ES2642186T3

ES2642186T3 - Diagnóstico de la esclerosis múltiple

Info

Publication number: ES2642186T3
Application number: ES13704627.2T
Authority: ES
Inventors: Daniel Anthony; Nicola Sibson; Jacqueline PALACE
Original assignee: Oxford University Innovation Ltd
Current assignee: Oxford University Innovation Ltd
Priority date: 2012-02-07
Filing date: 2013-02-07
Publication date: 2017-11-15
Anticipated expiration: 2033-02-07
Also published as: WO2013117930A2; AU2013217415B2; CA2864026C; GB201202092D0; US20150338389A1; EP2812690B1; CA2864026A1; US20180372716A1; AU2013217415A1; EP2812690A2; WO2013117930A3

Description

DESCRIPCION

Diagnostico de la esclerosis multiple

5 [0001] La presente invencion se refiere a procedimientos de diagnostico de trastornos del sistema nervioso

central, usando el perfil de metabolitos. En particular, la presente invencion se refiere a procedimientos de diagnostico de la esclerosis multiple (EM) en sujetos humanos.

[0002] La esclerosis multiple (EM) es la causa mas comun de incapacidad progresiva en el mundo occidental. 10 Desde el inicio de la afeccion, el fenotipo de cllnico de la EM sigue bien un curso de recalda remision (EM RR) o

bien un curso progresivo (EM primaria progresiva (PP)). Despues de un periodo de tiempo en la fase de RR, la mayorla de los pacientes desarrollan una fase secundaria progresiva (SP). Es durante las fases progresivas que se produce la mayor parte de la incapacidad. Parece que predomina la inflamacion durante la fase de recalda, mientras que la neurodegeneracion es el sustrato patologico de la incapacidad durante la fase progresiva. Sin embargo, hay 15 mucho solapamiento.

[0003] Desgraciadamente, los agentes modificadores de la enfermedad actuales que se dirigen a los mecanismos inflamatorios no son eficaces en la enfermedad progresiva, y se requieren nuevas estrategias de tratamiento. La investigation de diferencias entre los fenotipos de la EM puede identificar mecanismos clave que

20 dirigen la progresion, y es la primera etapa en el desarrollo de nuevas terapias eficaces para prevenir la incapacidad.

[0004] Los criterios de valoracion principales usados actualmente en la EM consisten en escalas cllnicas e imagenes por resonancia magnetica (MRI). Estos estan asociados con una serie de desventajas. Los resultados cllnicos tienen sensibilidad baja y poca especificidad patogena, y estan abiertos a la distorsion subjetiva debido a la

25 subjetividad de los pacientes y del especialista cllnico. Un ensayo neuroprotector que mide los resultados de discapacidad cllnica puede requerir 600 o mas pacientes a lo largo de dos o incluso tres anos. La MRI se ha usado para estudiar lesiones inflamatorias y en estudios de terapias antiinflamatorias. La atrofia es un marcador subrogado para la neuroproteccion; sin embargo, carece de sensibilidad y es diflcil de medir en pacientes con enfermedad grave o avanzada cuando la atrofia es notable. Ademas, se observa pseudoatrofia cuando la inflamacion se reduce 30 tal como con farmacos inmunomoduladores. Los cambios en la mielina y el dano en el tejido cerebral que parece normal se reconocen patologicamente, pero no son faciles de medir debido a la dificultad para medir el cerebro entero y la carga de medula espinal.

[0005] La identification de biomarcadores especlficos en fluidos biologicos se ha considerado en una serie de 35 enfermedades, tanto en modelos animales como en seres humanos. Se han ensayado en la orina de pacientes con

enfermedad neurologica, incluyendo la EM, marcadores especlficos de la enfermedad, tales como material derivado de protelna basica mielina que indican desmielinizacion (Whitaker et al., 1994; Whitaker et al., 1995). Sin embargo, estos estudios se centraban en la detection de un solo metabolito especlfico, y aunque se han identificado diferencias a nivel de grupo, el valor predictivo a un nivel individual ha sido bajo.

40

[0006] El documento WO 2011/067243 A1 describe un metodo para el diagnostico de la esclerosis multiple en un sujeto.

[0007] Por lo tanto se necesita un procedimiento mejorado de diagnostico de la EM que tenga un mayor valor 45 predictivo a nivel individual. Tambien es necesario identificar criterios de valoracion subrogados de la inflamacion y

neurodegeneracion que se puedan usar para poner en marcha estudios cllnicos de tratamientos de la EM. Serla ademas ventajoso si el procedimiento mejorado pudiera diferenciar entre fases (tambien denominado estadios) de la EM.

50 [0008] La presente invencion se dirige a uno o mas de los problemas anteriores proporcionando

procedimientos para el diagnostico de la EM en seres humanos.

[0009] En un aspecto, la invencion proporciona un procedimiento in vitro para el diagnostico de la EM en un

sujeto de ensayo humano, que comprende:

55

a.

(i) determinar las concentraciones relativas de tres o mas metabolitos en una muestra de dicho sujeto, en el que

dichos tres o mas metabolitos se seleccionan de: metabolitos de la sangre, en el que dichos metabolitos de la sangre comprenden: fosfocolina, lactato, especies N-acetilo, acido graso, glucosa y L-glutamina;

(ii) comparar las concentraciones relativas de dichos tres o mas metabolitos en la muestra con las concentraciones 5 relativas de los mismos metabolitos en al menos un patron de referencia de un sujeto que no tiene EM; y

(ii) identificar una diferencia de concentracion para dichos tres o mas metabolitos en la muestra con respecto al patron de referencia, en el que dicha diferencia de concentracion se selecciona de: un aumento en la concentracion 10 de uno o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: acido graso, especies N-acetilo y lactato; y una disminucion en la concentracion de los metabolitos de la sangre glucosa y fosfocolina; o

en el que la dicha diferencia de concentracion se selecciona de: un aumento en la concentracion de uno o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: acido graso, especies de N-acetilo y L-glutamina; y una disminucion en la concentracion de los metabolitos de la sangre glucosa y fosfocolina;

15 en el que dichas diferencias de concentracion se correlacionan con la presencia de EM;

en el que dicha especie N-acetilo es N-acetil-aspartato y/o N-acetil-glucoprotelna; y/o

en el que el acido graso tiene un valor de resonancia de 50,90, ancho, CH3, 51,30, ancho, CH2CH2CH3, 51,55, ancho, CH2CH3, 5 2,05, ancho, CH2CH=, 5 2,25, ancho, CH2COOH, 55,35, ancho, CH2CH= respecto a la resonancia 20 del metilo del 3-trimetilsilil-1-propionato (TSP) definido a 0,00 ppm determinable por RMN 1H; y/o

b.

(i) determinar las concentraciones relativas de dos o mas metabolitos en una muestra de dicho sujeto, en el que 25 dichos dos o mas metabolitos se seleccionan de: metabolitos de la orina, en el que dichos metabolitos de la orina

comprenden: citrato, creatinina, lactato y N-oxido de trimetilamina (TMSO);

(ii) comparar las concentraciones relativas de dichos dos o mas metabolitos en la muestra con las concentraciones relativas de los mismos metabolitos en al menos un patron de referencia de un sujeto que no tiene EM;

30 y

(iii) identificar una diferencia de concentracion para cada uno de dichos dos o mas metabolitos en la muestra con respecto al patron de referencia, en el que dicha diferencia de concentracion se selecciona de: un aumento en la concentracion de uno o mas metabolitos de la orina seleccionados de: TMAO y citrato; y

35

una disminucion en la concentracion de uno o mas metabolitos de la orina seleccionados de: creatinina y lactato; en el que dicha diferencia de concentracion se correlaciona con la presencia de EM.

[0010] Mediante el uso de espectroscopla de RMN 1H (resonancia magnetica nuclear) de alta resolucion,

40 acoplada con analisis discriminante por mlnimos cuadrados parcial (PLS-DA), los autores de la presente invencion han identificado metabolitos que se pueden usar para el diagnostico de la EM. Se describe ademas en el presente documento la diferenciacion entre diferentes fases especlficas de la enfermedad de la EM. Los metabolitos son moleculas pequenas que son productos intermedios y/o productos del metabolismo de los mamlferos.

45 [0011] Se describen en el presente documento dos o mas (por ejemplo, dos, tres o cuatro) metabolitos

seleccionados de: metabolitos de la sangre, en los que dichos metabolitos de la sangre comprenden: fosfocolina, lactato, especies N-acetilo y beta-hidroxibutirato; y/o metabolitos de la orina, en los que dichos metabolitos de la orina comprenden: TMAO, citrato, creatinina y lactato.

50 [0012] Se describen en el presente documento dos o mas (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco o seis)

metabolitos seleccionados de: metabolitos de la sangre, en los que dichos metabolitos de la sangre comprenden: fosfocolina, lactato, especies N-acetilo, beta-hidroxibutirato, acido graso (preferiblemente acido graso 5x-y 0,88, 1,30, 5,35) y glucosa; y/o metabolitos de la orina, en los que dichos metabolitos de la orina comprenden: TMAO, citrato, creatinina y lactato.

55

[0013] Se describen en el presente documento dos o mas metabolitos seleccionados de: metabolitos de la

sangre, en los que dichos metabolitos de la sangre comprenden: L-glutamina, alanina, glucosa, fosfocolina, acido

graso, especies N-acetilo, lactato, beta-hidroxibutirato; y/o metabolitos de la orina, en los que dichos metabolitos de la orina comprenden: TMAO, citrato, creatinina y lactato.

[0014] En una realizacion, “especies N-acetilo” significa al menos uno de los siguientes metabolitos: N-acetil- 5 aspartato y N-acetil-glucoprotelna.

[0015] En una realizacion, “glucosa” comprende alfa-glucosa y beta-glucosa. En una realizacion, la glucosa es alfa-glucosa. En una realizacion, la glucosa es beta-glucosa.

10 [0016] En una realizacion, dichos metabolitos comprenden ademas un singlete (5x-y 3,37) y un singlete (5x-y

2,65), medido usando RMN 1H.

[0017] En una realizacion, dichos metabolitos estan asociados con los siguientes parametros, medidos

usando RMN 1H (Clave: 5 - desplazamiento qulmico, M - multiplicidad, A - asignacion de proton, s - singlete, d - 15 doblete, t - triplete, q - cuartete, dd - doblete de dobletes, ddd - doblete de dobletes de dobletes, m - multiplete, ancho - resonancia ancha, 5x-y centro de la senal identificada por SIMCA. Los valores de resonancia (desplazamiento qulmico) se indican con respecto a la resonancia del metilo del 3-trimetilsilil-1 -propionato (TSP) definida a 0,00 ppm, y se indican con un margen de error de ± 0,01 ppm):

20 alanina (51,46, d, CH3; 53,73, q, CH), acido graso (50,90, ancho, CH3, 51,30 ancho, CH2CH2CH3, 51,55, ancho, CH2CH3, 52,05, ancho, CH2CH=, 52,25, ancho, CH2COOH, 55,35, ancho, CH2CH=), a-glucosa (53,42, dd, C(4)H, 53,44, dd, C(6)HaHb, 53,54, dd, C(2)H, 53,73, dd, C(3)H, 53,79, dd, C(6)H4Hb, 53,86, m, C(5)H, 55,24, d, C(1)H), p- glucosa (53,26, dd, C(2)H, 53,40, dd, C(4)H, 53,47, dd, C(5)H, 53,49, dd, C(3)H, 53,86, d, C(6)H2, 54,63, d, C(1)H), lactato (51,32 d, CH3, 54,11, q, CH), especies N-acetilo (52,03, s ancho, COCH3), p-hidroxibutirato (51,19 d, CH3, 25 52,28, m, CHaHb, 52,37, m, CHaHb, 54,12, m, CH), fosfocolina (53,25, s, N(CH3)3, 53,59, t, NCH2, 54,17, m, NCH2CH2), L-glutamina (52,13, m, CH2CHNH2, 52,45, m, OCCH2, 53,77, t, CH2CHNH2), singlete no identificado (5x- y3,37), singlete no identificado (5x-y2,65), citrato (52,50, d, CHaHb, 52,65, d, CHaHb), creatinina (53,05, s, NCH3, 54,10, s, CH2), y N-oxido de trietilamina (TMAO) (53,26, s, ON(CH3)3).

30 [0018] Los autores de la presente invencion han descubierto que hay presentes diferencias en las

concentraciones de los metabolitos anteriores, comparado con un patron de referencia especlfico, en la sangre y/o orina de sujetos que tienen EM, y que la determination de las concentraciones de dichos metabolitos en la sangre/orina de un sujeto de ensayo se puede usar para diagnosticar la EM. Por lo tanto, el procedimiento de la presente invencion se puede usar para el diagnostico de la EM. Se describe en el presente documento un 35 procedimiento que permite diagnosticar una fase especlfica de la enfermedad de la EM.

[0019] Como se usa en el presente documento en relation con la EM, “fase de la enfermedad” se refiere a fenotipos cllnicos especlficos de la EM, de EM de fase de recalda-remision (RR), EM de fase primaria progresiva (PP) y EM de fase secundaria progresiva (SP). Dichos fenotipos cllnicos describen el curso de la enfermedad desde

40 el inicio.

[0020] La muestra que se va a ensayar usando el procedimiento de la invencion puede proceder de sangre u orina que se ha obtenido de un sujeto de ensayo humano.

45 [0021] El termino sangre comprende sangre entera, suero de la sangre (en lo sucesivo “suero”) y plasma

sangulneo (en lo sucesivo “plasma”. El suero y el plasma proceden de la sangre y por lo tanto se pueden considerar como subtipos especlficos dentro del genero mas amplio de “sangre”. Los procedimientos para obtener suero o plasma de la sangre se conocen en la materia. Por ejemplo, se conoce en la materia que la sangre se puede someter a centrifugation con el fin de separar los globulos rojos, globulos blancos y el plasma. El suero se define 50 como el plasma que carece de factores de coagulation. El suero se puede obtener por centrifugacion de la sangre en el que se ha producido el procedimiento de coagulacion. Opcionalmente, esto se puede llevar a cabo en tubos de centrlfuga especiales disenados para este fin.

[0022] Una muestra para usar en el procedimiento de la presente invencion puede proceder de sangre u 55 orina que se ha sometido a procesamiento despues de obtenerse de un sujeto de ensayo. Alternativamente, una

muestra puede proceder de sangre u orina que no se ha sometido a ningun procesamiento despues de obtenerla de un sujeto de ensayo.

[0023] El procedimiento de la presente invencion abarca, por lo tanto, el uso de muestras que han tenido

procesamiento mlnimo o cero antes del ensayo. Esto proporciona una ventaja significativa frente a procedimientos de la tecnica anterior, en terminos de tiempo, coste y viabilidad. A modo de ejemplo, una muestra de orina obtenida de un sujeto de ensayo se puede ensayar directamente usando el procedimiento de la presente invencion, sin procesamiento adicional. Las muestras de suero y plasma se pueden obtener facilmente de muestras de sangre 5 usando tecnicas simples y facilmente disponibles que son bien conocidas en la tecnica, como se ha descrito antes.

[0024] El procedimiento de la presente invencion es un procedimiento de diagnostico in vitro. Por lo tanto, el procedimiento de la presente invencion se puede llevar a cabo in vitro en una muestra aislada que se ha obtenido de un sujeto de ensayo.

10

[0025] Se describen en el presente documento una serie de ventajas. El uso de muestras obtenidas de fluidos tisulares que son facilmente accesibles permite que las muestras sean medidas longitudinalmente. Ademas, los procedimientos descritos en el presente documento se pueden usar ventajosamente para estudiar grupos de pacientes con afecciones neuroprotectoras puras, afecciones inflamatorias puras y diferentes fases y tipos de la EM,

15 permitiendo as! la separacion de los procesos patologicos para la medicion. Por ejemplo, un resultado util serla “un movimiento de la fase de recalda-remision de la EM a la fase secundaria progresiva” (la primera de las fases temprana produce poca discapacidad permanente mientras que la ultima es donde la discapacidad aumenta progresivamente). En este momento, esta transferencia es gradual y no cllnicamente clara, de modo que una fecha solo se puede identificar de forma retrospectiva y solo en el plazo de 12-18 meses. Por lo tanto, analizando los 20 biomarcadores de estas dos fases usando procedimientos descritos en el presente documento, se puede usar un tiempo de transferencia como un resultado. Ademas, usando procedimientos descritos en el presente documento para separar la EM temprana de la tardla, se pueden identificar marcadores de diferenciacion que pueden medir el progreso de la enfermedad. De forma similar, el procedimiento de la presente invencion se puede usar para identificar caracterlsticas especlficas de diagnostico relevantes para la EM frente a otras afecciones inflamatorias y 25 lo mismo con afecciones neurodegenerativas. Esto proporciona la identificacion de marcadores etiologicos relevantes que se pueden usar para diagnostico, y objetivos de tratamiento. Tambien se describen en el presente documento nuevos biomarcadores para evaluar tratamientos neuroprotectores.

[0026] Un metabolito de la sangre es un metabolito que se puede identificar en la sangre (incluyendo suero y 30 plasma). Un metabolito de la orina es un metabolito que se puede identificar en la orina. Los autores de la presente

invencion han identificado el metabolito lactato tanto en el suero como en la orina, y por lo tanto se clasifica tanto como un metabolito de la sangre como un metabolito de la orina.

[0027] Los autores de la presente invencion han descubierto que resultados que tengan una gran utilidad (tal

35 como alta precision y alto valor predictivo) requieren que se determinen las concentraciones de al menos dos

metabolitos. Se ha encontrado que los procedimientos de la tecnica anterior que miden solo un metabolito individual carecen de precision y valor predictivo.

[0028] Las concentraciones de los metabolitos en la muestra (como se ha descrito antes) se pueden 40 determinar usando cualquier tecnica adecuada conocida en la materia. A modo de ejemplo, se pueden usar las

siguientes tecnicas para detectar y cuantificar moleculas pequenas en disolucion, y por lo tanto son adecuados para determinar concentraciones de metabolitos: espectroscopla de resonancia magnetica nuclear (RMN), espectrometrla de masas, cromatografla de gases, espectrometrla ultravioleta (UV) (por ejemplo en combinacion con cromatografla llquida de alto rendimiento [HPLC] como HPLC-UV) y espectroscopla infrarroja.

45

[0029] En una realizacion, se determinan las concentraciones de dichos metabolitos usando espectroscopla

de RMN. En una realizacion, se determinan las concentraciones de dichos metabolitos usando espectrometrla de masas. En una realizacion, se determinan las concentraciones de dichos metabolitos usando HPLC-UV. En una realizacion, se determinan las concentraciones de dichos metabolitos usando espectroscopla infrarroja.

50

[0030] La concentration de un metabolito en la muestra de diagnostico se puede expresar en una serie de formas diferentes, por ejemplo, como concentracion molar (numero de moles de metabolito por unidad de volumen de muestra de diagnostico), o concentracion de masa (masa de metabolito por unidad de volumen de muestra de diagnostico). Alternativamente, la concentracion de un metabolito se puede expresar como partes por millon (ppm) o

55 partes por billon (ppb). Dichas formas de expresar la concentracion de una molecula pequena en disolucion son conocidas en la materia.

[0031] Por lo tanto, en una realizacion, la concentracion de un metabolito en la muestra de diagnostico es la concentracion molar de dicho metabolito. En una realizacion, la concentracion de un metabolito en la muestra de

diagnostico es la concentracion en masa de dicho metabolito.

[0032] La concentracion de un metabolito en la muestra de diagnostico se puede expresar por comparacion con la concentracion de un metabolito diferente en la misma muestra (es decir, en terminos relativos). A modo de

5 ejemplo, la concentracion de un metabolito en la muestra de diagnostico, en la muestra de diagnostico se puede normalizar por comparacion con la concentracion de un metabolito de referencia diferente dentro de la misma muestra de diagnostico. Ejemplos de metabolitos de referencia adecuados son glucosa y creatinina.

[0033] En una realizacion, un patron de referencia comprende (o consiste en) una muestra o muestras de 10 sangre (que incluyen una muestra o muestras de suero y una muestra o muestras de plasma), o una muestra o

muestras de orina, procedentes de sangre u orina (segun sea adecuado) obtenidas de un sujeto o sujetos de referencia, en el que el sujeto de referencia es distinto del sujeto de ensayo.

[0034] En una realizacion, un “patron de referencia” comprende (o consiste en) una serie de datos 15 relacionados con la concentracion de dichos metabolitos en una muestra o muestras de sangre (incluyendo suero y

plasma) o de orina procedentes de sangre u orina obtenidos de un sujeto o sujetos de referencia, en el que el sujeto de referencia es un sujeto distinto del sujeto de ensayo. El conjunto de datos (como se ha descrito antes) se obtiene midiendo la concentracion de dichos metabolitos. Dicha medicion se puede llevar a cabo usando cualquier tecnica conocida en la materia, por ejemplo, una de las siguientes: espectroscopla de resonancia magnetica nuclear (RMN), 20 espectrometrla de masas, cromatografla de gases, espectrometrla ultravioleta (UV) (por ejemplo en combinacion con cromatografla llquida de alto rendimiento [HPLC] como HPLC-UV) y espectroscopla infrarroja.

[0035] En una realizacion, el patron de referencia comprende (o consiste en) una serie de datos relacionados con la concentracion de dichos metabolitos en una muestra o muestras procedentes de un solo sujeto de referencia,

25 en el que el sujeto de referencia es distinto del sujeto de ensayo.

[0036] En una realizacion, el patron de referencia comprende (o consiste en) una serie de datos relacionados con la concentracion de dichos metabolitos en una muestra procedente de una pluralidad (es decir, dos o mas) sujetos de referencia. Por lo tanto, en una realizacion, el patron de referencia se obtiene de la mezcla de datos

30 obtenidos de dos o mas (p. ej., tres, cuatro, cinco, 10, 15, 20 o 25) sujetos de referencia y calculando una concentracion promedio (por ejemplo, media o mediana) para cada metabolito. Por lo tanto, el patron de referencia puede reflejar concentraciones promedio de dichos metabolitos en la sangre y/o la orina en una poblacion dada de sujetos de referencia. Dichas concentraciones se pueden expresar en terminos relativos, de la misma forma descrita antes en relacion con la muestra que se va a ensayar usando el procedimiento de la invencion.

35

[0037] Cuando se comparan concentraciones entre la muestra y el patron de referencia, el modo en el que se expresan las concentraciones coincide entre la muestra y el patron de referencia. Por lo tanto, se puede comparar una concentracion relativa con una concentracion relativa.

40 [0038] El patron de referencia procede de un sujeto (o sujetos) que no tiene (o tienen) EM. Por lo tanto, la

comparacion de una muestra de un sujeto de ensayo con dicho patron de referencia puede permitir el diagnostico de la EM.

[0039] Se describe en el presente documento un patron de referencia obtenido de un sujeto (o sujetos) que 45 tiene una de las siguientes fases especlficas de la enfermedad EM: secundaria progresiva, de recalda-remision y

primaria progresiva. Se describe en el presente documento un patron de referencia que es un patron de fase especlfico de la enfermedad EM.

[0040] Se describe en el presente documento un patron de referencia que es un patron de fase de la EM 50 secundaria progresiva. Se describe en el presente documento un patron de referencia que se obtiene de un sujeto o

sujetos previamente diagnosticados de EM de fase secundaria progresiva.

[0041] Se describe en el presente documento un patron de referencia que es un patron de EM de fase de recalda-remision. Se describe en el presente documento un patron de referencia que se obtiene de un sujeto o

55 sujetos previamente diagnosticados de EM de recala-remision.

[0042] El patron de referencia se obtiene del mismo tipo de fluido biologico (sangre u orina) que la muestra que se va a ensayar, permitiendo as! una comparacion adecuada entre los dos. Por lo tanto, a modo de ejemplo, si la muestra se obtiene de orina, el patron de referencia se obtiene tambien de orina. Alternativamente, si la muestra

es una muestra de sangre (p. ej., una muestra de plasma o suero), entonces el patron de referenda tambien sera una muestra de sangre (p. ej., una muestra de plasma o una muestra de suero, segun sea adecuado).

[0043] Los autores de la presente invencion han descubierto que se pueden identificar variaciones en las 5 concentraciones de metabolitos (como se ha descrito antes) en la sangre y/o la orina en sujetos que tienen EM,

comparado con sujetos de control sanos. Por lo tanto, dichas variaciones se pueden usar para diagnosticar la EM.

[0044] La expresion “diferencia de concentracion” abarca diferencias tanto positivas como negativas. Por lo tanto, una diferencia de concentracion puede significar que la concentracion de un metabolito es mayor en la

10 muestra que se esta ensayando que en el patron de referencia. Alternativamente, una diferencia de concentracion puede significar que la concentracion de un metabolito es menor en la muestra que en el patron de referencia.

[0045] La identificacion de una diferencia de concentracion (como se ha descrito antes) se puede lograr usando procedimientos de analisis estadlstico. A modo de ejemplo, se puede usar la espectroscopla de RMN para

15 obtener un espectro de RMN para una muestra. Despues se pueden aplicar procedimientos de analisis estadlstico (por ejemplo, analisis discriminante por mlnimos cuadrados parcial [PLS-DA]), para comparar dicho espectro con un espectro de RMN obtenido para un patron de referencia, permitiendo la identificacion de diferencias de concentracion.

20 [0046] Se describe en el presente documento que tambien se pueden asociar variaciones en las

concentraciones de metabolitos (como se ha descrito antes) con fases especlficas de la enfermedad de la EM (tales como EM SP, EM RR y EM PP). Por lo tanto, se describe en el presente documento el diagnostico de una fase especlfica de la enfermedad de la EM en un sujeto de ensayo. Esto se puede lograr tanto en sujetos a los que no se les ha diagnosticado previamente EM como en sujetos a los que se les ha diagnosticado previamente EM.

25

[0047] Por lo tanto, al permitir el diagnostico de una fase de la enfermedad de la EM en un sujeto de ensayo,

el procedimiento descrito en el presente documento proporciona una ventaja significativa frente a procedimientos de la tecnica anterior. Antes de la presente descripcion, el diagnostico de una fase de la enfermedad de la EM se habrla logrado de forma retrospectiva mediante la evaluacion del fenotipo cllnico de un paciente de EM. El procedimiento 30 descrito en el presente documento permite un diagnostico mucho mas rapido de la fase de la enfermedad de la EM en un a paciente. A modo de ejemplo, el procedimiento descrito en el presente documento permite el diagnostico de una fase de la enfermedad de la EM en ausencia de signos cllnicos exteriores de dicho fenotipo. Por lo tanto, a modo de ejemplo adicional, el procedimiento descrito en el presente documento permite el diagnostico temprano de la fase secundaria progresiva de la EM en un paciente al que se ha diagnosticado previamente EM en fase de 35 recalda-remision, en el que el paciente aun no ha manifestado signos cllnicos exteriores de la EM secundaria progresiva. Por lo tanto, el procedimiento descrito en el presente documento permite de forma ventajosa que los profesionales medicos hagan mejores elecciones en relacion con las opciones de terapia para un paciente con EM, y en una etapa mas temprana de lo que serla posible de otra forma.

40 [0048] Se describe en el presente documento que se puede diagnosticar una fase especlfica de la

enfermedad de la EM con mayor precision usando subconjuntos especlficos de metabolitos citados antes.

[0049] Se describen en el presente documento metabolitos que comprenden dos o mas metabolitos de la sangre (por ejemplo, dos, tres o mas, cinco o mas, seis o mas, siete o mas, u ocho o mas) seleccionados de: n-

45 butirato, N-acetil-aspartato, glucosa, taurina-betalna, acido ascorbico, N-acetil-glucoprotelna, acido graso y colina.

[0050] Se describen en el presente documento metabolitos que comprenden (o consisten en) los siguientes ocho metabolitos de la sangre: n-butirato, N-acetil-aspartato, glucosa, taurina-betalna, acido ascorbico, N-acetil- glucoprotelna, acido graso y colina.

50

[0051] Se describe en el presente documento que dichos metabolitos comprenden dos o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: n-butirato, N-acetil-aspartato, glucosa, taurina-betalna, acido ascorbico, N-acetil- glucoprotelna, acido graso y colina (como se ha descrito antes); el patron de referencia se obtiene de un sujeto (o sujetos) que no tiene (o tienen) EM; y dichas diferencias de concentracion se seleccionan de:

55

un aumento en la concentracion de uno o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: n-butirato, N-acetil- aspartato, N-acetil-glucoprotelna y acido graso; y/o una disminucion en la concentracion de uno o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: glucosa, taurina-betalna, acido ascorbico y colina.

[0052] Se describen en el presente documento diferencias de concentration que comprenden (o consisten en):

un aumento en la concentracion de: n-butirato, N-acetil-aspartato, N-acetil-glucoproteina y acido graso; y una 5 disminucion en la concentracion de: glucosa, taurina-betaina, acido ascorbico y colina.

[0053] Se describe en el presente documento que cambios en la concentracion de los metabolitos de la sangre descritos antes son adecuados para usar en el diagnostico de la EM en fase PP. Por lo tanto, en una description, en la que dichos metabolitos comprenden dos o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: n-

10 butirato, N-acetil-aspartato, glucosa, taurina-betaina, acido ascorbico, N-acetil-glucoproteina, acido graso y colina (como se ha descrito antes); dichas diferencias de concentracion confirman la presencia de la EM en fase primaria progresiva (PP).

[0054] Se describen en el presente documento metabolitos que comprenden dos o mas metabolitos de la 15 sangre (por ejemplo, dos, tres o mas, cuatro o mas, cinco o mas, o seis) seleccionados de: fosfocolina, lactato,

especies N-acetilo, beta-hidroxibutirato, acido graso (preferiblemente acido graso 5x-y 0,88, 1,30, 5,35) y glucosa.

[0055] Se describen en el presente documento metabolitos que comprenden (o consisten en) los siguientes seis metabolitos: fosfocolina, lactato, especies N-acetilo, beta-hidroxibutirato, acido graso (preferiblemente acido

20 graso 5x-y 0,88, 1,30, 5,35) y glucosa.

[0056] Se describe en el presente documento que, cuando dichos metabolitos comprenden dos o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: fosfocolina, lactato, especies N-acetilo, beta-hidroxibutirato, acido graso (preferiblemente acido graso 5x-y 0,88, 1,30, 5,35) y glucosa (como se ha descrito antes), el patron de referencia se

25 obtiene de un sujeto (o sujetos) que no tiene (o no tienen) EM; y dichas diferencias de concentracion se seleccionan de: un aumento en la concentracion de uno o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: acido graso, especies N-acetilo y lactato; y/o

una disminucion en la concentracion de uno o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: glucosa y fosfocolina. 30

[0057] Se describen en el presente documento metabolitos que comprenden dos o mas metabolitos de la sangre (por ejemplo, dos, tres o mas, o cuatro o mas) seleccionados de acido graso, especies N-acetilo, glucosa, fosfocolina y L-glutamina.

35 [0058] Se describen en el presente documento dos o mas metabolitos que comprenden ademas un singlete

(5x-y 3,37) y un singlete (5x-y 2,65), medido usando RMN 1H.

[0059] Se describen en el presente documento metabolitos que comprenden (o consisten en) los siguientes cinco metabolitos: acido graso, especies N-acetilo, glucosa, fosfocolina y L-glutamina.

40

[0060] Se describe en el presente documento que, donde dichos metabolitos comprenden dos o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: acido graso, especies N-acetilo, glucosa, fosfocolina y L-glutamina (como se ha descrito antes); el patron de referencia se obtiene de un sujeto (o sujetos) que no tiene (o no tienen) EM; y dichas diferencias de concentracion se seleccionan de:

45

un aumento en la concentracion de uno o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: acido graso, especies N- acetilo y L-glutamina; y/o una disminucion en la concentracion de uno o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: glucosa y fosfocolina.

50 [0061] Se describen en el presente documento diferencias de concentracion que comprenden (o consiste en;

un aumento en la concentracion de: acido graso, especies N-acetilo y L-glutamina; y una disminucion en la concentracion de: glucosa y fosfocolina.

55 [0062] Se describen en el presente documento diferencias de concentracion que comprenden (o consisten

en):

un aumento en la concentracion de: acido graso, especies N-acetilo, L-glutamina y un singlete (5x-y 3,37) medido usando RMN 1H; y una disminucion en la concentracion de: glucosa, fosfocolina y un singlete (5x-y 2,65) medido

usando RMN 1H.

[0063] Se describen en el presente documento cambios en la concentracion de los metabolitos de la sangre descritos antes que son particularmente adecuados para usar en el diagnostico de la EM en fase PP. Se describe en

5 el presente documento que, donde dichos metabolitos comprenden dos o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: fosfocolina, lactato, especies N-acetilo, beta-hidroxibutirato, acido graso (preferiblemente acido graso 5x-y 0,88, 1,30, 5,35) y glucosa; o acido graso, especies N-acetilo, glucosa, fosfocolina y L-glutamina (como se ha descrito antes); dichas diferencias de concentracion confirman la presencia de EM en fase primaria progresiva (PP).

10

[0064] Se describe en el presente documento que, donde dichos metabolitos comprenden dos o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: acido graso, especies N-acetilo, glucosa, fosfocolina, L-glutamina, un singlete (5x-y 3,37) y un singlete (5x-y 2,65) medido usando rMn 1H, (como se ha descrito antes); dichas diferencias de concentracion confirman la presencia de EM en fase primaria progresiva (PP).

15

[0065] Se describen en el presente documento metabolitos que comprenden dos o mas metabolitos de la sangre (por ejemplo, dos, tres o mas, cuatro o mas, cinco o mas, seis o mas, siete o mas, ocho o mas, o nueve o mas) seleccionados de: acido graso, acido ascorbico, n-butirato, tirosina, glucosa, lactato, alanina, fosfocolina, acido oxiglutarico y N-acetil-aspartato; y/o dos o mas metabolitos de la orina (por ejemplo, dos, o tres o mas)

20 seleccionados de: citrato, inositol, lactato y TMAO.

[0066] Se describen en el presente documento metabolitos que comprenden dos o mas metabolitos de la sangre (por ejemplo, dos, tres o mas, o cuatro o mas) seleccionados de: acido graso, acido ascorbico, n-butirato, tirosina y glucosa.

25

[0067] Se describen en el presente documento metabolitos que comprenden (o consisten en) los cinco siguientes metabolitos de la sangre: acido graso, acido ascorbico, n-butirato, tirosina y glucosa.

[0068] Se describe en el presente documento que, donde dichos metabolitos comprenden dos o mas 30 metabolitos de la sangre seleccionados de: acido graso, acido ascorbico, n-butirato, tirosina y glucosa (como se ha

descrito antes); el patron de referencia se obtiene de un sujeto (o sujetos) que no tiene (o no tienen) EM y dichas diferencias de concentracion se seleccionan de:

una disminucion en la concentracion de uno o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: acido graso, acido 35 ascorbico, n-butirato, tirosina y glucosa.

[0069] Se describen en el presente documento diferencias de concentracion que comprenden (o consisten en):

40 una disminucion en la concentracion de: acido graso, acido ascorbico, n-butirato, tirosina y glucosa.

[0070] Se describe en el presente documento que cambios en la concentracion de los metabolitos de la sangre descritos antes son adecuados para usar en el diagnostico de la EM en fase SP. En una descripcion cuando dichos metabolitos comprenden dos o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: acido graso, acido ascorbico,

45 n-butirato, tirosina y glucosa (como se ha descrito antes); dichas diferencias de concentracion confirman la presencia de EM en fase secundaria progresiva (SP).

[0071] Se describen en el presente documento metabolitos que comprenden dos o mas (por ejemplo, dos, o tres o mas) metabolitos de la orina seleccionados de: citrato, inositol, lactato y TMAO.

50

[0072] Se describen en el presente documento metabolitos que comprenden (o consisten en) los cuatro siguientes metabolitos de la orina: citrato, inositol, lactato y TMAO.

[0073] Se describe en el presente documento que, donde dichos metabolitos comprenden dos o mas 55 metabolitos de la orina seleccionados de: citrato, inositol, lactato y TMAO; el patron de referencia se obtiene de un

sujeto (o sujetos) que no tiene (o no tienen) EM y dichas diferencias de concentracion se seleccionan de:

un aumento en la concentracion de uno o mas metabolitos de la orina seleccionados de: TMAO y citrato; y/o una disminucion en la concentracion de uno o mas metabolitos de la orina seleccionados de: inositol y lactato.

[0074] Se describen en el presente documento diferencias de concentration que comprenden (o consisten en):

5 un aumento en la concentracion de: TMAO y citrato; y una disminucion en la concentracion de: inositol y lactato.

[0075] Se describe en el presente documento que cambios en la concentracion de los metabolitos de la orina descritos antes, son adecuados para diagnosticar la EM en fase SP. En una description, cuando dichos metabolitos comprenden dos o mas metabolitos de la orina seleccionados de: citrato, inositol, lactato y TMAO; dichas diferencias

10 de concentracion confirman la presencia de EM en fase secundaria progresiva (SP).

[0076] Se describen en el presente documento metabolitos que comprenden dos o mas metabolitos de la sangre (por ejemplo, dos, tres o mas, cuatro o mas, cinco o mas, seis o mas, o siete o mas) seleccionados de: n- butirato, acido graso, lactato, alanina, fosfocolina, acido oxiglutarico, N-acetil-aspartato y glucosa.

15

[0077] Se describen en el presente documento metabolitos que comprenden (o consisten en) los siguientes ocho metabolitos de la sangre: n-butirato, acido graso, lactato, alanina, fosfocolina, acido oxiglutarico, N-acetil- aspartato y glucosa.

20 [0078] Se describe en el presente documento que, donde dichos metabolitos comprenden dos o mas

metabolitos de la sangre seleccionados de: n-butirato, acido graso, lactato, alanina, fosfocolina, acido oxiglutarico, N- acetil-aspartato y glucosa (como se ha descrito antes); el patron de referencia es un patron de EM en fase de recalda-remision (RR) y dichas diferencias de concentraciones se seleccionan de:

25 un aumento en la concentracion de uno o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: n-butirato, acido graso, lactato y acido oxiglutarico; y una disminucion en la concentracion de uno o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: alanina, fosfocolina, N-acetil-aspartato, y/o glucosa.

[0079] Se describen en el presente documento diferencias de concentracion que comprenden (o consisten 30 en): un aumento en la concentracion de: n-butirato, acido graso, lactato y acido oxiglutarico; y una disminucion en la

concentracion de: alanina, fosfocolina, N-acetil-aspartato y glucosa.

[0080] Se describe en el presente documento que cambios en la concentracion de los metabolitos de la sangre descritos antes son particularmente adecuados para usar en el diagnostico de la EM en fase SP. En una

35 descripcion cuando dichos metabolitos comprenden dos o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: n- butirato, acido graso, lactato, alanina, fosfocolina, acido oxiglutarico, N-acetil-aspartato y glucosa (como se ha descrito antes); dichas diferencias de concentracion confirman la presencia de EM en fase secundaria progresiva (SP).

40 [0081] Se describen en el presente documento metabolitos que comprenden dos o mas metabolitos de la

sangre (por ejemplo, dos, tres o mas, cuatro o mas, cinco o mas, o seis o mas) seleccionados de: fosfocolina, lactato, especies N-acetilo y beta-hidroxibutirato; o fosfocolina, lactato, especies N-acetilo, beta-hidroxibutirato, acido graso y glucosa; o glucosa, fosfocolina, acido graso, lactato, alanina, beta-hidroxibutirato y especies N-acetilo; y/o dos o mas metabolitos de la orina (por ejemplo, dos, o tres o mas) seleccionados de: TMAO, citrato, creatinina y 45 lactato.

[0082] Se describen en el presente documento dos o mas metabolitos de la sangre que ademas comprenden

un singlete (5x-y 3,37) medido usando RMN 1H.

50 [0083] Se describen en el presente documento metabolitos que comprenden dos o mas metabolitos de la

sangre (por ejemplo, dos, o tres o mas), seleccionados de: acido graso, glucosa, fosfocolina, lactato y especies N- acetilo; o glucosa, fosfocolina, acido graso y lactato.

[0084] Se describen en el presente documento metabolitos que comprenden (o consisten en) los cuatro 55 siguientes metabolitos de la sangre: glucosa, fosfocolina, acido graso y lactato.

[0085] Se describe en el presente documento que, donde dichos metabolitos comprenden dos o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: glucosa, fosfocolina, acido graso y lactato (como se ha descrito antes); el patron de referencia se obtiene de un sujeto (o sujetos) que no tiene (o no tienen) EM y dichas diferencias de

concentracion se seleccionan de:

una disminucion en la concentracion de uno o mas metabolitos de la sangre seleccionados de:

5 fosfocolina, lactato, especies N-acetilo y glucosa; o

una disminucion en la concentracion de uno o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: glucosa, fosfocolina, acido graso y lactato.

[0086] Se describen en el presente documento diferencias de concentracion que comprenden (o consisten 10 en):

una disminucion en la concentracion de: glucosa, fosfocolina, acido graso y lactato.

[0087] Se describen en el presente documento diferencias de concentracion que comprenden (o consisten 15 en): un aumento en la concentracion de un singlete (5x-y 3,37) medido usando RMN 1H; y una disminucion en la

concentracion de: glucosa, fosfocolina, acido graso y lactato.

[0088] Se describe en el presente documento que cambios en la concentracion de los metabolitos de la

sangre descritos antes son particularmente adecuados para usar en el diagnostico de la EM en fase SP. Por lo tanto,

20 en una descripcion cuando dichos metabolitos comprenden dos o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: acido graso, glucosa, fosfocolina, lactato y especies N-acetilo; o glucosa, fosfocolina, acido graso y lactato (como se ha descrito antes); dichas diferencias de concentracion confirman la presencia de EM en fase secundaria progresiva (SP).

25 [0089] Se describe en el presente documento que cuando dichos metabolitos comprenden dos o mas

metabolitos de la sangre seleccionados de: glucosa, fosfocolina, acido graso, lactato y un singlete (5x-y 3,37) medido usando RMN 1H (como se ha descrito antes); dichas diferencias de concentracion confirman la presencia de EM en fase secundaria progresiva (SP).

30 [0090] En una realizacion, dichos metabolitos comprenden dos o mas (por ejemplo, dos, o tres o mas)

metabolitos de la orina seleccionados de: TMAO, citrato, creatinina y lactato.

[0091] En una realizacion, dichos metabolitos comprenden (o consisten en) los cuatro siguientes metabolitos de la orina: TMAO, citrato, creatinina y lactato.

35

[0092] En una realizacion, cuando dichos metabolitos comprenden dos o mas metabolitos de la orina seleccionados de: TMAO, citrato, creatinina y lactato; el patron de referencia se obtiene de un sujeto (o sujetos) que no tiene (o no tienen) EM y dichas diferencias de concentracion se seleccionan de:

40 un aumento en la concentracion de uno o mas metabolitos de la orina seleccionados de: TMAO y citrato; y/o una disminucion en la concentracion de uno o mas metabolitos de la orina seleccionados de: creatinina y lactato.

[0093] En una realizacion, dichas diferencias de concentracion comprenden (o consisten en):

45 un aumento en la concentracion de: TMAO y citrato; y una disminucion en la concentracion de: creatinina y lactato.

[0094] Se describe en el presente documento que cambios en la concentracion de los metabolitos de la orina descritos antes son particularmente adecuados para usar en el diagnostico EM en fase SP. Se describe en el presente documento que, donde dichos metabolitos comprenden dos o mas metabolitos de la orina seleccionados

50 de: TMAO, citrato, creatinina y lactato; dichas diferencias de concentracion confirman la presencia de EM en fase secundaria progresiva (SP).

[0095] Se describen en el presente documento metabolitos que comprenden dos o mas metabolitos de la sangre (por ejemplo, dos, tres o mas, cuatro o mas, cinco o mas, o seis o mas) seleccionados de: fosfocolina,

55 especies N-acetilo y beta-hidroxibutirato; o fosfocolina, especies N-acetilo, beta-hidroxibutirato, acido graso y glucosa; o acido graso, lactato, alanina, fosfocolina, beta-hidroxibutirato, especies N-acetilo y glucosa.

[0096] Se describen en el presente documento metabolitos que comprenden (o consisten en) los siete siguientes metabolitos de la sangre: acido graso, lactato, alanina, fosfocolina, beta-hidroxibutirato, especies N-acetilo

y glucosa.

[0097] Se describe en el presente documento que, donde dichos metabolitos comprenden dos o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: fosfocolina, especies N-acetilo y beta-hidroxibutirato; o fosfocolina,

5 especies N-acetilo, beta-hidroxibutirato, acido graso y glucosa; o acido graso, lactato, alanina, fosfocolina, beta- hidroxibutirato, especies N-acetilo y glucosa (como se ha descrito antes); el patron de referencia es un patron de EM en fase de recalda-remision (RR) y dichas diferencias de concentracion se seleccionan de:

un aumento en la concentracion de: beta-hidroxibutirato; y/o una disminucion en la concentracion de uno o mas 10 metabolitos de la sangre seleccionados de: fosfocolina, especies N-acetilo y glucosa y opcionalmente acido graso (preferiblemente acido graso 5x-y 0,88, 1,30, 5,35); o dichas diferencias de concentraciones se seleccionan de:

un aumento en la concentracion de uno o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: acido graso, lactato y beta-hidroxibutirato; y una disminucion en la concentracion de uno o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: 15 alanina, fosfocolina, especies N-acetilo y glucosa.

[0098] Se describen en el presente documento diferencias de concentracion que comprenden (o consisten en):

20 un aumento en la concentracion de: beta-hidroxibutirato; y una disminucion en la concentracion de uno o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: fosfocolina, especies N-acetilo y glucosa y opcionalmente acido graso (preferiblemente acido graso de 5x-y 0,88, 1,30, 5,35); o un aumento en la concentracion de: acido graso, lactato y beta-hidroxibutirato; y una disminucion en la concentracion de: alanina, fosfocolina, especies N-acetilo y glucosa.

25 [0099] Se describe en el presente documento que cambios en la concentracion de los metabolitos de la

sangre descritos antes son particularmente adecuados para usar en el diagnostico de la EM en fase SP. En una descripcion cuando dichos metabolitos comprenden dos o mas metabolitos de la sangre seleccionados de fosfocolina, especies N-acetilo y beta-hidroxibutirato; o fosfocolina, especies N-acetilo, beta-hidroxibutirato, acido graso y glucosa; o acido graso, lactato, alanina, fosfocolina, beta-hidroxibutirato, especies N-acetilo y glucosa (como 30 se ha descrito antes); dichas diferencias de concentracion confirman la presencia de EM en fase secundaria progresiva (SP).

[0100] Se describen en el presente documento metabolitos que comprenden dos o mas metabolitos de la sangre (por ejemplo, dos, tres o mas, cuatro o mas, cinco o mas, seis o mas, siete o mas, ocho o mas, nueve o mas,

35 10 o mas, o 11 o mas) seleccionados de: N-acetil-glucoprotelna, fosfocolina, glucosa, taurina-betalna, acido ascorbico, acido graso, n-butirato, tirosina, Nacetil-aspartato, lactato, alanina y acido oxiglutarico.

[0101] Se describen en el presente documento metabolitos que comprenden dos o mas metabolitos de la sangre (por ejemplo, dos, tres o mas, cuatro o mas, cinco o mas, seis o mas, siete o mas, u ocho o mas)

40 seleccionados de: N-acetil-glucoprotelna, fosfocolina, glucosa, taurina-betalna, acido ascorbico, acido graso, n- butirato, tirosina y N-acetil-aspartato.

[0102] Se describen en el presente documento metabolitos que comprenden (o consisten en) los nueve siguientes metabolitos de la sangre: N-acetil-glucoprotelna, fosfocolina, glucosa, taurina-betalna, acido ascorbico,

45 acido graso, n-butirato, tirosina y N-acetil-aspartato.

[0103] Se describe en el presente documento que, donde dichos metabolitos comprenden dos o mas metabolitos seleccionados de: N-acetil-glucoprotelna, fosfocolina, glucosa, taurina-betalna, acido ascorbico, acido graso, n-butirato, tirosina y N-acetil-aspartato; el patron de referencia se obtiene de un sujeto (o sujetos) que no tiene

50 (o no tienen) EM; y dichas diferencias de concentracion se seleccionan de:

un aumento en la concentracion de uno o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: N-acetil-glucoprotelna, fosfocolina, acido graso, n-butirato y/o tirosina; y/o una disminucion en la concentracion de uno o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: glucosa, taurina-betalna, acido ascorbico y N-acetil-aspartato.

55

[0104] Se describen en el presente documento diferencias de concentracion que comprenden (o consisten en):

un aumento en la concentracion de: N-acetil-glucoprotelna, fosfocolina, acido graso, n-butirato and tirosina; y una

disminucion en la concentracion de: glucosa, taurina-betalna, acido ascorbico y N-acetil-aspartato.

[0105] Se describen en el presente documento metabolitos que comprenden dos o mas metabolitos de la sangre (por ejemplo, dos, tres o mas, cuatro o mas, cinco o mas, seis o mas, o siete o mas) seleccionados de: n-

5 butirato, acido graso, lactato, alanina, fosfocolina, acido oxiglutarico, N-acetil-aspartato y glucosa.

[0106] Se describen en el presente documento metabolitos que comprenden (o consisten en): n-butirato, acido graso, lactato, alanina, fosfocolina, acido oxiglutarico, N-acetil-aspartato y glucosa.

10 [0107] Se describe en el presente documento que, donde dichos metabolitos comprenden dos o mas

metabolitos seleccionados de: n-butirato, acido graso, lactato, alanina, fosfocolina, acido oxiglutarico, N-acetil- aspartato y glucosa; el patron de referencia es un patron de EM en fase secundaria progresiva (SP) y dichas diferencias de concentraciones se seleccionan de:

15 un aumento en la concentracion de uno o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: alanina, fosfocolina, N- acetil-aspartato y glucosa; y una disminucion en la concentracion de: n-butirato, acido graso, lactato, y/o acido oxiglutarico.

[0108] Se describen en el presente documento diferencias de concentracion que comprenden (o consisten 20 en) un aumento en la concentracion de: alanina, fosfocolina, N-acetil-aspartato y glucosa; y una disminucion en la

concentracion de: n-butirato, acido graso, lactato y acido oxiglutarico.

[0109] Se describe en el presente documento que, donde dichos metabolitos comprenden al menos dos metabolitos de la sangre seleccionados de: N-acetil-glucoprotelna, fosfocolina, glucosa, taurina-betalna, acido

25 ascorbico, acido graso, n-butirato, tirosina, N-acetil-aspartato, lactato, alanina y acido oxiglutarico (como se ha descrito antes); dichas diferencias de concentracion confirman la presencia de EM en fase de recalda-remision (RR).

[0110] Se describen en el presente documento metabolitos que comprenden dos o mas metabolitos de la sangre (por ejemplo, dos, tres o mas, cuatro o mas, cinco o mas, seis o mas, o siete o mas) seleccionados de:

30 fosfocolina, especies N-acetilo, beta-hidroxibutirato y lactato; o fosfocolina, especies N-acetilo, beta-hidroxibutirato, lactato, acido graso y glucosa; o L-glutamina, alanina, glucosa, fosfocolina, lactato, acido graso, beta-hidroxibutirato y especies N-acetilo.

[0111] Se describen en el presente documento metabolitos que comprenden dos o mas metabolitos de la 35 sangre (por ejemplo, dos, tres o mas, o cuatro o mas) seleccionados de: L-glutamina, alanina, glucosa, fosfocolina y

lactato.

[0112] Se describen en el presente documento metabolitos que comprenden (o consisten en) los cinco siguientes metabolitos de la sangre: L-glutamina, alanina, glucosa, fosfocolina y lactato.

40

[0113] Se describe en el presente documento que, donde dichos metabolitos comprenden dos o mas metabolitos seleccionados de: fosfocolina, especies N-acetilo, beta-hidroxibutirato y lactato; o fosfocolina, especies N-acetilo, beta-hidroxibutirato, lactato, acido graso y glucosa; o L-glutamina, alanina, glucosa, fosfocolina y lactato; el patron de referencia se obtiene de un sujeto (o sujetos) que no tiene (o no tienen) EM; y dichas diferencias de

45 concentracion se seleccionan de:

una disminucion en la concentracion de uno o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: glucosa, fosfocolina, lactato y especies N-acetilo;

o un aumento en la concentracion de uno o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: L-glutamina y alanina; 50 y/o una disminucion en la concentracion de uno o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: glucosa, fosfocolina y lactato.

[0114] Se describen en el presente documento diferencias de concentracion que comprenden (o consisten en):

55

un aumento en la concentracion de: un singlete (5x-y 3,37) medido usando RMN 1H, L-glutamina y alanina; y una disminucion en la concentracion de: glucosa, fosfocolina y lactato.

[0115] Se describen en el presente documento diferencias de concentracion que comprenden (o consisten

en):

5 o un aumento en la concentracion de: L-glutamina y alanina; y una disminucion en la concentracion de: glucosa, fosfocolina y lactato.

[0116] Se describen en el presente documento metabolitos que comprenden dos o mas metabolitos de la sangre (por ejemplo, dos, tres o mas, cuatro o mas, cinco o mas, o seis o mas) seleccionados de: acido graso,

10 lactato, alanina, fosfocolina, beta-hidroxibutirato, especies N-acetilo y glucosa.

[0117] Se describen en el presente documento metabolitos que comprenden (o consisten en): acido graso, lactato, alanina, fosfocolina, beta-hidroxibutirato, especies N-acetilo y glucosa.

15 [0118] Se describe en el presente documento que, donde dichos metabolitos comprenden dos o mas

metabolitos seleccionados de: acido graso, lactato, alanina, fosfocolina, beta-hidroxibutirato, especies N-acetilo y glucosa; el patron de referencia es un patron de EM en fase secundaria progresiva (SP) y dichas diferencias de concentraciones se seleccionan de:

20 un aumento en la concentracion de uno o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: alanina, fosfocolina, especies N-acetilo y glucosa; y una disminucion en la concentracion de: acido graso, lactato y beta-hidroxibutirato.

[0119] Se describen en el presente documento diferencias de concentracion que comprenden (o consisten en) un aumento en la concentracion de: alanina, fosfocolina, especies N-acetilo y glucosa; y una disminucion en la

25 concentracion de: acido graso, lactato y beta-hidroxibutirato.

[0120] Se describe en el presente documento que, donde dichos metabolitos comprenden al menos dos metabolitos de la sangre seleccionados de: fosfocolina, especies N-acetilo, beta-hidroxibutirato y lactato; o fosfocolina, especies N-acetilo, beta-hidroxibutirato, lactato, acido graso y glucosa; o L-glutamina, alanina, glucosa,

30 fosfocolina, lactato, acido graso, beta-hidroxibutirato y especies N-acetilo (como se ha descrito antes); dichas diferencias de concentracion confirman la presencia de una Em en fase de recalda-remision (RR).

[0121] Se describe en el presente documento un procedimiento para el diagnostico de la esclerosis multiple en un sujeto humano, midiendo la concentracion de dos o mas metabolitos usando espectroscopla de RMN.

35

[0122] Se describe en el presente documento un procedimiento in vitro para el diagnostico de la EM en un sujeto de ensayo humano usando espectroscopla de RMN 1H, que comprende

(i) determinar las concentraciones de dos o mas metabolitos en una muestra de dicho sujeto, en donde dichos dos o 40 mas metabolitos se seleccionan de:

metabolitos de la sangre, en los que dichos metabolitos de la sangre comprenden (o consisten) en especies qulmicas que tienen los siguientes parametros medios por RMN 1H, con los desplazamientos qulmicos definidos con respecto a la resonancia del metilo del 3-trimetilsilil-1-propionato (TSP) definido a 0,00 ppm: (51,46, d, CH3; 53,73, q, 45 CH), (50,90, ancho, CH3, 51,30, ancho, CH2CH2CH3, 51,55, ancho, CH2CH3, 52,05, ancho, CH?CH=, 52,25, ancho, CH2COOH, 55,35, ancho, CH2CH=), (53,42, dd, C(4)H, 53,44, dd, C(6)HaHb, 53,54, dd, C(2)H, 53,73, dd, C(3)H, 53,79, dd, C(6)HaHb, 53,86, m, C(5)H, 55,24, d, C(1)H) y/o (53,26, dd, C(2)H, 53,40, dd, C(4)H, 53,47, dd, C(5)H,

53,49, dd, C(3)H, 53,86, d, C(6)H?, 54,63, d, C(1)H), (51,32 d, CH3, 54,11, q, CH), (53,25, s, N(CHb)3, 53,59, t, NCH2,

54,17, m, NCH2CH2), (52,13, m, CH2CHNH2, 52,45, m, OCCH2, 53,77, t, CH2CHNH2), (52,03, s ancho, COCH3), 50 (51,19 d, CH3, 52,28, m, CHaHb, 52,37, m, CHaHb, 54,12, m, CH), (5x-y 3,37) y (5x-y 2,65);

y/o

metabolitos de la orina, en el que dichos metabolitos de la orina comprenden (o consisten en) especies qulmicas que tienen los siguientes parametros medidos por RMN 1H, con desplazamientos qulmicos definidos con respecto a la 55 resonancia del metilo del 3-trimetilsilil-1-propionato (TSP) definido a 0,00 ppm: (52,50, d, CHaHb, 52,65, d, CHaHb), (53,05, s, NCH3, 54,10, s, CH2), (51,32 d, CH3, 54,11, q, CH) y (53,26, s, ON(CHb)3);

(ii) comparar las concentraciones de dichos dos o mas metabolitos en la muestra con las concentraciones de los mismos metabolitos en al menos un patron de referencia; y

(iii) identificar una diferencia de concentracion para cada uno de dichos dos o mas metabolitos en la muestra con respecto al patron de referencia;

5 en el que dichas diferencias de concentracion se correlacionan con la presencia de EM.

[0123] Se describen en el presente documento dos o mas metabolitos seleccionados de: metabolitos de la

sangre, en el que dichos metabolitos de la sangre comprenden: (52,13, m, CH2CHNH2, 52,45, m, OCCH2, 53,77, t, CH2CHNH2), (51,46, d, CH3; 53,73, q, CH), (53,42, dd, C(4)H, 53,44, dd, C(6)HaHb, 53,54, dd, C(2)H, 53,73, dd,

10 C(3)H, 53,79, dd, C(6)HaHb, 53,86, m, C(5)H, 55,24, d, C(1)H) y/o (53,26, dd, C(2)H, 53,40, dd, C(4)H, 53,47, dd,

C(5)H, 53,49, dd, C(3)H, 53,86, d, C(6)H2, 54,63, d, C(1)H), (53,25, s, N(CHa)3, (50,90, ancho, CH3, 51,30 ancho, CH2CH2CH3, 51,55 ancho, CH2CH3, 52,05, ancho, CH2CH=, 52,25, ancho, CH2COOH, 55,35, ancho, CH2CH=), (52,03, s ancho, COCH3), (51,32 d, CH3, 54,11, q, CH), y (51,19, d, CH3, 52,28, m, CHaHb, 52,37, m, CHaHb, 54,12, m, CH); y/o metabolitos de la orina, en el que dichos metabolitos de la orina comprenden: (53,26, s, ON(CH3)3), 15 (52,50, d, CHaHb, 52,65, d, CHaHb), (53,05, s, NCH3, 54,10, s, CH2), y (51,32, d, CH3, 54,11, q, CH).

[0124] Se describen en el presente documento metabolitos de la sangre que ademas comprenden un singlete (5x-y 3,37) y un singlete (5x-y 2,65) medidos usando RMN 1H.

20 [0125] Se describen en el presente documento metabolitos que comprenden dos o mas metabolitos de la

sangre (por ejemplo, dos, tres o mas, o cuatro o mas) seleccionados de: (50,90, ancho, CH3, 51,30 ancho, CH2CH2CH3, 51,55, ancho, CH2CH3, 52,05, ancho, CH2CH=, 52,25, ancho, CH2COOH, 55,35, ancho, CH2CH=), (52,03, s ancho, COCH3), (53,42, dd, C(4)H, 53,44, dd, C(6)HaHb, 53,54, dd, C(2)H, 53,73, dd, C(3)H, 53,79, dd,

C(6)HaHb, 53,86, m, C(5)H, 55,24, d, C(1)H) y/o (53,26, dd, C(2)H, 53,40, dd, C(4)H, 53,47, dd, C(5)H, 53,49, dd,

25 C(3)H, 53,86, d, C(6)H2, 54,63, d, C(1)H), (53,25, s, N(CH3)3, 53,59, t, NCH2, 54,17, m, NCH2CH2) y (52,13, m, CH2CHNH2, 52,45, m, OCCH2, 53,77, t, CH2CHNH2).

[0126] Se describen en el presente documento dos o mas metabolitos de la sangre que ademas comprenden un singlete (5x-y 3,37) y un singlete (5x-y 2,65).

30

[0127] Se describen en el presente documento metabolitos que comprenden (o consisten en) los cinco siguientes metabolitos de la sangre: (50,90, ancho, CH3, 51,30 ancho, CH2CH2CH3, 51,55 ancho, CH2CH3, 52,05, ancho, CH2CR=, 52,25, ancho, CH2COOH, 55,35, ancho, CH2CH=), (52,03, s ancho, COCH3), (53,42, dd, C(4)H,

53,44, dd, C(6)HaHb, 53,54, dd, C(2)H, 53,73, dd, C(3)H, 53,79, dd, C(6)HaHb, 53,86, m, C(5)H, 55,24, d, C(1)H) y/o

35 (53,26, dd, C(2)H, 53,40, dd, C(4)H, 53,47, dd, C(5)H, 53,49, dd, C(3)H, 53,86, d, C(6)H2, 54,63, d, C(1)H), (53,25, s, N(CHb)3, 53,59, t, NCH2, 54,17, m, NCH2CH2), y (52,13, m, CH2CHNH2, 52,45, m, OCCH2, 53,77, t, CH2CHNH2).

[0128] Se describe en el presente documento que, donde dichos metabolitos comprenden dos o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: (50,90, ancho, CH3, 51,30 ancho, CH2CH2CH3, 51,55 ancho, CH2CH3,

40 52,05, ancho, CH2CH=, 52,25, ancho, CH2COOH, 55,35, ancho, CH2CH=), (52,03, s ancho, COCH3), (53,42, dd,

[0129] C(4)H, 53,44, dd, C(6)HaHb, 53,54, dd, C(2)H, 53,73, dd, C(3)H, 53,79, dd, C(6)HaHb, 53,86, m, C(5)H,

55,24, d, C(1)H) y/o (53,26, dd, C(2)H, 53,40, dd, C(4)H, 53,47, dd, C(5)H, 53,49, dd, C(3)H, 53,86, d, C(6)H2, 54,63, d, C(1)H), (53,25, s, N(CHa)3, 53,59, t, NCH2, 54,17, m, NCH2CH2) y (52,13, m, CH2CHNH2, 52,45, m, OCCH2, 53,77,

45 t, CH2CHNH2) (como se ha descrito antes); el patron de referencia se obtiene de un sujeto (o sujetos) que no tiene (o no tienen) EM; y dichas diferencias de concentracion se seleccionan de:

un aumento en la concentracion de uno o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: (50,90, ancho, CH3, 51,30 ancho, CH2CH2CH3, 51,55 ancho, CH2CH3, 52,05, ancho, CH2CH=, 52,25, ancho, CH2COOH, 55,35, ancho, 50 CH2CH=), (52,03, s ancho, COCH3) y (52,13, m, CH2CHNH2, 52,45, m, OCCH2, 53,77, t, CH2CHNH2); y/o una disminucion en la concentracion de uno o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: (53,42, dd, C(4)H, 53,44, dd, C(6)HaHb, 53,54, dd, C(2)H, 53,73, dd, C(3)H, 53,79, dd, C(6)HaHb, 53,86, m, C(5)H, 55,24, d, C(1)H) y/o (53,26, dd, C(2)H, 53,40, dd, C(4)H, 53,47, dd, C(5)H, 53,49, dd, C(3)H, 53,86, d, C(6)H2, 54,63, d, C(1)H), y (53,25, s, N(CHb)3, 53,59, t, NCH2, 54,17, m, NCH2CH2).

55

[0130] Se describen en el presente documento diferencias de concentracion que comprenden (o consisten en):

un aumento en la concentracion de: (50,90, ancho, CH3, 51,30, ancho, CH2CH2CH3, 51,55, ancho, CH2CH3, 52,05,

ancho, CH2CH=, 52,25, ancho, CH2COOH, 55,35, ancho, CH2CH=), (52,03, s ancho, COCH3) y (52,13, m, CH2CHNH2, 52,45, m, OCCH2, 53,77, t, CH2CHNH2); y una disminucion en la concentracion de: (53,42, dd, C(4)H,

53.44, dd, C(6)HaHb, 53,54, dd, C(2)H, 53,73, dd, C(3)H, 53,79, dd, C(6)HaHb, 53,86, m, C(5)H, 55,24, d, C(1)H) y/o (53,26, dd, C(2)H, 53,40, dd, C(4)H, 53,47, dd, C(5)H, 53,49, dd, C(3)H, 53,86, d, C(6)H2, 54,63, d, C(1)H) y (53,25,

5 s, N(CHa)a, 53,59, t, NCH2, 54,17, m, NCH2CH2).

[0131] Se describen en el presente documento diferencias de concentracion que comprenden (o consisten en):

10 un aumento en la concentracion de: (50,90, ancho, CH3, 51,30, ancho, CH2CH2CH3, 51,55, ancho, CH2CH3, 52,05, ancho, CH2CH=, 52,25, ancho, CH2COOH, 55,35, ancho, CH2CH=), (52,03, s ancho, COCH3), (52,13, m, CH2CHNH2, 52,45, m, OCCH2, 53,77, t, CH2CHNH2) y un singlete (5x-y 3,37); y una disminucion en la concentracion de: (53,42, dd, C(4)H, 53,44, dd, C(6)HaHb, 53,54, dd, C(2)H, 53,73, dd, C(3)H, 53,79, dd, C(6)HaHb, 53,86, m, C(5)H, 55,24, d, C(1)H) y/o (53,26, dd, C(2)H, 53,40, dd, C(4)H, 53,47, dd, C(5)H, 53,49, dd, C(3)H, 53,86, d, C(6)H2, 15 54,63, d, C(1)H), (53,25, s, N(CHa)a, 53,59, t, NCH2, 54,17, m, NCH2CH2) y un singlete (5x-y 2,65).

[0132] Se describe en el presente documento que cambios en la concentracion de los metabolitos de la sangre descritos antes son particularmente adecuados para usar en el diagnostico de la EM en fase PP. Por lo tanto, en una realizacion, cuando dichos metabolitos comprenden dos o mas metabolitos de la sangre seleccionados de:

20 (50,90, ancho, CH3, 51,30, ancho, CH2CH2CH3, 51,55, ancho, CH2CH3, 52,05, ancho, CH2CH=, 52,25, ancho, CH2COOH, 55,35, ancho, CH2CH=), (52,03, s ancho, COCH3), (53,42, dd, C(4)H, 53,44, dd, C(6)HaHb, 53,54, dd, C(2)H, 53,73, dd, C(3)H, 53,79, dd, C(6)HaHb, 53,86, m, C(5)H, 55,24, d, C(1)H) y/o (53,26, dd, C(2)H, 53,40, dd, C(4)H, 53,47, dd, C(5)H, 53,49, dd, C(3)H, 53,86, d, C(6)H2, 54,63, d, C(1)H), (53,25, s, N(CHa)a, 53,59, t, NCH2,

54,17, m, NCH2CH2), y (52,13, m, CH2CHNH2, 52,45, m, OCCH2, 53,77, t, CH2CHNH2), (como se ha descrito antes); 25 dichas diferencias de concentracion confirman la presencia de EM en fase primaria progresiva (PP).

[0133] Se describe en el presente documento que, cuando dichos metabolitos comprenden dos o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: (50,90, ancho, CH3, 51,30 ancho, CH2CH2CH3, 51,55, ancho, CH2CH3, 52,05, ancho, CH2CH=, 52,25, ancho, CH2COOH, 55,35, ancho, CH2CH=), (52,03, s ancho, COCH3), (53,42, dd,

30 C(4)H, 53,44, dd, C(6)HaHb, 53,54, dd, C(2)H, 53,73, dd, C(3)H, 53,79, dd, C(6)HaHb, 53,86, m, C(5)H, 55,24, d, C(1)H) y/o (53,26, dd, C(2)H, 53,40, dd, C(4)H, 53,47, dd, C(5)H, 53,49, dd, C(3)H, 53,86, d, C(6)H>, 54,63, d, C(1)H), (53,25, s, N(CHa)3, 53,59, t, NCH2, 54,17, m, NCH2CH2), (52,13, m, CH2CHNH2, 52,45, m, OCCH2, 53,77, t, CH2CHNH2), un singlete (5x-y 3,37) y un singlete (5x-y 2,65), (como se ha descrito antes); dichas diferencias de concentracion confirman la presencia de EM en fase primaria progresiva (PP).

35

[0134] Se describen en el presente documento metabolitos que comprenden dos o mas metabolitos de la sangre (por ejemplo, dos, tres o mas, cuatro o mas, cinco o mas, o seis o mas) seleccionados de: (53,42, dd, C(4)H,

53.44, dd, C(6)HaHb, 53,54, dd, C(2)H, 53,73, dd, C(3)H, 53,79, dd,

40 [0135] C(6)HaHb, 53,86, m, C(5)H, 55,24, d, C(1)H) y/o (53,26, dd, C(2)H, 53,40, dd, C(4)H, 53,47, dd,

C(5)H, 53,49, dd, C(3)H, 53,86, d, C(6)H2, 54,63, d, C(1)H), (53,25, s, N(CHa)3, 53,59, t, NCH2, 54,17, m, NCH2CH2), (50,90, ancho, CH3, 51,30, ancho, CH2CH2CH3, 51,55, ancho, CH2CH3, 52,05, ancho, CH2CH=, 52,25, ancho, CH2COOH, 55,35, ancho, CH2CH=), (51,32, d, CH3, 54,11, q, CH), (51,46, d, CH3; 53,73, q, CH), (51,19, d, CH3, 52,28, m, CHaHb, 52,37, m, CHaHb, 54,12, m, CH), y (52,03, s ancho, COCH3); y/o dos o mas metabolitos de la orina 45 (por ejemplo, dos, o tres o mas) seleccionados de:(53,26, s, ON(CH3)3), (52,50, d, CHaHb, 52,65, d, CHaHb), (53,05, s, NCH3, 54,10, s, CH2), y (51,32, d, CH3, 54,11, q, CH).

[0136] Se describen en el presente documento dos o mas metabolitos de la sangre que ademas comprenden un singlete (5x-y 3,37).

50

[0137] Se describen en el presente documento metabolitos que comprenden dos o mas metabolitos de la sangre (por ejemplo, dos, o tres o mas), seleccionados de: (53,42, dd, C(4)H, 53,44, dd, C(6)HaHb, 53,54, dd, C(2)H,

53,73, dd, C(3)H, 53,79, dd, C(6)HaHb, 53,86, m, C(5)H, 55,24, d, C(1)H) y/o (53,26, dd, C(2)H, 53,40, dd, C(4)H,

53,47, dd, C(5)H, 53,49, dd, C(3)H, 53,86, d, C(6)H2, 54,63, d, C(1)H), (53,25, s, N(CHa)a, 53,59, t, NCH2, 54,17, m,

55 NCH2CH2), (50,90, ancho, CH3, 51,30, ancho, CH2CH2CH3, 51,55, ancho, CH2CH3, 52,05, ancho, CH2CH=, 52,25, ancho, CH2COOH, 55,35, ancho, CH2CH=), y (51,32, d, CH3, 54,11, q, CH).

[0138] Se describen en el presente documento metabolitos que comprenden (o consisten en) los cuatro siguientes metabolitos de la sangre: (53,42, dd, C(4)H, 53,44, dd, C(6)HaHb, 53,54, dd, C(2)H, 53,73, dd, C(3)H,

53,79, dd, C(6)HaHb, 53,86, m, C(5)H, 55,24, d, C(1 )H) y/o (53,26, dd, C(2)H, 53,40, dd, C(4)H, 53,47, dd, C(5)H,

53.49, dd, C(3)H, 53,86, d, C(6)H2, 54,63, d, C(1)H), (53,25, s, N(CH3)3, 53,59, t, NCH2, 54,17, m, NCH2CH2), (50,90, ancho, CH3, 51,30, ancho, CH2CH2CH3, 51,55, ancho, CH2CH3, 52,05, ancho, CH2CH=, 52,25, ancho, CH2COOH,

55.35, ancho, CH2CH=), y (51,32, d, CH3, 54,11, q, CH).

5

[0139] Se describe en el presente documento que, donde dichos metabolitos comprenden dos o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: (53,42, dd, C(4)H, 53,44, dd, C(6)HaHb, 53,54, dd, C(2)H, 53,73, dd, C(3)H, 53,79, dd, C(6)HaHb, 53,86, m, C(5)H, 55,24, d, C(1)H) y/o (53,26, dd, C(2)H, 53,40, dd, C(4)H, 53,47, dd, C(5)H, 53,49, dd, C(3)H, 53,86, d, C(6)H2, 54,63, d, C(1)H), (53,25, s, N(CH3)3, 53,59, t, NCH2, 54,17, m, NCH2CH2),

10 (50,90, ancho, CH3, 51,30 ancho, CH2CH2CH3, 51,55, ancho, CH2CH3, 52,05, ancho, CH2CH=, 52,25, ancho, CH2COOH, 55,35, ancho, CH2CH=), y (51,32, d, CH3, 54,11, q, CH) (como se ha descrito antes); el patron de referencia se obtiene de un sujeto (o sujetos) que no tiene (o no tienen) EM y dichas diferencias de concentracion se seleccionan de:

15 una disminucion en la concentracion de uno o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: (53,42, dd, C(4)H,

53,44, dd, C(6)HaHb, 53,54, dd, C(2)H, 53,73, dd, C(3)H, 53,79, dd, C(6)HaHb, 53,86, m, C(5)H, 55,24, d, C(1)H) y/o (53,26, dd, C(2)H, 53,40, dd, C(4)H, 53,47, dd, C(5)H, 53,49, dd, C(3)H, 53,86, d, C(6)H2, 54,63, d, C(1)H), (53,25, s, N(CH3)3, 53,59, t, NCH2, 54,17, m, NCH2CH2), (50,90, ancho, CH3, 51,30, ancho, CH2CH2CH3, 51,55, ancho, CH2CH3, 52,05, ancho, CH2CH=, 52,25, ancho, CH2COOH, 55,35, ancho, CH2CH=), y (51,32, d, CH3, 54,11, q, CH).

20

[0140] Se describen en el presente documento diferencias de concentracion que comprenden (o consisten en):

una disminucion en la concentracion de: (53,42, dd, C(4)H, 53,44, dd, C(6)HaHb, 53,54, dd, C(2)H, 53,73, dd, C(3)H, 25 53,79, dd, C(6)HaHb, 53,86, m, C(5)H, 55,24, d, C(1)H) y/o (53,26, dd, C(2)H, 53,40, dd, C(4)H, 53,47, dd, C(5)H,

55.35, ancho, CH2CH=), y (51,32, d, CH3, 54,11, q, CH).

30 [0141] Se describen en el presente documento diferencias de concentracion que comprenden (o consisten

en): un aumento en la concentracion de un singlete (5x-y 3,37); y una disminucion en la concentracion de: (53,42, dd, C(4)H, 53,44, dd, C(6)HaHb, 53,54, dd, C(2)H, 53,73, dd, C(3)H, 53,79, dd, C(6)HaHb, 53,86, m, C(5)H, 55,24, d, C(1)H) y/o (53,26, dd, C(2)H, 53,40, dd,

35 [0142] C(4)H, 53,47, dd, C(5)H, 53,49, dd, C(3)H, 53,86, d, C(6)H2, 54,63, d, C(1)H), (53,25, s, N(CH3)3,

53,59, t, NCH2, 54,17, m, NCH2CH2), (50,90, ancho, CH3, 51,30, ancho, CH2CH2CH3, 51,55 ancho, CH2CH3, 52,05, ancho, CH2CH=, 52,25, ancho, CH2COOH, 55,35, ancho, CH2CH=), y (51,32 d, CH3, 54,11, q, CH).

[0143] Se describe en el presente documento que cambios en la concentracion de los metabolitos de la 40 sangre descritos antes son particularmente adecuados para usar en el diagnostico de la EM en fase SP. Por lo tanto,

en una realizacion cuando dichos metabolitos comprenden dos o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: (53,42, dd, C(4)H, 53,44, dd, C(6)HaHb, 53,54, dd, C(2)H, 53,73, dd, C(3)H, 53,79, dd, C(6)HaHb, 53,86, m, C(5)H,

55,24, d, C(1)H) y/o (53,26, dd, C(2)H, 53,40, dd, C(4)H, 53,47, dd, C(5)H, 53,49, dd, C(3)H, 53,86, d, C(6)H2, 54,63, d, C(1)H), (53,25, s, N(CH3)3, 53,59, t, NCH2, 54,17, m, NCH2CH2), (50,90, ancho, CH3, 51,30, ancho, CH2CH2CH3, 45 51,55 ancho, CH2CH3, 52,05, ancho, CH2CH=, 52,25, ancho, CH2COOH, 55,35, ancho, CH2CH=), y (51,32, d, CH3, 54,11, q, CH) (como se ha descrito antes); dichas diferencias de concentracion confirman la presencia de EM en fase secundaria progresiva (SP).

[0144] Se describe en el presente documento que donde dichos metabolitos comprenden dos o mas 50 metabolitos de la sangre seleccionados de: (53,42, dd, C(4)H, 53,44, dd, C(6)HaHb, 53,54, dd, C(2)H, 53,73, dd,

C(3)H, 53,79, dd, C(6)HaHb, 53,86, m, C(5)H, 55,24, d, C(1)H) y/o (53,26, dd, C(2)H, 53,40, dd, C(4)H, 53,47, dd, C(5)H, 53,49, dd, C(3)H, 53,86, d, C(6)H2, 54,63, d, C(1)H), (53,25, s, N(CH3)3, 53,59, t, NCH2, 54,17, m, NCH2CH2), (50,90, ancho, CH3, 51,30, ancho, CH2CH2CH3, 51,55, ancho, CH2CH3, 52,05, ancho, CH2CH=, 52,25, ancho, CH2COOH, 55,35, ancho, CH2CH=), (51,32 d, CH3, 54,11, q, CH) y un singlete (5x-y 3,37) (como se ha descrito 55 antes); dichas diferencias de concentracion confirman la presencia de EM en fase secundaria progresiva (SP).

[0145] Se describen en el presente documento metabolitos que comprenden dos o mas (por ejemplo, dos, o tres o mas) metabolitos de la orina seleccionados de: (53,26, s, On(CH3)3), (52,50, d, CHaHb, 52,65, d, CHaHb), (53,05, s, NCH3, 54,10, s, CH2), y (51,32 d, CH3, 54,11, q, CH). Se describen en el presente documento metabolitos

que comprenden (o consisten en) los cuatro siguientes metabolitos de la orina: (53,26, s, ON(CH3)3), (52,50, d, CHaHb, 52,65, d, CHaHb), (53,05, s, NCH3, 54,10, s, CH2), y (51,32 d, CH3, 54,11, q, CH).

[0146] Se describe en el presente documento que, donde dichos metabolitos comprenden dos o mas 5 metabolitos de la orina seleccionados de: (53,26, s, ON(CH3)3), (52,50, d, CHaHb, 52,65, d, CHaHb), (53,05, s, NCH3,

54,10, s, CH2), y (51,32, d, CH3, 54,11, q, CH); el patron de referencia se obtiene de un sujeto (o sujetos) que no tiene (o no tienen) EM y dichas diferencias de concentracion se seleccionan de:

un aumento en la concentracion de uno o mas metabolitos de la orina seleccionados de:(53,26, s, ON(CH3)3, y 10 (52,50, d, CHaHb, 52,65, d, CHaHb); y/o una disminucion en la concentracion de uno o mas metabolitos de la orina seleccionados de:(53,05, s, NCH3, 54,10, s, CH2), y (51,32, d, CH3, 54,11, q, CH).

[0147] Se describen en el presente documento diferencias de concentracion que comprenden (o consisten en):

15

un aumento en la concentracion de: (53,26, s, ON(CH3)3), y (52,50, d, CHaHb, 52,65, d, CHaHb); y una disminucion en la concentracion de: (53,05, s, NCH3, 54,10, s, CH2), y (51,32 d, CH3, 54,11, q, CH).

[0148] Se describe en el presente documento que cambios en la concentracion de los metabolitos de la orina 20 descritos antes son particularmente adecuados para usar en el diagnostico de la EM en fase SP. En una

descripcion, cuando dichos metabolitos comprenden dos o mas metabolitos de la orina seleccionados de: (53,26, s, ON(CHa)a), (52,50, d, CHaHb, 52,65, d, CHaHb), (53,05, s, NCH3, 54,10, s, CH2), y (51,32, d, CH3, 54,11, q, CH);

dichas diferencias de concentracion confirman la presencia de EM en fase secundaria progresiva (SP).

25 [0149] Se describen en el presente documento metabolitos que comprenden dos o mas metabolitos de la

sangre (por ejemplo, dos, tres o mas, cuatro o mas, cinco o mas, o seis o mas) seleccionados de: (50,90, ancho, CH3, 51,30, ancho, CH2CH2CH3, 51,55, ancho, CH2CH3, 52,05, ancho, CH2CH=, 52,25, ancho, CH2COOH, 55,35, ancho, CH2CH=), (51,32, d, CH3, 54,11, q, CH), (51,46, d, CH3; 53,73, q, CH), (53,25, s, N(CHb)3, 53,59, t, NCH2,

54,17, m, NCH2CH2), (51,19, d, CH3, 52,28, m, CHaHb, 52,37, m, CHaHb, 54,12, m, CH), (52,03, s ancho, COCH3), y 30 (53,42, dd, C(4)H, 53,44, dd, C(6)HaHb, 53,54, dd, C(2)H, 53,73, dd, C(3)H, 53,79, dd, C(6)HaHb, 53,86, m, C(5)H,

55,24, d, C(1)H) y/o (53,26, dd, C(2)H, 53,40, dd, C(4)H, 53,47, dd, C(5)H, 53,49, dd, C(3)H, 53,86, d, C(6)H2, 54,63, d, C(1)H).

[0150] Se describen en el presente documento metabolitos que comprenden (o consisten en) los siete 35 siguientes metabolitos de la sangre: (50,90, ancho, CH3, 51,30 ancho, CH2CH2CH3, 51,55, ancho, CH2CH3, 52,05,

ancho, CH2CH=, 52,25, ancho, CH2COOH, 55,35, ancho, CH2CH=), (51,32 d, CH3, 54,11, q, CH), (51,46, d, CH3;

53.73, q, CH), (53,25, s, N(CHa)a, 53,59, t, NCH2, 54,17, m, NCH2CH2), (51,19, d, CH3, 52,28, m, CHaHb, 52,37, m, CHaHb, 54,12, m, CH), (52,03, s ancho, COCH3), y (53,42, dd, C(4)H, 53,44, dd, C(6)HaHb, 53,54, dd, C(2)H, 53,73, dd, C(3)H, 53,79, dd, C(6)HaHb, 53,86, m, C(5)H, 55,24, d, C(1)H) y/o (53,26, dd, C(2)H, 53,40, dd, C(4)H, 53,47, dd,

40 C(5)H, 53,49, dd, C(3)H, 53,86, d, C(6)H2, 54,63, d, C(1)HJ.

[0151] Se describe en el presente documento que, donde dichos metabolitos comprenden dos o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: (50,90, ancho, CH3, 51,30, ancho, CH2CH2CH3, 51,55 ancho, CH2CH3, 52,05, ancho, CH2CH=, 52,25, ancho, CH2COOH, 55,35, ancho, CH2CH=), (51,32, d, CH3, 54,11, q, CH), (51,46, d,

45 CH3; 53,73, q, CH), (53,25, s, N(CHa)3, 53,59, t, NCH2, 54,17, m, NCH2CH2), (51,19, d, CH3, 52,28, m, CHaHb, 52,37, m, CHaHb, 54,12, m, CH), (52,03, s ancho, COCH3), y (53,42, dd, C(4)H, 53,44, dd, C(6)HaHb, 53,54, dd, C(2)H,

53.73, dd, C(3)H, 53,79, dd, C(6)HaHb, 53,86, m, C(5)H, 55,24, d, C(1)H) y/o (53,26, dd, C(2)H, 53,40, dd, C(4)H,

53,47, dd, C(5)H, 53,49, dd, C(3)H, 53,86, d, C(6)H2, 54,63, d, C(1)H) (como se ha descrito antes); el patron de referencia es un patron de EM en fase de recalda-remision (RR) y dichas diferencias de concentraciones se

50 seleccionan de:

un aumento en la concentracion de uno o mas metabolitos de la sangre seleccionados de:(50,90, ancho, CH3, 51,30, ancho, CH2CH2CH3, 51,55, ancho, CH2CH3, 582,05, ancho, CH2CH=, 52,25, ancho, CH2COOH, 55,35, ancho, CH2CH=), (51,32, d, CH3, 54,11, q, CH), y (51,19, d, CH3, 52,28, m, CHaHb, 52,37, m, CHaHb, 54,12, m, CH); y una 55 disminucion en la concentracion de uno o mas metabolitos de la sangre seleccionados de:(51,46, d, CH3; 53,73, q, CH), (53,25, s, N(CHa)3, 53,59, t, NCH2, 54,17, m, NCH2CH2), (52,03, s ancho, COCH3), y (53,42, dd, C(4)H, 53,44, dd, C(6)HaHb, 53,54, dd, C(2)H, 53,73, dd, C(3)H, 53,79, dd, C(6)HaHb, 53,86, m, C(5)H, 55,24, d, C(1)H) y/o (53,26, dd, C(2)H, 53,40, dd, C(4)H, 53,47, dd, C(5)H, 53,49, dd, C(3)H, 53,86, d, C(6)H2, 54,63, d, C(1)H).

[0152] Se describen en el presente documento diferencias de concentration que comprenden (o consisten en):

un aumento en la concentracion de: (50,90, ancho, CH3, 51,30, ancho, CH2CH2CH3, 51,55, ancho, CH2CH3, 52,05, 5 ancho, CH2CH=, 52,25, ancho, CH2COOH, 55,35, ancho, CH2CH=), (51,32, d, CH3, 54,11, q, CH), y (51,19, d, CH3, 52,28, m, CHaHb, 52,37, m, CHaHb, 54,12, m, CH); y una disminucion en la concentracion de: (51,46, d, CH3; 53,73, q, CH), (53,25, s, N(CH3)3, 53,59, t, NCH2, 54,17, m, NCH2CH2), (52,03, s ancho, COCH3), y (53,42, dd, C(4)H,

53.44, dd, C(6)HaHb, 53,54, dd, C(2)H, 53,73, dd, C(3)H, 53,79, dd, C(6)HaHb, 53,86, m, C(5)H, 55,24, d, C(1)H) y/o (53,26, dd, C(2)H, 53,40, dd, C(4)H, 53,47, dd, C(5)H, 53,49, dd, C(3)H, 53,86, d, C(6)H2, 54,63, d, C(1)H).

10

[0153] Se describe en el presente documento que cambios en la concentracion de los metabolitos de la sangre descritos antes son particularmente adecuados para usar en el diagnostico de la EM en fase SP. En una realization donde dichos metabolitos comprenden dos o mas metabolitos de la sangre seleccionados de (50,90, ancho, CH3, 51,30, ancho, CH2CH2CH3, 51,55, ancho, CH2CH3, 52,05, ancho, CH2CH=, 52,25, ancho, CH2C0OH,

15 55,35, ancho, CH2CH=), (51,32, d, CH3, 54,11, q, CH), (51,46, d, CH3; 53,73, q, CH), (53,25, s, N(CH3)3, 53,59, t, NCH2, 54,17, m, NCH2CH2), (51,19, d, CH3, 52,28, m, CHaHb, 52,37, m, CHaHb, 54,12, m, CH), (52,03, s ancho, COCH3), y (53,42, dd, C(4)H, 53,44, dd, C(6)HaHb, 53,54, dd, C(2)H, 53,73, dd, C(3)H, 53,79, dd, C(6)HaHb, 53,86, m, C(5)H, 55,24, d, C(1)H) y/o (53,26, dd, C(2)H, 53,40, dd, C(4)H, 53,47, dd, C(5)H, 53,49, dd, C(3)H, 53,86, d, C(6)H2, 54,63, d, C(1)H) (como se ha descrito antes); dichas diferencias de concentracion confirman la presencia de 20 EM en fase secundaria progresiva (SP).

[0154] Se describen en el presente documento metabolitos que comprenden dos o mas metabolitos de la sangre (por ejemplo, dos, tres o mas, cuatro o mas, cinco o mas, seis o mas, o siete o mas) seleccionados de: (52,13, m, CH2CHNH2, 52,45, m, OCCH2, 53,77, t, CH2CHNH2), (51,46, d, CH3; 53,73, q, CH), (53,42, dd, C(4)H,

25 53,44, dd, C(6)HaHb, 53,54, dd, C(2)H, 53,73, dd, C(3)H, 53,79, dd, C(6)HaHb, 53,86, m, C(5)H, 55,24, d, C(1)H) y/o (53,26, dd, C(2)H, 53,40, dd, C(4)H, 53,47, dd, C(5)H, 53,49, dd, C(3)H, 53,86, d, C(6)H2, 54,63, d, C(1)H), (53,25, s, N(CH3)3, 53,59, t, NCH2, 54,17, m, NCH2CH2), (51,32, d, CH3, 54,11, q, CH), (50,90, ancho, CH3, 51,30, ancho, CH2CH2CH3, 51,55, ancho, CH2CH3, 52,05, ancho, CH2CH=, 52,25, ancho, CH2COOH, 55,35, ancho, CH2CH=), (51,19, d, CH3, 52,28, m, CHaHb, 52,37, m, CHaHb, 54,12, m, CH), y (52,03, s ancho, COCH3).

30

[0155] Se describen en el presente documento metabolitos que comprenden dos o mas metabolitos de la sangre (por ejemplo, dos, tres o mas, o cuatro o mas) seleccionados de: (52,13, m, CH2CHNH2, 52,45, m, OCCH2, 53,77, t, CH2CHNH2), (51,46, d, CH3; 53,73, q, CH), (53,42, dd, C(4)H, 53,44, dd, C(6)HaHb, 53,54, dd, C(2)H, 53,73, dd, C(3)H, 53,79, dd, C(6)HaHb, 53,86, m, C(5)H, 55,24, d, C(1)H) y/o (53,26, dd, C(2)H, 53,40, dd, C(4)H, 53,47, dd,

35 C(5)H, 53,49, dd, C(3)H, 53,86, d, C(6)H2, 54,63, d, C(1)H), (53,25, s, N(CH3)3, 53,59, t, NCH2, 54,17, m, NCH2CH2), (51,32, d, CH3, 54,11, q, CH).

[0156] Se describen en el presente documento metabolitos que comprenden (o consisten en) los cinco siguientes metabolitos de la sangre: (52,13, m, CH2CHNH2, 52,45, m, OCCH2, 53,77, t, CH2CHNH2), (51,46, d, CH3;

40 53,73, q, CH), (53,42, dd, C(4)H, 53,44, dd, C(6)HaHb, 53,54, dd, C(2)H, 53,73, dd, C(3)H, 53,79, dd, C(6)HaHb, 53,86, m, C(5)H, 55,24, d, C(1)H) y/o (53,26, dd, C(2)H, 53,40, dd, C(4)H, 53,47, dd, C(5)H, 53,49, dd, C(3)H, 53,86, d, C(6)H2, 54,63, d, C(1)H), (53,25, s, N(CH3)3, 53,59, t, NCH2, 54,17, m, NCH2CH2), (51,32, d, CH3, 54,11, q, CH).

[0157] Se describe en el presente documento que, donde dichos metabolitos comprenden dos o mas

45 metabolitos seleccionados de: (52,13, m, CH2CHNH2, 52,45, m, OCCH2, 53,77, t, CH2CHNH2), (51,46, d, CH3; 53,73,

q, CH), (53,42, dd, C(4)H, 53,44, dd, C(6)HaHb, 53,54, dd, C(2)H, 53,73, dd, C(3)H, 53,79, dd, C(6)HaHb, 53,86, m, C(5)H, 55,24, d, C(1)H) y/o (53,26, dd, C(2)H, 53,40, dd, C(4)H, 53,47, dd, C(5)H, 53,49, dd, C(3)H, 53,86, d, C(6)H2, 54,63, d, C(1)H), (53,25, s, N(CH3)3, 53,59, t, NCH2, 54,17, m, NCH2CH2), (51,32, d, CH3, 54,11, q, CH); el patron de referencia se obtiene de un sujeto (o sujetos) que no tiene (o no tienen) EM; y dichas diferencias de 50 concentraciones se seleccionan de:

un aumento en la concentracion de uno o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: (52,13, m, CH2CHNH2,

52.45, m, OCCH2, 53,77, t, CH2CHNH2), y (51,46, d, CH3; 53,73, q, CH); y/o una disminucion en la concentracion de uno o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: (53,42, dd, C(4)H, 53,44, dd, C(6)HaHb, 53,54, dd, C(2)H,

55 53,73, dd, C(3)H, 53,79, dd, C(6)HaHb, 53,86, m, C(5)H, 55,24, d, C(1)H) y/o (53,26, dd, C(2)H, 53,40, dd, C(4)H,

53,47, dd, C(5)H, 53,49, dd, C(3)H, 53,86, d, C(6)H2, 54,63, d, C(1)H), (53,25, s, N(CH3)3, 53,59, t, NCH2, 54,17, m, NCH2CH2), y (51,32, d, CH3, 54,11, q, CH).

[0158] Se describen en el presente documento diferencias de concentracion que comprenden (o consisten

en):

un aumento en la concentracion de: un singlete (5x-y 3,37), (52,13, m, CH2CHNH2, 52,45, m, OCCH2, 53,77, t, CH2CHNH2), y (51,46 d, CH3; 53,73, q, CH); y una disminucion en la concentracion de: (53,42, dd, C(4)H, 53,44, dd, 5 C(6)HaHb, 53,54, dd, C(2)H, 53,73, dd, C(3)H, 53,79, dd, C(6)HaHb, 53,86, m, C(5)H, 55,24, d, C(1)H) y/o (53,26, dd, C(2)H, 53,40, dd, C(4)H, 53,47, dd, C(5)H, 53,49, dd, C(3)H, 53,86, d, C(6)H>, 54,63, d, C(1)H), (53,25, s, N(CH3)3, 53,59, t, NCH2, 54,17, m, NCH2CH2), y (51,32, d, CH3, 54,11, q, CH).

[0159] Se describen en el presente documento diferencias de concentracion que comprenden (o consisten 10 en):

un aumento en la concentracion de: (52,13, m, CH2CHNH2, 52,45, m, OCCH2, 53,77, t, CH2CHNH2), y (51,46, d, CH3; 53,73, q, CH); y una disminucion en la concentracion de: (53,42, dd, C(4)H, 53,44, dd, C(6)HaHb, 53,54, dd, C(2)H, 53,73, dd, C(3)H, 53,79, dd, C(6)HaHb, 53,86, m, C(5)H, 55,24, d, C(1)H) y/o (53,26, dd, C(2)H, 53,40, dd, 15 C(4)H, 53,47, dd, C(5)H, 53,49, dd, C(3)H, 53,86, d, C(6)H2, 54,63, d, C(1)H), (53,25, s, N(CHa)a, 53,59, t, NCH2,

54.17, m, NCH2CH2), y (51,32, d, CH3, 54,11, q, CH).

[0160] Se describen en el presente documento metabolitos que comprenden dos o mas metabolitos de la sangre (por ejemplo, dos, tres o mas, cuatro o mas, cinco o mas, o seis o mas) seleccionados de: (50,90, ancho,

20 CH3, 51,30, ancho, CH2CH2CH3, 51,55, ancho, CH2CH3, 52,05, ancho, CHaCH=, 52,25, ancho, CH2COOH, 55,35, ancho, CH2CH=), (51,32, d, CH3, 54,11, q, CH), (51,46, d, CH3; 53,73, q, CH), (53,25, s, N(CH3)3, 53,59, t, NCH2,

54.17, m, NCH2CH2), (51,19, d, CH3, 52,28, m, CHaHb, 52,37, m, CHaHb, 54,12, m, CH), (52,03, s ancho, COCH3), y (53,42, dd, C(4)H, 53,44, dd, C(6)HaHb, 53,54, dd, C(2)H, 53,73, dd, C(3)H, 53,79, dd, C(6)HaHb, 53,86, m, C(5)H,

55.24, d, C(1)H) y/o (53,26, dd, C(2)H, 53,40, dd, C(4)H, 53,47, dd, C(5)H, 53,49, dd, C(3)H, 53,86, d, C(6)H2, 54,63, 25 d, C(1)H).

[0161] Se describen en el presente documento metabolitos que comprenden (o consisten en): (50,90, ancho, CH3, 51,30, ancho, CH2CH2CH3, 51,55, ancho, CH2CH3, 52,05, ancho, CHaCH=, 52,25, ancho, CH2COOH, 55,35, ancho, CH2CH=), (51,32, d, CH3, 54,11, q, CH), (51,46, d, CH3; 53,73, q, CH), (53,25, s, N(CH3)3, 53,59, t, NCH2,

30 54,17, m, NCH2CH2), (51,19, d, CH3, 52,28, m, CHaHb, 52,37, m, CHaHb, 54,12, m, CH), (52,03, s ancho, COCH3), y (53,42, dd, C(4)H, 53,44, dd, C(6)HaHb, 53,54, dd, C(2)H, 53,73, dd, C(3)H, 53,79, dd, C(6)HaHb, 53,86, m, C(5)H,

55.24, d, C(1)H) y/o (53,26, dd, C(2)H, 53,40, dd, C(4)H, 53,47, dd, C(5)H. 53,49, dd, C(3)H, 53,86, d, C(6)H2, 54,63, d, C(1)H).

35 [0162] Se describe en el presente documento que, donde dichos metabolitos comprenden dos o mas

metabolitos seleccionados de: (50,90, ancho, CH3, 51,30, ancho, CH2CH2CH3, 51,55, ancho, CH2CH3, 52,05, ancho, CHaCH=, 52,25, ancho, CH2COOH, 55,35, ancho, CH2CH=), (51,32, d, CH3, 54,11, q, CH), (51,46, d, CH3; 53,73, q, CH), (53,25, s, N(CH3)3, 53,59, t, NCH2, 54,17, m, NCH2CH2), (51,19, d, CH3, 52,28, m, CHaHb, 52,37, m, CHaHb, 54,12, m, CH), (52,03, s ancho, COCH3), y (53,42, dd, C(4)H, 53,44, dd, C(6)HaHb, 53,54, dd, C(2)H, 53,73, dd, 40 C(3)H, 53,79, dd, C(6)HaHb, 53,86, m, C(5)H, 55,24, d, C(1)H) y/o (53,26, dd, C(2)H, 53,40, dd, C(4)H, 53,47, dd, c(5)h, 53,49, dd, C(3)h, 53,86, d, C(6)H2, 54,63, d, C(1)H); el patron de referencia es un patron de la EM en fase secundaria progresiva (SP) y dichas diferencias de concentraciones se seleccionan de:

un aumento en la concentracion de uno o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: (51,46 d, CH3; 53,73, q, 45 CH), (53,25, s, N(CH3)3, 53,59, t, NCH2, 54,17, m, NCH2CH2), (52,03, s ancho, COCH3), y (53,42, dd, C(4)H, 53,44, dd, C(6)HaHb, 53,54, dd, C(2)H, 53,73, dd, C(3)H, 53,79, dd, C(6)HaHb, 53,86, m, C(5)H, 55,24, d, C(1)H) y/o (53,26, dd, C(2)H, 53,40, dd, C(4)H, 53,47, dd, C(5)H, 53,49, dd, C(3)H, 53,86, d, C(6)H2, 54,63, d, C(1)H); y una disminucion en la concentracion de: (50,90, ancho, CH3, 51,30, ancho, CH2CH2CH3, 51,55, ancho, CH2CH3, 52,05, ancho, CH2CH=, 52,25, ancho, CH2COOH, 55,35, ancho, CH2CH=), (51,32, d, CH3, 54,11, q, CH) y (51,19, d, CH3, 50 52,28, m, CHaHb, 52,37, m, CHaHb, 54,12, m, CH).

[0163] Se describen en el presente documento diferencias de concentracion que comprenden (o consisten

en) un aumento en la concentracion de: (51,46, d, CH3; 53,73, q, CH), (53,25, s, N(CH3)3, 53,59, t, NCH2, 54,17, m, NCH2CH2), (52,03, s ancho, COCH3), y (53,42, dd, C(4)H, 53,44, dd, C(6)HaHb, 53,54, dd, C(2)H, 53,73, dd, C(3)H, 55 53,79, dd, C(6)HaHb, 53,86, m, C(5)H, 55,24, d, C(1)H) y/o (53,26, dd, C(2)H, 53,40, dd, C(4)H, 53,47, dd, C(5)H,

53,49, dd, C(3)H, 53,86, d, C(6)H2, 54,63, d, C(1)h); y una disminucion en la concentracion de: (50,90, ancho, CH3, 51,30, ancho, CH2CH2CH3, 51,55, ancho, CH2CH3, 52,05, ancho, CH2CH=, 52,25, ancho, CH2COOH, 55,35, ancho, CH2CH=), (51,32, d, CH3, 54,11, q, CH) y (51,19 d, CH3, 52,28, m, CHaHb, 52,37, m, CHaHb, 54,12, m, CH).

[0164] Se describe en el presente documento que, donde dichos metabolitos comprenden al menos dos metabolitos de la sangre seleccionados de: (52,13, m, CH2CHNH2, 52,45, m, OCCH2, 53,77, t, CH2CHNH2), (51,46, d, CH3; 53,73, q, CH), (53,42, dd, C(4)H, 53,44, dd, C(6)HaHb, 53,54, dd, C(2)H, 53,73, dd, C(3)H, 53,79, dd, C(6)HaHb, 53,86, m, C(5)H, 55,24, d, C(1)H) y/o (53,26, dd, C(2)H, 53,40, dd, C(4)H, 53,47, dd, C(5)H, 53,49, dd,

5 C(3)H, 53,86, d, C(6)H2, 54,63, d, C(1)H), (53,25, s, N(CH3)a, 53,59, t, NCH2, 54,17, m, NCH2CH2), (51,32, d, CH3, 54,11, q, CH), (50,90, ancho, CH3, 51,30, ancho, CH2CH2CH3, 51,55, ancho, CH2CH3, 52,05, ancho, CH2CH=, 52,25, ancho, CH2COOH, 55,35, ancho, CH2CH=), (51,19, d, CH3, 52,28, m, CHaHb, 52,37, m, CHaHb, 54,12, m, CH) y (52,03, s ancho, COCH3) (como se ha descrito antes); dichas diferencias de concentration confirman la presencia de la EM en fase de recalda-remision (RR).

10

[0165] En el que el procedimiento descrito en el presente documento permite el diagnostico de una fase de la enfermedad de la eM (como se ha descrito antes), la muestra se obtiene de una muestra de sangre y el patron de referencia se obtiene de la sangre.

15 [0166] En el que el procedimiento descrito en el presente documento permite el diagnostico de una fase de la

enfermedad de la eM (como se ha descrito antes), la muestra se obtiene de una muestra de suero o plasma y el patron de referencia se obtiene de suero o plasma.

[0167] En una realization, el procedimiento de la invention comprende ademas registrar los resultados de al

20 menos una etapa en un medio de almacenamiento de datos. A modo de ejemplo, el procedimiento de la presente

invencion puede generar datos relativos al sujeto de ensayo, siendo dichos datos registrables en un medio de almacenamiento de datos (por ejemplo, en forma de una memoria de ordenador, tal como un disco duro, un disco compacto, disco flexible, o disco de estado solido). Dichos datos pueden comprender (o consistir en) datos relativos a la concentracion en una muestra (de dicho sujeto de ensayo) de cualesquiera de dichos dos o mas metabolitos

25 anteriores (como se ha descrito).

[0168] Se describe en el presente documento un medio de almacenamiento de datos obtenidos por un procedimiento descrito en el presente documento.

30 [0169] Se describe en el presente documento un dispositivo para usar en un procedimiento como se ha

descrito antes, en el que dicho dispositivo es capaz de realizar la etapa de identificar una diferencia de concentracion para cada uno de dichos dos o mas metabolitos en la muestra con respecto a la muestra de referencia.

35 Lista de figuras

[0170]

Figura 1

40 (A) Una grafica que muestra las puntuaciones cllnicas de ratones con Cr-EAE, las puntuaciones de CFA no se muestran debido a que la puntuacion no se desviaba nunca de 0. Las flechas indican cuando se tomaron las muestras de cada animal. (B) Una grafica que muestra el porcentaje de perdida de peso de animales tanto con EAE como de CFA.

45 Figura 2

(A) Espectro de RMN 1H NOESY-presat de una muestra de orina del dla 38 de una animal con Cr-EAE. (B) Grafica de PLS-DA de muestras de orina de animales que compara animales con Cr-EAE el dla 38 (cuadrados negros) y animales con Cr-EAE el dla 28 (cuadrados grises). (C) Grafica de PLS-DA de muestras de orina de animales que compara animales con Cr-EAE el dla 38 (cuadrados negros) y animales sin tratamiento previo (triangulos grises). (D)

50 Grafica de PLS-DA de muestras de orina de animales que compara animales con Cr-EAE el dla 38 (cuadrados negros) y animales de CFA el dla 38 (clrculos grises). (E) Tabla que muestra los valores de q2 de todos los modelos animales. (F) Tabla que muestra los valores de q2 de animales con Cr-EAE y de CFA en diferentes puntos de medicion comparado con el grupo sin tratamiento previo.

55 Figura 3

Espectros de RMN 1H superpuestos (espectros 1D registrados con presaturacion de disolvente y supresion de fondo CPMG) de suero de pacientes en recalda-remision (azul) y en fase secundaria progresiva (rojo) con los metabolitos clave identificados. Secciones aumentadas de los espectros: (i) region anomerica de la a-glucosa; (ii) region que contiene las resonancias debidas a los azucares; (ii) region que contiene resonancias de acido graso y metilo. Clave:

1: Agua (H2O), 2: resonancias de la glucosa, 3: protones anomericos de la p-glucosa, 4: acido graso =CH-CH2-, 5: especies N-acetilo (CH3), asignacion putativa basada en los datos publicados (Fan, 1996; Wishart, et al., 2009), 6: Alanina (CH3), 7: pico de acido graso (CH3) 8: pico de acido graso (cadena -CH2-), 9: Lactato (CH3), 10: Lactato (CH), 11: protones anomericos de la a-glucosa, 12: acido graso insaturado (CH2CH=CHCH2).

5

Figura 4

(A) Espectro de RMN 1H NOESY-presat de una muestra de plasma de animal con Cr-EAE el dla 38. (B) Grafica de PLS-DA de muestras de plasma de animales que compara animales con Cr-EAE el dla 38 (cuadrados negros) y animales con Cr-EAE el dla 28 (cuadrados grises). (C) Grafica de PLS-DA de muestras de plasma de animales que 10 compara animales con Cr-EAE el dla 38 (cuadrados negros) y animales sin tratamiento previo (triangulos grises). (D) Grafica de PLS-DA de muestras de plasma de animales que compara animales con Cr-EAE el dla 38 (cuadrados negros) y animales de CFA el dla 38 (clrculos grises). (E) Tabla que muestra los valores de q2 de todos los modelos animales. (F) Tabla que muestra los valores de q2 de animales con Cr-EAE y de CFA en diferentes puntos de medicion comparado con el grupo sin tratamiento previo.

15

Figura 5

(A) Espectro de RMN 1H NOESY-presat de una muestra de orina humana. (B) Grafica de PLS-DA de muestras de orina humana que compara pacientes en recalda-remision (rombos grises) y pacientes en fase secundaria progresiva (clrculos negros). (C) Grafica de PLS-DA de muestras de orina humana que compara pacientes en fase 20 secundaria progresiva (triangulos grises) y un grupo de control (clrculos negros). (D) Grafica de PLS-DA de muestras de suero humano que compara pacientes en fase secundaria progresiva (triangulos grises) y un grupo de control (clrculos negros). (E) Tabla que muestra los valores de q2 de las muestras de orina humana de todos los modelos. (F) Tabla que muestra los valores de q2 de muestras de suero humano de todos los modelos.

25 Figura 6

Una grafica de cajas y bigotes que muestra el analisis dejando uno fuera del modelo de RR frente a SP. Las estrellas indican diferencia p<0,0001 entre las medias de dos grupos, la caja muestra la desviacion estandar, la llnea media muestra la media de dos grupos. Los bigotes muestran los llmites superior e inferior de los datos.

30 Figura 7

Information complementaria 1: Grafica de validation de modelo de muestra, cuadrado trazado valor de q2 observado y cuadrados negros valores de q2 generados. Los valores de q2 generados se generaron en Simca, con el fin de considerar que la grafica sea valida, todos los valores de q2 generados deben ser menores que el valor de q2 observado para el modelo. El eje y muestra la correlation de los valores generados cuando se comparan con los 35 valores observados.

Figura 8

Informacion complementaria 2: Un espectro COSY de muestra de plasma de un animal con Cr-EAE el dla 38 que muestra las correlaciones destacadas que ayudan a la identification de metabolitos. Clave 1: Acido graso, 2: 40 Glutamato, 3: Taurina, 4: Citrato, 5: Alanina, 6: Lactato, 7: Region que contiene correlaciones de glucosa, 8: p- glucosa, 9: a-glucosa.

Figura 9

Informacion complementaria 3: Tabla de todos los desplazamientos qulmicos de los metabolitos identificados en la 45 section de resultados dados en la bibliografla, Clave: 5 - desplazamiento qulmico, M - multiplicidad, s - singlete, d - doblete, t - triplete, q - cuartete, dd - doblete de dobletes, ddd - doblete de dobletes de dobletes, m - multiplete, ancho - resonancia ancha.

Figura 10

50 Informacion complementaria 4: Experimentos de enriquecimiento de RMN. (A) Espectro de RMN 1H de potenciales metabolitos con el fin de confirmar la identidad de determinados metabolitos con una resonancia de singlete. (B) RMN 1H NOESY llnea base de orina de animal, (C) adicion de acido ureidopropionico, (D) adicion de TMAO, (E) adicion de fosfocolina, (F) adicion de TMA.

55 Figura 11

Informacion complementaria 5: Tabla que muestra los metabolitos regulados tanto por aumento como por disminucion que causan la separation en los modelos de orina animales.

Information complementaria 6: (A) Tabla que muestra los metabolitos positivos y negativos que causan la separation en los modelos de plasma de Cr-EAE cuando se compara con animales el dla 10. (B) Tabla que muestra los metabolitos positivos y negativos que causan la separation en los modelos de plasma de Cr-EAE cuando se compara con animales el dla 14. (C) Tabla que muestra los metabolitos positivos y negativos que causan la 5 separation en los modelos de plasma de Cr-EAE cuando se compara con animales el dla 17. (D) Tabla que muestra los metabolitos positivos y negativos que causan la separation en los modelos de plasma de Cr-EAE cuando se compara con animales el dla 21.

Figura 13

10 Information complementaria 7: (A) Tabla que muestra los metabolitos del plasma positivos y negativos que causan la separation entre los animales con Cr-EAE y sin tratamiento previo en diferentes puntos de medicion. (B) Tabla que muestra los metabolitos del plasma positivos y negativos que causan la separation entre los animales con Cr- EAE y de CFA en diferentes puntos de medicion. (C) Tabla que muestra los metabolitos del plasma positivos y negativos que causan la separation entre los animales de CFA y sin tratamiento previo en diferentes puntos de 15 medicion.

Figura 14

Information complementaria 8: (A) Tabla que muestra el primer ciclo de metabolitos positivos y negativos que produclan la separation en el modelo de orina humano. (B) Tabla que muestra el primer ciclo de metabolitos 20 positivos y negativos que produclan la separation en los modelos de suero humano. (C) Tabla que muestra el segundo ciclo de metabolitos positivos y negativos que produclan la separation en los modelos de suero humano.

Figura 15

Information complementaria 9: Esquema para mostrar los cambios de los metabolitos a lo largo del tiempo en 25 modelos animales. (A) Esquema que muestra los cambios de los metabolitos en los animales con Cr-EAE con respecto a animales sin tratamiento previo. (B) Esquema que muestra los cambios de los metabolitos en animales con Cr-EAE con respecto a los animales de CFA. Las barras sombreadas representan el periodo de enfermedad activa.

30 Figura B1

Analisis humano: (A) Grafica de PLS-DA de muestras de suero humano que compara los pacientes en recalda- remision (triangulos grises vaclos) y un grupo de control (cuadrados negros llenos). (B) Grafica de PLS-DA de muestras de suero humano que compara los pacientes en recalda-remision (rombos negros llenos) y pacientes en fase secundaria progresiva (triangulos grises vaclos). (C) Tabla que muestra los valores de q2 de los modelos de 35 muestras de suero humano. n.p. = no predictivo (es decir, q2 < 0).

Figura B2

Curvas ROC + tablas de contingencia: (A, B, C) tablas de contingencia 2x2 para resultados de prediction del modelo humano que resumen las identificaciones correctas e incorrectas. En cada caso, los p-valores de la prueba exacta 40 de Fisher bilateral son menores de 0,05 (Control frente a RRMS, p = 0,0013; Control frente a SPmS, p =5,1x10'5; SPMS frente a RRMS, p = 0,017). (D) Curvas de rendimiento diagnostico (ROC) construidas para cada uno de los tres modelos humanos validados con un conjunto de pacientes de ensayo. El control frente a EMSP es cuadrados negros y llnea negra. El control frente a EMRR es triangulos grises y llnea gris. La EMSP frente a EMRR es clrculos blancos y llnea negra.

45

Figura B3

Tablas de information de pacientes. A. Datos para la comparacion de la poblacion entera. * = p<0,05 con respecto a la EMRR. *** = p<0,001 con respecto a la eMrR. fff = p<0,001 con respecto a la EMPP, EmRR y EMSP. = p<0,001 con respecto a la EMRR. B. Comparaciones dentro y entre conjuntos de pacientes, es decir, comparaciones 50 hechas entre grupos dentro de cada conjunto (p. ej., EMRR frente a EMSP dentro del conjunto A) as! como en el mismo grupo dentro de cada conjunto (p. ej., conjunto A de EMRR frente a Conjunto B de EMRR). Donde no se citan > 0,05. a = p<0,05 con respecto a la EMSP del conjunto B y conjunto C. b = p<0,001 con respecto a la EMRR del conjunto A. c = p<0,01 con respecto a la EMRR del conjunto A. d = p<0,001 con respecto al control del conjunto A. e = p<0,05 con respecto al control del conjunto A y p<0,01 con respecto a la EMSP del conjunto A. f = p<0,05 con 55 respecto al control del conjunto B. g = p<0,001 con respecto al control del conjunto B. h = p<0,001 con respecto al control del conjunto C. Los datos son medianas (mln-max)

Figura B4

Grafica de validation del modelo de muestra. El valor de q2 observado es el cuadrado trazado y los valores de q2

generados son los cuadrados negros. Los valores de q2 generados se obtienen por aleatorizacion de las muestras en diferentes grupos en multiples combinaciones y calculando el valor de q2 para todas las permutaciones ensayadas. Con el fin de considerar que la grafica es valida >95% de los valores de q2 generados deben ser menores que el valor de q2 observado para el modelo. El eje y muestra la correlation de los valores generados 5 cuando se compara con el valor observado.

Figura B5

Un espectro COSY de muestra de plasma de un paciente de EMSP que muestra correlaciones destacadas que ayudan a la identification de metabolitos. Clave 1: Acido graso, 2: Glutamato, 3: Taurina, 4: Citrato, 5: Alanina, 6: 10 Lactato, 7: Region que contiene correlaciones de glucosa, 8: p-glucosa, 9: a-glucosa.

Figura B6

Tabla de desplazamientos qulmicos de los metabolitos. Clave: 5 - desplazamiento qulmico, M - multiplicidad, s - singlete, d - doblete, t - triplete, q - cuartete, dd - doblete de dobletes, ddd - doblete de dobletes de dobletes, m - 15 multiplete, ancho - resonancia ancha.

Figura B7

Experimentos de enriquecimiento de RMN en orina. Espectro de RMN 1H de potenciales metabolitos con el fin de confirmar la identidad de los metabolitos con una resonancia de singlete. (A, azul) RMN 1H NOESY llnea base de 20 orina de animal. (B, rojo) adicion de TMAO, (C, verde) adicion de fosfocolina.

Figura B8

Tabla que muestra los valores de q2 de los modelos de muestras de suero junto con la clave de los metabolitos identificados.

25

Figura B9

Resumen estadlstico y caracterlsticas para las curvas ROC producidas con el conjunto de ensayo de muestras independientes (Conjunto C) para el modelo. El EE area es el error estandar del area. Los p valores se calculan con la hipotesis de nulidad de que el area es 0,5 (es decir, asignacion aleatoria de los pacientes a clases).

30

Figura B10

(A) Grafica de PLS-DA de muestras de orina que comparan pacientes en fase secundaria progresiva (triangulos grises vaclos) y un grupo de control (clrculos negros llenos). (B) Tabla que muestra los valores de q2 de los modelos de muestras de orina humanas junto con los metabolitos clave identificados.

35

EJEMPLOS

[0171] Los siguientes materiales y procedimientos se usaron en los ejemplos descritos a continuation.

40 Materiales y procedimientos

Preparacion de los animales

[0172] Las muestras de orina y plasma se obtuvieron de un modelo de raton de encefalomielitis autoinmune 45 experimental recidivante cronica (Cr-EAE), un modelo cllnicamente mas relevante para la EM que los modelos de

enfermedad monofasica usados habitualmente. Ratones Biozzi ABH adultos se alimentaron con una dieta de gelatina y pienso con alto contenido en protelnas en la jaula durante un periodo de una semana antes de la induction de la Cr-EAE y a lo largo de la evolution de la enfermedad. La Cr-EAE se indujo como han descrito Baker et al. (J Neuroimmunol. 1990; 28(3): 261-70). Brevemente, se inyecto a cada animal por via subcutanea el dla 0 y el 50 dla 7 homogeneizado de medula espinal de raton en adyuvantes de Freund incompleto complementado con M. tuberculosis y M. butyricum desecados no viables. Se inyecto a un grupo de animales de control el adyuvante de Freund incompleto complementado (CFA), pero omitiendo el homogeneizado de la medula espinal. Los animales se pesaron diariamente y se evaluaron los signos cllnicos (figura 1).

55 [0173] Las muestras de sangre y orina se tomaron los dlas 10, 14, 17, 28 y 38 despues de la induccion de la

Cr-EAE. La sangre se recogio por puncion cardiaca usando una jeringa revestida de heparina y se puso inmediatamente en un tubo para sangre que contenla acido etilendiaminotetraacetico dipotasico (EDTA) sobre hielo (Teklab, Reino Unido). Posteriormente las muestras de sangre se centrifugaron (14000 rpm, 5 min) a 4°C, despues de lo cual se separo la capa superior de plasma y se almaceno a -80°C. Las muestras de orina se recogieron bien

directamente de la vejiga despues de sacrificar el animal con CO2 o poniendo una placa de 96 pocillos bajo el animal durante el sacrificio.

Muestras humanas

5

[0174] Se obtuvieron muestras de suero de la sangre (n=58) y de orina (n=84) de pacientes con EM (n=58) bajo aprobacion etica (C03.054, Perfil metabolico de la orina en la EM) con cohortes de pacientes con EM en recalda-remision (RR) (orina n = 22; suero n = 19), primaria progresiva (orina n = 32; suero n = 13) y secundaria progresiva (orina n = 30; suero n = 26). Las muestras de control se recogieron de voluntarios de edad y sexo

10 correspondiente (orina n = 28; suero n = 16).

Espectroscopfa de RMN

[0175] Las muestras de orina o suero/plasma de la sangre se descongelaron durante la noche en una sala 15 frla antes de los experimentos de RMN y despues las muestras de sangre se centrifugaron mas (100000 g, 30 min).

Las muestras de orina y plasma (100 pl para EAE o 150 pl para EM) se pusieron en un tubo de RMN de 5 mm y se diluyeron a un volumen final de 600 pl con tampon de fosfato (Na2HPO4 0,2 M/NaH2PO4 0,04, pH 7,4, azida sodica al 0,1%, cloruro sodico al 0,8%) en D2O que contenla TSP 1 mM (3-trimetilsilil-1-[2,2,3,3,-2H4]-propionato) como una referencia interna. Se adquirieron los espectros de RMN 1H de cada muestra usando un sistema 16,4T NMR (700 20 MHz 1H) (Bruker Avance III equipado con una criosonda 1H TCI). Para todas las muestras se uso una secuencia de presaturacion de 1D NOESY, con presaturacion de disolvente durante el retraso de la relajacion (2 s) y tiempo de mezcla (10 ms). Para las muestras de plasma solo se uso una secuencia de CPMG con presaturacion de disolvente y un filtro T2 (duracion total 40 ms; 20 ciclos de 2 ms de eco de espln) para suprimir las resonancias de llpidos.

25 [0176] Los espectros de RMN 1H bidimensionales se adquirieron de una muestra en cada grupo para ayudar

a la identification de metabolitos. Los espectros de espectroscopla de correlation 2D (COSY) se adquirieron en el mismo espectrometro que el espectro de RMN 1D.

[0177] Los espectros COSY se adquirieron con presaturacion de disolvente de 1,5 s, una anchura espectral 30 de 10 ppm (7002 Hz), y 16 o 32 transiciones por incremento t1 para 256 incrementos. Todos los espectros de RMN

se adquirieron a 293 K.

[0178] Los espectros 1D 1H de plasma se subdividieron en regiones de 0,02 ppm (5 = punto medio de la region de integration) y se integraron, reduciendo cada espectro a 435 variables independientes entre 0,20 - 4,30 y

35 5,00 - 9,60 ppm. La integracion se llevo a cabo usando una macro en el ACD 1D NMR Processor version 12 (Advanced Chemical Development, Reino Unido). Los espectros de 1H 1D de la orina se subdividieron en regiones de integracion de 0,02 ppm y se integraron, reduciendo el espectro a 385 variables independientes, entre 0,20 - 4,30 y 5,00 - 9,60 ppm. En todos los espectros, se omitio la region entre 4,30 y 5,00 ppm debido a la distorsion del espectro que aparece por la supresion del agua a 4,7 ppm. En el caso de los espectros de orina, la region entre 5,00 40 y 6,00 ppm tambien se excluyo para evitar la resonancia ancha que aparece de la urea. Estas secciones representan regiones altamente variables del espectro. Posteriormente, se aplico el reconocimiento de patron estadlstico a los espectros para diferenciar entre muestras obtenidas de diferentes estados de la enfermedad sea en el modelo de EAE o de los pacientes de EM.

45 [0179] Toda la modelizacion estadlstica se llevo a cabo usando SIMCA P+ 12,0 (Umetrics, Suecia). Todos los

datos se aumentaron usando la varianza Pareto con el fin de suprimir el ruido en los datos. Con el fin de determinar como de predictivos eran los modelos, se uso el valor de q2 para cada modelo como una gula de la validez del modelo de PLS-DA. Un valor de q2 por encima de 0,4 se consideraba estadlsticamente significativo (Waterman, et al., 2010) y por lo tanto se ensayaba mas. La funcion de validation en Simca P+ se uso para generar 100 modelos 50 donde las muestras se pusieron en clases aleatorias. Despues se calcularon los valores de q2 de estos modelos 10 y se compararon con el valor real de q2 del modelo genuino. El modelo se considero valido si todos los valores de q2 predictivos eran menores que el valor de q2 real (Information complementaria 1).

[0180] Los modelos se validaron ademas por elimination de puntos individuales en los modelos de PLS.

55 Despues se volvieron a construir los modelos y la muestra omitida entonces se reintrodujo con el fin de confirmar que cala dentro del grupo requerido (el llamado analisis de “dejando uno fuera”). Con el fin de una clasificacion perfecta, las muestras se puntuaron 1 si eran un miembro del grupo requerido o 0 si no eran un miembro. Se aplico un valor de corte de exclusion arbitrario de 0,5 a las muestras que no se ajustaban perfectamente al modelo (Brindle, et al., 2002; Gavaghan, et al., 2000). Despues se ensayo la diferencia entre los grupos con un ensayo t para datos

no pareados para investigar las diferencias entre los grupos. Si los modelos no pasaban estos ensayos se clasificaban como no significativos (ns), sin embargo, si pasaban todos los ensayos se consideraba que eran modelos predictivos.

5 [0181] Con el fin de identificar los metabolitos se examinaron las cargas usando una grafica s-plot, y los picos

se identificaron usando una combination de espectroscopla COSY (information complementaria 2), valores de la bibliografla y referencias a bases de datos de metaboloma humanos (informacion complementaria 3) (Fan, 1996; Wishart, et al., 2007; Wishart, et al., 2009). Se logra la confirmation adicional de los metabolitos examinando el acoplamiento J (interacciones de espln-espln entre hidrogenos vecinos) de las resonancias dentro del espectro.

10

[0182] Con el fin de confirmar la identidad de los picos singletes que no dan correlaciones dentro de los espectros 2D COSY, se anadio el metabolito predicho (“enriquecimiento”) en el tubo de RMN como una muestra de referencia autentica (informacion complementaria 4 A).

15 Ejemplo 1

Cr-EAE: Modelo animal

[0183] Todos los animales con Cr-EAE siguieron el curso tlpico de la enfermedad descrito previamente por 20 Baker et al. 1990; los animales presentaban perdida de peso significativa y aumentaron la puntuacion cllnica, que

alcanzo el maximo el dla 17, y le siguio una remision completa de modo que la puntuacion cllnica habla vuelto a los valores base en todos los animales el dla 26 (figura 1). Posteriormente, los animales entraron en la fase de recalda, alrededor del dla 32, con un segundo aumento importante en la puntuacion cllnica y la perdida de peso. Durante el maximo de la enfermedad los animales con Cr-EAE se alimentaron manualmente para reducir la deshidratacion y la 25 perdida de peso. La inyeccion de CFA solo (grupo de CFA) no causo ningun signo cllnico manifiesto ni perdida de peso significativa (figura 1).

Ejemplo 2

30 Cr-EAE: Analisis de orina

[0184] Los espectros obtenidos por la espectroscopla de RMN 1H de alta resolution tenlan una resolution suficiente para permitir la identification de alrededor de 30 metabolitos. El analisis de PLS de los espectros de orina de los animales sin tratamiento previo en diferentes puntos de medicion devolvio a un modelo con un q2 bajo (0,10),

35 indicando que no era predictivo. Por consiguiente, despues los datos de los animales sin tratamiento previo se combinaron como un solo grupo y se llevo a cabo el analisis usando un solo grupo de control (sin tratamiento previo).

[0185] Visualmente, parecla haber separation de los diferentes grupos de enfermedad, como se ilustra en la 40 figura 2B, C y D. Sin embargo, aunque muchos de los modelos de orina devolvieron un valor de q2 positivo indicando

diferencias tanto dentro de los animales con Cr-EAE en diferentes tiempos de medicion como entre los animales con Cr-EAE y de control (CFA o sin tratamiento previo), solo 12 modelos alcanzaron signification estadlstica (q2 > 0,4; Figura 2, Tabla E y F). El dla 10 se podia separar tanto los animales con Cr-EAE como los de CFA de los animales sin tratamiento previo (q2 = 0,55 y 0,53, respectivamente; (Figura 2, Tabla E y F), aunque, mientras que la 45 separacion era fuertemente positiva entre los animales con Cr-EAE y de CFA en este tiempo de medicion, no alcanzaron la significacion estadistica (q2 = 0,38). Sin embargo, se encontro una separacion importante entre los animales con Cr-EAE y de CFA el dia 14 con un valor de q2 de 0,46 (Figura 2, Tabla E). Los animales con Cr-EAE el dia 38 mostraban una separacion positiva de todos los demas tiempos de medicion de Cr-EAE y tambien de los controles de CFA y sin tratamiento previo (Figura 2, Tabla E y F). No se obtuvieron datos de los animales el dia 17 50 ya que el volumen de orina recogido no era adecuado.

[0186] Los animales de CFA el dia 10 mostraban una separacion positiva tanto del dia 14 como del 38 (q2 = 0,47* y 0,5, respectivamente; Figura 2, Tabla E) y el dia 28 se podia separar los animales de CFA de la cohorte sin tratamiento previo (q2 0,5) (Figura 2, Tabla F).

55

[0187] Las cargas de los modelos estadisticamente significativos generados para la evolution de la enfermedad identificaban varios metabolitos clave que eran responsables de las separaciones entre grupos (vease complementario 3 para las asignaciones completas de la bibliografla). Aqui, 5x-y se define como el desplazamiento quimico del centro de la region identificada por el reconocimiento de patron en SIMCA. En particular, el citrato (5x-y

2,50, 2,65), creatina (5x-y 3,03), taurina (5x-y 3,25, 3,40), un conjunto de resonancias sin asignar (5x-y 3,13, dos singletes muy cerca uno de otro), N-oxido de la trimetilamina (TMAO; 5x-y 3,26), trimetilamina (TMA; 5x-y 2,89) y acido ureidopropionico (5x-y 2,37) variaban todos significativamente a lo largo de la evolucion de la enfermedad. La identidad de estos tres ultimos metabolitos se confirmo por experimentos de enriquecimiento (informacion 5 complementaria 4). Con excepcion del acido ureidopropionico, tambien se identificaron los mismos metabolitos cuando se compararon los animales con Cr-EAE con los dos grupos de control (CFA y sin tratamiento previo). Ademas, la 14 fosfocolina (5x-y 3,23), tambien confirmada por enriquecimiento (Informacion complementaria 4e), era un contribuyente importante al modelo que separaba los animales con Cr-EAE y de CFA el dla 38. La direccion del cambio en cada metabolito variaba a lo largo de la evolucion de la enfermedad. Por ejemplo, los dlas 10 y 14, que 10 estan en las fases de inicio precllnico y temprano de la enfermedad, los niveles de citrato eran mas bajos en los animales con Cr- EAE que en los animales de control, mientras que durante la recalda el dla 38 eran elevados comparado con los controles de CFA. En cambio, los niveles de la resonancia de TMAO alcanzaron el maximo en animales con Cr-EAE durante la fase de remision justo antes de la recalda (dla 28), pero despues permaneclan elevados el dla 38 (recalda maxima) comparado con los tiempos de medicion sintomaticos precllnicos y tempranos 15 (dla 10 y dla 14; Informacion complementaria 5).

Ejemplo 3

Cr-EAE: Analisis de plasma

20

[0188] Se usaron dos secuencias de RMN diferentes para obtener espectros de las muestras de plasma; (i) la secuencia de presaturacion de NOESY usada para las muestras de orina, y (ii) una secuencia CPMG con un filtro de supresion de llpidos T2. Para algunas muestras la modulacion de fase era evidente con los espectros de CPMG y, por lo tanto, los espectros de presaturacion de NOESY se usaron en todos los analisis posteriores.

25

[0189] Como para la orina, el analisis de PLS de los espectros de plasma de animales sin tratamiento previo en diferentes tiempos de medicion, devolvio un modelo con un q2 bajo (0,176) indicando que no era predictivo. Por consiguiente, todos los datos de animales sin tratamiento previo se combinaron como un solo grupo despues y se llevo cabo el analisis usando un solo grupo de control (sin tratamiento previo).

30

[0190] Aunque los espectros de todos los grupos superficialmente pareclan similares tras la superposicion inicial (figura 3) el analisis estadlstico multivariante de los conjuntos de datos mostraba separaciones predictivas entre los grupos de Cr-EAE en todos los tiempos de medicion durante el curso de la enfermedad y tambien cuando se comparaba los animales con Cr-EAE tanto con animales de CFA como sin tratamiento previo (figura 4, tabla E y

35 F). Tambien se podlan generar modelos predictivos basados en los espectros del plasma de animales de CFA en todos los tiempos de medicion durante el curso de la enfermedad, con excepcion del dla 14 frente al dla 28 (figura 4, tabla E).

Al examinar las cargas dentro de los modelos de PLS para la evolucion de la Cr-EAE, se identificaron varios metabolitos clave como generadores de las separaciones positivas. Los modelos positivos iniciales generados 40 comparando los diferentes tiempos de medicion para los animales con Cr-EAE mostraron variaciones en el n-butirato (5x-y 0,88, 1,58) y N-oxido de trimetilamina (TMAO) (5x-y 3,44). Tras la exclusion de estos metabolitos de los espectros originales, se podlan generar mas modelos positivos con valores de q2 significativos. A lo largo de todas las comparaciones de los tiempos de medicion, los unicos modelos que no eran estadlsticamente significativos eran las comparaciones entre Cr-EAE y CFA los dlas 17 y 28, es decir durante la remision de la Cr-EAE (Informacion 45 complementaria 6). La taurina (5x-y 3,25) y el lactato (5x-y 1,32) se identificaron como metabolitos que tenlan una funcion clave en la generacion del segundo ciclo de modelos positivos.

[0191] Tambien se identificaron los metabolitos clave de los modelos originales que separaban los animales con Cr-EAE de los grupos de control (CFA o sin tratamiento previo). Los metabolitos que mostraban la mayor

50 variacion en estos modelos eran: acido graso (5x-y 0,88, 1,58, 2,03), citrato (5x-y 2,5, 2,65), lactato (5x-y 1,32, 4,11), glucosa (5x-y 3,25) y fosfocolina (5x-y 3,23). Como antes, la eliminacion de estos metabolitos de los espectros originales generaro modelos positivos adicionales con valores de q2 significativos. Los metabolitos que generaban los valores de q2 positivos eran: taurina (5x-y 3,25, 3,43) y valina (5x-y 0,99, 1,04) (Informacion complementaria 7; A y B). Cuando se compararon los animales con CFA 16 con la cohorte sin tratamiento previo, de nuevo era posible 55 separar los animales en todos los tiempos de medicion excepto el dla 28 (Informacion complementaria 7; C).

[0192] Todos los metabolitos anteriores mostraron cambios tanto positivos como negativos comparado con los valores base a lo largo de la evolucion de la enfermedad (informacion complementaria 7; A y B). En el caso de la taurina, se encontro un patron constante cuando se compararon los animales con Cr-EAE tanto con los animales de

CFA como los de sin tratamiento previo, de modo que durante el maximo de la enfermedad, los dlas 10 y 38, la taurina aumento en los grupos de animales con Cr-EAE comparado con ambos grupos de control. De forma similar, los metabolitos glucosa y fosfocolina mostraron un aumento con respecto a los animales sin tratamiento previo durante periodos de enfermedad activos (p. ej., dlas 14 y 38), mientras que los metabolitos fosfocolina disminuyeron 5 durante la remision (dla 28). Sin embargo, la concentracion relativa de glucosa era menor tanto el dla 10 como el 28 en los animales con Cr-EAE que en los animales de CFA, pero mayor el dla 38.

[0193] A diferencia de los aumentos observados antes, la concentracion de acido graso en los animales con Cr-EAE se redujo durante la enfermedad activa, los dlas 10, 14 y 38, con respecto a los animales sin tratamiento

10 previo, pero aumentaron durante la segunda remision (dla 28). En estos tiempos de medicion, los niveles de acido graso en los animales de CFA eran incluso menores que en los animales con Cr-EAE, indicando un efecto mayor del CFA solo que de la Cr-EAE en estos metabolitos.

[0194] No habla diferencias evidentes en TMAO entre los animales con Cr-EAE y los animales sin 15 tratamiento previo. Sin embargo, el TMAO era menor a lo largo de la evolucion de la enfermedad temprana (dlas 10,

14 y 17) en los animales con Cr-EAE que en los animales de CFA, y mayor el dla 38, indicando de nuevo efectos diferenciales de CFA y Cr-EAE.

Ejemplo 4

20

EM humana: Analisis de orina

[0195] Inicialmente, todos los pacientes de EM se configuraron frente al grupo de control. Sin embargo, aunque positivo (q2 = 0,11), este modelo no alcanzaba significacion. Cuando las diferentes fases de la enfermedad

25 se consideraron por separado frente a los controles, todos los modelos de PLS devolvieron de nuevo valores de q2 positivos indicando diferencias entre cada uno de estos grupos (RR, PP, SP) y los grupos de control sanos. Sin embargo solo el modelo de SP frente al control alcanzo significacion definida (q2 = 0,51, analisis dejando uno fuera p < 0,05; Figura 5E). Al examinar las cargas, el citrato y TMAO eran mayores en el grupo de SP comparado con el grupo de control (informacion complementaria 8; Tabla A). Los niveles relativos de lactato y creatinina (5x-y 4,06) 30 eran menores en el grupo de SP comparado con el control. Cuando se comparaban el grupo RR y PP frente al grupo de control sano, los valores de q2 eran solo 0,22 y 0,20, respectivamente, a pesar de mostrar una separacion visual entre los grupos. Con respecto a las separaciones entre los grupos de enfermedad, la comparacion de los grupos RR y SP mostro una clara separacion visualmente, pero el valor de q2 de 0,33 casi no alcanzaba significacion. No se encontraron diferencias significativas entre el grupo de PP y cualquiera de los grupos de SP o RR (Figura 5; Tabla 35 E).

EM humana: Analisis de suero

[0196] Se llevaron a cabo las mismas dos secuencias de RMN usadas para las muestras animales, en las 40 muestras de suero humanas. Sin embargo, a diferencia de los espectros obtenidos de las muestras animales, no era

evidente la modulacion de fase en los espectros obtenidos de las muestras humanas. Puesto que no habla diferencias entre los dos tipos de espectros, se usaron espectros CPMG en todos los analisis posteriores. La espectroscopla de RMN 1H de alta resolucion proporciono espectros de suficiente resolution para identificar alrededor de 30 metabolitos (Figura 5A).

45

[0197] De nuevo, se comparo la cohorte entera de pacientes de EM con el grupo de control sano. Este modelo mostro una separacion significativa entre los dos grupos con un valor de q2 de 0,40; analisis dejando uno fuera p<0,05. Posteriormente a esto, se consideraron individualmente los diferentes estados de la enfermedad. Todas las comparaciones individuales entre los grupos de pacientes con EM (RR, PP, SP) y el grupo de control sano

50 (Figura 5B, C y D) mostraron ser altamente significativas frente a los criterios definidos q2 > 0,4 (q2 = 0,73, 0,64, 0,70, respectivamente). Al examinar los espectros del grupo de control, tres de las muestras de control contenlan un contaminante desconocido (5x-y 3,66, 3,73). Estos lotes se excluyeron del analisis y se generaron modelos nuevos, los cuales alcanzaban todos la significacion definida (q2 = 0,72, 0,67, 0,71, respectivamente). Es interesante, que cuando se compara cada una de las etapas individuales de la EM (RR, PP y SP) frente a los controles, tres 55 metabolitos, la glucosa (5x-y 3,25, 3,75, 3,91), fosfocolina (5x-y 3,23; confirmada por enriquecimiento) y un metabolito no identificado (singlete 5x-y 3,37), eran constantes a traves de los grupos (Informacion complementaria 8; Tabla B). La glucosa y la fosfocolina se redujeron en todos los pacientes con EM con respecto a los controles sanos, mientras que el singlete desconocido era mayor en todos los grupos de EM. Para el grupo de RR, las concentraciones relativas de L-glutamina (5x-y 2,15) y L-alanina (5x-y 1,47) tambien eran mayores que en los controles sanos. Cuando

se examinaron las cargas para el modelo de SP frente al control, no aumentaron mas metabolitos en el grupo de SP comparado con el grupo de control, pero se redujeron los acidos grasos. En cambio, los acidos grasos eran mas elevados en el grupo de PP comparado con los controles, como lo era una resonancia asignada a las especies N- acetilo (5x-y 2,03).

5

[0198] Siguiendo el analisis inicial, los metabolitos responsables en cada grupo de producir las separaciones, se eliminaron de los espectros de ese grupo particular y se genero un segundo ciclo 19 de modelos positivos (information complementaria 8; tabla C). Cuando se comparaban los grupos de RR y de control sanos, se encontro que el lactato se habla reducido en los pacientes de RR. El lactato tambien era el unico otro metabolito que variaba

10 en el modelo de SP frente al control, y de forma similar, se redujo en los pacientes de SP. Cuando se comparaban los grupos de PP y de control, se encontro que la L-glutamina era elevada en las muestras de PP, mientras que un singlete desconocido (5x-y 2,65) disminula.

[0199] La comparacion de los grupos de RR y SP generaron un modelo significativo, con un valor de q2 de 15 0,46. El posterior analisis dejando uno fuera genero una grafica de cajas y bigotes que mostraba una diferencia

estadlsticamente significativa entre los dos grupos con un p valor < 0,0001 (figura 6), confirmando adicionalmente que este es un modelo predictivo. Aunque el modelo que comparaba los grupos de PP y RR parecla mostrar dos grupos claros, unos pocos valores atlpicos que se solapaban en cada grupo dieron como resultado un valor de q2 negativo (-0,19). Por consiguiente, este modelo no podia diferenciar de forma fiable entre la EM PP y RR (Figura 4; 20 Tabla F). La comparacion de los grupos de PP y SP devolvio un valor de q2 (0,10) positivo, pero no significativo, y era evidente el solapamiento de los grupos.

[0200] En el caso del modelo de RR frente a SP, despues del primer ciclo de analisis, se encontro que el acido graso (5x-y 0,88, 1,58 1,3) y el lactato (5x-y 1,32) eran mayores en el grupo de SP, mientras que se encontro

25 que la alanina (5x-y 3,73) y la fosfocolina (5x-y 3,23) eran menores en el grupo de SP que en el grupo de RR (Informacion complementaria 8; Tabla B). La elimination de estas regiones de los espectros genero un modelo positivo adicional (q2 = 0,40), que reflejaba niveles mas altos de betahidroxibutirato (5x-y 2,43) y niveles mas bajos de glucosa y una resonancia de tipo singlete ancho que se asigno de forma provisional a especies N-acetilo, 20 (previamente asignado como N-acetil-glucoprotelna (Griffin, et al., 2004)), en el grupo de SP (Informacion 30 complementaria 8; Tabla C).

Ejemplo 5

Sujetos/materiales y procedimientos

35

Muestras humanas

[0201] Se obtuvieron muestras de tres cohortes de pacientes de EM as! como de voluntarios de control de edad y sexo correspondiente con aprobacion etica (UK NHS C03,054, Perfil metabolico de la orina en pacientes con

40 EM y 08/H0604/155): Conjunto A: orina n=22, 30 y 28, suero n=15, 38 y 10; Conjunto B: suero n=6, 10 y 7; Conjunto C: suero n=5, 10 y 7 en EMRR, EMSP y voluntarios de control, respectivamente. Las muestras de orina y suero del conjunto A tambien se recogieron para pacientes con EM primaria progresiva (EMPP) (n=32 y 13 respectivamente). Las muestras de suero se recogieron por centrifugation (3000xg, 10 min) despues de dejar coagular la sangre durante 30 min a temperatura ambiente en tubos Vacutainer que contenlan activador de la coagulation y gel (BD, 45 Reino Unido). El suero y la orina se repartieron en partes allcuotas y se almacenaron a -80°C. Los detalles cllnicos de los pacientes con EM se dan en la informacion complementaria B2. Las muestras de pacientes humanos se excluyeron del analisis si se encontraba que los pacientes padeclan otra enfermedad (p.ej., diabetes), si la calidad del espectro era mala o estaba distorsionado de un modo grosero o si se encontraban que la muestra preparada tenia un contenido de lipidos mayor que 2XEE de la media del grupo.

50

Espectroscopfa de RMN

[0202] Las muestras se descongelaron a 4°C antes del analisis de RMN. Las muestras de sangre se centrifugaron adicionalmente (100.000xg, 30 min, 4°C). Las muestras de orina y plasma (100 pl para EAE o 150 pl

55 para EM) se diluyeron en un tubo de RMN de 5 mm a un volumen final de 600 pl con tampon de fosfato sodico 0,24 M (pH 7,4, NaN3 al 0,1%, NaCl al 0,8%) en D2O que contenia TSP 1 mM (3-trimetilsilil-1-[2,2,3,3,-2H4]-propionato) como una referencia interna. Se adquirieron los espectros de RMN 1H de cada muestra usando un sistema 16,4T NMR (700 MHz 1H) (Bruker Avance III equipado con una criosonda 1H TCI). Para todas las muestras se uso una secuencia de presaturacion de 1D NOESY, con presaturacion de disolvente durante el retraso de la relajacion (2 s) y

tiempo de mezcla (10 ms). Para las muestras solo de sangre se uso tambien una secuencia de CPMG con presaturacion de disolvente (2 s) y un filtro T2 (duracion total 40 ms; 20 ciclos de 2 ms de eco de espln) para suprimir las resonancias de llpidos. Todos los espectros 1D se corrigieron automaticamente respecto a la llnea base usando un polinomio de orden cero (Topspin 3.0). Se adquirieron los espectros de RMN 1H de espectroscopla de correlation 5 bidimensionales (COSY) de una muestra de cada grupo para ayudar a la identification de metabolitos. Los espectros COSY se adquirieron con presaturacion de disolvente de 1,5 s, una anchura espectral de 10 ppm (7002 Hz), y 16 o 32 transiciones por incremento ti para 256 incrementos. Todos los espectros de RMN se adquirieron a 293 K.

10 Analisis de datos

[0203] Se llevo a cabo el alineamiento de picos no lineal16 en cada uno de los espectros de 1H 1D que despues se subdividieron en regiones de 0,02 ppm (5 = punto medio de la region de integration) y se integraron entre 0,20-9,60 ppm usando un fichero de comandos de MATLAB a medida. En todos los espectros, se excluyo la

15 region entre 4,30 y 5,00 ppm que aparecla debido a la supresion del agua. En los espectros de orina, tambien se excluyo la resonancia de la urea variable entre 5,00-6,00 ppm. As! los espectros se redujeron a 435 (sangre) o 385 (orina) variables independientes. Los datos se aumentaron usando la varianza de Pareto para suprimir el ruido y se aplico PLS/DA. Los lotes de integracion que contenlan contaminantes grandes (p.ej., disolvente organico, EDTA) se excluyeron del analisis.

20

Metodos estadfsticos

[0204] Para cada comparacion, se obtuvo un modelo de PLS-DA que mejor explicaba las diferencias entre las variables de los grupos que se estaban estudiando (SIMCA P+ 12.0 Umetrics, Suecia). Para determinar la

25 potencial naturaleza predictiva de los modelos, se calculo el valor de q2. q2 se obtiene de una validation cruzada por pasos del modelo de forma que se usa un modelo generado con un subconjunto de muestras eliminado para predecir la pertenencia al grupo de las muestras que faltan. Un valor de q2 > 0 significa que el modelo es predictivo. Se mantiene en general que q2 > 0,4 es el umbral para la signification para modelos biologicos17.

30 [0205] Ademas, se llevo a cabo la validacion del modelo usando un metodo de pseudo-Monte Carlo donde se

construyeron 100 modelos usando asignaciones de grupo aleatorias. Solo los modelos en los que el q2 autentico era mayor que 95% de los valores de q2 generados aleatoriamente se consideraron significativos (information complementaria B3).

35 [0206] Con el fin de identificar los metabolitos que subyacen en las separaciones de grupos, se examinaron

las cargas de variables de cada modelo y se identificaron las resonancias relevantes usando una combination de

espectroscopla COSY (informacion complementaria B4), valores de la bibliografla y referencia a las bases de datos de metaboloma humano (vease la informacion complementaria B5 para las asignaciones completas de RMN)18-20. Para confirmar la identidad de los picos singlete, los metabolitos previstos se “enriquecieron” en las muestras como 40 referencias autenticas (informacion complementaria B6).

[0207] Para validar los modelos se usaron conjuntos de muestras adicionales generados (conjuntos B y C).

Los pacientes con EMPP no estaban incluidos debido a la falta de muestras. El conjunto B se uso para construir modelos predictivos y el conjunto C se uso como un conjunto de ensayo y validacion, es decir, el conjunto C tenia

45 ocultacion y los modelos construidos usando el conjunto B se usaron para predecir la pertenencia a un grupo para

cada muestra en el conjunto C. Los resultados se expresan como una tabla de contingencia 2x2 para cada modelo. Se calculo en cada caso el descriptor estadlstico exacto de Fisher. Se construyeron las curvas de rendimiento diagnostico (ROC) para cada modelo y se determino el area bajo la curva. Los umbrales de probabilidad de pertenencia al modelo obtenidos del conjunto de construction de modelo se usaron para determinar la sensibilidad y 50 especificidad en el conjunto de prediction (Conjunto C).

RESULTADOS

Conjunto de muestras de EM inicial (Conjunto A)

55

[0208] Se empezo con el analisis de las muestras de suero de pacientes de EM en el conjunto A. Un modelo construido usando los espectros CPMG y que separaba todos los pacientes de EM de la cohorte de control era predictivo (q2=0,41). Ademas, las comparaciones entre los grupos de pacientes de EM individuales y de control eran significativas (q2=0,70, 0,61 y 0,42 para los controles frente a EMPP, EMRR EMSP respectivamente; Figura B1A y

C). Todos los modelos se validaron satisfactoriamente usando el procedimiento de validation cruzada descrito antes. Es interesante que cuando se comparan cada una de las etapas individuales de la EM frente a los controles, tres metabolitos eran constantes a lo largo de los grupos. La glucosa (5x-y 3,25, 3,75, 3,91) y la fosfocolina (5x-y 3,23; confirmadas por enriquecimiento, (Information complementaria B5 y B6) se reduclan mientras que un metabolito no 5 identificado (singlete 5x-y 3,34) aumentaba en todos los pacientes con EM con respecto a los controles sanos. El examen adicional de las cargas de modelo tanto de RR frente a control como de SP frente a control mostro el lactato (5x-y 1,32), una resonancia de tipo singlete ancho asignada provisionalmente a especies N-acetilo (5x-y 2,03, previamente asignado como N-acetil-glucoprotelnas14) y algunos acidos grasos disminuyeron mientras que otros acidos grasos aumentaron. El examen de las cargas de modelo de PP frente a control mostro que el lactato, las 10 especies N-acetilo y algunos acidos grasos tambien eran mayores. Los hallazgos de los metabolitos detallados se muestran en la informacion complementaria B7.

[0209] Cuando se haclan comparaciones entre los grupos de EM, el modelo que comparaba los grupos de RR y SP puso de manifiesto una separation significativa (q2 = 0,45; Figura B1B y C). El examen de las cargas puso

15 de manifiesto que los acidos grasos (5x-y 0,88, 1,30, 5,35), la fosfocolina (5x-y 3,23), las especies N-acetilo, (5x-y 2,03) y la glucosa (5x-y 3,25, 3,75, 3,91) tambien eran menores en EMSP con respecto a EMRR mientras que otros acidos grasos y el p-hidroxibutirato (5x-y 1,19) eran mayores. Para otras comparaciones intra-EM, el modelo que comparaba los grupos PP y RR parecla mostrar dos grupos claros, sin embargo unos pocos valores atlpicos que se solapaban en cada grupo dio como resultado un valor de q2 no predictivo (-0,11). Por consiguiente, este modelo no podia 20 diferenciar de forma fiable entre la EM PP y RR. De forma similar, la comparacion de los grupos PP y SP devolvio un valor de q2 no predictivo (-0,02), y el solapamiento de los grupos era evidente.

[0210] Los analisis de orina produjeron modelos que no eran tan fuertes como los construidos con las muestras de suero. Los modelos construidos que comparaban la orina de voluntarios de control con cada uno de los

25 grupos de EM eran todos predictivos, pero solo el control frente a la EMSP alcanzo la signification definida de q2>0,4 (Control frente a EMRR q2 = 0,22, frente a EMPP q2 = 0,20, frente a EMSP q2 = 0,51). Para las comparaciones de orina intra-EM, tanto los modelos de EMPP frente a EMRR como de EMPP frente a EMSP mostraron ser no predictivos mientras que EMSP frente a EMRR mostro ser predictivo pero no significativo (q2 = 0,33; Informacion complementaria B1 y B9).

30

Analisis del conjunto de muestras de EM independientes (Conjuntos B y C)

[0211] Para validar los modelos generados a partir del conjunto A de muestras, se usaron dos conjuntos independientes de muestras de suero, los conjuntos B y C. Las muestras del conjunto B se usaron de la misma

35 forma que las muestras del conjunto A y se generaron tres nuevos modelos: ControlB frente a EMRRb, ControlB frente a EMSPb y EMRRb frente a EMSPb. En cada caso, los modelos del conjunto B eran predictivos y estaban todos validados de la misma forma que los modelos del conjunto A. Como previamente, los valores de q2 eran mayores que 0,4 para cada modelo: ControlB frente a EMRRb, q2 = 0,62; ControlB frente a EMSPb q2 = 0,77; y EMRRb frente a EMSPb, q2 = 0,48. Ademas, tras el examen de las cargas, se encontro que los mismos metabolitos 40 eran responsables de las separaciones observadas entre los grupos en este conjunto de datos secundario, con la exception de la glucosa, que no era tan importante en la separacion de los pacientes de EMSP de los de EMRR en el conjunto de datos secundario. Es probable que esto se deba a la variation en la tecnica de manipulation de la muestra en el centro cllnico, p. ej., momento del analisis cllnico o duration desde la ultima comida.

45 [0212] Se ensayo en cada nuevo modelo generado a partir del conjunto B su capacidad predictiva usando el

conjunto C, el segundo conjunto de datos independientes que no se habla usado en la construction de ningun modelo. Todos los modelos del conjunto B eran tanto sensibles como especlficos en la prediction de la pertenencia a grupos para los pacientes: modelo de EMRR frente a EMSP, sensibilidad = 0,9 y especificidad = 0,8; modelos de EMRR y EMSP frente a control, sensibilidad y especificidad = 1,0. Las tablas de contingencia que muestran las 50 clasificaciones correctas e incorrectas para cada modelo se dan en la figura B3A a C. En cada caso, los p valores bilaterales calculados usando la prueba exacta de Fisher eran menores de 0,05 (control frente a EMRR, p = 0,0012; control frente a EMSP, p = 5,1x10'5; EMSP frente a EMRR, p = 0,017). Las graficas de ROC para los modelos (Figura B3D) daban areas bajo la curva (AUC) significativamente mayores que 0,5, indicando un buen poder predictivo (control frente a EmRr AUC = 1,00, p = 0,0045; control frente a EMSP AUC = 1,00, p = 6,4x10'4; EmSP 55 frente a EMRR AUC = 0,94, p = 0,007), vease la informacion complementaria B8.

Referencias

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Fan WMT. Metabolite profiling by one- and two-dimensional NMR analysis of complex mixtures. Progress in Nuclear 5 Magnetic Resonance Spectroscopy. 1996; 28: 161-219.

Gavaghan CL, Holmes E, Lenz E, Wilson ID, Nicholson JK. An NMR-based metabonomic approach to investigate the biochemical consequences of genetic strain differences: application to the C57BL10J and Alpk: ApfCD mouse. FEBS letters. 2000; 484(3): 169-74.

Griffin JL, Anthony DC, Campbell SJ, Gauldie J, Pitossi F, Styles P, et al. Study of cytokine induced neuropathology 10 by high resolution proton NMR spectroscopy of rat urine. FEBS Letters. 2004; 568(1-3): 49-54.

Waterman C, Currie R, Cottrell L, Dow J, Wright J, Waterfield C, et al. An integrated functional genomic study of acute phenobarbital exposure in the rat. BMC genomics. 2010; 11(1): 9.

Whitaker JN, McKeehan A, Freeman DW. Monoclonal and polyclonal antibody responses to the myelin basic protein epitope present in human urine. J Neuroimmunol. 1994; 52(1): 53-60. 35 15 Whitaker JN, Kachelhofer RD, Bradley EL, Burgard S, Layton BA, Reder AT, et al. Urinary myelin basic protein-like material as a correlate of the progression of multiple sclerosis. Ann Neurol. 1995; 38(4): 625-32.

Wishart DS, Tzur D, Knox C, Eisner R, Guo AC, Young N, et al. HMDB: the Human Metabolome Database. Nucleic Acids Research. 2007; 35(suppl 1): D521-D6.

Wishart DS, Knox C, Guo AC, Eisner R, Young N, Gautam B, et al. HMDB: a knowledgebase for the human 20 metabolome. Nucleic Acids Research. 2009; 37(suppl 1): D603.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento in vitro para el diagnostico de la esclerosis multiple (EM) en un sujeto de ensayo humano, que comprende:

5

a.

(i) determinar las concentraciones relativas de tres o mas metabolitos en una muestra de dicho sujeto, en el que dichos tres o mas metabolitos se seleccionan de:

metabolitos de la sangre, en el que dichos metabolitos de la sangre comprenden: fosfocolina, lactato, especies IN- 10 acetilo, acido graso, glucosa y L-glutamina;

(ii) comparar las concentraciones relativas de dichos tres o mas metabolitos en la muestra con las concentraciones relativas de los mismos metabolitos en al menos un patron de referencia de un sujeto que no tiene EM;

y

15

(ii) identificar una diferencia de concentracion para dichos tres o mas metabolitos en la muestra con respecto al patron de referencia, en el que dicha diferencia de concentracion se selecciona de: un aumento en la concentracion de uno o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: acido graso, especies N-acetilo y lactato; y una disminucion en la concentracion de los metabolitos de la sangre glucosa y fosfocolina;

20 o

en el que la dicha diferencia de concentracion se selecciona de:

un aumento en la concentracion de uno o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: acido graso, especies de N-acetilo y L-glutamina; y

una disminucion en la concentracion de los metabolitos de la sangre glucosa y fosfocolina;

25 en el que dichas diferencias de concentracion se correlacionan con la presencia de EM;

en el que dicha especie N-acetilo es N-acetil-aspartato y/o N-acetil-glucoprotelna; y/o

en el que el acido graso tiene un valor de resonancia de 50,90, ancho, CH3, 51,30, ancho, CH2CH2CH3, 51,55, ancho, CH2CH3, 5 2,05, ancho, CH2CH=, 5 2,25, ancho, CH2COOH, 55,35, ancho, CH2CH= respecto a la resonancia 30 del metilo del 3-trimetilsilil-1-propionato (TSP) definido a 0,00 ppm determinable por RMN 1H; y/o

b.

(i) determinar las concentraciones relativas de dos o mas metabolitos en una muestra de dicho sujeto, en el que 35 dichos dos o mas metabolitos se seleccionan de: metabolitos de la orina, en el que dichos metabolitos de la orina

comprenden: citrato, creatinina, lactato y N-oxido de trimetilamina (TMSO);

(ii) comparar las concentraciones relativas de dichos dos o mas metabolitos en la muestra con las concentraciones relativas de los mismos metabolitos en al menos un patron de referencia de un sujeto que no tiene EM;

40

(iii) identificar una diferencia de concentracion para cada uno de dichos dos o mas metabolitos en la muestra con respecto al patron de referencia, en el que dicha diferencia de concentracion se selecciona de: un aumento en la concentracion de uno o mas metabolitos de la orina seleccionados de: TMAO y citrato; y

45 una disminucion en la concentracion de uno o mas metabolitos de la orina seleccionados de: creatinina y lactato; en el que dicha diferencia de concentracion se correlaciona con la presencia de EM.
2. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que dichos metabolitos comprenden

50 (a) cuatro o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: acido graso, especies N-acetilo, glucosa, fosfocolina y L-glutamina; o

(b) cinco metabolitos de la sangre: acido graso, especies N-acetilo, glucosa, fosfocolina y L-glutamina

en el que dicha especie N-acetilo es N-acetil-aspartato y/o N-acetil-glucoprotelna; y/o en el que el acido graso tiene 55 un valor de resonancia de 50,90, ancho, CH3, 51,30, ancho, CH2CH2CH3, 51,55, ancho, CH2CH3, 5 2,05, ancho, CH2CH=, 5 2,25, ancho, CH2C0OH, 55,35, ancho, CH2CH= respecto a la resonancia del metilo del 3-trimetilsilil-1- propionato (TSP) definido a 0,00 ppm determinable por RMN 1H.
3. El procedimiento de la reivindicacion 1 o 2, en el que dichos metabolitos comprenden tres o mas

metabolitos de la sangre seleccionados de: glucosa, fosfocolina, acido graso y lactato;

en el que el acido graso tiene un valor de resonancia de 50,90, ancho, CH3, 51,30, ancho, CH2CH2CH3, 51,55, ancho, CH2CH3, 5 2,05, ancho, CH2CH=, 5 2,25, ancho, CH2COOH, 55,35, ancho, CH2CH= respecto a la resonancia 5 del metilo del 3-trimetilsilil-1-propionato (TSP) definido a 0,00 ppm determinable por RMN 1H.
4. El procedimiento de la reivindicacion 3, en el que dichas diferencias de concentracion se seleccionan de:

10 una disminucion en la concentracion de uno o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: fosfocolina, lactato, especies N-acetilo, en el que dicha especie N-acetilo es N-acetil-aspartato y/o N-acetil-glucoprotelna, y glucosa; o en el que dichas diferencias de concentracion se seleccionan de:

una disminucion en la concentracion de uno o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: glucosa, fosfocolina, 15 acido graso, en el que el acido graso tiene un valor de resonancia de 50,90, ancho, CH3, 51,30, ancho, CH2CH2CH3, 51,55, ancho, CH2CH3, 5 2,05, ancho, CH2CH=, 5 2,25, ancho, CH2COOH, 55,35, ancho, CH2CH= respecto a la resonancia del metilo del 3-trimetilsilil-1-propionato (TSP) definido a 0,00 ppm determinable por RMN 1H, y lactato.
5. El procedimiento de la reivindicacion 1 o 2, en el que dichos metabolitos comprenden:

20

(a) tres o mas metabolitos de la orina seleccionados de: TMAO, citrato, creatinina y lactato; o

(b) los cuatro siguientes metabolitos de la orina: TMAO, citrato, creatinina y lactato.

25 6. El procedimiento de la reivindicacion 1 o 2, en el que dichos metabolitos comprenden:

(a) tres o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: acido graso, lactato, alanina, fosfocolina, beta- hidroxibutirato, especies N-acetilo y glucosa; o

30 (b) cuatro o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: acido graso, lactato, alanina, fosfocolina, beta- hidroxibutirato, especies N-acetilo y glucosa; o

(c) cinco o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: acido graso, lactato, alanina, fosfocolina, beta- hidroxibutirato, especies N-acetilo y glucosa; o

35

(d) seis o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: acido graso, lactato, alanina, fosfocolina, beta- hidroxibutirato, especies N-acetilo y glucosa; o

(e) los siguientes siete metabolitos de la sangre: acido graso, lactato, alanina, fosfocolina, beta-hidroxibutirato, 40 especies N-acetilo y glucosa;

en el que dicha especie N-acetilo es N-acetil-aspartato y/o N-acetil-glucoprotelna; y/o en el que el acido graso tiene un valor de resonancia de 50,90, ancho, CH3, 51,30, ancho, CH2CH2CH3, 51,55, ancho, CH2CH3, 5 2,05, ancho, CH2CH=, 5 2,25, ancho, CH2COOH, 55,35, ancho, CH2CH= respecto a la resonancia del metilo del 3-trimetilsilil-1- 45 propionato (TSP) definido a 0,00 ppm determinable por RMN 1H.
7. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que dichos metabolitos comprenden:

(a) tres o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: L-glutamina, alanina, glucosa, fosfocolina y lactato; o 50

(b) cuatro o mas metabolitos de la sangre seleccionados de: L-glutamina, alanina, glucosa, fosfocolina y lactato; o

(c) los siguientes cinco metabolitos de la sangre: L-glutamina, alanina, glucosa, fosfocolina y lactato.

55 8. El procedimiento de cualquier reivindicacion anterior, en el que las concentraciones de los metabolitos

se determinan usando una tecnica seleccionada de: espectroscopla de resonancia magnetica nuclear (RMN), espectrometrla de masas, HPLC- UV y espectrometrla infrarroja.