CN105388202A - 用于测量凝血细胞功能的方法 - Google Patents
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Abstract
采用用于测量凝血细胞功能的方法应当提供一种解决方案，借助于所述方案可以以尽量少的设备耗费高通量地测量单个凝血细胞的灵敏度。由此实现所述目的：将其中凝血细胞分散存在的液态凝血细胞溶液引入微流体室，并与至少一种刺激物接触，其中在所述微流体室上施加横跨凝血细胞溶液进入方向指向的电场，并观察和评估凝血细胞在电场中的运动轨迹，如此，将运动轨迹朝向电场的负极方向指向的凝血细胞归类为未活化的凝血细胞，且将运动轨迹朝向电场的正极方向指向的凝血细胞归类为活化的凝血细胞。
Description
本发明涉及用于测量凝血细胞功能的方法。
在人类医学和兽医学领域都有对凝血细胞功能检测的需求，凝血细胞功能检测可以诊断凝血细胞(血小板)和止血功能的障碍和监控抗凝治疗，在这种情况下可以是预测更可靠的和成本更有效的，此外可以在临床实验室以外使用。目前可用的凝血细胞功能检测是测量静态条件下凝血细胞群体(几百万凝血细胞)对激动剂的反应应答。所述反应应答不反映精确分配旁分泌信号的体内条件，甚至不考察不同凝血细胞之间功能能力(例如灵敏度)的固有差异，尤其是考虑超敏感的凝血细胞。
光透射聚集是在凝血细胞功能检测时的所谓的“黄金标准”，而由于影响精确度的各种因素，阻抗集合度没有被广泛使用。目前，所有凝血细胞检测分析凝血细胞群体对激动剂(刺激物)的应答，但没有给出在单个凝血细胞水平上的任何信息。
由WO2007/008064A2已知具有微流体室的自由流电泳系统，如在自由流电泳系统中充分已知的，其用于将颗粒根据它们的电荷互相分离和进行分析，任选地，在下游的检测单元中继续影响如此分离的颗粒。
由WO2013/013228A1已知一种方法，所述方法首先用于研究事先给药的患者的血液样品，以便检验药物的有效性。或者还可以提出，不将这类药物或相应的物质事先给予患者，而直接添加至血液样品并且随后进行相应的检测。随后，在药物或相应的物质对血液样品进行作用之后，将样品引入电场中，借助电场中的不同偏移来区分活化的和未活化的凝血细胞。
由US7138269B2已知用于表征颗粒和血细胞的微流体系统，可以在所述系统中应用电场，从而通过微流体系统中不同的运动来识别不同电荷的颗粒，其中可以独立地检验单个颗粒。在此过程中，在检验之前将试剂加入含有颗粒的待检验的溶液中。
本发明的目的在于，提供一种解决方案，借助于所述方案可以采用尽量少的设备耗费高通量地测量单个凝血细胞的灵敏度。
所述目的根据本发明以开篇所述类型的方法由此实现：将其中凝血细胞分散存在的液态凝血细胞溶液引入微流体室，在所述微流体室上施加横跨凝血细胞溶液进入方向指向的电场，并在电场作用之前立即或在电场作用期间与至少一种刺激物接触，并观察和评估凝血细胞在电场中的运动轨迹，如此，将运动轨迹朝向电场的负极方向指向的凝血细胞归类为活化的凝血细胞，且将运动轨迹朝向电场的正极方向指向的凝血细胞归类为未活化的凝血细胞。
本发明提供了一种方法，利用所述方法可以采用尽量少的设备耗费高通量地测量单个凝血细胞的灵敏度。为此将其中凝血细胞分散存在的凝血细胞溶液，即例如大量稀释的凝血细胞溶液在电场作用之前立即或在电场作用期间与对凝血细胞起作用的刺激物合并到一起。根据刺激物(激动剂)的有效性以已知的方式改变单个凝血细胞的表面，并因此改变其电荷状态。已知的是，未活化的凝血细胞的表面电荷是负的，且活化的凝血细胞的表面电荷是较少负的至正的。根据由刺激物对各个凝血细胞的发生活化或不发生的活化(在使用活化剂作为刺激物的情况下)，改变单个凝血细胞在电场中的运动轨迹，这可以以简单的方式用显微镜观察到。同样地，在使用抑制剂作为刺激物时，通过观察凝血细胞的运动轨迹来检验抑制剂对各个凝血细胞的有效性。根据运动轨迹的走向可以以简单的方式对凝血细胞进行归类。微流体室内的电场因此不用于(颗粒-)分离，而是评估运动轨迹的变化，并在电场的作用之前立即或在电场作用期间将颗粒(凝血细胞)与刺激物混合。
在特别优选的实施方案中提出，所述凝血细胞溶液首先与第一刺激物接触，随后在室中在下游与第二刺激物接触。此外，所述第一刺激物优选是活化剂和第二刺激物优选是抑制剂。
在优选的其它实施方案中提出，将所述液态凝血细胞溶液引入微流体自由流电泳室中。
所述凝血细胞溶液与刺激物的合并或混合可以不同方式进行。
根据第一实施方案提出，所述液态凝血细胞溶液首先与刺激物溶液合并，且随后将混合的凝血细胞-刺激物溶液引入微流体室中。在该实施方案中，所述混合因此在引入微流体室之前立即完成。
根据第二实施方案提出，所述液态凝血细胞溶液和刺激物溶液平行地引入微流体室中。所述混合随后才在电场的有效区域中进行。
最后，作为选择地提出，在将凝血细胞溶液引入微流体室之前将刺激物颗粒固定在室的底板上。所述凝血细胞溶液和因此的凝血细胞与固定地布置在室中的刺激物颗粒接触。在室的底板上的固定还特别好地适用于凝血细胞与第二刺激物接触。
在本发明意义上，刺激物溶液应理解为不仅是溶液本身，还有其中存在未溶解的刺激物颗粒的悬浮液。
作为刺激物基本上可以使用所有已知和适合于凝血细胞处理的那些，优选使用二磷酸腺苷、胶原、凝血酶或前列腺素作为活化剂，和使用乙酰水杨酸、惊厥蛋白(Convulxin)、氯吡格雷(Clopidogrel)、普拉格雷(Prasugrel)、替格雷洛(Ticagrelor)、前列环素(Prostacyclin)作为抑制剂。
作为所述凝血细胞溶液中用于凝血细胞的流体载体介质，可以使用例如Hepes缓冲液。
为了评估凝血细胞的运动轨迹，根据第一实施方案优选提出，借助于成像方法或光学检测方法使室中的凝血细胞的运动轨迹成像。
微流体室中的电场可以借助于直流电压或借助于脉冲直流电压来产生。用于产生电场的电极可以布置在微流体室内。所述电极可以是微细加工的电极(mikrofabrizierteElektrode)或丝状电极。所述电极可以例如由金、铂、石墨或可以压印在透明基材，例如玻璃或聚甲基丙烯酸甲酯上的其它导电材料构成，或者是由这些材料制备的丝状的电极。
所述电极在微流体室内部被通过边界区域(例如电解质桥)与实际的流动通道隔开，所述边界区域可以由聚合物基质如水凝胶或类似的材料形成，或者体现为一系列微通道。
以下借助附图示例性地详细阐述本发明。
图1显示了未活化的和活化的凝血细胞的主要表面的示意图；
图2显示了凝血细胞引入的第一实施方案的自由流电泳室的俯视图；
图3显示了引入溶液中的第二实施方案的自由流电泳室的俯视图，和
图4显示了凝血细胞引入的第三实施方案的自由流电泳室的侧视图。
在图1中以放大的比例用TNA来表示未活化的圆形构成的凝血细胞。所述未活化的凝血细胞TNA在其表面O1上具有负的表面电荷。
如果将这些未活化的凝血细胞TNA通过刺激物或激动剂活化(这由箭头Pf象征性地表示)，则活化的凝血细胞TA采取另一种，即不规则的表面结构，且膜成分在凝血细胞膜内以另一种方式布置，使得活化的凝血细胞TA的表面O2上的电荷为较少负的至正的。未活化的凝血细胞TNA和活化的凝血细胞TA的这种不同的表面电荷分布对根据本方面的方法而言是有用的。
在图2中示出了自由流电泳室1形式的微流体室，在其上横跨室1的纵向延伸的主流动方向施加电场，所述电场通过正极P和负极M表示。相应地在室1的两侧边缘区域内布置合适的电极，或者当所述电极是压印的电极时将其集成在室1中。
自由流电泳室1具有多个平行的入口通道2和出口通道2a。在根据图2的实施例中，在中心入口通道上连接Y形导管3，通过所述导管3将具有单个的未活化凝血细胞TNA的凝血细胞溶液8引入进口4，并通过所述导管3将刺激物溶液9引入另一进口5，它们在导管3的混合区域6内混合并混合着到达室1。与此同时，通过其它的通道2将运行缓冲液7引入室1，使得室1在其整个宽度和长度上被流过。
除了分散包含在溶液中的未活化凝血细胞TNA之外，凝血细胞溶液8优选由Hepes缓冲液构成，还有运行缓冲液7可以是Hepes缓冲液，任选地也为刺激物溶液。
在Y形导管3的混合区域6内，刺激物溶液9对凝血细胞产生作用，由此活化一些凝血细胞，并且其表面电荷由负的向较少负的至正的变化。
这导致在室1内部的电场的作用区域中，未活化的凝血细胞TNA的运动轨迹BNA在正极P方向上延伸，而活化的凝血细胞TA的运动轨迹BA在负极M的方向上延伸。
根据本发明，例如借助于显微镜检测每个单个凝血细胞的各个运动轨迹，将运动轨迹朝向正极方向的凝血细胞归类和评价(也是评定)为未活化的凝血细胞TNA，且将运动轨迹BA朝向负极方向的凝血细胞归类和评价(也是评定)为活化的凝血细胞TA。
在根据图3的实施例中，与根据图2的实施例不同，将凝血细胞溶液8和刺激物溶液9导入室1是不同的，在其它方面该实施例与根据图2的实施例没有区别。在根据图3的实施例的情况下将刺激物溶液9从中央引入入口通道2中，并基本上沿着阴影区域流过室1。凝血细胞溶液8通过布置在其附近的通道2'引入。由于室1中电场的作用，起先未活化的凝血细胞TNA向正极方向偏移，并由此实现与刺激物溶液9接触。保持未活化的那些凝血细胞，即凝血细胞TNA沿着以BNA表示的运动轨迹向正极P的方向运动。与此不同，由于与刺激物溶液的接触而活化的凝血细胞TA改变了其运动轨迹，它的运动轨迹BA最终指向负极M的方向。通过观察单个凝血细胞的运动轨迹BNA、BA能够将它们因此在本实施例中归类，具有最终指向正极P的运动轨迹BNA的凝血细胞是未活化的凝血细胞TNA，且具有最终指向负极的运动轨迹BA的凝血细胞是活化的凝血细胞TA。
在图4中示出了其它的实施方案，自由流电泳室1相对于根据图2和3的图示转动了90°，并从侧面来示出。在这个实施方案中，不向室中引入刺激物溶液，而是将刺激物颗粒固定在室1的底面上。
凝血细胞溶液8通过入口通道2引入，正如在图4中没有示出的分离缓冲液那样。另外，通过上侧入口10将用于动态聚集的另外的缓冲液引入室1。
活化的凝血细胞再次用TA示出，其运动轨迹横跨图4的画面向负极方向偏移。如前所述地进行对室1中单个凝血细胞运动轨迹的评价。
本发明当然不限于所描述的实施例。在不背离基本思想的条件下，其它实施方案也是可能的。因此，凝血细胞溶液可以首先与第一刺激物接触，并随后在室中于下游与第二刺激物接触。第一刺激物例如是活化剂，且可以与分散的凝血细胞以图2至4所述的方式接触。所述第二刺激物例如是抑制剂，它优选在室1入口的下游固定在室1底上，或者在室1的下游引入室1。凝血细胞在室1入口区域的运动轨迹体现了活化剂对凝血细胞的有效性，且凝血细胞在下游的运动轨迹又体现了抑制剂对凝血细胞的有效性。
附图标记：
1室
2,2'入口通道
2a出口通道
3Y-型管道
4进口
5进口
6混合区域
7运行缓冲液
8凝血细胞溶液
9刺激物溶液
10入口
TNA未活化的凝血细胞
TA活化的凝血细胞
Pf箭头
M负极
P正极
BNA未活化的凝血细胞的运动轨迹
BA活化的凝血细胞的运动轨迹
O1未活化的凝血细胞的表面
O2活化的凝血细胞的表面
Claims (9)
1.用于测量凝血细胞功能的方法，
其特征在于，
将其中凝血细胞分散存在的液态凝血细胞溶液引入微流体室，在所述微流体室上施加有横跨凝血细胞溶液进入方向指向的电场，并在电场作用之前立即或在电场作用期间与至少一种刺激物接触，并观察和评估每个单个凝血细胞在电场中的运动轨迹，如此，将运动轨迹朝向电场的负极方向指向的凝血细胞归类为活化的凝血细胞，且将运动轨迹朝向电场的正极方向指向的凝血细胞归类为未活化的凝血细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，
其特征在于，
将所述凝血细胞溶液首先与第一刺激物接触，并随后在室中于下游与第二刺激物接触。
3.根据权利要求1或2所述的方法，
其特征在于，
将所述液态凝血细胞溶液引入微流体自由流电泳室内。
4.根据权利要求1、2或3所述的方法，
其特征在于，
将所述液态凝血细胞溶液首先与刺激物溶液合并到一起，并随后将混合的凝血细胞-刺激物溶液引入微流体室内。
5.根据权利要求1、2或3所述的方法，
其特征在于，
将所述液态凝血细胞溶液与刺激物溶液平行地引入微流体室。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，
其特征在于，
在将凝血细胞溶液引入微流体室之前，在室的底上固定刺激物颗粒。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，
其特征在于，
使用二磷酸腺苷、胶原、凝血酶或前列腺素作为刺激物。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，
其特征在于，
使用乙酰水杨酸、惊厥蛋白、氯吡格雷、普拉格雷、替格雷洛、前列环素作为刺激物。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，
其特征在于，
借助成像方法或光学检测方法使凝血细胞在室内的运动轨迹成像。
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