ES2677564T3

ES2677564T3 - Método y composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de trastornos neurodegenerativos

Info

Publication number: ES2677564T3
Application number: ES15180776.5T
Authority: ES
Inventors: Thierry Leveillard; José Alain Sahel; Alain Van Dorsselaer; Ludivine Perrocheau
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 2009-06-19
Filing date: 2010-06-18
Publication date: 2018-08-03
Anticipated expiration: 2030-06-18
Also published as: EP2442820B1; US20170176417A1; WO2010146150A1; US11313852B2; EP2442820A1; EP2997974B1; US20120156221A1; EP2997974A1

Abstract

Un compuesto que activa la ruta de señalización de BASIGINA para su uso en un método de tratamiento de un trastorno neurodegenerativo retiniano, en el que dicho compuesto es un ácido nucleico que codifica la BASIGINA.

Description

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DESCRIPCION

Metodo y composicion farmaceutica para su uso en el tratamiento de trastornos neurodegenerativos Sector de la tecnica

La invencion se refiere a un compuesto que activa la ruta de senalizacion de BASIGINA para el tratamiento de un trastorno degenerativo. En particular, La invencion se refiere a un agonista de BASIGINA para el tratamiento de un trastorno degenerativo.

Estado de la tecnica

Los trastornos neurodegenerativos han representado un desaffo durante muchos anos, tanto en la investigacion basica como en los contextos clfnicos.

Como ejemplo de tal trastorno neurodegenerativo, la retinosis pigmentaria (RP) es una degeneracion retiniana geneticamente heterogenea caracterizada por la degeneracion secuencial de una poblacion de neuronas que corresponde a los fotorreceptores bastones y conos. Los primeros signos clfnicos de la RP son la ceguera nocturna y el estrechamiento del campo de vision periferico que empeora progresivamente hasta convertirse en "tipo tunel". Finalmente, la vision central se reduce a la ceguera completa en la mayorfa de los casos. A nivel celular, los fotorreceptores bastones de la retina implicados en las visiones nocturnas y laterales se degeneran lentamente. Posteriormente, los fotorreceptores conos responsables tanto de la vision a color como de alto contraste, la agudeza visual, la percepcion detallada y la vision con luz normal se ven afectados de manera similar. El raton de degeneracion retiniana 1 (rd1) es el modelo animal mas estudiado para la retinosis pigmentaria. Este lleva una mutacion recesiva en el gen de la subunidad beta de la cGMP fosfodiesterasa especffica de bastones que conduce a la muerte de los fotorreceptores bastones por apoptosis (Carter-Dawson et al., 1978; Portera-Cailliau et al., 1994) seguida de la muerte de los conos supuestamente por falta de soporte trofico (Mohand-Said et al., 1998).

El gen RdCVF, tambien denominado tiorredoxina de tipo 6 (Txnl6) y nucleoredoxina 1 (Nxnl1), codifica la protefna Q8VC33 UniProt, que tiene una similitud limitada con la superfamilia de la tiorredoxina y que ejerce actividad trofica sobre los fotorreceptores conos (Leveillard et al., 2004). Las tiorredoxinas (TXN), normalmente, son protefnas pequenas que pueden estar implicadas en las actividades pleiotropicas, tales como el control de oxidorreduccion, la regulacion de la apoptosis y la actividad de la citocina (Holmgren, 1985; Holmgren, 1989; ARNER and Holmgren, 2000). El sitio activo conservado de TXN contiene dos cistefnas distintas (CXXC) que contribuyen a una actividad de tiol-oxidorreductasa (Arner and Holmgren, 2000, Powis and Montfort, 2001) que cataliza la reduccion de enlaces de disulfuro en multiples protefnas de sustrato (Holmgren, 1979; Holmgren, 1979). El gen RdCVF codifica dos productos mediante un proceso de corte y empalme alternativo: una protefna de longitud completa y una protefna truncada C- terminal comparten similitudes con la TRX80. Esta ultima forma de tiorredoxina-1 humana (Txn) (Pekkari et al., 2000; Pekkari et al., 2005; Liu et al., 2005) no tiene actividad de tiolrreductasa, pero esta implicada en el control del crecimiento de los globulos sangufneos mononucleares perifericos (Pekkari et al., 2000; Pekkari et al., 2003). De manera similar a la Txn, el RdCVF parece un gen bifuncional porque codifica tanto una forma larga (RdCVF-L, 217 aa, Q8VC33), que tiene una actividad de tiol-oxidorreductasa putativa (Jeffery, 1999; Jeffery, Trends Genet., vol.19(8):415-417, 2003), como una forma corta (RdCVF-S, 109 aa, Q91W38), con actividad trofica para los conos, pero sin actividad de oxidorreduccion. Sin embargo, el receptor de RdCVF aun no se ha identificado.

Sigue existiendo la necesidad de hallar nuevos compuestos que puedan usarse en el tratamiento de los trastornos neurodegenerativos.

Objeto de la invencion

Actualmente, los inventores han demostrado que la BASIGINA (tambien denominada HT7, 5A11, EMMPRIN o CD147) es el receptor de RdCVF.

Un primer objeto de la invencion se refiere a un compuesto que activa la ruta de senalizacion de BASIGINA para el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo, en el que dicho compuesto es un acido nucleico que codifica la BASIGINA.

Otro objeto de la invencion se refiere a una composicion farmaceutica para el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo que comprende un compuesto que activa la ruta de senalizacion de BASIGINA, tal como se ha descrito anteriormente, y un portador farmaceuticamente aceptable.

Tambien se describe un metodo para la exploracion de un compuesto que activa la ruta de senalizacion de BASIGINA, en particular, un agonista de BASIGINA, para el tratamiento de trastornos neurodegenerativos.

Tambien se describe el uso de la BASIGINA en un metodo para la exploracion de un farmaco para el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo.

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Descripcion detallada de la invencion Definiciones:

Tal como se usa en el presente documento, el termino "BASIGINA", tambien conocida como HT7/5A11/EMMPRIN/CD147, se refiere a un elemento de la superfamilia de las inmunoglobulinas, con una estructura relacionada con la forma primordial putativa de la familia (Miyauchi et al., 1991; Kanekura et al., 1991). La BASIGINA es un receptor de membrana integral de tipo I que tiene muchos ligandos, incluyendo las protefnas de la ciclofilina (CyP) Cyp-A y CyP-B y determinadas integrinas. Se expresa mediante muchos tipos de celulas, incluyendo celulas epiteliales, celulas endoteliales y leucocitos. La protefna BASIGINA humana contiene 269 aminoacidos que forman dos dominios similares a inmunoglobulina de tipo C2 fuertemente glucosilados en la parte extracelular N- terminal. Tambien se ha caracterizado una segunda forma de BASIGINA que contiene un dominio adicional similar a inmunoglobulina en su parte extracelular.

Tal como se usa en el presente documento, el termino "compuesto que activa la ruta de senalizacion de BASIGINA" se refiere a una molecula que da como resultado un aumento de la senalizacion a traves de la BASIGINA, ya sea mediante la regulacion ascendente de los niveles de BASIGINA presente sobre la superficie celular o mediante la estimulacion de la cascada de senalizacion aguas abajo uniendose a la BASIGINA. Los metodos para la evaluacion del nivel de activacion de la ruta de senalizacion de BASIGINA pueden incluir la medicion de la cantidad de segundo mensajero aguas abajo en la ruta de senalizacion de BASIGINA.

Los compuestos que activan la ruta de senalizacion de BASIGINA de acuerdo con la invencion incluyen moleculas que aumentan los niveles de la protefna BASIGINA sobre la superficie celular, tales como el polipeptido de BASIGINA, un acido nucleico que codifica la BASIGINA o un vector que comprende un acido nucleico que codifica la BASIGINA.

Los compuestos que activan la ruta de senalizacion de BASIGINA tambien pueden incluir agonistas de BASIGINA. Tal como se usa en el presente documento, el termino "agonista de BASIGINA" se refiere a una molecula que activa la senalizacion a traves del receptor de la BASIGINA, mediante la union a BASIGINA. Los ejemplos de tales agonistas de BASIGINA incluyen, pero sin limitacion, ciclofilina A y ciclofilina B.

Tfpicamente, un agonista de BASIGINA no es RdCVF1 o RdCVF2.

Tal como se usa en el presente documento, el termino "tratar" o "tratamiento", significa revertir, aliviar, inhibir el progreso de, o prevenir el trastorno o la afeccion a los que se aplica tal termino, o revertir, aliviar, inhibir el progreso de, o prevenir uno o mas sfntomas del trastorno o la afeccion a los que se aplica tal termino.

Tal como se usa en el presente documento, la expresion "trastorno neurodegenerativo" se refiere a un trastorno asociado a la degeneracion de las neuronas, tal como los trastornos degenerativos del sistema nervioso central, los trastornos degenerativos retinianos o los trastornos degenerativos de las neuronas olfativas. Tfpicamente, los trastornos neurodegenerativos de acuerdo con la invencion incluyen, pero sin limitacion, alcoholismo, enfermedad de Alexander, enfermedad de Alper, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrofica, ataxia-telangiectasia, enfermedad de Batten (tambien conocida como enfermedad de Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten), encefalopatfa espongiforme bovina (BSE), enfermedad de Canavan, sfndrome de Cockayne, degeneracion corticobasal, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, enfermedad de Huntington, demencia asociada al VIH, enfermedad de Kennedy, enfermedad de Krabbe, demencia del cuerpo de Lewy, enfermedad de Machado-Joseph (ataxia espinocerebelosa tipo 3), esclerosis multiple, atrofia multisistemica, narcolepsia, neuroborreliosis, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, enfermedad de Pick, esclerosis lateral primaria, enfermedades prionicas, paralisis supranuclear progresiva, enfermedad de Refsum, enfermedad de Sandhoffs, enfermedad de Schilder, degeneracion combinada subaguda de la medula espinal secundaria a anemia perniciosa, enfermedad de Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten (tambien conocida como enfermedad de Batten), ataxia espinocerebelosa (multiples tipos con caracterfsticas variables), atrofia muscular espinal, enfermedad de Steele-Richardson-Olszewski, tabes dorsal y trastornos degenerativos de la retina.

Agonistas y usos de los mismos

Un primer objeto de la invencion se refiere a un compuesto que activa la ruta de senalizacion de BASIGINA para el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo, tal como se define en las reivindicaciones.

En un aspecto de la memoria descriptiva, dicho compuesto que activa la ruta de senalizacion de BASIGINA es el polipeptido de BASIGINA humano al que se hace referencia en el numero de acceso EAW61182 de Genpept o una variante del mismo que tiene al menos el 90 % de identidad con EAW61182, preferentemente el 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad con EAW61182.

De acuerdo con la presente invencion, dicho agonista de BASIGINA es un acido nucleico que codifica la BASIGINA o un vector que comprende un acido nucleico que codifica la BASIGINA.

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Un agonista de BASIGINA puede ser un agonista de bajo peso molecular, por ejemplo, una molecula organica pequena (natural o no).

El termino "molecula organica pequena" se refiere a una molecula (natural o no) de un tamano comparable a aquellas moleculas organicas usadas generalmente en los productos farmaceuticos. El termino excluye las macromoleculas biologicas (por ejemplo, proteinas, acidos nucleicos, etc.). Las moleculas organicas pequenas preferidas varian en tamano hasta aproximadamente 5000 Da, mas p refe rente me nte hasta 2000 Da y lo mas preferentemente hasta aproximadamente 1000 Da.

Un agonista de BASIGINA puede consistir en un anticuerpo que activa la BASIGINA o un fragmento de anticuerpo que activa la BASIGINA.

Los anticuerpos dirigidos contra la BASIGINA se pueden sensibilizar de acuerdo con metodos conocidos mediante la administracion del antfgeno o epftopo adecuado a un animal hospedador seleccionado, por ejemplo, entre cerdos, vacas, caballos, conejos, cabras, ovejas y ratones, entre otros. Se pueden usar diversos adyuvantes conocidos en la materia para potenciar la produccion de anticuerpos. Aunque los anticuerpos utiles en la practica de la invencion pueden ser policlonales, se prefieren los anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales contra la BASIGINA se pueden preparar y aislar usando cualquier tecnica que proporcione la produccion de moleculas de anticuerpo mediante lfneas celulares continuas en cultivo. Las tecnicas para la produccion y el aislamiento incluyen, pero sin limitacion, la tecnica de los hibridomas originalmente descrita por Kohler y Milstein (1975); la tecnica del hibridoma de linfocitos B humanos (Cote et al., 1983); y la tecnica del hibridoma EBV (Cole et al., 1985). Como alternativa, la tecnica descrita para la produccion de anticuerpos monocatenarios (vease, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 4.946.778) puede adaptarse para producir anticuerpos monocatenarios anti-BASIGINA. Los agonistas de BASIGINA utiles en la practica de la presente invencion tambien incluyen fragmentos de anticuerpo anti-BASIGINA que incluyen, pero sin limitacion, fragmentos F(ab')2, que se pueden generar mediante la digestion con pepsina de la molecula de anticuerpo, y fragmentos Fab, que se pueden generar mediante la reduccion de los puentes de disulfuro de los fragmentos F(ab')2. Como alternativa, se pueden construir bibliotecas de expresion de Fab y/o scFv para permitir una rapida identificacion de los fragmentos que tienen la especificidad deseada para la BASIGINA.

Los anticuerpos anti-BASIGINA humanizados y los fragmentos de anticuerpo de los mismos tambien se pueden preparar de acuerdo con las tecnicas conocidas. Los "anticuerpos humanizados" son formas de anticuerpos quimericos no humanos (por ejemplo, roedores) que contienen una secuencia minima procedente de una inmunoglobulina no humana. En su mayoria, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una region hipervariable (CDR) del receptor se reemplazan por residuos de una region hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como raton, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la region marco (RM) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los correspondientes residuos no humanos. Ademas, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprendera sustancialmente la totalidad de al menos uno, y tipicamente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las RM son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado tambien comprendera, opcionalmente, al menos una parte de una region constante (Fc) de inmunoglobulina, tipicamente aquella de una inmunoglobulina humana. Los metodos para la preparacion de anticuerpos humanizados son descritos, por ejemplo, por Winter (patente estadounidense n.° 5.225.539) y Boss (Celltech, patente estadounidense n.° 4.816.397).

Los agonistas de BASIGINA pueden seleccionarse entre aptameros. Los aptameros son una clase de molecula que representa una alternativa a los anticuerpos en terminos de reconocimiento molecular. Los aptameros son secuencias de oligonucleotidos u oligopeptidos con la capacidad de reconocer practicamente cualquier clase de moleculas diana con elevada afinidad y especificidad. Tales ligandos se pueden aislar mediante la evolucion sistematica de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX) de una biblioteca de secuencias aleatorias, tal como se describe en Tuerk C. and Gold L., 1990. La biblioteca de secuencias aleatorias se puede obtener mediante la sfntesis qufmica combinatoria del ADN. En esta biblioteca, cada elemento es un oligomero lineal, finalmente modificado qufmicamente, de una secuencia unica. Las posibles modificaciones, usos y ventajas de esta clase de moleculas se han revisado en Jayasena S.D., 1999. Los aptameros peptfdicos consisten en regiones variables de anticuerpos conformacionalmente restringidas presentadas por una protefna en plataforma, tal como la tiorredoxina A de E. coli, que se seleccionan a partir de bibliotecas combinatorias mediante metodos de dos hfbridos (Colas et al., 1996).

Tambien se describe un metodo para el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo que comprende administrar a un sujeto que lo necesite un compuesto que activa la ruta de senalizacion de BASIGINA, tal como se ha descrito anteriormente.

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Tambien se describe un metodo para el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo que comprende administrar a un sujeto que lo necesite un agonista de BASIGINA, tal como se ha descrito anteriormente.

Los compuestos de la invencion pueden administrarse en la forma de una composicion farmaceutica, tal como se define a continuacion.

Preferentemente, dicho compuesto que activa la ruta de senalizacion de BASIGINA, preferentemente dicho agonista de BASIGINA, se administra en una cantidad terapeuticamente eficaz.

Por la expresion "cantidad terapeuticamente eficaz" se entiende una cantidad suficiente del compuesto para tratar y/o prevenir el trastorno neurodegenerativo.

Se entendera que el uso diario total de los compuestos y composiciones de la presente invencion lo decidira el medico responsable dentro del alcance del buen criterio medico. El nivel especffico de dosis terapeuticamente eficaz para cualquier paciente particular dependera de una diversidad de factores, incluyendo el trastorno que se este tratando y la gravedad del trastorno; la actividad del compuesto especffico empleado; la composicion especffica empleada, la edad, el peso corporal, el estado de salud general, el genero y la dieta del paciente; el tiempo de administracion, la via de administracion y la velocidad de excrecion del compuesto especffico empleado; la duracion del tratamiento; los farmacos usados en combinacion o a la vez con el polipeptido especffico empleado; y los factores similares bien conocidos en la practica medica. Por ejemplo, dentro de la experiencia de la tecnica se encuentra el inicio con dosis del compuesto a niveles mas bajos de los requeridos con el fin de lograr el efecto terapeutico deseado y aumentar gradualmente la dosificacion hasta que se logre el efecto deseado. Sin embargo, la dosificacion diaria de los productos puede variar en un amplio intervalo de 0,01 a 1.000 mg por adulto al dfa. Preferentemente, las composiciones contienen 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, 50,0, 100, 250 y 500 mg del principio activo para el ajuste sintomatico de la dosificacion al paciente a tratar. Un medicamente contiene, tfpicamente, de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 500 mg del principio activo, preferentemente de 1 mg a aproximadamente 100 mg del principio activo. Una cantidad eficaz del farmaco se suministra, normalmente, a un nivel de dosificacion de 0,0002 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal al dfa, especialmente de aproximadamente 0,001 mg/kg a aproximadamente 7 mg/kg de peso corporal al dfa.

Los compuestos de acuerdo con la invencion pueden usarse para la preparacion de una composicion farmaceutica para el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo.

Por tanto, la presente invencion tambien proporciona una composicion farmaceutica que comprende una dosis eficaz de un compuesto que activa la ruta de senalizacion de BASIGINA, de acuerdo con las reivindicaciones.

Cualquier agente terapeutico de la invencion puede combinarse con los excipientes farmaceuticamente aceptables y, opcionalmente, las matrices de liberacion sostenida, tales como los polfmeros biodegradables, para formar composiciones terapeuticas.

Los terminos "farmaceuticamente" o "farmaceuticamente aceptable" se refieren a entidades moleculares y composiciones que no producen una reaccion adversa, alergica o negativa distinta cuando se administran a un mamffero, especialmente un ser humano, segun sea adecuado. Un portador o excipiente farmaceuticamente aceptable se refiere a una carga, diluyente, material de encapsulacion o adyuvante de formulacion solido, semisolido o lfquido no toxico de cualquier tipo.

La forma de las composiciones farmaceuticas, la via de administracion, la dosificacion y el tratamiento dependeran, naturalmente, de la afeccion a tratar, la gravedad de la enfermedad, la edad, el peso y el genero del paciente, etc.

Las composiciones farmaceuticas de la invencion se pueden formular para una administracion topica, oral, intranasal, parenteral, intraocular, intravenosa, intramuscular o subcutanea y similares.

Preferentemente, las composiciones farmaceuticas contienen vehfculos que son farmaceuticamente aceptables para una formulacion capaz de inyectarse. Estas pueden estar, en particular, soluciones isotonicas, esteriles, salinas (fosfato de disodio o monosodio, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio y similares o mezclas de tales sales) o composiciones secas especialmente liofilizadas que, tras la adicion, dependiendo del caso, de agua esterilizada o solucion salina fisiologica, permiten la constitucion de soluciones inyectables.

Las dosis usadas para la administracion pueden adaptarse en funcion de diversos parametros y, en particular, en funcion del modo de administracion usado, de la patologfa relevante o, como alternativa, de la duracion de tratamiento deseada.

Ademas, otras formas farmaceuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, comprimidos u otros productos solidos para administracion oral; capsulas de liberacion prolongada; y, actualmente, puede usarse cualquier otra forma.

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Como alternativa, los compuestos que activan la ruta de senalizacion de BASIGINA puede identificarse, adicionalmente, mediante los metodos de exploracion descritos mas adelante en el presente documento.

Metodos de exploracion:

Tambien se describe un metodo para la exploracion de un compuesto que activa la ruta de senalizacion de BASIGINA.

En particular, la memoria descriptiva describe un metodo para la exploracion de un agonista de BASIGINA para el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo.

Por ejemplo, el metodo de exploracion puede medir la union de un compuesto candidato a la BASIGINA o a las celulas o membranas que portan BASIGINA, o una protefna de fusion de la misma por medio de un marcador directa o indirectamente asociado al compuesto candidato. Como alternativa, un metodo de exploracion puede implicar la medicion o, cualitativa o cuantitativamente, la deteccion de la competicion de union de un compuesto candidato al receptor con un competidor marcado (por ejemplo, un antagonista).

Ademas, los metodos de exploracion pueden someter a ensayo si el compuesto candidato da como resultado una senal generada por un agonista de BASIGINA, usando sistemas de deteccion adecuados para las celulas que portan el receptor.

En una realizacion particular, el metodo de exploracion descrito en el presente documento comprende la etapa que consiste en:

a) proporcionar una pluralidad de neuronas que expresan BASIGINA sobre su superficie;

b) incubar dichas neuronas con un compuesto candidato;

c) determinar si dicho compuesto candidato se une a y activa la BASIGINA; y

d) seleccionar el compuesto candidato que se une a y activa la BASIGINA.

En una realizacion, el receptor de BASIGINA usado en el metodo de exploracion puede ser sus ortologos y derivados definidos en la presente memoria descriptiva.

En general, tales metodos de exploracion implican la provision de celulas adecuadas que expresen BASIGINA, sus ortologos y derivados de los mismos sobre su superficie. En particular, se puede emplear un acido nucleico que codifica la BASIGINA para transfectar celulas para expresar de ese modo el receptor. Tal transfeccion puede lograrse mediante los metodos bien conocidos en la tecnica.

En una realizacion particular, las neuronas se seleccionan entre el grupo que consiste en fotorreceptores conos, neuronas, celulas de la retina, retinoblastoma y otras lfneas celulares neuronales inmortalizadas de cualquier especie (raton, ser humano...).

El metodo de exploracion puede emplearse para la determinacion de un agonista mediante el contacto de tales neuronas con los compuestos a explorar y la determinacion de si tal compuesto activa el receptor.

La determinacion de la activacion de la BASIGINA puede evaluarse mediante la determinacion de la viabilidad de las neuronas. Se considera que un compuesto aumenta la viabilidad de las neuronas si es positivo en uno cualquiera de los metodos descritos a continuacion como ejemplos de actividad de rescate neuronal.

Como alternativa, la determinacion de la activacion de la BASIGINA puede determinarse mediante el analisis de la ruta de senalizacion molecular aguas abajo. De hecho, se ha demostrado que la estimulacion de la BASIGINA por la ciclofilina A da como resultado la proteccion neuronal mediante la senalizacion a traves de Erk1/2 (Boulos et al., Neurobiology of Disease, vol 25(1), p54-64, 2007). Por tanto, la determinacion de la activacion de la BASIGINA puede llevarse a cabo mediante el control del estado de fosforilacion de Erk.

El compuesto candidato se puede seleccionar entre una biblioteca de compuestos previamente sintetizados, o una biblioteca de compuestos para los que se determina la estructura en una base de datos, o entre una biblioteca de compuestos que se han sintetizado de novo o compuestos naturales.

El compuesto candidato puede seleccionarse entre el grupo de (a) protefnas o peptidos, (b) acidos nucleicos y (c) compuestos organicos o qufmicos (naturales o no). De manera ilustrativa, pueden obtenerse bibliotecas de acidos nucleicos candidatos seleccionados previamente mediante la realizacion del metodo de SELEX descrito en los documentos US 5.475.096 y US 5.270.163. Adicionalmente, de manera ilustrativa, el compuesto candidato puede seleccionarse entre el grupo de anticuerpos dirigidos contra la BASIGINA.

Tal metodo puede usarse para explorar los agonistas de BASIGINA.

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Ademas, la memoria descriptiva describe el uso del polipeptido de BASIGINA en un metodo para la exploracion de un farmaco para el tratamiento de trastornos neurodegenerativos.

La invencion se ilustrara, adicionalmente, mediante las siguientes figuras y ejemplos.

Descripcion de las figuras

Figura 1: Union especffica para el cultivo enriquecido con conos: El peptido de RdCVF humano yodado se incubo con a. cultivos enriquecidos con conos de embrion de pollo, b. celulas epiteliales pigmentadas retinianas de cerdo, c. celulas Cos-1. La lfnea discontinua en a muestra la union especffica despues de la competicion con el peptido no marcado de raton

Figura 2: Purificacion del receptor de RdCVF mediante el ensayo de transferencia Far-Western: Fracciones de retina de pollo y fibroplastos embrionarios (CEF). S, solubles. M, fracciones de membrana. T, total. Tincion de tipo Coomassie en calles 2-4. Transferencia Far-Western en calles 5-14 con GST-RdCVFL, GST-RdCVF y GST, tal como se indica

Figura 3: Migracion del receptor de BASIGINA en SDS-PAGE: Analisis mediante transferencia Western de extractos retinianos (tomados a partir del trabajo publicado)

Ejemplos

Ejemplo 1: Union especffica para el cultivo enriquecido con conos:

Material y metodos:

El RdCVF humano (hRdCVF) y el RdCVF de raton (mRdCVF) se sintetizaron en GeneProt y se remultiplicaron (>90 % de pureza). El metodo de cloramina T se uso para marcar el hRdCVF con 125I con una actividad especffica de 2130 Ci/mmol. Las celulas de retina de pollo se aislaron y se cultivaron, tal como se ha descrito previamente (Adler and Hatlee, 1989; Fintz et al, 2003), con modificaciones menores. Las celulas se plaquearon en placas de 24 pocillos revestidas con poli-L-lisina a 3x105 celulas/cm2 (6x105/pocillo) y se cultivaron durante 24 h en un medio que contenfa suero. Despues de 24 horas, las celulas se enjuagaron tres veces y, a continuacion, se anadieron 50 pl de un tampon de union (control) o 50 pl de un tampon de union que contenfa mRdCVF no marcado (para determinar la union no especffica) a cada pocillo del cultivo. Despues de la incubacion durante 30 min a temperatura ambiente, se anadieron 50 pl de un tampon de union que contenfa [125I]-hRdCVF a cada pocillo. Despues de la incubacion durante 90 min a temperatura ambiente, las placas se incubaron a 4 °C durante 45 min. Las celulas se enjuagaron tres veces y se solubilizaron con SDS al 1 %. La radioactividad de los extractos se conto usando un contador de gamma. La union especffica se midio mediante un ensayo de competicion con RdCVF de raton recombinante no marcado en exceso. El nivel de radioactividad se redujo parcialmente mediante mRdCVF 300 nM no marcado, lo que sugiere la presencia de sitios especfficos, a pesar de que no se alcanzo la saturacion en el intervalo de concentraciones de [125I]-hRdCVF (0,05-0,5 nM, Figura 2a). En tres experimentos independientes, el mRdCVF 300 nM inhibio el 26 % (2,4 fmol/pocillo), el 32 % (1,2 fmol) y el 31 % (0,76 fmol) de la radioactividad medida en [125I]-hRdCVF 0,5 nM.

Resultados:

En ausencia de celulas, no se observo ningun efecto inhibidor de mRdCVF que sugiriera que la union especffica se habfa producido en las celulas. Se calculo una union especffica con un Kd de aproximadamente 150 pM y un Bmax de 200 sitios/celula. La diferenciacion celular parece estar implicada porque no se pudieron detectar sitios de union a RdCVF en suspensiones de celulas nuevas. Aunque la falta de union de celulas indiferenciadas puede estar reflejando la especificidad de la expresion putativa del receptor de RdCVF mediante conos, se aborda esto directamente mediante la comparacion de la union en conos de pollo con la de las celulas epiteliales pigmentadas retinianas (RPE) primarias de los cerdos. Ya que las celulas RPE no responden a la actividad trofica de RdCVF, se espera que estas no muestren ninguna union a RdCVF especffica. La radioyodacion del peptido de RdCVF sintetico se realizo con un protocolo alternativo al que se uso previamente (perlas de yodo en lugar de lactoperoxidasa). Se ha comparado la union de [125I]-hRdCVF y el efecto inhibidor del RdCVF de raton con las celulas enriquecidas con conos de retina de pollo, el epitelio pigmentado retiniano (RPE) de cerdo y las celulas de COS-1. La union no especffica es lineal para estos tres tipos de celulas examinados. La union especffica se observo unicamente en el cultivo enriquecido con conos (Figura 1). Una comparacion entre la union de [125I]-hRdCVF y el contenido de ATP en cuatro experimentos independientes muestra que existe una relacion lineal entre la union total y ATP. La IC50 se estimo en 35 nM (5,7 a 210 nM, lfmites de confianza del 95 %). Una estimacion aproximada del numero de sitios de union saturables, obtenida mediante la extrapolacion de los parametros de union, da 54.000 por celula (5.300 a 460.000, lfmites de confianza del 95 %). Esto confirma que una actividad de union especffica para RdCVF se expresa mediante conos.

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Ejemplo 2: Purificacion del receptor de RdCVF mediante el ensayo de transferencia Far-Western:

Material y metodos:

Para purificar el receptor de RdCVF de las fracciones de membrana de la retina de pollo, se desarrollo un ensayo de transferencia Far-Western (Leveillard et al., 1996). Las fracciones de protema cargadas en geles de SDS se transfieren a membranas de nitrocelulosa. Las protemas desnaturalizadas en la membrana se vuelven a naturalizar parcialmente mediante la incubacion en serie en un tampon que contiene cantidades decrecientes de guanidina, el agente desnaturalizante. La protema, usada en este caso como sonda, se produce en E. coli como una fusion de GST en el vector pGEX2TK. Anteriormente, se ha demostrado que la protema de RdCVF producida usando este sistema de vectores tiene una actividad trofica hacia los conos de pollo (Leveillard et al., 2004). Esta sonda se aplico a las protemas en la membrana (Figura 2).

Resultados:

Se han buscado las protemas que interaction con RdCVF en la membrana y las fracciones solubles de la retina embrionaria de pollo y se ha sometido a ensayo la expresion restringida de tejido usando la fraccion de membrana de fibroblastos embrionarios de pollo (CEF). Se han usado tanto las protemas de RdCVF largas como cortas como sondas, asf como GST. Cuando la protema GST se uso como control negativo, se pudieron detectar dos bandas no espedficas (* = 37, 28 kDa en la calle 14). Curiosamente, se hallaron varias protemas de interaccion espedficas en las fracciones de membrana de la retina de pollo (+ - 100, 75 y 45 kDa en la calle 6 para GST-RdCVFL de retina de pollo). La banda a 50 kDa corresponde probablemente a una protema soluble que contamina la fraccion de membrana, ya que esta enriquecida en la calle 5. La banda a aproximadamente 60 kDa, detectada en la calle 6, tiene un intervalo de expresion mas amplio, ya que tambien se detecta en la fraccion de membrana de fibroplastos embrionarios de pollo (triangulo en la calle 8). Usando los mismos extractos, la isoforma corta detecta una banda espedfica menor de 45 kDa en la fraccion de membrana de la retina de pollo (+ en la calle 10). La tincion de tipo Coomassie de estas fracciones muestra que no existe ninguna banda prominente a 45 kDa (calles 2-4). Tomados en conjunto, estos resultados indican la existencia de una protema de interaccion con RdCVF candidata en la fraccion de membrana de la retina de pollo que migra a 45 kDa. Adicionalmente, aunque no es cuantitativo, el ensayo muestra que esta interaccion es de mayor afinidad con la isoforma corta (calle 10) que la larga (calle 6) de RdCVF. Se ha demostrado que el efecto trofico esta mediado por la isoforma corta y no larga (Leveillard et al., 2004 y los datos no mostrados), lo que refuerza el interes en esta protema de 45 kDa.

Se ha realizado un analisis proteomico de la banda a 45 kDa de la fraccion de membrana de la retina de pollo (calle 3). Debido a la purificacion limitada (fraccionamiento de membrana y pagina de SDS), cada banda contiene muchas protemas. Se identificaron un total de 144 protemas usando MS/MS para al menos un peptido coincidente. El analisis de 111 protemas con secuencia cubierta en al menos 5 % muestra que 58 protemas se identificaron como protema del genoma de Gallus gallus y se consideraron para un analisis posterior. Dentro de tal lista, la presencia de la arrestina, la vimentina y la subunidad alfa de transducina de tipo cono indica la presencia de protemas retinianas dentro de esta fraccion, pero tambien indica que el protocolo de purificacion no permite la retirada de todas las protemas solubles. Se establecio una lista corta de 33 protemas candidatas retirando los candidatos poco probables como las tres protemas retinianas citadas y otras protemas abundantes y muy probablemente contaminantes como la enolasa, creatina cinasa, beta actina, ATPasa mitocondrial, factor de iniciacion de traslacion, aldolasa, glucosa 3P deshidrogenasa, glucosa fosfato isomerasa, piruvato cinasa, ribonucleoprotemas nucleares heterogeneas descritas en Casuvoglu et al. (2003). La abundancia de protemas unidas a la membrana interna de las celulas como la protema G probablemente refleja la abundancia de protemas asociadas a los receptores de la superficie celular en la preparacion.

Entre la lista de las 33 protemas candidatas, 3 protemas contienen un dominio de transmembrana (TM), un criterio que se ha retenido para la seleccion de un receptor de la superficie celular. Uno de aquellos fue el precursor de la glicoprotema HT7 de la superficie celular conocido como BASIGINA (gi|69992).

Ejemplo 3: Migracion del receptor de BASIGINA en SDS-PAGE.

La glicoprotema de la superficie celular BASIGINA se identifico originalmente como una protema de barrera hematoencefalica identica al antfgeno 5A11 que media el reconocimiento celula-celula en la retina aviar (Fadool and Linser, 1993), un anticuerpo monoclonal generado mediante la inmunizacion de ratones con celulas vivas disociadas de la retina de pollo embrionaria aislada del dfa 7 (Linser and Perkins, 1987). Aquellas celulas son muy similares a la retina de pollo embrionaria del dfa 6 usada como sistema de cultivo enriquecido en conos (Fintz et al., 2003; Leveillard et al., 2004). La migracion de esta glicoprotema en SDSPAGE es muy similar a la protema que interactua con RdCVF, tal como se observa en una figura tomada del trabajo de Fadool and Linser (Fig. 3). Curiosamente, en tal informe, los autores muestran que el anticuerpo BASIGINA (clon 5A11) inhibe la reagregacion de celulas de la retina in vitro, lo que sustenta el papel de la BASIGINA en las interacciones celula-celula. Se han identificado dos clones que codifican la BASIGINA a partir de una biblioteca de expresion construida con ARN preparado a partir de estos cultivos enriquecidos en conos. La presencia de estos dos clones de un total de 1000 EST secuenciados dentro del marco de una colaboracion continua con el Genoscope (
http://www.genoscope.cns.fr/spip/Mus-

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Ejemplo 4: Actividad de rescate neuronal de los agonistas de BASIGINA

Los agonistas de BASIGINA descritos en la presente invencion se sometieron a ensayo para determinar su capacidad para rescatar neuronas de acuerdo con los siguientes protocolos:

1) Actividad de rescate de conos

El cultivo primario es un sistema de cultivo celular primario enriquecido con conos de embrion de pollo (60-80 % de conos), tal como se describe en Fintz et al. (Invest. Ophtamol. Vis. Sci, vol 44(2): 818-825, 2003).

Despues de 7 dfas de incubacion con o sin el compuesto de ensayo, un perfodo durante el que se degeneran estas celulas posmitoticas, se puntua la viabilidad de las celulas en el cultivo usando el ensayo Live/Dead (sondas moleculares) y una plataforma de recuento celular, tal como se ha descrito previamente (Leveillard et al., 2004).

2) Actividad de rescate de neuronas sensibles olfativas

Los ratones adultos se sacrifican mediante decapitacion. La parte posterior del tabique nasal se disecciona libre de la cavidad nasal y se coloca inmediatamente en un DMEM helado que contiene 50 pg/ml de gentamicina (Eurobio; Gibco) y 10 (v/v) de suero de ternera fetal (eurobio). El cartflago del tabique se retira y la mucosa olfativa se incuba durante 30 min a 37 °C en una solucion de dispasa II de 2,4 U/MI (Roche). El epitelio olfativo se separa cuidadosamente de la lamina propria subyacente bajo el microscopio de diseccion y se tritura suavemente aproximadamente 20 veces para separar las celulas. La suspension celular resultante se transfiere a un tubo conico de 50 ml y la dispasa se inactiva mediante la adicion de 40 ml de HBSS sin calcio y magnesio. La suspension celular se centrifuga a 700 rpm durante 5 min y la pella que contiene las celulas se vuelve a suspender en un medio compuesto por DMEM que contiene insulina (10 pg/ml, Sigma), transferina (10 pg/ml, Sigma), selenio (10 pg/ml, Sigma), suero fetal de ternera (5 %), acido ascorbico (200 pM). Las celulas se plaquearon en cubreobjetos de vidrio esteriles de 12 mm revestidos con 5 pg/cm2 de colageno IV humano (Sigma); proporcionando de este modo un cultivo primario de neuronas sensibles olfativas (OSN).

Despues de 4 dfas de cultivo con o sin el compuesto de ensayo, las celulas se fijaron y se marcaron con tubulina III y se recontaron.

3) Actividad de rescate de celulas Purkinje

Despues de la decapitacion del raton en el dfa posnatal 1-3, los cerebros se diseccionan en solucion de sal equilibrada de Grey frfa que contiene 5 mg/ml de glucosa y se retiran las meninges. Las fracciones parasagitales cerebelosas (35 ° o 250 pm de espesor) se cortan en un triturador de tejido Mcllwain y se transfieren a una membrana de insertos de cultivo Millipore de 30 mm con un tamano de poro de 0,4 pm (Millicel; Millipore, Bedford, MA). Las fracciones se mantienen en cultivo en placas de 6 pocillos que contienen 3 ml de medio a 35 ° en una atmosfera del 5 % de CO2 humidificado. El medio esta compuesto del 50 % de medio basal con sales de Earle (Invitrogen), el 25 % de HBSS (Invitrogen), el 25 % de suero de caballo (Invitrogen), L-glutamina (1 mM) y 5 mg/ml de glucosa (Stoppini et al, J Neurosci Methods, vol 37(2), p173-82, 1991).

4) Actividad de rescate de neuronas corticales

La preparacion libre de suero de los cultivos primarios corticales de raton se realiza con el raton en el dfa posnatal 1. Despues de la retirada de las meninges, las cortezas enteras se disocian mecanicamente en una solucion de glucosa salina tamponada con fosfato sin cationes divalentes anadidos (NaCl 100 mM, KCl 3 mM, KH2PO4 1,5 mM, Na2HPO4 7,9 mM, glucosa 33 mM, 100 U/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina) y se vuelven a suspender en un medio Neurobasal (Invitrogen) que contiene el 2 % de suplemento B27 (Gibco), glutamina 0,5 mM; y glutamato 25 pM. Despues, se cultivan las celulas sobre cubreobjetos revestidos con poli-ornitina para producir cultivos altamente enriquecidos en neuronas corticales.

Referencias

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Carter-Dawson et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., vol. 17(6), p:489-498, 1978.

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Holmgren, Annu. Rev. Biochem., vol. 54, p:237-271, 1985.

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Jeffery, Trends Biochem. Sci., vol.24(1):8-11, 1999.

5 Jeffery, Trends Genet., vol.19(8):415-417, 2003.

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10 Pekkari et al., FEBS Lett., vol.539(1-3):143-148, 2003.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto que activa la ruta de senalizacion de BASIGINA para su uso en un metodo de tratamiento de un trastorno neurodegenerativo retiniano, en el que dicho compuesto es un acido nucleico que codifica la BASIGINA.

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2. El compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que dicho acido nucleico codifica el polipeptido al que se hace referencia en el numero de acceso EAW61182 de Genpept.
3. El compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en el que dicho trastorno degenerativo retiniano 10 se selecciona entre el grupo que consiste en retinosis pigmentaria, degeneracion macular relacionada con la edad,

sfndrome Bardet-Biedel, sfndrome de Bassen-Kornzweig, enfermedad de Best, coroidema, atrofia giratoria, amaurosis congenita de Leber, enfermedad de Refsum, enfermedad de Stargardt o sfndrome de Usher.
4. El compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicacion 3, en el que dicha enfermedad degenerativa retiniana 15 es la retinosis pigmentaria.
5. Una composicion farmaceutica para su uso en un metodo de tratamiento de un trastorno neurodegenerativo que comprende un compuesto que activa la ruta de senalizacion de BASIGINA de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y un vehfculo farmaceuticamente aceptable.

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