ES2678244T3 - Separador de microfluidos de bomba peristáltica - Google Patents

Abstract

Un separador de microfluidos que comprende una bomba (10) peristáltica acoplada a una fuente y un canal retenido, un miembro (15) separador de componente fluido, y una salida (16) de filtrado, en donde: la bomba peristáltica comprende al menos tres áreas de control de presión interconectadas por al menos un canal microfluídico o nanofluídico que recubre el miembro (15) separador, el al menos un canal (12) y áreas de control de presión que definen un circuito microfluídico cerrado; y el miembro (15) separador está situado entre la bomba (10) peristáltica y la salida (16) de filtrado con una primera superficie del miembro de separación acoplada con al menos un canal (12), y una segunda superficie del miembro de separación acoplado con la salida (16) de filtrado para permitir selectivamente que los componentes fluidos pasen desde al menos un canal a la salida (16) de filtrado.

Description

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DESCRIPCION

Separador de microfluidos de bomba peristaltica Campo de la invencion

La presente invencion se refiere en general a la separacion y filtracion de microfluidos, y en particular a una estructura microflmdica de tres capas con una bomba peristaltica, encima de un filtro, que esta encima de una salida de filtrado, donde la bomba peristaltica proporciona presiones circulares y verticales para que el fluido evite el bloqueo y mejore la filtracion.

Antecedentes de la invencion

La filtracion es una operacion importante en dispositivos microflmdicos. Para muchas aplicaciones de laboratorio en fragmentos, se requieren diversas funciones de filtrado, purificacion, limpieza, extraccion y similares que dependen de la eficiencia. Filtrar aqm equivale a separar sistematicamente los componentes de una corriente de microfluidos en microfluidos de filtrado y retenido, dependiendo de una propiedad de la especie contenida o arrastrada en la corriente de microfluidos, para producir concentraciones mas altas de especies respectivas en los microfluidos de filtrado y retenido que los presentes en la corriente de microfluidos. Para lograr esto, tfpicamente se proporciona un filtro o membrana como una barrera selectiva entre un canal para la corriente de microfluidos y el retenido, y el filtrado.

El documento US 6,878,271 ensena la integracion de la tecnologfa de filtro de membrana convencional en sistemas microflmdicos. Se muestra una variedad de sistemas de filtracion. En el documento US 6,878,271 se establece (columna 6, lmea 35) que una fuente de flujo (no ilustrada) "puede comprender una bomba de jeringa off-chip, una bomba peristaltica microfabricada, una jeringa microfabricada, o cualquier fuente de flujo adecuada conocida en la tecnica, tal como las descritas en la Solicitud de Patente Provisional de EE. UU. No. 60/391,868".

El principal problema con los filtros/membranas y los separadores similares es que tienen una eficacia limitada. En el tiempo que el fluido pasa en la superficie, solo parte del fluido se separara segun lo previsto. Debido a que la porosidad de la mayona de los filtros disponibles comercialmente esta solo en el rango del 20% y debido a que la mayona de los dispositivos microflmdicos producen el flujo laminar en canales microflmdicos, el 80% de las partfculas generalmente se bloquean en la superficie del filtro. El propio filtrado pretendido, en combinacion con el producto retenido deseado, tiende a obstruir los poros de los filtros, disminuyendo aun mas la eficacia. Aumentar la velocidad de cizallamiento del flujo, y/o la diferencia de presion a traves de la membrana puede ayudar a retrasar el efecto de obstruccion (ver la patente de Estados Unidos, 4,871,462) y puede conducir el filtrado deseado a traves de perforaciones parcialmente obstruidas, hasta cierto punto, pero aun asf no evita el problema de obstruccion. Cuanto mayor es la presion que extrae el filtrado en relacion con el producto retenido, mas rapidamente se obstruye la membrana, lo que da como resultado un bajo rendimiento despues de la obstruccion. Cuanto mayor es la presion que atrae el producto retenido en relacion con el filtrado, menos obstruida esta la membrana, pero en realidad pasa menos fluido que puede pasar a traves del separador, lo que resulta en una menor eficiencia. La solucion para obstruccion inherente proporcionada en el documento de Estados Unidos 6,878,271 es 1) para proporcionar un area de superficie de filtracion grande, y 2) para reemplazar el modulo con frecuencia, pero esto puede no ser rentable, y a veces puede no ser practico (por ejemplo, si el filtro esta integrado en un sistema microflmdico).

Por lo tanto, se han desarrollado muchas tecnicas en la tecnica de la filtracion; estos pueden clasificarse generalmente en tecnicas activas y pasivas 1-3 Los enfoques de separacion activa mejoran la separacion utilizando fuerzas ffsicas de fuentes externas como dielectroforesis4, opticas5-7, fuerzas12 magneticas8-11 o acusticas.12 Sin embargo, muchos de ellos son caros, requieren campos externos y fuentes de alimentacion, requieren preprocesamiento de las partfculas objetivo, no pueden implementarse facilmente en multiples niveles de separacion con alta eficiencia y pueden no miniaturizarse facilmente como se requiere para la aplicacion de microfluidos.

Por otro lado, los enfoques de separacion pasiva dependen puramente de los fenomenos microflmdicos y la interaccion del fluido con las geometnas del residuo microflmdico. Incluye separacion inducida por obstaculos, filtracion13-14 hidrodinamica, fraccionamiento15 del flujo fragmentado, inercia y separacion16-17 del flujo de duna. Los fragmentos, vertederos y vastagos son obstaculos microflmdicos comunes, que estan dispuestos en canales microflmdicos para actuar como filtros, disminuyendo las partfculas de algunos tamanos y densidades en ciertas areas, y aumentar la concentracion de tales partfculas en otras areas. El filtrado ffsico es una de las pocas tecnicas de separacion que no requieren pasos de preprocesamiento o estfmulos externos, como campos magneticos u opticos. El documento de Estados Unidos 7,727,399 por Leonard et al., es un ejemplo de separacion basada en flujo. Cuando tiene un fluido bien caracterizado y el problema de separacion esta bien circunscrito, existen numerosos medios para mejorar la separacion.

Es mas diffcil proporcionar un sistema de separacion de fluidos generico y multiproposito que opere independientemente de caudales, volumenes, densidades de filtrado, etc. Al disenar un separador de proposito general, la mayona de las tecnicas de separacion basadas en flujo son de uso limitado, porque cuando el flujo tiene una constitucion diferente, la eficiencia del sistema se degrada.

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Ademas del problema de la eficacia operativa, existen problemas en la tecnica con la fabricacion, ya que la union de filtros a sustratos en dispositivos microflmdicos puede ser diffcil. El sellado y la union son especialmente problematicos para membranas delgadas, que de otro modo son muy eficientes y muy adecuadas para aplicaciones de microfluidos. Especialmente si la membrana es fragil, ya que tienden a ser si son de alto rendimiento y tienen poros pequenos. La union no se puede lograr facilmente con membranas muy fragiles de una manera1819 rentable y eficaz en el tiempo. Esta limitacion se vuelve aun mas importante (aunque puede que no sea imposible realizarla) cuando se requieren multiples niveles de membranas para implementar multiples fracciones de partfculas en el mismo dispositivo.

Es conocido en la tecnica de filtracion macroscopica, recircular fluido desde un flujo retenido hasta el suministro de un filtro en general, sin embargo, el control de flujo y la perdida de presion a traves de la membrana pueden requerir numerosas bombas y equipos de control de flujo para orquestar esta recirculacion. El equipo adicional de control de flujo aumenta el costo de los dispositivos microflmdicos. En consecuencia, existe una necesidad de tecnicas de separacion mejoradas para dispositivos microflmdicos.

Resumen de la invencion

El solicitante ha disenado un separador de microfluidos en una estructura microflmdica de tres capas con una capa de bomba peristaltica que tiene fuente y canales de retenidos, un miembro de separacion y una capa de salida de filtrado que exhibe una alta eficiencia, que es diffcil de lograr en microfluidos donde la turbulencia es diffcil de inducir. La fabricacion de bajo costo puede proporcionarse mediante el uso de elastomeros termoplasticos blandos (TPE) en alternancia con capas mas duras. Por ejemplo, se pueden proporcionar ventajas sustanciales en la union y sellado del miembro de separacion usando TPE como primera y tercera capas.

La capa de bomba peristaltica proporciona al menos tres areas de control de presion para ejercer fuerzas sobre segmentos de uno o mas canales microflmdicos interconectados que se superponen a una primera superficie del miembro separador para permitir que los componentes fluidos de los canales pasen a traves del miembro separador. La capa de bomba esta adaptada para aplicar presion coordinada en las al menos tres areas de control de presion para asegurar que el fluido experimente una circulacion y a traves de las presiones del separador dentro de uno o mas canales. La recirculacion evita el bloqueo y mejora la eficacia de la separacion. El flujo puede hacerse tipicamente turbulento, aumentando aun mas la eficiencia de la separacion.

Por consiguiente se proporciona un separador de microfluidos, comprendiendo el separador una bomba peristaltica acoplada a una fuente y un canal retenido, un miembro de separacion de componente fluido, y una salida de filtrado, en donde: la bomba peristaltica comprende al menos tres areas de control de presion interconectadas por al menos un canal microflmdico o nanoflmdico que recubre el miembro de separacion, al menos un canal y areas de control de presion que definen un circuito microflmdico cerrado; y el miembro de separacion esta situado entre la bomba peristaltica y la salida de filtrado con una primera superficie del miembro de separacion acoplada con al menos un canal, y una segunda superficie del miembro de separacion acoplada con la salida de filtrado para permitir selectivamente que los componentes fluidos pasen desde al menos un canal a la salida de filtrado.

Las partes del al menos un canal y la salida de filtrado estan alineadas preferiblemente en una direccion neta de accionamiento de presion ejercida sobre el area de control de presion.

La bomba peristaltica preferiblemente comprende una capa elastomerica termoplastica que tiene una primera superficie modelada unida al miembro de separacion para definir el circuito microflmdico cerrado.

Tambien se divulga un separador de microfluidos integrado que se puede usar para separar/clasificar mas de dos partfculas de diferentes tamanos. El separador de microfluidos integrado comprende al menos tres capas que definen dos de los miembros separadores de microfluidos. Si bien puede ser posible alinear estos en una pila, es posible organizarlos uno al lado del otro con el filtrado del primer separador de microfluidos que sirve como fuente del siguiente separador de microfluidos.

Tambien en consecuencia, se proporciona un metodo para separar componentes de un fluido. El metodo comprende: proporcionar un canal micro o nano-flmdico autointersecante que define un camino dclico para hacer circular el fluido sobre una superficie receptora de un miembro separador de componente fluido; y aplicar presion coordinada para canalizar en una pluralidad de areas de control de presion a lo largo de la trayectoria dclica para hacer circular el fluido sobre la superficie de recepcion, aplicando una presion para fomentar una transmision deseada a traves del miembro de separacion, y una presion de circulacion para eliminar obstrucciones superficiales en el miembro de separacion.

El metodo puede comprender ademas la aplicacion de la presion coordinada durante una duracion predefinida, y la inyeccion continua del fluido en el canal a medida que el filtrado abandona el canal.

Despues de inyectar repetidamente el fluido hasta que se agota el fluido, o el retenido contiene demasiado material que no puede pasar a traves del miembro de separacion, el metodo puede implicar dispensar un fluido de lavado para eliminar un retenido del canal. La distribucion de un fluido de lavado puede comprender accionar una valvula para cerrar un suministro del fluido, o un filtrado del miembro de separacion, o para abrir una salida del producto retenido.

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Se describiran otras caractensticas de la invencion o seran evidentes en el transcurso de la siguiente descripcion detallada.

Breve descripcion de los dibujos

Para que la invencion pueda entenderse mas claramente, las realizaciones de esta se describiran ahora en detalle a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:

Las figuras 1a, b son ilustraciones esquematicas de vistas en despiece ordenado y en seccion transversal de un separador de microfluidos de tres capas, de acuerdo con una realizacion de la invencion;

La figura 2 es una ilustracion esquematica de un separador de microfluidos de 4 capas de prueba con una capa de control neumatica, de acuerdo con un ejemplo de la invencion;

Las figuras 3a, b son imagenes a dos aumentos de un separador de microfluidos de prueba de la figura 2;

Las figuras 4 y 4a son imagenes en una vista superior y una vista en seccion transversal de una capa inferior alternativa para el separador de microfluidos de prueba de la figura 2;

La figura 5 es una ilustracion esquematica de un proceso para fabricar y ensamblar una realizacion alternativa adicional de la capa inferior del separador de microfluidos de prueba de la figura 2;

La figura 6(A) y (B) son graficos que muestran los caudales de filtrado y del producto retenido en funcion de la frecuencia (A) operativa y la presion (B) de aire neumatica aplicada para el separador de microfluidos de prueba de la figura 2;

La figura 7 es un panel de graficos y de imagenes de microscopfa de fluorescencia selectiva que muestra la separacion de microperlas utilizando el separador de microfluidos de prueba de la figura 2;

La figura 8 es un panel de graficos y de imagenes de microscopfa de fluorescencia selectiva que muestra la separacion de micro/nanoperlas utilizando el separador de microfluidos de prueba de la figura 2;

La figura 9 es un panel de imagenes de microscopfa de fluorescencia selectiva del separador de microfluidos de prueba de la figura 2, que muestra el lavado eficaz del retenido;

La figura 10 es una ilustracion esquematica de un separador de microfluidos de 2 etapas de acuerdo con otro ejemplo, teniendo la segunda etapa un separador que filtra componentes de flujo igualmente finos o mas finos que el primero; y

La figura 11 es un panel de imagenes y graficos de microscopfa de fluorescencia selectiva que muestra la filtracion celular usando el separador de microfluidos de prueba de la figura 2.

Descripcion de las formas de realizacion preferidas

La presente invencion se refiere a un dispositivo separador de microfluidos con una bomba peristaltica integrada. El separador mejora la eficiencia de separacion y disminuye la obstruccion al conducir el fluido a traves del separador y hacer circular el fluido alrededor de un canal que pasa sobre el separador. La fuerza de circulacion disminuye la obstruccion y aumenta el tiempo de permanencia del fluido fuente adyacente al filtro, y la fuerza de avance estimula la extraccion del filtrado. Aqrn el filtrado se refiere a la fraccion del suministro de fluido que pasa a traves del separador, y el retenido se refiere a la fraccion del suministro de fluido que no pasa a traves del separador, independientemente de la naturaleza del separador.

Las figuras 1a, b son ilustraciones esquematicas de un separador de microfluidos de tres capas en vistas en seccion transversal despiezadas y ensambladas, respectivamente. El separador de microfluidos incluye una capa 10 de bomba peristaltica, preferiblemente formada por un elastomero termoplastico (TPE) u otro material que comunica una fuerza, teniendo una primera superficie 10a de reunion que esta disenada para definir un canal 12 en una interfaz 14 entre la capa 10 de bomba peristaltica y el miembro 15 separador. La union mtima de la capa 10 de bomba peristaltica y el miembro 15 separador es tipicamente relativamente facil si se eligen materiales adecuados. Similar a la capa 10 superior, se proporciona una capa 16 de filtrado que tiene una primera superficie 16a de reunion modelada para producir un espacio para, o conducto para filtrado, unido al miembro 15 separador en un lado opuesto del miembro 15 separador.

El miembro 15 separador se ilustra esquematicamente como un filtro, y se define preferiblemente en un material relativamente ngido. Se apreciara que el miembro 15 separador puede ser un filtro de superficie, un filtro de profundidad, un filtro electro osmotico, un gel de electroforesis, una membrana, una membrana de osmosis o osmosis inversa, o una membrana qmmicamente activada, una membrana semipermeable, una membrana selectivamente permeable, una membrana biologica, una membrana sintetica, una membrana pasiva, una membrana activa, una

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membrana actuable, tales como una membrana actuable accionada electricamente, una membrana cargada, una membrana polarizada, una membrana neutra, una membrana porosa, una membrana de gradiente, una membrana organica, una membrana inorganica, una membrana lfquida, una membrana de gel, una membrana semisolida, una membrana solida, una malla, una membrana solida porosa, una membrana de emulsion, una membrana reactiva y una membrana foto reactiva. A continuacion, hemos demostrado la invencion con membranas porosas de plastico solido, sin embargo, dado el flujo turbulento generado, se espera que la gama completa de los separadores de fluido conocidos en la tecnica se pueda unir utilmente a la bomba peristaltica de la presente invencion para lograr una mejor filtracion y una obstruccion o bloqueo reducidos.

Los patrones de las superficies 10a y 16a estan alineados, y definen una porcion 13 usada del miembro 15 separador, como el area total sobre la cual el fluido en el canal 12 puede pasar a la capa 16 de filtrado.

El canal 12 esta en comunicacion de fluido con una fuente 18, y ademas puede acoplarse a un sumidero 19 de retenido. El canal 12 es una parte de un circuito microflmdico cerrado (es decir, una trayectoria de auto interseccion). Se prefiere un circuito cerrado porque permite una filtracion continua para cualquier duracion deseada, sin ningun equipo adicional de control de microfluidos (valvulas, microbombas, etc.) para extraer y reinsertar el fluido. Se prefiere, pero no es necesario, que todo el circuito cerrado se superponga a la porcion 13 utilizada, como se muestra. De esta forma, la recirculacion se proporciona continuamente sin retirar el fluido del contacto con el miembro 15 separador. Se apreciara que los puntos de control de recirculacion y/o presion 20 pueden proporcionarse alternativamente en puntos en los que el fluido no esta en contacto con el miembro 15 separador (por ejemplo, al lado de la porcion 13 usada). Por ejemplo, puede ser preferible colocar los puntos 20 de control de presion lejos del miembro 15 separador si el miembro 15 separador esta compuesto de una membrana que no puede soportar una presion deseada aplicada directamente a los puntos 20 de control de presion.

Aunque la realizacion ilustrada se muestra con una pista sustancialmente circular que tiene tres areas 20 de control de presion ampliadas, se apreciara que una gran variedad de disenos para un circuito cerrado es igualmente posible. En lugar de mostrar un anillo simple, puede ser eficiente tener multiples anillos en diferentes radios que se comuniquen entre las areas de control de presion, o tener multiples bucles que no sean concentricos, como en la figura 8 o rosa topologica de cualquier numero, o mas generalmente un conjunto de bucles que tienen cierto numero de conexiones.

Aunque se muestran tres regiones 20 de control de la presion que no se superponen, puede haber mas, o pueden estar ordenadas de forma diferente. En algunas realizaciones, las regiones 20 de control de presion pueden superponerse y asemejarse efectivamente a un unico area 20 de control de presion, pero el funcionamiento del dispositivo tendra presion en una o mas partes separadas de las areas ampliadas a la vez, y la coordinacion de la presion aplicada en las partes separadas equivale a areas 20 de control de presion separadas para la presente invencion, incluso si la presion se aplica a cada parte del canal en un punto del ciclo u otro.

Una superficie superior (o superficie intermedia) de la capa de bomba 10 peristaltica proporciona una region 21 alineada con cada region 20 de control de presion, donde la presion se comunica al canal 12. La presion puede suministrarse como actuacion positiva o negativa, porque el fluido puede circular por liberaciones dclicas a presion a lo largo del canal, o por presion positiva aplicada, en secuencia. Por ejemplo, una presion de vacfo aplicada en la region 21 (suponiendo que este cerrada) puede levantar una membrana que expande un volumen de la region 20 de control de presion para efectuar el bombeo, o puede usarse un aumento de presion en la region 21 para accionar la region 20 de control de presion. La region 21 puede accionarse con presion neumatica o hidraulica; tambien pueden ser actuables electromecanicamente, por ejemplo, con polfmeros piezoelectricos, conocidos o electroactivos; o puede ser actuable por la variedad completa de dispositivos mecanicos adecuados conocidos en la tecnica.

No es necesario que exista una relacion de uno a uno entre las bombas para controlar las regiones 21 y las regiones 20 de control de presion. Por ejemplo, algunos disenos pueden tener una pluralidad de regiones 20 de control de presion comunmente accionadas por un conjunto de regiones 21 que estan acopladas para operacion concurrente, o para operar con un retardo de tiempo inherente que es beneficioso para la operacion de bombeo dentro del canal 12.

Hay un valor para maximizar el area 13 de superficie usada, ya que esto afecta la eficiencia de la separacion. Como se muestra mejor en la figura 1b, en la realizacion ilustrada, la porcion 13 usada se maximiza reduciendo de manera efectiva el canal 12, de modo que el canal 12 tiene una seccion transversal que disminuye con una mayor distancia desde la interfaz 14 mientras proporciona el mayor volumen del fluido dentro de las areas de control de presion (donde la altura del canal es mayor, y hay menos ahusamiento).

Las estructuras planas de una amplia variedad de materiales se modelan facilmente. El separador como se muestra se puede formar con un diseno de tres capas. Puede proporcionarse una cuarta capa para encerrar las regiones de presion para permitir el control de fluido presurizado sobre las regiones de presion, y para controlar de ese modo independientemente las presiones en las areas de control de presion correspondientes.

En uso, el fluido que se va separar se suministra a traves del puerto 18, y llena el canal 12. Esto se puede lograr preparando primero el separador con un fluido de cebado, y luego suministrando el fluido que se va a separar. El fluido de cebado puede eliminarse a traves del puerto 19 opcional retenido, y/o la salida opcional en la capa 16 retenida, por

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ejemplo. Las areas de control de presion son accionadas y relajadas secuencialmente para bombear fluido alrededor del circuito microflmdico cerrado.

Ejemplos

Un ejemplo de un separador de microfluidos se ilustra esquematicamente en la figura 2, que es un mosaico que muestra una vista a ensamblada, transparente a del separador de microfluidos, una vista en seccion transversal b de un canal de microfluido dentro del separador, y una vista en despiece c del separador de microfluidos Este separador se diseno para la separacion de partfculas/celulas de un tampon o suspension acuosa. Este dispositivo se fabrico en cuatro capas: una capa de canal microflmdico inferior (BFL), una capa de membrana porosa (ML) formada de policarbonato (PC), una capa superior de microfluidos (TFL) y una capa de control neumatico de aire (PL). El BFL, TFL y PL se formaron cada uno de un elastomero termoplastico (TPE), espedficamente Mediprene de 400M. El ML elegido para este ejemplo es un filtro de policarbonato disponible comercialmente (EMD Millipore, MA, EE. UU.) Con un espesor en el rango de 7 pm a 20 pm y con tamanos de poro de unos pocos cientos de nanometros a 10 pm. Para evitar el colapso del filtro, se anadieron algunos pilares de soporte dentro del canal de microfluidos en la capa de microfluidos inferior.

Con este diseno, un grosor del BFL fue de 1 mm (y de acuerdo con el mismo diseno es preferiblemente de 1 a 3 mm), el TFL es de 300+/-10 pm (y de acuerdo con el mismo diseno preferiblemente de 0.2 a 0.3 mm), y el PL fue de 1 mm (y de acuerdo con el mismo diseno es preferiblemente de 1 a 3 mm). La profundidad del canal del TFL se controlo para asegurarse de que el espesor del residuo TPE (despues del modelado) estaba en un rango que las micro valvulas peristalticas integradas y microbombas se pueden operar a baja presion neumatica (menor a 15 psi) y al mismo tiempo para lograr cierta velocidad de bombeo (mayor a 50 pl/min). Esto se logro controlando el espesor inicial de la lamina de la pelfcula TPE y el grosor de las caractensticas del molde blando. La capa residual del tPe del TFL se controlo para que fuera de 100+/-5 pm (y segun el mismo diseno puede ser de 50-150 pm). Esta capa de residuos se usa para controlar la presion en las areas de control de presion durante el funcionamiento de la micro bomba peristaltica. La actuacion puede generar un flujo turbulento dentro del area del canal circular del dispositivo, y generalmente evita o limita la obstruccion del filtro.

Se aplico patron para formar el BFL, TFL y PL rapidamente mediante gofrado en caliente con moldes blandos (SU-8) (para detalles, veanse los documentos WO 2012/109724 del solicitante y US 12/588,236, cuyos contenidos se incorporan aqm como referencia). Un patron aplicado al BFL consiste en un canal circular acoplado a un canal recto a una salida. Un patron aplicado al TFL tiene el patron aplicado al BFL con un canal de ingreso adicional, que se divide por una union para permitir que dos entradas diferentes accedan al canal circular. El canal circular es el ejemplo mas simple de un circuito microflmdico cerrado. El canal recto y la salida del TFL proporcionan una corriente de captura del retenido, aunque en realizaciones alternativas, esto puede no ser deseado o no requerido. Con este diseno, el intercambio de componentes lfquidos entre los canales microflmdicos superiores e inferiores solo puede ocurrir en el area del canal circular. La capa neumatica de control de aire esta alineada con la capa superior de microfluidos, y no hay diferenciacion entre las areas de canal y de control de presion del canal circular, sino para la alineacion con las regiones de presion del PL.

Cada region de presion tiene forma de abanico (que define un sector anular) y tiene un canal microflmdico y un puerto respectivo que se extienden por vfas hacia la parte superior del PL. Vfas que acoplan las dos entradas y la salida del retenido del TFL con una parte superior del PL, y la salida de filtrado del BFL con el PL se proporcionan despues del montaje. Se suministra (3) una pluralidad de valvulas adicionales tanto en las corrientes de entrada como en las del retenido del TFL, mediante camaras correspondientes, y conectando canales de microfluidos en el PL.

El proceso de ensamblaje del dispositivo microflmdico integrado es bastante sencillo. Una vez que se diseno el BFL, se coloca ML (membrana porosa de policarbonato) sobre la capa de TPE para cubrir el area del canal circular. Luego, el TFL modelado se alinea en la parte superior de la capa BFL bajo un microscopio optico para asegurarse de que el canal circular en la capa superior este bien alineado con su contraparte en la capa inferior. Esto es seguido colocando el lado del patron PL hacia abajo, sobre el TFL bajo un microscopio optico para asegurarse de que las camaras de aire esten bien alineadas con el canal circular de la capa superior de microfluidos. Finalmente, una cubierta termoplastica dura (Zeonor 1060R) con puertos de conexion se une a la parte superior del dispositivo ensamblado. El PL esta modelado y se coloca en la parte superior del TFL.

La figura 3a, b son fotograffas de este ejemplo. La figura 3a muestra la mayona del separador de microfluidos de una superficie superior. Las flechas de abajo muestran las dos entradas simetricas para separar el fluido; las flechas de la izquierda son dos de los puertos neumaticos de las regiones de presion adyacentes, la flecha desde la parte superior es la via al TFL para el flujo del retenido, y la flecha de la derecha es una via al BFL para el flujo del filtrado. La figura 3b es una ampliacion que presenta el circuito microflmdico cerrado. Las tres flechas de la figura 3b apuntan al canal de filtrado (cerca de las 3 en punto) que tiene pilares en el canal para soporte; un canal para la region de presion en forma de abanico (cerca de las 8 en punto) y esa region de presion en forma de abanico (cerca de las 10 en punto). A partir de esta imagen, se puede ver un contorno del filtro circular, asf como los canales circulares mas blancos y los canales de conexion. Dos de las tres valvulas en la fuente y los canales retenidos tambien son visibles en la parte inferior y superior. Se observara que una de las regiones de control de presion y su area de presion se superponen al suministro de entrada (1), una segunda region de control de presion y su area (2) de presion no se superpone a ningun

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acoplamiento con el canal circular, una tercera region de control de presion y area de presion se superpone al canal (3) retenido y una cuarta cubre el filtrado (4).

Como se menciono anteriormente, los pilares de soporte se fabricaron en el medio del BFL para evitar el colapso del ML en el canal inferior, y tambien se incluyeron en el canal de filtrado. Los pilares teman 200 pm de diametro, con un espacio de 1 mm.

Se apreciara que en algunas realizaciones es deseable proporcionar un area superficial alta o un gran volumen para el filtrado. Por ejemplo, el separador puede estar involucrado en un proceso que tiene un paso de incubacion posterior a la filtracion. Si es asf, puede ser conveniente proporcionar una camara ampliada para que el filtrado se congregue. Para evitar el colapso de la ML, se podnan emplear varias estrategias, incluida la provision de un refuerzo plano local directamente debajo de las areas de control de presion. En algunos casos, una cafda de presion de fluido a traves del ML podna provocar un colapso o una distorsion no deseada del ML. En tales casos, se puede proporcionar una serie de pilares, postes, crestas u otros soportes.

Las figuras 4 y 4A ilustran esquematicamente una realizacion alternativa del BFL. La figura 4 es una vista del BFL que lleva un patron diferente, pero utilizable en combinacion con ML, TFL y PL de las figuras 2,3. La figura 4a es una imagen de seccion transversal a lo largo de A. El patron aplicado a BFL implica evacuar sustancialmente un disco con una cavidad de pared circular, y soportar la cavidad con una matriz de pilares. En la realizacion ilustrada, se proporciona un rebaje para el ML, que puede ser deseable si el grosor del ML es lo suficientemente alto como para que surjan preocupaciones sobre el sellado alrededor del borde. El solicitante ha descubierto que las membranas que tienen espesores de aproximadamente 7-20 pm pueden no requerir dicho rebaje. Se observa que un receso similar podna proporcionarse alternativamente en un TFL, y tales pilares o similares, pueden ser deseables en los conductos del TFL. Se entendera que, dependiendo del grosor del ML, puede no ser necesario dicho receso, ya que se puede proporcionar un sello mediante un enlace entre el BFL y el TFL, y cualquiera (o ambos) del BFL o TFL y una periferia del ML. Ventajosamente, la camara circular puede ser ligeramente mas grande que el diametro exterior del canal circular en el TFL, pero mas pequeno que el diametro del ML, de modo que el area de filtrado efectiva no esta limitada por el BFL, y hay menos restricciones en la alineacion entre el TFL y BFL durante el ensamblaje del dispositivo.

La figura 5 ilustra esquematicamente 5 etapas para producir un BFL de acuerdo con otra realizacion mas, que coopera igualmente con la realizacion de las figuras 2,3. El BFL se puede proporcionar preferiblemente en un plastico mas duro, o vidrio (Zeonor 1060R, por ejemplo, que se une facilmente y de forma segura a TPE), y puede producirse en masa de forma economica mediante moldeo por inyeccion. Por razones similares, el PL puede estar compuesto por el mismo material que el BFL. El BFL puede tener una superficie funcionalizada de area de superficie alta, tal como la proporcionada por el conjunto de pilares, por ejemplo.

Si el material del BFL no se sella facilmente contra el ML, se puede proporcionar una junta de TPE (paso A). La junta puede tener una variedad de formas, tamanos y contornos, en dependencia de la disposicion del BFL, pero en la realizacion ilustrada, una abertura de la junta TPE anular esta alineada con un canal en la capa BFL para que el lfquido, despues de pasar a traves del filtro PC a la camara circular, fluya a la salida inferior en el BFL. El bFl se puede formar con el ML en mente (paso B) y proporcionar pilares para apoyar el ML. La junta se inserta en el BFL, para sellar contra un piso del BFL, como se muestra en el paso C. Luego, en el paso D, se inserta el ML y se sella contra la junta. Suponiendo que el TFL proporciona inherentemente un material para unir y sellar al ML y al BFL, la colocacion alineada del TFL sera suficiente para encerrar los canales y areas selladas.

El rendimiento de las caractensticas de flujo del separador de la figura 3 ha sido estudiado. El separador de microfluidos mostrado en la figura 3 se ensamblo y los puertos del dispositivo microflmdico se acoplaron a un colector de control neumatico de 12 canales hecho en casa. Consiste en 24 valvulas electromagneticas. Las operaciones de apertura y cierre estan controladas por el software Lab View. La presion de salida maxima del colector es de 30 psi. La figura 6(A) es un grafico de la velocidad de bombeo del dispositivo en funcion de la frecuencia operativa a una presion de aire neumatica de 9 psi aplicada cuando el filtrado esta cerrado y el retenido esta abierto (drculos rellenos) o cuando el producto retenido esta cerrado y el filtrado esta abierto (drculos solidos). En general, la velocidad de bombeo (caudal) aumenta al aumentar la frecuencia operativa de menos de 1 Hz a casi 9 Hz. Se observaron caudales tan altos como 40 pl/min a traves del ML. El ciclo utilizado se describe a continuacion como operacion como dos bombas smcronas de desplazamiento positivo.

La figura 6(B) muestra la tasa de bombeo del dispositivo como una funcion de la presion de aire neumatica aplicada a una frecuencia operativa fija de 3 Hz para los mismos dos casos con las mismas etiquetas que en la figura 6(A). La velocidad de bombeo (caudal) aumenta al aumentar la presion aplicada cuando se fija la frecuencia operacional. El dispositivo puede operar a un caudal bastante alto con una presion aplicada relativamente pequena.

Al equilibrar las resistencias de flujo del retenido y las corrientes de filtrado, se pueden lograr altas velocidades de caudal alrededor del circuito microflmdico cerrado mientras se promueve la filtracion de alta eficiencia. Estos caudales permiten flujos turbulentos, al menos dentro del circuito cerrado, lo que es conducente a la eliminacion del bloqueo en la superficie del ML, disminuyendo la probabilidad de bloqueo e incrementando el rendimiento de los componentes del filtrado de la corriente incluso en el caso de un bloqueo parcial.

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La microbomba peristaltica (por ejemplo, para bombear fluido desde la fuente al retenido, como se muestra en la figura 3b) se puede operar mediante la activacion de cuatro superficies de control de presion dispuestas en cuatro puntos cardinales en el canal circular tratando dos ramas del circuito cerrado como dos bombas de desplazamiento positivo sincronicas, es decir, con un ciclo que comprende: Paso 1) Se inyecta aire dentro de las cuatro regiones de presion a una presion operativa, haciendo que las cavidades cerradas dentro de las regiones de presion se hinchen, reduciendo un volumen dentro de las cuatro areas de control de presion correspondientes. Paso 2) 3 etapas de liberacion del area de control de presion 1, seguidas de las areas de control de presion 2 y 4, y finalmente se libera el area de control de presion 3, extrayendo el lfquido en etapas desde la entrada hacia el area de control de presion 3. Paso 3) es una presurizacion en tres etapas del fluido embebido, que se presuriza por etapas y se expulsa. El area de control de presion 1 se presuriza primero mientras que las areas de control de presion 2, 3 y 4 se mantienen en el estado de ventilacion. Esto empuja una fraccion del volumen sistolico del lfquido de regreso a la entrada y el resto del volumen sistolico se fuerza hacia el producto retenido. Si la resistencia del flujo de fluido a traves de la membrana es menor que la resistencia hacia la entrada, la fraccion mas pequena se extraera retrograda hacia la entrada. Una vez que el area de control de presion 1 esta presurizada, hay una reduccion sustancial en cualquier flujo retrogrado adicional durante el ciclo. Con el area de control de presion 1 mantenida bajo presion, las areas de control de presion 2 y 4 se presurizan simultaneamente, seguido por la presurizacion del area de control de presion 3 una vez que las areas de control de presion 2 y 4 estan presurizadas completa o sustancialmente. Por lo tanto, el ciclo ha regresado al paso 1. Esto forma dos bombas de desplazamiento positivo paralelas y smcronas. Este ciclo puede preferirse con el flujo retenido cerrado, o sustancialmente cerrada, en la que una gran parte del flujo se fuerza a traves de la membrana, como una etapa de purificacion en la que se espera una pequena cantidad de impurezas.

Una ventaja significativa de este esquema de control es que no se requiere control de flujo mas que la bomba peristaltica. El funcionamiento de la bomba es suficiente para absorber el fluido y conducirlo a traves del retenido y las corrientes de filtrado. Sin embargo, se puede proporcionar una operacion mejorada impidiendo el flujo retrogrado, o suprimiendo el retenido y/o los flujos de filtrado durante los pasos 2 con valvulas adicionales o medios de control de flujo, si estan bien sincronizados y receptivos, por ejemplo, con actuacion precisa de las valvulas mostradas en las figuras 2, 3.

Hay varias operaciones de bombeo, que se pueden usar para diferentes propositos de separacion/clasificacion de partfculas, que un mejor uso de las areas de control de presion para impulsar selectivamente las corrientes de filtrado y retenido. Por ejemplo, la valvula entre el canal circular superior y el producto retenido puede cerrarse durante la primera parte de un ciclo. Por ejemplo, los pasos 1 y 2 descritos anteriormente pueden realizarse para embeber el fluido durante una primera fase de la primera parte, y el fluido puede retenerse dentro del canal circular para una segunda fase de la primera parte. Despues de la segunda fase, la valvula de retenido se abre, para eliminar el retenido, y se completa la etapa 3 para eliminar el retenido, preparar el separador para el cierre de la valvula de retenido y el paso 1.

Durante la segunda fase, se puede observar una variedad de procesos para conducir selectivamente una corriente de filtrado. Un primer ejemplo: presurizar el area de control de presion 1, y luego el area de control de presion 3 dara como resultado cierta perdida de fluido como flujo retrogrado, y una presurizacion del fluido entre la valvula de retenido y el area de control de presion 3, pero mientras la resistencia del fluido a traves del ML sea menor que estos, la mayor parte del fluido quedara atrapada en el canal circular y se expresara a traves del ML. La subsiguiente presurizacion de las areas 2 y 4 de control de la presion de presurizacion con la presion retenida en las areas 1, y 3 de control de la presion conducira adicionalmente el fluido a traves del ML de manera eficiente. Dicha progresion impulsara selectivamente una corriente de filtrado.

Un segundo proceso de segunda fase, que se puede usar ventajosamente en alternancia con el primer ejemplo, implica hacer circular selectivamente el flujo en el canal circular. Esto se puede realizar haciendo circular la presion a las areas de control de presion en secuencia. Esto puede implicar mantener sustancialmente relajadas una, dos o tres areas de control de presion a la vez. Si dos estan abiertos a la vez, pueden ser areas de control de presion vecinas u opuestas, lo que conduce efectivamente a una o dos ondas por iteracion. Cada vez que el area de control de presion 1 se relaja, se aspira mas fluido y las corrientes de filtrado pueden fluir libremente durante este proceso, pero se obtiene un equilibrio de presion durante todo este proceso si el numero de areas de control de presion relajadas permanece fijo, y el flujo del filtrado se equilibrara con el fluido extrafdo para lograr un enjuague eficaz del ML. En algunas aplicaciones, se puede proporcionar una valvula de control de flujo en la corriente de filtrado, que se puede operar para evitar el flujo de filtrado nominal durante una presion dclica, por ejemplo, si el lfquido es una descarga y el proceso se esta realizando para mejorar la recuperacion del retenido.

Como una variante del proceso de la segunda fase, se puede acumular (o disminuir) una presion dentro del canal circular al disminuir gradualmente (o aumentar) un numero de areas de control de presion relajadas en cualquier instante dado.

Por lo tanto, es posible, con esquemas de control de presion adecuados, proporcionar una gama de procesos que tendran diversos equilibrios de presiones de fluido entre las corrientes de producto retenido y de filtrado, como se desee en diferentes procesos o con diferentes operaciones durante la clasificacion, separacion o limpieza, cebado y bombeo. El proceso puede ser elegido, probado o mejorado, empmcamente, semi-empmcamente, o mediante un modelo

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microflmdico. Se pueden incorporar sensores y retroalimentacion en un controlador para controlar el accionamiento en las regiones de presion.

Aunque el ejemplo anterior consideraba que los dos canales al canal circular eran una entrada de fuente y un flujo retenido, se aprecia que, en otras realizaciones, se puede filtrar una corriente mixta utilizando este separador. Ambas corrientes pueden ser introducidas por canales respectivos, y mezcladas en el canal circular. Un ejemplo de un proceso para mezclar y filtrar sena comenzar con todas las areas de control de presion presurizadas, relajando las areas de control de presion 1 y 3 para empapar algunos de los dos fluidos, relajar las areas de control de presion 2 y 4 para extraer los fluidos embebidos en el canal circular, en cuyo punto los fluidos pueden someterse a una serie de procesos que, respectivamente, circulan y expresan la mezcla en varios grados, seguido de presurizar las areas de control de presion 1 y 4, y luego presurizar las areas de control de presion 2 y 3 para expresar la mezcla, y devolver el aparato al estado inicial.

Se observara que las unicas aplicaciones que requieren la capacidad de actuacion independiente de las cuatro areas de control de presion es la progresion de la segunda fase (y su variante). Por lo tanto, para algunas aplicaciones de la invencion, cuando se proporciona una circulacion suficiente para evitar la obstruccion sin requerir tal proceso, las regiones de presion 2 y 3 se pueden aplicar comunmente mediante un unico actuador de fuerza. De forma similar, en la operacion de filtrado de mezclado, las regiones de presion 1 y 4 pueden aplicarse comunmente mediante un unico actuador de fuerza, lo que puede simplificar considerablemente los sistemas de control.

Dado que el dispositivo posee funciones de mezcla y separacion, una aplicacion directa (ademas de la separacion de celulas) de este tipo de dispositivo esta en el uso de la captura y liberacion del objetivo de ADN. Por ejemplo, una corriente de perlas recubiertas con adsorbente de afinidad de ADN y una corriente de solucion de ADN diana se introducen simultaneamente en el canal circular. Al accionar la microbomba peristaltica integrada en el modo de mezcla, el ADN objetivo podna unirse eficazmente a las perlas que se capturaran en la superficie del filtro. La union de ADN en las perlas podna maximizarse haciendo circular la corriente de aDn diana desde el flujo de filtrado de regreso al ingreso y luego mezclandose una y otra vez con las perlas capturadas en el filtro. Esos ADN de union no espedficos en las perlas podnan lavarse haciendo circular tampon de lavado en el canal circular. El ADN unido espedfico en las perlas se puede liberar bombeando el tampon de elucion espedfico dentro del canal circular y mezclandolo con las perlas capturadas accionando los modos de mezcla y bombeo y finalmente recogiendo del canal de filtrado para un analisis posterior.

La operacion del separador de microfluidos ha sido demostrada. La figura 7 es un mosaico de resultados de esta demostracion. La demostracion uso el separador mostrado en la figura 3, usando los materiales y metodos descritos anteriormente, excepto que el tamano de poro del filtro utilizado en el dispositivo es de 10 pm. El sistema de control utilizado fue el mismo que el descrito anteriormente. En este experimento, se preparo una suspension de microperlas de poliestireno de fluorescencia azul de pm y verde de 2 pm en agua desionizada con una concentracion de 5 x 104 p/ml cada una. Luego se prepararon suspensiones mixtas con volumenes iguales de cada suspension. Las muestras iniciales y recogidas en cada salida se analizaron con un microscopio de fluorescencia invertida (Nikon TE-2000-E). Las microesferas recogidas se analizaron adicionalmente usando un sistema de clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS). Las partfculas de tamano nano separadas tambien se evaluaron usando un Multi-Angle Particles Sizer (Brookhaven Instruments Corporation).

La separacion del cordon se realizo aplicando dos modos de bombeo diferentes, y se investigo la eficiencia de cada uno. El primer modo de bombeo funciono de la siguiente manera: las valvulas adicionales a los flujos retenidos se cerraron y la mezcla de microperlas se introdujo desde la corriente de entrada, luego se paso a traves de la membrana a la salida inferior. Esta etapa de filtracion fue seguida por el lavado de la membrana usando el mismo modo de bombeo (donde la corriente de entrada suministraba lfquido exento de gotas) para eliminar las pequenas perlas restantes. Al final, las valvulas adicionales para el flujo retenido se abrieron y las perlas mas grandes salieron de la salida superior. Para el segundo modo de bombeo (figura 3(b)), tanto el retenido como las corrientes de entrada se usaron como entradas. La mezcla de perlas entro a traves de la corriente de entrada, y se introdujo un lfquido exento de perlas a partir del flujo retenido. Despues de filtrar la mezcla, se realizo una etapa de lavado usando el mismo modo de bombeo para eliminar cualquier perla pequena, cerrando las valvulas adicionales de la corriente de entrada. Finalmente, invirtiendo la presion sobre el flujo retenido, el flujo se dirigio hacia la salida superior y se recogieron perlas mas grandes en esta salida.

Una banda derecha de imagenes son imagenes de microscopfa de fluorescencia selectiva etiquetadas de a a e. La imagen a de microscopfa de fluorescencia selectiva es representativa de la mezcla inicial, que tiene partes sustancialmente iguales de microperlas (de 2 pm) y (15 pm). Las imagenes etiquetadas b y c, y dye representan respectivamente las corrientes de salida superior (retenido) y de salida inferior (filtrado) para el primer modo y el segundo modo de bombeo (esquema de control). Se observa que sustancialmente no se encuentran microperlas fluorescentes verdes en ninguna corriente de filtrado, y que el flujo retenido del primer modo (b) muestra aproximadamente 2 de 10 perlas fluorescentes azules, y ninguna fluorescencia azul en la imagen d.

Los graficos f y g son graficos de imagenes de clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS) para la distribucion de tamanos de la mezcla inicial. Los graficos h e i son imagenes de FACS para una distribucion de tamanos

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de muestras recogidas en la salida superior (retenido) aplicando el segundo modo de bombeo. Los graficos j y k son las imagenes FACS para la distribucion del tamano de la muestra recogida en la salida inferior (filtrado) aplicando el segundo modo de bombeo. Los graficos de barras l y m muestran la concentracion inicial de perlas mezcladas y la concentracion de perlas recolectadas en los canales de salida superior e inferior aplicando los modos de bombeo primero (l) y segundo (m), respectivamente.

La eficiencia de separacion se definio como la relacion entre el numero de partfculas objetivo y el numero total de partfculas recogidas en cada salida.18 Se demostro que el segundo modo era sustancialmente perfecto.

El separador tambien se probo para la separacion del cordon de tamano submicrometrico. En este experimento, se preparo una suspension de partfculas de 390 nm en agua desionizada con una concentracion de 4,5 x 105 p/ml. Luego se mezclo con una suspension de microperlas de 2 pm preparada a una concentracion de 1,5 x 104 p/ml con volumenes iguales de cada suspension. La figura 8 tiene paneles etiquetados a-d. Los paneles a-c son imagenes de microscopfa de fluorescencia selectiva de una mezcla inicial, salida inferior (filtrado) y salida superior (retenido). El panel d muestra un grafico de barras que muestra menos de aproximadamente 5% de contaminacion cruzada en el producto retenido. En principio, el dispositivo inventado se puede aplicar para separacion/clasificacion de nanopartfculas incluso mas pequenas ya que los filtros de PC con tamano de poro por debajo de 100 nm estan disponibles comercialmente. Tambien se puede usar una amplia variedad de otros filtros, activos y pasivos, y aprovechar el flujo turbulento y las flexibilidades del separador de microfluidos de bomba peristaltica de la presente invencion.

La figura 9 muestra el area de superficie ML en el canal circular en diferentes etapas del proceso de separacion para la separacion de partfculas de 2 pm-15 pm y 2 pm-390 nm. La figura 9A es una imagen de fluorescencia de la superficie de la membrana despues de la separacion de microperlas de 2 pm de microperlas de 15 pm, usando solo la primera estrategia de bombeo (flujo retenido cerrado) usando el chip de tamano de poro de 10 pm. Perlas de 15 pm permanecen en la superficie de la membrana. La misma area superficial se muestra en la figura 9b despues de la etapa de lavado con la corriente de filtrado cerrada, y el bombeo de lfquido sin perlas. Muy pocas perlas permanecieron en la superficie de la membrana. Las figuras 9C y 9D tambien son imagenes de fluorescencia, pero desde la superficie de la membrana de 800 nm en el canal circular (lado TFL), despues de recoger partfculas de 390 nm, y despues de una etapa de lavado, respectivamente. Casi todas las cuentas de 2 pm unidas a la superficie de la membrana en esta area se despegaron y se recogieron. Estos resultados indican el efecto de un flujo turbulento para separar y recoger perlas de la superficie de la membrana. Por lo tanto, el dispositivo fabricado se puede usar repetidamente sin necesidad de una limpieza adicional del area de la membrana.

La figura 10 ilustra esquematicamente un ejemplo de dos separadores de microfluidos de bomba peristaltica en un solo dispositivo, con el flujo de filtrado del primero que proporciona una fuente para el segundo. Una via se usa para interconectar estas dos capas en serie. Un primer retenido, que es el retenido del primer separador de microfluidos, tendra los componentes fluidos que no pasaron la primera membrana, que es un tipo diferente de membrana, o una membrana de porosidad mas fina que la primera membrana. El retenido de la segunda membrana tendra componentes fluidos que pasaron por la primera membrana, pero no la segunda. Un filtrado del segundo separador proporciona los componentes fluidos pasados por ambas membranas. Por lo tanto, es posible separar o clasificar tres tipos diferentes de partfculas con este dispositivo. En general, es posible una matriz con multiples separadores.

De nuevo, el dispositivo microflmdico integrado consiste principalmente en las mismas cuatro capas que se mencionaron anteriormente. Por lo tanto, no hay complejidad aumentada en terminos de la fabricacion. Por lo tanto, un dispositivo microflmdico integrado se puede fabricar rapidamente para separar/clasificar con mas de 3 tamanos diferentes.

Las trazas paralelas de las lmeas de control de presion a las regiones de presion correspondientes de los respectivos separadores pueden permitir el control consolidado y puertos y equipos neumaticos para operar las respectivas bombas peristalticas.

El dispositivo fabricado se aplico para la aplicacion en la separacion de las celulas progenitoras de oligodendrocitos (OPCs) de microglia y astrocitos que se extrajeron del sistema nervioso central de rata. Se prepararon cultivos primarios mixtos de OPC a partir de cerebros de ratas Sprague-Dawley recien nacidas. Las meninges y los vasos sangmneos se eliminaron de los hemisferios cerebrales en medio F-12 de Ham. Los tejidos se forzaron suavemente a traves de una malla de nylon de 230 pm. Las celulas disociadas se filtraron por gravedad usando el mismo tipo de malla. Este segundo filtrado se centrifugo durante 7 minutos a 1000 rpm, y el sedimento se resuspendio en medio Eagle modificado de Dubecco (DMEM) suplementado con 12,5% de suero de ternera fatal, 50 unidades/ml de penicilina y 50 pg/ml de estreptomicina. Las celulas se plaquearon en matraces de 75 cm2 revestidos con poli-L-ornitina y se incubaron a 37°C con 5% de CO2. Los matraces de celulas mixtas se usaron luego para experimentos de separacion posteriores. Las OPC formaron menos del 10% de los cultivos celulares primarios, que se consideran celulas raras. Los OCPs se enriquecieron al menos 10 veces, y la eficacia de separacion de OPCs puede alcanzar hasta el 95% (figura 11). La eficiencia de separacion es ligeramente mayor cuando el dispositivo funciona a baja presion neumatica (3 psi), lo que puede interpretarse como: algunas de las celulas de microglia y astrocitos cuyo tamano es cercano a 10 pm pueden apretarse y pasar a traves del filtro, el numero de esas celdas exprimidas y pasadas a traves del filtro disminuye al

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disminuir la presion neumatica de operacion. Nuestros experimentos tambien mostraron que las celulas separadas todav^a eran biologicamente funcionales y se diferenciaban en oligodendrocitos maduros.

En conclusion, la verificacion experimental de los separadores de microfluidos de la bomba peristaltica se ha llevado a cabo utilizando una variedad de problemas de separacion, y se ha demostrado una buena evidencia de flujos turbulentos. Se espera que el uso de los separadores de microfluidos de bomba peristaltica tenga ventajas sustanciales sobre la tecnica anterior, que no eran esperadas por los expertos en la materia.

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Otras ventajas que son inherentes a la estructura son obvias para un experto en la tecnica. Las realizaciones se describen aqrn de forma ilustrativa y no pretenden limitar el alcance de la invencion como se reivindica. Las variaciones de las realizaciones anteriores seran evidentes para un experto en la materia y el inventor pretende abarcar las siguientes reivindicaciones.

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   REIVINDICACIONES

   1. Un separador de microfluidos que comprende una bomba (10) peristaltica acoplada a una fuente y un canal retenido, un miembro (15) separador de componente fluido, y una salida (16) de filtrado, en donde:

   la bomba peristaltica comprende al menos tres areas de control de presion interconectadas por al menos un canal microflmdico o nanoflmdico que recubre el miembro (15) separador, el al menos un canal (12) y areas de control de presion que definen un circuito microflmdico cerrado; y el miembro (15) separador esta situado entre la bomba (10) peristaltica y la salida (16) de filtrado con una primera superficie del miembro de separacion acoplada con al menos un canal (12), y una segunda superficie del miembro de separacion acoplado con la salida (16) de filtrado para permitir selectivamente que los componentes fluidos pasen desde al menos un canal a la salida (16) de filtrado.
2. 2. El separador de microfluidos de la reivindicacion 1, en donde partes del al menos un canal y la salida de filtrado estan alineadas respectivamente en una direccion neta de actuacion de presion ejercida sobre el area de control de presion.
3. 3. El separador de microfluidos de la reivindicacion 1 o 2, en donde la bomba peristaltica comprende una capa elastomerica termoplastica que tiene una primera superficie con diseno unida al miembro de separacion para definir el circuito microflmdico cerrado.
4. 4. El separador de microfluidos de la reivindicacion 3 en donde la capa elastomerica termoplastica es sustancialmente plana, y de espesor uniforme, y la direccion neta de actuacion de presion para cada area de control de presion es sustancialmente perpendicular a las superficies amplias de las capas.
5. 5. El separador de microfluidos de la reivindicacion 1, en donde el canal cubre al menos el 10%, mas preferiblemente al menos el 25%, mas preferiblemente al menos el 50% de la primera superficie.
6. 6. El separador de microfluidos de la reivindicacion 1, en donde cada una de las al menos tres areas de control de presion comprende un aumento de canal para el circuito microflmdico cerrado.
7. 7. El separador de microfluidos de la reivindicacion 1, en donde el circuito microflmdico cerrado tiene dos acoplamientos: un primer acoplamiento para suministrar un fluido de entrada a separar, y un segundo acoplamiento para eliminar un retenido.
8. 8. El separador de microfluidos de la reivindicacion 7, que comprende ademas al menos una valvula de control de flujo para abrir selectivamente el primer o el segundo acoplamiento.
9. 9. El separador de microfluidos de la reivindicacion 7 que comprende ademas un tercer acoplamiento al circuito microflmdico cerrado o a un suministro del primer fluido, para suministrar selectivamente un fluido de lavado.
10. 10. El separador de microfluidos de la reivindicacion 1, en donde el miembro separador es: un filtro de superficie, un filtro de profundidad, una membrana, una membrana de osmosis o osmosis inversa, una membrana activada qmmicamente, un filtro electro osmotico, un gel de electroforesis, una membrana semipermeable, una membrana selectivamente permeable, una membrana biologica, una membrana sintetica, una membrana pasiva, una membrana activa, una membrana activable, una membrana nanoporosa accionada electricamente, una membrana cargada, una membrana polarizada, una membrana neutra, una membrana porosa, una membrana de gradiente, membrana organica, membrana inorganica, membrana lfquida, membrana de gel, membrana semisolida, membrana solida, membrana de emulsion, membrana reactiva o membrana foto reactiva.
11. 11. El separador de microfluidos de la reivindicacion 7 que comprende, ademas:

    al menos tres regiones de presion para aplicar presion a areas de control de presion respectivas; y el controlador adaptado para controlar independientemente la presion en las al menos tres regiones de presion para accionar las al menos 3 areas de control para producir en el canal una bomba de desplazamiento positivo que controla la administracion del fluido de entrada al area de filtro.
12. 12. El separador de microfluidos de la reivindicacion 11 en donde las al menos tres regiones de presion se proporcionan alineadas con las areas de control de presion modelando una capa elastomerica termoplastica en dos lados, proporcionando un lado el circuito microflmdico cerrado, proporcionando el otro las regiones de presion, donde cada region de control de presion esta alineada con un area de control de presion respectiva, y se forma una membrana entre ellas.
13. 13. El separador de microfluidos de la reivindicacion 12, en donde la bomba peristaltica comprende ademas una capa que recubre las regiones de presion, para formar cavidades cerradas dentro de las regiones de presion, para el control de las areas de control de presion mediante el suministro controlado de fluido presurizado a las cavidades cerradas alrededor de las regiones de presion.
14. 14. Un metodo para separar componentes de un fluido, que comprende:

    proporcionar un canal (12) micro o nano-flmdico autointersecable que define un camino dclico para hacer circular el fluido sobre una superficie receptora de un miembro (15) separador de componente fluido, y

    aplicar presion coordinada para canalizar en una pluralidad de areas de control de presion a lo largo de la trayectoria 5 dclica para hacer circular el fluido sobre la superficie de recepcion, aplicando una presion para fomentar una

    transmision deseada a traves del miembro (15) de separacion, y una presion de circulacion para eliminar obstrucciones superficiales en el miembro (15) de separacion.
15. 15. El metodo de la reivindicacion 14 que comprende adicionalmente despues de inyectar repetidamente el fluido hasta que se gasta el fluido, o el producto retenido contiene demasiado material que no puede pasar a traves del miembro de

    10 separacion, dispensar un fluido de lavado para enjuagar el producto retenido del canal, en donde dispensar un fluido de lavado comprende preferiblemente accionar una valvula para cerrar un suministro del fluido, o un filtrado del miembro de separacion, o para abrir una salida del producto retenido.