ES2637317T3 - Procedimiento para medir la función trombocítica - Google Patents

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Abstract

Procedimiento para medir la función trombocítica, caracterizado por que se conduce una disolución líquida de trombocitos, en la que los trombocitos se encuentran en forma individual, a una cámara microfluídica, a la que se aplica un campo eléctrico orientado transversalmente a la dirección de entrada de la disolución de trombocitos, e inmediatamente antes o bien durante la acción del campo eléctrico, se la pone en contacto con al menos un estimulante y se observa y se evalúa la trayectoria de movimiento de cada trombocito individual en el campo eléctrico, de manera que un trombocito con una trayectoria de movimiento dirigida hacia el polo negativo del campo eléctrico se clasifica como trombocito activado, y un trombocito con una trayectoria de movimiento dirigida hacia el polo positivo del campo eléctrico se clasifica como trombocito no activado.

Description

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DESCRIPCION
Procedimiento para medir la funcion trombocftica
La invencion se refiere a un procedimiento para medir la funcion trombocftica.
Existe una necesidad de pruebas de la funcion trombocftica en el sector de la medicina humana y veterinaria, que puedan diagnosticar trastornos de los trombocitos (plaquetas sangumeas) y de la hemostasia, y monitorizar terapias anticoagulantes, que sean para ello mas fiables en terminos de prediccion y mas rentables, y que puedan utilizarse fuera de laboratorios cftnicos. Las pruebas de la funcion trombocftica disponibles en la actualidad miden la respuesta de reaccion de una poblacion de trombocitos (varios millones de trombocitos) a agonistas en condiciones estaticas. Estas condiciones no reflejan condiciones in vivo, en las que se dan senales paracrinas finamente distribuidas, y tampoco se tienen en cuenta las diferencias inherentes en la capacidad funcional (por ejemplo, la sensibilidad) entre distintos trombocitos, particularmente con respecto a trombocitos hipersensibles.
A la agregometna de transmision luminosa se le considera el "patron oro" de las pruebas de la funcion trombocftica pero, sin embargo, la agregometna de impedancia no se utiliza ampliamente debido a diversos factores que influyen en su precision. En la actualidad, todas las pruebas para trombocitos analizan las respuestas de una poblacion de trombocitos a agonistas (estimulantes), pero no proporcionan informacion alguna al nivel de los trombocitos individuales.
A partir del documento WO 2007/008064 A2 se conoce un sistema de electroforesis de flujo libre con una camara microflmdica que, como es suficientemente sabido en sistemas de electroforesis de flujo libre, sirve para separar entre sf partmulas y analizarlas, basandose en sus cargas electricas, e influir adicionalmente en las partmulas que han sido separadas de esta manera, eventualmente en una unidad de deteccion conectada detras.
A partir del documento WO 2013/013228 A1 se conoce un procedimiento que sirve principalmente para estudiar muestras de sangre de pacientes a quienes se ha administrado previamente un medicamento, con el fin de comprobar la eficacia del medicamento. Como alternativa, tambien se puede prever anadir directamente a la muestra de sangre dicho medicamento o una sustancia correspondiente, sin administrarlo previamente a los pacientes, y realizar despues las pruebas correspondientes. A continuacion, es decir, despues de la accion del medicamento o de una sustancia correspondiente sobre la muestra de sangre, se introduce la muestra en un campo electrico y se realiza una distincion entre trombocitos activados y no activados basandose en la distinta desviacion en el campo electrico.
A partir del documento US 7 138 269 B2 se conocen sistemas microflmdicos para caracterizar partmulas y celulas sangumeas, en los cuales se puede utilizar un campo electrico para distinguir partmulas diversamente cargadas, gracias a su distinto movimiento en el sistema microflmdico, con lo que se pueden examinar individualmente las partmulas individuales. En este caso, se puede anadir un reactivo a la disolucion a examinar, que contiene las partmulas, antes del examen.
Ward et al. (Journal of Immunological Methods 1974, vol. 6, n.° 1-2, 121-128) describe un procedimiento para medir la funcion trombocftica en el cual se conduce una disolucion ftquida de trombocitos a una camara de electroforesis, a la que se aplica un campo electrico orientado en la direccion de entrada de la disolucion de trombocitos, y se la pone en contacto con un estfmulo (suero equino) inmediatamente antes de la accion del campo electrico y se observa y se evalua la velocidad de cada trombocito individual en el campo electrico. Una menor movilidad sugiere un efecto mas intenso del suero equino sobre los trombocitos.
Es mision de la invencion poner a disposicion una disolucion por medio de la cual se pueda medir la sensibilidad de trombocitos individuales con alto rendimiento y el menor gasto posible en aparatos.
Esta mision se resuelve segun la invencion, en un procedimiento del tipo indicado al principio, conduciendo una disolucion ftquida de trombocitos, en la que los trombocitos se encuentran en forma individual, a una camara microflmdica, a la que se aplica un campo electrico orientado transversalmente a la direccion de entrada, e inmediatamente antes o bien durante la accion del campo electrico, poniendola en contacto con al menos un estimulante y observando y evaluando la trayectoria de movimiento de los trombocitos en el campo electrico, de manera que los trombocitos con una trayectoria de movimiento dirigida hacia el polo negativo del campo electrico se clasifican como trombocitos activados, y los trombocitos con una trayectoria de movimiento dirigida hacia el polo positivo del campo electrico se clasifican como trombocitos no activados.
Con la invencion, se pone a disposicion un procedimiento con el que es posible, con escaso gasto en aparatos y alto rendimiento, medir la sensibilidad de trombocitos individuales. Para ello, se combina una disolucion de trombocitos, en la que los trombocitos estan presentes de manera individual, es decir, por ejemplo, una disolucion de trombocitos muy diluida, inmediatamente antes o durante la accion de un campo electrico, con un estimulante que actua sobre los trombocitos. Dependiendo del efecto del estimulante (el agonista), la superficie de los trombocitos individuales cambia de manera conocida, y con ello su estado de carga electrica. Se sabe que la carga superficial de un trombocito no activado es negativa y la de un trombocito activado esta entre menos negativa y positiva. Dependiendo de si ha tenido lugar o no la activacion del trombocito respectivo por el estimulante (cuando se utiliza
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un activador como estimulante), la trayectoria de movimiento del trombocito individual en el campo electrico cambia, lo que se puede observar facilmente al microscopio. Igualmente, cuando se usa un inhibidor como estimulante, se puede comprobar el efecto del inhibidor sobre el trombocito respectivo mediante la observacion de la trayectoria de movimiento del trombocito. Dependiendo del curso de la trayectoria de movimiento, es posible de forma sencilla la clasificacion del trombocito. Por lo tanto, el campo electrico en la camara microflmdica no se utiliza para la separacion (de partfculas), sino que se evalua el cambio en las trayectorias de movimiento, y se realiza una mezcla de las partfculas (trombocitos) con un estimulante, inmediatamente antes o durante la accion del campo electrico.
En una modalidad particularmente preferida, se preve poner primeramente en contacto la disolucion de trombocitos con un primer estimulante y a continuacion, aguas abajo en la camara, se pone en contacto con un segundo estimulante. El primer estimulante es entonces, preferiblemente, un activador, y el segundo es un inhibidor.
En otra modalidad preferida se preve conducir la disolucion lfquida de trombocitos a una camara microflmdica para electroforesis de flujo libre.
La combinacion o mezcladura de la disolucion de trombocitos con el estimulante puede tener lugar de diversas maneras.
Segun una primera modalidad, se preve combinar primeramente la disolucion lfquida de trombocitos con una disolucion de estimulante y, a continuacion, conducir la disolucion mezclada de trombocitos y estimulante a la camara microflmdica. Por lo tanto, en esta modalidad la mezcladura se lleva a cabo inmediatamente antes de la introduccion en la camara microflmdica.
Segun una segunda modalidad, se preve conducir en paralelo la disolucion lfquida de trombocitos y una disolucion de estimulante a la camara microflmdica. La mezcladura se produce entonces solo en la zona de accion del campo electrico.
Finalmente, se preve como alternativa que, antes de introducir la disolucion de trombocitos en la camara microflmdica, se inmovilicen partfculas de estimulante en el fondo de la camara. La disolucion de trombocitos, y por lo tanto los trombocitos, entran entonces en contacto con las partfculas de estimulante dispuestas de manera estacionaria en la camara. La inmovilizacion en el fondo de la camara tambien es particularmente adecuada para poner en contacto los trombocitos con un segundo estimulante.
En el sentido de la invencion, debe entenderse por una disolucion de estimulante no solo disoluciones como tales, sino tambien suspensiones en las que esten presentes partfculas de estimulante no disueltas.
En principio, se pueden utilizar todos los estimulantes conocidos y adecuados para el tratamiento de trombocitos; y preferiblemente se utilizan difosfato de adenosina, colageno, trombina o prostaglandina como activadores, y acido acetilsalidlico, convulxina, clopidogrel, prasugrel, ticagreloro prostaciclina como inhibidores.
Como medio portador fluido para los trombocitos en la disolucion de trombocitos se puede utilizar, por ejemplo, un tampon de HEPES.
Segun una primera modalidad, para evaluar la trayectoria de movimiento de los trombocitos se puede prever, preferiblemente, que la trayectoria de movimiento de los trombocitos en la camara se capte mediante procedimientos de formacion de imagenes o procedimientos opticos de deteccion.
El campo electrico en la camara microflmdica se puede generar mediante tension de corriente continua o mediante tension de corriente continua pulsada. Los electrodos para generar el campo electrico se pueden disponer en la camara microflmdica. Pueden ser electrodos microfabricados o bien electrodos de alambre. Los electrodos estan hechos, por ejemplo, de oro, platino, grafito u otro material conductor que pueda imprimirse sobre un sustrato transparente, tal como vidrio o poli(metacrilato de metilo), o bien se fabrican, en forma de alambre, a partir de estos materiales.
Dentro de la camara microflmdica, los electrodos estan separados del canal de flujo propiamente dicho por una zona lfmite (por ejemplo, puentes de electrolito), que puede estar formada por una matriz polimerica tal como un hidrogel o un material similar, o que puede estar integrada por una serie de microcanales.
A continuacion se explica con mayor detalle la invencion por medio de los dibujos. Estos muestran,
en la Figura 1, una representacion esquematica de la estructura superficial fundamental de trombocitos no activados y activados,
en la Figura 2, una vista desde arriba de una camara de electroforesis de flujo libre con una primera modalidad de la aportacion de trombocitos,
en la Figura 3, una camara de electroforesis de flujo libre en una vista desde arriba, con una segunda modalidad de la aportacion a la disolucion, y
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en la Figura 4, una camara de electroforesis de flujo libre en vista lateral, con una tercera modalidad de la aportacion de trombocitos.
En la Figura 1 se indican con Tna los trombocitos no activados, con forma redonda y a una escala muy ampliada. Estos trombocitos no activados Tna presentan una carga superficial negativa en su superficie O1.
Cuando estos trombocitos no activados Tna son activados por un estimulante o un agonista, lo que se indica simbolicamente por la flecha Pf, los trombocitos activados Ta adoptan otra estructura superficial, en concreto una superficie irregular, y los componentes de membrana se organizan de manera diferente en la membrana de los trombocitos, de forma que la carga electrica en la superficie O2 de los trombocitos activados Ta esta entre menos negativa y positiva. El procedimiento segun la invencion aprovecha esta distinta distribucion de carga superficial de trombocitos no activados Tna y trombocitos activados Ta.
En la Figura 2 se representa una camara microflmdica en forma de una camara 1 de electroforesis de flujo libre, a la que se aplica un campo electrico transversalmente a la direccion de flujo principal, que se extiende en la direccion longitudinal de la camara 1, lo que se indica con un polo positivo P y un polo negativo M. En las zonas de borde a ambos lados de la camara 1 estan dispuestos electrodos adecuados correspondientes, o bien estan integrados en la camara 1, cuando los electrodos son electrodos impresos.
La camara 1 de electroforesis de flujo libre presenta una pluralidad de canales 2 de entrada y canales 2a de salida paralelos. En el ejemplo de realizacion segun la Figura 2, un conducto 3 de aportacion, en forma de Y, esta conectado a un canal central de entrada, aportandose a traves de uno de sus afluentes 4 una disolucion 8 de trombocitos con trombocitos no activados Tna individuales y aportandose a traves de su otro afluente 5 una disolucion 9 de estimulante, que se mezclan en una zona 6 de mezcladura del conducto 3 de aportacion y llegan mezcladas a la camara 1. Paralelamente a ello, se lleva a la camara 1, a traves de los otros canales 2, un tampon 7 de elucion, de forma que el flujo recorre la camara 1 en toda su anchura y longitud.
La disolucion 8 de trombocitos consiste preferiblemente, aparte de los trombocitos no activados Tna contenidos de manera individual en la disolucion; en un tampon de HEPES, y el tampon 7 de elucion tambien puede ser un tampon de HEPES, pero eventualmente tambien puede ser una disolucion de estimulante.
En la zona 6 de mezcladura del conducto 3 de aportacion en forma de Y, la disolucion 9 de estimulante actua sobre los trombocitos, provocando asf que algunos trombocitos se activen y su carga superficial cambie de negativa a entre menos negativa y positiva.
Esto lleva a que, en la zona de influencia del campo electrico dentro de la camara 1, la trayectoria de movimiento Bna de los trombocitos no activados Tna se extienda en direccion al polo positivo P, mientras que la trayectoria de movimiento Ba de los trombocitos activados Ta se extiende en direccion al polo negativo M.
Segun la invencion, se detecta la trayectoria de movimiento respectiva de cada trombocito individual, por ejemplo por medio de un microscopio; y se clasifican y se evaluan (es decir, se califican) como trombocitos no activados Tna los trombocitos con una trayectoria de movimiento dirigida hacia el polo positivo, y como trombocitos activados Ta los trombocitos con una trayectoria de movimiento Ba dirigida hacia el polo negativo.
En el ejemplo de realizacion segun la Figura 3, el conducto de aportacion de la disolucion 8 de trombocitos y de la disolucion 9 de estimulante en la camara 1 es diferente, comparado con el ejemplo de realizacion segun la Figura 2, pero por lo demas el ejemplo de realizacion no difiere del ejemplo de realizacion segun la Figura 2. En el ejemplo de realizacion segun la Figura 3, la disolucion 9 de estimulante se introduce centralmente en los canales 2 de entrada, y fluye a traves de la camara 1 esencialmente a lo largo de la zona rayada. La disolucion 8 de trombocitos se introduce a traves de un canal 2' de entrada dispuesto adyacente a ello. Por accion del campo electrico en la camara 1, los trombocitos Tna inicialmente no activados se desvfan en direccion al polo positivo y, portanto, entran en contacto con la disolucion 9 de estimulante. Aquellos trombocitos que permanecen no activados, es decir los trombocitos Tna, se mueven a lo largo de una trayectoria de movimiento representada como Bna, en direccion al polo positivo P. En contraste, los trombocitos Ta que se han activado al entrar en contacto con la disolucion de estimulante cambian su trayectoria de movimiento, y finalmente su trayectoria de movimiento Ba esta orientada en direccion al polo negativo M. Por lo tanto, observando la trayectoria de movimiento Bna, Ba de los trombocitos individuales, en este ejemplo de realizacion tambien se les puede clasificar, los trombocitos con una trayectoria de movimiento Bna finalmente dirigida hacia el polo positivo P son trombocitos no activados Tna, y los trombocitos con una trayectoria de movimiento Ba finalmente dirigida hacia el polo negativo son trombocitos activados Ta.
En Figura 4 se representa una modalidad adicional, la camara 1 de electroforesis de flujo libre esta girada 90° con respecto a la representacion segun las Figuras 2 y 3, y se muestra desde un lado. En esta realizacion no se introduce en la camara ninguna disolucion estimulante, sino que las partfculas de estimulante estan inmovilizadas en la superficie del fondo de la camara 1.
La disolucion 8 de trombocitos se aporta a traves de los canales 2 de entrada, al igual que un tampon de separacion, que no esta representado en la Figura 4. Ademas, a traves de una entrada 10 en el lado superior se introduce en la camara 1 un tampon adicional para el enfoque dinamico.
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Los trombocitos que se han activado se indican una vez mas con Ta; su trayectoria de movimiento se desvfa entonces transversalmente al plano del dibujo de la Figura 4 en direccion al polo negativo. La evaluacion de las trayectorias de movimiento de los trombocitos individuales en la camara 1 tiene lugar como se ha descrito mas arriba.
Por supuesto, la invencion no esta restringida a los ejemplos de realizacion mostrados. Son posibles otras modalidades sin apartarse de la idea fundamental. Por ejemplo, se puede poner primeramente en contacto la disolucion de trombocitos con un primer estimulante y, a continuacion, en la direccion de avance del flujo en la camara, en contacto con un segundo estimulante. El primer estimulante es entonces un activador, por ejemplo, y se puede poner en contacto con los trombocitos individuales de la manera descrita en las Figuras 2 a 4. El segundo estimulante es entonces un inhibidor, por ejemplo, que esta inmovilizado en el fondo de la camara 1, preferiblemente aguas abajo de la entrada en la camara 1, o se introduce en la camara 1 aguas abajo de la camara 1. La trayectoria de movimiento de los trombocitos en la zona de entrada a la camara 1 refleja entonces el efecto del activador sobre los trombocitos y la trayectoria de movimiento de los trombocitos aguas abajo refleja el efecto del inhibidor sobre los trombocitos.
Listado de referencias numericas:
1 camara
2, 2' canales de entrada
2a canales de salida
3 conducto de aportacion en forma de Y
4 afluente
5 afluente
6 zona de mezcladura
7 tampon de elucion
8 disolucion de trombocitos
9 disolucion de estimulante
10 entrada
Tna trombocitos no activados
Ta trombocitos activados
Pf flecha
M polo negativo
P polo positivo
Bna trayectoria de movimiento de trombocitos no activados
Ba trayectoria de movimiento de trombocitos activados
01 superficie de un trombocito no activado
02 superficie de un trombocito activado

Claims (10)

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    10
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    20
    25
    30
    REIVINDICACIONES
    1. Procedimiento para medir la funcion trombodtica, caracterizado por que se conduce una disolucion Kquida de trombocitos, en la que los trombocitos se encuentran en forma individual, a una camara microflmdica, a la que se aplica un campo electrico orientado transversalmente a la direccion de entrada de la disolucion de trombocitos, e inmediatamente antes o bien durante la accion del campo electrico, se la pone en contacto con al menos un estimulante y se observa y se evalua la trayectoria de movimiento de cada trombocito individual en el campo electrico, de manera que un trombocito con una trayectoria de movimiento dirigida hacia el polo negativo del campo electrico se clasifica como trombocito activado, y un trombocito con una trayectoria de movimiento dirigida hacia el polo positivo del campo electrico se clasifica como trombocito no activado.
  2. 2. Procedimiento segun la reivindicacion 1, caracterizado por que primeramente se pone en contacto la disolucion de trombocitos con un primer estimulante y a continuacion, aguas abajo en la camara, se pone en contacto con un segundo estimulante.
  3. 3. Procedimiento segun la reivindicacion 1 o 2, caracterizado por que se conduce la disolucion lfquida de trombocitos a una camara microflmdica de electroforesis de flujo libre.
  4. 4. Procedimiento segun la reivindicacion 1, 2 o 3, caracterizado por que primeramente se combina la disolucion lfquida de trombocitos con una disolucion de estimulante y a continuacion se conduce la disolucion mezclada de trombocitos y estimulante a la camara microflmdica.
  5. 5. Procedimiento segun la reivindicacion 1, 2 o 3, caracterizado por que se conducen en paralelo la disolucion lfquida de trombocitos y una disolucion de estimulante a la camara microflmdica.
  6. 6. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que, antes de la introduccion de la disolucion de trombocitos en la camara microflmdica, se inmovilizan partfculas de estimulante en el fondo de la camara.
  7. 7. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que se utilizan como estimulantes difosfato de adenosina, colageno, trombina o prostaglandina.
  8. 8. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que se utilizan como estimulantes acido acetilsalidlico, convulxina, clopidogrel, prasugrel, ticagrelor, prostaciclina.
  9. 9. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que se pone primeramente en contacto la disolucion de trombocitos con un primer estimulante y a continuacion, aguas abajo en la camara, se pone en contacto con un segundo estimulante, en donde como primer estimulante se utiliza un activador segun la reivindicacion 7 y como segundo estimulante un inhibidor segun la reivindicacion 8.
  10. 10. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por que la trayectoria de movimiento de los trombocitos en la camara se capta mediante procedimientos de formacion de imagenes o procedimientos opticos de deteccion.
ES15180931.6T 2014-08-27 2015-08-13 Procedimiento para medir la función trombocítica Active ES2637317T3 (es)

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