ES2638370T3 - Inhibidores del complejo PP1/GADD34 para el tratamiento de una afección que requiera una actividad inmunosupresora - Google Patents

Abstract

Un inhibidor de la actividad o de la formación del complejo PP1/GADD34 para uso en el tratamiento de una afección inflamatoria.

Description

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DESCRIPCION

Inhibidores del complejo PP1/GADD34 para el tratamiento de una afeccion que requiera una actividad inmunosupresora

Campo de la invencion:

La presente invencion se refiere a un inhibidor de la actividad o de la formacion del complejo PP1/GADD34 para uso en el tratamiento de una afeccion inflamatoria.

Antecedentes de la invencion:

Las celulas dendnticas (DC) son reguladores de la respuesta inmunitaria cuyas actividades de procesamiento de antfgenos son controladas en respuesta a patrones moleculares asociados a patogenos (PAMPS). Las DC son mas eficaces en la iniciacion de las respuestas espedficas de antigenos, induciendo la diferenciacion de los linfocitos T vfrgenes. Tras estimulacion por receptores de reconocimiento de patrones, las DC comienzan un proceso de maduracion caracterizado por cambios funcionales, tales como produccion de citoquinas (por ejemplo, IL-12) o sobrerregulacion de la presentacion de antigenos [Mellman, I. et al., 2001]. El RNA bicatenario (ds-RNA) presente como genoma viral o en celulas infectadas viralmente es reconocido por el receptor tipo Toll 3 (TLR3), que es expresado por varios tipos de celulas especializadas incluyendo las DC [Alexopoulou, L., et al. 2001]. Por estimulacion con poli I:C, un imitador del dsRNA, TLR3, desencadena una cascada de senalizacion compleja que conduce a la produccion de interferones (IFN) de tipo I [Alexopoulou, L. et al., 2001 and Kawai, T. et al., 2006]. Ademas del tLR3 unido a membranas, otro receptor de dsRNA intracelular, el gen 5 asociado a la diferenciacion de melanoma (MDA5) por RNA helicasa induce la produccion de IFN de tipo I en respuesta a poli I:C por medio de una cascada de senalizacion diferente que tambien conduce a la translocacion nuclear de los factores reguladores de interferon, IRF-3 e IRF-7 [Kawai, T. et al., 2006 and Gitlin, L. et al., 2006]. Una vez unidos a su receptor sobre la superficie celular, los interferones de tipo I activan tirosina-quinasa de Janus/transductor de senal y la via del activador, que induce la expresion de un amplio espectro de genes celulares. Entre estos, esta la protema quinasa R (PKR) dependiente de RNA bicatenario, una pieza clave de la accion antiviral mediada por interferon, que esta implicada en la diferenciacion celular y la apoptosis [Donze, O. et al., 2004 and Scheuner, D. et al., 2006].

La PKR tambien es activada por el dsRNA en el citosol y desencadena la fosforilacion del factor 2-alfa eucariota de iniciacion de la traduccion (eIF2-a) en la serina 51 [Proud, C. G, 1995 and Williams, B.R., 1999] que conduce a la interrupcion de la smtesis de protemas y a la inhibicion de la replicacion viral. Ademas de la deteccion de dsRNA, diferentes senales de estres desencadenan la fosforilacion de eIF2-a, atenuando asf la traduccion del mRNA y activando los programas de expresion genica conocidos globalmente como la respuesta integrada al estres (ISR) [Harding, H. P. et al., 2003]. Hasta la fecha, se han identificado cuatro quinasas que median en la ISR: PKR, PERK (quinasa del retmulo endoplasmatico (ER) similar a la protema quinasa de RNA (PKR)) [Harding, H.P., et al., 2000], GCN2 (quinasa 2 de control general no desrepresora) [Zhang, P. et al. 2002 and Berlanga, J. J. et al. 2006] y HRI (inhibidor regulado por hemina) [Chen, J. J. et al., 1995 and Lu, L., et al., 2001]. La fosforilacion de eIF2-a mediada por estres del ER es realizada por la PERK, que es activada por un exceso de protemas desplegadas que se acumulan en el lumen del ER [Harding, H.P., et al., 2000]. La PERK activada fosforila el eIF2-a, atenuando la smtesis de protemas y desencadenando la traduccion de moleculas espedficas, tales como el factor de transcripcion activador ATF4, que es necesario para montar parte de una ISR particular, conocida como la respuesta a protemas desplegadas (UPR) [Ron, D. & Walter, P., 2007 and Todd, D.J., et al., 2008 and Zhang, K. & Kaufman, R.J. et al., 2008].

Curiosamente, la deteccion de dsRNA por TLR3, MDA5 y PKR es probable que ocurra simultaneamente en celulas como las DC, dando como resultado por tanto potencialmente episodios de senalizacion en conflicto y efectos biologicos opuestos (por ejemplo, activacion celular frente a la detencion de la traduccion y/o anergia).

Los inventores demuestran en la presente invencion que la deteccion de poli I:C por las DC o fibroblastos activa el circuito de control con retroalimentacion negativa de la UPR e induce la desfosforilacion del eIF2-a a traves de la fosfatasa 1 (PP1) y la expresion de su cofactor inducible, la protema 34 inducible por dano al DNA y por deteccion del crecimiento (GADD34/MyD116) [Connor, J.H., et al., 2001]. Como consecuencia, la detencion de la traduccion, normalmente mediada por medio de la fosforilacion del eIF2-a en respuesta a la deteccion de dsRNA citosolico, la privacion de tapsigargina o triptofano, es evitada en las DC activadas. Este fenomeno permite que las DC realicen su funcion inmunitaria, en condiciones bajo las cuales la detencion de la traduccion perjudicana normalmente su actividad. Este punto es ilustrado por la demostracion de que la ausencia de inhibicion de la traduccion inducida por estres en las DC activadas es esencial para producir cantidades normales de interferon-p y para prevenir la escision de la caspasa-3 y la apoptosis y porque las DC inactivadas para el gen GADD34 son incapaces de producir citoquinas.

Como es sabido, las DC desempenan un papel importante en afecciones inflamatorias como las enfermedades autoinmunitarias liberando citoquinas inflamatorias. como interferon-p o IL-12. Por tanto, la inhibicion de GADD34 podna permitir el control de la respuesta inmunitaria hiperactiva en afecciones patogenas como las enfermedades autoinmunitarias o el rechazo de injertos bloqueando la liberacion de citoquinas inflamatorias por las DC u otras

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celulas.

Hasta el momento, muy pocos tratamientos estan disponibles para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias o el rechazo de injertos que tengan un mdice de seguridad aceptable.

Por tanto, existe una necesidad permanente en la tecnica de nuevas moleculas para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias o para el rechazo de injertos.

Sumario de la invencion:

La invencion se basa en el descubrimiento de que GADD34 representa una diana nueva y prometedora que controla la inflamacion bloqueando la liberacion de citoquinas inflamatorias y otros mediadores moleculares segregados que conducen a afecciones patogenas, tales como enfermedades autoinmunitarias o enfermedades infecciosas y no infecciosas que conducen a hipercitoquinemia incluyendo la enfermedad de injerto contra hospedante (GVHD), smdrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS), sepsis, gripe aviar, viruela y smdrome de respuesta inflamatoria sistemica (SIRS). Los inhibidores de GADD34 ya se conocen para el tratamiento de cancer, como carcinoma o sarcoma (vease por ejemplo el documento WO 2008028965).

Por tanto, la invencion se refiere a un inhibidor de la actividad o de la formacion del complejo PP1/GADD34 para uso en el tratamiento de una afeccion inflamatoria.

Descripcion detallada de la invencion:

Definiciones:

Como se usa en la presente memoria, el termino “celulas dendnticas (DC)” denota celulas inmunitarias que forman parte del sistema inmunitario de los mairnferos. Su funcion principal es procesar el material antigenico y presentarlo en la superficie a otras celulas del sistema inmunitario, actuando asf como celulas presentadoras de antigenos.

Como se usa en la presente memoria, el termino “enfermedades autoinmunitarias” denota una respuesta inmunitaria hiperactiva del cuerpo frente a sustancias y tejidos presentes normalmente en el cuerpo. En otras palabras, el cuerpo ataca realmente sus propias celulas. Esto puede estar restringido a ciertos organos (por ejemplo, en la tiroiditis) o implicar un tejido particular en diferentes lugares (por ejemplo, la enfermedad de Goodpasture que puede afectar a la membrana basal tanto en el pulmon como en el rinon). El tratamiento de enfermedades autoinmunitarias es tfpicamente con medicacion inmunosupresora que disminuye la respuesta inmunitaria.

Como se usa en la presente memoria, el termino “poli I:C” (acido poliinosmico:policitidflico o sal sodica del acido poliinosmico-policitidflico) denota un inmunoestimulante. Se utiliza para simular infecciones virales. Se sabe que el poli I:C interacciona con el receptor tipo Toll (TLR) 3, que se expresa en los compartimentos intracelulares de los linfocitos B y las celulas dendnticas. El poli I:C es estructuralmente similar al RNA bicatenario, que esta presente en algunos virus y es un estimulante “natural” de TLR3. Por tanto, el poli I:C puede ser considerado un analogo sintetico del RNA bicatenario y es una herramienta comun para la investigacion cientffica sobre el sistema inmunitario.

Como se usa en la presente memoria, el termino “GADD34” para la “protema 34 inducible por dano al DNA” o MyD116 denota una protema que interacciona con el inhibidor de protema 1 (I-1) que se asocia con el extremo C del I-1 humano. La GADD34, cuya expresion en celulas de mai^ero se eleva por la detencion del crecimiento, dano al DNA, y otras formas de estres celular, tiene una homologfa estructural con una region del factor de neurovirulencia del herpesvirus simple (HSV-1) ICP-345, mostrado anteriormente unido a PP1. Una secuencia ilustrativa para el gen GADD34 humano (PPP1R15A) esta depositada en la base de datos NCBI con el numero de acceso NW_927240.1 y mRNA U83981.1.

Como se usa en la presente memoria, el termino “un inhibidor de la formacion del complejo PP1/GADD34” denota un inhibidor capaz de competir en el intervalo pM con GADD34 para formar un complejo con PP1 y por tanto hacer que dicho complejo sea no funcional o bloquear la expresion de GADD34 o hacer que GADD34 sea estructuralmente inactiva. En otras palabras, “un inhibidor de la formacion del complejo PP1/GADD34” tendra una EC50 no mayor que 50 |jM y preferiblemente no mayor que 25 jM.

Como se usa en la presente memoria, el termino “un inhibidor de la actividad del complejo PP1/GADD34” denota un inhibidor en el intervalo pM que es responsable de la no expresion de dicho complejo en la celula y/o de la no induccion de una reaccion del sistema inmunitario o de una reaccion disminuida del sistema inmunitario en comparacion con su reaccion en ausencia de dicho inhibidor. En otras palabras, “un inhibidor de la actividad del complejo PP1/GADD34” tendra una EC50 no mayor que 50 jM y preferiblemente no mayor que 25 jM.

Como se usa en la presente memoria, el termino “inhibidor selectivo” denota un compuesto que solo inhibe la actividad o expresion de GADD34, sin afectar la actividad del activador no inducible de Ppl, CreP, o la actividad de PP1 fuera del complejo de GADD34.

Como se usa en la presente memoria, el termino “protema fosfatasa 1 (PP1)” denota una protema eucariota principal serina/treonina-fosfatasa que regula una enorme variedad de funciones celulares a traves de la interaccion de su

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subunidad catalftica (PP1c) con mas de cincuenta diferentes subunidades reguladoras establecidas o supuestas.

Como se usa en la presente memoria, el termino “injerto” se refiere a una celula, tejido, organo o cualquier otra retmulo biologico compatible para trasplante.

Como se usa en la presente memoria, el termino “rechazo de injerto” denota el rechazo agudo o cronico de celulas, tejidos o aloinjertos o xenoinjertos de organos solidos de por ejemplo islotes pancreaticos, celulas madre, medula osea, piel, musculo, tejido corneo, tejido neuronal, corazon, pulmon, corazon-pulmon combinados, rinon, tugado, intestino, pancreas, traquea o esofago o enfermedades de injerto contra hospedante.

Como se usa en la presente memoria, el termino “alogenico” denota un injerto procedente de un animal diferente de la misma especie.

Como se usa en la presente memoria, el termino “xenogenico” denota un injerto procedente de un animal de una especie diferente.

Como se usa en la presente memoria, el termino “trasplante” denota un retmulo biocompatible o un tejido, organo o celula donantes, para ser trasplantados. Un ejemplo de un trasplante puede incluir, aunque sin limitacion, piel, medula osea y organos solidos, tales como corazon, pancreas, rinon, pulmon e tugado.

Como se usa en la presente memoria, los terminos “tratar” o “tratamiento”, denota invertir, aliviar, inhibir el progreso o prevenir el trastorno o afeccion al que se aplica dicho termino, o uno o mas smtomas de dicho trastorno o afeccion.

Inhibidores y sus usos

Un primer aspecto de la invencion se refiere a un inhibidor de la actividad o de la formacion del complejo PP1/GADD34 para uso en el tratamiento de una afeccion inflamatoria.

En una primera realizacion, el inhibidor de acuerdo con la invencion es util para el tratamiento de afecciones inflamatorias.

Como se usa en la presente memoria, el termino "afeccion(es) inflamatoria(s)" denota una respuesta biologica caracterizada por componentes celulares y bioqmmicos. Por ejemplo, el componente celular se caracteriza por la migracion de leucocitos (hinchamiento) y el componente bioqmmico se caracteriza por activacion del sistema del complemento o por la produccion de mediadores, quimioquinas y citoquinas.

El inhibidor puede ser util para el tratamiento de afecciones inflamatorias incluyendo asma, miopatfas, smdrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS), smdrome de respuesta inflamatoria sistemica (SIRS), enfermedades inflamatorias intestinales y sepsis.

En otra realizacion preferida, la afeccion inflamatoria es sepsis.

En otra realizacion preferida, el inhibidor de acuerdo con la invencion es un inhibidor de la GADD34

En otra realizacion preferida, el inhibidor de acuerdo con la invencion es un inhibidor de PP1 en complejo con GADD34.

En otra realizacion preferida, el inhibidor de acuerdo con la invencion inhibe el dominio de interaccion comprendido entre los residuos de aminoacidos 540 y 600 de la GADD34.

En una realizacion preferida, el inhibidor de acuerdo con la invencion se selecciona entre salubrinal, tautomicina y caliculina A.

En otra realizacion preferida, el inhibidor de acuerdo con la invencion es un peptido que consiste o comprende un fragmento de la GaDd34.

En otra realizacion, el inhibidor de acuerdo con la invencion es un inhibidor selectivo de la GADD34. Un inhibidor selectivo de acuerdo con la invencion se puede encontrar en la solicitud de patente WO2008028965.

En una realizacion preferida, el inhibidor selectivo se selecciona de pequenos RNA inactivantes u otros compuestos capaces de bloquear la expresion de la GADD34 en el nivel de transcripcion o traduccion.

En una realizacion, el inhibidor de la invencion puede ser un inhibidor de bajo peso molecular, por ejemplo una molecula organica pequena (natural o no).

El termino “molecula organica pequena” se refiere a una molecula (natural o no) de un tamano comparable a las moleculas organicas usadas generalmente en productos farmaceuticos. El termino excluye macromoleculas biologicas (por ejemplo, protemas, acidos nucleicos, etc.). Las moleculas organicas pequenas preferidas vanan en tamano hasta aproximadamente 5000 Da, mas preferiblemente hasta 2000 Da y lo mas preferiblemente hasta aproximadamente 1000 Da.

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En otra realizacion, el inhibidor de la invencion puede consistir en un anticuerpo que inhibe la actividad o la formacion del complejo PP1/GADD34 o un fragmento de anticuerpo que inhibe la actividad o la formacion del complejo PP1/GADD34.

Los anticuerpos dirigidos contra el complejo PP1/GADD34 se pueden producir de acuerdo con metodos conocidos administrando el antigeno o epftopo apropiado a un animal hospedante seleccionado, por ejemplo, cerdos, vacas, caballos, conejos, cabras, ovejas y ratones, entre otros. Se pueden usar varios adyuvantes conocidos en la tecnica para potenciar la produccion de anticuerpos. Aunque los anticuerpos utiles en la practica de la invencion pueden ser policlonales, se prefieren los anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales contra el complejo PP1/GADD34 se pueden preparar y aislar usando cualquier tecnica que proporcione la produccion de moleculas de anticuerpo por lmeas celulares continuas en cultivo. Las tecnicas para la produccion y el aislamiento incluyen, aunque sin limitacion, la tecnica del hibridoma descrita originalmente por Kohler and Milstein (1975); la tecnica del hibridoma de linfocitos B humanos (Cote et al., 1983); y la tecnica EBV-hibridoma (Cole et al., 1985). Alternativamente, las tecnicas descritas para la produccion de anticuerpos monocatenarios (vease, por ejemplo, la patente de EE.UU. N° 4.946.778) se pueden adaptar para producir anticuerpos monocatenarios anti-complejo PP1/GADD34. El inhibidor del complejo PP1/GADD34 util en la practica de la presente invencion incluye tambien fragmentos de anticuerpos anti-complejo PP1/GADD34 que incluyen, aunque sin limitacion, fragmentos F(ab')2, que pueden ser generados por digestion con pepsina de una molecula de anticuerpo intacta, y fragmentos Fab, que pueden ser generados reduciendo los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab')2. Alternativamente, se pueden construir colecciones de expresion de Fab y/o scFv para permitir la identificacion rapida de fragmentos que tengan la especificidad deseada para el complejo PP1/GADD34.

Anticuerpos anti-complejo PP1/GADD34 humanizados y sus fragmentos tambien se pueden preparar de acuerdo con tecnicas conocidas. Los “anticuerpos humanizados” son formas de anticuerpos quimericos no humanos (por ejemplo, de roedores) que contienen una secuencia minima procedente de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una region hipervariable (CDR) del receptor estan sustituidos por residuos de una region hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como raton, rata, conejo o primate no humano, que tenga la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la region de entramado (FR) de la inmunoglobulina humana estan sustituidos por residuos no humanos correspondientes. Ademas, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se hacen para refinar aun mas el comportamiento de los anticuerpos. En general, el anticuerpo humanizado comprendera sustancialmente todos de al menos uno y, tfpicamente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todos o sustancialmente todos los FR son los de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado comprendera tambien opcionalmente al menos una porcion de una region constante de inmunoglobulina (Fc), tfpicamente la de una inmunoglobulina humana. Metodos para preparar anticuerpos humanizados han sido descritos, por ejemplo, por Winter (Patente de EE.UU. N° 5.225.539) y Boss (Celltech, Patente de EE.UU. N° 4.816.397).

Incluso en otra realizacion, el inhibidor del complejo PP1/GADD34 se puede seleccionar de aptameros. Los aptameros son una clase de moleculas que representa una alternativa a los anticuerpos en terminos de reconocimiento molecular. Los aptameros son secuencias de oligonucleotidos u oligopeptidos con la capacidad de reconocer virtualmente cualquier clase de moleculas diana con altas afinidad y especificidad. Dichos ligandos se pueden aislar por evolucion sistematica de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX) de una coleccion de secuencias aleatorias, como ha sido descrito por Tuerk C. and Gold L., 1990. La coleccion de secuencias aleatorias se puede obtener por smtesis qrnmica combinatoria de DNA. En esta coleccion, cada miembro es un oligomero lineal, eventualmente modificado qmmicamente, de una secuencia unica. Las posibles modificaciones, usos y ventajas de esta clase de moleculas han sido revisados por Jayasena S.D., 1999. Los aptameros peptfdicos consisten en una region variable de anticuerpo conformacionalmente restringida mostrada por una protema plataforma, tal como tiorredoxina A de E. coli que se seleccionan de colecciones combinatorias por metodos de dos tubridos (Colas et al., 1996).

Composicion terapeutica

Otro objeto de la invencion se refiere a una composicion terapeutica que comprende un inhibidor de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8 para uso en el tratamiento de una afeccion inflamatoria.

Cualquier agente terapeutico de la invencion se puede combinar con excipientes farmaceuticamente aceptables, y opcionalmente matrices de liberacion prolongada, tales como polfmeros biodegradables, para formar composiciones terapeuticas.

“Farmaceuticamente” o “farmaceuticamente aceptable” se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reaccion adversa, alergica u otra reaccion inadecuada cuando se administran a un mairnfero, especialmente a un ser humano, segun sea apropiado. Un vehfculo o excipiente farmaceuticamente aceptable se refiere a una carga, diluyente, material encapsulante o auxiliar de formulacion de cualquier tipo, solido, semisolido o lfquido no toxico.

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La forma de las composiciones farmaceuticas, la v^a de administracion, la dosificacion y el regimen dependen naturalmente de la afeccion que se ha de tratar, de la gravedad de la enfermedad, de la edad, peso y sexo del paciente, etc.

Las composiciones farmaceuticas de la invencion se pueden formular para administracion topica, oral, intranasal, parenteral, intraocular, intravenosa, intramuscular o subcutanea y similares.

Preferiblemente, las composiciones farmaceuticas contienen vehmulos que son farmaceuticamente aceptables para una formulacion capaz de ser inyectada. En particular pueden ser soluciones salinas esteriles e isotonicas (fosfato monosodico o disodico, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio y similares o mezclas de dichas sales), o composiciones secas, especialmente liofilizadas que por adicion, dependiendo el caso, de agua esterilizada o solucion salina fisiologica, permiten la constitucion de soluciones inyectables.

Las dosis utilizadas para la administracion se pueden adaptar en funcion de diversos parametros y, en particular, en funcion del modo de administracion utilizado, de la patologfa pertinente o alternativamente de la duracion deseada del tratamiento.

Ademas, otras formas farmaceuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, comprimidos u otros solidos para administracion oral; capsulas de liberacion prolongada; y cualquier otra forma que se pueda utilizar actualmente.

Alternativamente, los compuestos de la invencion que inhiben la actividad o la formacion del complejo PP1/GADD34 se pueden identificar adicionalmente por metodos de cribado como se describe a continuacion.

La invencion sera ilustrada adicionalmente por las figuras y los ejemplos siguientes. Sin embargo, estos ejemplos y figuras no deben ser interpretados en modo alguno como limitativos del alcance de la presente invencion.

Figuras:

Figura 1. Los factores de transcripcion ATF4 y CHOP son inducidos en las DC por estimulacion con poli I:C.

a) Se midio la expresion del mRNA de ATF4 por PCR cuantitativa (qPCR) en respuesta a la estimulacion con poli I:C en diferentes periodos (panel izquierdo). Se cuantificaron los niveles de la protema ATF4 en el extracto nuclear de las DC estimuladas con poli I:C por inmunotransferencia. Los niveles de protema aumentaron despues de 8 horas de estimulacion, de forma similar a las celulas tratadas con tunicamicina (panel derecho). Una muestra para simulacion (simul.) se trato con DMSO, en el que estaba disuelta tunicamicina; se muestra la inmunotransferencia para la histona H1 como control de carga igual. b) Por qPCR se encontro que la expresion del mRNA de CHOP habfa aumentado 8 veces en las DC activadas con poli I:C. c) Los niveles de expresion del mRNA de la fosfatasa 1 (PP1) solo aumentaron modestamente por poli I:C. d) La expresion del mRNA de GADD34 aumento hasta 14 veces (panel superior). Fue necesario un tratamiento con el inhibidor de proteasoma MG132 (2 pM, anadido 4 horas antes de la recoleccion) para permitir la deteccion de GADD34 por inmunotransferencia. La GADD34 se acumula en las celulas despues de 8 horas de estimulacion con poli I:C, en cantidades comparables a las inducidas por tunicamicina. e) Los niveles de expresion del mRNA de CReP (cofactor constitutivo de PP1) fueron inducidos muy modestamente.

Figura 2. La smtesis de protemas y la desfosforilacion de eIF2-a estan estrechamente reguladas durante la maduracion de las DC inducida por poli I:C. a) Se cuantifico la smtesis de protemas en las DC activadas con poli I:C usando un marcaje con puromicina seguido por inmunotransferencia con el mAb anti-puromicina, 12D10. La smtesis de protemas fue potenciada en las primeras horas de estimulacion con poli I:C, seguido por una reduccion despues de 8 horas. Los controles son celulas no tratadas con puromicina (co) y celulas tratadas con cicloheximida (chx) 5 minutos antes de la incorporacion de puromicina. Se muestra la inmunotransferencia de p-actina para un control de carga igual. b) Se realizaron inmunotransferencias para eIF2-a fosforilado (P-eIF2-a) y total en los mismos extractos de DC. Tambien se muestra la cuantificacion de los niveles de P-eIF2-a. c) Las DC se activaron con poli I:C soluble durante 24 horas y se trataron con salubrinal 75 pM (inhibidor espedfico del complejo PP1/GADD34) durante las ultimas 4 horas de estimulacion, antes de la deteccion de P-eIF2-a por inmunotransferencia. d) Experimentos identicos realizados con tautomicina, un inhibidor de PP1 diferente.

Figura 3. La PKR fosforila el eIF2-a en las DC activadas. a) Las DC de tipo natural, (WT), y con PKR'/_ fueron estimuladas con poli I:C soluble durante diferentes periodos y PKR y P-eIF2-a fueron detectadas por inmunotransferencia. Los niveles de PKR aumentan considerablemente despues de la maduracion. Los niveles de PKR estan inversamente correlacionados con la intensidad de P-eIF2-a, que se reduce gradualmente. En las DC con PKR'/_ no activadas los niveles de P-eIF2-a son comparables a los de las DC de tipo natural, mientras que por estimulacion con poli I:C el P-eIF2-a es casi abolido. b) Se observo una disminucion comparable de P-eIF2-a despues de estimulacion con poli I:C (sol) en las DC con PKR'/_ por suministro directo de poli I:C en el citosol (lip). Se realizo un control con celulas tratadas con arsenito de sodio (500 |jM, 30 minutos). c) La lipofeccion de poli I:C (lip) y poli I:C (sol) no soluble induce la fosforilacion del eIF2-a dependiente de PKR en los mEf de tipo natural y en las celulas NIH3T3. d) Las celulas NIH3T3 se lipofectaron con poli I:C durante 8 horas, con la adicion del inhibidor de proteasoma MG132 en las ultimas 4 horas de tratamiento. A diferencia de las DC (Fig. 1d), disminuyen los niveles de GADD34. La inmunotransferencia de p-actina se muestra como un control de carga igual.

Figura 4. Las DC estan protegidas de la inhibicion de la traduccion inducida por PKR por sensibilizacion con

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poli I:C citosolico. a) Monitorizacion de la traduccion en los MEF, las DC y NIH3T3 de tipo natural y con PKR'/_ tratados con poli I:C soluble (sol) o lipofectado (lip) durante 8 horas. La lipofeccion de poli I:C en los MEF (wt) y NIH3T3 induce la detencion de la traduccion dependiente de PKR. El poli I:C soluble no afecta a las celulas NIH3T3, pero inhibe la traduccion en los MEF de tipo natural. Por el contrario, la detencion de la traduccion por tratamiento con poli I:C no se observa nunca en las DC. Se presentan controles sin puromicina (co), cicloheximida (chx) y lipofectamina sola (simulacion). Se muestra una inmunotransferencia de p-actina para control de carga igual. b) Se trataron NIH3T3, MEF y DC durante 8 horas con monitorizacion previa con poli I:C marcado con Cy5 lipofectado por FACS. Se presenta un experimento representativo de los tres. c) La traduccion se controlo en las DC estimuladas con poli I:C durante 4 u 8 horas. La smtesis de protemas se redujo considerablemente en presencia de salubrinal (anadido a las celulas 2 horas antes de la estimulacion con poli I:C).

Figura 5. Vias de transduccion de senales implicadas en la regulacion de la fosforilacion del eIF2-a y la transcripcion de GADD34. a) Las DC de tipo natural, con TLR3'/_ y con MDA5-/" se estimularon con poli I:C durante diferentes periodos antes de la inmunotransferencia para P-eIF2-a, eIF2-a y PKR. En todos los tipos de celulas, los niveles de PKR aumentaron durante la maduracion de las DC, mientras que eIF2-a es desfosforilado (panel superior). Por el contrario, el tratamiento con el inhibidor de la quinasa PI3, Ly294002 (Ly), (1 hora antes de la recoleccion) evita eficazmente la desfosforilacion del eIF2-a (panel inferior). b) No se observa ningun cambio en la desfosforilacion del eIF2-a en las DC con IFN-ap R-/" estimuladas con poli I:C, mientras que en estas celulas se reducen drasticamente los niveles de PKR. c) Monitorizacion por qPCR de los niveles de mRNA de GADD34 en las DC de tipo natural y activadas con IFN-ap R'/_. Los niveles se reducen 2 a 6 veces con el IFN-ap R- / ' en comparacion con las celulas de tipo natural.

Figura 6. Las DC activadas son resistentes a la formacion de granulos de estres y a la privacion de triptofano. a) Las DC se activaron con poli I:C o LPS durante diferentes periodos y se trataron con arsenito de sodio 500 |jM durante los ultimos 30 minutos de cada periodo. La formacion de granulos de estres (SG) se visualizo por microscopfa confocal despues de hibridacion in situ de mRNA con oligodT y tincion con anticuerpo eIF4A. Barra, 10 pm (panel superior). Se represento el numero de las DC que llevan SG en funcion del tiempo de maduracion. Se encuentran SG en casi el 100% de las DC no activadas, una proporcion que se reduce por activacion. La cinetica de formacion de los SG corresponde al estado de la fosforilacion del eIF2-a y la expresion de GADD34 inducidas por poli I:C o LPS (panel inferior). b) Se midio la intensidad de la traduccion en los MEF de tipo natural y con GCN2'/_ cultivados en medio completo o libre de triptofano (Trp) durante 6 horas. La traduccion se inhibe en respuesta al agotamiento del triptofano en los MEF de tipo natural pero no en los que tienen GCN2'/_ (panel superior izquierdo). A continuacion las DC activadas con poli I:C durante 2 horas se someten a privacion durante 6 horas (se mantuvo poli I:C durante la privacion). Contrariamente a los MEF, las DC activadas expuestas al agotamiento de triptofano, no presentan ninguna inhibicion de la traduccion durante al menos 6 horas (panel superior derecho). Se muestran controles sin puromicina ni cicloheximida (chx). Se presentan inmunotransferencias de p-actina como control de carga igual. Tambien se monitorizaron P-eIF2-a y eIF2-a en los MEF y las DC de tipo natural y con GCN2'/'. Se observa fosforilacion del eIF2-a en respuesta al agotamiento de triptofano en los MEF de tipo natural, pero no en los MEF o las DC con GCN'/_ (panel inferior).

Figura 7. La desfosforilacion del eIF2-a es esencial para la produccion normal de IFN-p y la inhibicion de caspasa-3 en las DC. a) Se cuantifico IFN-p por ELISA en las DC de medula osea de tipo natural y con PKR'/_ estimuladas con poli I:C durante diferentes periodos. La produccion de IFN-p en las celulas con PKR'/_ se reduce significativamente en comparacion con las celulas de tipo natural, lo que confirma el requisito de PKR para este proceso (panel izquierdo). Se cuantifico IFN-p en las DC estimuladas con poli I:C o LPS durante 8 horas, en presencia o ausencia del inhibidor de PP1/GADD34, salubrinal (anadido 2 horas antes de la estimulacion) (panel derecho). Por tratamiento con salubrinal, se reduce drasticamente la secrecion de IFN-p en las DC activadas, lo que indica que el control de la fosforilacion del eIF2-a durante la activacion de PKR es esencial para la produccion normal de IFN-p. b) La escision de caspasa-3 se revelo por inmunotransferencia en las DC estimuladas con poli I:C o LPS durante 8 horas, en presencia o ausencia de salubrinal (anadido 2 horas antes de la estimulacion). El tratamiento con salubrinal solo induce un aumento masivo en los niveles totales de caspasa-3 (visualizada como una banda a 35 kDa) y su forma activa escindida (17 kDa). Los tratamientos con poli I:C o LPS disminuyen la expresion de caspasa-3 y la escision inducida por salubrinal solo, probablemente debido a la induccion de GADD34 en las DC activadas. Se muestra la inmunotransferencia de p-actina como un control de carga igual.

Figura 8. Las DC activadas deficientes en GADD34 son incapaces de producir IFN-p e IL-12. Las DC de tipo natural y con GADD34'/_ fueron estimuladas con poli I:C durante diferentes periodos antes de inmunotransferencia para P-eIF2-a, eIF2-a y PKR. En todos los tipos de celulas, los niveles de PKR disminuyen considerablemente durante la maduracion de las DC, mientras que eIF2-a se reduce y fosforila considerablemente (panel superior). El IFN-p y la IL-12 se cuantificaron por ELISA en las DC de medula osea de tipo natural y con GADD34'/_ y estimuladas con poli I:C o LPS durante un periodo diferente. La produccion de IFN-p e IL-12 en GADD34'/_ se reduce significativamente en comparacion con las celulas de tipo natural, confirmando asf el requisito de GADD34 para este proceso y explicando la escasa expresion de PKR en estas celulas (PKR es inducible por IFN).

Figura 9: Se requiere GADD34 para la produccion de citoquinas (IFN-p e IL-6) por los MEF estimulados con poli I:C. B) Despues de 6 horas de estimulacion con poli I:C, se cuantificaron por ELISA, IFN-p (panel izquierdo) e IL-6 (panel derecho) en lfquidos sobrenadantes de cultivos celulares de los MEF de tipo natural y con GADD34aC/aC.

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Las muestras de simulacion son muestras tratadas solo con lipofectamina. Los datos son el valor medio ± SD de cinco (IFN-p) y tres (IL-6) experimentos independientes. C) Los MEF de tipo natural y con GADD34aC/aC se trataron con poli I:C durante los periodos indicados, se extrajo el RNA total y se realizaron PCR cuantitativas en cDNA. Se calculo el numero de veces de aumento de los transcritos indicados en comparacion con un valor = 1 para cada una de las muestras de simulacion (tratadas solo con lipofectamina). Los transcritos de IFN-p, IL-6 y PKR se sometieron a una sobrerregulacion por estimulacion con poli I:C tanto en los MEF de tipo natural como con GADD34aC/aC y, en los periodos finales, incluso mas en los MEF con GADD34aC/aC que en los de tipo natural. El nivel de transcritos de cistatina C permanecio aproximadamente constante por tratamiento con poli I:C tanto en los MEF de tipo natural como con GADD34aC/aC. Los datos son representativos de dos experimentos independientes con resultados similares. D) Los MEF de tipo natural y con GADD34aC/aC se transfectaron durante una noche con un plasmido que llevaba la secuencia de GADD34 de muridos y luego se trataron con poli I:C durante 6 horas. La produccion de FN- p se cuantifico por ELISA en los lfquidos sobrenadantes de cultivos celulares (panel izquierdo), mientras que la desfosforilacion eficaz del eIF2-a se comprobo por inmunotransferencia (panel derecho). Se muestra uno de los tres experimentos independientes con resultados similares.

Figura 10. La infeccion por CHIKV y la produccion de IFN-p se controlan por GADD34 en los MEF. A) Los MEF

de tipo natural y con GADD34aC/aC fueron expuestos a 10 o 50 MOI de CHIKV durante 24 horas o 48 horas y la infeccion productiva se estimo por expresion de GFP. B) La produccion de IFN-p por los MEF de tipo natural y con GADD34aC/aC expuestos a CHIKV se cuantifico por ELISA en los lfquidos sobrenadantes de cultivos celulares. C) Se anadio IFN-p de muridos 3 horas antes de la infeccion de los MEF de tipo natural y con GADD34aC/aC por CHIKV (10 MOI). La infeccion productiva se estimo por expresion de GFP, 24 horas despues de la exposicion a CHIKV. Los datos representados en A, B y C son los valores medios ± SD por triplicado. Se muestra uno de dos resultados independientes con resultados similares.

Figura 11. Infeccion por CHIKV en neonatos de raton. Se inocularon por via intradermica a neonatos de raton de tipo natural (FVB) y con GADD34aC/aC (de 12 dfas) 106 PFU de CHIKV y se observo su letalidad (n = 14 por grupo).

Ejemplo 1:

Materiales y Metodos Ratones

Se adquirieron ratones C57BL/6 machos de 6 semanas a Charles River Laboratories. Se obtuvieron ratones TLR-3'/_ de L. Alexopoulou (CIML, Marsella), ratones IFN-a/p R'/_ de M. Dalod (CIML, Marsella), medula osea de raton MDA- 5-/' de M. Colonna (Universidad de Washington) y medula osea de raton PKR'/_ de Caetano Reis e Sousa (Cancer Research UK, Londres).

Cultivo celular

Se obtuvieron las DC procedentes de medula osea y se cultivaron como se ha descrito previamente50. Se cultivaron celulas NIH3T3 en RPMI 1640 (GIBCO) suplementado con FCS al 10% (HyClone, PERBIO), 100 unidades/mL de penicilina y 100 pg/mL de estreptomicina (GIBCO). Se cultivaron los MEF de tipo natural y con PKR'/_ (de Caetano Reis e Sousa) en DMEM, FCS al 10%, penicilina/estreptomicina. Se cultivaron los MEF de tipo natural y con GCN2'/_ (de David Ron) en RPMI, FCS al 10%, penicilina/estreptomicina, aminoacidos no esenciales MEM (GIBCO) y beta- mercaptoetanol 55 pM. Para los experimentos de privacion de triptofano, se cultivaron los MEF y las DC durante el tiempo indicado en medio RPMI 1640 - triptofano (21875, GIBCO). Todas las celulas se cultivaron a 37°C y CO2 al 5%.

Compuestos quimicos

Se trataron los MEF, NIH3T3 y las DC inmaduras durante el tiempo indicado con 10 pg/mL de poli I:C (InvivoGen), solo o en combinacion con lipofectamina 2000 (Invitrogen). Se anadieron 2 pg/mL de tunicamicina (SIGMA) a las DC durante 2 horas; se anadio 4 horas antes de la recoleccion MG132 2 pM (BIOMOL International) a las DC y a NIH3T3; 4 horas antes de la recoleccion se anadieron salubrinal 75 pM (Calbiochem) o tautomicina 100 nM (Calbiochem) a las DC; se anadio arsenito de sodio 500 pM (SIGMA) durante 30 minutos a las DC, a NIH3T3 y a los MEF; 1 hora antes de la recoleccion se anadio LY294002 50 pM (Calbiochem) a las DC. Las DC inmaduras se trataron durante el tiempo indicado con 100 ng/mL de LPS (SIGMA).

Hibridacion con micromatrices de Affymetrix y extraccion de datos

Se extrajo el ARN total de las DC de medula osea en diferentes periodos despues de estimulacion con poli I:C usando el kit RNeasy miniprep (Qiagen). Para cada condicion se emplearon 100 ng de RNA total para sintetizar cDNA bicatenario usando dos reacciones sucesivas de transcripcion inversa de acuerdo con los protocolos estandar de Affymetrix (GeneChip Two-Cycle Target Labeling, Affymetrix). La amplificacion lineal con T7-RNA-polimerasa y el marcaje con biotina se realizaron por transcripcion in vitro por procedimientos estandar de Affymetrix. El cRNA marcado con biotina resultante se fragmento e hibrido al chip de micromatrices genicas de 39.000 oligonucleotidos MOE 430 2.0 del genoma de raton de Affymetrix durante 16 horas a 45°C. Despues de la hibridacion, la matriz de sondas se lavo y tino en una estacion de fluidos y se exploro inmediatamente en un escaner Affymetrix GCS 3000

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GeneArray. Los datos generados del escaneo se analizaron a continuacion utilizando el programa informatico MicroArray Suite (MAS 5.0, Affymetrix) y se normalizaron utilizando el algoritmo GC-RMA. El analisis bioinformatico se realizo utilizando el programa GeneSpring GX 9.0 (Agilent).

Cuantificacion de mRNA por RT-PCR en tiempo real

Se aislo el RNA total de las DC usando el kit RNeasy miniprep (Qiagen). Se sintetizo cDNA a partir de muestras de RNA usando la transcriptasa inversa Superscript II (Invitrogen). Se realizo una PCR cuantitativa en tiempo real en tampon completo de pCr SYBR Green (PE Biosystem) usando 200 nM de cada cebador espedfico. Se anadio un total de 20 pL de mezcla de PCR a 5 pL de molde de cDNA y la amplificacion se rastreo por incorporacion de SYBR Green utilizando un sistema de deteccion de secuencias de Stratagene. La concentracion de cDNA en cada muestra se normalizo usando HPRT. Tambien se realizo rutinariamente un control sin molde. Se generaron los cebadores utilizados para la amplificacion de genes (disenados con el programa informatico Primer3).

Medida de la intensidad de la traduccion

El marcaje con puromicina para medir la intensidad de la traduccion se realizo usando 10 pg/mL de puromicina (SIGMA, min 98% por TLC, cultivo celular analizado, P8833, diluida en PBS) en el medio de cultivo y las celulas se incubaron durante 10 minutos a 37°C y CO2 al 5%. Cuando se indica, se anadio cicloheximida 25 pM (SIGMA) 5 minutos antes de la puromicina. Las celulas se recogieron entonces, se centrifugaron a 4°C y se lavaron con PBS fno antes de la lisis celular y de inmunotransferencia con el anticuerpo 12D10.

Inmunotransferencia

Las celulas se lisaron en Triton X-100 al 1%, Hepes 50 mM, NaCl 10 mM, MgCh 2,5 mM, EDTA 2 mM, glicerol al 10%, PMSF 1 mM, suplementado con comprimidos de un coctel completo de inhibidores de miniproteasa (Roche). La cuantificacion de protemas se realizo utilizando el ensayo de protemas BCA (Pierce). Se cargaron 25-50 pg de material soluble en Triton X-100 en SDS-PAGE con gradiente de 2% -12% antes de la deteccion por inmunotransferencia y quimioluminiscencia (SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate, Pierce). La extraccion nuclear se realizo utilizando el kit Nuclear Complex Co-IP (Active Motif). Los anticuerpos policlonales de conejo contra ATF4 (CREB-2, C-20) y eIF2-a (FL-315) procedfan de Santa Cruz Biotechnology, asf como los anticuerpos monoclonales de raton contra GADD34 (C-19) y PKR (B-10). Los anticuerpos policlonales de conejo contra P-eIF2-a (Ser 51) y caspasa-3 procedfan de BioSource y Cell Signalling Technology, respectivamente. Los anticuerpos monoclonales de raton contra p-actina e histona H1 procedfan de SIGMA y Upstate, respectivamente. Los anticuerpos secundarios procedfan de Jackson ImmunoResearch Laboratories. La cuantificacion de la fosforilacion del eIF2-a se realizo utilizando el programa informatico Multi Gauge (Fujifilm).

Inmunocitoquimica

Las DC se recolectaron y dejaron que se adhirieran a portaobjetos tratados con Alcian Blue al 1% durante 10 minutos a 37°C, se fijaron con paraformaldefndo al 3% en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente, se permeabilizaron con saponina al 0,5% en PBS/FCS al 5%/glicina 100 mM durante 15 minutos a temperatura ambiente y se tineron 1 hora con el anticuerpo primario indicado. El anticuerpo policlonal de cabra contra eIF4A (N- 19) procedfa de Santa Cruz; el anticuerpo monoclonal de rata contra Lamp2 procedfa de I. Mellman's lab. Todos los anticuerpos secundarios de Alexa (tincion de 30 minutos) procedfan de Molecular Probes (Invitrogen). Se acoplo poli I:C con Cy5 utilizando el kit de marcaje LabelT Cy5 (Mirus). La inmunofluorescencia y la microscopfa confocal (utilizando el modelo de microscopio LSM 510; Carl Zeiss MicroImaging) se realizaron utilizando un objetivo de 63 aumentos y acompanadas de un programa informatico de formacion de imagenes.

Hibridacion in situ de mRNA

La formacion de granulos de estres se detecto por hibridacion in situ con oligo-dT (Alexa Fluor 555 dT18, Invitrogen). Las celulas se fijaron con PFA, se permeabilizaron con metanol 10 minutos a 20°C y se incubaron con oligodT durante 4 horas a 43°C. A continuacion, se realizo una tincion con los anticuerpos primarios y secundarios.

ELISA de IFN-P

La cuantificacion de IFN-p en el lfquido sobrenadante de cultivo de las DC (diluido 5 veces) se realizo usando el kit de ELISA del interferon beta de raton (PBL InterferonSource) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Analisis por citometria de flujo

Las celulas se tineron con anticuerpos espedficos para marcadores de superficies celulares: CD86-biotina, IA/IE-PE y CD11c-APC (BD Pharmingen) (30 minutos a 4°C, en PBS/FCS al 1%). Despues del lavado, las celulas se tineron con estreptavidina PerCP-Cy5.5 (BD Pharmingen) (20 minutos a 4°C, en PBS/FCS al 1%), despues se lavaron y se fijaron en paraformaldefndo al 2% en PBS. Se recogieron los episodios en un FACScalibur (Becton Dickinson) y los datos se adquirieron utilizando el programa informatico CellQuest (BD Biosciences) y se analizaron utilizando el programa informatico FlowJo.

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Resultados

La estimulacion de las DC por poli I:C induce parte de los genes de la ISR

La smtesis de protemas esta estrechamente regulada en las DC activadas procedentes de medula osea de raton [Lelouard, H. et al., 2007]. Para identificar las moleculas potenciales implicadas en este control, se realizo un analisis de la expresion de todo el genoma de las DC estimuladas con poli I:C utilizando matrices Affymetrix Mouse Genoma 430 2.0. Se encontro que fueron fuertemente inducidos al menos nueve transcritos, expresados tfpicamente durante la respuesta a protemas desplegadas (UPR) inducida por tunicamicina [Harding, H. P. et al., 2003; Okada, T., et al., 2002; Marciniak, S. J. et al., 2004]. En particular, los transcritos que codifican los factores de transcripcion ATF4, ATF3 y CHOP (Ddit3/GADD153) asf como MyD116 (GADD34), triptofanil-tRNA-sintetasa (Wars), el componente de COP2, Sec23b y la isomerasa Eroll unida por disulfuros y todos fueron sobrerregulados. La sobrerregulacion de estos transcritos se confirmo por RT-PCR cuantitativa (qPCR), lo que demuestra la existencia de una firma de la expresion genica relacionada con UPR en las DC estimuladas con poli I:C.

La induccion de ATF4 y CHOP (Ddit3/GADD153) es una de las caractensticas de la UPR [Harding, H.P. et al., 2000]. Por PCR cuantitativa (qPCR) se encontro que la expresion del mRNA de ATF4 y CHOP aumentaba respectivamente 2 y 8 veces (Fig. 1a y 1b) en respuesta a poli I:C. El mRNA de ATF4 se expresa normalmente en celulas no estresadas pero se traduce mal. Sin embargo, por fosforilacion del eIF2-a mediada por estres, se puede observar una rapida smtesis de la protema ATF4 [Harding, H.P. et al., 2000; Scheuner, D. et al., 2001; Lu, P.D., et al., 2004]. La smtesis de ATF4 induce la expresion de CHOP/GADD153, que a su vez provoca la transcripcion de muchos genes diana aguas abajo importantes para la respuesta a una variedad de estres que da como resultado la detencion del crecimiento o el dano al DNA (GADD) [Marciniak, S. J. et al. 2004]. Por tanto, los inventores han monitorizado los niveles de ATF4 por inmunotransferencia durante la activacion de las DC. La traduccion de ATF4 fue sobrerregulada considerablemente por estimulacion con poli I:C y la protema se detecto mayormente en el nucleo despues de 8 horas de estimulacion. Curiosamente, los niveles de induccion fueron similares a los inducidos por la tunicamicina (Fig. 1a). De este modo, la expresion de ATF4 es inducida por deteccion de poli I:C y conduce a la transcripcion de CHOP y sus efectores aguas abajo.

Sobrerregulacion de GADD34 en las DC activadas

Una de las dianas principales aguas abajo de CHOP es GADD34 (MyD116), que sirve para aliviar la represion de la traduccion durante el estres en ER [Marciniak, S. J. et al., 2004; Novoa, I., et al., 2001; Novoa, I. et al., 2003]. La GADD34 inhibe la subunidad catalftica de la protema fosfatasa 1 (PP1) que desfosforila el eIF2-a. La expresion de PP1 y GADD34 en las DC activadas fue monitorizada por qPCR (Fig. 1c y 1d). La expresion del mRNA de PP1 se aumento moderadamente por exposicion a poli I:C. Por el contrario, la transcripcion del mRNA de GADD34 se potencio al menos 14 veces durante la maduracion. La GADD34 contiene dos secuencias PEST que promueven la degradacion rapida mediada por proteasoma. Por tanto, era necesaria la inhibicion del proteasoma por MG132 para permitir la deteccion de GADD34 en extractos celulares (Fig. 1d). Como era de esperar del analisis transcripcional, se encontro que la protema se acumulaba progresivamente durante la activacion de las DC, alcanzando un maximo despues de 8 horas de estimulacion y en cantidades comparables a los niveles inducidos por tunicamicina (Fig. 1d). Por tanto, la estimulacion con poli I:C induce en las DC la transcripcion y la smtesis de varios componentes importantes de la UPR incluyendo ATF4, CHOP y GADD34. Es importante destacar que GADD34, que es un potente cofactor de PP1, se considera parte del bucle de retroalimentacion negativa que reduce el estres traducional durante la UPR [Novoa, I., et al., 2001; Novoa, I. et al., 2003]. Por el contrario, el cofactor constitutivo de PP1, CReP (represor constitutivo de la fosforilacion del eIF2-a [Jousse, C. et al., 2003]) fue inducido solo muy modestamente por la maduracion de las DC (Fig. 1e), lo que sugiere que esta molecula no tiene un papel importante durante la deteccion de poli I:C.

El eIF2-a es desfosforilado durante la activacion de las DC

La smtesis de protemas en las DC se cuantifico usando marcaje con puromicina seguido por inmunotransferencia con el mAb anti-puromicina 12D10 (Fig. 2a). Como se demostro anteriormente para las DC activadas con LPS, la smtesis de protemas se potencia en las primeras horas de estimulacion con poli I:C seguida por una reduccion despues de 12-16 horas de activacion [Lelouard, H. et al., 2007]. La inmunotransferencia y la cuantificacion del eIF2- a fosforilado (P-eIF2-a) y el total tambien se realizaron en los mismos extractos de las DC (Fig. 2b). Curiosamente se encontraron que los niveles de P-eIF2-a se hadan reducido gradualmente durante la estimulacion con poli I:C.

La perdida de P-eIF2-a en celulas tratadas con poli I:C, que en este ultimo periodo de maduracion muestran una tasa de smtesis de protema reducida, indica que la fosforilacion del eIF2-a probablemente no esta implicada en la inhibicion de la traduccion. Sin embargo, puesto que la intensidad de fosforilacion del eIF2-a estaba inversamente correlacionada con los niveles de expresion de GADD34, los inventores analizaron de que forma la inhibicion dirigida de la actividad del complejo PP1/GADD34 con el inhibidor espedfico salubrinal [Boyce, M. et al., 2005] podna afectar al eIF2-a en las DC. El salubrinal solo induda la fosforilacion del eIF2-a (Fig. 2c), que se potenciaba considerablemente en presencia de poli I:C soluble. Estos resultados se confirmaron usando tautomicina, otro inhibidor de PP1. Por tanto, las eIF2-a-quinasas son funcionales en las DC y la actividad de PP1 es responsable de la desfosforilacion del eIF2-a a traves de la expresion de GADD34 potenciada desencadenada por la deteccion de

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poli I:C

La PKR es funcional y fosforila el eIF2-a en las DC activadas

La PKR actua como un transductor de senal en la respuesta proinflamatoria a diferentes productos microbianos, incluyendo LPS y dsRNA. Alternativamente, la activacion de la PKR durante la infeccion por dsRNA viral da como resultado la fosforilacion del eIF2-a y la inhibicion de la smtesis de protemas. Para obtener mas informacion sobre el papel de la PKR durante la activacion de las DC, las celulas de tipo natural y con PKR-/- fueron monitorizadas para la fosforilacion del eIF2-a por estimulacion con poli I:C (Fig. 3a). Las DC inmaduras mostraron niveles relativamente bajos de PKR, que fueron fuertemente sobrerreguladas por maduracion. Curiosamente, los niveles de PKR estaban inversamente correlacionados con la intensidad de fosforilacion del eIF2-a, que se redujo gradualmente durante la maduracion. En las DC con PKR-/- no activadas, los niveles de P-eIF2-a eran proximos a los valores normales, lo que confirma que otras quinasas distintas de la PKR fosforilan el eIF2-a en las DC inmaduras (Fig. 3a). Sin embargo, por exposicion a poli I:C, la fosforilacion del eIF2-a fue casi abolida en estas celulas, confirmando que la PKR media normalmente en la fosforilacion del eIF2-a por deteccion de poli I:C, pero su actividad es contrarrestada por la activacion de PP1. Este mecanismo tambien era capaz de limitar la fosforilacion del eIF2-a por suministro directo de poli I:C en el citosol de las DC (Fig. 3b), un modo de direccionamiento que induce la fosforilacion del eIF2-a dependiente de PKR en los MEF de tipo natural y en las celulas NIH3T3 (Fig. 3c). Aunque la delecion de PKR afecto a los niveles totales de P-eIF2-a en los MEF, la estimulacion con poli I:C no influyo en su fosforilacion en comparacion con las celulas de control, lo que indica que la desfosforilacion inducida por la deteccion de dsRNA en las DC no se produce en los fibroblastos. De acuerdo con esta observacion, se encontro que los niveles de GADD34 en celulas NIH3T3 no cambiaban si no disminrna la respuesta a la lipofeccion con poli I:C (Fig. 3d).

La smtesis de protemas no se inhibe en las DC expuestas a poli I:C citosolico

Se monitorizo la traduccion en las DC y los fibroblastos expuestos a poli I:C soluble o lipofectado durante varias horas. La lipofeccion de poli I:C en los MEF (de tipo natural y con PKR-/-) y en NIH3T3 indujo eficazmente la detencion de la traduccion dependiente de PKR en 4 a 8 horas (Fig. 4a). Curiosamente, aunque poli I:C soluble no afectaba a las celulas NIH3T3, la traduccion fue inhibida en los MEF de tipo natural, lo que sugiere que dsRNA soluble puede acceder eficazmente al citosol de estas celulas e interactuar con PKR. En el caso de las DC, y como fue anticipado por los bajos niveles de fosforilacion del eIF2-a inducidos por lipofeccion con poli I:C, la traduccion no fue inhibida incluso despues de 8 horas de exposicion (Fig. 4a). Curiosamente, mientras se verifico por FACS que cantidades equivalentes de poli I:C eran suministradas en las celulas por lipofeccion (Fig. 4b), los inventores visualizaron la entrada de poli I:C. Ademas de detectar la acumulacion de poli I:C lipofectado en grandes agregados citosolicos, los inventores tambien pudieron mostrar que el poli I:C soluble penetra en el citoplasma de las DC y aparece como motitas situadas lejos de los endo/lisosomas positivos a LAMP2, un fenomeno nunca observado en las celulas NIH3T3.

Este acceso relativamente eficaz de poli I:C soluble al citosol de las DC sugiere que la PKR podna ser activada simultaneamente con TLR3 y MDA5. Esta hipotesis se apoya en la observacion de que el poli I:C soluble acentua fuertemente la fosforilacion del eIF2-a en presencia de salubrinal, lo que inhibe espedficamente la actividad de PP1/GADD34 (Fig. 2c). Por otra parte, la smtesis de proteinas en las DC estimuladas con poli I:C se redujo fuertemente en presencia de salubrinal (Fig. 4c), lo que sugiere que las DC activadas dependen de la induccion de la actividad de PP1/GADD34 para resistir la detencion de la traduccion dependiente de PKR desplazando el equilibrio bioqmmico hacia la desfosforilacion del eIF2-a.

Vias de transduccion de las senales implicadas en la sobrerregulacion de la transcripcion de GADD34

Los inventores utilizaron las DC generadas por ratones que caredan de los sensores de dsRNA, TLR3 y MDA5, para determinar la cascada de senalizacion responsable del desencadenamiento de la desfosforilacion del eIF2-a (Fig. 5). Las DC fueron estimuladas con poli I:C como se ha indicado antes de la inmunotransferencia para P-eIF2-a (Fig. 5a). La inactivacion solo de TLR3 o MDA5 no afecto la fosforilacion del eIF2-a en comparacion con las celulas de control. Por tanto, la cascada que induce la expresion de GADD34 puede ser desencadenada probablemente por la estimulacion de cualquiera de estos receptores, lo que es probable que ocurra en los endosomas o por medio del pase de poli I:C en el citosol. Recientemente, los inventores han mostrado que es necesaria la activacion de la quinasa PI3 para lograr la maduracion total de las DC en respuesta al ligamiento del TLR y que esta implicada en el control de la sobrerregulacion de la traduccion [Lelouard, H. et al., 2007]. Por tanto, los inventores monitorizaron la fosforilacion del eIF2-a en presencia del inhibidor de PI3K, LY294002 (LY) (Fig. 5a). El tratamiento con LY evito eficazmente la desfosforilacion del eIF2-a, lo que indica que la senalizacion de PI3K y la induccion de la via de respuesta al estres en las DC activadas estan estrechamente unidas. La fase relativamente tardfa de maduracion en la que eIF2-a es desfosforilado llevo a los inventores a investigar si la actividad autocrina de IFN-p podna estar implicada en este proceso. Aunque se requiere la senalizacion del receptor de IFN para conseguir la maduracion normal de las DC y la abundante produccion de IFN-p (Fig. S3), no se observo ningun cambio en la fosforilacion del eIF2-a en las DC con receptor-'' de IFN-ap activado con poli I:C (IFN-ap R --) (Fig. 5b). Por el contrario, la cuantificacion por qPCR indico que los niveles de mRNA de GADD34 se redujeron de dos a seis veces en comparacion con las celulas de tipo natural (Fig. 5c). Curiosamente, tambien se mostro que la senalizacion del receptor de IFN-p era responsable de la fuerte sobrerregulacion de la PKR durante la maduracion de las DC (Fig.

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5b). Esta falta de sobrerregulacion de la PKR podna por tanto compensar la perdida relativa de la actividad de GADD34 en las DC con IFN-ap R-/" estimuladas, explicando por que la velocidad de desfosforilacion del eIF2-a permanece inalterada o incluso mayor en los periodos finales. Por tanto, el efecto autocrino de IFN-p sobre las DC contribuye significativamente a la induccion de GADD34.

Las DC activadas resisten el estres que induce la inhibicion de la traduccion

Como se observa con poli I:C, la desfosforilacion del eIF2-a es probable que aumente la resistencia de las DC a otro estres que provoca la detencion de la traduccion. El tratamiento con arsenito induce la formacion de granulos de estres (SG), que sirven como depositarios de mRNA y los factores de traduccion y que requieren la fosforilacion del eIF2-a para su formacion [Kedersha, N. & Anderson, P., 2002; Anderson, P. & Kedersha, N, 2002; Kedersha, N. et al., 2005]. La induccion de los SG por arsenito se visualizo por la deteccion por microscopfa confocal de mRNA de poli-A y eIF4a durante estimulacion de las DC por poli I:C o LPS (Fig. 6a). Se encontraron Sg en casi el 100% de las DC no activadas, una proporcion que se redujo progresivamente hasta 15% despues de la activacion. Curiosamente, la intensidad y la cinetica de la formacion de los SG reflejo perfectamente el estado de fosforilacion del eIF2-a y de la expresion de GADD34 inducidas por poly I:C o LPS (Fig. 6a). Sorprendentemente, las cineticas de la desfosforilacion del eIF2-a en las DC estimuladas con LPS fueron impresionantemente diferentes de las inducidas por poli I:C.

Tambien se sabe que la privacion de aminoacidos induce la fosforilacion del eIF2-a. Curiosamente, el agotamiento del triptofano mediado por la enzima indolamina-2,3-dioxigenasa (IDO), que se produce en las DC activadas, promueve la tolerancia periferica provocando la anergia de los linfocitos T [Mellor, A.L. & Munn, D.H., 2004; Puccetti, P., 2007]. La GCN2-quinasa en linfocitos T es parcialmente responsable de este fenomeno detectando los triptofano- tRNA desacilados y provocando la fosforilacion del eIF2-a [Munn, D. H. et al., 2005]. Los inventores han analizado si la activacion de las DC evitana tambien la detencion de la traduccion por privacion de triptofano. La inhibicion de la traduccion y la fosforilacion del eIF2-a en respuesta al agotamiento de triptofano se observaron claramente en los MEF de tipo natural cultivados en medio libre de triptofano durante 6 horas pero no en los MEF con GCN2'/_ (Fig. 6b). En los MEF, la inhibicion de la traduccion ya era detectable despues de 2 horas de privacion y total despues de 8 horas, simultaneamente con una potenciacion de la fosforilacion del eIF2-a. Basandose en estas observaciones, se activaron las DC durante 2 horas con poli I:C antes de la privacion de triptofano (manteniendo poli I:C durante la privacion). Contrariamente a los MEF, las DC activadas, sometidas a agotamiento de triptofano, no mostraron ninguna inhibicion de la traduccion durante 6 horas, presumiblemente debido a la induccion de GADD34 y su posterior control de la fosforilacion del eIF2-a (Fig. 6b). La expresion inducible en las DC de triptofanil-tRNA- sintetasa (Wars) en esos periodos tambien podna favorecer la smtesis de protemas en las condiciones de privacion de triptofano y acentuar el fenotipo. Desagraciadamente, los autores de la presente invencion no pudieron monitorizar la actividad de la traduccion en las DC no estimuladas, ya que las condiciones experimentales de privacion, usadas en la presente invencion, indujeron su maduracion espontanea y/o muerte celular. Por tanto, las DC activadas muestran espedficamente una resistencia aguda a la mayor parte de los estres que inducen la fosforilacion del eIF2-a y la inhibicion de la traduccion mediada por la caperuza.

Fosforilacion del eIF2-a y funcion de las DC

Se ha demostrado que la PKR es un importante mediador de la produccion y apoptosis de citoquinas a traves de la fosforilacion del eIF2-a y la activacion de la via p38, especialmente por deteccion de LPS por macrofagos [Hsu, L.C. et al., 2004]. Por tanto, los inventores evaluaron el impacto de la fosforilacion del eIF2-a sobre la expresion de IFN-p, la citoquina principal producida por las DC por estimulacion con poli I:C [Diebold, S. S. et al., 2007] (Fig. 7a). Las DC con PKR _/' estimuladas con poli I:C mostraron niveles extremadamente reducidos de secrecion de IFN-p en comparacion con las celulas de tipo natural, confirmando asf el requisito de la activacion de la PKR para este proceso [Samuel, C. E., 2001]. A continuacion, los inventores analizaron el impacto de la inhibicion de PP1/GADD34 sobre la secrecion de IFN-p por las DC. Despues de tratamiento con salubrinal, la secrecion de IFN-p se redujo drasticamente en las DC tratadas con poli I:C, lo que indica que la fosforilacion incontrolada del eIF2-a durante la activacion de la PKR podna perjudicar la produccion normal de IFN-p. Por tanto, se requiere la expresion de GADD34 para compensar la activacion simultanea de la PKR y lograr la maduracion funcional durante la activacion de las DC.

Los inventores analizaron ademas si la fosforilacion del eIF2-a desregulada tambien podna conducir a la apoptosis en las DC activadas [Scheuner, D. et al., 2006; Rintahaka, J., et al., 2008]. Las DC fueron expuestas a diversos estfmulos y tratamientos farmacologicos previos a la deteccion de caspasa-3 por inmunotransferencia (Fig. 7b). Aunque la adicion de poli I:C o LPS tuvo poco efecto, el tratamiento con salubrinal solo indujo un aumento masivo de los niveles totales de caspasa-3 y de su producto activo escindido, generalmente considerado como una etapa importante para la iniciacion de la apoptosis. Asf, la fosforilacion del eIF2-a parece tener un efecto directo sobre la smtesis y la escision de caspasa-3. Los tratamientos tanto con salubrinal como con poli I:C o LPS tuvieron un efecto menor que con salubrinal solo, debido probablemente a la induccion de GADD34 en las DC activadas que las hace mas resistentes a la inhibicion inducida por salubrinal. Estos experimentos confirman la necesidad de controlar la fosforilacion del eIF2-a para evitar la induccion anormal de caspasa-3, una situacion que normalmente sena evitada por la expresion de GADD34 y la desfosforilacion del eIF2-a en las DC activadas.

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La expresion de GADD34 es necesaria para producir citoquinas en fibroblastos en respuesta a dsRNA

La deteccion de poli I:C citosolico en fibroblastos embrionarios de raton (MEF) promueve tambien una detencion de la traduccion de mRNA dependiente de la PKR y una respuesta similar a ISR, durante la cual, ATF4 y su diana aguas abajo, el cofactor fosfatasa-1 (PP1) y la protema 34 inducible por dano al DNA y deteccion del crecimiento (GADD34/MyD116/Ppp1r15a) estan fuertemente sobrerreguladas. Curiosamente, aunque la mayor parte de la traduccion de mRNA es fuertemente inhibida por poli I:C, en estas condiciones aumento considerablemente la smtesis de IFN-beta (IFN-p), interleuquina-6 (lL-6) y PKR. Los inventores demostraron ademas que la expresion dependiente de PKR de GADD34 es absolutamente necesaria para la traduccion normal de los mRNA de IFN-p e IL- 6, aunque prescindible para la neo-smtesis de la PKR (Fig. 9). Los inventores recapitularon estas observaciones utilizando el CHIKV como un modelo patologicamente relevante y mostraron que los MEF deficientes en GADD34 son extremadamente permisivos al virus debido a su incapacidad para producir interferon tipo I (Fig. 10). Los inventores mostraron ademas que, aunque los ratones normales de l2 dfas son totalmente resistentes a la infeccion por CHIKV, la deficiencia en GADD34 induce un 100% de mortalidad entre los neonatos de la misma edad (Fig. 11). Las observaciones de los inventores demuestran que la induccion del programa de transcripcion de ATF4 es parte de la respuesta antiviral e implica la existencia de diversos grupos distintos y segregados de mRNA traducidos de forma diferente durante la fosforilacion del eIF2-a inducida por dsRNA.

Conclusion

La inhibicion de la traduccion se produce en respuesta a muchos estreses en los que la actividad celular tiene que ser orientada o suspendida momentaneamente. Los inventores demostraron en la presente invencion que las vfas de defensa celular que implican las diferentes quinasas similares a PKR y la fosforilacion del eIF2-a se inactivan en las DC activadas. Los inventores han mostrado que las celulas tratadas con poli I:C muestran una firma de la expresion genetica que comparte rasgos comunes con una respuesta integrada al estres, incluyendo induccion de CHOP y de GADD34. Curiosamente la induccion de GADD34 tambien fue senalada recientemente en un analisis del transcriptoma de macrofagos infectados con Hysteria monocytogenes [Leber, J. H. et al., 2008], lo que sugiere que su expresion esta asociada a la deteccion de patogenos en diferentes APC. La GADD34 se asocia con la subunidad catalttica de PP1, que desfosforila el eIF2-a y contrarresta la actividad de quinasas similares a PKR.

Durante las presentes investigaciones, los inventores no pudieron identificar una unica via de senalizacion responsable de la induccion de GADD34. Se ha mostrado principalmente que la expresion de GADD34 actua como un bucle de retroalimentacion negativa durante las respuestas de protemas desplegadas (UPR). Tambien se ha informado que las DC expresan niveles inusualmente altos de XBP-1, un factor de transcripcion esencial para la homeostasis del ER durante las UPR [Ron, D. & Walter, P., 2007; Yoshida, H., et al., 2001; Calfon, M. et al., 2002], que es necesario para la supervivencia y funcion normales de las DC, incluyendo la expresion de IFN-p [Iwakoshi, N. N. et al., 2007; Smith, J. A. et al., 2008]. Por otra parte, los inventores han mostrado que la activacion de las DC conduce a un aumento masivo de la traduccion de protemas, asf como a la produccion de numerosas citoquinas, que en su mayona utilizan la via de secrecion mediada por el ER. Curiosamente, LPS y poli I:C inducen de manera diferente GADD34, aunque tambien desencadenan diferentes niveles y cinetica de la produccion de citoquinas. Ademas, la expresion de GADD34 esta disminuida en las DC con IFN-apR'7' activadas, lo que produce niveles reducidos de citoquinas en respuesta a productos microbianos. Finalmente, la desfosforilacion del eIF2-a es evitada por el inhibidor farmacologico de PI3K, LY294002, que tiene tambien un fuerte efecto inhibidor sobre la smtesis de protemas [Lelouard, H. et al., 2007]. Por tanto, la expresion de GADD34 esta estrechamente ligada a la intensidad de la smtesis de protemas y a la produccion de citoquinas en las DC activadas. Es posible que la iniciacion brusca de la smtesis de protemas temprana durante la maduracion de las DC pudiera promover una situacion transitoria similar a las UPR que conducina a la traduccion de ATF4 y posterior expresion de GADD34. Curiosamente, aunque el eIF2-a esta claramente fosforilado en las DC inmaduras, no se observo gran aumento en esta fosforilacion durante la primera fase de activacion que explicara completamente la traduccion de ATF4. Por tanto, la respuesta transcripcional a la deteccion de poli I:C es relativamente diferente de lo que se observa normalmente durante las UPR caracterizadas previamente e implica potencialmente un nuevo mecanismo de senalizacion capaz de inducir la produccion de ATF4.

Los inventores han mostrado que el dsRNA soluble accede rapidamente al citosol de las DC y por lo tanto tiene el potencial de interaccionar tanto con MDA5 como con PKR. La PKR es rapidamente activada por ligandos de TLR que promueven la senalizacion por p38 y NF-kB [Williams, B.R., 2001]. Por tanto, la activacion de PKR es necesaria para conseguir la maduracion funcional de las DC, sin embargo su activacion tambien debena conducir normalmente a la inhibicion de la traduccion por medio de la fosforilacion del eIF2-a. Por tanto, la existencia de la respuesta a ATF4/GADD34 podna adaptarse a los estfmulos microbianos detectados y a los niveles de activacion de PKR requeridos para conseguir la maduracion funcional de las DC. El poli I:C es probablemente un ejemplo extremo, ya que puede inducir la PKR a traves de la senalizacion de TLR y tambien por medio del reconocimiento directo. Este bucle de control negativo sena particularmente importante para evitar la apoptosis prematura y para asegurar una produccion optima de citoquinas.

La induccion de GADD34 tambien podna tener algun efecto protector adicional frente a algunos aspectos de la maduracion de las DC propiamente dichas. De hecho, la indolamina-2,3-dioxigenasa (IDO) y la heme-oxigenasa-I (HO-I) son dos enzimas catabolicas producidas por tumores y las DC maduras, que conforman la respuesta

inmunitaria por el agotamiento de triptofano y porfirina respectivamente en la proximidad de las DC [Munn, D.H. et al., 2005; Uyttenhove, C. et al., 2003; Chauveau, C. et al., 2005; Munn, D. H., 2006]. Los linfocitos T vecinos expuestos a estas condiciones son anergizados o diferenciados a traves de la activacion de GCN2 (agotamiento de triptofano) o HRI (agotamiento de heme). Por tanto, la expresion de GADD34 podna proteger a las DC de los efectos 5 perjudiciales de la privacion de triptofano y tambien probablemente del agotamiento de heme desencadenado por su propia activacion o la activacion de las DC vecinas. Esta especificidad permite que las DC prioricen las vfas de transduccion de la senalizacion que rigen su funcion de inmunidad innata sobre las vfas que protegen normalmente su integridad celular del estres que, si se activan, conducinan a la detencion de la traduccion, apoptosis o anergia en la mayona de los tipos de celulas [Freigang, S., et Al., 2005].

10 Ejemplo 2: La GADD34 es necesaria para controlar la infeccion por el virus de la chikunguna y la produccion de IFN in vitro e in vivo.

Materiales y Metodos

Virus.

Se obtuvieron aislados de CHIKV de individuos durante el brote de CHIKV de 2005-06 en isla Reunion y se 15 amplificaron en celulas C6/36 de mosquito como se describe en [4]. El CHIKV-21 se aislo del suero de un varon recien nacido con encefalopatfa asociada a CHIKV; el CHIKV-27 se aislo del fluido cerebroespinal, CSF, de otro varon recien nacido con encefalopatfa; el CHIKV-115 del suero de una mujer de 24 anos con smtomas clasicos de CHIK. El CHIKV-117 se aislo en el Institut de Medecine Tropicale du Service de Sante des Armees (IMTSSA), Marsella, Francia, durante el brote de CHIKV del 2000 en la Republica Democratica del Congo, del suero de una 20 persona que presentaba smtomas clasicos de CHIK. Los tttulos de las existencias de virus se determinaron por ensayo estandar en placas de celulas Vero y se expresaron como PFU por mL.

Celulas.

Los fibroblastos embrionarios de raton de control y con GADD34-/" fueron infectados con CHIKV con una multiplicidad de infeccion (MOI) de 10 y 50.

25 Animales.

Se obtuvieron ratones FVB endogamicos de Charles River Laboratories (Francia). Los ratones fueron criados de acuerdo con las directrices del Instituto Pasteur para la cna de animales y se mantuvieron en aisladores de nivel 3. A los ratones se les inocularon por via ID en el torax ventral 50 pL de una suspension viral diluida con PBS para ratones adultos y 30 pL para neonatos. Los ratones infectados simuladamente recibieron PBS solo. Los ratones 30 fueron anestesiados con isoflurano (Forene, Abbott Laboratories Ltd, Reino Unido). Se extrajo sangre por puncion cardiaca, despues de lo cual a cada raton se le perfundieron por via intracardfaca 40 mL de PBS a 4°C antes de la extraccion de los organos. Se homogeneizaron los tejidos y los tttulos de virus de cada muestra de tejido se determinaron en celulas Vero por dosis infecciosa citopatica 50 (TCID50) y los tftulos virales en tejidos y en suero se expresaron como TCID50/g o TCID50/mL, respectivamente. Durante todo el proceso experimental se siguieron los 35 principios del buen cuidado de los animales de laboratorio. Se realizaron estudios de mortalidad en grupos de seis ratones y de los tftulos virales en tejidos de cuatro ratones en cada periodo.

Histologia e inmunofluorescencia.

Los organos de raton se congelaron rapidamente en isopentano enfriado con nitrogeno lfquido para preparar criocortes o se fijaron en paraformaldetndo para su incrustacion en parafina. Los tejidos incrustados en parafina se 40 trataron para tincion histologica (hematoxilina y eosina). Para la inmunofluorescencia, las criosecciones se fijaron durante 10 minutos en metanol enfriado con hielo antes de incubacion durante 12 horas a 4°C con los anticuerpos primarios seguido de incubacion durante 1 hora con los anticuerpos secundarios. Se contratineron portaobjetos con Hoechst (Vector Lab). Se usaron los siguientes anticuerpos: anti-colageno policlonal de conejo IV (Chemicon, Temecula CA, 1:200), anti-vimentina policlonal de pollo (Abcam, Cambridge, UK, 1:200), anti-GFAP monoclonal de 45 raton (BD Pharmingen 1:1000 o 1:5000 para ver solamente los limitantes gliales), anrtgeno monoclonal anti- macrofago de rata F4/80 (Abcam, 1:100), anti-PECAM1/CD31 policlonal de conejo (Abcam, 1:400), anti-CHIKV de suero humano que fueron obtenidos y caracterizados por el Centre National de Reference des Arbovirus como positivos para IgM e IgG anti-CHIKV. Las especificidades de los marcadores se confirmaron sistematicamente examinando los cortes en los que el anticuerpo primario estaba reemplazado por el isotipo de control o 50 inmunoglobulinas a la misma concentracion y por inmunotincion de tejidos no infectados de la misma raza de animal. Los portaobjetos se examinaron con un microscopio Zeiss AxioPlan 2 equipado con un sistema ApoTome con el fin de obtener cortes opticos con un grosor de 0,7 pm. Las fotos y los apilamientos Z se obtuvieron con el programa informatico AxioVision 4.5. Cuando era necesario, las imagenes fueron procesadas usando el programa de formacion de imagenes J (
http://rsb.info.nih.gov.gate2.inist.fr/ij/).

55 Resultados

Los fibroblastos tanto de origen humano como de raton constituyen una celula diana principal del CHIKV en la fase

aguda de la infeccion. En ratones adultos con una senalizacion de IFN de tipo I totalmente anulada, la enfermedad asociada al CHIKV es particularmente grave y esta correlacionada con las cargas virales mas altas. Es importante destacar que los ratones con una copia del gen receptor de IFN-a/p (IFNAR) desarrollan una enfermedad leve, reforzando la implicacion de la senalizacion del IFN de tipo I en el control de la replicacion del CHIKV. Por tanto el 5 CHIKV es un patogeno particularmente relevante para confirmar las observaciones de los inventores sobre el papel de la PKR y la GADD34 en el control de la produccion de IFN de tipo I en respuesta al dsRNA. Los MEF de raton de tipo natural y con GADD34aC/aC se expusieron a 106 PFU de CHIKV (intervalo 0,1-50 de la multiplicidad de infeccion [MOI]) durante 24 o 48 horas. Se monitorizaron los lfquidos sobrenadantes de cultivo para determinar la presencia de los IFN de tipo I, mientras se estimo la infeccion productiva por expresion de GFP (Fig. 10 A y B). La infeccion 10 productiva por CHIKV solo se pudo observar a MOI maxima en los MEF de tipo natural, mientras que IFN-p se detecto a MOI baja y se produjo gran cantidad en un mayor intervalo de infeccion. En contraste con estos resultados, se observo un nivel muy alto de replicacion viral en los MEF con GADD34aC/aC, que eran exquisitamente sensibles al CHIKV mostrando una tasa de infeccion del 50% en comparacion con solo el 15% observado en los MEF de tipo natural despues de 24 horas de infeccion (MOI 50). Correlacionada con esta hipersensibilidad, la produccion de IFN- 15 p no se pudo detectar durante la infeccion por CHIKV de los MEF con GADD34aC/aC, lo que indica de nuevo su incapacidad para producir citoquinas en respuesta al dsRNA citosolico, lo que es probable que facilite la replicacion viral en el cultivo. Esta interpretacion esta claramente apoyada por la anulacion similar de la replicacion viral en los MEF tanto de tipo natural como con GADD34aC/aC tratados brevemente con IFN-p antes de la infeccion (Fig. 10C), demostrando que la inactivacion de GADD34 no favorece la replicacion viral en presencia de niveles suficientes de 20 IFN.

Como en los seres humanos, la patogenicidad del CHIKV es fuertemente dependiente de la edad en los ratones, y en ratones neonatos de menos de 12 dfas, el CHIKV induce una enfermedad grave acompanada de una alta tasa de mortalidad [Couderc, 2008]. Se ha mostrado que varios componentes de la respuesta inmunitaria innata tienen un impacto sobre la resistencia de ratones mayores y restringen eficazmente la infeccion por CHIKV y sus 25 consecuencias. Se pusieron inyecciones intradermicas (ID) de 106 PFU del CHIKV a ratones neonatos naturales (FVB) y con GADD34aC/aC para determinar la importancia de la via de GADD34 durante el establecimiento de la respuesta antiviral innata en los animales completos. Como se observo anteriormente para los ratones C57/BL6 [Couderc, 2008], cuando se realizo la inoculacion de CHIKV en neonatos FVB de 12 dfas, se observo una tasa de supervivencia del 100% entre las cnas (Fig. 11). En fuerte contraste con estos resultados, los neonatos con 30 GADD34aC/aC de 12 dfas murieron todos antes de las 72 horas de la infeccion por CHIKV (Fig. 11). Demostrando

ademas que la expresion funcional de GADD34 es un componente clave de la via anti-viral y que esta formando con ATF4 y PKR un modulo de senalizacion especializado en la respuesta de IFN de tipo I a los virus espedficos que incluyen el grupo alfavirus y probablemente otras diversas familias virales que son detectadas por MDA5 y PKR.

Estos resultados muestran que la inhibicion de la formacion del complejo PP1/GADD34 utilizando un inhibidor como 35 se ha definido anteriormente puede ser util para disminuir la capacidad de las celulas para producir citoquinas. Los inhibidores de acuerdo con la invencion se pueden usar por tanto para tratar afecciones inflamatorias, tales como sepsis o afecciones inflamatorias exacerbadas causadas por una enfermedad infecciosa o viral.

Referencias:

A traves de esta solicitud diversas referencias describen el estado de la tecnica a la que pertenece esta invencion. 40 Las descripciones de estas referencias se incorporan en la presente descripcion como referencia.

Alexopoulou, L., Holt, A. C., Medzhitov, R. & Flavell, R. A. Recognition of double-stranded RNA and activation of NF- kappaB by Toll-like receptor 3. Nature 413, 732-8 (2001).

Anderson, P. & Kedersha, N. Stressful initiations. J Cell Sci 115, 3227-34 (2002).

Berlanga, J. J. et al. Antiviral effect of the mammalian translation initiation factor 2alpha kinase GCN2 against RNA 45 viruses. Embo J 25, 1730-40 (2006).

Boyce, M. et al. A selective inhibitor of eIF2alpha dephosphorylation protects cells from ER stress. Science 307, 9359 (2005).

Calfon, M. et al. IRE1 couples endoplasmic reticulum load to secretory capacity by processing the XBP-1 mRNA. Nature 415, 92-6 (2002).

50 Chauveau, C. et al. Heme oxygenase-1 expression inhibits dendritic cell maturation and proinflammatory function but conserves IL-10 expression. Blood 106, 1694-702 (2005).

Chen, J. J. & London, I. M. Regulation of protein synthesis by heme-regulated eIF-2 alpha kinase. Trends Biochem Sci 20, 105-8 (1995).

Connor, J. H., Weiser, D. C., Li, S., Hallenbeck, J. M. & Shenolikar, S. Growth arrest and DNA damage-inducible 55 protein GADD34 assembles a novel signaling complex containing protein phosphatase 1 and inhibitor 1. Mol Cell Biol 21, 6841-50 (2001).

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Couderc T, Chretien F, Schilte C, Disson O, Brigitte M, Guivel-Benhassine F, Touret Y, Barau G, Cayet N, Schuffenecker I, Despres P, Arenzana-Seisdedos F, Michault A, Albert ML, Lecuit M. A mouse model for Chikungunya: young age and inefficient type-I interferon signaling are risk factors for severe disease. PLoS Pathog. 2008 Feb 8;4(2):e29.

Diebold, S. S. et al. Viral infection switches non-plasmacytoid dendritic cells into high interferon producers. Nature 424, 324-8 (2003).

Donze, O. et al. The protein kinase PKR: a molecular clock that sequentially activates survival and death programs. Embo J 23, 564-71 (2004).

Freigang, S., Probst, H. C. & van den Broek, M. DC infection promotes antiviral CTL priming: the 'Winkelried' strategy. Trends Immunol 26, 13-8 (2005). Munn, D. H. Indoleamine 2,3-dioxygenase, tumor-induced tolerance and counter-regulation. Curr Opin Immunol 18, 220-5 (2006).

Gitlin, L. et al. Essential role of mda-5 in type I IFN responses to polyriboinosinic:polyribocytidylic acid and encephalomyocarditis picornavirus. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 8459-64 (2006).

Harding, H. P., Zhang, Y., Bertolotti, A., Zeng, H. & Ron, D. Perk is essential for translational regulation and cell survival during the unfolded protein response. Mol Cell 5, 897-904 (2000).

Harding, H. P. et al. Regulated translation initiation controls stress-induced gene expression in mammalian cells. Mol Cell 6, 1099-108 (2000).

Harding, H. P. et al. An integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress. Mol Cell 11, 619-33 (2003).

Hsu, L. C. et al. The protein kinase PKR is required for macrophage apoptosis after activation of Toll-like receptor 4. Nature 428, 341-5 (2004).

Iwakoshi, N. N., Pypaert, M. & Glimcher, L. H. The transcription factor XBP-1 is essential for the development and survival of dendritic cells. J Exp Med 204, 2267-75 (2007).

Jousse, C. et al. Inhibition of a constitutive translation initiation factor 2alpha phosphatase, CReP, promotes survival of stressed cells. J Cell Biol 163, 767-75 (2003).

Kawai, T. & Akira, S. Innate immune recognition of viral infection. Nat Immunol 7, 131-7 (2006).

Kedersha, N. & Anderson, P. Stress granules: sites of mRNA triage that regulate mRNA stability and translatability. Biochem Soc Trans 30, 963-9 (2002).

Kedersha, N. et al. Stress granules and processing bodies are dynamically linked sites of mRNP remodeling. J Cell Biol 169, 871-84 (2005).

Leber, J. H. et al. Distinct TLR- and NLR-mediated transcriptional responses to an intracellular pathogen. PLoS Pathog 4, e6 (2008).

Lelouard, H. et al. Regulation of translation is required for dendritic cell function and survival during activation. J Cell Biol 179, 1427-39 (2007).

Lu, L., Han, A. P. & Chen, J. J. Translation initiation control by heme-regulated eukaryotic initiation factor 2alpha kinase in erythroid cells under cytoplasmic stresses. Mol Cell Biol 21, 7971-80 (2001).

Lu, P. D., Harding, H. P. & Ron, D. Translation reinitiation at alternative open reading frames regulates gene expression in an integrated stress response. J Cell Biol 167, 27-33 (2004).

Marciniak, S. J. et al. CHOP induces death by promoting protein synthesis and oxidation in the stressed endoplasmic reticulum. Genes Dev 18, 3066-77 (2004).

Mellman, I. & Steinman, R. M. Dendritic cells: specialized and regulated antigen processing machines. Cell 106, 2558 (2001).

Mellor, A. L. & Munn, D. H. IDO expression by dendritic cells: tolerance and tryptophan catabolism. Nat Rev Immunol 4, 762-74 (2004).

Munn, D. H. et al. GCN2 kinase in T cells mediates proliferative arrest and anergy induction in response to indoleamine 2,3-dioxygenase. Immunity 22, 633-42 (2005).

Novoa, I., Zeng, H., Harding, H. P. & Ron, D. Feedback inhibition of the unfolded protein response by GADD34- mediated dephosphorylation of eIF2alpha. J Cell Biol 153, 1011-22 (2001).

5

10

15

20

25

30

Novoa, I. et al. Stress-induced gene expression requires programmed recovery from translational repression. Embo J 22, 1180-7 (2003).

Okada, T., Yoshida, H., Akazawa, R., Negishi, M. & Mori, K. Distinct roles of activating transcription factor 6 (ATF6) and double-stranded RNA-activated protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase (PERK) in transcription during the mammalian unfolded protein response. Biochem J 366, 585-94 (2002).

Proud, C. G. PKR: a new name and new roles. Trends Biochem Sci 20, 241-6 (1995).

Puccetti, P. On watching the watchers: IDO and type I/II IFN. Eur J Immunol 37, 876-9 (2007).

Rintahaka, J., Wiik, D., Kovanen, P. E., Alenius, H. & Matikainen, S. Cytosolic antiviral RNA recognition pathway activates caspases 1 and 3. J Immunol 180, 1749-57 (2008).

Ron, D. & Walter, P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nat Rev Mol Cell Biol 8, 519-29 (2007).

Samuel, C. E. Antiviral actions of interferons. Clin Microbiol Rev 14, 778-809, table of contents (2001).

Scheuner, D. et al. Translational control is required for the unfolded protein response and in vivo glucose homeostasis. Mol Cell 7, 1165-76 (2001).

Scheuner, D. et al. Double-stranded RNA-dependent protein kinase phosphorylation of the alpha-subunit of eukaryotic translation initiation factor 2 mediates apoptosis. J Biol Chem 281, 21458-68 (2006).

Smith, J. A. et al. Endoplasmic reticulum stress and the unfolded protein response are linked to synergistic IFN-beta induction via X-box binding protein 1. Eur J Immunol 38, 1194-203 (2008).

Todd, D. J., Lee, A. H. & Glimcher, L. H. The endoplasmic reticulum stress response in immunity and autoimmunity. Nat Rev Immunol 8, 663-674 (2008).

Uyttenhove, C. et al. Evidence for a tumoral immune resistance mechanism based on tryptophan degradation by indoleamine 2,3-dioxygenase. Nat Med 9, 1269-74 (2003).

Williams, B. R. PKR; a sentinel kinase for cellular stress. Oncogene 18, 6112-20 (1999).

Williams, B. R. Signal integration via PKR. Sci STKE 2001, RE2 (2001).

Yoshida, H., Matsui, T., Yamamoto, A., Okada, T. & Mori, K. XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor. Cell 107, 881-91 (2001).

Zhang, P. et al. The GCN2 eIF2alpha kinase is required for adaptation to amino acid deprivation in mice. Mol Cell Biol 22, 6681-8 (2002).

Zhang, K. & Kaufman, R. J. From endoplasmic-reticulum stress to the inflammatory response. Nature 454, 455-62 (2008).

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un inhibidor de la actividad o de la formacion del complejo PP1/GADD34 para uso en el tratamiento de una afeccion inflamatoria.
2. 2. Un inhibidor para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde la afeccion inflamatoria se selecciona 5 entre asma, miopatias, smdrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS), smdrome de respuesta inflamatoria

   sistemica (SIRS), enfermedades inflamatorias intestinales y sepsis.
3. 3. Un inhibidor para uso de acuerdo con la reivindicacion 2, en donde la afeccion inflamatoria es sepsis.
4. 4. Un inhibidor para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el inhibidor es un inhibidor de GADD34.
5. 5. Un inhibidor para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el inhibidor es un inhibidor de PP1 en 10 complejo con GADD34.
6. 6. Un inhibidor para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el inhibidor inhibe el dominio de interaccion comprendido entre los residuos de aminoacidos 540 y 600 de GADD34.
7. 7. Un inhibidor para uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, en donde el inhibidor se selecciona entre salubrinal, tautomicina, caliculina A y un peptido que consiste o que comprende un fragmento de GADD34.

   15 8. Un inhibidor para uso de acuerdo con la reivindicacion 4, en el que el inhibidor es un inhibidor selectivo del

   complejo PP1/GADD34.
8. 9. Una composicion terapeutica que comprende un inhibidor de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8, para uso en el tratamiento de una afeccion inflamatoria.