KR101983447B1 - 다발성 경화증 및 시신경 척수염 범주 질환을 구별하는 방법 - Google Patents

다발성 경화증 및 시신경 척수염 범주 질환을 구별하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다발성 경화증 및 시신경 척수염 범주 질환의 구별을 위한 조성물 및 상기 조성물을 이용한 다발성 경화증 및 시신경 척수염 범주 질환의 구별 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 방법은 뇌척수액 내 특정 대사산물인 시트르산 및 젖산의 농도를 측정하여 정상개체의 시트르산 및 젖산의 농도와 비교함으로써, 임상적인 양상이 유사한 다발성 경화증 및 시신경 척수염 범주 질환을 명확하게 구별할 수 있으므로 다발성 경화증 및 시신경 척수염 범주 질환을 진단하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

다발성 경화증 및 시신경 척수염 범주 질환을 구별하는 방법{DISTINGUISHING METHOD BETWEEN MULTIPLE SCLEROSIS AND NEUROMYELITIS OPTICA SPECTRUM DISORDER}
본 발명은 다발성 경화증 및 시신경 척수염 범주 질환의 구별을 위한 조성물 및 상기 조성물을 이용한 다발성 경화증 및 시신경 척수염 범주 질환의 구별 방법에 관한 것이다.
다발성 경화증(multiple sclerosis, MS)은 대표적인 중추신경계에 영향을 주는 염증성 탈수초성 자가면역질환으로 아시아계와 아프리카계 사람에서는 발병빈도가 그리 높지 않은 편이나 유럽계 사람 특히 30대 백인 여성에게서 가장 많이 발병하며, 유럽계 백인에서는 100,000명당 200명의 빈도로 발병한다.
다발성 경화증은 시각장애, 사지의 근무력증과 이로 인한 보행장애, 통증 또는 무감각을 수반하는 피부감각장애, 언어 및 청각장애 및 인지장애 등을 수반하며 이들 장애는 완화 및 재발이 반복되면서 점차 심해지는 경우가 많다. 이러한 신경성 장애는 중추신경계 내의 염증성 반응으로 인한 신경세포의 축삭을 둘러싸고 있는 수초의 손상에서 기인한다. 병변은 뇌와 척수의 백질 부위에 산재성으로 나타나며 병변부에서는 정맥주위의 염증세포 침윤을 수반하는 염증성 반응과 신경섬유의 수포성 수초탈락이 관찰되며 그 외에도 희소돌기아교세포의 소실 및 성상아교세포의 증식 등이 수반된다. 다발성 경화증의 원인 및 병리학적 진행과정이 아직까지 완전히 밝혀지지는 않았으나, 세포성 면역계와 체액성 면역계가 모두 관여하는 자가면역 반응인 것으로 알려져 있다.
시신경 척수염 범주 질환(neuromyelitis optica spectrum disorder, NMOSD)은 중추신경과 시신경에 영향을 주는 염증성 탈수초성 자가면역질환으로 유럽이나 미주에 비해 아시아에서 흔히 발병하며, 여성의 유병률이 남성보다 약 9배 높고, 전 세계적으로 10만명당 0.5 내지 4.4명의 빈도로 발병한다.
시신경 척수염 범주 질환은 양측 급성시각신경염과 횡단척수염이 동시에 또는 수주 간격을 두고 발생하는 것이 특징이며, 급속한 시력장애, 근력약화, 보행장애, 하반신의 지각운동장애, 감각저하, 대소변 실금 등의 증상이 나타난다. 병변부에서는 척수의 백질과 회백질에 탈수초 현상 및 공동과 괴사가 보이며 괴사부분에 호중구와 호산구가 많이 존재하고, 소혈관의 비후 및 유리질화가 관찰되며 그 외에도 면역글로불린과 보체의 면역복합체가 혈관주변과 수초 주변으로 침착된다.
다발성 경화증과 시신경 척수염 범주 질환은 모두 중추신경계의 염증성 탈수초성 질환으로 재발 및 완화의 증상이 있는 특징적인 임상경과를 가지며, 뇌, 시신경 또는 척수를 반복적으로 침범하는 등의 임상 양상이 매우 유사하여 초기에 두 질환을 구별하는 것은 어렵다. 그러나, 일부 다발성 경화증의 치료 요법이 시신경 척수염 범주 질환을 악화시키므로 조기에 정확한 진단을 내리는 것이 중요하다.
다발성 경화증과 시신경 척수염 범주 질환을 구별하기 위한 새로운 방법의 개발이 요구되면서 이들을 구별하기 위한 바이오마커를 찾는 연구가 진행되고 있다. 최근 NMOSD 또는 MS 환자로부터 수득한 혈청으로부터 1H-NMR 분광학을 이용하여 두 환자군에서 농도 차이를 보이는 대사산물인 실로-이노시톨(scyllo-inositol) 및 아세테이트가 두 질환을 구별하기 위한 바이오마커로 사용될 수 있음이 보고되었다(Moussallieh FM et al., Mult. Scler., 2014 Apr;20(5):558-65).
이에, 본 발명자들은 다발성 경화증과 시신경 척수염 범주 질환을 구별하기 위한 방법을 개발하고자 노력하던 중, 다발성 경화증 환자, 시신경 척수염 범주 질환 환자 및 정상인 뇌척수액으로부터 1H NMR 스펙트럼 분석을 하여 대사산물의 농도를 비교하고, 바이오마커로서 시트르산 및 젖산을 선별함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은, 특정 대사산물의 함량을 측정 및 비교함으로써 다발성 경화증 및 시신경 척수염 범주 질환이 의심되는 환자를 구분하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 특정 대사산물의 함량을 측정하는 제제 또는 장치를 이용한 다발성 경화증 및 시신경 척수염 범주 질환의 구별 진단용 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 1) 다발성 경화증 또는 시신경 척수염 범주 질환로 의심되는 환자로부터 얻은 시료로부터 시트르산 및 젖산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 농도를 측정하는 단계; 및 2) 상기 단계 1)의 시트르산 및 젖산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 농도를 정상개체의 농도와 비교하는 단계를 포함하는 다발성 경화증 및 시신경 척수염 범주 질환의 구별 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 대사산물 분석 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 시트르산 또는 젖산의 정량용 제제 또는 정량 분석 장치를 포함하는 다발성 경화증 및 시신경 척수염 범주 질환의 구별 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 방법은 뇌척수액 내 특정 대사산물인 시트르산 및 젖산의 농도를 측정하여 정상개체의 시트르산 및 젖산의 농도와 비교함으로써, 임상적인 양상이 유사한 다발성 경화증 및 시신경 척수염 범주 질환을 명확하게 구별할 수 있으므로 다발성 경화증 및 시신경 척수염 범주 질환을 진단하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 정상군, MS 또는 NMOSD 환자군의 뇌척수액으로부터 정량한 대사산물을 PCA 방법으로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 정상군, MS 또는 NMOSD 환자군의 뇌척수액으로부터 정량한 대사산물을 직교부분최소자승판별 방법으로 분석하여, 정상군, MS 환자군 및 NMOSD 환자군의 OPLS-DA 모델(A), 정상군 및 MS 환자군의 OPLS-DA 모델(B), 및 정상군 및 NMOSD 환자군의 OPLS-DA 모델(C)을 나타내는 그래프이다.
도 3은 정상군(A), MS(B) 또는 NMOSD(C) 환자군의 뇌척수액으로부터 정량한 대사산물의 발현변화를 확인하고, 이를 비교한 그래프(D)이다.
도 4는 정상군, MS 또는 NMOSD 환자군의 뇌척수액으로부터 정량한 대사산물이 MS 또는 NMOSD 환자에서 그 수준이 변하는 경향을 OPLS-DA 모델의 S-플롯(A 및 B) 및 상자수염도(C)로서 나타내는 그래프이다
도 5는 정상군, MS 또는 NMOSD 환자군의 뇌척수액으로부터 정량한 대사산물 중에서 조합으로 사용가능한 바이오마커의 AUC 값을 확인한 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 1) 다발성 경화증 또는 시신경 척수염 범주 질환로 의심되는 환자로부터 얻은 시료로부터 시트르산 및 젖산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 농도를 측정하는 단계; 및 2) 상기 단계 1)의 시트르산 및 젖산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 농도를 정상개체의 농도와 비교하는 단계를 포함하는 다발성 경화증 및 시신경 척수염 범주 질환의 구별 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 대사산물 분석 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 대사산물 분석 방법은 다발성 경화증 또는 시신경 척수염 범주 질환로 의심되는 환자로부터 얻은 시료로부터 시트르산 및 젖산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 농도를 측정하는 단계를 제공한다.
상기 시료는 다발성 경화증 또는 시신경 척수염 범주 질환에 의해 시트르산 및 젖산의 농도 수준이 변화할 수 있는 시료라면 모두 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 시료는 소변, 혈액, 혈청, 혈장 또는 뇌척수액일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 시료는 뇌척수액일 수 있다.
본 발명에 따른 방법에서 농도의 측정은 시료에 포함된 대사산물, 구체적으로 시트르산 및 젖산의 농도를 측정할 수 있다고 공지된 모든 방법을 통해 수행될 수 있다. 구체적으로, 농도 측정은 핵자기공명분광기, 크로마토그래피, 자외선분광기(UV spectroscopy), 적외선 분광기(IR spectroscopy), 형광분광기(fluorescence spectroscopy), ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 및 질량분석기로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 장치로 측정될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 대사산물 분석 방법은 상기 시트르산 및 젖산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 농도를 정상개체의 농도와 비교하는 단계를 제공한다.
상기 단계에서 시트르산의 농도가 정상개체에 비해 감소하는 경우 다발성 경화증으로 판정할 수 있다. 구체적으로, 상기 단계에서 시트르산의 농도가 정상개체에 비해 감소하고, 젖산의 농도가 정상개체에 비해 유의적인 변화가 없으면 다발성 경화증으로 판정할 수 있다. 한편, 상기 단계에서 젖산의 농도가 정상개체에 비해 증가하는 경우 시신경 척수염 범주 질환로 판정할 수 있다. 구체적으로, 상기 단계에서 젖산의 농도가 정상개체에 비해 증가하고, 시트르산의 농도가 정상개체에 비해 유의적인 변화가 없으면 시신경 척수염 범주 질환로 판정할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서 본 발명자들은 정상인, 다발성 경화증 또는 시신경 척수염 범주 질환 환자로부터 뇌척수액을 수득하고, 수득된 뇌척수액에 포함된 대사산물을 농도를 분석하여 32개의 대사산물을 선별하였다(표 2 참조).
또한, 상기 선별된 32개의 대사산물 중, 정상인과 비교하여 다발성 경화증 또는 시신경 척수염 범주 질환 환자에서 발현이 유의미하게 변화된 8개의 대사산물을 추가로 선별하였고, 특히 시트르산 및 젖산의 농도가 다발성 경화증 및 시신경 척수염 범주 질환 환자에서 상이하게 나타나는 것을 확인하였다(표 3 및 도 3 참조). 또한, 상기 결과는 OPLS-DA 모델의 S- 플롯 및 상자수염도에서도 동일하였다(도 4 참조).
따라서, 본 발명에 따른 방법은 시트르산 및 젖산의 농도를 측정함으로써 다발성 경화증 또는 시신경 척수염 범주 질환이 의심되는 환자를 구별하는데 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 시트르산 또는 젖산의 정량용 제제 또는 정량 분석 장치를 포함하는 다발성 경화증 및 시신경 척수염 범주 질환의 구별 진단용 키트를 제공한다.
상기 키트는 상술한 바와 같은 다발성 경화증 및 시신경 척수염 범주 질환의 구별 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 대사산물 분석 방법과 동일한 원리로 다발성 경화증 및 시신경 척수염 범주 질환을 구별하는데 사용될 수 있다.
구체적으로, 상기 대사산물 분석 방법은 다발성 경화증 또는 시신경 척수염 범주 질환로 의심되는 환자로부터 얻은 시료로부터 시트르산 및 젖산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 농도를 측정하고, 상기 측정된 농도를 정상개체의 농도와 비교함으로써, 다발성 경화증 및 시신경 척수염 범주 질환을 구별할 수 있다. 상기 방법에 있어서, 시료는 소변, 혈액, 혈청, 혈장 또는 뇌척수액일 수 있다.
상기 키트에 포함되는 시트르산 또는 젖산의 정량용 제제는 시트르산 또는 젖산의 농도를 측정할 수 있다고 알려진 물질이면 모두 포함될 수 있다. 한편, 상기 정량 분석 장치는 핵자기공명분광기, 크로마토그래피, 자외선분광기, 적외선 분광기, 형광분광기, ELISA 및 질량분석기로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 키트를 사용하여 다발성 경화증 및 시신경 척수염 범주 질환을 구별하는 경우, 시트르산의 농도가 정상개체에 비해 감소하는 경우 다발성 경화증으로 판정할 수 있다. 구체적으로, 상기 단계에서 시트르산의 농도가 정상개체에 비해 감소하고, 젖산의 농도가 정상개체에 비해 유의적인 변화가 없으면 다발성 경화증으로 판정할 수 있다. 한편, 본 발명에 따른 키트를 사용하여 다발성 경화증 및 시신경 척수염 범주 질환을 구별하는 경우, 젖산의 농도가 정상개체에 비해 증가하는 경우 시신경 척수염 범주 질환로 판정할 수 있다. 구체적으로, 상기 단계에서 젖산의 농도가 정상개체에 비해 증가하고, 시트르산의 농도가 정상개체에 비해 유의적인 변화가 없으면 시신경 척수염 범주 질환으로 판정할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서, 본 발명자들은 정상인, 다발성 경화증 환자 또는 시신경 척수염 범주 질환 환자로부터 분리한 뇌척수액에 포함된 대사산물을 분석하여 32개의 대사산물을 선별하고(표 2 참조), 상기 선별된 대사산물 중에서 정상인과 비교하여 다발성 경화증 또는 시신경 척수염 범주 질환 환자에서 발현이 유의미하게 변화된 8개의 대사산물을 추가로 선별하였다. 특히, 선별된 대사산물 중 시트르산 및 젖산의 농도가 다발성 경화증 및 시신경 척수염 범주 질환 환자에서 상이하게 나타나는 것을 확인하였다(표 3 및 도 3참조).
따라서, 시트르산 및 젖산의 농도를 측정할 수 있는 제제 또는 장치를 포함하는 본 발명의 키트는 다발성 경화증 또는 시신경 척수염 범주 질환이 의심되는 환자를 구별하는데 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
뇌척수액 수득
먼저, 국립암센터에서 정상인 17명, 2010년에 발표된 McDonald 진단기준에 기초하여 다발성 경화증(MS)으로 진단받은 MS 환자 50명, 2015년에 발표된 IPND(International Panel for NMO diagnosis) 진단기준에 기초하여 시신경 척수염 범주질환(NMOSD)으로 진단받은 NMOSD 환자 57명을 대상으로 뇌척수액을 수득하였다. 정상인의 뇌척수액은 수막염을 배제하기 위해 요추 천자를 시행하여 수득하였다. 수득된 뇌척수액은 사용하기 전까지 -80℃에 보관하였다. 또한, 상기 정상인, MS 환자 또는 NMOSD 환자로부터 성별, 연령, 샘플링 날짜, EDSS(Expanded Disability Status Scale) 점수와 같은 환자의 인구통계데이터 및 임상데이터를 질병상태에 대한 정보와 함께 수집하였고, 이를 표 1에 나타내었다. 모든 실험은 국립암센터의 기관 검토위원회(NCC2014-0416)에 따라 수행되었다.
정상인, MS 환자 및 NMOSD 환자의 인구통계데이터 및 임상데이터
정상인 MS 환자 NMOSD 환자
전체 인원수 17 50 57
여성과 남성의 인원수 여성: 13명
남성: 4명 		여성: 33명
남성: 17명		 여성: 51명
남성: 6명
발병 연령의 평균,
표준편차 및 범위		 해당사항없음 평균: 30.20
표준편차: 8.06
범위: 14-48		 평균: 31.49
표준편차: 13.51
범위: 6-64
샘플 연령의 평균,
표준편차 및 범위		 평균: 33.35
표준편차: 8.36
범위: 22-49		 평균: 36.10
표준편차: 11.56
범위: 14-50		 평균: 35.64
표준편차: 11.50
범위: 10-65
EDSS 점수의
중앙값 및 범위		 해당사항없음 중앙값: 2.0
범위: 0-8.0		 중앙값: 3.5
범위: 0-9.0
질병상태 해당사항없음 재발(relapse): 20
완화(remission): 30		 재발(relapse): 36
완화(remission): 21
다발성 경화증 및 시신경 척수염 범주질환 환자에 존재하는 대사산물의 비교
<2-1> 1 H NMR 스펙트럼 분석을 통한 정상인, MS 및 NMOSD 환자 샘플의 정량적인 대사산물 프로파일링
<실시예 1>에서 수득한 정상인, MS 및 NMOSD 환자의 뇌척수액의 1H NMR 스펙트럼 분석은 다음과 같은 방법으로 수행되었다.
먼저, 정상인, MS 및 NMOSD 환자로부터 수득된 400 ㎕의 뇌척수액 샘플을 580 mM의 인산나트륨 완충액이 포함된 95 ㎕의 NMR 완충액과 섞어주었다. 최종 NMR 샘플은 100 mM의 인산 나트륨 완충액(pH 7.0), 2 mM의 트리메틸실릴-프로판산(TSP) 및 10% D2O를 포함한다. 대사산물을 확인하기 위해, 1차원 1H-NOESY NMR 펄스 시퀀스(noesygppr1d)는 298 K에서 저온탐침이 장착된 Bruker ASCEND Ⅲ 600 분광계로 얻었다. NOESY 펄스 시퀀스는 잔류 물 신호를 억제하기 위해 포화상태로 생성되었다. 각각의 샘플에 대한 1H-NMR 스펙트럼은 스펙트럼 폭이 12019.2 Hz, 스펙트럼 크기가 65,536 포인트, 펄스 폭(90)이 13.0 μs, 이완 지연(RD)이 5s 및 혼합 시간(mixing time)이 10 ms인 파라미터를 갖는 256개의 스캔으로 구성된다.
정상인, MS 및 NMOSD 환자의 뇌척수액 샘플의 정량적인 대사산물 프로파일링을 위해 Bruker Topspin 3.1(Bruker GmbH, Germany) 및 Chenomx NMR suite 7.7(Chenomx Inc., Canada)로 스펙트럼을 처리했으며, 확인된 대사산물은 1H-13C HSQC 및 2D 1H-TOCSY 스펙트럼에서 평가되었다. 각각의 유도 자유 감쇄(free induction decay, FID)는 64,000 포인트까지 0으로 채웠고 선폭 확장(line broadening, LB)은 0.3 Hz로 변형되었다. NMR 스펙트럼은 Bruker Topspin 3.1에 의해 수동으로 단계적으로 조정되었고, Chenomx NMR suite 7.7을 사용하여 기준선이 보정되었으며, 0 ppm에서 TSP를 기준으로 하였다. 즉, 기준선 모델은 다지점 기준선 보정 알고리즘을 사용하여 각각의 스펙트럼에 구축되었다. Chenomx NMR suite 7.7에 저장된 데이터베이스를 사용하여 대사산물을 확인하고 내부 표준(TSP) 비교로 정량화했다. 통계 분석은 웹 서버 기반 프로그램인 MetaboAnalyst(v3.0)를 사용하여 대사물질 분석을 수행했으며, SPSS version 23(IBM)을 사용했다.
정상인, MS 환자 및 NMOSD 환자의 뇌척수액에서 확인된 32개의 대사산물
대사산물
 정상인 MS 환자 NMOSD 환자
평균 표준편차
(±)		 평균 표준편차
(±)		 평균 표준편차
(±)
2-히드록시부티르산
(2-hydroxybutyrate)		 0.0420 0.0086 0.0544 0.0204 0.0718 0.0373
2-히드록시이소발레르산
(2-hydroxyisovalerate)		 0.0044 0.0006 0.0044 0.0001 0.0053 0.0022
3-히드록시부티르산
(3-hydroxybutyrate)		 0.0057 0.0010 0.0061 0.0013 0.0062 0.0011
3-히드록시이소부티르산
(3-hydroxyisobutyrate)		 0.0072 0.0016 0.0074 0.0016 0.0076 0.0019
3-히드록시이소발레르산
(3-hydroxyisovalerate)		 0.0038 0.0004 0.0035 0.0014 0.0046 0.0025
아세테이트(acetate) 0.2993 0.0033 0.2626 0.0565 0.2563 0.0396
아세토아세테이트
(acetoacetate)		 0.0033 0.0006 0.0046 0.0048 0.0051 0.0023
아세톤(acetone) 0.1112 0.0364 0.1868 0.0864 0.2135 0.0627
알라닌(alanine) 0.0408 0.0051 0.0381 0.0110 0.0545 0.0409
콜린(choline) 0.0021 0.0003 0.0025 0.0013 0.0028 0.0015
시트르산(citrate) 0.4352 0.0532 0.3451 0.0969 0.4698 0.1218
크레아틴(creatine) 0.0541 0.0060 0.0513 0.0126 0.0531 0.0121
크레아티닌(creatinine) 0.0539 0.0027 0.0510 0.0092 0.0535 0.0108
디메틸술폰
(dimethyl sulfone)		 0.0072 0.0012 0.0095 0.0144 0.0074 0.0019
에탄올(ethanol) 0.0127 0.0054 0.0199 0.0303 0.0202 0.0227
과당(fructose) 0.0565 0.0102 0.0533 0.0161 0.0517 0.0156
포름산(formate) 0.0449 0.0061 0.0530 0.0101 0.0576 0.0197
포도당(glucose) 4.5681 0.2540 4.0432 0.6704 4.1501 0.9873
글루타민(glutamine) 0.3291 0.0226 0.3203 0.0555 0.3434 0.0616
히스티딘(hisitidine) 0.0081 0.0010 0.0071 0.0014 0.0077 0.0024
이소부티르산
(isobutyrate)		 0.0086 0.0019 0.0088 0.0019 0.0091 0.0023
이소류신(isoleucine) 0.0079 0.0013 0.0085 0.0030 0.0112 0.0056
젖산(lactate) 1.8832 0.17415 1.8521 0.3670 2.4513 0.9397
류신(leucine) 0.0132 0.0020 0.0133 0.0041 0.0161 0.0065
메탄올(methanol) 0.0730 0.0185 0.0641 0.0213 0.0631 0.0413
미오-이노시톨
(myo-inositol)		 0.1651 0.0166 0.1548 0.0346 0.1569 0.0272
페닐알라닌
(phenylalanine)		 0.0109 0.0012 0.0107 0.0023 0.0125 0.0035
프로필렌 글리콜
(propylene glycol)		 0.0073 0.0104 0.0049 0.0028 0.0065 0.0076
피로글루타민산
(pyroglutamate)		 0.0332 0.0030 0.0454 0.0265 0.0443 0.0135
피루브산(pyruvate) 0.0085 0.0013 0.0093 0.0046 0.0103 0.0055
티로신(tyrosine) 0.0107 0.0013 0.0109 0.0023 0.0123 0.0032
발린(valine) 0.0183 0.0033 0.0184 0.0060 0.0237 0.0120
그 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이, 정상인, MS 및 NMOSD 환자 뇌척수액의 1H NMR 스펙트럼 분석을 통해 확인된 대사산물은 총 32개였다(표 2).
<2-2> PCA 분석
기본 그룹의 차별화를 조사하기 위해 먼저 실시예 <2-1>에서 얻은 각 그룹의 데이터를 주성분분석(principal component analysis, PCA) 방법으로 분석하였다. 샘플이 모델의 95% 신뢰 타원 영역 외부에 위치했을 때 극단치로 간주되었다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, PCA 분석결과 95% 신뢰 타원 영역의 경계선 밖에 8개의 샘플(MS 환자 3명과 NMOSD 환자 5명)이 위치하여, 이들 샘플은 추가 통계 분석과정에서 제외되었다(도 1).
<2-3> 그룹 분리를 위한 OPLS-DA 모델 구축
그룹의 차이를 특성화하기 위해 계급 분리와 무관한 변동성을 제거하여 계급 분리를 극대화하고 계급 구분에 관여하는 잠재 변수를 탐지하는 모델을 구축하는 직교부분최소자승판별 분석(OPLS-DA)을 적용하였다. S-플롯을 기반으로 중요한 특성을 식별하였다. OPLS-DA 모델의 S-플롯은 상관 p(corr) 로딩 프로파일에 대한 공분산 p가 결합된다. 이는 모델 구성요소 점수와 관련하여 모델 변수에 대한 기여도 또는 크기(모델링된 공변량)와 모델 구성 요소 점수와 관련하여 모델 변수에 대한 효과 및 신뢰성(모델링된 상관관계)을 각각 결합한 것과 일치하였다. OPLS-DA 모델의 질은 R2(적합도) 및 Q2(예측 능력) 매개변수에 의해 추정되었다. 모델의 질은 1000-무작위 순열 테스트로 검증하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 정상군, MS 환자군 및 NMOSD 환자군 사이의 OPLS-DA 모델은 R2 값이 0.443, Q2 값이 0.234로 그룹이 완전히 분리되지 않고 중복되었다. 특히, MS 환자군은 정상군과 NMOSD 환자군과 결과 값이 매우 많이 겹쳤다(도 2A). 한편, 정상군과 MS 환자군 사이의 OPLS-DA 모델은 R2 값이 0.738, Q2 값이 0.408로 그룹의 분리가 개선되었다(도 2B). 정상군과 MS 환자군에 대한 OPLS-DA 모델에서 관찰된 R2 값과 Q2 값은 순열 모델의 값보다 높았으며, 이는 모델의 예측 가능성을 나타냈다. 정상군과 NMOSD 환자군 사이의 OPLS-DA 모델은 R2 값이 0.589, Q2 값이 0.405로 그룹의 분리가 더 개선되었다(도 2C). 정상군과 NMOSD 환자군에 대한 OPLS-DA 모델에서 관찰된 R2 값과 Q2 값은 순열테스트의 값보다 높았으며 예측 가능성과 적합성을 나타냈다.
<2-4> 그룹간의 차별에 기여하는 대사산물을 확인하기 위한 단변량 분석
그룹간의 차별에 기여하는 대사산물을 확인하기 위해 단변량 분석을 수행하였다. 정량화된 대사산물 농도의 표준편차 및 균등도는 SPSS를 사용하여 평가하였다. 모든 변수가 콜모고로프-스미노프(Kolmogorov-Smirnov) 검정에 기초한 정규성과 레빈(Levene)의 검정에 기초한 분산의 동일성을 만족시키지 못하였으므로, 비모수 크러스컬-월리스(Kruskal-Wallis) 검정을 사용하였다. 그룹간의 다중 비교에서 p 값은 본페로니(Bonferroni)의 교정을 사용해 조정하였고, 다중 테스트 교정인 벤자미니-호크버그(Benjamini-Hochberg) 방법을 사용해 오류발견률(False Discovery Rate, FDR)을 계산하였다. 최종 p 값이 0.05보다 작으면 유의한 것으로 간주하였다.
정상군과 MS 환자군 및 정상군과 NMOSD 환자군간에 유의한 차이가 있는 대사산물
대사산물
 다중 비교
(조정된 p 값)		 FDR
 대사산물 변화 그룹의 평균(표준편차) (mM)
MS
환자		 NMOSD
환자		 정상인 MS 환자 NMOSD 환자
2-히드록시
부티르산		 *C-M(0.003) <0.05 △
 △
 0.0420
(0.0086)		 0.0544
(0.0204)		 0.0718
(0.0373)
C-N(<0.001) <0.05
아세톤
 C-M(0.001) <0.05 △
 △
 0.1112
(0.0364)		 0.1868
(0.0864)		 0.2135
(0.0627)
C-N(<0.001) <0.05
포름산
 C-M(0.003) <0.05 △
 △
 0.0449
(0.0061)		 0.0530
(0.0101)		 0.0576
(0.0197)
C-N(0.001) <0.05
피로글루타민산 C-M(0.001) <0.05 △
 △
 0.0332
(0.0030)		 0.0454
(0.0265)		 0.0443
(0.0135)
C-N(<0.001) <0.05
아세테이트 C-M(0.001) <0.05 ▽
 ▽
 0.2993
(0.0033)		 0.2626
(0.0565)		 0.2563
(0.0396)
C-N(<0.001) <0.05
포도당
 C-M(0.001) <0.05 ▽
 ▽
 4.5681
(0.2540)		 4.0432
(0.6704)		 4.1501
(0.9873)
C-N(<0.001) <0.05
시트르산
 C-M(0.003) <0.05 ▽
 -
 0.4352
(0.0532)		 0.3451
(0.0969)		 0.4698
(0.1218)
M-N(<0.001) <0.05
젖산
 C-N(0.002) 0.005 -
 △
 1.8832
(0.1715)		 1.8521
(0.3670)		 2.4513
(0.9397)
M-N(<0.001) <0.05
*C는 정상군, M은 MS 환자군, N은 NMOSD 환자군을 나타낸다.
△는 정상군에 비해 값이 증가함, ▽는 정상군에 비해 값이 감소함, -는 유의한 변화가 없음을 의미한다.
그 결과, 표 3에 나타낸 바와 같이, 2-히드록시부티르산, 아세톤, 포름산 및 피로글루타민산은 정상군에 비해 MS 환자군 및 NMOSD 환자군에서 상향조절되었고, 포도당 및 아세테이트는 MS 환자군 및 NMOSD 환자군에서 하향조절되었다. 한편, 시트르산은 정상군에 비해 MS 환자군에서만 하향조절되었고, 젖산은 NMOSD 환자군에서만 상향조절되었다(표 3 및 도 3). 또한, 도 4에 나타낸 바와 같이, 상기 결과가 OPLS-DA 모델의 S-플롯(도 4A 및 4B) 및 상자수염도(box and whisker plot)에서도 동일함을 확인하였다(도 4C).
<2-5> ROC 분석을 통한 바이오마커 선별
ROC 곡선(AUC), 민감도 및 특이성을 평가하는 ROC(Receiver Operating Characteristic) 분석을 통해 정상군, MS 환자군 또는 NMOSD 환자군을 판별할 수 있는 바이오마커를 선별하였다. 다변량 바이오마커의 ROC 곡선 계산 알고리즘은 PLS-DA 알고리즘을 기반으로 했다. 중요한 특징은 무작위 서브샘플링을 반복적으로 수행하는 몬테카를로 교차검증법(MCCV)을 통해 확인하였다. 각 MCCV의 샘플중 2/3는 변수의 중요성을 평가하는데 사용되었고, 상위 2, 3, 5, 10, 20, 32의 중요한 변수는 나머지 샘플의 1/3에서 검증된 분류모델을 구축하는데 사용되었다. 두가지 잠재변수를 갖는 PLS-DA 접근법을 분류방법으로 선택하였으며, ROC 곡선의 95% 신뢰구간(CI)은 500 부트스트래핑(bootstrapping)을 사용하여 계산하였고, 최적 대사산물의 수는 AUC 값을 기초로 얻었다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 약 5개의 바이오마커가 조합으로 사용되었을 때 AUC 값이 최대로 나타났다(도 5A). 계산에서 가장 빈번하게 이용된 대사산물은 시트르산, 젖산, 포도당, 아세톤 및 아세테이트였다. NMOSD 환자군과 다른군(정상군 및 MS 환자군)을 비교한 모델, MS 환자군과 NMOSD 환자군을 비교한 모델, 및 MS 환자군과 다른군(정상군 및 NMOSD 환자군)을 비교한 모델의 AUC 값은 각각 0.861, 0.829 및 0.771이었다(도 5B). 즉, NMOSD 환자군과 다른군을 비교한 모델은 다른 모델보다 더 나은 차별화 능력을 보였다. 이는 시트르산, 젖산, 포도당, 아세톤 및 아세테이트 바이오마커의 조합이 MS 환자 및 NMOSD 환자를 구별할 수 있음을 의미한다.

Claims (7)

1) 다발성 경화증 또는 시신경 척수염 범주 질환으로 의심되는 환자로부터 얻은 시료로부터 시트르산 및 젖산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 농도를 측정하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 시트르산 및 젖산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 농도를 정상개체의 농도와 비교하는 단계를 포함하는 다발성 경화증 및 시신경 척수염 범주 질환의 구별 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 대사산물 분석 방법이되,
시트르산의 농도가 정상개체에 비해 감소하고, 젖산의 농도는 정상개체에 비해 유의미한 변화가 없을 경우, 다발성 경화증으로 판정하고,
젖산의 농도가 정상개체에 비해 증가하고, 시트르산의 농도는 정상개체에 비해 유의미한 변화가 없을 경우, 시신경 척수염 범주 질환으로 판정하는 것인,
다발성 경화증 및 시신경 척수염 범주 질환의 구별 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 대사산물 분석 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 1)의 시료가 소변, 혈액, 혈청, 혈장 또는 뇌척수액인, 다발성 경화증 및 시신경 척수염 범주 질환의 구별 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 대사산물 분석 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 1)의 시트르산 및 젖산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 농도가 핵자기공명분광기, 크로마토그래피, 자외선분광기, 적외선 분광기, 형광분광기, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 및 질량분석기로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 장치로 측정되는, 다발성 경화증 및 시신경 척수염 범주 질환의 구별 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 대사산물 분석 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
F-M Moussallieh et al., Multiple Sclerosis Journal, Vol. 20(5), pp. 558-565.(2013.09.30.)*
I L Simone et al., Journal of the Neurological Sciences, Vol.144, pp. 182-190.(1996.12.)*
T Gebregiworgis et al., Journal of proteome research, Vol. 15(2), pp 659-666.(2016.01.27.)*

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