ES2682595T3 - Nuevo compuesto antiinfeccioso - Google Patents

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ES2682595T3
ES2682595T3 ES15160285.1T ES15160285T ES2682595T3 ES 2682595 T3 ES2682595 T3 ES 2682595T3 ES 15160285 T ES15160285 T ES 15160285T ES 2682595 T3 ES2682595 T3 ES 2682595T3
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aureus
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Bernhard Krismer
Andreas Peschel
Stephanie Grond
Alexander Zipperer
Martin Christoph Konnerth
Daniela Janek
Hubert Kalbacher
Nadine Anna Schilling
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Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
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Abstract

Compuesto de la fórmula:**Fórmula** en la que - X se selecciona del grupo que consiste en: H, CH3, CH2CH3,**Fórmula** y con la condición de que al menos uno y como mucho dos de X sean: y**Fórmula** - Y se selecciona del grupo que consiste en O, S y N, con la condición de que**Fórmula** comprenda 0, 1 o 2 enlaces dobles; - m es un número entero entre 1 y 3, - n es un número entero entre 0 y 4, y las sales de los mismos, los solvatos de los mismos y los solvatos de las sales de los mismos.

Description

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DESCRIPCION
Nuevo compuesto antiinfeccioso
La invencion se refiere a un nuevo compuesto antiinfeccioso, a su uso para la production de una composition farmaceutica para el tratamiento y/o la profilaxis de una enfermedad, preferiblemente una enfermedad infecciosa, una composicion farmaceutica que comprende dicho compuesto, y a metodos para producir dichos compuestos.
El control y tratamiento de enfermedades infecciosas es uno de los mayores desafios de la sociedad moderna. Casi 40.000 hombres, mujeres y ninos mueren cada dia por enfermedades infecciosas en todo el mundo.
Entre los agentes infecciosos, las bacterias patogenas son mas que nunca de alta relevancia. Las infecciones bacterianas se pueden tratar con antibioticos, que tienen la funcion de matar a las bacterias o prevenir su crecimiento. Sin embargo, la resistencia a los antibioticos amenaza la prevention y el tratamiento infecciosos de una gama cada vez mayor de bacterias patogenas. La resistencia a los antibioticos esta presente en todas partes del mundo. Se considera una amenaza cada vez mas grave para la salud publica mundial que requiere medidas en todos los sectores de la ciencia y la sociedad.
Hay altas proporciones de resistencia a antibioticos en bacterias que causan infecciones comunes en todas las regiones del mundo, por ejemplo, infecciones del tracto urinario, neumonia, infecciones de la corriente sanguinea. Un alto porcentaje de infecciones adquiridas en el hospital son causadas por el llamado Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA). MRSA es una bacteria responsable de varias infecciones dificiles de tratar en humanos. MRSA tambien se llama Staphylococcus aureus resistente a la oxacilina (ORSA). MRSA es cualquier cepa de Staphylococcus aureus que ha desarrollado, a traves del proceso de selection natural, resistencia a los antibioticos betalactamicos, que incluyen las penicilinas, tales como meticilina, dicloxacilina, nafcilina, oxacilina, etc., asi como las cefalosporinas. MRSA es especialmente problematico en hospitales, prisiones y hogares de ancianos, donde los pacientes con heridas abiertas, dispositivos invasivos y sistemas inmunes debilitados tienen un riesgo elevado de infection nosocomial en comparacion con el publico en general. MRSA comenzo como una infection adquirida en el hospital, pero ha desarrollado un estado endemico limitado y ahora se encuentra cada vez mas arraigado en la comunidad.
Ademas de las medidas de prevencion, las nuevas formas de tratamiento de MRSA son objeto de una intensa investigation. De acuerdo con un estudio del Hospital Henry Ford, ahora se cree que el farmaco de election para tratar MRSA es la vancomicina. Sin embargo, varias cepas recientemente descubiertas de MRSA muestran resistencia a antibioticos incluso a la vancomicina, por ejemplo, Staphylococcus aureus resistente a la vancomicina (VRSA), asi como contra otros antibioticos recientemente desarrollados destinados al tratamiento de MRSA.
El documento DE 10 2005 055 944 divulga derivados de iminopeptidos ciclicos destinados a usarse como agentes antibacterianos. Sin embargo, tales compuestos conocidos hasta ahora no han demostrado su valia en la practica clinica.
En este contexto, un objetivo subyacente de la invencion es proporcionar un nuevo compuesto antiinfeccioso eficaz en el tratamiento de agentes infecciosos que son resistentes a farmacos actualmente disponibles, tales como Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA), Staphylococcus aureus resistente a vancomicina (VRSA) o enterococos resistentes a la vancomicina (VRE).
Este objetivo se cumple mediante la provision de un compuesto que tiene la siguiente formula (I):
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en la que
- X se selecciona del grupo que consiste en: H, CH3, CH2CH3,
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y
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con la condicion de que al menos uno y como mucho dos de X sean:
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y
- Y se selecciona del grupo que consiste en O, S y N, con la condicion de que
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m
comprende 0, 1 o 2 dobles enlaces,
- m es un numero entero entre 1 y 3,
- n es un numero entero entre 0 y 4,
y sus sales, los solvatos de los mismos y los solvatos de las sales de los mismos.
Los inventores lograron aislar un peptido dclico de la bacteria Staphylococcus lugdunensis que se encuentra dentro del alcance de la formula (I). Este peptido dclico exhibe una fuerte actividad contra diversas bacterias patogenas, incluidas Enterococcus faecalis y E. faecium, Streptococcus pneumonia, Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus resistentes a vancomicina (VRE). En otras investigaciones, los inventores fueron capaces de identificar una estructura central representada por la formula (I), que es responsable de la actividad antimicrobiana del compuesto aislado.
El nuevo compuesto comprende 5 - 9 aminoacidos en una configuracion dclica. En este "anillo grande" entre los aminoacidos, se prefieren aminoacidos aromaticos e hidrofobos, en los que se requiere al menos un triptofano o fenilalanina. Se prefiere que no se proporcionen mas de dos aminoacidos aromaticos.
El nuevo compuesto comprende ademas un "anillo pequeno", es decir, un anillo heterodclico de 5, 6 o 7 miembros, tal como un anillo de tiazolidina, oxazolidina o imidazolidina. El anillo pequeno no necesita un doble enlace, sin embargo, puede haber uno o dos enlaces dobles en el anillo pequeno.
El compuesto de la invencion puede, dependiendo de su estructura espedfica, existir en formas estereoisomericas (enantiomeros, diastereomeros). La invencion por lo tanto tambien abarca los enantiomeros o diastereomeros y sus mezclas respectivas. Los constituyentes estereoisomericamente uniformes se pueden aislar de manera conocida a partir de tales mezclas de enantiomeros y/o diastereomeros. Si el compuesto de la invencion puede estar presente en formas tautomericas, la presente invencion abarca todas las formas tautomericas.
Las sales preferidas para los fines de la presente invencion son sales fisiologicamente aceptables del compuesto de la invencion. Tambien estan comprendidas, sin embargo, las sales que, en sf mismas, no son adecuadas para aplicaciones farmaceuticas, pero pueden usarse, por ejemplo, para el aislamiento o la purificacion del compuesto de la invencion.
Ejemplos de sales farmaceuticamente aceptables del compuesto de formula (I) incluyen sales de bases inorganicas tales como sales de amonio, sales de metales alcalinos, en particular sales de sodio o potasio, sales de metales alcalinoterreos, en particular sales de magnesio o calcio; sales de bases organicas, en particular sales derivadas de ciclohexilamina, bencilamina, octilamina, etanolamina, dietanolamina, dietilamina, trietilamina, etilendiamina, procama, morfolina, pirrolina, piperidina, N-etilpiperidina, N-metilmorfolina, piperazina como la base organica; o sales con aminoacidos basicos, en particular lisina, arginina, ornitina e histidina.
Los ejemplos de sales farmaceuticamente aceptables del compuesto de formula (I) tambien incluyen sales de acidos inorganicos tales como clorhidratos, bromhidratos, sulfatos, fosfatos o fosfonatos; sales de acidos organicos, en particular acetatos, formiatos, propionatos, lactatos, citratos, fumaratos, maleatos, benzoatos, tartratos, malatos, metanosulfonatos, etanosulfonatos, toluenosulfonatos o bencenosulfonatos; o sales con aminoacidos acidos, en particular aspartato o glutamato.
Los solvatos para los propositos de la invention se refieren a aquellas formas del compuesto de la invention, que en estado solido o Kquido forman un complejo por coordination con moleculas de disolvente. Los hidratos son una forma espedfica de solvatos en los que la coordinacion tiene lugar con agua.
El compuesto de la invencion tambien puede complejarse, por ejemplo, con hierro, calcio, etc., en el que el 5 compuesto puede actuar como un ligando, de modo que un complejo correspondiente tambien es objetivo de la presente invencion.
El problema que subyace a la invencion queda completamente resuelto.
De acuerdo con otra realization de la invencion, el compuesto se caracteriza por la siguiente formula (II):
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10 en la que
- X se selecciona del grupo que consiste en: H, CH3, CH2CH3,
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y
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con la condition de que al menos uno y a lo sumo dos de X sean:
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y las sales de los mismos, los solvatos de los mismos y los solvatos de las sales de los mismos.
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Como pudieron demostrar los inventores, el compuesto de acuerdo con la invencion que consiste en 7 aminoacidos que comprenden un anillo grande y un anillo pequeno de tiazolidina tiene actividades antimicrobianas particularmente fuertes.
20 Los rasgos, caracteristicas y ventajas especificadas para el compuesto representado por la formula (I) se aplican tambien al compuesto representado por la formula (II).
De acuerdo con otra realizacion, el compuesto de acuerdo con la invencion se caracteriza por la siguiente formula (III):
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en la que
Y se selecciona del grupo que consiste en:
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y
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xh2-ch3
ch3
Como los inventores pudieron darse cuenta, el compuesto de acuerdo con la invencion representado por la estructura del nucleo de formula (III) exhibe una actividad antimicrobiana muy alta.
Los rasgos, caractensticas y ventajas especificadas para el compuesto representado por las formulas (I) y (II) tambien se aplican al compuesto representado por la formula (III).
En otra realizacion, el compuesto de acuerdo con la invencion se caracteriza por la siguiente formula (IV):
imagen13
En esta realizacion, se proporciona el compuesto exacto que fue aislado por los inventores de Staphylococcus lugdunensis. Este compuesto se ha usado a manera de ejemplo en las realizaciones para demostrar la actividad antimicrobiana de los compuestos representados por las formulas generales (I) - (III). Como ha sido demostrado por los inventores, el compuesto tiene actividad bactericida, por lo tanto, asegura una lucha eficaz contra una infeccion bacteriana. Este compuesto puede aislarse de Staphylococcus lugdunensis mediante metodos bien conocidos de microbiologfa en combinacion con cromatograffa qmmica o sintetizarse mediante smtesis de peptidos.
Los rasgos, caractensticas y ventajas especificadas para el compuesto representado por las formulas (I), (II) y (III) tambien se aplican al compuesto representado por la formula (IV).
De acuerdo con un desarrollo adicional de la invencion, el compuesto de acuerdo con la invencion se proporciona para el tratamiento y/o la profilaxis de la enfermedad, preferiblemente una enfermedad infecciosa, mas preferiblemente una enfermedad bacteriana, mas preferiblemente una infeccion por una bacteria Gram positiva, muy preferiblemente una infeccion por Staphylococcus aureus, que incluye especialmente sus formas Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA) y resistente a vancomicina (VRSA).
Esta medicion tiene la ventaja de que se proporciona un compuesto que es eficaz contra una amplia gama de agentes infecciosos y, en particular, contra Staphylococcus aureus en su variante de MRSA, que es responsable de varias infecciones graves en humanos.
Debido a sus propiedades farmacologicas, el compuesto de la invencion puede usarse solo o en combinacion con otros agentes para el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades o enfermedades infecciosas, respectivamente, en infecciones particularmente bacterianas.
Por ejemplo, pueden tratarse y/o prevenirse las enfermedades locales y/o sistemicas, que son causadas por los siguientes patogenos o por mezclas de los siguientes patogenos:
Cocos Gram positivos, tales como Estafilococos (Staph. aureus, Staph. epidermidis) y Estreptococos (Strept. agalactiae, Enterococcus faecalis, Strept. Pneumonia, Strept. pyogenes), bacilos Gram positivos, tales como Bacilo (carbunco), Listeria (monocytogenes) y Corinebacterium (difteria), cocos Gram negativos (Neisseria gonorrhoeae) y bacilos Gram negativos, como Enterobacteriaceae, por ejemplo, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Citrobacter (Citrob. freundii, Citrob. divernis), Salmonella y Shigella, ademas Klebsiella (Klebs. pneumoniae, Klebs. oxytoca), Enterobacterias (Ent. aerogenes, Pantoea agglomerans), Hafnia, Serratia (Serr. marcescens), Proteus (Pr. mirabilis, Pr. rettgeri, Pr. vulgaris), Providencia, Yersinia, y el genero Acinetobacter. Ademas, el espectro antibacteriano incluye el genero de Pseudomonas (Ps. aeruginosa y P. maltophilia) y bacterias estrictamente anaerobicas tales como Bacteroides fragilis, representantes del genero de Peptococcus, Peptostreptococcus y el genero Clostridium; tambien micoplasmas (M. pneumoniae, M. hominis, M. urealyticum) y micobacterias, por ejemplo, Mycobacterium tuberculosis.
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La lista anterior de patogenos es meramente ilustrativa y no limitativa.
Las enfermedades causadas por los patogenos mencionados o por infecciones mixtas que se pueden curar, prevenir o atenuar mediante el compuesto de acuerdo con la invencion son, por ejemplo:
Enfermedades infecciosas en humanos tales como infecciones septicas, infecciones de huesos y articulaciones, infecciones de la piel, infecciones de heridas postoperatorias, abscesos, celulitis, infecciones de heridas, quemaduras infectadas, quemaduras, infecciones de la boca, infecciones despues de cirugfa dental, artritis septica, mastitis, amigdalitis, infecciones urogenitales e infecciones oculares.
Particularmente preferido es el uso del compuesto de acuerdo con la invencion para el tratamiento y/o la profilaxis de colonizacion e infecciones nasales.
De acuerdo con los hallazgos de los inventores, el compuesto se coloca en el entorno natural de accion del peptido dclico aislado.
Las infecciones bacterianas no solo pueden tratarse o prevenirse en humanos sino tambien en animales. Los ejemplos son:
Cerdo: diarrea por coli, enterotoxemia, sepsis, disentena, salmonelosis, smdrome de metritis-mastitis-agalactiae, mastitis;
Rumiantes (bovinos, ovinos, caprinos): diarrea, sepsis, bronconeumoma, salmonelosis, pasteurelosis, micoplasmosis e infecciones genitales;
Caballo: bronconeumoma, infecciones puerperales y post puerperales, salmonelosis;
Perro y gato: bronconeumoma, diarrea, dermatitis, otitis, infecciones del tracto urinario, prostatitis;
Aves de corral (pollo, pavo, codorniz, palomas, aves de aviario y otros): micoplasmosis, infecciones por E. coli, enfermedad cronica de las vfas respiratorias, salmonelosis, pasteurelosis, psitacosis.
De forma similar, las enfermedades bacterianas se pueden tratar en la cna y mantenimiento de peces utiles y ornamentales, pero tambien en humanos, en los que el espectro antibacteriano de los patogenos mencionados anteriormente se extiende mas alla hasta patogenos tales como Pasteurella, Brucella, Campylobacter, Listeria, Erysipelothris, Corynebacteria, Borrelia, Treponema, Nocardia, Rickettsia, Yersinia.
Con el compuesto de acuerdo con la invencion, las infecciones bacterianas no solo pueden tratarse o prevenirse en humanos o animales sino tambien en plantas.
El compuesto de acuerdo con la invencion puede actuar sistemica y/o localmente. Para este fin, se puede administrar de una manera adecuada, tal como oral, parenteral, pulmonar, nasal, sublingual, lingual, bucal, rectal, dermica, transdermica, conjuntival, otica o asociada con un implante o canula intraluminal.
Una aplicacion topica es especialmente preferida ya que los inventores demostraron con exito que el compuesto de acuerdo con la invencion es capaz de penetrar areas de tejido incluso mas profundas.
En este contexto, otro objetivo de la invencion es el uso del compuesto de acuerdo con la invencion para la produccion de una composicion farmaceutica para el tratamiento y/o la profilaxis de una enfermedad, preferiblemente una enfermedad infecciosa, mas preferiblemente una enfermedad bacteriana, mas preferiblemente una infeccion por una bacteria Gram positiva, muy preferiblemente una infeccion por Staphylococcus aureus, que incluye su forma resistente a la meticilina (MRSA).
Otro objetivo de la presente invencion es una composicion farmaceutica que comprende el compuesto de acuerdo con la invencion y un velmculo farmaceuticamente aceptable.
Para este proposito, se entiende que un "vehnculo farmaceuticamente aceptable" significa cualquier excipiente, aditivo o vehfculo que se usa tfpicamente en el campo del tratamiento de enfermedades infecciosas y que simplifica o permite la administracion del compuesto de acuerdo con la invencion a un ser vivo, y/o mejora su estabilidad y/o actividad. La composicion farmaceutica tambien puede incorporar agentes aglutinantes, agentes diluyentes o lubricantes. La seleccion de un vehfculo farmaceutico u otros aditivos se puede hacer sobre la base de la ruta de administracion prevista y la practica farmaceutica estandar. Como portador farmaceuticamente aceptable se pueden usar disolventes, extendedores u otros medios de union lfquidos tales como agentes dispersantes o de suspension, tensioactivos, agentes isotonicos, esparcidores o emulsionantes, conservantes, agentes de encapsulacion, medios de union de solidos, dependiendo de cual es el mas adecuado para el regimen de dosis respectivo y tambien es compatible con el compuesto de acuerdo con la invencion. Puede encontrarse una descripcion general de tales ingredientes adicionales, por ejemplo, en Rowe (Ed.) et al.: Handbook of Pharmaceutical Excipients, 7a edicion, 2012, Pharmaceutical Press.
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De acuerdo con un desarrollo adicional de la invencion, la composicion farmaceutica se proporciona para el tratamiento y/o la profilaxis de una enfermedad, preferiblemente una enfermedad infecciosa, mas preferiblemente una enfermedad bacteriana, mas preferiblemente una infeccion por una bacteria Gram positiva, altamente preferiblemente una infeccion por Staphylococcus aureus incluyendo sus formas resistentes a meticilina (MRSA).
Los rasgos, caractensticas, ventajas y realizaciones del compuesto de acuerdo con la invencion tambien se aplican al uso y a la composicion farmaceutica de acuerdo con la invencion.
Otro objetivo de la presente invencion es un metodo para producir el compuesto de acuerdo con la invencion, que comprende las siguientes etapas: 1. Proporcionar bacterias de la especie de Staphylococcus lugdunensis, 2. Purificar el compuesto de acuerdo con la invencion de dicha bacteria.
A continuacion, se proporciona un metodo que los inventores han utilizado para producir o aislar el compuesto de acuerdo con la invencion. La especie de Staphylococcus lugdunensis a la que se hace referencia en estas realizaciones o en otra parte en la descripcion incluye el aislado o cepa IVK28, respectivamente.
En una realizacion del metodo de acuerdo con la invencion despues de la etapa (1) y antes de la etapa (2), se extraen las bacterias y el medio del cultivo bacteriano y el extracto bacteriano y el medio se someten a la etapa (2) en la que el compuesto se purifica a partir de dicho extracto bacteriano y medio.
Esta medida tiene la ventaja de que solo las fuentes principales del compuesto de acuerdo con la invencion se proporcionan a la etapa de purificacion a partir de la cual se puede aislar por metodos de microbiologfa en combinacion con cromatograffa qmmica, que son bien conocidas por los expertos en la materia.
En otra realizacion del metodo de acuerdo con la invencion en la etapa (2), la purificacion implica el uso de cromatograffa lfquida de alto rendimiento (HPLC) para identificar una senal de pico, que esta asociada con dicho compuesto.
Esta medida tiene la ventaja de que se usa una herramienta bien establecida de purificacion de peptidos, que permite una identificacion confiable del compuesto de acuerdo con la invencion.
En otra realizacion del metodo de acuerdo con la invencion, dicho pico de la senal corresponde a una masa molecular de aprox. 650 Da - 950 Da, preferiblemente de aprox. 700 Da - 850 Da, mas preferiblemente de aprox. 750 Da - 800 Da, mas preferiblemente de aprox. 770 Da - 790 Da, y muy preferiblemente de aprox. 782,5 Da.
Esta medida tiene la ventaja de que el compuesto de acuerdo con la invencion, que se encuentra dentro de los intervalos indicados, se puede identificar facilmente a traves de su masa molecular.
Otro objetivo de la presente invencion es un metodo para producir el compuesto de acuerdo con la invencion, que comprende las siguientes etapas: 1. Expresar el sistema II de peptido sintetasa no ribosomica de la especie de Staphylococcus lugdunensis (NRPS-II) en un sistema biologico, 2. Incubar el NRPS-II expresado en condiciones que permitan la smtesis del compuesto de acuerdo con la invencion, 3. Purificar dicho compuesto.
Los inventores pudieron descubrir que el NRPS-II de la especie de Staphylococcus lugdunensis es responsable de la smtesis del compuesto de acuerdo con la invencion y, por lo tanto, este metodo hace uso del aparato natural para producir el nuevo compuesto.
En una realizacion del metodo de acuerdo con la invencion, dicho NRPS-II esta codificado por una molecula de acido nucleico que comprende cualquiera de las secuencias codificantes de los genes lugA, lugB, lugC, lugD, y, opcionalmente, de un regulador transcripcional de la familia GntR, transportador ABC (sistema de transporte multifarmaco de tipo GdmF), protema permeasa del sistema de transporte tipo ABC-2, un transportador ABC, protema de membrana con hidroxiprolina, regulador de la familia TetR/AcrR, protema de la familia de la tioesterasa, 4'-fosfopanteteiniltransferasa y regulador negativo put. de sigY (en Bacillus).
Los inventores pudieron identificar los genes responsables de la smtesis del compuesto de acuerdo con la invencion y los cofactores opcionales y, por lo tanto, proporcionar un metodo en el que las caractensticas esenciales se usan en un sistema artificial de biologfa molecular para generar los compuestos a gran escala.
Las secuencias codificantes comprendidas por NRPS-II pueden tomarse de la SEQ ID NO: 1; las posiciones de los nucleotidos se indican a continuacion:
lugA: 6007-13131
lugB: 13121-17341
lugC: 17359-26172
lugD: 26893-28632
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regulador transcripcional de la familia GntR: 427-936
transportador ABC (sistema de transporte multifarmaco tipo GdmF): 1253-2143
protema permeasa del sistema de transporte de tipo ABC-2: 2140-2904
transportador ABC: 2917-3630
protema de membrana con hidroxiprolina: 3623-5164
regulador de la familia TetR/AcrR: 5409-5981
protema de la familia de la tioesterasa: 26169-26855
4'-fosfopanteteiniltransferasa: 28640-29293
regulador negativo put. de sigY (en Bacillus): 1027-1266
En este contexto, otro objetivo de la presente invencion es una molecula de acido nucleico que comprende la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 1 y/o cualquiera de las secuencias de codificacion enumeradas anteriormente del sistema II de peptido sintetasa no ribosomal de la especie de Staphylococcus lugdunensis (NRPS- II). Los ejemplos de tales moleculas de acido nucleico incluyen vectores o plasmidos configurados para una expresion controlada de las protemas codificadas en sistemas de expresion biologicos moleculares comunes. El objeto de la invencion es tambien una molecula de acido nucleico que codifica la protema y/o el peptido identico codificado por la molecula de acido nucleico antes mencionada, pero que tienen una secuencia de nucleotidos modificada o diferente debido a la degeneracion del codigo genetico.
Otro objetivo de la invencion se refiere a los productos generados por la expresion de la molecula de acido nucleico de acuerdo con la invencion, que incluyen protemas y/o peptidos codificados por cualquiera de los genes lugA, lugB, lugC, lugD, el regulador transcripcional de la familia GntR, el transportador aBc (sistema de transporte multifarmaco tipo GdmF), la protema permeasa del sistema de transporte tipo ABC-2, el transportador ABC, la protema de membrana con hidroxiprolina, el regulador de la familia TetR/AcrR, protema de la familia de la tioesterasa, 4'- fosfopanteteiniltransferasa y el regulador negativo put. de sigY (en Bacillus), o codificados por la secuencia de nucleotidos antes mencionada que son en sf mismos un objetivo de la presente invencion.
Un objetivo adicional de la invencion se refiere a un anticuerpo dirigido espedficamente contra cualquiera de los productos (peptidos, protemas) generados por la expresion de las moleculas de acido nucleico de acuerdo con la invencion.
En otra realizacion del metodo de acuerdo con la invencion, las condiciones que permiten la smtesis del compuesto de acuerdo con la invencion comprenden aminoacidos, tioesterasa y regulador.
Mediante esta medida, las condiciones se ajustan de forma tal que aseguren un alto rendimiento del compuesto de acuerdo con la invencion.
Otro objetivo de la presente invencion es un metodo para el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades, especialmente de las enfermedades mencionadas anteriormente, en un ser vivo, tal como un ser humano o un animal, que comprende la administracion a dicho ser vivo de una cantidad efectiva del compuesto antibacteriano de acuerdo con la invencion.
Se debe entender que las caractensticas antes mencionadas y las que se mencionaran a continuacion no solo pueden usarse en la combinacion indicada en el caso respectivo, sino tambien en otras combinaciones o de forma aislada sin apartarse del alcance de la invencion.
La invencion se explica ahora adicionalmente por medio de realizaciones que dan como resultado rasgos, caractensticas y ventajas adicionales de la invencion. Las realizaciones son de naturaleza puramente ilustrativa y no limitan el alcance o intervalo de la invencion.
Las caractensticas mencionadas en las realizaciones espedficas son tambien caractensticas de la invencion en general, que no solo son aplicables en la realizacion respectiva sino tambien de forma aislada en el contexto de cualquier realizacion de la invencion.
La invencion tambien se describe y explica con mas detalle haciendo referencia a los siguientes dibujos:
La Figura 1 muestra el locus genetico requerido para la smtesis de lugdunina y la arquitectura de dominio de peptido sintetasas no ribosomales de S. lugdunensis IVK28 con especificidades predichas;
La Figura 2 muestra la identificacion del producto del NRPS-II en extractos celulares de S. lugdunensis IVK28. (A) Cromatograma de HPLC-UV (UV210 nm) de extractos celulares de S. lugdunensis de tipo silvestre (azul) y mutante M1 (rojo) (eje x: tiempo [min], adsorcion en el eje y a 210 nm [mAU]; (B) HPLC-MS del pico con un tiempo de retencion
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de 10,6 min que da como resultado una masa de 782,5 Da (ESI pos.: m/z 783,6 [M+H]+, ESI neg.: m/z 781,5 [MH]-, m/z 817,5 [M+Cl]-);
La Figura 3: muestra que S. lugdunensis IVK28 es capaz de eliminar S. aureus USA300. S. aureus USA300 (negro) y S. lugdunensis IVK28 de tipo silvestre (A) o mutante AlugD (B y C) (blanco) se mezclaron en proporciones variables (10:1 (A y B) o 1:10 (C)) y se detectaron en agar BM que contema 2,2'-bipiridina. Despues de los puntos de tiempo indicados, se determino la proporcion de las cepas en la mancha. Las figuras representan la media de tres experimentos;
La Figura 4: muestra (A) los fragmentos de HPLC-MS-MS y (B) la formula estructural del peptido dclico que incorpora el compuesto de acuerdo con la invencion ("lugdunina");
La Figura 5: muestra que la lugdunina exhibe actividad bactericida contra S. aureus USA300. La incubacion de S. aureus USA300 con 1,5 pg/mL de lugdunina conduce a una disminucion de al menos 2 log de las celulas viables en 6 horas;
La Figura 6: muestra que la lugdunina es activa in vivo en un modelo de raton de remocion con cinta. Despues de la colonizacion de la piel de raton C57BL/6 afeitada con S. aureus se aplico lugdunina de Newman tres veces con pocas horas de diferencia. Despues de 45 horas, se sacrificaron los ratones y se determino el numero de bacterias en la superficie de la piel (fraccion de lavado) y en el tejido cutaneo mas profundo (fraccion de raspado). El tratamiento con lugdunina redujo significativamente la carga bacteriana en ambas fracciones, lo que indica su eficacia tambien in vivo. (★ p <0,05);
La Figura 7: muestra una prueba de citotoxicidad o la determinacion de los posibles efectos citotoxicos sobre los granulocitos neutrofilos dentro de las 3 h de incubacion.
La Figura 8: muestra la distribucion de la presencia de S. aureus, S. lugdunensis, y ambos en una muestra de 187 pacientes de riesgo.
Realizaciones
1.Staphylococcus lugdunensis produce un peptido NRPS dclico antimicrobiano altamente potente con fuerte actividad contra Staphylococcus aureus
En habitats naturales, especialmente en nichos ecologicos pobres en nutrientes como la nariz humana [Krismer et al. (2014) Nutrient limitation governs Staphylococcus aureus Metabolism and niche adaptation in the human nose. PLoS Pathog 10: e1003862], se asume una feroz competencia por los nutrientes disponibles entre las bacterias colonizadoras. Los inventores seleccionaron aislados bacterianos de hisopos nasales para la produccion de compuestos activos contra S. aureus. Ademas de la actividad contra una gran variedad de diversas bacterias nasales, los inventores identificaron dos cepas con propiedades inhibidoras contra S. aureus. Mientras un aislado, que se identifico como Staphylococcus epidermidis, exhibio una produccion constante de actividad antibacteriana en las condiciones investigadas, el segundo aislado, Staphylococcus lugdunensis, mostro su efecto antibacteriano solo en condiciones limitantes del hierro. No se ha descrito aun dicha actividad inhibidora para los estafilococos. Por esta razon, este aislado denominado IVK28 de S. lugdunensis fue investigado adicionalmente por los inventores.
2. La organizacion genetica del operon del NRSP de S. lugdunensis IVK28
La mutagenesis posterior del transposon de la cepa dio como resultado el mutante M1 negativo para la produccion. El analisis del sitio de insercion por PCR inversa dio como resultado la identificacion de un gen que codifica un peptido sintetasa no ribosomal (NRPS; posicion 860375/76 en la secuencia del genoma anotado de S. lugdunensis N920143; acceso No.: FR870271.1) que es parte de el sistema designado NRPS-II. Esto indico claramente que un peptido pequeno podna exhibir la actividad antibacteriana de S. lugdunensis contra S. aureus. En el genoma de S. lugdunensis se han identificado tres supuestos sistemas NRPS [La secuencia completa del genoma de Staphylococcus lugdunensis N920143 se publica en Heilbronner, et al. (2011) Genome sequence of Staphylococcus lugdunensis N920143 allows identification of putative colonization and virulence factors. FEMS Microbiol Lett 322: 60-67, que se incorpora aqrn por referenda]. Aunque NRPS-I exhibe altas homologfas con el sistema dipeptfdico NRPS de S. aureus que codifica aureusimina A y B [Wyatt et al. (2010) Staphylococcus aureus nonribosomal peptide secondary metabolites regulate virulence. Science 329: 294-296] [Erratum in Science, 2011 Sep 9; 333 (6048): 1381], y NRPS-III tiene sorprendentes similitudes con los sistemas sideroforos descritos (Heilbronner et al., cit. loc.), no se sabe nada sobre el producto potencial codificado por NRPS-II. La investigacion de los genomas publicados de
S. lugdunensis (secuencias completas de las cepas N920143, HKU09-01 y secuencias parciales de las cepas VCU139 y M235909 (puede determinarse facilmente con base en la secuencia del genoma de Staphylococcus lugdunensis N920143 HKU09-01: entre 864800/864801) mostro que la aplicacion de operon de NrPs-II esta presente en todas las cepas secuenciadas hasta el momento y, por lo tanto, no representa una caractenstica espedfica de la cepa. Sin embargo, los genomas publicados contienen varios posibles errores de secuencia o mutaciones reales de desplazamiento de marco, lo que lleva a anotaciones diferentes. Por esta razon, todas las posiciones relevantes, que indican un cambio de marco potencial, se amplificaron por PCR a partir de la cepa IVK28. La posterior secuenciacion de los productos de PCR revelo que la secuencia de IVK28 corresponde a la de la cepa
N920143 y su anotacion, a excepcion de la posicion de nucleotidos anotada 863.515 que se encuentra en el extremo 3' del gen SLUG_08110. En contraste con N920143, en IVK28 hay un tramo de ocho en lugar de siete nucleotidos de adenosina, lo que conduce a la fusion de los genes SLUG_08110 y SLUG_08120 con un marco de lectura abierto.
5 La Figura 1 representa la organizacion genetica del operon de NRPS-II de 29,6 kb en S. lugdunensis IVK28. Las ubicaciones de las secuencias de codificacion se indican en la siguiente informacion de secuencia del operon de NRPS de S. lugdunensis IVK28:
LOCUS
operon de nrp de IVK28
29605 pb ADN
lineal
CARACTERfSTlCAS
Ubicacion/Calificadores
caracteristica nueva complemento (427.. 936)
/nota= "regulador transcripcional de la familia GntR"
caracteristica nueva 1253. .2143
/ nota= "transportador ABC (sistema de transporte multifarmaco de tipo GdmF)"
caracteristica nueva 2140 . . 2904
/nota= "proteina permeasa del sistema transportador de tipo ABC-2 "
caracteristica nueva 2917.. 3630
/ nota= "transportador ABC "
caracteristica nueva caracteristica nueva
caracteristica nueva
3623.. 5164
/nota= "proteina de membrana con hidroxiprolina"
5409.. 5981
/nota= "regulador de la familia TetR/AcrR"
6007.. 13131
/ nota= "lugA" (corresponde a SLUG_08100 de Staphylococcus
lugdunensis N920143)
caracteristica nueva 13121..17341
/nota= "lugB" corresponde a la secuencia fusionada de SLUG 08110 y SLUG_08120 (por insercion de un nucleotido
adicional) de Staphylococcus lugdunensis N920143)
10
caracteristica nueva
caracteristica nueva caracteristica nueva
caracteristica nueva caracteristica nueva caracteristica nueva RECUENTOBASE 11616
17359.. 26172
/nota= "lugC" corresponde a SLUG_08130 de Staphylococcus lugdunensis 11920143)
26169.. 26855
/nota= "proteina de la familia de la tioesterasa"
26893.. 28632
/nota= "lugD" corresponde a SLUG_08150 de Staphylococcus lugdunensis N920143)
28640.. 29293
/ nota= "4 ' -fosfopanteteiniltransferasa "
1027.. 1266
/nota= "regulador negativo put. de sigV (en Bacillus)"
10338.. 10347
/nota= "sitio de insercion Tn917 "
a 3273 c 4650 g 10066 t
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Curiosamente, con solo el 26,7% el contenido de GC del operon de NRPS es significativamente menor que el contenido total de GC del genoma ( 33,8%), indicando la transferencia de genes horizontal desde un organismo extremadamente bajo en GC. El operon contiene cuatro genes consecutivos que codifican protemas NRPS, interrumpidas por un gen de tioesterasa tipo II entre lugC y lugD. En la region 5' se codifican dos transportadores ABC y dos genes reguladores potenciales. En el extremo 3' del operon se codifica la 4'-fosfopanteteiniltransferasa. Aunque la actividad antimicrobiana solo pudo detectarse en condiciones limitadas de hierro, no se pudo identificar ninguna caja Fur obvia dentro del operon, lo que indica un efecto mas bien indirecto de la falta de hierro en la expresion del operon.
El analisis computacional (predictor NRPS 2, Anti-Smash, HMMER) de las protemas codificadas por lugA-D revelo una arquitectura de dominio poco comun, que se muestra en la Figura 1. La mayona de los sistemas NRPS ensamblan aminoacidos activados de forma lineal hasta la liberacion del producto, que generalmente es catalizado por una tioesterasa tipo I. Por el contrario, el operon de S. lugdunensis exhibe un dominio de reductasa putativo para la liberacion del producto final, codificado al final del lugC. Al mismo tiempo, diferente de LugA-C, LugD carece de un dominio de condensacion, que es una caractenstica comun para los llamados modulos de iniciacion que proporcionan los primeros aminoacidos en algunos sistemas NRPS. La posterior reaccion de condensacion es luego catalizada por uno de los modulos de elongacion.
La prediccion de especificidad del dominio de adenilacion con el software NRPS predictor2 y Anti-Smash reporto valina y treonina (LugA), leucina (LugB), valina (LugC) y cistema (LugD) como los aminoacidos activados mas probables, aunque con diferentes probabilidades (60% para Thr y 100% para Cys).
3. Identificacion del producto NRPS-II
Ya que la actividad inhibitoria contra S. aureus solo fue detectable en placas de agar que contienen 2,2'-bipiridina 200 |jM, se usaron las mismas condiciones para un intento de extraccion del peptido. Despues de crecimiento durante 48 horas celulas de S. lugdunensis IVK28 se rasparon del agar y se extrajeron con etanol al 100%. El analisis posterior por HPLC de extractos de la cepa de tipo silvestre y mutante M1 revelo diferencias en solo un pico principal con un tiempo de retencion de 10,6 minutos (con una masa molecular de 782,5 Da (Figuras 2A y B). Sorprendentemente, el espectro de absorbancia mostro caractensticas de protemas que contienen triptofano a 280 nm, aunque no se ha predicho ningun aminoacido de este tipo de acuerdo con la organizacion genetica in silico. Para confirmar que la ausencia del pico de HPLC respectivo se debe en realidad a la integracion del transposon en lugA y no a una segunda mutacion del sitio no identificada, se construyo una cepa inactivada definida de lugD (AlugD::erm). Como se esperaba, el cromatograma de HPLC del mutante AlugD respectivo era casi identico al de S. lugdunensis M1 y no mostro el pico a 10,6 min. (datos no mostrados). El fenotipo de produccion podna restaurarse parcialmente por complementacion con el plasmido pRB474-lugD.
4.S. lugdunensis IVK28 es capaz de eliminar S. aureus USA300 en experimentos de cocultivo
Para investigar si la expresion del sistema NRPS-II le confiere a S. lugdunensis una ventaja competitiva se cocultivaron las cepas IVK28 o AlugD::erm en proporciones variables con S. aureus USA300 en placas de agar que contienen 2,2'-bipiridina. Como se muestra en La Figura 3, S. lugdunensis IVK28 fue capaz de erradicar completamente S. aureus USA300 de la mezcla en 72 horas, incluso con 90% S. aureus en las condiciones de partida (A). Por el contrario, S lugdunensis AlugD::erm mutante solo disminuyo ligeramente la relacion de S. aureus dentro de las primeras 48 horas y posteriormente fue cubierto por S. aureus dentro de las 72 horas (B). Aun mas, S. aureus fue capaz de desplazar al mutante cuando las condiciones de partida conteman 90% de S. lugdunensis (C). Estos resultados demuestran claramente la importancia del sistema NRPS-II como un factor de aptitud de S. lugdunensis en la lucha contra S. aureus. Notese que los resultados fueron casi identicos cuando se omitio 2,2'- bipiridina del medio, lo que indica que la limitacion del hierro podna no ser la verdadera y unica senal inductora, sino mas bien un tipo especial de estres como el contacto estrecho con S. Aureus.
5. Sobreproduccion y purificacion del peptido de NRPS-II
De forma interesante, no se pudo detectar actividad antimicrobiana, cuando S. lugdunensis IVK28 se cultivo en cultivos lfquidos que conteman 2,2'-bipiridina, ni en extractos celulares ni en el sobrenadante del cultivo. Por esta razon, la cepa se modifico geneticamente mediante la sustitucion del gen represor de la familia tetR secuencia arriba de lugA con el sistema regulador de xylR inducible por xilosa bien establecido. Esto permitio a los inventores inducir la produccion de peptidos mediante la adicion de 0,5% de xilosa y en ausencia de bipiridina. La cepa correspondiente AtetR::erm/xylR exhibio una actividad antimicrobiana significativa en el sobrenadante del cultivo despues de la adicion de xilosa. Mediante extraccion con 1-butanol, los inventores pudieron concentrar la actividad antimicrobiana en el disolvente. Despues de la evaporacion de 1-butanol, resuspension en metanol al 100% y cromatograffa de exclusion por tamano en una columna Sefadex LH-20, se pudo obtener una fraccion activa altamente enriquecida. La purificacion final se realizo por HPLC preparativa, dando como resultado el compuesto antimicrobiano puro, que se resolvio y almaceno en DMSO a una concentracion de 10 mg/mL a -20°C. El analisis por LC-MS y MS-Ms confirmo el peso molecular determinado anteriormente de 782,5 Da con la formula elemental C40H62N8O6S (Figura 4).
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Se aislo una realizacion del compuesto de acuerdo con la invencion llamada "lugdunina" como un solido blanco, el espectro de UV apuntaba a un anillo indol y HR-ESI-MS revelo un pico de iones en m/z = 783,4581 ([M+H]+) y fragmentos espedficos en HPLC-MS-MS. Los productos de la modificacion de Marfey de los estandares de aminoacidos D- y L- y de lugdunina tambien se sometieron a HPLC-ESI-MS y HPLC-MS-MS. Los aductos y fragmentos de masa revelaron aminoacidos D- y L- correspondientes a tres valinas, leucina/isoleucina, triptofano y un nuevo fragmento para C8H15N2OS asignado a una estructura de anillo de tiazolidina. El espectro de RMN 1H mostro senales alifaticas caractensticas para los protones de valina y senales caractensticas para la fraccion de triptofano. Los espectros de RMN apuntaban a al menos dos isomeros y conformeros diferentes para lugdunina debido a desplazamientos qmmicos alterados despues de 48 horas en solucion. Los experimentos adicionales de RMN bidimensional respaldaron la estructura de lugdunina. Sin embargo, las senales superpuestas no permitieron la determinacion completa de la regioqmmica por metodos de RMN ni la estereoqmmica de los aminoacidos individuales de lugdunina, el orden de los residuos de D-valina y L-valina no es asignable mediante espectroscopfa de RMN. Por lo tanto, la lugdunina se asigna al peptido ciclico representado en La Figura 4A y B generado a partir de los 7 aminoacidos y la formula empmca C40H62N8O6S.
6. El nuevo compuesto es bactericida y principalmente activo contra bacterias Gram positivas
Para determinar el espectro de actividad, se uso una gama de bacterias Gram positivas y Gram negativas clmicamente relevantes para la determinacion de MIC. Como se muestra en la Tabla 1, se pudo confirmar que, al lado de diversas cepas de S. aureus, el nuevo compuesto es activo frente a una amplia gama de bacterias Gram positivas, incluyendo Enterococcus faecalis y E. faecium, Streptococcus pneumoniae y Listeria monocytogenes resistentes a la vancomicina (VRE). Las MIC que vanan de 1,5 a 12 jg/mL (1,9 a 15 jM) subrayan el fuerte potencial antibacteriano de la lugdunina. Curiosamente, la cepa S. aureus USA300 MRSA era mas susceptible que la cepa de laboratorio RN4220. La cepa productora tambien mostro actividad contra Propionibacterium acnes, Streptococcus pyogenes, Micrococcus luteus y una variedad de otros estafilococos. Ninguna de las bacterias Gram negativas se inhibio significativamente en el rango de concentracion investigado (hasta 100 jg/mL).
Tabla 1: Determinacion de MIC de lugdunina contra diversas bacterias
Cepa
MIC Resistencia
Staphylococcus aureus USA 300
1,5 |jg/mL MRSA
Staphylococcus aureus RN4220
3 jg/mL
Enterococcus faecalis VRE366
12 jg/ mL VRE
Enterococcus faecium BK463
3 jg/ mL VRE
Listeria monocytogenes ATCC 19118
6 jg/ mL
Streptococcus pneumoniae ATCC 49619
1,5 jg/ mL
Pseudomonas aeruginosa PAO1
sin inhibicion
Escherichia coli SL01B
sin inhibicion
Klebsiella pneumoniae
sin inhibicion
Enterobacter cloacae
sin inhibicion
Para probar si la actividad es bacteriostatica o bactericida, se realizaron ensayos de eliminacion con S. aureus USA300 y concentraciones de peptido de 1 x MIC (1,5 jg/mL). Como se muestra en la Figura 5, se logro una reduccion de celulas viables de al menos dos unidades logantmicas dentro de las 6 horas de incubacion en PBS, indicando claramente un modo de accion bactericida. 7
7. El tratamiento topico con lugdunina es efectivo en un modelo de raton in vivo
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Dado que la efectividad de lugdunina podna mostrarse in vitro, el siguiente paso fue el desarrollo de un modelo in vivo. Para este proposito, se aplico el denominado modelo de remocion con cinta [Wanke et al., (2013) Staphylococcus aureus skin colanization is promoted by barrier disruption and leads to local inflammation. Exp Dermatol 22: 153-15]. Para este modelo, se afeito el lomo de ratones C57BL/6 y se rompio la barrera de la piel mediante un fuerte estiramiento con cinta (7 veces) sin crear heridas. Se aplico S. aureus Newman (inoculo de 107 ufc en 15 pL de solucion salina regulada con fosfato (PBS)) sobre la piel maltratada y cubierta por camaras Finn durante 20 horas para asegurar una colonizacion eficiente. Debido a su naturaleza hidrofoba, la lugdunina se disolvio en 100% de DMSO a una concentracion de 10 mg/mL y posteriormente se diluyo en aceite de sesamo al 100% hasta una concentracion final de 100 pg/mL. Se aplicaron 15 pL de esta preparacion de lugdunina a las manchas colonizadas 18, 24 y 42 horas despues de la aplicacion de S. aureus. Para el control solo se aplico DMSO al 1% en aceite de sesamo. Tres horas despues de la aplicacion final, se sacrificaron los ratones y se analizaron las biopsia de piel para detectar la presencia de S. aureus. Los inventores distinguieron entre la fraccion de lavado (bacterias debilmente unidas eliminadas por una etapa de lavado en PBS) y la fraccion de raspado (destruccion del material de la piel con escalpelos para liberar bacterias de las areas profundas de la piel). La Figura 6 muestra claramente la reduccion de S. aureus por tratamiento con lugdunina despues de 45 horas en la fraccion de lavado, asf como en la fraccion de raspado, lo que indica que la lugdunina tambien esta penetrando las areas mas profundas del tejido.
En un experimento preliminar, donde se midio la liberacion de lactato-deshidrogenasa de granulocitos neutrofilos, no se pudo observar citotoxicidad significativa dentro de las 3 h de incubacion de las celulas con el peptido, incluso a concentraciones de 50 pg/mL que se asemejaban a mas de 30 veces MIC para S. aureus USA300; vease la Figura
7.
8. La presencia de S. lugdunensis en la nariz humana esta muy probablemente correlacionada con la ausencia de S. aureus
Como una prueba de principio de la influencia de S. lugdunensis sobre S. aureus se investigo la ocurrencia conjunta de las dos especies en narices humanas. Para esto, se investigaron hisopos nasales de 187 pacientes con riesgo. En total, 61 individuos fueron colonizados con S. aureus (32,6%) y 17 con S. lugdunensis (9,1%). Ninguna de las especies se encontro en 109 personas (58,2%). De este numero, se puede esperar que 2,97% (casi 6 individuos) sean colonizados conjuntamente con S. aureus y S. lugdunensis. Por el contrario, solo una persona fue identificada como colonizada conjuntamente, lo que es significativamente menor de lo esperado (Figura 8, p <0,05). Esto podna indicar que la presencia in vivo de S. lugdunensis inhibe la colonizacion con S. aureus por la secrecion de lugdunina. De acuerdo con esta suposicion, es la deteccion de la masa de lugdunina (782,4513 Da) en hisopos de extrafdos con butanol de portadores de S lugdunensis, pero no de los no portadores (datos no mostrados).
9. Resumen
Aqu los inventores describen la elucidacion del aislamiento y la estructura del nuevo antibiotico peptfdico bactericida lugdunina, que es activo contra S. aureus y otras especies bacterianas patogenas. Con base en este peptido, los inventores han desarrollado una estructura central que muestra la actividad observada. El peptido aislado es producido no ribosomicamente por un Staphylococcus lugdunenses aislado (cepa IVK28) en el que el correspondiente operon de NRPS esta codificado cromosomicamente. Sin embargo, el analisis de la base de datos del genoma y los experimentos de amplificacion por PCR con 14 aislados naturales indicaron que el operon esta presente en todas las cepas investigadas, aunque no todas exhibieron la actividad antibiotica (datos no mostrados). Excepto por la descripcion de la produccion de micrococcina P1 en la cepa WS2733 de Staphylococcus equorum asociada a un solo animal (Carnio et al., (2001) Pyridinyl polythiazole class peptide antibiotic micrococcin P1, secreted by foodborne Staphylococcus equorum WS2733, is biosynthesized non ribosomally. Eur J Biochem 268: 6390-6401), no se conocen peptidos de NRPS para el genero Staphylococcus que exhiban propiedades antibacterianas. Micrococcin P1 se identifico originalmente en Micrococcus varians y Bacillus pumilus, pero la lugdunina representa el primer producto de NRPS antibacteriano espedfico del genero con una nueva estructura para Staphylococcus. Ya que S. lugdunensis puede aislarse con frecuencia de la nariz humana, es un competidor potencial de S. aureus en este habitat. Los experimentos de cocultivo del inventor han demostrado claramente que la produccion de lugdunina se equipara a S. lugdunensis con una gran ventaja en la competencia. Incluso una minona de celulas de S. lugdunensis IVK28 en las condiciones de partida puede erradicar S. aureus del cultivo dentro de las 72 horas. Ademas, la lugdunina purificada es eficaz en la erradicacion de S. aureus en un modelo de raton (modelo de remocion con cinta).
La Lugdunina representa una estructura novedosa y bastante poco comun ya que comprende un residuo de triptofano en combinacion con tres residuos de valina consecutivos, de los cuales uno es parte de una estructura de anillo de valinoil-tiazolidina. El triptofano y la porcion de tiazolidina estan flanqueando un cuarto residuo de valina. Se ha encontrado un alto contenido de D-valina y L-valina alternadas en el antibiotico valinomicina de macrolactona, que actua como un ionoforo, pero no hay similitud estructural con la lugdunina. Se ha descrito una estructura combinada de L-triptofano-tiazol para los inhibidores de smtesis de protemas A21459 [Ferrari et al., (1996) Antibiotics A21459 A and B, new inhibitors of bacterial protein synthesis. II. Structure elucidation. J Antibiot (Tokio) 49: 150-154], Kocurin [Martin et al., (2013) Kocurin, The true structure of PM181104, and anti-methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) thiazolyl peptide from the marine-derived bacterium Kocuria palustris. Mar Drugs 11:
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387-398], o la zelkovamicina que contiene 7-metoxi-triptofano [Tabata N, Tomoda H, Zhang H, Uchida R, Omura S (1999) Zelkovamycin, a new cyclic peptide antibiotic from Streptomyces sp. K96-0670. II. Structure Elucidation J Antibiot (Tokio) 52: 34-39]. Sin embargo, no existe una similitud adicional entre lugdunina y los antibioticos mencionados, lo que hace que la prediccion objetivo para lugdunina sea puramente especulativa. Dado que la lugdunina exhibe actividad bactericida, su modo de accion puede diferir de los otros peptidos descritos, cuya actividad es bacteriostatica.
Ademas del uso del peptido purificado para estrategias de erradicacion, tambien podna ser posible la aplicacion preventiva de una cepa productora de lugdunina, por ejemplo, la colonizacion clara de S. aureus en narices humanas.
Una incoherencia aun no resuelta es la presencia de solo cinco dominios de adenilacion en los genes de NRPS para la biosmtesis de lugdunina, aunque el antibiotico esta compuesto por siete aminoacidos. Una explicacion podna ser la estructura de dominio inusual de LugC, que consiste en solo un dominio A espedfico de valina y un dominio de condensacion/epimerizacion extendido con un dominio de PCP terminal inusual (Figura 1). Dado que los ultimos tres aminoacidos de lugdunina son valina (muy probablemente configuracion D y L), es tentador especular que este LugC se usa mas de una vez en la biosmtesis y puede agregar los tres residuos finales de valina en el crecimiento de la cadena peptfdica.
Listado de secuencias
<110> Eberhard-Karls-Universitat <120> Nuevo compuesto antiinfeccioso <130> 5402P541 <160> 1
<170> BiSSAP 1.0
<210> 1 <211> 29605 <212> ADN <213> nulo
<220>
<221> fuente <222> 1..29605
<223> /tipo_mol="ADN" /nota="nrp-operon IVK28" /organismo=Staphylococcus lugdunensis <220>
<221> caractenstica_misc <222> 427..936
<220>
<221> caractenstica_misc <222> 1253..2143
<223> /alelo="transportador ABC (sistema de transporte multifarmaco tipo GdmF)"
<220>
<221> caractenstica_misc <222> 2140..2904
<223> /alelo="protema permeasa del sistema de transporte tipo ABC-2 "
<220>
<221> caracter^stica_misc
<222> 2917..3630
<223> /alelo="transportador ABC"
<220>
<221> caracter^stica_misc <222> 3623..5164
<223> /alelo="hyp. prote^na de membrana"
<220>
<221> caractenstica_misc <222> 5409..5981
<223> /alelo="TetR/regulador familia AcrR"
5
10
15
20
25
30
35
<220>
<221> caracteristica_misc <222> 6007..13131
<223> /alelo="lugA (corresponde a SLUG_08100 de Staphylococcus lugdunensis N920143"
<220>
<221> caracteristica_misc <222> 13121..17341
<223> /alelo="lugB corresponde a la secuencia condensada de SLUG_08110 and SLUG_08120 (por insercion de un nucleotido adicional) de Staphylococcus lugdunensis N920143"
<220>
<221> caracteristica_misc <222> 17359..26172
<223> /alelo="lugC corresponde a SLUG_08130 de Staphylococcus lugdunensis N920143"
<220>
<221> caracteristica_misc <222> 26169..26855
<223> /alelo-'protema de la familia de tioesterasa"
<220>
<221> caracteristica_misc <222> 26893..28632
<223> /alelo="lugD corresponde a SLUG_08150 de Staphylococcus lugdunensis N920143"
<220>
<221> caracteristica_misc <222> 28640..29293
<223> /alelo="4'-fosfopanteteiniltransferasa"
<220>
<221> caracteristica_misc <222> 1027..1266
<223> /alelo="put. regulador negativo de sigY (en Bacillus)"
<220>
<221> caracteristica_misc
<222> 10338..10347
<223> /alelo="sitio de insercion Tn917"
<400>
1
aggtcttaaa
aaagcacgtc gttctccaca attctcaaaa cgttaattgt tggaagaaat 60
atacaaaaca
cctcgatatt atgtcgaggt gttttttgtg gaaaaattca gtatattgtg 120
tcttgatatt
taaccaatct ttctaggatt aacttgagag gtatatataa aacatattac 180
actatactat
tacgaaaaag atttctggag gaactactgt ttgacgtttt aaaactccat 240
ctaacagtct
tttaaagaga gatatatgat gtgttcgtat acctattaca aaagtaggaa 300
aatcaaatta
tattattaca gtcaatgtgg ccgatgttga ttttggcaat atagtcataa 360
gaaataatca
tatgaaccac agtattaata gttttaactt ttgctagtaa agtgaatcaa 420
aattggttat
ggaataataa caagtgaaat ggttcgctct ttgttattcg tattttgttt 480
ttcattgtaa
tatttattaa ttaaacagtt aagatcggac tggaaatttt caaattcact 540
gttttctaaa
tttagttttg aaatagaaaa ggtagcttta tcatccttat taattgtttt 600
atgataattt
tgataagatt gtaatacata cataaaataa taagtaacaa agtctatttt 660
tttactgtaa
ttcgcttgag tccactctgt ttcatcaatt ttatagcctt tagagtttat 720
tgcataatag
ttttcttcac tagaacgtaa ttttttggtc tttacaattt ttaataattg 780

Claims (14)

  1. 5
    10
    15
    20
    REIVINDICACIONES
    1. Compuesto de la formula:
    imagen1
    (i)
    en la que
    - X se selecciona del grupo que consiste en: H, CH3, CH2CH3,
    imagen2
    ■c"o
    con la condicion de que al menos uno y como mucho dos de X sean:
    imagen3
    con la condicion de que
    imagen4
    comprenda 0, 1 o 2 enlaces dobles;
    - m es un numero entero entre 1 y 3,
    - n es un numero entero entre 0 y 4,
    y las sales de los mismos, los solvatos de los mismos y los solvatos de las sales de los mismos. 2. Compuesto de la reivindicacion 1, caracterizado por la siguiente formula:
    imagen5
    en la que
    - X se selecciona del grupo que consiste en: H, CH3, CH2CH3,
    y
    imagen6
    YCHa
    o
    y
    con la condicion de que al menos uno y como mucho dos de X sean:
    imagen7
    5 3. Compuesto de la reivindicacion 1 o 2, caracterizado por la siguiente formula:
    en la que
    Y se selecciona del grupo que consiste en:
    imagen8
    ch3
    -ch"CH3 h,c-ch
    ''CH3 \ CHa
    ■CH
    -CH2-CH3
    ^CH3
    10 4. Compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por la siguiente formula:
    (IV)
  2. 5. Compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para el tratamiento y/o la profilaxis de una enfermedad, preferiblemente una enfermedad infecciosa, mas preferiblemente una enfermedad bacteriana, mas preferiblemente una infeccion por una bacteria Gram positiva, muy preferiblemente una infeccion por Staphylococcus aureus que
    15 incluye sus formas de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA) y resistente a la vancomicina (VRSA).
  3. 6. Composition farmaceutica que comprende el compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y un vehfculo farmaceuticamente aceptable.
    imagen9
    5
    10
    15
    20
    25
    30
  4. 7. Composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 6 para el tratamiento y/o la profilaxis de una enfermedad, preferiblemente una enfermedad infecciosa, mas preferiblemente una enfermedad bacteriana, mas preferiblemente una infeccion por una bacteria Gram positiva, muy preferiblemente una infeccion por Staphylococcus aureus que incluye sus formas de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA) y resistente a la vancomicina (VRSA).
  5. 8. Metodo para la produccion del compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende las siguientes etapas:
    1. Proporcionar bacterias de la especie de Staphylococcus lugdunensis,
  6. 2. Purificar el compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 de dicha bacteria.
  7. 9. Metodo de acuerdo con la reivindicacion 8, caracterizado porque despues de la etapa (1) y antes de la etapa (2) se extraen las bacterias y el medio del cultivo bacteriano y el extracto bacteriano y el medio se someten a la etapa (2) en la que el compuesto es purificado a partir de dicho extracto bacteriano y medio.
  8. 10. Metodo de acuerdo con la reivindicacion 8 y 9, caracterizado porque en la etapa (2) la purificacion implica el uso de cromatograffa lfquida de alta resolucion (HPLC) que identifica un pico de senal asociado con dicho compuesto.
  9. 11. Metodo de acuerdo con la reivindicacion 10, caracterizado porque dicho pico de senal corresponde a una masa molecular de aprox. 650 Da - 950 Da, preferiblemente de aprox. 700 Da - 850 Da, mas preferiblemente de aprox. 750 Da - 800 Da, mas preferiblemente de aprox. 770 Da - 790 Da, y muy preferiblemente de aprox. 782,5 Da.
  10. 12. Metodo para la produccion del compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende las siguientes etapas:
    1. Expresar el sistema II de peptido sintetasa no ribosomal de la especie de Staphylococcus lugdunensis (NRPS-II) en un sistema biologico,
  11. 2. Incubar el NRPS-II expresado en condiciones que permitan la smtesis del compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5,
  12. 3. Purificar dicho compuesto.
  13. 13. Metodo de acuerdo con la reivindicacion 12, caracterizado porque dicho NRPS-II esta codificado por una molecula de acido nucleico que comprende cualquiera de las secuencias codificantes de los genes lugA, lugB, lugC, lugD, y, opcionalmente, de un regulador transcripcional de la familia GntR, transportador ABC (sistema de transporte multifarmaco tipo GdmF), protema permeasa del sistema de transporte ABC-2, transportador ABC, protema de membrana con hidroxiprolina, regulador de la familia TetR/AcrR, protema de la familia de la tioesterasa, 4'- fosfopanteteiniltransferasa y regulador negativo put. de sigY (en Bacillus).
  14. 14. Metodo de acuerdo con las reivindicaciones 12 y 13, caracterizado porque las condiciones comprenden aminoacidos, tioesterasa y regulador.
    CO
    cn
    Vat
    Thr
    Leu
    Val
    Cys
    imagen10
    ©
    Domirsio de reductasa
    Fig. 1
    imagen11
    imagen12
    Oh 24h 48h 72h
    0 S. aureus □ S^ugdunensis tipo silvestre
    □ 5. aureus
    □ S.lugdunensis Alugu
    Fig. 3
    100%
    80%
    60%
    40%
    20%
    0 S .aureus □ S-lugdunensiS 6lugu
    imagen13
    UFC [ceiulasfmL]
    imagen14
    PBS
    Peptido 1,5 pg/mL
    Fig. 5
    imagen15
    opedsej dp uQioaejj
    o
    _L
    _L
    R
    _L
    imagen16
    J
    imagen17
    imagen18
    pos. neg.
    Fig. 7
    imagen19
    ^ $. lugdunenis ^ S. aureus ■ am bos ^ Sin vehfculo
    imagen20
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