-metilo (ARN), ribosa modificada con 2'-0-etilo, ribosa modificada con 2'-O-propilo, y/o derivados sustituidos de estas modificaciones, tales como derivados halogenados. Un AON más preferido de acuerdo con la invención comprende de 2'-0-metilfosforotioato ribosa. Dichos AON normalmente no necesitan tener un tramo complementario muy grande. Dicha AON contiene típicamente un tramo de entre 15-25 nucleótidos complementarios. Como se describe a continuación en el presente documento, otra AON preferida de la invención comprende un esqueleto de morfolino. Los AON que comprenden dichos esqueletos suelen contener tramos de complementariedad algo mayores. Dicha AON contiene típicamente un tramo de entre 25­ 40 nucleótidos complementarios. Cuando en esta invención se hace referencia al rango de nucleótidos, este rango incluye el(los) número(s) mencionado(s). Así, a modo de ejemplo, cuando se hace referencia a un tramo de entre 8­ 50, este incluye 8 y 50.

Una AON de la invención que es complementaria a un ARN diana es capaz de hibridarse con el ARN diana en condiciones rigurosas. Típicamente, esto significa que el complemento inverso de la AON es al menos el 90% y preferiblemente al menos el 95% y más preferiblemente al menos el 98% y lo más preferiblemente al menos el 100% idéntico a la secuencia de nucleótidos de la diana en el sitio objetivo. Un AON de la invención, por lo tanto, tiene preferiblemente dos o menos desajustes con el complemento inverso del ARN diana, preferiblemente tiene uno o ningún desajuste con el complemento inverso del ARN diana. En otra realización preferida, el AON puede diseñarse específicamente para tener uno o más desajustes, preferiblemente uno o dos desajustes, por ejemplo. en los casos en que es necesario reducir la afinidad cuando la omisión de la AON complementaria al 100% es más efectiva de lo que se desea biológicamente en vista de la actividad restante de la proteína necesaria. Una falta de coincidencia se define aquí como un nucleótido o análogo de nucleótido que no tiene la misma capacidad de apareamiento de bases en especie, no necesariamente en cantidad, como el nucleótido al que reemplaza. Por ejemplo, la base de uracilo que reemplaza a una timina y viceversa, no es una falta de coincidencia. Una falta de coincidencia preferido comprende una inosina. Un nucleótido inosina es capaz de emparejarse con cualquier base natural en un ARN, es decir, capaz de emparejarse con un A, C, G o U en el ARN diana.

En una realización preferida, el análogo de nucleótido o equivalente comprende un esqueleto modificado. Ejemplos de tales esqueletos son proporcionados por esqueletos de morfolino, esqueletos de carbamato, esqueletos de siloxano, esqueletos de sulfuro, sulfóxido y sulfona, esqueletos de formacetilo y tioformacetilo, esqueletos de metilenformacetilo,

esqueletos del riboacetilo, esqueletos que contienen alquenos, esqueletos de sulfamato, sulfonato y sulfonamida, esqueletos de metilenimino y metilendihidrazino, y esqueletos de amida. Los oligómeros de morfolino fosforodiamidato son oligonucleótidos del esqueleto modificado que se han investigado previamente como agentes antisentido. Los oligonucleótidos morfolinos tienen un esqueleto no cargado en donde el azúcar desoxirribosa del ADN se reemplaza por un anillo de seis miembros y el enlace fosfodiéster se reemplaza por un enlace fosforodiamidato. Los oligonucleótidos morfolinos son resistentes a la degradación enzimática y parecen funcionar como agentes antisentido al detener la traducción o interferir con el corte y empalme del ARNm antes que mediante la activación de los oligonucleótidos de la RNasa H. Los oligonucleótidos morfolinos se han administrado con éxito a células de cultivo tisular mediante métodos que interrumpen físicamente la membrana celular, y un estudio que comparó varios de estos métodos encontró que la carga de raspado era el método de administración más eficiente; sin embargo, debido a que el esqueleto de morfolino no está cargado, los lípidos catiónicos no son mediadores efectivos de la captación de oligonucleótidos de morfolino en las células. Un informe reciente demostró la formación de tríplex por un oligonucleótido morfolino y, debido al esqueleto no iónico, estos estudios demostraron que el oligonucleótido morfolino era capaz de formar triplex en ausencia de magnesio. Normalmente se prefiere un esqueleto modificado para aumentar la resistencia a la nucleasa de la AON, el ARN diana o el híbrido de AON/ARN diana o una combinación de los mismos. También se puede preferir un esqueleto modificado debido a su afinidad alterada por la secuencia diana en comparación con un esqueleto no modificado. Un esqueleto no modificado puede ser ARN o ADN, preferiblemente es un esqueleto de ARN.

Además, se prefiere que el enlace entre los residuos en un esqueleto no incluya un átomo de fósforo, tal como un enlace que esté formado por enlaces internucleósidos de alquilo de cadena corta o cicloalquilo, heteroátomo mixto y enlaces internucleósidos de alquilo o cicloalquilo, o uno o más enlaces internucleosídicos heterocíclicos o heterocíclicos de cadena corta.

Un análogo de nucleótido preferido o equivalente comprende un ácido nucleico peptídico (PNA), que tiene un esqueleto de poliamida modificado (Nielsen, et al. (1991) Science 254, 1497-1500). Las moléculas basadas en PNA son verdaderas imitaciones de las moléculas de ADN en términos de reconocimiento de pares de bases. El esqueleto del PNA está compuesto por unidades de 7V-(2-aminoetil)-glicina unidas por enlaces peptídicos, en donde las nucleobases están unidas al esqueleto por enlaces metilencarbonilo. Un esqueleto alternativo comprende un monómero de PNA de pirrolidina extendida de un solo carbono (Govindaraju and Kumar (2005) Chem. Commun, 495­ 497). Como el esqueleto de una molécula de PNA no contiene grupos fosfato cargados, los híbridos de PNA-ARN son generalmente más estables que los híbridos de ARN-ARN o ARN-ADN, respectivamente (Egholm et al (1993) Nature 365, 566-568).

Un esqueleto preferido adicional comprende un análogo de nucleótido de morfolino o equivalente, en donde el azúcar ribosa o desoxirribosa se reemplaza por un anillo de morfolino de 6 miembros. Un análogo de nucleótido más preferido o un equivalente comprende un fosforodiamidato de morfolino oligómero (PMO), en donde el azúcar ribosa o desoxirribosa se reemplaza por un anillo de morfolino de 6 miembros, y el enlace fosfodiéster aniónico entre los anillos morfolino adyacentes se reemplaza por un enlace fosforodiamidato no iónico.

En otra realización adicional, un análogo de nucleótido o equivalente de la invención comprende una sustitución de uno de los oxígenos que no forman puentes en el enlace fosfodiéster. Esta modificación desestabiliza ligeramente el apareamiento de bases, pero agrega una resistencia significativa a la degradación de las nucleasas. Un análogo de nucleótido o equivalente preferido comprende fosforotioato, fosforotioato quiral, fosforoditioato, fosfotriéster, aminoalquilfosfotriéster, H-fosfonato, metilo y otro alquilfosfonato, incluyendo 3'-alquileno fosfonato, 5'-alquileno fosfonato y fosfato quiral, fosfinato, fosforamidato que incluye 3'-amino fosforamidato y aminoalquilfosforamidato, tionofosforamidato, tioalquilfosfonato, tioalquilfosfotriéster, selenofosfato o boranofosfato.

Un análogo de nucleótido preferido adicional o equivalente de la invención comprende una o más unidades estructurales de azúcar que están mono- o disustituidos en la posición 2', 3' y/o 5' tal como un -OH; -F; alquilo (Cl-ClO), alquenilo, alquinilo, alcarilo, alilo, arilo o aralquilo inferior sustituido o no sustituido, que puede estar interrumpido por uno o más heteroátomos; O-, S- o N-alquilo; O-, S- o N-alquenilo; O-, S- o N-alquinilo; O-, S- o N-alilo; O-alquil-0-alquilo, -metoxi, -aminopropoxi; -aminoxi; metoxietoxi; -dimetilaminooxietoxi; y -dimetilaminoetoxietoxi. La unidad estructural azúcar puede ser una piranosa o un derivado de la misma, o una desoxipiranosa o un derivado de la misma, preferiblemente una ribosa o un derivado de la misma, o una desoxirribosa o un derivado de la misma. Dichas unidades estructurales de azúcar derivados preferidos comprenden ácido nucleico bloqueado (LNA), en donde el átomo de carbono 2' está unido al átomo de carbono 3' o 4' del anillo de azúcar formando así una unidad estructural de azúcar bicíclico. Un LNA preferido comprende ácido nucleico con puente 2'-0,4'-C-etileno (Morita et al. 2001. Nucleic Acid Res Supplement No. 1: 241-242). Estas sustituciones hacen que el análogo de nucleótido o equivalente RNasa H y nucleasa sean resistentes y aumenten la afinidad por el ARN diana. Como es evidente para un experto en la técnica, las sustituciones proporcionadas en este documento hacen que el complejo de doble cadena del oligonucleótido antisentido con su pre-ARNm objetivo sea la ARNasa H resistente. Por consiguiente, los oligonucleótidos preferidos se unen al pre-ARNm de dicha proteína para formar un complejo de ácido nucleico de doble cadena y se modifican químicamente para hacer que dicho complejo de ácido nucleico de doble cadena sea resistente a RNAsa H.

Un experto en la materia entiende que no es necesario que todas las posiciones en un oligonucleótido antisentido se modifiquen uniformemente. Además, más de uno de los análogos o equivalentes mencionados anteriormente pueden incorporarse en un oligonucleótido antisentido único o incluso en una posición única dentro de un oligonucleótido antisentido. En ciertas realizaciones, un oligonucleótido antisentido de la invención tiene al menos dos tipos diferentes de análogos o equivalentes.

Como se mencionó anteriormente en este documento, un AON preferido de acuerdo con la invención comprende un oligonucleótido antisentido de fosforotioato de alquilo T-O, tal como ribosa modificada en 2'-O-metilo (ARN), ribosa modificada en 2'-0-etilo, 2'-O- ribosa modificada con propilo, y/o derivados sustituidos de estas modificaciones, tales como derivados halogenados. Un AON más preferido de acuerdo con la invención comprende de 2'-0-metilfosforotioato ribosa.

Una AON de la invención se puede enlazar a un unidad estructural que mejora la captación del oligonucleótido antisentido en las células. Ejemplos de tales fracciones son colesteroles, carbohidratos, vitaminas, biotina, lípidos, fosfolípidos, péptidos que penetran en las células, que incluyen pero no se limitan a antennapedia, TAT, transportano y aminoácidos cargados positivamente, como oligoarginina, poliarginina, oligolisina o polisisina, dominios de unión a antígeno tales como los proporcionados por un anticuerpo, un fragmento Fab de un anticuerpo, o un dominio de unión a antígeno de cadena única, tal como un dominio de unión a antígeno de dominio único cameloide.

Preferiblemente, se usan secuencias flanqueantes adicionales para modificar la unión de una proteína a dicha AON, o para modificar una propiedad termodinámica de la AON, más preferiblemente para modificar la afinidad de unión al ARN diana.

La administración de AON en humanos es típicamente bien tolerada. Las manifestaciones clínicas de la administración de AON en ensayos clínicos en humanos se han limitado a los efectos secundarios locales después de la inyección subcutánea (SC) (en general, la administración intravenosa (iv) parece ser mejor tolerada) y los efectos secundarios generalizados, como fiebre y escalofríos, similares a la respuesta a la administración de interferón, responde bien al paracetamol. Más de 4000 pacientes con diferentes trastornos han sido tratados hasta el momento mediante el suministro sistémico de AON de primera generación (esqueleto de fosforotioato), y aproximadamente 500 después de la administración local. La dosis típica utilizada varió de 0.5 mg/kg cada dos días durante 1 mes en la enfermedad de Crohn, a 200 mg dos veces a la semana durante 3 meses en la artritis reumatoide, a dosis más altas de 2 mg/kg por día en otros protocolos relacionados con tumores malignos. Hasta el momento, se han tratado menos pacientes (aproximadamente 300) utilizando AON de nueva generación (esqueleto fosforotioado uniforme con ala 2'-metoxietoxi flanqueante) administrada sistémicamente a dosis comprendidas entre 0.5 y 9 mg/kg por semana durante hasta 3 semanas.

La administración de AON a las células del cerebro se puede lograr por diversos medios. Por ejemplo, pueden administrarse directamente al cerebro a través de una inoculación intracerebral (Schneider et al, journal of Neuroimmunology 195 (2008) 21-27), infusión intraparenquimatosa (Broaddus et al., J Neurosurg. 1998 Apr; 88(4): 734-42), intratecal o intraventricular. Alternativamente, la AON se puede acoplar a un anticuerpo de dominio único o al dominio variable del mismo (VHH) que tiene la capacidad de pasar la barrera hematoencefálica. También se ha utilizado nanotecnología para administrar oligonucleótidos al cerebro, por ejemplo, un nanogel que consiste en PEG entrecruzado y polietilenimina. La encapsulación de AON en liposomas también es bien conocida por los expertos en la técnica.

Un AON de la invención comprende preferiblemente una secuencia que es complementaria a parte de dicho pre-ARNm como se define en el presente documento. En una realización más preferida, la longitud de dicha parte complementaria de dicho oligonucleótido es de al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 nucleótidos. Preferiblemente, se usan secuencias flanqueantes adicionales para modificar la unión de una proteína a dicha molécula u oligonucleótido, o para modificar una propiedad termodinámica del oligonucleótido, más preferiblemente para modificar la afinidad de unión al ARN diana. Un AON de la invención puede comprender además nucleótidos adicionales que no son complementarios al sitio diana en el pre-ARNm diana. En una realización preferida, una AON contiene entre 8-50 nucleótidos. Un AON de la invención comprende preferiblemente un tramo de al menos 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 nucleótidos. En una realización preferida, dicha AON contiene un tramo continuo de entre 12-45 nucleótidos, más preferiblemente un tramo de entre 15-41 nucleótidos. Dependiendo de la química del esqueleto como se indica aquí anteriormente, un AON de la invención contiene entre 15-25 nucleótidos. Un AON de la invención con un esqueleto de morfolino contiene típicamente un tramo de entre 25-40 nucleótidos. En una realización preferida, las cantidades indicadas para el número de nucleótidos en el AON se refieren a la longitud de la complementariedad al pre-ARNm objetivo, preferiblemente a una secuencia interna del exón, sin embargo, la secuencia objetivo también puede ser un 5' o un 3' sitio de empalme de un exón o una secuencia de intrón, tal como preferiblemente un punto de ramificación. En otra realización preferida, las cantidades indicadas se refieren al número total de nucleótidos en la AON.

Preferiblemente, la parte complementaria es al menos el 50% de la longitud del oligonucleótido de la invención, más preferiblemente al menos el 60%, incluso más preferiblemente al menos el 70%, incluso más preferiblemente al menos el 80%, incluso más preferiblemente al menos 90% o incluso más preferiblemente al menos 95%, o incluso más preferiblemente 98% y lo más preferiblemente hasta el 100% de la longitud del oligonucleótido de la invención, con la supuesta excepción de desajustes específicos introducidos deliberadamente, por ejemplo para disminuir la afinidad cuando sea necesario.

Con respecto a los AON que también contienen nucleótidos adicionales, el número total de nucleótidos normalmente no excede de 50, y los nucleótidos adicionales varían preferiblemente entre 5-25, preferiblemente de 10-25, más preferiblemente de 15-25. Los nucleótidos adicionales típicamente no son complementarios al sitio objetivo en el pre-ARNm pero pueden ser complementarios a otro sitio en dicho pre-ARNm o pueden tener un propósito diferente y no ser complementarios al pre-ARNm objetivo, es decir, menos de 95 % de identidad de secuencia de los nucleótidos adicionales al complemento inverso del pre-ARNm diana.

El sitio de escisión proteolítica que debe eliminarse de una proteína mediante un método o AON de la invención es preferiblemente un sitio de escisión de endoproteasa de serina, un sitio de escisión de metaloendopeptidasa, un sitio de escisión de secretasa y/o un sitio de escisión de caspasa. En una realización particularmente preferida, dicho sitio de escisión es un sitio de escisión de caspasa o sitio de escisión de secretasa. Las caspasas son una familia de cisteína proteasas intracelulares que juegan un papel central en el inicio y la ejecución de la muerte celular programada. El término caspasas es una forma corta para las proteasas específicas de cisteína-aspartato: su actividad catalítica depende de un residuo de cisteína crítico dentro de un pentapéptido QACRG de sitio activo altamente conservado, y las caspasas escinden específicamente sus sustratos después de los residuos de Asp (también la serina-proteasa granzima B tiene especificidad por Asp en la posición P1 de los sustratos). Se han identificado más de diez miembros diferentes de la familia de las caspasas en los mamíferos. De acuerdo con una nomenclatura unificada, las caspasas se mencionan en el orden de su publicación: por lo tanto, la caspasa-1 es ICE (interleuquina-1beta que convierte la enzima), la primera proteasa de cisteína específica para el aspartato descrita. La familia de proteasas secretasa se subdivide en tres grupos, las alfa, beta y gamma secretasas. En una realización preferida, dicha secretasa es una gamma-secretasa.

La proteína a partir de la cual se debe eliminar el sitio de escisión proteolítica puede ser cualquier proteína que contenga un sitio de escisión proteolítica. En una realización preferida, dicha proteína es una proteína de mamífero, más preferiblemente una proteína de primate. En una realización particularmente preferida, dicha proteína es una proteína humana. En una realización preferida, dicha proteína está asociada con una enfermedad en seres humanos. En una realización particularmente preferida, dicha proteína está asociada con una enfermedad de repetición de tripletes en seres humanos. Preferiblemente, una enfermedad de repetición de poliglutamina.

En una realización preferida, dicha proteína comprende un sitio de escisión de caspasa o un sitio de escisión de secretasa. Preferiblemente, la proteína comprende un sitio de escisión proteolítica de caspasa-3 o -6. Preferiblemente, la proteína es una proteína que normalmente está presente en el cerebro de un mamífero. En una realización particularmente preferida, el gen que codifica dicha proteína es un gen mutante que codifica una expansión de repetición de trinucleótidos cuando se compara con el gen de un individuo normal.

En una realización particularmente preferida, dicha proteína es una proteína codificada por uno de los genes enumerados en la tabla 1a o 1b. En una realización particularmente preferida, dicho gen es un gen mutante que es el gen causante de un trastorno de poliglutamina, preferiblemente un gen de la tabla 1a. En una realización particularmente preferida, dicho gen es el gen de la huntingtina (Htt). La Htt se expresa en todas las células de mamíferos. Las concentraciones más altas se encuentran en el cerebro y los testículos, con cantidades moderadas en el hígado, el corazón y los pulmones. La función de Htt en humanos aún no está completamente resuelta. La Htt interactúa, entre otras, con proteínas que intervienen en la transcripción, la señalización celular y el transporte intracelular. En los seres humanos, el gen, y en particular los mutantes del mismo, está asociado con la enfermedad de Huntington (HD). La HD es un trastorno genético neurodegenerativo progresivo, que afecta el movimiento muscular y la coordinación muscular y conduce al deterioro cognitivo y la demencia. Normalmente se hace notable en la mediana edad. La HD es la causa genética más común de los movimientos retorcidos involuntarios anormales llamados corea y es mucho más común en personas de ascendencia de Europa occidental que en Asia o África. La enfermedad es causada por una mutación autosómica dominante del gen Htt. Un hijo de un padre afectado tiene un riesgo del 50% de heredar la enfermedad.

Para el gen Htt, se prefiere que el sitio de escisión proteolítica de caspasa-6 codificado por el exón Htt, el exón 12 se elimine de la proteína Huntingtina. Se prefiere que la región de codificación que codifica el sitio de escisión proteolítica se elimine "en marco", para permitir la incorporación de la secuencia de aminoácidos corriente abajo normal en la proteína mutante. En una realización, dicha eliminación "en marco" se logra al proporcionar a la célula un AON que permite omitir el exón 12 y un AON que permite omitir el exón 13 del gen Htt. En otra realización preferida, dicha eliminación "en marco" se logra al proporcionar a la célula un AON capaz de inducir el omisión de exón dirigido hacia la región delimitada por los nucleótidos 269-297 del exón 12 del gen Htt. En una realización preferida, dicha AON se dirige hacia la región delimitada por los nucleótidos 207 hasta el 341 del exón 12. Se prefiere que dicha AON esté dirigida hacia la región interna delimitada por los nucleótidos 207 hasta el 341 del exón 12. Esto incluye los nucleótidos 207 y 341. Se ha encontrado en la presente invención que la AON dirigida hacia las regiones preferidas induce la omisión de los últimos 135 nucleótidos del exón 12, lo que produce una eliminación completa "en marco" de dos sitios activos de escisión de la caspasa 3 en el aminoácido 513 y 552, y eliminación del primer aminoácido de un sitio activo de caspasa 6 ubicado parcialmente en el exón 12 y parcialmente en el exón 13. El AON HDEx12_1 (tabla 2) activa un sitio de empalme críptico en el nucleótido 206 en el exón 12, lo que lleva a la ausencia de la unidad estructural del exón 12 del ARNm formado.

La invención proporciona además un ARNm de Htt modificado aislado y/o recombinante que tiene una eliminación de al menos los nucleótidos 207 hasta el 341 del exón 12. El ARNm de Htt modificado comprende preferiblemente los exones 1-11, los primeros 206 nucleótidos del exón 12 y exones 13-67. En otra realización preferida, dicho ARNm de Htt modificado comprende los exones 1-11, 14-67.

En otra realización, la invención comprende una proteína Htt modificada aislada y/o recombinante que comprende una eliminación de los aminoácidos 538-583. La proteína Htt modificada comprende preferiblemente la secuencia de aminoácidos codificada por los exones 1-11, los primeros 206 nucleótidos del exón 12 y los exones 13-67. En otra realización preferida, dicha proteína Htt modificada comprende la secuencia de aminoácidos codificada por los exones 1-11, 14-67.

En otra realización más, la invención proporciona una célula aislada y/o recombinante que comprende un ARNm de Htt modificado y/o una proteína Htt modificada como se indica anteriormente en el presente documento. Preferiblemente, dicha célula comprende un gen Htt que comprende una región codificante de una repetición de poliglutamina, cuya longitud está asociada con la HD.

Para el gen ATXN3 se prefiere que los sitios de escisión de caspasa en el exón 7 se eliminen de la proteína. Se prefiere que la región de codificación que codifica el sitio de escisión proteolítica se elimine "en marco", para permitir la incorporación del aminoácido corriente abajo normal en la proteína mutante. En una realización, dicha eliminación "en marco" se logra al proporcionar a la célula un AON que permite omitir el exón 7 y un AON que permite omitir el exón 8 del gen ATXN3.

Para el gen ATN1, se prefiere que el sitio de escisión de la caspasa 3 cerca del extremo N de la proteína y el tracto de poliglutamina (106DSLD109) en el exón 5 se elimine de la proteína. Se prefiere que la región de codificación que codifica el sitio de escisión proteolítica se elimine "en marco", para permitir la incorporación del aminoácido corriente abajo normal en la proteína mutante. En una realización, dicha eliminación "en marco" se logra al proporcionar a la célula un AON que permite omitir el exón 5 y un AON que permite omitir el exón 6 del gen ATN1. En una realización preferida, dicha AON comprende una secuencia como se representa en la tabla 2 bajo DPRLA AON.

La invención proporciona además un AON de la invención de preferiblemente entre 14-40 nucleótidos que induce la omisión de un exón que codifica un sitio de escisión proteolítica en una proteína. En una realización preferida, la invención proporciona una AON como se indica aquí anteriormente que comprende una secuencia como se representa en la tabla 2. La AON es adecuada para omitir el exón indicado del gen. En una realización particularmente preferida, dicha AON comprende la secuencia de HDEx12_1 de la tabla 2. En otra realización preferida, la invención proporciona una AON como se indica aquí anteriormente que es específica para la región identificada por una secuencia de una AON representada en la tabla 2. En una forma preferida la realización de dicha AON comprende al menos 10 nucleótidos consecutivos de la región identificada por un oligonucleótido como se muestra en la tabla 2. En una realización particularmente preferida, la invención proporciona una AON como se indica aquí anteriormente que es específica para la región identificada por una secuencia de HDEx12_1 de la tabla 2.

La invención proporciona además el uso de omisión de exón en una célula para eliminar un sitio de escisión proteolítica de una proteína. Además, se proporciona el uso de un AON que induce la omisión de un exón que codifica un sitio de escisión proteolítica en una proteína, para eliminar dicho sitio de escisión proteolítica de dicha proteína en una célula que produce un pre-ARNm que codifica dicha proteína. La invención proporciona además un oligonucleótido de entre 14-40 nucleótidos que induce la omisión de un exón que codifica un sitio de escisión proteolítica en una proteína para uso en el tratamiento de una enfermedad que está asociada con un producto de escisión proteolítica de dicha proteína.

En otra realización, la invención proporciona un método para alterar el procesamiento proteolítico de una proteína que comprende un sitio de escisión proteolítica que comprende proporcionar una célula que produce un pre-ARNm que codifica dicha proteína con un AON que es específico para dicha proteína ARNm; y que evita la inclusión del código para dicho sitio de escisión proteolítica en el ARNm maduro producido a partir de dicho pre-ARNm, comprendiendo además el método permitir que la traducción de dicho ARNm produzca la proteína a la que se altera el procesamiento proteolítico.

La invención proporciona además un animal no humano que comprende un oligonucleótido de la invención. Preferiblemente, dicho animal no humano comprende un gen mutante que codifica una expansión de repetición de trinucleótidos cuando se compara con el gen de un individuo normal.

La invención proporciona además una proteína humana modificada a partir de la cual se elimina un sitio de escisión proteolítica mediante omisión de exón. Además, proporciona un ARNm que codifica una proteína humana modificada de la que se elimina un sitio de escisión proteolítica mediante la omisión de exón.

La invención proporciona además una célula que codifica una proteína humana que comprende un sitio de escisión proteolítica, en la que dicha célula contiene un AON de la invención para eliminar dicho sitio de escisión proteolítica de dicha proteína en dicha célula.

La nomenclatura general de las posiciones del sitio de escisión del sustrato fue formulada por Schecter and Berger, 1967-68 [Schechter and Berger, 1967], [Schechter and Berger, 1968]. Designan el sitio de escisión entre P1-P1', incrementando la numeración en la dirección N-terminal del enlace peptídico escindido (P2, P3, P4, etc.). En el lado carboxilo de la numeración del sitio de escisión también se incrementan (P1 ', P2', P3 'etc.).

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Omisión de exón después de la transfección con varias concentraciones HDEx12_1 AON. A) Los fibroblastos HD derivados del paciente se trataron con 1, 25, 150 y 1000 nM HDEx12_1. La p-actina se tomó como control de carga. El aumento de la concentración de AON de 1 nM a 25 nM dio como resultado un mayor porcentaje de omisión de 16% a 92%, según lo medido por Lab-on-a-Chip. El porcentaje de omisión más alto del 95% se obtuvo con 150nM HDEx12_1. Una concentración demasiado alta de AON dio como resultado una omisión ineficiente. En el control de Mock I (solo agente de transfección), no se ve ningún omisión como se esperaba. La potencia de omisión del exón 12 de HDEx12_1 también se observó en otra línea celular de fibroblastos HD y de control y en células de neuroblastoma humano SH-SY5Y. B) Representación esquemática de la PCR de los exones HD de 9 a 14. Se muestran tanto la representación esquemática de los productos del exón 12 omitido (inferior) normales (superiores) como los más cortos.

Figura 2: Curva Log de respuesta de dosis de HDEx12_1 AON en una línea celular de fibroblastos de HD. El eje X muestra la concentración de registro (nM) y el eje y el porcentaje de omisión. El valor inhibitorio máximo medio (lC50) de la HDEx12_1 AON se encontró que era de 40 nM. El porcentaje óptimo de omisión de exón 12 se logró con una concentración de AON de 150 nM y superior. Los resultados se muestran como media ± SEM (n = 2-3).

Figura 3: Secuenciación de Sanger de un producto de PCR normal (A) y omitido (B). La transfección de HDEx12_1 AON en una línea celular de fibroblastos de HD dio como resultado una omisión en el marco de 135 nucleótidos, que corresponde a 45 aminoácidos. La omisión observada se debe a la activación de un sitio de empalme alternativo (Ag | GTRAG, véase cuadro de puntos), lo que resulta en una isoforma de exón de sitio de empalme alternativo. Esta omisión parcial del exón 12 da como resultado la eliminación de un sitio activo de caspasa-3 549DLND552 y la eliminación parcial del primer aminoácido (isoleucina) de un sitio activo de caspasa-6 (583IVLD586).

Figura 4: Secuencia parcial de aminoácidos de la proteína huntingtina. Subrayados están los aminoácidos codificados por el exón 12 y 13. Destacados en rojo es la parte de la proteína que actualmente se omite en el exón 12 AON. En negrita está el sitio 510DSVD513 de caspasa-3, el sitio 549dLnD552 de caspasa-3 y el sitio 583|VLD586 de caspasa-6.

Figura 5: Diagrama esquemático de la huntingtina. A) Diagrama de la proteína htt completa. PolyQ indica el tracto de poliglutamina. Las flechas indican los sitios de escisión de la caspasa y sus posiciones de aminoácidos. B) Parte amino-terminal de la proteína htt. Se representan los exones 1 a 17 de Htt. Las flechas indican los sitios de escisión de la caspasa y sus posiciones de aminoácidos. C) Representación esquemática y secuencia de aminoácidos de los exones 12 y 13 de htt con los motivos de escisión de la caspasa en negrita. Los límites de los exones se muestran con barras verticales de color gris. D) Secuencias parciales de aminoácidos y nucleótidos de htt exón 12 y 13. Los motivos de escisión de la caspasa se representan en negrita y el límite del exón se muestra con una barra gris vertical. La secuencia resaltada en gris claro denota la parte que se omite después del tratamiento con HDEx12_1 AON. Ejemplos

Omisión de exón mediada por AON en enfermedades neurodegenerativas para eliminar los sitios de escisión proteolítica. Omisión de exón mediado por AON en la enfermedad de Huntington para eliminar los sitios de escisión proteolítica de la proteína huntingtina

Métodos

AONs y cebadores

Todos los AON consistían en 2'-O-metil ARN y esqueletos de fosforotioato de longitud completa.

Cultivos celulares y transfección de AON.

Se transfectaron células de fibroblastos de pacientes y células de neuroblastoma humano con AON a concentraciones que oscilaban entre 1-1000 nM usando polietilenemina (PEI) ExGen500 de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con 3.3 j l de PEI por |jg de AON transfectado. Se realizó una segunda transfección 24 horas después de la primera transfección. El ARN se aisló 24 horas después de la segunda transfección y el ADNc se sintetizó utilizando cebadores hexaméricos aleatorios.

Líneas celulares utilizadas:

Control de fibroblastos humanos FLB73

Fibroblasto Humano HD GM04022

Fibroblasto Humano HD GM02173

Control de neuroblastoma SH-SY5Y

La PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) se llevó a cabo utilizando el sistema LightCycler® 480 (Roche), lo que permitió la cuantificación de la expresión génica.

Gel de agarosa y secuenciación de Sanger.

Todos los productos de PCR se ejecutaron en gel de agarosa al 2% con escaleras de 100 pares de bases. Las bandas se aislaron utilizando el kit de purificación de PCR QIAgen® de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Luego, las muestras se secuenciaron mediante la secuenciación de Sanger utilizando el kit Applied Biosystems BigDyeTerminator v3.1.

Lab-on-a-Chip

Se usó la electroforesis automatizada Lab-on-a-Chip para cuantificar los productos de PCR usando un Bioanalizador 2100. Las muestras se fabricaron con 1 parte de producto cebado con B-actina, como una transcripción de referencia, con 5 partes de productos de PCR experimentales. Las muestras se ejecutaron en un chip de ADN 1000.

Inmunoprecipitación Western

La proteína se aisló de las células 72 horas después de la primera transfección y se ejecutó en inmunotransferencias Western, se transfirió a una membrana de PVDF y se realizó una inmunomarcación con anticuerpos primarios que reconocían htt, 1H6 o 4C8 (ambos diluidos 1:1,000)

Materiales

Los AON y los cebadores se obtuvieron de Eurogentec, Lieja, Bélgica.

Secuencias AON:

HDEx12_1: CGGUGGUGGUCUGGGAGCUGUCGCUGAUG

HDEx12 2: UCACAGCACACACUGCAGG

HDEx13_1: GUUCCUGAAGGCCUCCGAGGCUUCAUCA

HDEx13_2: GGUCCUACUUCUACUCCUUCGGUGU

Las líneas celulares de fibroblastos de pacientes GM04022 y GM02173 se obtuvieron de Coriell, Institute for Medical Research, Camden, Estados Unidos y la línea de células de fibroblastos de control FLB73 de Maaike Vreeswijk, LUMC. Resultados

La transfección de AON HDEx12_1 en células de fibroblastos HD y neuroblastoma humano derivadas de paciente mostró una omisión eficaz (ver Fig. 1) del exón 12. El porcentaje óptimo de omisión del exón 12 se logró con una concentración de 150 nM, pero ya se observó una omisión a 1 nM (ver Fig. 2). La secuenciación de Sanger confirmó que los últimos 135 nucleótidos del exón 12 se omitieron después de la transfección de las células con AON HDEx12_1. Esto correspondió a la eliminación de 45 aminoácidos que contienen dos sitios activos de caspasa 3 y el primer aminoácido de un sitio activo de caspasa 6 (ver Fig. 3 y 4). El análisis in silico reveló que la omisión observada es probable debido a la activación del sitio de empalme alternativo AG | GTRAG que resulta en una isoforma de exón de sitio de empalme alternativa (ver Fig. 3).

Conclusiones

Con AON HDEx12_1 se ha mostrado una omisión parcial del exón 12 de la transcripción de la huntingtina que resulta en un producto de proteína truncado pero en marco. Usando diferentes líneas celulares, se ha confirmado esta omisión parcial del exón 12 mediante la secuenciación de Sanger y el análisis in silico reveló un sitio de empalme alternativo en el exón 12 que probablemente sea la causa de esta omisión parcial. Este producto de proteína omitido pierde dos sitios completos de escisión de la caspasa-3 ubicados en el exón 12, y el primer aminoácido del sitio de escisión de la caspasa-6 que se encuentra en el borde del exón 12 y 13. Datos recientes de un modelo de ratón mostraron que el sitio preferido de escisión in vivo de htt para estar en el aminoácido 552, que se utiliza in vitro por caspasa-3 o caspasa-2 1 y esa mutación del último aminoácido del sitio de escisión de la caspasa 6 en la posición de aminoácido 586, reducen la toxicidad en un modelo HD 2

Se realizará un análisis funcional para determinar si AON HDEx12_1 puede reducir la toxicidad de la huntingtina mutante y para determinar el nivel de prevención de la formación de fragmentos de huntingtina N-terminales tóxicos. También se probarán otros AON para omitir completamente los exones 12 y 13 de la transcripción de la huntingtina. Referencias citadas

1. Wellington,C.L. et al. Inhibiting caspase cleavage of huntingtin reduces toxicity and aggregate formation in neuronal and nonneuronal cells. J. Biol. Chem. 275, 19831-19838 (2000).

2. Graham,R.K. et al. Cleavage at the Caspase-6 Site Is Required for Neuronal Dysfunction and Degeneration Due to Mutant Huntingtina. Cell 125, 1179-1191 (2006).

Tabla 1a: Enfermedades de poliglutamina (PolyQ)

Tabla 1b: Enfermedades no relacionadas con poliglutamina

Tabla 2

HDEx12_2 es un ejemplo comparativo de un oligonudeótido que tiene la secuencia de nucleótidos de Htt en la cadena en sentido.

DRPLA AON

Los HDEx AON son oligonucleótidos para omitir los exones 12 o 13 del gen Htt.

Los DRPLA AON son oligonucleótidos para omitir los exones 5 o 6 del Gen DRPLA/ATN1.

La Tabla 3 proporciona oligonucleótidos adicionales para la omisión de exones. APP: proteína precursora amiloide en la enfermedad de Alzheimer (EA); ATN1: Atrofina 1 en DRPLA; ATNX3: Ataxin 3 para SCa 3; ATXN7: Ataxin 7 en SCA7; TBP: proteína de unión a TATA para SCA17; y HTT en la enfermedad de Huntington (HD)

Tabla 3. Secuencias AON dirigidas a proteínas implicadas en enfermedades neurodegenerativas

Enfermedad Nombre AON Secuencia diana Secuencia de AON AD hAPPEx16_4 GCAGAAGATGTGGGTTCAAAC GUUUGAACCCACAUCUUCUGC AD hAPPEx16_5 GGTGATGCTGAAGAAGAAACAG CUGUUUCUUCUUCAGCAUCACC AD hAPPEx16_6 TCATCATGGTGTGGTGGAGGTAG CUACCUCCACCACACCAUGAUGA DRPLA hATN1Ex5_1 CTCCCTCGGCCACAGTCTCCCT AGGGAGACUGUGGCCGAGGGAG DRPLA hATN1Ex5_2 GCGGAGCCTTAATGATGATGGC GCCAUCAUCAUUAAGGCUCCGC DRPLA hATN1Ex5_3 AGCAGCGACCCTAGGGATATCG CGAUAUCCCUAGGGUCGCUGCU DRPLA hATN1Ex5_4 AGGACAACCGAAGCACGTCCC GGGACGUGCUUCGGUUGUCCU DRPLA hATN1Ex5_5 TGGAAGTGTGGAGAATGACTCTG CAGAGUCAUUCUCCACACUUCCA DRPLA hATN1Ex5_6 ATCTTCTGGCCTGTCCCAGGGC GCCCUGGGACAGGCCAGAAGAU DRPLA hATN1Ex5_7 CGACAGCCAGAGGCTAGCTTTGA UCAAAGCUAGCCUCUGGCUGUCG DRPLA hATN1Ex5_8 CTCGAATGTTCCAGGCTCCTCC GGAGGAGCCUGGAACAUUCGAG DRPLA hATN1Ex5_9 TCTATCCTGGGGGCACTGGTGG CCACCAGUGCCCCCAGGAUAGA DRPLA hATN1Ex5_1 TGGACCCCCAATGGGTCCCAAG CUUGGGACCCAUUGGGGGUCCA 0

DRPLA hATN1Ex5_1 AGGGGCTGCCTCATCAGTGG CCACUGAUGAGGCAGCCCCU 1

DRPLA hATN1Ex5_1 AAGCTCTGGGGCTAGTGGTGCTC GAGCACCACUAGCCCCAGAGCUU 2

DRPLA hATN1Ex5_1 ACAAAGCCGCCTACCACTCCAG CUGGAGUGGUAGGCGGCUUUGU 3

DRPLA hATN1Ex5_1 CTCCACCACCAGCCAACTTCC GGAAGUUGGCUGGUGGUGGAG 4

DRPLA hATN1Ex5_1 CCAACCACTACCTGGTCATCTG CAGAUGACCAGGUAGUGGUUGG 5

DRPLA hATN1Ex5_1 TGGCCCAGAGAAGGGCCCAAC GUUGGGCCCUUCUCUGGGCCA 6

DRPLA hATN1Ex5_1 TTCCTCTTCTGCTCCAGCGCC GGCGCUGGAGCAGAAGAGGAA 7

DRPLA hATN1Ex5_1 GTTTCCTTATTCATCCTCTAG CUAGAGGAUGAAUAAGGAAAC 8

DRPLA hATN1Ex5_1 GCCTCTCTGTCTCCAATCAGC GCUGAUUGGAGACAGAGAGGC

9

Enfermedad Nombre AON Secuencia diana Secuencia de AON DRPLA hATN1Ex5_2 CCATCCCAGGCTGTGTGGAG CUCCACACAGCCUGGGAUGG 0

DRPLA hATN1Ex5_2 TCTACTGGGGCCCAGTCCACCG CGGUGGACUGGGCCCCAGUAGA 1

DRPLA hATN1Ex5_2 GCATCACGGAAACTCTGGGCC GGCCCAGAGUUUCCGUGAUGC 2

DRPLA hATN1Ex5_2 CCACTGGAGGGCGGTAGCTCC GGAGCUACCGCCCUCCAGUGG 3

DRPLA hATN1Ex5_2 CTCCCTGGGGTCTCTGAGGCC GGCCUCAGAGACCCCAGGGAG 4

DRPLA hATN1Ex5_2 CACCAGGGCCAGCACACCTGC GCAGGUGUGCUGGCCCUGGUG 5

DRPLA hATN1Ex5_2 GTGTCCTACAGCCAAGCAGGCC GGCCUGCUUGGCUGUAGGACAC 6

DRPLA hATN1Ex5_2 CAAGGGTCCTACCCATGTTCAC GUGAACAUGGGUAGGACCCUUG 7

DRPLA hATN1Ex5_2 CACCGGTGCCTACGGTCACCAC GUGGUGACCGUAGGCACCGGUG 8

DRPLA hATN1Ex5_2 CTCTTCGGCTACCCTTTCCAC GUGGAAAGGGUAGCCGAAGAG 9

DRPLA hATN1Ex5_3 GGTCATTGCCACCGTGGCTTC GAAGCCACGGUGGCAAUGACC 0

DRPLA hATN1Ex5_3 CCACCGTACGGAAAGAGAGCC GGCUCUCUUUCCGUACGGUGG 1

DRPLA hATN1Ex5_3 CCACCGGGCTATCGAGGAACCTC GAGGUUCCUCGAUAGCCCGGUGG 2

DRPLA hATN1Ex5_3 CAGGCCCAGGGACCTTCAAGCC GGCUUGAAGGUCCCUGGGCCUG 3

DRPLA hATN1Ex5_3 CCACCGTGGGACCTGGGCCCCTG CAGGGGCCCAGGUCCCACGGUGG 4

DRPLA hATN1Ex5_3 GCCACCTGCGGGGCCCTCAGGC GCCUGAGGGCCCCGCAGGUGGC 5

DRPLA hATN1Ex5_3 CCATCGCTGCCACCACCACCT AGGUGGUGGUGGCAGCGAUGG 6

DRPLA hATN1Ex5_3 CCTGCCTCAGGGCCGCCCCTG CAGGGGCGGCCCUGAGGCAGG 7

DRPLA hATN1Ex5_3 GCCGGCTGAGGAGTATGAGACC GGUCUCAUACUCCUCAGCCGGC

8

Enfermedad Nombre AON Secuencia diana Secuencia de AON DRPLA hATN1Ex5_3 CCAAGGTGGTAGATGTACCCA UGGGUACAUCUACCACCUUGG 9

DRPLA hATN1Ex5_4 GCCATGCCAGTCAGTCTGCCAG CUGGCAGACUGACUGGCAUGGC 0

DRPLA hATN1Ex6_1 CCTGGATCGCGGCTTCAACTC GAGUUGAAGCCGCGAUCCAGG DRPLA hATN1Ex6_2 CCTGTACTTCGTGCCACTGGAGG CCUCCAGUGGCACGAAGUACAGG DRPLA hATN1Ex6_3 GACCTGGTGGAGAAGGTGCGGCG CGCCGCACCUUCUCCACCAGGUC DRPLA hATN1Ex6_4 CGCGAAGAAAAGGAGCGCGAGCG CGCUCGCGCUCCUUUUCUUCGCG DRPLA hATN1Ex6_5 GCGAGCGGGAACGCGAGAAAG CUUUCUCGCGUUCCCGCUCGC DRPLA hATN1Ex6_6 GCGAGAAGGAGCGCGAGCTTG CAAGCUCGCGCUCCUUCUCGC SCA3 hATXN3Ex7_ TTGTCGTTAAGGGTGATCTGC GCAGAUCACCCUUAACGACAA 1

SCA3 hATXN3Ex7_ CTGCCAGATTGCGAAGCTGA UCAGCUUCGCAAUCUGGCAG 2

SCA3 hATXN3Ex7 GACCAACTCCTGCAGATGATT AAUCAUCUGCAGGAGUUGGUC 3

SCA3 hATXN3Ex7 GGTCCAACAGATGCATCGAC GUCGAUGCAUCUGUUGGACC 4

SCA3 hATXN3Ex7 GCACAACTAAAAGAGCAAAG CUUUGCUCUUUUAGUUGUGC 5

SCA3 hATXN3Ex8 GTTAGAAGCAAATGATGGCTC GAGCCAUCAUUUGCUUCUAAC 1

SCA3 hATXN3Ex8 CTCAGGAATGTTAGACGAAG CUUCGUCUAACAUUCCUGAG 2

SCA3 hATXN3Ex8 GAGGAGGATTTGCAGAGGGC GCCCUCUGCAAAUCCUCCUC 3

SCA3 hATXN3Ex8 GAGGAAGCAGATCTCCGCAG CUGCGGAGAUCUGCUUCCUC 4

SCA3 hATXN3Ex8 GGCTATTCAGCTAAGTATGCAAG CUUGCAUACUUAGCUGAAUAGCC 5

SCA3 hATXN3Ex9 GGTAGTTCCAGAAACATATCTC GAGAUAUGUUUCUGGAACUACC 1

SCA3 hATXN3Ex9 GCTTCGGAAGAGACGAGAAGC GCUUCUCGUCUCUUCCGAAGC

2

Enfermedad Nombre AON Secuencia diana Secuencia de AON

SCA3 hATXN3Ex10 CAGCAGCAAAAGCAGCAACAGC GCUGUUGCUGCUUUUGCUGCUG _1

SCA3 hATXN3Ex10 GACCTATCAGGACAGAGTTC GAACUCUGUCCUGAUAGGUC _2

SCA7 hATXN7Ex3_ GAGCGGAAAGAATGTCGGAGC GCUCCGACAUUCUUUCCGCUC 1

SCA7 hATXN7Ex3_ AGCGGGCCGCGGATGACGTCA UGACGUCAUCCGCGGCCCGCU 2

SCA7 hATXN7Ex3 AGCAGCCGCCGCCTCCGCAG CUGCGGAGGCGGCGGCUGCU 3

SCA7 hATXN7Ex3 ACACGGCCGGAGGACGGCG CGCCGUCCUCCGGCCGUGU

4

SCA7 hATXN7Ex3 GCGCCGCCTCCACCTCGGCCG CGGCCGAGGUGGAGGCGGCGC 5

SCA7 hATXN7Ex3 ACCTCGGCCGCCGCAATGGCGA UCGCCAUUGCGGCGGCCGAGGU 6

SCA7 hATXN7Ex3 GGCCTCTGCCCAGTCCTGAAGT ACUUCAGGACUGGGCAGAGGCC 7

SCA7 hATXN7Ex3 TGATGCTGGGACAGTCGTGGAAT AUUCCACGACUGUCCCAGCAUCA 8

SCA7 hATXN7Ex3 AGGCTTCCAAACTTCCTGGGAAG CUUCCCAGGAAGUUUGGAAGCCU 9

HD hHTTEx12 1 CATCAGCGACAGCTCCCAGACCACCA CGGUGGUGGUCUGGGAGCUGUCGCU

CCG GAUG

HD hHTTEx12 2 TCACAGCACACACTGCAGGC GCCUGCAGUGUGUGCUGUGA HD hHTTEx12 3 GGTCAGCAGGTCATGACATCAT AUGAUGUCAUGACCUGCUGACC HD hHTTEx12 4 AGAGCTGGCTGCTTCTTCAG CUGAAGAAGCAGCCAGCUCU HD hHTTEx12_5 GATGAGGAGGATATCTTGAG CUCAAGAUAUCCUCCUCAUC HD hHTTEx12_6 TCAGTGAAGGATGAGATCAGTGG CCACUGAUCUCAUCCUUCACUGA HD hHTTEx12_7 ATGGACCTGAATGATGGGAC GUCCCAUCAUUCAGGUCCAU HD hHTTEx12_8 TGACAAGCTCTGCCACTGAT AUCAGUGGCAGAGCUUGUCA HD hHTTEx12_9 TCCAGCCAGGTCAGCGCCGT ACGGCGCUGACCUGGCUGGA HD hHTTEx12_1 ACTCAGTGGATCTGGCCAGCT AGCUGGCCAGAUCCACUGAGU

0

Enfermedad Nombre AON Secuencia diana Secuencia de AON HD hHTTEx13_1 CCTGCAGATTGGACAGCC GGCUGUCCAAUCUGCAGG HD hHTTEx13_2 GGTACCGACAACCAGTATTT AAAUACUGGUUGUCGGUACC HD hHTTEx14_1 AACATGAGTCACTGCAGGCAG CUGCCUGCAGUGACUCAUGUU HD hHTTEx14_2 GCCTTCTGACAGCAGTGTTGAT AUCAACACUGCUGUCAGAAGGC HD hHTTEx14_3 GTTGAGAGATGAAGCTACTG CAGUAGCUUCAUCUCUCAAC SCA17 hTBPEx3_1: GCCATGACTCCCGGAATCCCTA UAGGGAUUCCGGGAGUCAUGGC SCA17 hTBPEx3_2: CCTATCTTTAGTCCAATGATGC GCAUCAUUGGACUAAAGAUAGG SCA17 hTBPEx3_3: TATGGCACTGGACTGACCCCAC GUGGGGUCAGUCCAGUGCCAUA SCA17 hTBPEx3_4: GCAGCTGCAGCCGTTCAGCAG CUGCUGAACGGCUGCAGCUGC SCA17 hTBPEx3_5: GTTCAGCAGTCAACGTCCCAGC GCUGGGACGUUGACUGCUGAAC SCA17 hTBPEx3_6: AACCTCAGGCCAGGCACCACAG CUGUGGUGCCUGGCCUGAGGUU SCA17 hTBPEx3_7: GCACCACAGCTCTTCCACTCA UGAGUGGAAGAGCUGUGGUGC SCA17 hTBPEx3_8: CTCACAGACTCTCACAACTGC GCAGUUGUGAGAGUCUGUGAG SCA17 hTBPEx3_9: GGCACCACTCCACTGTATCCCT AGGGAUACAGUGGAGUGGUGCC SCA17 hTBPEx3_10: CATCACTCCTGCCACGCCAGCT AGCUGGCGUGGCAGGAGUGAUG SCA17 hTBPEx3_11: AGAGTTCTGGGATTGTACCGCA UGCGGUACAAUCCCAGAACUCU SCA17 hTBPEx4_1: TGTATCCACAGTGAATCTTGGT ACCAAGAUUCACUGUGGAUACA SCA17 hTBPEx4_2: GGTTGTAAACTTGACCTAAAG CUUUAGGUCAAGUUUACAACC SCA17 hTBPEx4 3: CATTGCACTTCGTGCCCGAAACG CGUUUCGGGCACGAAGUGCAAUG

Claims (20)

REIVINDICACIONES

1. Un método para eliminar un sitio de escisión de caspasa o un sitio de escisión de secretasa de una proteína que comprende proporcionar una célula que expresa el pre-ARNm que codifica dicha proteína ex vivo con un oligonucleótido antisentido que induce a omitir la secuencia exónica que codifica dicho sitio de escisión de caspasa o sitio de escisión de secretasa, comprendiendo además el método permitir la traducción del ARNm producido a partir de dicho pre-ARNm, caracterizado el método porque la proteína no es distrofina.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el gen que codifica dicha proteína es un gen mutante que codifica una expansión de repetición de trinucleótido cuando se compara con el gen de un individuo normal.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el gen mutante es el gen causante de un trastorno de poliglutamina.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde dicho gen es el gen de la huntingtina.

5. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde dicho oligonucleótido antisentido se dirige hacia el interior del exón que codifica dicho sitio de escisión proteolítica.

6. Uso de omisión de exón en una célula para eliminar ex vivo un sitio de escisión proteolítica de una proteína.

7. Uso de un oligonucleótido antisentido que induce la omisión de un exón que codifica un sitio de escisión proteolítica en una proteína, para eliminar ex vivo dicho sitio de escisión proteolítica de dicha proteína en una célula que produce un pre-ARNm que codifica dicha proteína.

8. Un oligonucleótido de entre 14-40 nucleótidos que induce la omisión de un exón o una parte del mismo que codifica un sitio de escisión proteolítica en una proteína, en donde dicha proteína está involucrada en una enfermedad que está asociada con un producto de escisión proteolítica de dicha proteína y la proteína no es distrofina.

9. Un oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 8, en donde dicha enfermedad es un trastorno de poliglutamina.

10. Un oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 9, en donde dicho trastorno de poliglutamina es la enfermedad de Huntington.

11. Un oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 10, en donde se omite parte del exón 12 del pre-ARNm de la huntingtina humana (HTT).

12. Un oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 11, en donde se omiten los nucleótidos 207-341 del exón 12.

13. Un oligonucleótido de omisión de exón que comprende la secuencia de nucleótidos:-HDEx12_1: CGGUGGUGGUCUGGGAGCUGUCGCUGAUG;

- HDEx13_1: GUUCCUGAAGGCCUCCGAGGCUUCAUCA;

- HDEx13_2: GGUCCUACUUCUACUCCUUCGGUGU;

- DRPLAEx5_18: GUCGCUGCUGCCAUCAUCAU;

- DRPLAEx5_128: AAGAGGAAGCAGGAGGCAGA;

- DRPLAEx5_81: GGAGGAGCCUGGAACAUUCG;

- DRPLAEx6_80: AAGCUCGCGCUCCUUCUCGC;

- DRPLAEx6_1: CGAGUUGAAGCCGCGAUCCA;

- DRPLAEx6_84: GUUCAAGCUCGCGCUCCUUC;

- hAPPEx15_1: CUUGAUAUUUGUCAACCCAGAAC;

- hAPPEx15_2: CUUCACUUCAGAGAUCUCCUCCG;

- hAPPEx15_3: GUCAUGUCGGAAUUCUGCAUC;

- hAPPEx15_4: GAUGAUGAACUUCAUAUCCUGAG;

- hAPPEx16_1: ACCAUGAGUCCAAUGAUUGC;

- hAPPEx16_2: UCACCAAGGUGAUGACGAUC;

- hAPPEx16_3: CACCAUGAUGAAUGGAUGUGUAC;

- hAPPEx16 4: GUUUGAACCCACAUCUUCUGC;

- hAPPEx16 5: CUGUUUCUUCUUCAGCAUCACC;

- hAPPEx16 6: CUACCUCCACCACACCAUGAUGA; - hATN1Ex5 1: AGGGAGACUGUGGCCGAGGGAG; - hATN1Ex5 2: GCCAUCAUCAUUAAGGCUCCGC;

- hATN1Ex5 3: CGAUAUCCCUAGGGUCGCUGCU; - hATN1Ex5 4: GGGACGUGCUUCGGUUGUCCU;

- hATN1Ex5 5: CAGAGUCAUUCUCCACACUUCCA; - hATN1Ex5 6: GCCCUGGGACAGGCCAGAAGAU; - hATN1Ex5 7: UCAAAGCUAGCCUCUGGCUGUCG; - hATN1Ex5 8: GGAGGAGCCUGGAACAUUCGAG; - hATN1Ex5 9: CCACCAGUGCCCCCAGGAUAGA;

- hATN1Ex5 10: CUUGGGACCCAUUGGGGGUCCA; - hATN1Ex5 11: CCACUGAUGAGGCAGCCCCU;

- hATN1Ex5 12: GAGCACCACUAGCCCCAGAGCUU; - hATN1Ex5 13: CUGGAGUGGUAGGCGGCUUUGU; - hATN1Ex5 14: GGAAGUUGGCUGGUGGUGGAG; - hATN1Ex5 15: CAGAUGACCAGGUAGUGGUUGG; - hATN1Ex5 16: GUUGGGCCCUUCUCUGGGCCA; - hATN1Ex5 17: GGCGCUGGAGCAGAAGAGGAA;

- hATN1Ex5 18: CUAGAGGAUGAAUAAGGAAAC;

- hATN1Ex5 19: GCUGAUUGGAGACAGAGAGGC;

- hATN1Ex5 20: CUCCACACAGCCUGGGAUGG;

- hATN1Ex5 21: CGGUGGACUGGGCCCCAGUAGA; - hATN1Ex5 22: GGCCCAGAGUUUCCGUGAUGC; - hATN1Ex5 23: GGAGCUACCGCCCUCCAGUGG; - hATN1Ex5 24: GGCCUCAGAGACCCCAGGGAG;

- hATN1Ex5 25: GCAGGUGUGCUGGCCCUGGUG; - hATN1Ex5 26: GGCCUGCUUGGCUGUAGGACAC; - hATN1Ex5 27: GUGAACAUGGGUAGGACCCUUG; - hATN1Ex5 28: GUGGUGACCGUAGGCACCGGUG; - hATN1Ex5 29: GUGGAAAGGGUAGCCGAAGAG;

- hATN1Ex5 30: GAAGCCACGGUGGCAAUGACC;

- hATN1Ex5 31: GGCUCUCUUUCCGUACGGUGG; - hATN1Ex5 32: GAGGUUCCUCGAUAGCCCGGUGG; - hATN1Ex5 33: GGCUUGAAGGUCCCUGGGCCUG; - hATN1Ex5 34: CAGGGGCCCAGGUCCCACGGUGG; - hATN1Ex5_35: GCCUGAGGGCCCCGCAGGUGGC;

- hATN1Ex5_36: AGGUGGUGGUGGCAGCGAUGG;

- hATN1Ex5_37: CAGGGGCGGCCCUGAGGCAGG;

- hATN1Ex5_38: GGUCUCAUACUCCUCAGCCGGC;

- hATN1Ex5_39: UGGGUACAUCUACCACCUUGG;

- hATN1Ex5_40: CUGGCAGACUGACUGGCAUGGC;

- hATN1Ex6_1: GAGUUGAAGCCGCGAUCCAGG;

- hATN1Ex6_2: CCUCCAGUGGCACGAAGUACAGG;

- hATN1Ex6_3: CGCCGCACCUUCUCCACCAGGUC;

- hATN1Ex6_4: CGCUCGCGCUCCUUUUCUUCGCG;

- hATN1Ex6_5: CUUUCUCGCGUUCCCGCUCGC;

- hATN1Ex6_6: CAAGCUCGCGCUCCUUCUCGC;

- hATXN3Ex7_1: GCAGAUCACCCUUAACGACAA;

- hATXN3Ex7_2: UCAGCUUCGCAAUCUGGCAG;

- hATXN3Ex7_3: AAUCAUCUGCAGGAGUUGGUC;

- hATXN3Ex7_4: GUCGAUGCAUCUGUUGGACC;

- hATXN3Ex7_5: CUUUGCUCUUUUAGUUGUGC;

- hATXN3Ex8_1: GAGCCAUCAUUUGCUUCUAAC;

- hATXN3Ex8_2: CUUCGUCUAACAUUCCUGAG;

- hATXN3Ex8_3: GCCCUCUGCAAAUCCUCCUC;

- hATXN3Ex8_4: CUGCGGAGAUCUGCUUCCUC;

- hATXN3Ex8_5: CUUGCAUACUUAGCUGAAUAGCC;

- hATXN3Ex9_1: GAGAUAUGUUUCUGGAACUACC;

- hATXN3Ex9_2: GCUUCUCGUCUCUUCCGAAGC;

- hATXN3Ex10_1: GCUGUUGCUGCUUUUGCUGCUG;

- hATXN3Ex10_2: GAACUCUGUCCUGAUAGGUC;

- hATXN7Ex3_1: GCUCCGACAUUCUUUCCGCUC;

- hATXN7Ex3_2: UGACGUCAUCCGCGGCCCGCU;

- hATXN7Ex3_3: CUGCGGAGGCGGCGGCUGCU;

- hATXN7Ex3_4: CGCCGUCCUCCGGCCGUGU;

- hATXN7Ex3_5: CGGCCGAGGUGGAGGCGGCGC;

- hATXN7Ex3_6: UCGCCAUUGCGGCGGCCGAGGU;

- hATXN7Ex3_7: ACUUCAGGACUGGGCAGAGGCC;

- hATXN7Ex3_8: AUUCCACGACUGUCCCAGCAUCA;

- hATXN7Ex3_9: CUUCCCAGGAAGUUUGGAAGCCU;

- hHTTEx12_1: CGGUGGUGGUCUGGGAGCUGUCGCUGAUG; - hHTTEx12_2: GCCUGCAGUGUGUGCUGUGA;

- hHTTEx12_3: AUGAUGUCAUGACCUGCUGACC: ;

- hHTTEx12_4: CUGAAGAAGCAGCCAGCUCU;

- hHTTEx12_5: CUCAAGAUAUCCUCCUCAUC;

- hHTTEx12_6: CCACUGAUCUCAUCCUUCACUGA;

- hHTTEx12_7: GUCCCAUCAUUCAGGUCCAU;

- hHTTEx12_8: AUCAGUGGCAGAGCUUGUCA;

- hHTTEx12_9: ACGGCGCUGACCUGGCUGGA;

- hHTTEx12_10: AGCUGGCCAGAUCCACUGAGU;

- hHTTEx13_1: GGCUGUCCAAUCUGCAGG;

- hHTTEx13_2: AAAUACUGGUUGUCGGUACC;

- hHTTEx14_1: CUGCCUGCAGUGACUCAUGUU;

- hHTTEx14_2 AUCAACACUGCUGUCAGAAGGC;

- hHTTEx14_3: CAGUAGCUUCAUCUCUCAAC;

- hTBPEx3_1: UAGGGAUUCCGGGAGUCAUGGC;

- hTBPEx3_2: GCAUCAUUGGACUAAAGAUAGG;

- hTBPEx3_3: GUGGGGUCAGUCCAGUGCCAUA ;

- hTBPEx3_4: CUGCUGAACGGCUGCAGCUGC ;

- hTBPEx3_5: GCUGGGACGUUGACUGCUGAAC ;

- hTBPEx3_6: CUGUGGUGCCUGGCCUGAGGUU ;

- hTBPEx3_7: UGAGUGGAAGAGCUGUGGUGC ;

- hTBPEx3_8: GCAGUUGUGAGAGUCUGUGAG ;

- hTBPEx3_9: AGGGAUACAGUGGAGUGGUGCC ;

- hTBPEx3_10: AGCUGGCGUGGCAGGAGUGAUG ;

- hTBPEx3_11: UGCGGUACAAUCCCAGAACUCU ;

- hTBPEx4_1: ACCAAGAUUCACUGUGGAUACA ;

- hTBPEx4_2: CUUUAGGUCAAGUUUACAACC ; o

- hTBPEx4_3: CGUUUCGGGCACGAAGUGCAAUG.

14. Un oligonucleótido de acuerdo una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, en donde dicho oligonucleótido se une al pre-ARNm de dicha proteína para formar un complejo de ácido nucleico bicatenario y en donde dicho oligonucleótido se modifica químicamente para hacer que dicha ARNasa H compleja de ácido nucleico bicatenario sea resistente.

15. Un oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 14, en donde dicho oligonucleótido comprende uno o más enlaces de fosforotioato.

16. Un oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 14 o 15, en donde dicho oligonucleótido comprende una o más unidades estructurales de azúcar que están sustituidas con una modificación 2'-metoxi o 2'-metoxietoxi.

17. Un método para alterar el procesamiento proteolítico de una proteína que comprende un sitio de escisión proteolítica que comprende proporcionar una célula que produce un pre-ARNm que codifica dicha proteína ex vivo con un oligonucleótido antisentido que es específico para dicho pre-ARNm; y que evita la inclusión del código para dicho sitio de escisión proteolítica en el ARNm maduro producido a partir de dicho pre-ARNm, comprendiendo además el método permitir que la traducción de dicho ARNm produzca la proteína cuyo procesamiento proteolítico está alterado, en donde la proteína no es distrofina.

18. Un animal no humano que comprende un oligonucleótido de acuerdo una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 16, en donde dicho animal no humano comprende además un gen mutante que codifica una expansión de repetición de trinucleótido cuando se compara con el gen de un individuo normal.

19. Una proteína Htt modificada aislada y/o recombinante que comprende una eliminación de los aminoácidos 538­ 583.

20. Una célula aislada y/o recombinante que comprende un ARNm de Htt modificado que comprende una eliminación de los nucleótidos 207-341 del exón 12.