ES2688302T3 - Vacuna contra nemátodos de las ovejas - Google Patents

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Abstract

Una proteína de Teladorsagia circumcincta que tiene el 95 % de identidad con el antígeno de Teladorsagia circumcincta metaloproteinasa 1 de tipo astacina (Tci-MEP-1) de la SEQ ID NO: 7, o un fragmento inmunogénico de la misma, para su uso en la generación de una respuesta inmunitaria en un animal.

Description

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opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Los comprimidos hechos por compresión se pueden preparar comprimiendo, en una máquina adecuada, un compuesto activo (por ejemplo, uno o más antígenos de T. circumcincta) en una forma de flujo libre tal como un polvo o gránulos mezclados opcionalmente con un aglutinante, un lubricante, un diluyente inerte, un agente lubricante, un agente tensioactivo o un agente dispersante. Los
5 comprimidos hechos por moldeo se pueden hacer moldeando un compuesto activo con un diluyente líquido inerte. Los comprimidos se pueden recubrir opcionalmente y, si no se recubren, se pueden marcar opcionalmente. Las cápsulas se pueden preparar rellenando un compuesto activo, bien solo o en mezcla con uno o más ingredientes accesorios, en las cubiertas de la cápsula y después sellándolo de la forma habitual. Las obleas son análogas a cápsulas en las que se sella un compuesto activo junto con cualquier ingrediente accesorio en una cubierta de papel de arroz. También se puede formular un compuesto activo como gránulos dispersables, que, por ejemplo, se pueden suspender en agua antes de la administración, o espolvorear sobre los alimentos. Los gránulos se pueden envasar, por ejemplo, en un sobrecito. Las formulaciones adecuadas para la administración oral en las que el vehículo es un líquido se pueden presentar como una solución o una suspensión en un líquido acuoso o no acuoso, o como una emulsión líquida de aceite en agua.
15 Las composiciones adecuadas para la administración oral incluyen formas de dosificación de liberación controlada, por ejemplo, comprimidos en donde un compuesto activo (por ejemplo, uno o más antígenos de Teladorsagia) se formulan en una matriz de control de liberación apropiada, o se recubre con una película de control de liberación adecuada. Tales composiciones pueden ser particularmente convenientes para uso profiláctico.
La composición y las composiciones de vacuna formuladas para la administración parenteral incluyen soluciones o suspensiones estériles de un compuesto activo (por ejemplo, uno o más antígenos de Teladorsagia) en vehículos acuosos u oleaginosos.
25 Las composiciones inyectables y las vacunas se pueden adaptar para la inyección de bolos o la infusión continua. Tales preparaciones se presentan de manera conveniente en dosis unitaria o en recipientes multidosis, que se sellan tras la introducción de la formulación hasta que se requiera su uso. Como alternativa, un compuesto activo (por ejemplo, uno o más antígenos de T. circumcincta) puede estar en forma de polvo que está constituido por un vehículo adecuado, tal como agua estéril sin pirógenos o PBS antes de su uso.
Las composiciones que comprende uno o más antígenos de Teladorsagia también se pueden formular como preparaciones de medicamento de acción prolongada, que se pueden administrar mediante inyección intramuscular
o mediante implantación, por ejemplo, por vía subcutánea o intramuscular. Las preparaciones de medicamento de acción prolongada pueden incluir, por ejemplo, materiales poliméricos adecuados o hidrófobos, o resinas de
35 intercambio iónico. También pueden incluir preparaciones o adyuvantes conocidos por mejorar la afinidad y/o la longevidad de la respuesta inmunitaria de un animal (por ejemplo, ovino), tal como emulsiones únicas o dobles de aceite en agua. Tales composiciones de acción prolongada son particularmente convenientes para uso profiláctico.
Las composiciones adecuadas (o formuladas) para la administración mucosal incluyen composiciones que comprenden partículas para la dispersión en aerosol o dispensadas en agua potable. Cuando se dispensan, tales composiciones tener de forma deseable un diámetro de partículas en el intervalo de 10 a 200 micrómetros para permitir la retención en, por ejemplo, la cavidad nasal; esto se puede lograr mediante, según sea apropiado, el uso de un polvo de un tamaño de partícula adecuado o la elección de una válvula apropiada. Otras composiciones adecuadas incluyen los polvos gruesos que tiene un diámetro de partícula en el intervalo de 20 a 500 micrómetros,
45 para la administración mediante inhalación rápida a través del conducto nasal desde un recipiente que se mantiene cerca de la nariz, y gotas nasales que comprenden del 0,2 al 5 % en p/v de un compuesto activo en solución o suspensión acuosa u oleosa.
Debe entenderse que además de los ingredientes de vehículo mencionados anteriormente, las diversas composiciones descritas en el presente documento pueden incluir, uno o más ingredientes de vehículo adicionales (farmacéuticamente aceptables) tales como diluyentes, tampones, agentes aromatizantes, aglutinantes, agentes tensioactivos, espesantes, lubricantes, conservantes (incluyendo antioxidantes) y similares, y sustancias incluidas con el fin de hacer que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor deseado.
55 Los vehículos farmacéuticamente aceptables son bien conocidos para los expertos en la materia e incluyen, pero sin limitación, tampón fosfato 0,1 M y preferentemente 0,05 M o solución salina al 0,8 %. Además, los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden ser soluciones acuosas o no acuosas, suspensiones, y emulsiones. Los ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. Los transportadores acuosos incluyen agua, soluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, incluyendo solución salina y medios tamponados. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro sódico, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sódico, lactato de Ringer o aceites fijos. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos, tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes y similares.
65 Las composiciones adecuadas para formulación tópica se pueden proporcionar por ejemplo como geles, cremas o pomadas.
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Tci-SAA-1
CAQ43040 Antígeno asociado a superficie enriquecida de L3 BQ098696.1a,b 94 % 100 % (aa1-162) No publicado
Tci-MIF-1
CBI68362 Factor inhibidor de BQ457770.1a 99 % 91% No publicado
migración de macrófagos enriquecido en L3
(aa11-115)
Tci-ASP-1
CBJ15404 Proteína secretora CAD23183.1 76 % 97 % Mol Biochem
asociada a la activación enriquecida con L4
(aa5-235) Parasitol 2003; 126, 201-208
Tci-TGH-2
ACR27078 Proteína de tipo proteína de crecimiento transformante 2 Sin accesos significativos en NCBI, EMBL o Nembase 4
Tci-CF-1
ABA01328** Catepsina F secretada enriquecida en F4 BQ457843.1 a 73 % 59 % (aa12-229) No publicado
Tci-ES20
Todavía no enviado* Proteína excretora/ secretora (ES) CAC44259.1 35 % 100 % (aa1-140) Mol Biochem Parasitol 2003; 126, 201-208
Tci-MEP-1
Todavía no enviado* Metaloproteinasa ES de tipo astacina CAD19995.2 69% 100 % (aa1-498) Parasitology 2002; 125, 383391
Tci-APY-1
CBW38507 Apirasa ES activada por calcio enriquecida en L4 ADG63133.1 92 % 96 % (aa12-339) Parasitology 2011; 138, 333343
*Función supuesta o inferida **Tci-CF-1 es altamente polimórfico, el clon usado para la producción de la vacuna tenía las siguientes sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia publicada. En cada caso, el aminoácido en la secuencia publicada está en cursiva, que en la secuencia de la isoforma de la vacuna tiene una fuente normal y la posición de los aminoácidos en la secuencia publicada está en subíndice: I44⇒T44, N101⇒D101, T129⇒A129, R137⇒Q137, R305⇒K305, L306⇒P306, S307⇒Y307 *** Las secuencias de longitud completa todavía no se han depositado. a De la secuencia EST traducida b con la siguiente advertencia de los autores: "AVISO: El posterior examen de estas muestras ha revelado la presencia de un nemátodo adicional de ganado bovino de Trichostrongyloidea, Cooperia oncophora. Las secuencias en la presente biblioteca pueden provenir o bien de Ostertagia o Cooperia".
En vista de lo anterior, debería entenderse que los diversos aspectos y realizaciones de la presente divulgación (tal como se aplica a los antígenos de T. circumcincta y a su uso en la generación de respuestas inmunitarias en animales, especialmente ovinos) se puede aplicar adicionalmente a uno o más de los antígenos de O. ostertagi
5 descritos anteriormente.
Además, a la vista de los niveles de identidad presentados entre los antígenos de T. circumcincta descritos en el presente documento y los antígenos de O. ostertagi identificados anteriormente, se puede usar uno o más de los antígenos de T. circumcincta descritos en el presente documento para generar respuestas inmunitarias en sujetos
10 bovinos, siendo las respuestas inmunitarias protectoras y sirviendo para reducir, prevenir, tratar o eliminar las infecciones/infestaciones por Ostertagia (por ejemplo, O. ostertagi). Un experto en la materia apreciará que los antígenos de T. circumcincta proporcionados mediante la presente divulgación se pueden usar de forma individual o conjunta (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o los 8 antígenos de T. circumcincta) para generar respuestas inmunitarias en hospedadores bovinos.
15 Como alternativa, la presente divulgación se puede extender al uso de uno o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6 o los 7) de los antígenos de O. ostertagi presentados anteriormente en la tabla, opcionalmente en combinación con uno o más de los antígenos de T. circumcincta descritos en el presente documento, para su uso en la generación de respuestas inmunitarias en sujetos bovinos. De nuevo, tales respuestas inmunitarias pueden ser protectoras frente a
20 infecciones/infestaciones de Ostertagia.
En una realización, la presente divulgación se extiende a composiciones de vacuna o composiciones que comprenden uno o más de los antígenos de Ostertagia descritos anteriormente opcionalmente en combinación con uno o más de los antígenos de T. circumcincta en el presente documento, para su uso en la generación de
25 respuestas inmunitarias en sujetos bovinos.
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Tci-ASP-1 CBJ15404 Proteína secretora asociada a la activación enriquecida con L4 pET SUMO E. coli BL21 (DE3)-RIL Nisbet et al., 2010b
Tci-TGH-2 ACR27078 Proteína de tipo proteína de crecimiento transformante 2 pET SUMO E. coli BL21 (DE3)-RIL McSorley et al., 2010
Tci-CF-1 ABA01328** Catepsina F secretada enriquecida en F4 pPICZ• C Pichia pastoris cepa X33 Redmond et al., 2006
Tci-ES20 Todavía no enviado*** Proteína excretora/ secretora (ES) pPICZ• C Pichia pastoris cepa X33 Smith et al., 2009
Tci-MEP-1 Todavía no enviado*** Metaloproteinasa ES de tipo astacina pET SUMO E. coli BL21 (DE3)-RIL Smith et al., 2009
Tci-APY-1 CBW38507 Apirasa ES activada por calcio enriquecida en L4 pSUMO E. coli BL21 (DE3)-RIL Nisbet et al., 2011
*Función supuesta o inferida **Tci-CF-1 es altamente polimórfico, el clon usado para la producción de la vacuna tenía las siguientes sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia publicada. En cada caso, el aminoácido en la secuencia publicada está en cursiva, que en la secuencia de la isoforma de la vacuna tiene una fuente normal y la posición de los aminoácidos en la secuencia publicada está en subíndice: I44⇒T44, N101⇒D101, T129⇒A129, R137⇒Q137, R305⇒K305, L306⇒P306, S307⇒Y307 *** Las secuencias de longitud completa todavía no se han depositado. Estas moléculas han derivado de los datos de EST en el dominio público: Tci-ES20 basado en CB043664, Tci-MEP-1 basado en CB036707
Ensayo de inmunización
Catorce ovejas del cruzamiento macho/hembra de Texel que se han criado en condiciones para minimizar el riesgo
5 de infección por helmintos, se alojaron en dos grupos de 7 animales en corrales separados en el mismo edificio. Las ovejas eran de 204-206 días de vida al comienzo del experimento. Los recuentos de huevos fecales (RHF, Christie y Jackson, 1982), realizados antes del inicio del experimento, confirmaron que todos los animales y tenían RHF negativos. Las ovejas en el Grupo 1 se inmunizaron mediante inyección subcutánea usando una mezcla de proteína recombinante de 400 µg (que incorpora 50 µg de cada uno de Tci-ASP-1; Tci-MIF-1; Tci-TGH-2; Tci-APY-1; Tci
10 SAA-1; Tci-CF-1; Tci-ES20; Tci-MEP-1 en PBS) más 5 mg de Quil A total (Brenntag Biosector). Siete de las 8 proteínas recombinantes eran solubles en PBS y se administraron como una mezcla en una única inyección con 2,5 mg de Quil A. El Tci-MEP-1 fue insoluble en PBS y, por lo tanto, se formuló con urea 100 mM en PBS más 2,5 mg de Quil A. Las dos preparaciones se inyectaron por vía subcutánea, una inmediatamente después de la otra, en dos lugares del cuello de cada oveja. Cada oveja recibió tres inmunizaciones de la mezcla de proteína recombinante con
15 un intervalo de 3 semanas entre cada inmunización. Cada oveja en el grupo de control (Grupo 2) recibió tres inmunizaciones solo con urea/PBS/Quil A, al mismo tiempo que las ovejas del Grupo 1. El día de la tercera inmunización, se inició una exposición por goteo oral,mediante la cual, se administró a cada una de las ovejas de ambos grupos con 2000 T. circumcincta L3. Esto fue continuo tres veces por semana (lunes, miércoles y viernes) durante 4 semanas. Se tomaron muestras de sangre antes de cada inmunización y se tomaron muestras semanales
20 desde el día de la tercera inmunización en adelante para determinar las respuestas de IgA e IgG séricas específicas de antígeno y los niveles de pepsinógeno en suero (Lawton et al., 1996). Se realizaron RHF (Christie y Jackson, 1982) tres veces por semana (lunes, miércoles y viernes) desde 14 días después del inicio de la exposición por goteo hasta el final del experimento 5 semanas más tarde. Todas las ovejas se pesaron semanalmente. Para ambos grupos, se tomaron muestras de frotis del abomaso post mortem (Smith et al., 2009) para determinar los niveles de
25 anticuerpo IgA e IgG específico de antígeno en la superficie de la mucosa abomasal. En la necropsia, las cargas de nemátodos del lumen y de la mucosa (parásitos adultos y larvarios) se contaron siguiendo las técnicas habituales. Se determinó el porcentaje de larvas paralizadas o "inhibidas", basándose en el tamaño, tal como se describe anteriormente (Halliday et al., 2010). El experimento se realizó bajo las regulaciones de una licencia de proyecto del Ministerio del Interior del Reino Unido.
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Ensayo 2
Veintiocho ovejas del cruzamiento macho/hembra de Texel se criaron tal como se describe para el Ensayo 1 y se alojaron en cuatro grupos de 7 animales. Las ovejas eran de 172-178 días de vida y no excretaban huevos de 35 helmintos al inicio del experimento. Los grupos 1 y 3 se inmunizaron mediante inyección subcutánea usando la mezcla de proteína recombinante exactamente tal como se describe para el Ensayo 1, recibiendo cada una de las ovejas tres inmunizaciones con un intervalo de 3 semanas entre cada uno. Cada una de las ovejas de los Grupos 2 y 4 recibieron tres inmunizaciones con urea/PBS/Quil A, al mismo tiempo que los Grupos 1 y 3. En la inmunización final, comenzó la exposición por goteo oral en todos los grupos y se obtuvieron todas las muestras biológicas tal 40 como se describe anteriormente, para el Ensayo 1. Las ovejas en los Grupos 1 y 2 se sacrificaron 7 semanas después del inicio del período de infección (como para el Ensayo 1) y las de los Grupos 3 y 4 se sacrificaron 4 semanas más tarde. Para todos los grupos, las cargas de nemátodos del lumen y de la mucosa tal como se describe
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Claims (1)

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