ES2635727T3 - Anticuerpos contra DC-STAMP - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un epítopo de DC-STAMP, en donde el epítopo es Glu- Val-His-Leu-Lys-Leu-His-Gly-Glu-Lys-Gln-Gly-Thr-Gln (SEQ ID NO: 1), en donde una cadena ligera del anticuerpo monoclonal comprende la SEQ ID NO: 5, y en donde una cadena pesada del anticuerpo monoclonal comprende la SEQ ID NO: 6.

Description

DESCRIPCION

Anticuerpos contra DC-STAMP 5 ANTECEDENTES

El hueso es un organo muy dinamico como se demuestra por el proceso de remodelacion osea que se basa en un equilibrio delicado entre la formacion osea y la resorcion osea y se orquesta por los osteoblastos (OB) y osteoclastos (OC). La interaccion coordinada de OB y OC remodela continuamente el hueso a traves de acontecimientos 10 moleculares y celulares altamente regulados de tal manera que el esqueleto humano entero se reemplaza en el transcurso de cada decada de vida. La alteracion del equilibrio homeostatico de eliminacion y reemplazo de hueso puede manifestarse como una perdida patologica de hueso que se observa en la osteoporosis, enfermedad periodontal y en algunas artritis inflamatorias, o como una formacion inapropiada de hueso nuevo (por ejemplo, espondiloartritis).

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SUMARIO

En el presente documento se proporcionan anticuerpos monoclonales como se definen en las reivindicaciones, que se unen espedficamente a un epftopo de la protema transmembrana espedfica de celulas dendnticas (DC-STAMP). 20 Espedficamente, el anticuerpo se une a un epftopo de DC-STAMP que comprende la secuencia de aminoacidos Glu-Val-His-Leu-Lys-Leu-His-Gly-Glu-Lys-Gln-Gly-Thr-Gln (SEQ ID NO:1).

Tambien se proporcionan composiciones que comprenden el anticuerpo como se define en las reivindicaciones.

25 Tambien se proporcionan metodos para inhibir la osteoclastogenesis en una celula (por ejemplo, un osteoclasto o celula precursora de osteoclastos). Los metodos comprenden administrar a la celula una composicion que comprende un anticuerpo que se une espedficamente a un epftopo de DC-STAMP.

Tambien se proporcionan secuencias de acido nucleico y secuencias de aminoacidos que codifican las 30 inmunoglobulinas de cadena pesada y ligera del anticuerpo que se unen espedficamente a DC-STAMP. Tambien se detallan vectores que incluyen las secuencias de acido nucleico que codifican las inmunoglobulinas de cadena pesada y/o ligera, o partes de las mismas (por ejemplo, regiones determinantes de complementariedad (CDR) del anticuerpo que se une espedficamente a DC-STAMP y las celulas hospedadoras transformadas con el vector o vectores que codifican las inmunoglobulinas de cadena pesada y/o ligera o partes de las mismas.

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DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 muestra que el mAb 1A2 reconoce DC-STAMP e indica sus niveles de protema en OC maduros. La Figura 1A muestra la inmunoprecipitacion-inmunotransferencia de un lisado celular de celulas RAW 264.7 40 CD11b+ tratadas con RANKL durante 2 dfas para generar OCP. Despues de la inmunoprecipitacion con el mAb 1A2, se realizo inmunotransferencia con el mAb 1A2, el anticuerpo policlonal de conejo KR104 (control positivo) o un anticuerpo anti-IgG de raton (control negativo) en condiciones no reductoras (nr: p-mercaptoetanol) o reductoras (r: + p-mercaptoetanol). M: marcador de protema, superposicion explorada blanca y negra. La transferencia representa 4 ensayos separados. La Figura 1B muestra lisados celulares de macrofagos de medula 45 osea murina cultivados con M-CSF y RANKL durante 2 dfas (para generar OCP - precursores de osteoclastos) o 4 dfas para generar (OCL - osteoclastos) que se sometieron a inmunotransferencia con el mAb 1A2 anti-DC- STAMP, catepsina K (marcador de OCL maduro) y p-actina (control de carga). Los numeros mostrados debajo de las bandas representan valores de densitometna usados como una medida semicuantitativa del nivel relativo de protema. La transferencia representa 2 ensayos separados.

50 La Figura 2 muestra celulas positivas para DC-STAMP en la superficie que expresan marcadores de linaje mieloide.

La Figura 2A muestra citometna de flujo sobre PBMC recogidas de ratones WT C57B1/6 de 20 semanas de edad (n = 3) que muestran la tincion para DC-STAMP-FITC entre celulas CD11b+ (solido, panel derecho) y celulas CD11b- (contorno, panel izquierdo). El histograma es representativo de >3 experimentos. La Figura 2B muestra 55 la citometna de flujo en celulas de medula osea reunidas CD11b+DC-STAMP+ seleccionadas electronicamente

procedentes de ratones WT C57B1/6 de 20 semanas de edad (n = 3) que muestran tincion multicolor para marcadores mieloides (CD11c y Gr1) y marcadores de linfocitos T (CD4 y CD8a). Los numeros representan el porcentaje de celulas en las regiones indicadas. La Figura 3 muestra la dinamica temporal de la expresion del gen de DC-STAMP durante condiciones de diferenciacion de OC y mDC. La Figura 3A (panel izquierdo) muestra 60 una tincion TRAP representativa de celulas multinucleadas generadas a partir de un cultivo RANKL de macrofagos de medula osea. La Figura 3A (panel derecho) muestra una imagen fluorescente representativa de celulas derivadas de medula osea cultivadas con IL-4 + GM-CSF y tenidas con faloidina para destacar la actina en los procesos dendrfticos. La Figura 3B muestra histogramas de citometna de flujo realizados en celulas derivadas de medula osea tenidas con anticuerpos marcados con fluorescencia espedficos para CD11b y CD11c 65 que se cultivaron durante 3 dfas con M-CSF para enriquecer la poblacion CD11b+ adherente. Despues, las

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celulas se cultivaron adicionalmente con RANKL o IL-4 + GM-CSF durante 1, 2 o 3 dfas. Se muestran graficos de puntos representativos de >3 experimented.

La Figura 4 muestra que la citometna de flujo de superficie e intracelular revela patrones de expresion diferenciales para la protema DC-STAMP en el desarrollo de OC y mDC, asf como heterogeneidad en OCP durante la osteoclastogenesis. La Figura 4A muestra un histograma de citometna de flujo de superficie representativo que muestra la tincion con DC-STAMP-FITC de celulas de medula osea adherentes CD11b+ enriquecidas con M-CSF cultivadas con RANKL durante 1, 2 o 3 dfas. La lmea discontinua indica el nivel el dfa 1, mientras que los histogramas sombreados en gris representan el valor durante el dfa indicado. Los numeros indican el porcentaje de celulas en la region indicada. La Figura 4B muestra un histograma de citometna de flujo de superficie representativo que muestra la tincion con DC-STAMP-FITC de celulas de medula osea adherentes CD l1b+ enriquecidas con Gm-CSF cultivadas con IL-4 + GM-CSF durante 1, 2 o 3 dfas. La lmea de puntos indica el nivel el dfa 1 mientras que los histogramas sombreados en gris representan el valor para el dfa indicado. Los numeros indican el porcentaje de celulas en la region indicada. La Figura 4C muestra un histograma de citometna de flujo intracelular representativo que muestra la tincion DC-STAMP-FITC de celulas de medula osea adherentes CD11b+ enriquecidas con M-CSF cultivadas con RANKL durante 1, 2 o 3 dfas. Los numeros indican el porcentaje de celulas que expresan DC-STAMP intracelular. La Figura 4D muestra un histograma de citometna de flujo intracelular representativo que muestra la tincion con DC-STAMP-FITC de celulas de medula osea adherentes CD11b+ enriquecidas con M-CSF cultivadas con IL-4 + GM-CSF durante 1, 2 o 3 dfas. Los numeros indican el porcentaje de celulas que expresan DC-STAMP intracelular.

La Figura 5 muestra que la citometna de flujo de superficie y la inmunofluorescencia intracelular revelan patrones de expresion diferenciales para la protema DC-STAMP en el desarrollo de OC y mDC humanos, de forma similar a lo observado en celulas murinas. Las Figura 5A y 5B muestran un histograma de citometna de flujo de superficie representativo que muestra la tincion DC-STAMP-FITC de monocitos CD14+ humanos enriquecidos procedentes de sangre periferica de un individuo sano cultivados con RANKL y M-CSF (A) o IL-4 + GM-CSF (B) durante 1 o 2 dfas. El histograma solido indica el nivel el dfa 0, mientras que los histogramas de contorno representan el valor para el dfa indicado. La Figura 5C muestra una imagen inmunofluorescente representativa que demuestra un monocito CD14+ humano enriquecido cultivado con RANKL y M-CSF y que presenta la morfologfa alargada descrita previamente como caractenstica de los OCP ya que responden a estfmulos de RANK durante la osteoclastogenesis. La Figura 5D muestra una imagen inmunofluorescente representativa que demuestra un monocito humano CD14+ enriquecido cultivado con IL-4 + GM-CSF y que presenta procesos dendnticos.

La Figura 6 muestra la fenotipificacion de las celulas de superficie DC-STAMP|Q y DC-STAMPhi inducidas por RANKL. La Figura 6A muestra un histograma de citometna de flujo intracelular representativo que muestra la tincion DC-STAMP-FITC de celulas RAW 264.7 de superficie CD-StAMPIQ (histograma blanco) y CD-STAMPhi (histograma sombreado) inducidas con RANKL. La Figura 6B muestra un histograma de citometna de flujo representativo de celulas RAW 264.7 cultivadas con RANKL durante 3 dfas y seleccionadas electronicamente como de superficie DC-STAMPhi (R1) y de superficie DC-STAMP|Q (R2) y despues analizadas por dispersion frontal y dispersion lateral (grafico de puntos). La Figura 6C muestra graficos de puntos representativos de celulas DC-STAMPhi inducidas por RANKL y celulas DC-STAMPhi inducidas por RAnKl que se clasificaron y se volvieron a cultivar con IL-4 y GM-CSF durante 3 dfas. Despues de este periodo de tiempo, las celulas se tineron para determinar la expresion de MHCII y CD11c usando anticuerpos marcados con fluorescencia espedficos.

La Figura 7 muestra PBMC Gr1lD que contienen tanto poblaciones de DC-STAMPlQ como poblaciones de DC- STAMPhi, mientras que las PBMC Gr1hi contienen una poblacion de DC-STAMPhi. La Figura 7A muestra un grafico de puntos de citometna de flujo representativo para dispersion frontal y dispersion lateral de PBMC reunidas procedentes de ratones C57B1/6 de 12 semanas de edad (n= 3). Se muestra la region que indica los monocitos (R1). El numero indica la proporcion de PBMC en esta region. La Figura 7B (panel izquierdo) muestra una citometna de flujo representativa de PBMC tenidas para Gr1 y CD11c. La region R2 representa celulas Gr1+CD11c. La Figura 7B (panel derecho) muestra graficos de puntos de citometna de flujo representativos de la region R2 seleccionada electronicamente de forma adicional en regiones Gir1lo (R3) y Gr1hi (R4). Los numeros indican el porcentaje relativo de celulas en cada region. La Figura 7C muestra histogramas de citometna de flujo representativos de PBMC del portal citometrico de monocitos R1, el portal citometrico R3 de Gr1loCD11c- o e| portal citometrico R4 de Gr1hiCD11c- para indicar la presencia o ausencia de PBMC DC-STAMP|Q y DC-STAMPhi en las poblaciones seleccionadas. Los numeros representan el porcentaje de celulas DC-STAMPlo.

La Figura 8 muestra que las celulas DC-StAmPIQ inducidas con RANKL representan un subtipo mas osteoclastogenico de OCP y son necesarias para la formacion de grandes celulas mutinucleadas TRAP+. La Figura 8A muestra celulas RAW 264.7 DC-STAMPhi y DC-STAMP|Q inducidas por RANKL que se clasificaron basandose en la expresion de DC-STAMP en la superficie como se indica y se volvieron a cultivar con RANKL durante 3 dfas mas como poblaciones homogeneas (DC-STAMP|Q o DC-STAMPhi) o poblaciones mixtas a relaciones de 10:1, 1:1 o 1:10 DC-STAMPlo:DC-STAMPhi. Se muestran fotograffas representativas de los cultivos tenidos con TRAP para demostrar el potencial osteoclastogenico relativo de las diferentes condiciones de cultivo. Los numeros indican el area media de celulas multinucleadas TRAP+ y se presenta en mm2. La Figura 8B (panel izquierdo) muestra un grafico de barras que demuestra el cambio en veces en el ARNm de DC-STAMP relativo en las celulas RAW 264.7 DC-STAMPhi (barra blanca) y DC-STAMP|Q (barra negra) inducidas por RANKL. La Figura 8B (panel derecho) muestra un grafico de barras que demuestra el cambio de veces en el ARNm de DC- STAMP relativo en celulas DC-STAMP""' (barra blanca) y DC-STAMP|Q (barra negra) inducidas por RANKL. Los

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graficos son representativos de experimented realizados por triplicado y los dates estan normalizados para la p- actina. *P < 0,05 frente a niveles de expresion genica de dC-STAMPIq. La Figura 8C muestra un grafico de barras que demuestra el cambio en veces relativo del ARNm frente a genes marcadores de OC o genes relacionados con la fusion en celulas RAW 264.7 DC-STAMPhi (barras blancas) y DC-STAMPlQ (barras negras) inducidas por RANKL. Los graficos son representativos de experimented realizados por triplicado y los datos estan normalizados para la p-actina. *P < 0,05 frente a niveles de expresion genica de DC-STAMPId.

La Figura 9 muestra que existe una subserie de celulas que expresan DC-STAMP en la superficie entre monocitos humanos CD14+ que portan protemas de superficie relacionadas con la fusion. La Figura 9A muestra un histograma de citometna de flujo representativo de PBMC aisladas recientemente de un individuo sano usando anticuerpos espedficos marcados con fluorescencia contra CD14, DC-STAMP y protemas relacionadas con la fusion (CD9, CD44, CD47 y SIRPa). La Figura 9B muestra una tabla que demuestra el cambio en veces relativo del ARNm para genes marcadores de OC o genes relacionados con la fusion en celulas DC-STAMPlQ y DC-STAMPhi inducidas por RANKL. Los experimentos se realizaron por triplicado y los datos estan normalizados para la p-actina.

La Figura 10 muestra un mayor porcentaje de DC-STAMP en la superficie con expresion de CD11b+ en artritis inflamatoria erosiva. Las Figuras 10A y 10B (paneles de la izquierda) muestran imagenes 3D-CT reconstruidas representativas de la articulacion de la rodilla derecha de ratones CD57B1/6 de 20 semanas de edad (A) o ratones TNF-Tg de 20 semanas de edad (B) y los graficos de puntos de citometna de flujo asociados (paneles de la derecha) de PMBC reunidas procedentes de los ratones (n = 3-5) tenidas con anticuerpos espedficos marcados con fluorescencia contra CD11b y DC-STAMP. Los numeros representan el porcentaje de celulas en el cuadrante indicado. Las Figuras 10C y 10D muestran graficos de puntos de citometna de flujo representativos de PBMC de un individuo sano (HC) (Figura 10C) o un individuo con RA (Figura 10D) con tincion con anticuerpos espedficos marcados con fluorescencia contra CD14 y DC-STAMP. Los numeros representan porcentajes de celulas en los cuadrantes indicados. La Figura 10E muestra histogramas de citometna de flujo representativos de PBMC en las regiones recuadradas en C y D para mostrar diferencias en el nivel de DC-STAMP en la superficie. La Figura 11 muestra que IFN-a impide el desarrollo inducido por RANKL de una celula DC-STAMPlQ y mantiene el fenotipo DC-STAMPhi. La Figura 11A muestra un histograma de citometna de flujo representativo de celulas RAW 264.7 que se cultivaron durante 1, 2, 3 o 4 dfas con IFN-a y se tineron con anticuerpo marcado con fluorescencia contra DC-STAMP para citometna de flujo. Los histogramas de citometna de flujo representativos de >3 experimentos muestran el patron de expresion en superficie de DC-STAMP para cada dfa (histograma gris solido) y para las celulas no tratadas (histograma de puntos). La Figura 11B muestra un histograma de citometna de flujo representativo como se describe en (A) en celulas RAW 264.7 cultivadas durante 3 dfas con RANKL, IFN-a, RANKL antes que IFN-a, o IFN-a antes que RANKL. Los histogramas representativos muestran el patron de expresion en superficie de DC-STAMP para cada condicion de cultivo para revelar el efecto dependiente del estadio de la exposicion a IFN-a. La Figura 11C muestra un histograma de citometna de flujo intracelular representativo realizado usando un anticuerpo marcado con fluorescencia contra DC-STAMP en celulas tratadas con RANKL o IFN -a durante 3 dfas. La Figura 11D muestra una citometna de flujo representativa para DC- STAMP de superficie en celulas DC-STAMPlQ inducidas por RANKL clasificadas y que se volvieron a cultivar durante 3 dfas con RANKL, RANKL e IFN-a, o INF -a solo. La Figura 11E muestra una citometna de flujo representativa para DC-STAMP de superficie en macrofagos de medula osea de ratones WT C57B1/6 o IFNR1-/- cultivados con RANKL durante 4 dfas. Los numeros indican el porcentaje de celulas en la region DC-STAMPlQ indicada.

La Figura 12 muestra que los OCP DC-STAMPlQ inducidos por RANKL expresan mas IFN de tipo I que los OCP DC-STAMPhi y son capaces de generar celulas multinucleadas TRAP+ en co-cultivo con celulas expuestas a IFN -a. La Figura 12A muestra graficos de barras que demuestran el cambio en veces relativo de ARNm (+ SEM) para IFN de tipo I y SOCS1 y SOCS3 que contrarrestan los efectos de los IFN de tipo I en OCP DC-StAMPIQ inducidos por RANK clasificados con FACS (barras negras) y OCP DC-STAMPhi (barras blancas). Los graficos son representativos de experimentos realizados por triplicado y los datos estan normalizados para la p-actina. *P<0,05 frente a DC-STAMPId. La Figura 12B muestra histogramas de citometna de flujo representativos que demuestran pSTAT1 intracelular en OCP DC-STAMPhi y DC-STAMPlQ inducidos por RANKL procedentes de macrofagos de medula osea de C57B1/6 despues de 4 dfas de cultivo con RANKL (histogramas grises solidos) en comparacion con macrofagos de medula osea antes de la exposicion a RANKL (histograma de contorno negro). Los numeros representan el porcentaje de celulas en las regiones indicadas. La Figura 12C muestra un grafico de barras que demuestra celulas DC-STAMPhi y DC-STAMPlQ inducidas por RANKL clasificadas por FACS o celulas DC-STAMPlQ inducidas por RANKL clasificadas con FACS y celulas RAW 264.7 cultivadas con IFN-a durante 3 dfas que se co-cultivaron durante 3 dfas mas con RANKL. El numero medio de celulas multinucleadas TRAP+ por pocillo + SEM (n = 4) se cuantifico para el co-cultivo de DC-STAMPlQ + DC-STAMPhi inducido por RANKL (barra blanca) o CD-STAMPlQ inducidas por RANKL + celulas cultivadas con IFN-a (barra rayada).

La Figura 13 muestra que ratones NZBxNZW F1 con artrosis no erosiva y ratones NZW tratados con Ad-IFN-a con SIA tienen una menor frecuencia de PBMC CD11b+DC-STAMPlQ y una poblacion de PBMC CD11b+DC- STAMPhi prominente. Las Figuras 13A-13C muestran graficos de puntos de citometna de flujo representativos de sangre que se recogio a partir de los ratones NZW y NZBxNZW F1 (A, B) de 2, 5 y 9 meses de edad, y de los ratones NZW tratados con Ad-IFN-a y SIA (C). Se marcaron PBMC con anticuerpos marcados con fluorescencia

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espedficos para CD11b y DC-STAMP, y se analizaron por citometna de flujo como se describe en la seccion de Metodos. Se muestran graficos de puntos representativos para destacar el porcentaje de PBMC CD11b+DC- STAMPlD en las regiones recuadradas indicadas.

La Figura 14 muestra que un transcriptoma de IFN-a elevado se correlaciona significativamente con una menor frecuencia de PBMC CD11b+DC-STAMPlD Una menor frecuencia de PBMC CD11b+DC-STAMPlQ se correlaciona significativamente con un mayor volumen oseo. La Figura 14A muestra un grafico que demuestra un analisis de regresion lineal del porcentaje de PMBC CD11b+DC-STAMPlQ y datos de expresion del gen ifi202. La Figura 14B muestra un grafico que demuestra un analisis de regresion lineal del porcentaje de PBMC CD11b+DC-STAMPlQ y el volumen del astragalo. Los puntos individuales representan valores medios para 3-5 ratones.

La Figura 15 muestra una caracterizacion funcional del mAb 1A2 contra DC-STAMP. La Figura 15A es un grafico que demuestra que existe una correlacion positiva entre la expresion de DC-STAMP y CD16. Los monocitos CD14+CD16+ humanos tienen una mayor expresion en superficie de DC-STAMP que las celulas CD14+CD16-. Se purificaron PBMC humanos por gradiente de Ficoll y se tineron con un coctel de anticuerpo compuesto de anticuerpos 7-AAD, DC-STAMP y CD16. La expresion de DC-STAMP en celulas CD14+CD16- y CD14+CD16 se marco en gris y negro respectivamente. Para este analisis se uso el anticuerpo policlonal de DC-STAMP disponible en el mercado KR104. La Figura 15B es una imagen de una transferencia de Western que muestra protemas de dos controles sanos (HC A y HC B) que se aislaron, se inmunoprecipitaron, se separaron por gel de protema en gradiente al 10% y se sondaron con el mAb 1A2 contra DC-STAMP. La Figura 15C muestra imagenes de expresion de DC-STAMP en PBMC humanas y celulas gigantes (tumor oseo) detectadas por tincion inmunohistoqmmica (IHC) usando 1A2, (a) y (b). Se purificaron PBMC humanas por gradiente de Ficoll, se incluyeron en parafina para obtener secciones y se tineron con (a) control de isotipo de IgG2a de raton o (b) 1A2. Se seccionaron muestras de biopsia humana recogidas de tumores oseos, y se tineron con (c) control de isotipo de IgG2a de raton o (d) 1A2. Tanto el 1A2 como el control de isotipo de IgG2a de raton se diluyeron a 1:1500 para la tincion. La expresion polarizada de DC-STAMP en celulas de tumor oseo se etiqueto mediante flechas. La Figura 15D muestra que el mAb 1A2 contra -DC-STAMP podfa bloquear la formacion de OC in vitro. Se cultivaron monocitos humanos enriquecidos en ausencia (a) o presencia (b) de 1A2 durante 8 dfas y se tineron con TRAP para la visualizacion y enumeracion de OC. La Figura 15D(c) muestra un grafico del recuento medio de OC en ausencia (barra izquierda, 489 + 284) o presencia (barra derecha, 60 + 107) de 1A2 en el cultivo celular. Se empleo el ensayo de permutacion con 105 re-muestreos para el analisis estadfstico. El ensayo de permutacion mostro una diferencia significativa entre dos condiciones de cultivo (p=0,013). Los datos mostrados fueron para 6 sujetos analizados y presentados en la Tabla 2.

La Figura 16 muestra que DC-STAMP se expresa en la superficie de monocitos y una pequena subserie de celulas CD3+ en PBCM humanas. La Figura 16A muestra un analisis de expresion de DC-STAMP en PBMC humanas. Se purificaron PBMC humanas a partir de sangre entera por gradiente de Ficoll, se sometieron a tincion con anticuerpo y analisis de citometna de flujo. Las PBMC humanas se tineron con un coctel de anticuerpo compuesto de 6 anticuerpos. Primero se excluyeron las celulas muertas (7AAD+) del analisis de los presentes solicitantes (a); y las PBMc vivas se seleccionaron basandose en el tamano celular por FSC y en la granularidad celular por SSC en 3 subseries (b) (P1, P2 y P3). La expresion de CD14 y DC-STAMP en la subserie P1, P2 y P3 se mostro en (c), (d) y (e), respectivamente. La expresion en la superficie de DC-STAMP en las celulas seleccionadas P1, P2 y P3 (f). Los datos mostrados son representativos de 4 sujetos HC y 4 PsA. La Figura 16B muestra que DC-STAMP se expresa en una subserie pequena de celulas CD3+. Se purificaron PBMC humanas y se tineron con un coctel de anticuerpo compuesto de 6 anticuerpos. Las PBMC se seleccionaron por FSC/SSC (a). Las celulas vivas se seleccionaron por 7AAD (b). Los monocitos, las celulas T y las celulas B se identificaron por seleccion de celulas CD14+, CD3+ y CD19+, respectivamente (c). El histograma muestra la superposicion de la expresion de DC-STAMP en poblaciones CD14+ (lmea gris clara), CD3+ (lmea negra) y CD19+ (lmea gris). Un pequeno porcentaje de CD3+ son DC-STAMP+ (indicado por la flecha). Se muestra la expresion relativa de DC-STAMP y CD3 en PBMC humanas (d). La Figura 16C muestra la expresion de DC-STAMP en monocitos humanos mostrada por las estrategias de seleccion por etapas para el analisis de PBCM humanas con un coctel de anticuerpos compuesto de 10 anticuerpos. Se seleccionaron PBMC totales en FSC y SSC (a); las celulas muertas se excluyeron por 7AAD (b); las celulas DC-STAMP+ vivas se seleccionaron como 1A2+ (~14%) basandose en los controles (c); las celulas 1A2+ se clasificaron adicionalmente en 4 subseries basandose en la expresion de CD3 y CD19 (d). Dos poblaciones de celulas 1A2+ principales, CD3- CD19- (31,9 %) y CD3+CD19- (38,4 %) se marcaron por <x y *, respectivamente. Las celulas DC-STAMP+ no B, no C (CD3-CD19-1A2+, indicado por <» en (d)) se diseccionaron adicionalmente en 4 subseries (Q1, Q2, Q3, Q4) por expresion de CD14 y CD16 (e). La expresion de CD11b y CD11c (i, iii, v, vii) y HLA-DR y CD 15 (ii, iv, vi, viii) en estas 4 subseries se mostraron de (i) a (viii). Los numeros en cada grafico de puntos representan la intensidad media de fluorescencia (MFI) de cada marcador individual. El dato experimental es representativo de 4 muestras independientes.

La Figura 17 muestra que las PBMC humanas tienen cuatro patrones de expresion de DC-STAMP distintos que difieren entre sujetos Ps/PsA y HC. La Figura 17A muestra que se observaron cuatro patrones de expresion de DC-STAMP distintos en PBMC humanas. Se aislaron PBMC de una cohorte de sujetos humanos (>100) y se tineron con el anticuerpo 1A2-FITC). Las celulas muertas se excluyeron por 7-ADD. Vease en la Tabla 3 el criterio de clasificacion de estos patrones. La Figura 17B muestra el numero de sujetos observados en cada patron. El ensayo exacto de Fisher muestra una diferencia significativa entre HC, Ps y PsA en los patrones de

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DC-STAMP (valor de p = 0,0119). La Tabla 3 resume los patrones de DC-STAMP y la distribucion de pacientes HC y Ps/PsA en esos cuatro patrones.

La Figura 18 muestra que DC-STAMP esta regulado negativamente en monocitos humanos durante la osteoclastogenesis. La Figura 18A muestra cambios dinamicos de expresion en la superficie de DC-STAMP en 5 monocitos humanos durante la osteoclastogenesis. Se cultivaron monocitos humanos enriquecidos en medio suplementado con RANKL y M-CSF, y se examino la expresion en la superficie de DC-STAMP en diferentes puntos de tiempo (a: dfa0, b: dial, c: dfa2, d: dfa5, e: dfa7). Las lmeas continuas en cada panel representan el nivel de expresion de DC-STAMP original en monocitos recientes y las lmeas abiertas muestran la expresion de DC-STAMP en los diversos puntos de tiempo. La Figura 18B muestra imagenes que demuestran la localizacion 10 celular de DC-STAMP. Se cultivaron monocitos humanos con RANKL+M-CSF durante 8 dfas, se fijaron y se inmunotineron con DAPI que se une a los nucleos, 1A2 anti-DC-STAMP-FITC, y faloidina rodamina para la actina. Las imagenes muestran la localizacion de DC-STAMP en un pro-OC con forma de huso (a) y en OC maduros (b). Las celulas mostradas en (a) y (b) se cultivaron en un solo portaobjetos con los mismos aumentos. Las imagenes son representativas de celulas frecuentes con fenotipos similares (mononucleares frente a multi- 15 nucleadas y forma de huso frente a forma redonda grande).

La Figura 19 muestra que las celulas DC-STAMPhigh demuestran un mayor potencial de osteoclastogenesis. La Figura 19A muestra una estrategia de seleccion de monocitos humanos basandose en la expresion de DC- STAMP. Se enriquecieron monocitos humanos por seleccion negativa, se tineron con 1A2-FITC y se clasificaron en DC-STAMPhig y DC-STAMPlow (1,9 % y 1,8 % del maximo y mmimo). La Figura 19B muestra imagenes de la 20 actividad de resorcion osea de celulas DC-STAMPhigh y DC-STAMPlow. Se cultivaron celulas DC-STAMPhigh y DC- STAMPlow clasificadas mostradas en (A) con obleas de hueso durante 14 dfas en presencia de RANKL y M-CSF. Los numeros entre parentesis representan el numero total de OC TRAP+ por 105 celulas clasificadas. Se mostraron OC y cavidades de erosion en las obleas de hueso por celulas DC-STAMPlow y DC-STAMPhigh en (a y b) y (c y d) respectivamente. Representantes de tres experimentos individuales realizados en HC.

25 La Figura 20 muestra que las protemas DC-STAMP estan fosforiladas en restos de tirosina y se asocian con CD16 y SHP-1. La Figura 20A muestra lisados celulares de OC, DC y monocitos (M) que se sometieron a inmunoprecipitacion (IP) con mAb 1A2 contra DC-STAMP (a) o mAb contra CD16 (b). Los inmunoprecipitados se separaron por SDS-PAGE y se sometieron a inmunotransferencia (IB) con mAb 4G10 anti-fosfotirosina. La Figura 20B muestra lisados celulares de monocitos sometidos a IP con mAb contra DC-STAMP (a) o contra 30 CD16 (b), e IB con mAb 1A2 contra DC-STAMP. La Figura 20C muestra lisados celulares de monocitos que se sometieron a IP con mAb 1A2 anti-DC-STAMP e IB con mAb anti-SHP-1.

DESCRIPCION DETALLADA

35 En el presente documento se proporcionan anticuerpos como se definen en las reivindicaciones que se unen espedficamente a un epftopo de DC-STAMP. Espedficamente, en el presente documento se proporcionan anticuerpos monoclonales que se unen a un epftopo de DC-STAMP, en donde el epftopo comprende la secuencia de aminoacidos Glu-Val-His-Leu-Lys-Leu-His-Gly-Glu-Lys-Gln-Gly-Thr-Gln (SEQ ID No: 1). Opcionalmente, el epftopo comprende la secuencia de aminoacidos His-Gly-Glu-Lys-Gln-Gly-Thr-Gln (SEQ ID NO: 2). Una cadena 40 ligera del anticuerpo monoclonal comprende la SEQ ID NO: 5. Una cadena pesada del anticuerpo monoclonal comprende la SEQ ID NO: 6.

Tambien se proporcionan composiciones que comprenden un anticuerpo como se define en las reivindicaciones, en donde la composicion comprende un anticuerpo que se une espedficamente a un epftopo de DC-STAMP, y en 45 donde el epftopo de DC-sTaMP comprende la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2. El anticuerpo comprende una cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 5. El anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 6. El anticuerpo es anticuerpo monoclonal. La composicion puede comprender ademas, por ejemplo, un vehmulo farmaceuticamente aceptable.

50 Ademas, se proporcionan metodos para inhibir la osteoclastogenesis en una celula. Los metodos comprenden administrar a la celula una composicion que comprende un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo bloqueante) que se une espedficamente a un epftopo de DC-STAMP. Una cadena ligera del anticuerpo comprende la sEq ID NO: 5. Una cadena pesada del anticuerpo comprende la SEQ ID NO: 6. El anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. Opcionalmente, el epftopo de DC-STAMP comprende la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. La composicion puede 55 administrarse, por ejemplo, in vitro o a un sujeto in vivo. La celula puede, por ejemplo, ser una celula de mairftfero. Opcionalmente, la celula de mairftfero puede ser una celula humana. Las celulas pueden incluir celulas progenitoras, celulas madre, osteoclastos y similares.

Como se una en el presente documento, el termino anticuerpo incluye, pero sin limitacion, inmunoglobulina entera 60 (es decir, un anticuerpo intacto) de cualquier clase. Los anticuerpos nativos normalmente son glicoprotemas heterotetramericas compuestas de dos cadenas ligeras (L) identicas y dos cadenas pesadas (H) identicas. Tfpicamente, cada cadena ligera esta unida a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que el numero de enlaces disulfuro vana entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulinas. Cada cadena pesada y ligera tambien tiene puentes disulfuro intracatenarios separados regularmente. Cada cadena 65 pesada tiene en un extremo un dominio variable (V(H)) seguido de varios dominios constantes. Cada cadena ligera

tiene un dominio variable en un extremo (V(L)) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera esta alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera esta alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que los restos de aminoacido particulares forman una interfaz entre los dominios variables de cadena ligera y cadena pesada. Las cadenas ligeras 5 de los anticuerpos de cualquier especie de vertebrado pueden asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, denominados kappa (k) y lambda (X), basandose en las secuencias de aminoacidos de sus dominios constantes. Dependiendo de la secuencia de aminoacidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas pueden dividirse adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG-1, IgG-2, IgG-3 e IgG-4; 10 IgA-1 e IgA-2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan alfa, delta, epsilon, gamma y mu, respectivamente.

El termino variable se usa en el presente documento para describir ciertas partes de los dominios de anticuerpo que difirieren en secuencia entre anticuerpos y se usan en la union y especificidad de cada anticuerpo particular por su 15 antfgeno particular. Sin embargo, la variabilidad normalmente no se distribuye de forma uniforme a lo largo de los dominios variables de los anticuerpos. Tfpicamente, se concentra en tres segmentos denominados regiones determinantes de complementariedad (CDR) o regiones hipervariables tanto en los dominios variables de la cadena ligera como en los dominios variables de la cadena pesada. Las partes mas conservadas de los dominios variables se denominan regiones marco (FR). Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera nativas comprenden, 20 cada uno, cuatro regiones FR, que adoptan principalmente una configuracion de lamina p, conectadas por tres CDR, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lamina p. Las CDR de cada cadena se mantienen juntas y proximas entre sf por las regiones FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formacion del sitio de union a antfgeno de los anticuerpos. Los dominios constantes no estan implicados directamente en la union de un anticuerpo a un antfgeno, pero presentan diversas funciones efectoras, tales como la 25 participacion del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de anticuerpo.

Como se usa en el presente documento, se entiende que el termino epftopo incluye cualquier determinante capaz de interaccionar espedficamente con los anticuerpos proporcionados. Los determinantes epitopicos normalmente consisten en agrupamientos de moleculas de superficie qmmicamente activos tales como aminoacidos o cadenas 30 laterales de azucar y normalmente tienen caractensticas estructurales tridimensionales espedficas, asf como caractensticas de carga espedficas. La identificacion del epftopo que reconoce el anticuerpo se realiza como se indica a continuacion. En primer lugar, se preparan diversas estructuras parciales de la molecula diana que reconoce el anticuerpo monoclonal. Las estructuras parciales se preparan preparando peptidos parciales de la molecula. Estos peptidos se preparan, por ejemplo, por tecnicas de smtesis de oligopeptidos conocidas o mediante la incorporacion 35 de un ADN que codifica el polipeptido parcial deseado en un plasmido de expresion adecuado. El plasmido de expresion se libera en un hospedador adecuado, tal como E. coli, para producir los peptidos. Por ejemplo, puede prepararse una serie de polipeptidos que tienen longitudes apropiadamente reducidas, trabajando desde el extremo C o N de la molecula diana, mediante tecnicas de ingeniena genetica establecidas. Al establecer que fragmentos reaccionan con el anticuerpo, se identifica la region del epftopo. El epftopo se identifica de forma mas precisa 40 mediante la smtesis de una diversidad de peptidos pequenos o mutantes de los peptidos usando tecnicas de smtesis de oligopeptidos establecidas. Los peptidos mas pequenos se usan, por ejemplo, en un ensayo de inhibicion competitiva para determinar si un peptido espedfico interfiere con la union del anticuerpo a la molecula diana. Si es asf, el peptido es el epftopo al que se une el anticuerpo. Pueden usarse kits disponibles en el mercado, tales como el Kit SPOTs (Genosys Biotechnologies, Inc., The Woodlands, TX) y una serie de kits de smtesis de peptidos en 45 multipines basandose en el metodo de smtesis en multipines (Chiron Corporation, Emeryvile, CA) para obtener una gran diversidad de oligopeptidos.

El termino anticuerpo o fragmentos del mismo tambien puede incluir anticuerpos quimericos y anticuerpos dbridos, con especificidades de antfgeno o epftopo duales o multiples, y fragmentos tales como F(ab')2, Fab', Fab y similares, 50 incluyendo fragmentos dbridos. De esta manera, se proporcionan fragmentos de los anticuerpos que conservan la capacidad de unirse a sus antfgenos espedficos. Por ejemplo, dentro del significado del termino anticuerpo o fragmento del mismo se incluyen fragmentos de anticuerpos que mantienen la actividad de union a DC-STAMP. Dichos anticuerpos y fragmentos pueden obtenerse por tecnicas conocidas en este campo y pueden seleccionarse con respecto a la especificidad y actividad de acuerdo con metodos generales para producir anticuerpos y explorar 55 la especificidad y actividad de los anticuerpos (vease Harlow and Lane. Antibodies, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Publications, New York (1988)).

Dentro del significado de anticuerpos o fragmentos de los mismos tambien se incluyen conjugados de fragmentos de anticuerpos y protemas de union a antfgeno (anticuerpos monocatenarios) como se describe, por ejemplo, en la 60 Patente de Estados Unidos N.° 4.704.692.

El anticuerpo de la invencion es un anticuerpo monoclonal. El termino anticuerpo monoclonal como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo de una poblacion sustancialmente homogenea de anticuerpos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la poblacion son identicos excepto por posibles mutaciones 65 naturales que pueden estar presentes en cantidades minoritarias. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse

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usando metodos de hibridoma tales como los descritos por Kohler and Milstein, Nature, 256: 495 (1975) o Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Publications, New York (1988). En un metodo de hibridoma, un raton u otro animal hospedador apropiado tipicamente se inmuniza con un agente de inmunizacion para inducir linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se uniran espedficamente al agente 5 de inmunizacion. Como alternativa, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. El agente de inmunizacion puede ser DC-STAMP o un fragmento inmunogenico del mismo.

En general, se usan linfocitos de sangre periferica (PBL) en metodos para producir anticuerpos monoclonales si se desean celulas de origen humano, o se usan celulas de bazo o celulas de ganglio linfatico si se desean fuentes de 10 mairnfero no humano. Los linfocitos despues se fusionan con una lmea celular inmortalizada usando un agente de fusion adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una celula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, paginas 59-103 (1986)). Las lmeas celulares inmortalizadas normalmente son celulas de marnffero transformadas, incluyendo celulas de mieloma de origen de roedor, bovino, equino y humano. Normalmente, se emplean lmeas celulares de mieloma de rata o raton. Las celulas de hibridoma pueden 15 cultivarse en un medio de cultivo adecuado que preferentemente contiene una o mas sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las celulas inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las celulas parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas tfpicamente incluira hipoxantina, aminopterina y timidina (“medio HAT”) como sustancias que impiden el crecimiento de celulas deficientes en HGPRT.

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Las lmeas de celulas inmortalizadas utiles en el presente documento son las que se fusionan eficazmente, soportan un alto nivel de expresion estable de anticuerpo por las celulas productoras de anticuerpo seleccionadas y son sensibles a un medio tal como medio HAT. Las lmeas de celulas inmortalizadas incluyen lmeas de mieloma murino, que pueden obtenerse, por ejemplo, en el Salk Institute Cell Distribution Center; San Diego, Calif, y la American Type 25 Culture Collection; Rockville, Md. Tambien se han descrito lmeas celulares de mieloma humano y de heteromieloma de raton-humano para la produccion de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, paginas 51-63 (1987)).

30 El medio de cultivo en que se cultivan las celulas de hibridoma despues puede ensayarse con respecto a la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra DC-STAMP o epftopos seleccionados de los mismos. La especificidad de union de los anticuerpos monoclonales producidos por las celulas de hibridoma puede determinarse por inmunoprecipitacion o por un ensayo de union in vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Dichas tecnicas y ensayos se conocen en la tecnica y se describen 35 adicionalmente en Harlow and Lane Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York (1988).

Despues de que se han identificado las celulas de hibridoma deseadas, los clones pueden subclonarse por dilucion limitante de procedimientos de clasificacion FACS y crecimiento por metodos convencionales. Los medios de cultivo 40 adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, Medio de Eagle Modificado de Dulbecco y Medio RPMI-1640. Como alternativa, las celulas de hibridoma pueden cultivarse in vivo como ascitis en un mamnfero.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones pueden aislarse o purificarse del medio de cultivo o el lfquido asdtico por procedimientos de purificacion de inmunoglobulina convencionales tales como, por ejemplo, 45 protema A-Sepharose, cromatograffa de hidroxilapatita, electroforesis en gel, dialisis o cromatograffa de afinidad.

Los anticuerpos monoclonales tambien pueden obtenerse por metodos de ADN recombinantes, tales como los descritos en la Patente de Estados Unidos N.° 4.816.567. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales puede aislarse facilmente y secuenciarse usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas 50 oligonucleoffdicas que son capaces de unirse espedficamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos murinos). Las celulas de hibridoma pueden servir como una fuente preferida de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN puede ponerse en vectores de expresion, que despues se introducen por transfeccion en celulas hospedadoras tales como celulas COS de simio, celulas de ovario de hamster chino (CHO), celulas de plasmacitoma o celulas de mieloma que, de otra manera, no producen protema inmunoglobulina, para obtener la smtesis de 55 anticuerpos monoclonales en las celulas hospedadoras recombinantes. El ADN tambien puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante de dominios constantes humanos de cadena pesada y ligera en lugar de las secuencias murinas homologas (Patente de Estados Unidos N.° 4.816.567) o mediante la union covalente a la secuencia codificante de inmunoglobulina de todo o parte de la secuencia codificante de un polipeptido que no es inmunoglobulina. Dicho polipeptido que no es inmunoglobulina puede sustituir a los dominios constantes de un 60 anticuerpo proporcionado en el presente documento, o puede sustituir a los dominios variables de un sitio de combinacion con el anffgeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimerico que comprende un sitio de combinacion de anffgenos que tiene especificidad por DC-STAMP y otro sitio de combinacion de anffgenos que tiene especificidad por un anffgeno diferente.

65 Los metodos in vitro tambien son adecuados para preparar anticuerpos monovalentes. La digestion de anticuerpos

para producir fragmentos de los mismos, particularmente, fragmentos de Fab, puede realizarse usando tecnicas rutinarias conocidas en este campo. Por ejemplo, la digestion puede realizarse usando papama. Se describen ejemplos de digestion con papama en el documento WO 94/29348, la Patente de Estados Unidos N.° 4.342.566, y Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York, (1988). La digestion 5 con papama de anticuerpos tipicamente produce dos fragmentos de union a antigeno identicos, denominados fragmentos Fab, cada uno con un solo sitio de union a antigeno, y un fragmento Fc residual. El tratamiento con pepsina produce un fragmento, denominado el fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de combinacion de antfgeno y aun es capaz de reticular el antigeno.

10 Los fragmentos Fab producidos en la digestion de anticuerpos tambien pueden contener los dominios constantes de la cadena ligera y el primer dominio constante de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adicion de unos pocos restos en el extremo carboxi del dominio de cadena pesada incluyendo una o mas cistemas de la region de bisagra de anticuerpo. El fragmento F(ab')2 es un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab' unidos por un puente disulfuro a la region de bisagra. Fab'-SH es la denominacion del presente 15 documento para un Fab' en el que el resto o los restos de cistema de los dominios constantes llevan un grupo tiol libre.

Un metodo para producir protemas que comprenden los anticuerpos o polipeptidos proporcionados es unir dos o mas peptidos o polipeptidos entre sf por tecnicas de qmmica de protemas. Por ejemplo, los peptidos o polipeptidos 20 pueden sintetizarse qmmicamente usando un equipo de laboratorio disponible actualmente usando la qmmica de Fmoc (9-fluorenilmetil-oxicarbonilo) o Boc (ferc-butiloxicarbonilo) (Applied Biosystems, Inc.; Foster City, CA). Los expertos en la materia apreciaran facilmente que un peptido o polipeptido correspondiente al anticuerpo proporcionado en el presente documento, por ejemplo, puede sintetizarse por reacciones qmmicas convencionales. Por ejemplo, un peptido o polipeptido puede sintetizarse y no escindirse de su resina de smtesis mientras que el otro 25 fragmento de un anticuerpo puede sintetizarse y posteriormente escindirse de la resina, exponiendo de esta manera un grupo terminal que esta bloqueado funcionalmente en el otro fragmento. Por reacciones de condensacion de peptidos, estos dos fragmentos pueden unirse covalentemente a traves de un enlace peptfdico por su extremo carboxilo y amino, respectivamente, para formar un anticuerpo o un fragmento del mismo. (Grant, Synthetic Peptides: A User Guide. W.H. Freeman and Co., N.Y. (1992); Bodansky and Trost, Ed., Principles of Peptide 30 Synthesis, Springer Verlag Inc., NY (1993)). Como alternativa, el peptido o polipeptido puede sintetizarse independientemente in vivo. Una vez aislados, estos peptidos o polipeptidos independientes pueden unirse para formar un anticuerpo o fragmento del mismo a traves de reacciones de condensacion de peptidos similares.

Por ejemplo, el ligamiento enzimatico de segmentos peptfdicos clonados o sinteticos puede permitir que los 35 fragmentos peptfdicos relativamente cortos se unan para producir fragmentos peptfdicos de mayor tamano, polipeptidos o dominios de protema completa (Abrahmsen et al., Biochemistry, 30: 4151 (1991)). Como alternativa, puede utilizarse el ligamiento qmmico nativo de peptidos sinteticos para construir de forma sintetica grandes peptidos o polipeptidos a partir de fragmentos peptfdicos mas cortos. Este metodo consiste en una reaccion qmmica de dos etapas (Dawson et al. Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science, 266: 776-9 (1994)). La 40 primera etapa es la reaccion quimioselectiva de un tioester de un peptido sintetico no protegido con otro segmento peptfdico no protegido que contiene un resto de Cys amino terminal para dar un intermedio ligado a tioester como producto covalente inicial. Sin cambio en las condiciones de reaccion, este intermedio se somete a una reaccion intramolecular rapida y espontanea para formar un enlace peptfdico nativo en el sitio de union. La aplicacion de este metodo de ligamiento qmmico nativo a la smtesis total de una molecula de protema se ilustra por la preparacion de 45 la interleucina 8 (IL-8) humana (Baggiolini et al., FEBS Lett. 307: 97-101 (1992); Clark et al., J. Biol. Chem. 269: 16075 (1994); Clark et al., Biochemistry 30: 3128 (1991); Rajarathnam et al., Biochemistry 33: 6623-30 (1994)).

Como alternativa, pueden unirse qmmicamente segmentos peptfdicos no protegidos cuando el enlace formado entre los segmentos peptfdicos como resultado del ligamiento qmmico es un enlace no natural (no peptfdico) (Schnolzer et 50 al., Science 256: 221 (1992)). Esta tecnica se ha usado para sintetizar analogos de dominios de protema, asf como grandes cantidades de protemas relativamente puras con actividad biologica completa (deLisle et al., Techniques in Protein Chemistry IV. Academic Press, New York, paginas 257-67 (1992)).

Los fragmentos polipeptfdicos proporcionados pueden ser protemas recombinantes obtenidas por clonacion de 55 acidos nucleicos que codifican el polipeptido en un sistema de expresion capaz de producir los fragmentos polipeptfdicos del mismo, tales como sistemas de expresion bacterianos, de adenovirus o de baculovirus. Por ejemplo, se puede determinar el dominio activo de un anticuerpo a partir de un hibridoma espedfico que puede causar un efecto biologico asociado con la interaccion del anticuerpo con DC-STAMP. Por ejemplo, pueden delecionarse aminoacidos que se ha observado que no contribuyen a la actividad o especificidad de union o afinidad 60 del anticuerpo sin perdida en la actividad respectiva.

Los fragmentos proporcionados, si estan unidos a otras secuencias, tambien pueden incluir inserciones, deleciones, sustituciones u otras modificaciones seleccionadas de regiones particulares o restos de aminoacidos espedficos, siempre que la actividad del fragmento no se vea alterada o perjudicada significativamente en comparacion con el 65 anticuerpo o epftopo no modificado. Estas modificaciones pueden proporcionar algunas propiedades adicionales,

tales como retirar o anadir aminoacidos capaces de formar enlaces disulfuro, aumentar su longevidad biologica, alterar sus caractensticas de secrecion y similares. En cualquier caso, el fragmento puede poseer una propiedad bioactiva, tal como una actividad de union, regulacion de la union en el dominio de union, y similares. Las regiones funcionales o activas pueden identificarse por mutagenesis de una region espedfica de la protema, seguido de la 5 expresion y ensayo del polipeptido expresado. Dichos metodos son facilmente evidentes para un experto en la materia y pueden incluir mutagenesis espedfica de sitio del acido nucleico que codifica el antfgeno (Zoller et al., Nucl. Acids Res. 10: 6487-500 (1982)).

Tambien se proporciona en el presente documento una version humanizada o humana del anticuerpo. 10 Opcionalmente, el anticuerpo modula la actividad de la molecula de DC-STAMP activando o inhibiendo la molecula de DC-STAMP. Opcionalmente, el anticuerpo humanizado o humano comprende al menos una region determinante de complementariedad (CDR) de un anticuerpo que tiene la misma especificidad de epftopo que un anticuerpo producido por la lmea celular de hibridoma desvelada en el presente documento. Por ejemplo, el anticuerpo puede comprender todas las CDR de un anticuerpo que tiene la misma especificidad de epftopo que un anticuerpo 15 producido por la lmea celular de hibridoma.

Opcionalmente, el anticuerpo humanizado o humano puede comprender al menos un resto de la region marco de las cadenas ligeras o pesadas proporcionadas en la SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6. Los anticuerpos humanizados y humanos pueden obtenerse usando metodos conocidos por un experto en la materia; por ejemplo, el anticuerpo 20 humano puede producirse usando un animal mutante de la lmea germinal o por una biblioteca de presentacion en fagos.

Los anticuerpos tambien pueden generarse en otras especies y humanizarse para administracion a seres humanos. Como alternativa, tambien pueden obtenerse anticuerpos completamente humanos inmunizando un raton u otra 25 especie capaz de crear un anticuerpo completamente humano (por ejemplo, raton geneticamente modificado para producir anticuerpos humanos) y separar clones que se unen a DC-STAMP. Vease, por ejemplo, Lonberg and Huszar, Int. Rev. Immunol. 13: 65-93, (1995). Como se usa en el presente documento, el termino humanizado y humano en relacion con los anticuerpos, se refiere a cualquier anticuerpo que se espera que induzca una respuesta inmunogenica debil terapeuticamente tolerable en un sujeto humano. De esta manera, el termino incluye 30 completamente humanizado o completamente humano, asf como parcialmente humanizado o parcialmente humano.

Son formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) inmunoglobulinas quimericas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de union a antfgeno de los anticuerpos) que contienen secuencias mmimas derivadas de inmunoglobulina no humana. Los 35 anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que restos de una CDR del receptor se han reemplazado por restos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como un raton, rata o conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseada. En algunos casos, los restos marco de Fv de las inmunoglobulinas humanas se reemplazan por restos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados tambien pueden comprender restos que no se unen ni en el anticuerpo receptor ni en la CDR 40 importada o secuencias marco. En general, el anticuerpo humanizado comprendera sustancialmente todos o al menos uno, y tfpicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado optimamente tambien comprendera al menos una parte de una region constante de inmunoglobulina (Fc), tfpicamente la de una 45 inmunoglobulina humana (Jones et al., Nature, 321: 522-5 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-7 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-6 (1992)).

En general, un anticuerpo humanizado tiene uno o mas restos de aminoacido introducidos procedentes de una fuente que no es humana. Estos restos de aminoacido no humanos con frecuencia se denominan restos importados, 50 que tfpicamente se toman de un dominio variable importado. La humanizacion puede realizarse esencialmente siguiendo los metodos descritos en Jones et al., Nature 321: 522-5 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-7 (1988); o Verhoeyen et al., Science 239: 1534-6 (1988), sustituyendo CdR de roedor o secuencias CDR por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, dichos anticuerpos humanizados son anticuerpos quimericos (Patente de Estados Unidos N.° 4.816.567) en donde sustancialmente menos de un dominio 55 variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la practica, los anticuerpos humanizados son tfpicamente anticuerpos humanos en los que algunos restos de CDR y posiblemente algunos restos de FR se han sustituido por restos de sitios analogos en anticuerpos de roedor.

Las secuencias de nucleotidos que codifican los anticuerpos proporcionados pueden aislarse y secuenciarse 60 facilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotfdicas que pueden unirse espedficamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos). Estas secuencias de nucleotidos tambien pueden modificarse, o humanizarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante de dominios constantes de cadena pesada y ligera humana en lugar de las secuencias murinas homologas (vease, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N.° 4.816.567). Las secuencias de nucleotidos que 65 codifican cualquiera de los anticuerpos proporcionados pueden expresarse en celulas hospedadoras apropiadas.

Estas incluyen celulas hospedadoras procariotas incluyendo, pero sin limitacion, E. coli, Bacillus subtilus, otras bacterias de la familia enterobacteriaceae tales como Salmonella typhimurium o Serratia marcesans, y diversas especies de Pseudomonas. Tambien pueden utilizarse celulas hospedadoras eucariotas. Estas incluyen, pero sin limitacion, celulas de levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris) y celulas de mairnfero tales 5 como celulas VERO, celulas HeLa, celulas de ovario de hamster chino (CHO), celulas W138, celulas BHK, celulas COS-7, celulas 293T y celulas MDCK. Los anticuerpos producidos por estas celulas pueden purificarse del medio de cultivo y ensayarse con respecto a la union, actividad, especificidad o cualquier otra propiedad de los anticuerpos monoclonales utilizando los metodos expuestos en este documento y convencionales en la tecnica.

10 Pueden emplearse animales transgenicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, tras la inmunizacion, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de produccion de inmunoglobulina endogena. Por ejemplo, se ha descrito que la delecion homocigota del gen de la region de union de la cadena pesada del anticuerpo (J(H)) en ratones mutantes de lmea germinal y quimericos da como resultado una inhibicion completa de la produccion de anticuerpo endogeno. La transferencia de la serie de genes de inmunoglobulina de lmea germinal 15 humana en dicho raton mutante de lmea germinal dara como resultado la produccion de anticuerpos humanos tras la exposicion al antfgeno (vease, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551-5 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-8 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno. 7: 33 (1993)). Tambien pueden producirse anticuerpos humanos en bibliotecas de presentacion en fagos (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)). Tambien estan disponibles las tecnicas de Cole et al. y Boerner et 20 al. para la preparacion de anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, ed., p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991)).

El anticuerpo o fragmento proporcionado puede marcarse o fusionarse con otro polipeptido o fragmento del mismo. Por ejemplo, los anticuerpos proporcionados o fragmentos de los mismos pueden fusionarse con un agente 25 terapeutico. De esta manera, un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a DC-STAMP puede unirse a un agente terapeutico. El enlace puede ser covalente o no covalente (por ejemplo, ionico). Los agentes terapeuticos incluyen, pero sin limitacion, toxinas, incluyendo, pero sin limitacion, toxinas vegetales y bacterianas, moleculas pequenas, peptidos, polipeptidos y protemas. Tambien se proporcionan protemas de fusion modificadas por ingeniena genetica en las que genes que codifican un anticuerpo o fragmentos del mismo, incluyendo la region Fv, 30 pueden fusionarse con los genes que codifican una toxina para liberar una toxina a la celula diana. Como se usa en el presente documento, una o mas celulas son celulas DC-STAMP positivas.

Otros ejemplos de agentes terapeuticos incluyen agentes quimioterapeuticos, un agente radioterapeutico y un agente inmunoterapeutico, asf como combinaciones de los mismos. De esta manera, el complejo de anticuerpo 35 suministrado al sujeto puede ser multifuncional, ya que ejerce un efecto terapeutico por la union a DC-STAMP y un segundo efecto terapeutico mediante la liberacion de un agente terapeutico complementario.

El agente terapeutico puede actuar extracelularmente, por ejemplo, iniciando o logrando una respuesta inmunitaria, o puede actuar intracelularmente, directamente por translocacion a traves de la membrana celular o indirectamente, 40 por ejemplo, logrando senalizacion a traves de la membrana celular. El agente terapeutico opcionalmente se puede escindir del anticuerpo o fragmento. La escision puede ser autolftica, realizarse por proteolisis o efectuarse poniendo en contacto la celula con un agente de escision. Ademas, el anticuerpo o fragmentos del mismo tambien pueden actuar extracelularmente, por ejemplo, iniciando, efectuando, potenciando o reduciendo una respuesta inmunitaria sin asociarse en un complejo molecular con un agente terapeutico. Dicho anticuerpo se conoce en la tecnica como 45 anticuerpo no conjugado. Un anticuerpo no conjugado puede inducir directamente una senal de crecimiento negativo o apoptosis o activar indirectamente un mecanismo de defensa de un sujeto para mediar la actividad antitumoral. El anticuerpo o fragmento puede modificarse para potenciar la destruccion celular dependiente de anticuerpo. Por ejemplo, pueden realizarse sustituciones de aminoacidos en la region Fc de los anticuerpos o fragmentos desvelados en el presente documento para aumentar la union de receptores de Fc para aumentar la citotoxicidad 50 celular dependiente de anticuerpo o aumentar la fagocitosis. El anticuerpo o fragmento tambien puede usarse para inducir la proliferacion celular. Al inducir la proliferacion celular, pueden potenciarse los efectos de un agente quimioterapeutico o radioterapeutico descrito en el presente documento.

Los ejemplos de toxina o restos de toxina incluyen difteria, ricina, estreptavidina y modificaciones de las mismas. Un 55 anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede conjugarse con un resto terapeutico tal como una citotoxina, un agente terapeutico o un ion metalico radiactivo. Una citotoxina o agente citotoxico incluye cualquier agente que es perjudicial para las celulas. Los ejemplos incluyen paclitaxel, cisplatino, carboplatino, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, etoposido, tenoposido, colchicina, dihidroxi antracinadiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procama, tetracama, lidocama, propranolol, puromicina y 60 analogos u homologos de los mismos. Los agentes terapeuticos incluyen, pero sin limitacion, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo, decarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tiotepa, clorambucilo, melfalan, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (por ejemplo, daunorubicina (anteriormente daunomicina) y doxorubicina), antibioticos (por 65 ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC)), y agentes

antimitoticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina).

Las tecnicas para conjugar dicho resto terapeutico a los anticuerpos son bien conocidas, vease, por ejemplo, Amon et al., Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), paginas 243-56 (1985); Hellstrom et al., 5 Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson et al. (eds.), paginas 623-53 (1987); Thorpe, Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), paginas 475-506 (1985); “Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy” in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), paginas 303-16 (1985), y Thorpe et al., Immunol. Rev. 62: 11958 (1982). Como alternativa, un anticuerpo puede conjugarse con un segundo anticuerpo para formar un anticuerpo 10 heteroconjugado como se describe en la Patente de Estados Unidos N.° 4.676.980.

En el presente documento se proporciona un anticuerpo contra DC-STAMP, un anticuerpo contra DC-STAMP humanizado, inmunoglobulinas de cadena pesada y ligera de un anticuerpo contra DC-STAMP, CDR del anticuerpo contra DC-STAMP y ciertos truncamientos de estos anticuerpos o inmunoglobulinas que realizan las funciones del 15 anticuerpo o inmunoglobulina de longitud completa. Por ejemplo, la secuencia de acido nucleico que codifica los anticuerpos contra DC-STAMP puede estar alterada. De tal manera, se desvelan acidos nucleicos que codifican las secuencias polipeptfdicas, variantes y fragmentos de las mismas. Estas secuencias incluyen todas las secuencias degeneradas relacionadas con una secuencia de protema espedfica, es decir, todos los acidos nucleicos que tienen una secuencia que codifica una secuencia de protema particular, asf como todos los acidos nucleicos, incluyendo 20 acidos nucleicos degenerados que codifican las variantes desveladas y derivados de las secuencias de protema. De esta manera, aunque cada secuencia de acido nucleico particular puede no estar escrita en el presente documento, se entiende que, en realidad, todas y cada una de las secuencias se desvelan y describen en el presente documento a traves de las secuencias de protema desveladas.

25 Como ocurre con todos los peptidos, polipeptidos y protemas, incluyendo fragmentos de los mismos, se entiende que pueden producirse modificaciones adicionales en la secuencia de aminoacidos de los anticuerpos contra DC- STAMP que no alteren la naturaleza o funcion de los peptidos, polipeptidos o protemas. Dichas modificaciones incluyen sustituciones de aminoacidos conservativas y se analizan con mayor detalle mas adelante.

30 Los anticuerpos contra DC-STAMP proporcionados en el presente documento tienen una funcion deseada. El anticuerpo contra DC-STAMP se une a un epttopo espedfico de la protema DC-STAMP. La union del epttopo puede inhibir, por ejemplo, la osteoclastogenesis.

Los anticuerpos contra DC-STAMP desvelados en el presente documento pueden modificarse y variarse 35 adicionalmente siempre que se mantenga la funcion deseada. Se entiende que una manera de definir cualquier modificacion conocida y derivados o los que podnan surgir a partir de las secuencias de acido nucleico y protemas desveladas en el presente documento es mediante la definicion de las modificaciones y derivados en terminos de identidad con secuencias conocidas espedficas. Se desvelan espedficamente polipeptidos que tiene al menos un 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 por 40 ciento de identidad con los anticuerpos contra DC-STAMP proporcionados en el presente documento. Los expertos en la materia entenderan facilmente como determinar la identidad de dos polipeptidos. Por ejemplo, la identidad puede calcularse despues de alinear las dos secuencias de forma que la identidad llegue a su maximo nivel.

Otra forma de calcular la identidad puede realizarse publicando algoritmos. Un alineamiento optimo de secuencias 45 con fines comparativos puede realizarse por el algoritmo de identidad local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math 2: 482 (1981), por el algoritmo de alineamiento de identidad de Needleman y Wunsch, J. Mol Biol. 48: 443 (1970), por la busqueda del metodo de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), por implementaciones informatizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA del Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o por inspeccion.

50

Los mismos tipos de identidad pueden obtenerse para acidos nucleicos, por ejemplo, mediante los algoritmos desvelados en Zuker, Science 244: 48-52 (1989); Jaeger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 7706-10 (1989); Jaeger et al., Methods Enzymol. 183:281-306 (1989). Se entiende que tfpicamente puede usarse cualquiera de los metodos y que, en ciertos casos, los resultados de estos diversos metodos pueden diferir, pero el experto en la 55 materia debe entender que, si se encuentra identidad con al menos uno de estos metodos, se dina que las secuencias tienen la identidad indicada y estanan desveladas en el presente documento.

Las modificaciones de protemas incluyen modificaciones de secuencias de aminoacidos. Las modificaciones en la secuencia de aminoacidos pueden producirse de forma natural como variaciones alelicas (por ejemplo, debido al 60 polimorfismo genetico) o pueden producirse por intervencion humana (por ejemplo, por mutagenesis de secuencias de ADN clonadas), tales como mutantes de punto inducido, delecion, insercion y sustitucion. Estas modificaciones pueden dar como resultado cambios en la secuencia de aminoacidos, proporcionar mutaciones silenciosas, modificar un sitio de restriccion o proporcionar otras mutaciones espedficas. Las modificaciones en la secuencia de aminoacidos tfpicamente se incluyen en una o mas de tres clases: modificaciones de sustitucion, insercion o 65 delecion. Las inserciones incluyen fusiones amino y/o terminales, asf como inserciones intrasecuencia de restos de

aminoacidos individuals o multiples. Las inserciones normalmente seran inserciones mas pequenas que las de las fusiones amino o carboxi terminales, por ejemplo, del orden de uno a cuatro restos. Las deleciones se caracterizan por la retirada de uno o mas restos de aminoacido de la secuencia de protemas. Tfpicamente, no se delecionan mas de aproximadamente 2 a 6 restos en ningun sitio dentro de la molecula de protema. Las sustituciones de 5 aminoacidos tipicamente son de restos individuales, pero pueden aparecer en varias localizaciones diferentes al mismo tiempo; las inserciones normalmente seran del orden de aproximadamente 1 a 10 restos de aminoacido; y las deleciones variaran de aproximadamente 1 a 30 restos. Las deleciones o inserciones preferentemente se realizan en pares adyacentes, es decir, una delecion de 2 restos o una insercion de 2 restos. Las sustituciones, deleciones, inserciones o cualquier combinacion de las mismas pueden combinarse para conseguir una construccion final. Las 10 mutaciones no deben poner la secuencia fuera de la fase de lectura y preferentemente no crearan regiones complementarias que puedan producir una estructura de ARNm secundaria. Las modificaciones sustitucionales son aquellas en las que se ha retirado al menos un resto y se ha insertado un resto diferente en su lugar. Dichas sustituciones generalmente se realizan de acuerdo con la siguiente Tabla 1 y se denominan sustituciones conservativas.

15 Tabla 1: Sustituciones de aminoacidos

Aminoacido

Sustituciones (en la tecnica se conocen otras)

Ala

Ser, Gly, Cys

Arg

Lys, Gln, Met, Ile

Asn

Gln, His, Glu, Asp

Asp

Glu, Asn, Gln

Cys

Ser, Met, Thr

Gln

Asn, Lys, Glu, Asp

Glu

Asp, Asn, Gin

Gly

Pro, Ala

His

Asn, Gln

Ile

Leu, Val, Met

Leu

Ile, Val, Met

Lys

Arg, Gln, Met, Ile

Met

Leu, Ile, Val

Phe

Met, Leu, Tyr, Trp, His

Ser

Thr, Met, Cys

Thr

Ser, Met, Val

Trp

Tyr, Phe

Tyr

Trp, Phe, His

Val

Ile, Leu, Met

Las modificaciones, incluyendo las sustituciones de aminoacidos espedficas, se realizan por metodos conocidos. A modo de ejemplo, se realizan modificaciones por mutagenesis espedfica de sitio de nucleotidos en el ADN que codifica la protema, produciendo de esta manera ADN que codifica la modificacion, y posteriormente expresando el ADN en el cultivo celular recombinante. Las tecnicas para realizar mutaciones de sustitucion en sitios 20 predeterminados en el ADN que tiene una secuencia conocida son bien conocidas, por ejemplo, la mutagenesis inducida por M13 y la mutagenesis por PCR.

En el presente documento se proporcionan metodos para inhibir la osteoclastogenesis en una celula. Dichos metodos incluyen administrar una composicion que comprende cualquiera de los anticuerpos contra DC-STAMP 25 proporcionados en el presente documento.

En el presente documento se proporcionan composiciones que comprenden los anticuerpos contra DC-STAMP descritos en el presente documento. Las composiciones proporcionadas en el presente documento son adecuadas para administracion in vitro o in vivo. Opcionalmente, las composiciones que comprenden los anticuerpos contra DC- 30 STAMP pueden comprender ademas un vehmulo farmaceuticamente aceptable. Por vehmulo farmaceuticamente aceptable se entiende un material que no es indeseable biologicamente y de otra manera, es decir, el material se administra a un sujeto sin provocar efectos biologicos indeseables o interactuar de una manera perjudicial con los demas componentes de la composicion farmaceutica en la que esta contenido. El vehmulo se selecciona para minimizar cualquier degradacion del principio activo y para minimizar cualquier efecto secundario adverso en el 35 sujeto.

Se describen vehmulos adecuados y sus formulaciones en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a Edicion, David B. Troy, ed., Lippicott Williams & Wilkins (2005). Tfpicamente, se usa una cantidad apropiada de una sal farmaceuticamente aceptable en la formulacion para hacer que la formulacion sea isotonica. Los ejemplos de los 40 vehmulos farmaceuticamente aceptables incluyen, pero sin limitacion, agua esteril, solucion salina, soluciones tamponadas tales como solucion de Ringer y solucion de dextrosa. El pH de la solucion generalmente es de aproximadamente 5 a aproximadamente 8 o de aproximadamente 7 a 7,5. Otros vehmulos incluyen preparaciones de liberacion sostenida tales como matrices semipermeables de polfmeros hidrofobos solidos que contienen los polipeptidos inmunogenicos. Las matrices estan en forma de artmulos moldeados, por ejemplo, pelmulas, liposomas

o micropartmulas. Ciertos vehmulos pueden ser mas preferibles dependiendo, por ejemplo, de la via de administracion y concentracion de la composicion que se este administrando. Los vehmulos son los adecuados para la administracion de la composicion, por ejemplo, los polipeptidos descritos en el presente documento y el adenovirus que codifica un antigeno, a seres humanos u otros sujetos.

5

Las composiciones se administran de varias formas dependiendo de si se desea el tratamiento local o sistemico y del area a tratar. Las composiciones se administran a traves de cualquiera de varias vfas de administracion, incluyendo la via topica, oral, parenteral, intravenosa, intra-articular, intraperitoneal, intramuscular, subcutanea, intracavitaria, transdermica, intrahepatica, intracraneal, nebulizacion/inhalacion, o por instilacion a traves de 10 broncoscopia.

Las preparaciones para administracion parenteral incluyen emulsiones, suspensiones y soluciones esteriles acuosas o no acuosas. Son ejemplos de disolventes no acuosos propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva y esteres organicos inyectables tales como oleato de etilo. Los vehmulos acuosos incluyen agua, 15 soluciones, emulsiones o suspensiones alcoholicas/acuosas, incluyendo solucion salina y medio tamponado. Los vehmulos parenterales incluyen solucion de cloruro sodico, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sodico, solucion de Ringer con lactato o aceites fijos. Los vehmulos intravenosos incluyen reponedores de fluidos y de nutrientes, reponedores de electrolitos (tales como los basados en dextrosa de Ringer) y similares. Opcionalmente estan presentes conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo, agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes, 20 y gases inertes y similares.

Las formulaciones para administracion topica incluyen pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, pulverizaciones, lfquidos y polvos. Opcionalmente son necesarios o deseables vehmulos farmaceuticos convencionales, bases acuosas, en polvo u oleosas, espesantes y similares.

25

Las composiciones para administracion oral incluyen polvos o granulos, suspensiones o soluciones en agua o medios no acuosos, capsulas, sobres o comprimidos. Opcionalmente son deseables espesantes, aromatizantes, diluyentes, emulsionantes, adyuvantes de dispersion o aglutinantes.

30 Opcionalmente, las moleculas de acido nucleico o polipeptidos se administran por un vector que comprende la molecula de acido nucleico o una secuencia de acido nucleico que codifica el anticuerpo contra DC-STAMP. Hay varias composiciones y metodos que pueden usarse para liberar las moleculas de acido nucleico y/o polipeptidos a las celulas, in vitro o in vivo, a traves de, por ejemplo, vectores de expresion. Estos metodos y composiciones pueden romperse principalmente en dos clases: sistemas de liberacion basados en virus y sistemas de liberacion no 35 basados en virus. Dichos metodos son bien conocidos en la tecnica y son facilmente adaptables al uso con las composiciones y metodos descritos en el presente documento.

Como se usan en el presente documento, los plasmidos o vectores virales son agentes que transportan los acidos nucleicos desvelados al interior de la celula sin degradacion indeseada e incluyen un promotor que produce la 40 expresion de la molecula de acido nucleico y/o un polipeptido adaptador en las celulas en las que se va a liberar. Son vectores virales, por ejemplo, adenovirus, virus adenoasociado, virus del herpes, Vaccinia virus, poliovirus, Sindbis y otros virus de ARN, incluyendo estos virus con la cadena principal de VIH. Tambien es preferida cualquier familia viral que comparta las propiedades de estos virus, lo cual hace que sean adecuadas para uso como vectores. Se describen vectores retrovirales en general por Coffin et al., Retroviruses, Cold Spring Harbor Laboratory Press 45 (1997). Se ha descrito la construccion de adenovirus con defectos de replicacion (Berkner et al., J. Virology 61: 1213-20 (1987); Massie et al., Mol. Cell. Biol. 6: 2872-83 (1986); Haj-Ahmad et al., J. Virology 57: 267-74 (1986); Davidson et al., J. Virology 61: 1226-39 (1987); Zhang et al., BioTechniques 15: 868-72 (1993)). El efecto beneficioso y el uso de estos virus como vectores es que estan limitados en el grado en el que pueden extenderse a otros tipos celulares, ya que pueden replicarse dentro de una celula infectada inicial, pero no pueden formar nuevas 50 partmulas virales infecciosas. Se ha demostrado que los adenovirus recombinantes consiguen una alta eficacia despues de la liberacion directa in vivo en el epitelio de las vfas respiratorias, hepatocitos, endotelio vascular, parenquima del SNC y varios tejidos distintos. Otros sistemas utiles incluyen, por ejemplo, vectores de vaccinia virus capaces de replicarse e incapaces de replicarse y restringidos en cuanto al hospedador.

55 Los anticuerpos contra DC-STAMP proporcionados y/o las moleculas de acido nucleico que codifican los anticuerpos contra DC-STAMP pueden liberarse a traves de partmulas de tipo virus. Las partmulas de tipo virus (VLP) consisten en una o mas protemas virales derivadas de las protemas estructurales de un virus. Se describen metodos para fabricar y usar partmulas de tipo virus, por ejemplo, en Garcea y Gissmann, Current Opinion in Biotechnology 15: 513-7(2004).

60

Los anticuerpos contra DC-STAMP proporcionados pueden liberarse por cuerpos densos subvirales (DB). Los DB transportan protemas al interior de las celulas diana por fusion de membranas. Se describen metodos para fabricar y usar DB, por ejemplo, en Pepperl-Klindworth et al., Gene Therapy 10: 278-84 (2003).

65 Los anticuerpos contra DC-STAMP proporcionados pueden liberarse por agregados de tegumento. Se describen

metodos para fabricar y usar agregados de tegumento en la Publicacion Internacional N.° WO 2006/110728.

Los metodos de liberacion que no estan basados en virus pueden incluir vectores de expresion que comprenden moleculas de acido nucleico y secuencias de acido nucleico que codifican los polipeptidos adaptadores, en donde 5 los acidos nucleicos estan unidos operativamente a una secuencia de control de la expresion. Las cadenas principales de vector adecuadas incluyen, por ejemplo, las usadas rutinariamente en la tecnica tales como plasmidos, cromosomas artificiales, BAC, YAC o PAC. Estan disponibles en el mercado numerosos vectores y sistemas de expresion de corporaciones tales como Novagen (Madison, WI), Clonetech (Pal Alto, CA), Stratagene (La Jolla, CA), e Invitrogen/Life Technologies (Carlsbad, CA). Los vectores ffpicamente contienen una o mas 10 regiones reguladoras. Las regiones reguladoras incluyen, sin limitacion, secuencias promotoras, secuencias potenciadoras, elementos de respuesta, sitios de reconocimiento de protemas, elementos inducibles, secuencias de union a protemas, regiones 5' y 3' no traducidas (UTR), sitios de inicio de la transcripcion, secuencias de terminacion, secuencias de poliadenilacion e intrones.

15 Pueden obtenerse promotores preferidos que controlan la transcripcion a partir de vectores en celulas hospedadoras de mairnfero procedentes de diversas fuentes, por ejemplo, los genomas de virus tales como polioma, Virus de Simio 40 (SV40), adenovirus, retrovirus, virus de la hepatitis B y, mas preferentemente, citomegalovirus (CMV), o de promotores de marnffero heterologos (por ejemplo, promotor de la p-actina o promotor de EF1a), o de promotores tffbridos o quimericos (por ejemplo, el promotor de CMV fusionado al promotor de la p-actina). Tambien son utiles en 20 el presente documento promotores de la celula hospedadora o especies relacionadas.

Potenciador generalmente se refiere a una secuencia de ADN que funciona a una distancia no fija del sitio de inicio de la transcripcion y puede estar en posicion 5' o 3' con respecto a la unidad de transcripcion. Ademas, los potenciadores pueden estar dentro de un intron, asf como dentro de la propia secuencia que lo codifica. 25 Normalmente tienen una longitud comprendida entre 10 y 300 pares de bases y funcionan en cis. Los potenciadores normalmente funcionan aumentando la transcripcion a partir de promotores cercanos. Los potenciadores tambien pueden contener elementos de respuesta que median la regulacion de la transcripcion. Aunque se conocen muchas secuencias potenciadoras a partir de genes de marnffero (globina, elastasa, albumina, fetoprotema e insulina), ffpicamente una usara un potenciador de un virus de celulas eucariotas para la expresion general. Son ejemplos 30 preferidos el potenciador de SV40 en el lado tardfo del origen de replicacion, el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardm del origen de replicacion y potenciadores de adenovirus.

El promotor y/o el potenciador pueden ser inducibles (por ejemplo, pueden estar regulados qmmica o ffsicamente). 35 Un promotor y/o potenciador regulado qmmicamente puede regularse, por ejemplo, por la presencia de alcohol, tetraciclina, un esteroide o un metal. Un promotor y/o potenciador regulado ffsicamente puede regularse, por ejemplo, por factores ambientales tales como la temperatura y luz. Opcionalmente, la region promotora y/o potenciadora puede actuar como un promotor y/o potenciador constitutivo para maximizar la expresion de la region de la unidad de transcripcion a transcribir. En ciertos vectores, la region promotora y/o potenciadora puede ser activa 40 de una manera espedfica del tipo celular. Opcionalmente, en ciertos vectores, la region promotora y/o potenciadora puede ser activa en todas las celulas eucariotas, independientemente del tipo celular. Son promotores preferidos de este tipo el promotor de CMV, el promotor de SV40, el promotor de la p-actina, el promotor de EF1a y la repeticion terminal larga retroviral (LTR).

45 Los vectores tambien pueden incluir, por ejemplo, offgenes de replicacion y/o marcadores. Un gen marcador puede conferir un fenotipo seleccionable, por ejemplo, resistencia a antibioticos, en una celula. El producto marcador se usa para determinar si el vector se ha liberado a la celula y, una vez liberado, se esta expresando. Los ejemplos de marcadores de seleccion para celulas de marnffero son dihidrofolato reductasa (DHFR), timidina quinasa, neomicina, analogo de neomicina G418, higromicina, puromicina y blasticidina. Cuando dichos marcadores de seleccion se 50 transfieren satisfactoriamente a una celula hospedadora de mamfffero, la celula hospedadora de marnffero transformada puede sobrevivir si se pone bajo presion selectiva. Los ejemplos de otros marcadores incluyen, por ejemplo, el gen lacZ de E. coli, la protema verde fluorescente (GFP) y luciferasa. Ademas, un vector de expresion puede incluir una secuencia tag disenada para facilitar la manipulacion o deteccion (por ejemplo, purificacion o localizacion) del polipeptido expresado. Ciertas secuencias Tag, tales como GFP, glutation S-transferasa (GST), 55 polihistidina, c-myc, hemaglutinina o tag FLAG™ (Kodak; New Haven, CT) ffpicamente se expresan como una fusion con el polipeptido codificado. Dichas secuencias tag pueden insertarse en cualquier sitio dentro del polipeptido, incluyendo el extremo carboxilo o amino.

Como se usan en el presente documento, los terminos peptido, polipeptido o protema se usan en sentido amplio 60 para hacer referencia a dos o mas aminoacidos unidos por un enlace pepffdico. Protema, peptido y polipeptido tambien se usan en el presente documento indistintamente para hacer referencia a secuencias de aminoacidos. Debe reconocerse que el termino polipeptido no se usa en el presente documento para sugerir un tamano o numero de aminoacidos particular que comprenden la molecula y que un peptido de la invencion puede contener hasta varios restos de aminoacido o mas.

Como se usa a lo largo del presente documento, un sujeto puede ser un vertebrado, mas espedficamente un mairnfero (por ejemplo, un ser humano, caballo, gato, perro, vaca, cerdo, oveja, cabra, raton, conejo, rata y cobaya), aves, reptiles, anfibios, peces y cualquier otro animal. El termino no denota una edad o sexo particular. De esta manera, se pretende incluir sujetos adultos y recien nacidos, tanto del sexo masculino como del sexo femenino. 5 Como se usa en el presente documento, un paciente o sujeto puede usarse indistintamente y el termino paciente o sujeto incluye sujetos humanos y veterinarios.

Se desvelan materiales, composiciones y componentes que pueden usarse para, pueden usarse junto con, pueden usarse en la preparacion para, o son productos de los metodos y composiciones desvelados. Estos y otros 10 materiales se desvelan en el presente documento y se entiende que cuando se desvelan combinaciones, subseries, interacciones, grupos, etc. de estos materiales, aunque no se desvele explfcitamente la referencia a cada una de las diversas combinaciones individuales y colectivas y permutaciones de estos compuestos, se considera que todos ellos estan contemplados y descritos espedficamente en el presente documento. Por ejemplo, si se desvela y analiza un metodo y se analizan varias modificaciones que pueden realizarse en varias moleculas que incluye el 15 metodo, se contemplan espedficamente todas y cada una de las combinaciones y permutaciones del metodo, y las modificaciones que son posibles, a menos que se indique espedficamente lo contrario. De forma similar, tambien se contempla y desvela espedficamente cualquier subserie o combinacion de estas. Este concepto se aplica a todos los aspectos de esta divulgacion incluyendo, pero sin limitacion, etapas en metodos que usan las composiciones desveladas. De esta manera, si hay una diversidad de etapas adicionales que puedan realizarse, se entiende que 20 cada una de estas etapas adicionales puede realizarse con cualquier etapa de metodo o combinacion de etapas de metodo espedfica de los metodos desvelados, y que cada una de estas combinaciones o subseries de combinaciones se contempla espedficamente y debe considerarse desvelada.

Ejemplos

25

Ejemplo 1: Aislamiento de un nuevo anticuerpo monoclonal contra DC-STAMP y el papel de DC-STAMP en la osteoclastogenesis.

Metodos generales 30

Reactivos. Se obtuvieron citocinas RANKL recombinante, M-CSF, IL-4 y GM-CSF en Cell Sciences (Canton, MA), el IFN-a se adquirio en PBL Biomedical Laboratories (Piscataway, NJ). El vector de adenovirus recombinante que contema el ADNc de mIFN-a de subtipo 5 (Ad-IFN-a) se propago como se ha descrito previamente (Mathian et al., J. Immunol. 174: 2499-506 (2005)). Los anticuerpos anti-murinos usados incluyen: anti-CD16/CD32 para bloquear los 35 receptores de Fc (BD Pharmingen; San Jose, Ca), CD11b-APC clon M1/70 (BD Pharmingen), CD4-PE clon RM2504 (Caltag; Burlingame, CA), CD8a-PE/Cy5 clon 53-6.7 (Biolegend; San Diego, CA), Gr-1-APC/Cy7 clon RB6-8C5 (Biolegend), STAT1-PE pY701 (BD Biosciences) y CD11c-PE Cy5.5 clon N418 (eBioscience; San Diego, CA). El anticuerpo policlonal de conejo anti-DC-STAMP de raton clon KR104 se adquirio en Cosmo Bio (Tokyo, Japan), y el control de isotipo de IgG de raton se obtuvo en Caltag. Los anticuerpos anti-humanos usados incluyen: CD14-APC 40 clon M5E2 (BD Biosciences), CD44-PE/Cy5 clon IM7, SIRPa-PE/Cy7 clon SE5A5, CD47-PerCP/Cy5.5 clon CC2C6, y CD9-PE clon HI9a (Biolegend).

Animales: Se obtuvieron ratones New Zealand Black (NZB) x New Zealand White (NZW) F1 y NZW/LacJ en Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Los experimentos se realizaron en ratones hembra NZBxNZW F2 de 2, 5 y 9 45 meses de edad y en controles hembra NZA/LacJ de edad similar. Tambien se adquirieron ratones C57B1/6 y Balb/c en Jackson Laboratories. La lmea 3647 de los ratones TNF-Tg (Keffer et al., EmBO J. 10: 4025-31 (1991)), se obtuvo originariamente del Dr. G. Kollias (Institute of Immunology, Biomedical Sciences Research Center Alexander Fleming, Vari, Greece) y se mantiene como heterocigotos en un fondo C57B1/6. Los experimentos se realizaron en ratones hembra de 6 meses de edad TNF-Tg y sus companeros de camada no transgenicos se utilizaron como 50 controles.

Cultivo celular: Se obtuvieron celulas del linaje de monocitos/macrofagos murinos RAW 264.7 de la ATCC (Manasas, VA). Se obtuvieron celulas de medula osea murina como se ha descrito previamente (Takeshita et al., J. Bone Miner. Res. 15: 1477-88 (2000)) lavando abundantemente femures y tibias de ratones con solucion salina 55 tamponada con fosfato 1X (PBS) esteril. Los esplenocitos se obtuvieron por homogeneizacion del bazo en un filtro de celulas en un tubo que contema PBS 1X. Todos los organos se diseccionaron del raton usando una tecnica aseptica. Se retiraron los globulos rojos (RBC) de las suspensiones celulares usando tampon de lisis ACK (BioWhittaker; Walkersville, MD). Se cultivaron celulas derivadas de medula osea y esplenocitos en medio esencial minimo con modificacion alfa (alfa-MEM, Invitrogen; Carlsbad, CA) complementado con suero bovino fetal inactivo 60 termicamente al 10% (FCS, Hyclone Laboratories; Logan, UT), penicilina/estreptomicina al 5% y medio esencial minimo al 5 % con aminoacidos no esenciales (Invitrogen) con un pH final de 7,4. Se anadio M-CSF (50 ng/ml) a las celulas derivadas de medula osea durante 3 dfas para enriquecer la poblacion de CD11b+ adherente como se ha descrito previamente (Hayashi et al., J. Biol. Chem. 277: 27880-6 (2002)). Se anadieron otras citocinas a las celulas derivadas de medula osea enriquecidas en CD11b+, celulas RAW 264.7 o esplenocitos, si era necesario para el 65 experimento espedfico. Las celulas RAW 264.7, celulas de medula osea y esplenocitos en el medio de cultivo se

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incubaron a 37 °C en una atmosfera con un 5 % de CO2.

Osteoclastogenesis ex vivo e in vitro y generacion de mDC. Para generar osteoclastos (OC) ex vivo, se anadieron 10 ng/ml de M-CSF y 5 ng/ml de RANKL a 2 x 105 esplenocitos en alfa-MEM en placas de 96 pocillos 5 durante 7 dfas con medio limpio y se anadieron citocinas cada 2 dfas. Se generaron OC a partir de 2 x 105 celulas derivadas de medula osea CD11b+ despues de 3 dfas de cultivo con M-CSF anadiendo 100 ng/ml de RANKL en alfa-MEM a las celulas durante 3 dfas mas. Se anadio medio nuevo y citocinas un dfa sf y otro no. Se generaron OC in vitro a partir de celulas RAW 264.7 anadiendo 100 ng/ml de RANKL a alfa-MEM durante 4 dfas en placas de 96 pocillos o placas de cultivo de 100 mm. Para estudiar los efectos de IFN-a sobre el desarrollo de OC, se anadio IFN- 10 a (PBL Biomedical Laboratories) a 750 U/ml como se ha descrito previamente (Santini et al., J. Exp. Med. 191: 177788 (2000)). Se anadieron medio limpio y citocinas un dfa sf y otro no. Despues, las celulas se fijaron y se tineron con respecto a la actividad fosfatasa acida resistente a tartrato (TRAP) usando el Kit Diagnostics Acid Phosphatase (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO) para identificar OC (celulas TRAP+ con >3 nucleos) que se cuantificaron como area de OC como se ha descrito previamente (Flick et al., J. Orthop. Res. 21: 676-84 (2003)).

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Para la generacion de mDC, se cultivaron 2 x 105 celulas de medula osea durante 3 dfas con 50 ng/ml de M-CSF para enriquecer la poblacion CD11b+ adherente como se ha descrito previamente (Hayashi et al., J. Biol. Chem. 277: 27880-6 (2002)). Las celulas derivadas de medula osea CD11b+ despues se cultivaron en RPMI-1640 (Invitrogen) que contema 20 ng/ml de IL-4 y 20 ng/ml de GM-CSF durante 3 dfas mas con medio nuevo y se 20 anadieron citocinas cada dos dfas. La generacion de mDC por este metodo de cultivo se evaluo por tincion inmunofluorescente para visualizar los procesos dendnticos.

Tincion inmunofluorescente. Se cultivaron celulas derivadas de medula osea murinas o PBMC humanas en cubreobjetos de vidrio en placas de 12 pocillos con citocinas apropiadas. Las celulas se fijaron en PFA al 4 % 25 durante 20 minutos a temperatura ambiente para la tincion inmunofluorescente. Despues, las celulas se bloquearon y permeabilizaron con PBS que contema BSA al 0,2 % y saponina al 0,1 % durante 15 minutos. Los cubreobjetos se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas en una camara humeda, despues de lo cual se anadieron anticuerpos, DAPI o faloidina durante 45 minutos a temperatura ambiente en la solucion de bloqueo y permeabilizacion. Despues de la incubacion, los cubreobjetos se lavaron con PBS y se montaron en portaobjetos 30 para obtener imagenes. Las imagenes despues se ensamblaron, se pseudo-colorearon y se superpusieron usando el software Adobe Photoshop 7.0 (Adobe Systems; San Jose, CA).

Histologia. Se fijaron huesos largos de una pata de cada raton en formalina tamponada con fosfato al 10%, se descalcificaron en solucion de EDTA al 10 % durante dos semanas a temperatura ambiente con agitacion suave y se 35 incluyeron en parafina. Se prepararon secciones de histologfa a partir de tres secciones contiguas de 3 |im separadas por 500 |im, que se tineron con hematoxilina y azul alcian/orange G (ABH/orange G) o para TRAP usando el Kit Diagnostics Acid Phosphatase (Sigma) como se ha descrito previamente (Flick et al., J. Orthop. Res. 21: 676-84 (2003)). Los OC se cuantificaron a partir de las secciones tenidas con TRAP como se ha descrito previamente usando el sistema de software de analisis de imagenes Osteomeasure (Osteometrics; Atlanta, GA) y se 40 expresaron como numero de OC por mm de hueso o superficie de placa de cultivo (Flick et al., J. Orthop. Res. 21: 676-84 (2003)).

Generacion de un nuevo anticuerpo monoclonal contra DC-STAMP. Se genero un anticuerpo monoclonal (mAb) contra DC-STAMP inmunizando ratones con un peptido de catorce aminoacidos (Glu-Val-His-Leu-Lys-Leu-His-Gly- 45 Glu-Lys-Gln-Gly-Thr-Gln (SEQ ID NO: 1)) que compartfa homologfa con una secuencia presente en el cuarto dominio extracelular de DC-STAMP tanto murino como humano. Los clones de hibridoma con fuertes senales por EIA generados por este procedimiento de inmunizacion se expandieron en medio sin suero SAFC EX-CELL 610 HSF (Sigma; St. Louis, MO) y se usaron para generar anticuerpos, que se purificaron usando columnas HiTrap de protema G y PD10 (GE Healthcare Biosciences; Piscataway, NJ). El clon 1A2 de este proceso se evaluo y se uso 50 para todos los analisis a causa de su fuerte respuesta EIA y alto rendimiento despues de la purificacion. El isotipo del clon 1A2 se determino usando el Kit Isostrip Monoclonal Antibody Isotyping de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Santa Cruz Biotechnology; Santa Cruz, CA). La conjugacion con FITC se realizo usando el kit de marcaje de Molecular Probes (Invitrogen).

55 Inmunotransferencia. El mAb contra DC-STAMP se uso para inmunoprecipitar DC-STAMP en celulas cultivadas. El Kit de Extraccion de Protema de Membrana Nativa (Calbiochem; San Diego, CA) se uso para extraer las protemas de la fraccion de la membrana de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las protemas de la fraccion de membrana extrafdas se inmunoprecipitaron usando perlas de Gel de Afinidad de Protema A EzView Red (Sigma) despues de la incubacion durante 1 hora a 4 °C como mAb anti-DC-STAMP para formar complejos de anticuerpo- 60 antfgeno.

Despues de la inmunoprecipitacion, se realizo inmunotransferencia cargando la protema inmunoprecipitada sobre un gel al 10% para SDS-PAGe. Las protemas separadas se transfirieron sobre una membrana de PVDF usando un metodo de transferencia en humedo. Despues de la transferencia, la membrana se bloqueo durante 1 hora a 65 temperatura ambiente con BSA al 5 % (Sigma) en TBST. Despues, se anadio el mAb contra DC-STAMP clon 1 A2,

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anticuerpo policlonal de conejo anti-DC-STAMP de raton disponible en el mercado clon KR104, o IgG de raton a una dilucion 1:1000 en la solucion de bloqueo durante una noche a 4 °C. Despues de los lavados en TBST, se anadio conjugado de IgG de cabra anti-raton con peroxidasa de rabano picante (BioRad) a una dilucion 1:3000, seguido de mas lavados con TBST. Las manchas de transferencia se revelaron con el kit de sustrato quimioluminiscente 5 SuperSignal West Femto (Pierce; Rockford, IL) y se obtuvieron imagenes en pelmulas cientificas Kodak (Eastman Kodak; Rochester, NY).

Citometna de flujo y clasificacion de celulas activada por fluorescencia (FACS). Se realizo tincion de la protema de superficie en celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) murinas y celulas RAW 264.7 o 10 celulas de medula osea murinas cultivadas con citocinas segun fue apropiado para el experimento. Se obtuvo sangre periferica por puncion cardiaca y se puso en un tubo con EDTa al 0,5 % para impedir la coagulacion. Despues se separaron los globulos rojos (RBC) de las PBMC con tampon de lisis ACK. Se anadieron anti- CD16/CD32 a las PBMC para bloquear los receptores de Fc durante 15 minutos. Despues se tineron las PBMC en la oscuridad en hielo con mAb anti-DC-STAMP como conjugado con FITC durante 30 minutos en PBS 1X que contema 15 FCS al 4% (para citometna de flujo) o PBS 1X esteril sin FCS (para FACS). Tambien se anadieron 7AAD (Invitrogen) a algunas celulas durante la incubacion de 30 minutos, y se uso para determinar la seleccion para el analisis posterior de la expresion de la protema DC-STAMP en la superficie. La permeabilizacion de las celulas para la tincion interna se realizo usando el kit Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences). Se usaron CD11b-APC clon M1/70, CD11c-PE Cy5.5 clon N418, CD4-PE clon RM2504, CD8a=PE/Cy5 clon 53-6.7, STAT1pY701-PE y Gr-1-APC/Cy7 20 clon RB6-8C5 para el analisis de citometna de flujo multicolor murino. Se usaron CD14-APC clon M5E2, CD44- PE/Cy5 clon IM7, SIRPa-PE/Cy7 clon SE5A5, CD47-PerCP/Cy5.5 clon CC2C6 y CD9-PE clon H19a para el analisis de citometna de flujo multicolor humano. Si las celulas no podfan analizarse por citometna de flujo el mismo dfa, se fijaban en PFA al 1 % y se analizaban al dfa siguiente. La citometna de flujo se realizo usando un FacsCalibur o un LSR II (Becton Dickinson). El FACS se realizo el mismo dfa de la tincion usando un FACS Vantage o un FACS Aria 25 (Becton Dickinson). El analisis de los datos se realizo con el software WinMDI 2.9 (Scripps Research Institute; La Jolla, CA).

Artritis inducida por suero (SIA) y tratamiento in vivo con Ad-IFN-a. Se obtuvo suero artritogenico de ratones K/BxN (Kouskoff et al., Cell 87: 811-22 (1996)). El suero se evaluo con respecto a la capacidad de inducir artritis por 30 inyeccion intraperitoneal (IP) de ratones Balb/c (Jackson Laboratories; Bar Harbor, ME), que son una cepa muy susceptible a SIA. Se administro suero en PBS a ratones NZW y NZBxNZW F1 por inyeccion IP a una dosis de 250 |il por raton durante 5 dfas, despues de lo cual se recogieron los bazos, la sangre y las extremidades para el analisis posterior. Un tftulo de 1 x 1011 partmulas vmcas/ml en PBS se inyecto retro-orbitalmente en ratones 2 dfas antes que el suero artritogenico y 7 dfas antes de recoger los bazos, la sangre y las extremidades para un analisis adicional.

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Evaluacion volumetrica de erosion osea a traves de micro-CT. El volumen de hueso se cuantifico a traves de micro-CT in vivo de alta resolucion (VivaCT 40; Scanco, Southeastern, PA) como se ha descrito previamente (Proulx et al., Arthritis Rheum. 56: 4024-37 (2007)). En resumen, cada articulacion se exploro a una resolucion isotropica de 17.5 m en un soporte de muestra a medida a 55 keV, con modo de haz conico. Los datos se reconstruyeron 40 mediante el software Scanco en archivos Dicom para el analisis. Se uso el software Amira 3.1 para segmentar y visualizar los huesos de la articulacion del tobillo o la rodilla en las exploraciones micro-CT. Los huesos se marcaron espedficamente usando el elemento Segmentation Editor. Se establecio un umbral de densidad >11.000 AU como hueso representativo, y los marcadores se reconstruyeron usando el modulo SurfaceGen para visualizar el hueso. El umbral se mantuvo constante a lo largo de todo el estudio. Como se explora el hueso entero, su volumen, como se 45 determina a partir del modulo TissueStatistics, se uso como medida cuantitativa de la erosion osea.

ELISA de IFN-a. Se uso el kit ELISA de IFN -a de raton (PBL Biomedical Laboratories) para evaluar la produccion de IFN -a por celulas transfectadas con el vector Ad-IFN-a. El ELISA se realizo de acuerdo con las instrucciones del fabricante en sobrenadantes de celulas 293T cultivadas en medio con 1 x 1011 partmulas vmcas/ml de Ad-IFN-a o 50 Ad-Null durante 4 dfas. El sobrenadante de las celulas no tratadas de control y el sobrenadante de las celulas tratadas con virus Ad-Null no produjeron IFN-a, mientras que el sobrenadante de las celulas tratadas con Ad-IFN-a mostro una OD media a 450 nm de 1,089 + 0,081 que corresponde a aproximadamente 641,5 pg/ml. El kit ELISA se uso tambien para medir los niveles de IFN-a en suero en ratones NZBxNZW F1. Se recogio suero por centrifugacion de sangre periferica coagulada a 10.000 rpm a temperatura ambiente durante 5 minutos. No se detecto IFN-a por 55 encima del nivel de fondo en ratones NZBxNZW F1 a pesar de la presencia de proteinuria. Aunque eran inesperados, estos resultados estaban en lmea con los descubrimientos previos de que el ELISA para el IFN-a de suero no es fiable (Hua et al., Arthritis Rheum. 54: 1906-16 (2006)).

ELISA de anticuerpo anti-ADNds. Para medir los tttulos de anticuerpo contra ADNds en el suero de ratones 60 NZBxNZW F1 y NZW en todos los grupos de tratamiento, se obtuvo sangre periferica por puncion cardiaca y se dejo coagular. La sangre coagulada despues se centrifugo a 10.000 rpm a temperatura ambiente durante 5 minutos para separar el suero de los componentes celulares. El suero despues se transfirio a un nuevo tubo y se uso con un kit ELISA de Ig total de ADNds de raton (Alpha Diagnostic International; San Antonio, TX) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Analisis estadistico. Los datos se presentan como media + error tipico de la media. Se realizaron pruebas t de Student o analisis de varianza (ANOVA) con un nivel de significado de P<0,05. La regresion lineal y el analisis chi- cuadrado se realizaron con un nivel de confianza mmimo del 95 %. Los parametros estadfsticos se calcularon usando el software Microsoft Excel 9.0 (Microsoft; Redmond, WA) o el paquete de software GraphPad PRISM 5 (GraphPad Software; La Jolla, CA).

RESULTADOS

Un nuevo anticuerpo monoclonal para detectar la expresion en la superficie de DC-STAMP en OCP. Para 10 estudiar la expresion de protemas en la superficie, se genero un mAb contra un peptido en el cuarto dominio extracelular de DC-STAMP. Para la comparacion, se uso un anticuerpo policlonal contra DC-STAMP que ha mostrados histologicamente expresion en la superficie en OC (Kukita et al., J. Exp. Med. 200: 941-6 (2004)). Se cultivaron celulas CD11b+ durante 2 dfas con RANKL y se extrajeron protemas de la fraccion de membrana para inmunoprecipitacion con el mAb 1A2. La Figura 1A muestra que el clon 1 A2 del mAb reconoce una protema un poco 15 mayor de 50 kDa en condiciones reductoras (r) que tambien se reconoce por el anticuerpo policlonal de conejo disponible en el mercado. Los dos anticuerpos tambien reconocen una protema de doble peso molecular (~100 kDa) en condiciones no reductoras (nr). Tanto en condiciones reductoras como en condiciones no reductoras, el mAb contra DC-STAMP 1A2 tiene una banda mas intensa para la misma cantidad de protema cargada en cada calle. El analisis de inmunotransferencia de DC-STAMP procedente del lisado de protema celular total durante el transcurso 20 de la osteoclastogenesis muestra que DC-STAMP aumenta a lo largo del tiempo segun maduran las celulas desde OCP hasta OC en cultivo con RANKL. Los niveles de protema catepsina K confirmaron el estado maduro del OC cultivado (Figura 1B). El clon de mAb 1A2 se conjugo con FITC y se uso para determinar si podfa detectarse DC- STAMP en la superficie de la membrana sobre celulas DC11b+ por citometna de flujo. La Figura 2A muestra que celulas CD11b+ expresan una mayor cantidad media de DC-STAMP por celula en comparacion con celulas CD11b-. 25

Como se ha mostrado previamente que OCP procede de celulas de medula osea CD11b+, se inmunofenotipificaron celulas de medula osea DC-STAMP+CD11b+ para una caracterizacion adicional. Las celulas DC-STAMP+CD11b+ en medula osea C57B1/6 expresaban bajos niveles de marcadores de celulas T CD4 y CD8 (ambos aproximadamente en un 1 %). Por el contrario, los marcadores del linaje mieloide se expresaban de forma mas 30 elevada entre esas celulas. De la poblacion de celulas de medula osea DC-STAMP+CD11b+, el 13,5% eran de superficie CD11c+ y el 83,1 % eran Gr1+ (Figura 2B).

Las condiciones que favorecen la osteoclastogenesis presentan una superficie DC-STAMP diferente y un patron de expresion de protemas interno en comparacion con las condiciones que soportan la formacion de 35 mDC. Al descubrir que la expresion de la protema de superficie DC-STAMP podfa identificar celulas que tienen potencial osteoclastogenico por citometna de flujo, se determino el perfil de expresion de DC-STAMP a lo largo del proceso de formacion de OC. Como originalmente se descubrio DC-STAMP en mDC, y los OC y mDC comparten un precursor de CD11b+ comun, se comparo el perfil de expresion de DC-STAMP en ambos tipos celulares. Para determinar si existfa alguna diferencia en el perfil de expresion de DC-STAMP en la superficie en condiciones que 40 promovfan OC frente a condiciones que promovfan mDC, se trataron celulas de medula osea de ratones C57B1/6 con M-CSF durante 3 dfas para enriquecer la poblacion de monocitos/macrofagos CD11b+ como se ha establecido previamente (Hayashi et al., J. Biol. Chem. 277: 27880-6 (2002)). Estas celulas despues se trataron con RANKL pro- osteoclastogenico o con pro-mDC IL-4 mas GM-CSF. Despues de 3 dfas de cultivo, se evaluo el desarrollo de OC a traves de tincion con TRAP o de mDC por observacion mediante inmunofluorescencia de la formacion de procesos 45 dendnticos (Figura 3A). Las celulas tambien se inmunofenotipificaron en cada uno de los 3 dfas en las condiciones pro-OC o pro-mDC para la expresion de CD11b y CD11c. Se ha descrito previamente que mDC presenta un fenotipo CD11b+CD11c+ y se ha notificado que la expresion de CD11c aumenta durante la diferenciacion en mDC (Metlay et al., J. Exp. Med. 171: 1753-71 (1990), Adachi et al., Stem Cells 20: 61-72 (2002)). Bajo la exposicion a RANKL, se observo un aumento en la proporcion de celulas CD11b+CD11c-, que se ha demostrado que representa una 50 poblacion que contiene OCP (Li et al., Arthritis Rheum. 50: 265-76 (2004)). Por el contrario, hubo una reduccion en el porcentaje de esta poblacion en celulas expuestas a IL-4 y GM-CSF. Sin embargo, el cultivo con IL-4 y GM-CSF aumento el porcentaje de la poblacion CD11b+CD11c+, como era de esperar (Figura 3B).

Cuando se cultivaron celulas de medula osea en condiciones osteoclastogenicas y se analizaron por citometna de 55 flujo, se observo un fuerte pico individual para la expresion en la superficie de DC-STAMP el dfa uno del cultivo con RANKL expresado de forma bastante homogenea entre el 88 % de las celulas CD11b+ (Figura 4A). Esto esta de acuerdo con el descubrimiento entre las celulas CD11b+ en sangre periferica murina (Figura 2A). El dfa dos de cultivo con RANKL, el porcentaje de celulas CD11b+ que expresaban DC-STAMP en la superficie empezo a reducirse, mientras que una segunda poblacion de D11b+DC-STAMPlQ se volvio mas prominente. Despues de 3 dfas 60 de cultivo con RANKl, esta poblacion de celulas DC-STAMPlQ inducida por RANKL aumento a 1/3 de las celulas cultivadas totales, dejando un 67 % que expresaban el nivel original de DC-STAMP observado el dfa 1 de cultivo (Figura 4A). Cuando se comparo esta observacion con la situacion de celulas cultivadas con IL-4 + GM-CSF, el desplazamiento a celulas que expresaban una menor cantidad de DC-STAMP en la superficie en comparacion con lo observado en el primer dfa de exposicion a IL-4 + GM-CSF se produjo mas rapidamente y entre un mayor 65 porcentaje de las celulas en comparacion con el desplazamiento observado en cultivo con RANKL. El dfa 3 del

cultivo con IL-4 + GM-CSF, casi el 75 % de las celulas estaba expresando una menor cantidad de DC-STAMP en la superficie en comparacion con los niveles del dfa uno (Figura 4B).

Para determinar lo que puede representar estos desplazamientos en la expresion de DC-STAMP en la superficie, se 5 midieron los niveles internos de DC-STAMP durante el mismo periodo de tiempo en las mismas condiciones de cultivo que el analisis de DC-STAMP en la superficie. La citometna de flujo para la expresion de la protema DC- STAMP interna revelo que un porcentaje muy bajo de celulas expresaban DC-STAMP interno despues de 1 dfa de cultivo con RANKL en comparacion con el porcentaje que expresaba DC-STAMP interno despues de 1 dfa de cultivo con IL-4 + GM-CSF (Figura 4C y 4D). Un mayor porcentaje de celulas en condiciones de cultivo pro-mDC expresaba 10 DC-STAMP interno en relacion al porcentaje de celulas en condiciones pro-OC durante los 3 dfas de cultivo (29 % frente a 18,3 %, respectivamente).

Se observaron descubrimientos similares en monocitos derivados de PBMC humanos tratados con RANKL y M-CSF o IL-4 + GM-CSF. Como ocurre en las celulas murinas primarias, los monocitos humanos cultivados con RANKL y 15 M-CSF generaron dos poblaciones de celulas basandose en la expresion en la superficie de DC-STAMP (Figura 5A). Tambien de acuerdo con los datos murinos, cuando se cultivaron con IL-4 + GM-CSF, los monocitos humanos expresaron de forma homogenea menores cantidades de DC-STAMP en la superficie en comparacion con el nivel observado cuando estaban recien aislados (Figura 5B). La tincion inmunofluorescente de celulas cultivadas con RANKL y M-CSF revelo que las celulas que presentaban la morfologfa alargada que habfa resultado ser 20 caractenstica de las celulas que respondfan a estfmulos pro-osteoclastogenicos (Takeshita et al., J. Bone Miner. Res. 15: 1477-88 (2000)) habfan internalizado DC-STAMP (Figura 5C). La tincion inmunofluorescente de celulas cultivadas con IL-4 + GM-CSF tambien revelo DC-STAMP intracelular (Figura 5D). De nuevo, el patron observado intracelularmente por citometna de flujo en celulas murinas se replico por tincion inmunofluorescente de celulas humanas en las mismas condiciones de cultivo.

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Se uso FACS para clasificar OCP cultivadas con RANKL basandose en la expresion en la superficie de DC-STAMPhi y DC-STAMPlQ y se realizo citometna de flujo intracelular para determinar si habfa diferencias en los niveles de DC- STAMP interno entre esas dos poblaciones recien identificadas (Figura 6A). La citometna de flujo para DC-STAMP intracelular demostro que las celulas DC-STAMPlQ inducidas por RANKL teman una mayor MfI de DC-STAMP 30 intracelular en comparacion con las celulas DC-STAMPhi inducidas por RANKL. Hubo un mayor porcentaje de celulas DC-STAMPlQ (59 %) con este nivel de MFI de DC-STAMP intracelular en comparacion con el porcentaje de celulas DC-STAMPhi (11 %).

Caracteristicas de las celulas DC-STAMP10 y DC-STAMPhl inducidas por cultivo con RANKL. Para caracterizar 35 las celulas de DC-STAMPlQ y DC-STAMPhi identificadas recientemente generadas en cultivo en RANKL, se realizo una serie de analisis de fenotipificacion. Usando el parametro de dispersion frontal por citometna de flujo, se observo que las celulas DC-STAMPlQ inducidas por RANKl eran mayores que sus homologas DC-STAMPhi (Figura 7B). Como el analisis de inmunofenotipificacion de las celulas de medula osea que expresaban CD11b+DC-STAMP revelaba que el 13% de ellas era CD11c+, se examino si este marcador de mDC difena entre las celulas DC- 40 STAMPlD y DC-STAMPhi despues del cultivo con IL-4 + GM-CSF. Cuando estas celulas se clasificaron por FACS y se cultivaron con IL-4 + GM-CSF, se descubrio que ambas teman porcentajes similares de celulas CD11c+ (8788%). Sin embargo, las celulas DC-STAMPhi pudieron generar un mayor porcentaje de celulas MHCII+CD11c+ (19 %) en comparacion con las celulas DC-STAMpIQ (9,7 %) despues del mismo periodo de tiempo en cultivo (Figura 6C). El analisis de inmunofenotipificacion de celulas de medula osea que expresaban CD11b+DC-STAMP tambien 45 revelo un alto porcentaje de celulas Gr1+ entre esta poblacion. Esto debe tenerse en cuenta porque un papel reciente sobre la intervencion de DC-STAMP en la diferenciacion mieloide en granulocitos y no granulocitos demostro que la expresion de DC-STAMP estaba asociada con la ramificacion no granulocftica de celulas mieloides (Eleveld-Trancikova et al., Leukemia 22: 455-9 (2008)). Las celulas se compararon basandose en si eran Gr1loCD11c- o Gr1hiCD11c-. Se descubrio que la expresion de protemas de fusion DC-STAMP-GFP permitfa el 50 crecimiento de las celulas Gr1loCD11c- pero inhibfa el crecimiento de las celulas Gr1hiCD11c-. Tambien se ha notificado que el cultivo ex vivo de celulas Gr1lD de sangre periferica con RANKL y M-CSF podfa dar lugar a OC (Yao et al., J. Biol. Chem. 281: 11846-55 (2006)). Para ver el patron de expresion de DC-STAMP de superficie en estas celulas, se seleccionaron celulas de sangre periferica en la region de los monocitos como se ha descrito previamente ^ (Sunderkotter et al., J. Immunol. 172: 4410-7 (2004)), y tambien en portales para celulas Gr1loCD11c- y 55 celulas Gr1hiCD11c- (Figuras 7A y 7B). Las celulas en el portal de monocitos mostraron una poblacion tanto DC- STAMPlD como DC-STAMPhi. La mayor parte de las celulas Gr1hiCD11c- eran DC-STAMPhi, siendo solo aproximadamente un 7 % DC-STAMPlQ. Por el contrario, la poblacion de Gr1loCD11c- presentaba tanto celulas DC- STAMPhi como celulas DC-STAMP'° (Figura 7C).

60 RANKL induce las celulas DC-STAMPl0 y DC-STAMPhi que muestran diferente potencial osteoclastogenico.

La observacion inesperada de las poblaciones de DC-STAMPhi de superficie inducidas por RANKL y las poblaciones de DC-STAMPlQ de superficie inducidas por RANKL promovio una investigacion sobre la posibilidad de la capacidad osteoclastogenica diferencial de estos dos grupos. Para determinar si habfa una diferencia en la capacidad de las poblaciones de expresion de DC-STAMP alta y baja inducidas por RANKL de generar OC, se cultivaron celulas RAW 65 264.7 con RANKL durante 3 dfas para generar las dos poblaciones. La tincion con TRAP despues de la exposicion a

RANKL durante 3 dfas despues de la clasificacion revelo que solo se formaban OC multinucleados TRAP+ cuando en el cultivo estaba presente la poblacion DC-STAMPlQ inducida por RANKL estaba presente. Las celulas DC- STAMPlD inducidas por RANKL cultivadas solas teman un area de OC media de 2,7+0,4 mm2, mientras que el cultivo de celulas DC-STAMPhi inducidas por RANKL solas no produda OC multinucleados TRAP+. Una relacion de cultivo 5 1:1 de DC-STAMPlQ inducidas por RANKL con respecto a DC-STAMPhi inducidas por RANKL dio como resultado un area de OC media de 2,8+1,4 mm2. Una relacion de cultivo 10:1 con las celulas DC-STAMPlQ inducidas por RANKL en exceso dio como resultado un area de OC media de 5,8+0,6 mm2, mientras que el tener las celulas DC-STAMPhi inducidas por RANKL en exceso en una relacion 10:1 con respecto a las celulas DC-STAMPlQ inducidas por RANKL no produda ningun OC TRAP+ multinucleado grande (Figura 8a).

10

Los OCP DC-STAMP10 inducidos por RANKL expresan altos niveles de marcador de OC y genes relacionados con la fusion. Para explicar el descubrimiento de que los OCP DC-STAMPlQ inducidos por ^ RANKL son mas capaces de formar celulas multinucleadas TRAP+ en comparacion con sus homologos DC-STAMPhi inducidos por RANKl, se examinaron diferencias en la expresion de marcadores de OCP entre las dos poblaciones. Si las celulas DC- 15 STAMPlD inducidas por RANKL efectivamente son la subserie de OCP mas osteoclastogenica, entonces sena de esperar que las celulas expresaran mas genes marcadores de OC. Como DC-STAMP es esencial para la fusion de OC, los genes para protemas que median los procesos de fusion tambien eran candidatos para el examen de cualquier diferencia en OCP que presentaban una dicotoirna en sus perfiles de DC-STAMP en la superficie celular (Chen et al., FEBS Lett. 581: 2181-93 (2007)). La RT-PCR cuantitativa en tiempo real demostro que la expresion del 20 gen dc-stamp es significativamente menor en un 60 % en los OCP DC-STAMPhi inducidos por RANKL en comparacion con los OCP DC-STAMPlQ inducidos por RANKL (Figura 8B).

La senalizacion a traves de RANKL induce la expresion de dc-stamp en la osteoclastogenesis, y TREM2 es un receptor regulado positivamente por la estimulacion por RANKL que se asocia con la protema adaptadora DAP 12 25 para mediar la multinucleacion de OCP (Hehning et al., Sci. Signal 1:ra11 (2008)). El perfilado de expresion genica para rank y trem2 no mostro ninguna diferencia estadfsticamente significativa entre los OCP DC-STAMPhi inducidos por RANKL y los OCP DC-STAMPlQ inducidos por RANKL. De hecho, la expresion de rank se redujo en las dos poblaciones por un promedio del 98 %. De manera interesante, y en apoyo de los resultados de la osteoclastogenesis in vitro, la expresion de trap fue significativamente mayor en 11,3 veces en las celulas RAW 30 264.7 DC-STAMPlQ inducidas por RANKL (Figura 8C). Tambien se examino la expresion de oc-stamp, que segun se describio recientemente era esencial para la diferenciacion de OC (Yang et al., J. Cell. Physiol. 215: 497-505 (2008)). Se observo un aumento de 21 veces en la expresion de oc-stamp en los OCP DC-STAmPIQ inducidos por RANKL, mientras que se observo unicamente un aumento de aproximadamente 5 veces en el grupo DC-STAMPhi inducido por RANKL (Figura 8C).

35

Para el analisis se eligieron las moleculas importantes implicadas en la fusion durante la osteoclastogenesis, que incluyen CD47, Sirpa, CD44 y CD9. Se examino la expresion genica para estas cuatro moleculas relacionadas con la fusion debido a la cuestion abierta de si DC-STAMP estaba implicado en la regulacion de la expresion de estos factores (Chen et al., FEBS Lett. 581: 2181-93 (2007)). Los niveles de expresion genica para cd9 y cd47 estaban 40 significativamente regulados positivamente 1,5 y 1,9 veces, respectivamente, en la poblacion DC-STAMPlQ inducida por RANKL con respecto a las celulas RAW 264.7 cultivadas en medio sencillo. Estos marcadores estaban regulados negativamente o permanedan invariables en las celulas DC-STAMPhi inducidas por RANKL. Los niveles de ARNm de Sirpa estaban significativamente mas regulados positivamente en la poblacion de DC-STAMPhi inducida por RANKL. Esto debe tenerse en cuenta porque la expresion genica de su ligando, cd47, era mayor en el 45 grupo dC-STAMPIq. El nivel de expresion del gen cd44 era significativamente mayor en las celulas DC-STAMPhi inducidas por RANKL (Figura 8C).

Se obtuvieron resultados similares en monocitos CD14+ humanos cuando la citometna de flujo demostro una subserie DC-STAMP+ entre celulas CD14+CD9+, celulas CD14+CD44+, celulas CD14+CD47+ y celulas 50 CD14+Sirpa+ (Figura 9A). Cuando se cultivaron celulas CD14+ con RANKL y se clasificaron en grupos DC-STAMPlQ y DC-STAMPhi, se encontro una reduccion significativa de 15 veces en la expresion de dc-stamp en OCP DC- STAMP+ en comparacion con OCP DC-STAMPlQ La expresion para trap fue significativamente mayor en 2,3 veces en OCP DC-STAMPlQ en comparacion con OCP DC-STAMPhi. La expresion de cd9, sirpa y cd44 tambien fue mayor en los OCP DC-STAMPlQ en comparacion con OCP DC-STAMPhi, mientras que la expresion del gen cd47 era mayor 55 en los OCP DC-STAMPhi (Figura 9B). De nuevo, el par de ligandos cd47-sirpa se expresa de forma diferencial entre los dos OCP como se observa en las celulas RAW 264.7.

La artritis inflamatoria erosiva esta asociada con tener un mayor porcentaje de celulas CD11b+ que expresan DC-STAMP. Para poner estos descubrimientos en el contexto de un IMID, se examino la expresion en la superficie 60 de DC-STAMP en celulas CD11b+ en el escenario de una artritis inflamatoria erosiva en la que numeros elevados de OC dan como resultado la destruccion osea. Para examinar si existe una diferencia en el porcentaje de OCP CD11b+ que expresan DC-STAMP circulantes en las PBMC de ratones artnticos en comparacion con controles no artnticos, se realizo una micro-CT en ratones CD57B1/6 de 20 semanas de edad y de ratones TNF-Tg de las mismas edades y generos. El analisis micro-CT en la articulacion de la rodilla mostro profundas erosiones artnticas

presentes en los ratones TNF-Tg, mientras que no se observaron erosiones en los ratones C57B1/6 (Figuras 10A y 10B). Cuando se analizo el porcentaje de PBMC CD11b+ circulantes que tambien expresaban DC-STAMP en la superficie, se descubrio que habfa un aumento de aproximadamente 2 veces en esta poblacion entre los animales artnticos en comparacion con los animales no artnticos (Figuras 10A y 10B). Se realizo el mismo analisis de 5 citometna de flujo en PBMC humanas CD14+ procedentes de un paciente con RA y un control sano. Como ocurre en el modelo TNF-Tg de artritis inflamatoria erosiva, el paciente RA tema un porcentaje mucho mayor de celulas CD14+ que tambien expresaban DC-STAMP en la superficie (Figura 10C y 10D). Ademas, esta poblacion que expresaba CD-STAMP era DC-STAMPlQ en la superficie en comparacion con la del control sano que era DC- STAMPhi en la superficie (Figura 10E). Esto indica que la expresion de DC-STAMP en la superficie puede ser un 10 marcador de OCP en sangre periferica y un mayor porcentaje de OCP que expresan DC-STAMP circulantes esta asociado con la enfermedad erosiva.

El IFN-a inhibe la formacion de los OCP DC-STAMP10 mas osteoclastogenicos y mantiene altos niveles de DC-STAMP en la superficie de una manera dependiente del estadio. Una JA no erosiva en SLE (siglas en ingles 15 de lupus eritematoso sistemico) puede ser otra caractenstica de lupus mediado por la firma del gen de IFN-a. Se ha demostrado que algunas citocinas solo tienen un efecto anti-osteoclastogenico de una manera dependiente del estadio (Huang et al., Arthritis Res. Ther. 5: R49-59 (2003), Sato et al., J. Exp. Med. 203: 2673-82 (2006)). Es decir, el efecto puede depender de si la celula es un OCP temprano (antes de la exposicion a RANKL) o es un OCP en estadio posterior (despues de RANKL).

20

Se evaluaron los efectos de la exposicion de OCP a IFN-a sobre el desarrollo de la poblacion DC-STAMPlQ En contraste con el desarrollo de una poblacion de DC-STAMPlQ como se observa con el cultivo con RANKL, el cultivo con IFN-a de celulas RAW 264.7 durante 4 dfas no dio como resultado una reduccion de la expresion en la superficie de DC-STAMP (Figura 11A). Cuando se precultivaron celulas RAW 264.7 con RANKL durante 48 horas 25 seguido de exposicion a IFN-a, se observo una poblacion de DC-STAMPlQ y DC-STAMPhi como en el grupo de cultivo solo con RANKL. Por el contrario, la induccion por RANKL de dos poblaciones de DC-STAMP se suprimio mediante el precultivo de las celulas con IFN-a durante 48 horas seguido por la exposicion a RANKL (Figura 11B). La citometna de flujo intracelular demostro que el porcentaje de celulas que expresaban DC-STAMP interno era mayor con 3 dfas de cultivo con RANKL (16 %) que con IFN-a (6 %) (Figura 11C). De esta manera, el IFN-a puede 30 prevenir la formacion de OCP DC-STAMPlQ que son mas osteoclastogenicos y esto depende de que los OCP se encuentren con IFN-a antes que con RANKL.

Despues se examino si los OCP DC-STAMPlQ inducidos por RANKL podnan verse afectados por la administracion de IFN-a. Sorprendentemente, el cultivo con IFN-a de OCP DC-STAMPlQ inducidos por RANKL dio como resultado 35 el desarrollo de una subserie de celulas DC-STAMPhi. La capacidad de IFN-a de generar esta poblacion de DC- STAMPhi a partir de un grupo de DC-STAMPlQ clasificado se mitigo por el cultivo simultaneo de las celulas con RANKL e IFN-a (Figura 11D).

Las celulas DC-STAMP^ inducidas por RANKL se desarrollan mas rapido a partir de OCP IFNR1-/- en 40 comparacion con OCP WT. Al observar estos efectos del IFN-a, se quiso determinar el perfil de expresion de DC- STAMP cuando la senalizacion de IFN-a es deficiente. Los ratones IFNR1'/' presentaban una osteopenia generalizada como resultado de numeros elevados de OC (Takayanagi et al., Nature 416: 744-9 (2002)). Al contrario de los OCP tratados con IFN-a, los OCP procedentes de ratones IFNR1'/' desarrollaron una poblacion DC-STAMPlQ en respuesta a RANKL. De forma interesante, el desarrollo de esta poblacion se produjo mas rapido en ratones 45 IFNR1'/' en comparacion con ratones WT. En el dfa 4 del cultivo, solo 1/3 de los OCP WT se habfan vuelto DC- STAMPlD en respuesta a RANKL en comparacion con un 50 % en los ratones IFNR1'/' (Figura 11C).

Los OCP DC-STAMP^ inducidos por RANKL tienen mayor expresion genica de IFN-a, IFN-p, SOCS1 y SOCS3 y menor pSTATI en comparacion con los OCP DC-STAMPhi inducidos por RANKL. Despues del trabajo que 50 identifico la produccion de IFN-p por OCP, se realizaron estudios que mostraban que SOCS1 y SOCS2 podfan contrarrestar el papel inhibidor del IFN-p durante la osteoclastogenesis (Hayashi et al., J. Biol. Chem. 277: 27880-6 (2002)). Por lo tanto, se examino si existfa heterogeneidad en los niveles de expresion para los genes IFN-p, IFN-a, SOCS1 y SOCS3 en DC-STAMPlQ inducido por RANKL frente a celulas DC-STAMPhi. La RT-PCR cuantitativa en tiempo real revelo niveles de expresion genica significativamente mayores para estos cuatro genes en los OCP DC- 55 STAMPlD inducidos por RANKL mas osteoclastogenicos en comparacion con los OCP DC-STAMPhi inducidos por RANKL (Figura 12A). Cuando se compararon los niveles de pSTAT1, un mayor porcentaje (69%) de OCP DC- STAMPhi inducidos por RANKL expresaban pSTAT1 a un nivel mayor que el observado en macrofagos de medula osea antes de la exposicion a RANKL. Por el contrario, un menor porcentaje (6 %) de OCP DC-STAMPlQ inducidos por RANKL mostraron evidencias de fosforilacion de STAT1 (Figura 12B).

El co-cultivo de celulas DC-STAMP^ inducidas por RANKL con celulas pretratadas con IFN-a da como resultado celulas multinucleadas TRAP+. Se observo la expresion diferencial del interferon del tipo I entre OCP DC-STAMPlQ inducidos por RANKL y OCP DC-STAMPhi inducidos por RANKL. La expresion del gen relacionada con

la fusion se redujo tanto en las celulas DC-STAMPhi inducidas por RANKL como en las celulas tratadas con IFN-a. Se examino si las celulas CD-STAMPlQ pod^an fusionarse con celulas tratadas con IFN-a como lo hadan las celulas DC-STAMPhi. Despues de tres d^as de cultivo con RANKL, se observaron celulas multinucleadas TRAP+ en co- cultivo de OCP DC-STAMPlQ clasificados con celulas que se hadan pretratado con IFN-a. El numero medio de 5 celulas multinucleadas TRAP+/pocillo fue comparable entre los co-cultivos de OCP DC-STAMPlQ y DC-STAMPhi y el co-cultivo de OCP DC-STAMPlQ y las celulas pretratadas con IFN-a (Figura 12C).

Los ratones NZBxNZW F1 con enfermedad de tipo SLE y los ratones NZW tratados con Ad-IFN-a tienen menos PBMC DC-STAMP'° y menos erosiones en el escenario de una artritis inflamatoria. Para ver si los

10 descubrimientos del efecto de IFN-a sobre el desarrollo de las celulas DC-STAMPlQ mas osteoclastogenicas pod^a explicar la artritis no erosiva en caso de SLE, se examino el desarrollo de celulas DC-STAMPlQ en ratones con la enfermedad de tipo SLE. El modelo NZBxNZW F1 es un modelo murino establecido de SLE y se ha descubierto que tiene indicios de una expresion elevada del gen ifi202 inducible por IFN-a, lo cual es un marcador de la susceptibilidad a SLE (Rozzo et al., Immunity 15: 435-43 (2001), Santiago-Raber et al., J. Exp. Med. 197: 777-88 15 (2003)). Se uso el modelo por transferencia de suero K/BxN para inducir artritis (SIA) en estos animales y controles NZW (sin SLE). La erosion osea controlada por mediciones del volumen del astragalo mediante de micro-CT demostro que los ratones NZW desarrollaban erosiones oseas en respuesta a SIA. Por el contrario, los ratones NZBxNZW F1 con marcadores de enfermedad de SLE, tales como proteinuria y altos tftulos de auto-anticuerpos anti-ADNds, no presentaban perdida osea con SIA. Cuando se examinaron OCP CD1 lb+ con respecto a la 20 expresion de DC-STAMP, se descubrio que el suero artritogenico induda una mayor poblacion de DC-STAMPlQ en ratones NZW (Figura 13A). Por el contrario, se encontraron menores niveles de celulas DC-STAMPlQ en los ratones NZBxNZW F1, y este porcentaje no aumentaba con SIA (Figura 13B). Para examinar si esta observacion era el resultado de un nivel elevado de IFN-a, los ratones NZW se pretrataron con Ad-IFN-a y despues se indujo SIA (Figura 13C). La erosion osea era menos pronunciada en los ratones tratados con Ad-IFN-a en la situacion de SIA 25 en comparacion con los ratones NZW no tratados con Ad-IFN-a. De manera interesante, la poblacion CD11b+DC- STAMPhi estaba elevada tanto en los ratones NZBxNZW F1 como en los ratones NZW tratados con Ad-IFN-a (Figuras 13B y 13C). El analisis de regresion lineal revelo correlaciones inversas altamente significativas entre el porcentaje de celulas CD11b+DC-STAMPlQ y la expresion del gen ifi202 inducible por IFN-a (P<0,0001) asf como entre celulas CD11b+DC-STAMPlQ y el volumen oseo (P=0,0001). De esta manera, cuanto mayor es la expresion del 30 ifi202, menor es el porcentaje de PBMC CD11b+DC-STAMPlQ, y cuanto mayor es el porcentaje de celulas CD11b+DC-STAMPlQ, menor es el volumen oseo (Figura 14A y 14B).

Ejemplo 2: Regulacion del desarrollo de osteoclastos humanos por protema transmembrana especifica de celulas dendriticas (DC-STAMP)

35

Metodos generales

Reactivos y anticuerpos. RANKL y MCSF se adquirieron en R&D systems (Minneapolis, MN). Se uso Suero Bovino Fetal Definido (Hyclone) para todos los cultivos. El anticuerpo policlonal contra DC-STAMP KR104 se adquirio en 40 CosmoBio Co., LTD. (Tokyo, Japan). Todos los anticuerpos usados se adquirieron en BD Bioscience (San Jose, CA). En todos los cocteles de anticuerpo se incluyo 7-amino-actinomicina D (7-AAD) como colorante vital para excluir las celulas muertas. El coctel de anticuerpo usado para la Figura 11B inclrna 1A2 (FITC), CD16 (PE), CD14 (APC), CD3 (Pacific Blue), CD19 (APC-Cy7) y 7-AAD. El otro coctel de anticuerpo usado para la Figura 16C estaba compuesto de 1A2 (FITC), HLA-DR (PE-Texas Red), CD14 (Alexa Fluor 700), CD16 (Pacific Orange), CD15 (Pacific 45 Blue), CD11b (APC-Cy7), CD11c (PECy7), CD 19 (PE), CD3 (APC) y 7-AAD. Las celulas se trataron con un 20% de bloqueante del receptor de Fc (Miltenyi Biotec; Bergisch Gladback, Germany) para bloquear la union no espedfica.

Produccion, purificacion y conjugacion con fluorocromo de anticuerpo monoclonal 1A2. Se conjugo un peptido DC-sTaMP sintetico correspondiente al cuarto dominio extracelular 447Glu-Val-His-Leu-Lys-Leu-His-Gly-Glu- 50 Lys-Gln-Gly-Thr-Gln460 (SEQ ID NO: 1) (numero de registro de NCBI Q9H295) con KLH y se inyecto en ratones para la inmunizacion usando protocolos convencionales (Yokoyama et al., Curr. Protoc. Immunol. Capftulo 2, Unidad 2.5 (2006)). Se fusionaron celulas de bazo de los ratones inmunizados con celulas tumorales de mieloma para generar un panel de hibridomas. Se recogieron los sobrenadantes de cada hibridoma y se exploro su reactividad anti-DC- STAMP por un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (EIA). Se identifico un anticuerpo monoclonal (mAb) 1A2 55 con especificidad por DC-STAMP y se uso para todos los experimentos. Se uso el kit de marcaje de protemas FluoReporter FITC (Molecular Probes; Invitrogen; Carlsbad, CA) para conjugar FITC a 1A2. Los anticuerpos marcados se titularon cuidadosamente y se confirmo su especificidad de union a DC-STAMP.

Aislamiento celular y enriquecimiento en monocitos. Se separaron celulas mononucleares de sangre periferica 60 (PBMC) de sangre entera por gradiente de Ficoll como se ha descrito previamente (Chiu et al., Arthritis Res. Ther. 12:R14 (2010)). Se enriquecieron monocitos humanos de sangre periferica entera por el Coctel de Enriquecimiento de Monocitos Humanos (StemCell technologies; Vancouver, BC, Canada) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Tincion celular, clasificacion y analisis FACS. Para clasificar celulas esteriles, se resuspendieron PBMC

preparadas en gradiente de Ficoll en PBS esteril (10 x 106 celulas/ml) y se incubaron con 1A2-FITC durante 20 minutes a temperatura ambiente. Las celulas se lavaron dos veces con PBS, se resuspendieron en PBS (5 x 106 celulas/ml) y se clasificaron de forma esteril con clasificador FACS Vantage (Becton Dickinson Immunocytometry Systems; San Jose, CA). Despues de la clasificacion, se volvio a examinar la pureza de las celulas por citometna de 5 flujo y 1 x 105 celulas se cultivaron en un pocillo de una placa plana de 96 pocillos por triplicado con RANKL y M- CSF durante 8 dfas. Para el analisis de citometna de flujo, las celulas se recogieron, se lavaron una vez con PBS, se bloquearon con suero de raton normal al 5% durante 10 minutos a temperatura ambiente y se tineron con anticuerpo durante 20 minutos a 4 °C en la oscuridad. Las celulas se lavaron minuciosamente con PBS y se fijaron en formaldetedo al 2 %. Los datos de FACS se adquirieron usando Canto o LSRII y se analizaron usando el software 10 CellQuest (Becton Dickinson) o FlowJo (TreeStar; Ashland, OR).

Cultivo de OC y tincion TRAP. Se cultivaron PBMC purificadas o monocitos en RPMI (Gibco; Invitrogen; Carlsbard, CA), complementado con suero bovino fetal inactivado termicamente al 8 % (Hyclone; Thermo Scientific; Logan, UT), glutamina 2 mM, 50 unidades/ml de penicilina y 50 ug/ml de estreptomicina. Se anadieron RANKL (100 ng/ml) y CSF 15 (25 ng/ml) al cultivo celular para estimular la generacion de OC. Se cultivaron PBMC (1 x 105 celulas/ml) o monocitos (1 x 106 celulas/ml) por pocillo en placas de 96 pocillos durante 8 dfas en una incubadora humidificada a 37 °C con un 5 % de CO2. Los medios se repusieron cada 2 dfas. El dfa 8, las celulas se fijaron con formaldetndo al 3 % y se tineron para la fosfatasa acida resistente a tartrato (TRAP) (Sigma; St. Louis, MO). Las celulas se examinaron por microscopfa optica y se contaron las celulas TRAP+ con tres o mas nucleos como OC. Para el analisis del efecto 20 inhibidor de 1A2 sobre la formacion de OC, 380 mg/ml de 1A2 estaban constantemente presentes en el cultivo celular.

Inmunoprecipitacion y analisis de transferencia de western. Se lisaron PBMC humanas purificadas de un gradiente de Ficoll usando el Reactivo de Extraccion de Protema CytoBuster (Novagen; EMD Chemicals; Darmstadt, Germany). Para la inmunoprecipitacion, los lisados celulares se sometieron a un ensayo Pull Down por 1A2 anti-DC- 25 STAMP o 3G8 anti-CD16 usando el kit de inmunoprecipitacion (Invitrogen). Los inmunoprecipitados se sometieron a un analisis de SDS-PAGE en geles en gradiente de Bis-Tris del 4-12 %, seguido de transferencia en humedo usando una membrana de PVDF. La membrana primero se sondo con el mAb de fosfotirosina 4G10 (Millipore), el mAb CD16 (BD Biosciences) o el mAb contra DC-STAMP 1A2, seguido de anticuerpo secundario espedfico de cadena ligera conjugado con HRP. El anticuerpo espedfico de cadena ligera conjugado con HRP (Jackson 30 ImmunoResearch; West Grove, PA) se eligio como anticuerpo secundario para evitar la senal de la cadena pesada proxima a 50 kDa. Las manchas de transferencia se revelaron con el kit de sustrato quimioluminiscente SuperSignal West Pico o Femto (Pierce; Rockford, IL) y se obtuvieron imagenes en pelteulas cientfficas Kodak (Eastman Kodak; Rochester, NY). 35 * * * * 40 * * * * 45 * * * * 50 * * * * 55

35 Tincion de inmunofluorescencia. Los monocitos se enriquecieron por el Coctel de Enriquecimiento de Monocitos

(StemCell) y se cultivaron en portaobjetos de vidrio en medio de cultivo con RANKL y M-CSF durante 8 dfas. Las

celulas se fijaron en metanol frte a -20 °C durante 10 minutos y se lavaron con PBS. Las celulas se permeabilizaron

y bloquearon con saponina al 0,1 % y BSA/PBS al 0,2 % durante 15 minutos a temperatura ambiente. Despues, las

celulas fijas se tineron con rodamina faloidina (Molecular Probes), anticuerpo contra DC-STAMP 1A2 conjugado con

40 FITC y DAPI durante 2 horas a temperatura ambiente, seguido de un lavado adicional con saponina al 0,1 % y

BSA/PBS al 0,2 % durante 5 minutos. Los portaobjetos se montaron en un 10% de glicerol y un 10 % de Tris 1 M

(pH 8). Se tomaron imagenes usando un microscopio de fluorescencia de contraste de fase Zeiss. Para la tincion

inmunohistoqmmica (Figura 15C), se centrifugaron PBMC y se fijaron en NBF al 10 % (Cardinal Health; Dublin, OH)

durante una hora. El sedimento celular se separo suavemente del tubo de centnfuga, se vertio a traves de un papel

45 de muestra y se puso en un casete de histologfa. El casete se proceso en un procesador de tejidos VIP

convencional usando un ciclo rutinario corto. El sedimento celular despues se incluyo en parafina. Se cortaron

secciones en serie de 4 micrometros y se montaron en portaobjetos de vidrio. La seccion de parafina se seco a 60

°C durante una hora y se desparafinizo a traves de dos cambios de xileno y alcoholes graduados. Los portaobjetos

se habfan tratado previamente con Target Retrieval Solutivo, pH 6 (Dato, Carpinterea, CA) durante 20 minutos a 99

50 °C con un breve periodo de refrigeracion y despues se lavaron varias veces en Tampon de Lavado 1X nuevo (Dako).

Los portaobjetos se incubaron con 1A2 o control de isotipo IgG2a de raton (BD Biosciences) a diluciones de 1:1500

durante 60 minutos a temperatura ambiente. Los anticuerpos no unidos se retiraron por varios aclarados. La tincion

se visualizo por el kit de deteccion basado en polfmero Flex con DAB como cromogeno (Dako) y utilizando como

tinte de contraste Flex Hematoxylin (Dako).

55

Analisis estadistico. El ensayo de permutacion se empleo con 105 re-muestreos para el analisis estadfstico para evaluar el efecto inhibidor de 1A2 sobre la formacion de OC para la Figura 16D(c). La distribucion de 4 patrones de DCSTAMP entre HC y PsA se analizo por el analisis exacto de Fisher para la Figura 17(B).

60 RESULTADOS

DC-STAMP es una protema que lleva ITIM. Recientemente se ha demostrado que la subserie de monocitos inflamatorios CD14+CD16+ se expande preferentemente en pacientes PsA con una afeccion asociada con una frecuencia de OCP elevada (Chiu et al., Arthritis Res. Ther. 12: R14 (2010). Basandose en este estudio, CD16 65 puede servir como un marcador de OCP, pero carece de especificidad. Con un papel esencial de DC-STAMP en el

desarrollo de OC, la relacion entre la expresion de DC-STAMP y CD16 se examino para identificar un marcador de OCP adicional que aumentara la especificidad en combinacion con CD16. Para este fin, se analizo la expresion en la superficie de dC-STAMP en monocitos CD14+CD16- y CD14+CD16+ con un anticuerpo policlonal anti-DC-STAMP disponible en el mercado KR1048 (Figura 15A). La intensidad media de fluorescencia (MFI) de DC-STAMP sobre 5 monocitos CD14+CD16+ fue significativamente mayor que la correspondiente a monocitos CD14+CD16- (519 ± 324 vs. 102648, n = 10), lo que sugena una asociacion positiva entre la expresion de CD16 y DC-STAMP en monocitos humanos nuevos (Figura 15A).

CD16 lleva un motivo de activacion de inmunorreceptor basado en tirosina (ITAM) sobre el dominio intracitoplasmico 10 (Sandor et al., Immunol. Lett. 54: 123-7 (1996)). La senal de activacion mediada por ITAM con frecuencia se acopla a una senal inhibidora que contrarresta liberada por el receptor que lleva el motivo inhibidor de inmunorreceptor basado en tirosina (ITlM). Un motivo ITIM es un motivo peptfdico corto que contiene una secuencia consenso (I/V/L/S)-XYXX-(L/V) donde X indica cualquier aminoacido (Nimmerjahn y Ravetch, Nat. Rev. Immunol. 8: 34-47 (2008)). Como se muestra en la Figura 15A, se observo una correlacion positiva entre la expresion en la superficie 15 de CD16 y DC-STAMP. Este descubrimiento sugirio la posibilidad de que DC-STAMP puede tener un motivo de tipo ITIM capaz de contrarrestar senales inducidas por ITAm sobre CD16. Esta especulacion se baso en los cambios dinamicos observados en la expresion de superficie de DC-STAMP y CD16 durante la osteoclastogenesis, en la que la expresion de superficie de CD16 aumento a lo largo del tiempo, mientras que los niveles de DC-STAMP se redujeron de forma constante (vease mas adelante en la Figura 18a). Para explorar esta posibilidad, se exploro la 20 secuencia proteica de DC-STAMP y se identifico un ITIM autentico, 07Ser-Phe-Tyr-Pro-Ser-Val412 (SEQ ID NO: 4), en el dominio citoplasmico de DC-STAMP.

Se establecio un nuevo anticuerpo monoclonal 1A2 con especificidad anti-DC-STAMP. Actualmente no se dispone de ningun marcador de superficie espedfico para OCP. Los metodos actuales para la cuantificacion de OCP 25 emplean tecnicas de cultivo celular, que requieren mucho tiempo, son caras y diffciles de replicar. Ademas de CD16, recientemente se identifico un posible marcador de superficie de OCP (Chiu et al., Arthritis Res. Ther. 12: R14 (2010)). DC-STAMP se examino para determinar si DC-STAMP tambien se expresaba por OCP. Para este fin, como se ha descrito anteriormente, se genero un anticuerpo monoclonal (mAb) contra DC-STAMP. El epttopo (447Glu-Val- His-Leu-Lys-Leu-His-Gly-Glu-Lys-Gln-Gly-Thr-Gln46 ) usado para generar el anticuerpo esta muy conservado entre 30 ratones y seres humanos y esta localizado en el cuarto dominio extracelular de DC-STAMP. Un clon, 1A2, con reactividad por DC-STAMP se identifico por EIA entre un panel de hibridomas, y la especificidad de 1A2 se confirmo por transferencia de Western con lisados de celulas murinas. Para determinar si el mAb 1A2 tambien puede reconocer la protema DC-STAMP humana, se aislaron los lisados de protema de monocitos a partir de 2 controles sanos (HC), se separaron por SDS-PAGE y se sondaron por 1A2 en transferencia de western. Como se muestra en 35 la Figura 15B, el mAb 1A2 reconoda una sola banda de 53 kDa espedficamente en la transferencia de western. Estos datos demostraron que 1A2 es un nuevo mAb anti-DC-STAMP que reconoce espedficamente un epftopo comun a la protema DC-STAMP tanto humana como de raton.

A continuacion, se uso 1A2 para examinar la expresion de DC-STAMP sobre PBMC humanas por tincion 40 inmunohistoqdmica (IHC). Una cierta proporcion de PBMC se unio por 1A2 (Figura 15C(b)), lo que sugena la expresion de DC-STAMP en esas celulas. Como DCSTAMP tambien es central en la formacion de celulas gigantes, se examino la expresion de DC-STAMP sobre muestras de biopsia recogidas a partir de celulas gigantes humanas (tumor de hueso). La expresion de DC-STAMP sobre celulas tumorales de hueso se polarizo como se indica por las flechas mostradas en la Figura 15C(d). La tincion de control con IgG2a de raton se muestra en las Figuras 15C(a) y 45 15C(c).

El mAb 1A2 contra DC-STAMP se secuencio de acuerdo con metodos conocidos (Jarrin y Andrieux, Methods Mol. Biol. 96: 21-8 (1999); Eswarakumar et al., Immunogenetics 46: 249-50 (1997); Morrison, Curr. Protoc. Immunol. Capttulo 10, Unidad 10.25 (2001)). La cadena ligera del mAb 1A2 comprende la secuencia de ADN de SEQ ID NO: 7 50 y la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 5. La cadena pesada del mAb 1A2 comprende la secuencia de ADN de SEQ ID NO: 8 y la secuencia polipeptfdica de SEQ ID NO: 6.

El mAb 1A2 anti-DC-STAMP bloquea la formacion de OC in vitro. Previamente se ha mostrado que el anticuerpo policlonal anti-DC-STAMP KR104 inhida la osteoclastogenesis en celulas RAW-D y celulas multinucleadas 55 derivadas de medula osea (MNC) (Kukita et al., J. Exp. Med. 200: 941-6 (2004)). Se examino si 1A2 tambien puede bloquear la formacion de OC en PBMC humanas y cultivos de monocitos. 1A2 estaba presente continuamente en cultivos de OC y se repoma despues de cada intercambio de medio durante un cultivo de OC de 8 dfas. De manera interesante, 1A2 bloqueaba la formacion de OC eficientemente (Figura 15D(a): sin 1A2; Figura 15D(b): con 1A2). 1A2 bloqueaba la formacion de OC de una manera dependiente de la dosificacion y era espedfico para DC-STAMP 60 en comparacion con el control de isotipo IgG2a. En presencia de 1A2, la mayona de los monocitos se detema en el estadio pre-OC TRAP-positivo (Figura 15D(b)). 1A2 tambien repriirna la formacion de cavidades de resorcion en obleas de hueso. El efecto inhibidor de 1A2 sobre la formacion de OC en 6 sujetos se resumio en la Tabla 2. La presencia de 1A2 en cultivo de monocitos inhida significativamente la formacion de OC. Los numeros medios de OC derivados de 106 monocitos en ausencia o presencia de 1A2 son 489 ± 284 y 61 ± 107, respectivamente (p = 0,013 65 por ensayo de permutacion).

Tabla 2: el mAb contra DC-STAMP 1A2 tema un efecto inhibidor sobre la formacion de OC.

Sujetoa

Sin 1A2b Con 1A2b,c

A

125 0

B

740 0

C

500 15

D

155 80

E

745 0

F

670 270

aPacientes HC, Ps o PsA bnumeros de OC derivados de 106 celulas CD14+ cpresencia constante de 1A2 en el cultivo a la concentracion de 380 pg/pl

Los monocitos son la mayona de las celulas DC-STAMP+. Se examino la expresion de DCSTAMP sobre PBMC

5 humanas por 1A2. La expresion de DC-STAMP en PBMC totales, celulas T y monocitos se muestra en las Figuras 16A, 16B y 16C, respectivamente. Para examinar la expresion de DC-STAMP en PBMC totales, se tineron PBMC humanas con un coctel de anticuerpo compuesto de 1A2-FITC, CD14-APC y 7-AAD. Despues de la exclusion de celulas muertas por 7-AAD (Figura 16A(a)), las PBMC se separaron por seleccion citometrica en monocitos (los portales P2 y P3 en la Figura 16A(b)) y linfocitos (el portal P1 en la Figura 16A(b)) basandose en el tamano de las 10 celulas y la granularidad usando dispersion frontal (FSC) y lateral (SSC). La expresion de DCSTAMP correspondiente en estas poblaciones de celulas distintas en relacion con el marcador espedfico de monocitos CD14 se muestra en la Figura 16A(c)-(e) y se superpone en la Figura 16A(f). Se uso el control de tincion de isotipo IgG2a para establecer las lmeas de corte entre poblaciones DC-STAMP+ y DC-STAMP- en la Figura 16A(c)-(e). Era evidente que las poblaciones de monocitos (P2 y P3, Figura 16A(d y e)) eran la mayona de celulas que expresaban 15 DC-STAMP, aunque algunas celulas seleccionadas en la poblacion de linfocitos (P1 en la Figura 16A(b) y (c)) tambien expresaban DC-STAMP (28,5% en la Figura 16A (c)). DC-STAMP se expresaba en la superficie de la mayona de los monocitos (Figura 16A(d)-(e) y 16A(f)). Se observo una mayor intensidad media de fluorescencia (MFl) en los monocitos que sugena que las protemas DC-STAMP se expresaban a mayores niveles en monocitos que en linfocitos (Figura l6A(f)).

20

Para superar los retos de la separacion entre linfocitos y monocitos unicamente por FSC/SSC (Figura 16A(b)), se incluyeron anticuerpos contra CD3 y CD19 para examinar de forma mas precisa la expresion de DC-STAMP en celulas T y B. El coctel de anticuerpo estaba compuesto de 1A2 (FITC), CD16 (PE), CD14 (APC), CD3 (Pacific Blue), CD19 (APCCy7) y 7-AAD. Despues de la seleccion con FSC/SSC y de la exclusion de celulas muertas (Figura 25 16B(a) y (b)), se seleccionaron individualmente las celulas CD14+, CD3+ y CD19+ y se analizo la expresion de DCSTAMP en estas tres poblaciones (Figura 16B(c), CD14+: verde; CD3+: azul; CD19+: rojo). Los resultados fueron coherentes con los datos mostrados en la Figura 16A(f), lo que indica que los monocitos son las celulas DC- STAMP+ principales. De manera interesante, habfa una pequena parte de celulas T CD3+ que expresaba DCSTAMP (indicado por la flecha en la Figura 16B(c)). Se examino la relacion entre la expresion de CD3 y DC-STAMP 30 en PBMC humanas. Como se muestra en la Figura 16B(d), aproximadamente un 12 % de las celulas T CD3+ totales son DC-STAMP+ (Figura 16B(d)). En todos los experimentos se incluyeron seis controles de tincion de fluorescencia menos uno (FMO-FITC, FMoPE, FMO-APC, FMO-Pacific Blue, FMO-APC-Cy7 y FMO-7AAD). La expresion de DCSTAMP se analizo adicionalmente en las poblaciones de celulas no T, no B. El panel de tincion de 10 colores inclma anticuerpos contra DC-STAMP, CD14, CD3, CD19, CD11c, CD11b, CD15, CD16, HLA-DR y 7AAD. Se usaron 35 CD14, CD3 y CD19 para identificar monocitos, celulas T, celulas B y CD11c, CD11b y HLA-DR para la clasificacion de monocitos y macrofagos, respectivamente. La Figura 16C(a)-(d) representa la estrategia de seleccion por etapas para la seleccion de la poblacion no T, no B. Primero se seleccionaron PBMC humanas por FSC/sSc (Figura 16C(a)), seguido de exclusion de celulas muertas usando 7-AAD (Figura 16C(b)), despues se seleccionaron celulas DC-STAMP+ (Figura 16(c)), y se analizaron adicionalmente por los marcadores Cd3 y CD19 (Figura 16C(d)). CD19- 40 CD3- (31,9 %, Figura 16C(d), marcado como ~) y CD19-CD3+ (38,4 %, Figura 16C(d), marcado como *) fueron dos poblaciones de celulas DC-STAMP+ principales. Como la expresion de DC-STAMP en celulas CD3+ (Figura 16C(d), marcado por *) ya se habfan analizado y mostrado en la Figura 16B, en este caso, los analisis se centraron en la poblacion no T, no B (Figura 16C(d), marcado como ~). Ademas, se analizaron adicionalmente celulas DC- STAMP+CD3-CD19- (~ en la Figura 16c(d)) en 4 cuadrantes basandose en la expresion de CD14 y CD16 (Figura 45 16C(e)). Se analizo la expresion de CD11b, CD11c (Figura 16C(e), i, iii, v, vii) y HLA-DR, CD15 (Figura 16C(e), ii, iv, vi, viii) en estos 4 cuadrantes. Las intensidades de expresion de estos marcadores se mostraron por la intensidad media de fluorescencia (MFI) (numeros en la Figura 16C(e), i a viii). Notablemente, las dos subseries DC- STAMP+CD14+CD16+ (Figura 16C(e), Q2: cuadrante superior derecho) y DC-STAMP+CD14+CD16- (Figura 16C(e), Q3: cuadrante inferior derecho) expresan niveles muy altos de CD11b y CD11c (Figura 16C(e), iii y vii), lo 50 que sugiere que las celulas CD14+ (Q2 y Q3 en la Figura 16C (e)) eran mas homogeneas que las poblaciones de CD16 simple positivo (Q1 en la Figura 16C(e) y CD14-CD16- doble negativo (Q4 en la Figura 16C(e)). Hubo una

mayor expresion de CD11b y CD11c en las celulas DC-STAMP+CD3-CD19-CD14+ (combinacion de Q2 y Q3 en la Figura 16C(e)), lo que sugiere que estas celulas tienen un mayor potencial de ser precursores de osteoclastos (OC), celulas dendnticas (DC) y macrofagos.

5 DC-STAMP tiene el potencial de servir como un marcador de OCP. Despues de examinar una cohorte de sujetos humanos (>100), se identificaron cuatro patrones de expresion de DCSTAMP principales en PBMC humanas y se denominaron patrones I a IV (Figura 17A). El patron I tema el menor numero de celulas DC-STAMP+, mientras que el patron IV tema el mayor numero de celulas DC-STAMP+. La Tabla 3 indica los criterios para la clasificacion de estos patrones basandose en la relacion de celulas DC-STAMP+ con respecto a DC-STAMP-. La relacion de DC- 10 STAMP+ con respecto a DC-STAMP- se multiplico por 100 y se uso como criterio para clasificar patrones. En resumen, el numero para el patron I era <20, para el patron II era >20 pero <67, para el patron III era > 68 pero <240 y, para el patron IV, era mayor de 240, respectivamente. Para determinar si DC-STAMP podfa usarse como biomarcador de OCP, se examino la correlacion entre estos cuatro patrones de expresion de DC-STAMP y la frecuencia de OCP. El patron de expresion de DC-STAMP se examino en PBMC aisladas recientemente por 15 citometna de flujo y la enumeracion de OC se realizo el dfa 8 por tincion con TRAP. El cultivo de OC se establecio en PBMC aisladas de once sujetos HC y veintiun sujetos PsA. Curiosamente, los pacientes HC y PsA mostraron una distribucion desigual en los patrones de DC-STAMp (Figura 17B). Once sujetos HC demostraron el patron I de expresion de DC-STAMP, mientras que los pacientes PsA se distribuyeron en todos los patrones con 4, 6, 5, 6 sujetos en el patron I, II, III, IV, respectivamente (Figura 17B). La distribucion de sujetos HC y PsA dentro de estos 20 cuatro patrones de DCSTAMP se examino por el analisis exacto de Fisher. Los resultados indicaron que habfa una diferencia significativa en la distribucion de HC y PsA dentro de estos patrones (p = 0,011). Los numeros medios de OC derivados del patron I, II, III y IV de DC-sTaMP fueron 50, 98, 105 y 203, respectivamente (Tabla 4 y Figura 17B). Estos resultados sugenan que existe una correlacion entre la frecuencia de OCP y los patrones de DCSTAMP, dado que la frecuencia de OC aumentaba segun se desplazaba el patron de DC-STAMP desde el patron I 25 hacia el IV.

Tabla 3: clasificacion de cuatro patrones principales de DC-STAMP en PBMC humanas.

Patron de DC-STAMP

Relacion DC-STAMP+/-* n.° de sujetos HC n.° de sujetos PsA

I

1 a 20 11 4

II

20 a 67 0 6

III

68 a 240 0 5

IV

>240 0 6

*El porcentaje de celulas DC-STAMP+ en PBMC humanas totales se divide por el de celulas DC-STAMP-

30

Tabla 4: analisis estadfstico de la relacion entre los patrones de expresion de DC-STAMP y el recuento de OC.

Patron de DC-STAMP

Mediana de OC Intervalo de confianza del 95 % de mediana de OC Rango intercuartflico de OC

I

50 15-105 17-105

II

98 13-385 21-390

III

105 30-131 62-131

IV

203 10-491 35-340

Los monocitos humanos regulaban negativamente DC-STAMP durante la osteoclastogenesis. Esta bien 35 establecido que DC-STAMP esta implicado en la fusion celular de monocitos murinos, pero la variacion de la expresion en la superficie durante el transcurso de la osteoclastogenesis en monocitos humanos no se ha caracterizado. Se examino la alteracion de la expresion en la superficie celular de DC-STAMP en monocitos humanos cultivados en medios pro-osteoclastogenicos para comprender mejor la secuencia temporal de expresion de DC-STAMP durante la osteoclastogenesis (Figura 18A). Los monocitos humanos enriquecidos expresaban un 40 alto nivel de DC-STAMP en la superficie (Figura 18A-a). La expresion en la superficie de DC-STAMP estaba regulada negativamente despues de 1 dfa de exposicion a RANKL+M-CSF (Figura 18A-b) y continuaba reduciendose despues del dfa 2 (Figura 18A, c-e). Notablemente, la expresion en la superficie de DC-STAMP se reduda espectacularmente despues del dfa 6 y se volvfa indetectable despues del dfa 7 (Figura 18A-e), un punto de tiempo en el que los OC maduros se visualizaban por tincion con TRAP.

45

A continuacion, se examino la localizacion celular de DC-STAMP sobre OC. En contraste con varios estudios en los que se realizo la localizacion de DC-STAMP sobre DC en celulas transfectadas con una protema de fusion DC- STAMP-GFP (Sawtani et al., Int. Immunol. 20: 1259-68 (2008); Eleveld-Trancikova et al., J. Leukoc. Biol. 77: 337-43 (2005); Jansen et al., 46: 505-15 (2009)), se uso el mAb anti-DC-STAMP 1A2 establecido recientemente para 50 localizar la protema DC-STAMP endogena. Este enfoque es un metodo mas fiable para rastrear la localizacion de la protema que la colocacion de marcadores de GFP (Lisenbee et al., Traffic 4: 491-501 (2003)). Despues de 8 dfas de

cultivo con RANKL+M-CSF, la mayona de los monocitos no podfan diferenciarse en OC y manifestaban una morfolog^a con forma de huso (Figura 18B(a)), indicativa de un estadio de diferenciacion de pre-osteoclasto. La protema DC-STAMP se localizaba intracelularmente con una distribucion puntuada en estas celulas (Figura 18B(a)). Por el contrario, la protema DC-STAMP no podfa identificarse en OC multinucleados de los mismos cultivos (Figura 5 18B(b)). Estos policariones que caredan de protema DC-STAMP presentaban anillos de actina prominentes, una estructura asociada con la capacidad de resorcion osea de OC. Considerados conjuntamente, los datos de tincion con FACS (Figura 18A) y confocales (Figura 18B) sugieren que DC-STAMP se regula negativamente cuando los monocitos se diferencian en OC.

10 Los monocitos DC-STAMPhigh generan mas osteoclastos que los monocitos DC-STAMPlow. Para determinar si el nivel de expresion en la superficie de DC-STAMP sobre monocitos se correlaciona con la capacidad de estas celulas de experimentar osteoclastogenesis, se tineron monocitos humanos recien aislados y enriquecidos (>85 % de pureza) con el mAb contra DC-STAMP 1A2 y las celulas se clasificaron en dos poblaciones, DC-STAMPhigh y DC- STAMPlow (Figura 19A, 1,9% maximo y 1,8% mmimo de monocitos clasificados totales, respectivamente). Las 15 actividades de resorcion osea de estas dos poblaciones se evaluaron despues de cultivar las celulas durante 8 dfas con RANKL y M-CSF.

Como se muestra en la Figura 19B, se generaron mas OC maduros TRAP+ a partir de DC-STAMPhigh recien aislados (162 por 105) en comparacion con celulas DC-STAMPlow (2 por 105). Ademas, las actividades de resorcion 20 osea de estas dos poblaciones celulares se examinaron con el ensayo de oblea de hueso (Figura 19B(c) y (d)). Mas del 90 % de la superficie del hueso se erosiono profundamente por OC derivados de monocitos humanos DCSTAMPhigh recientemente aislados (Figura 19B(d)), mientras que las celulas derivadas de monocitos humanos DC-STAMPlow recientemente aisladas produdan menos cavidades de erosion superficiales comparativamente (<10%, Figura 19B(c)). Considerados conjuntamente, los resultados sugieren una asociacion positiva entre la 25 expresion de DC-STAMP, el potencial osteoclastogenico y la actividad de resorcion osea en monocitos humanos.

DC-STAMP se fosforila en sus restos de tirosina e interacciona con SHP-1. Con el conocimiento de que DC-

STAMP contiene un motivo ITIM, se examino adicionalmente la fosforilacion de DC-STAMP a nivel de la protema. La presencia de un resto de tirosina (407Ser-Phe-Tyr-Pro-Ser-Val412) (SEQ ID NO: 4) en el ITIM de DC-STAMP, sugena 30 un posible sitio de fosforilacion. De esta manera, se examinaron los perfiles de fosforilacion de tirosina de DC- STAMP por analisis de transferencia de Western en monocitos que se cultivaron en presencia de M-CSF y RANKL o IL-4 y GM-CSF (Figura 20A). Como los pesos moleculares (M.W.) de DC-STAMP y la cadena pesada (50 kDa) estan muy proximos, se uso el segundo anticuerpo espedfico de cadena ligera para evitar el efecto de fondo de la cadena pesada en las transferencias de Western. Se sometieron lisados celulares de OC, DC y monocitos a 35 inmunoprecipitacion con mAb contra DC-STAMP 1A2. Los inmunoprecipitados se separaron por SDS-PAGE y despues se sometieron a inmunotransferencia con anti-fosfotirosina 4G10 (Figura 20A(a)). En los 3 linajes celulares se detecto una banda predominante de 54 kDa correspondiente al peso molecular de DC-STAMP. Ademas de esta banda, habfa una banda extra (~ 83 kDa) que puede ser una isoforma de DC-STAMP con una modificacion postraduccional tal como glicosilacion. A continuacion, se inmunoprecipitaron lisados celulares de OC con mAb anti- 40 DC-STAMP o anti-CD16 y la mancha de transferencia se sondo con 1A2 anti-DC-STAMP. Como se muestra en la Figura 24B, el mAb contra CD16 podfa reducir el nivel de protema DC-STAMP, lo cual indica una interaccion ffsica entre CD16 y DC-STAMP. Se inmunoprecipitaron menos protemas DC-STAMP por el mAb contra CD16 que por el mAb contra Dc-STAMP (comparense las Figuras 20B(a) y (b)).

45 A continuacion, se inmunoprecipitaron los mismos lisados celulares a partir de OC, DC y monocitos con el mAb contra CD16 y despues se sometieron a inmunotransferencia con 4G10 antifosfotirosina (Figura 20A(b)). A diferencia de los lisados celulares de OC y monocitos (Figura 24A(b), 1a y 3a calles) con la unica banda de 54 kDa correspondiente a la protema DC-STAMP, se atenuaba la intensidad de la banda de 54 kDa en los lisados de DC. En su lugar, habfa una banda de mayor tamano adicional (~ 70 kDa) en los lisados de DC que no se observaba en 50 OC o monocitos. La cantidad de fosforilacion de DC-STAMP coinmunoprecipitada con CD16 era comparable entre los OC y los monocitos (Figura 20A(b), 1a y 3a calles). Los datos sugirieron que DC-STAMP demostraba un menor grado de fosforilacion en DC. LILRB y PIR-B, los otros dos receptores de tipo inmunoglobulina que llevaban ITIM, se sabe que reclutan la fosfatasa SHP-1 y suprimen el desarrollo de OC in vitro. Estas son caractensticas comunes para los receptores de tipo Ig con funciones inhibidoras. De esta manera, se examino si DC-STAMP, de forma 55 similar a sus moleculas que llevan ITIM, tambien senaliza mediante una interaccion con SHP-1 como se observa en LILRB y PIR-B. Los lisados celulares primero se inmunoprecipitaron por el mAb 1A2 anti-DC-STAMP y se sometieron a inmunotransferencia con el mAb anti-SHP-1. Se observo una sola banda de 70 kDa correspondiente a SHP-1 en estos inmunoprecipitados (Figura 20C), lo que sugiere una interaccion entre DC-STAMP y SHP-1. De manera interesante, estaban presentes dos bandas (~ 70 kDa y ~ 68 kDa) en el control positivo (Figura 20C(a), IP 60 con SHP-1 e IB con SHP-1).

Ejemplo 3: caracterizacion farmacocinetica del mAb 1A2 contra DC-STAMP. Para determinar las propiedades farmacocineticas del mAb 1A2 contra DC-STAMP, se proporciono una sola administracion subcutanea de 30 mg/kg a ratones BALB/c. Cuatro ratones se dosificaron con el mAb 1A2 y se recogieron muestras de sangre seriadas a 65 partir de la vena de la cola 1, 4, 7, 24, 48, 72, 103 y 168 horas despues. Se determino que la media de la

concentracion maxima (Cmax) era de 305 mg/ml, lo que era de esperar despues de una dosis de 30 mg/kg. El tiempo transcurrido para conseguir la Cmax (Tmax) fue relativamente corto, indicando que la absorcion de este anticuerpo despues de la dosificacion subcutanea no era un problema. El raton 1 se retiro despues de 72 horas debido a la perdida de peso, de forma que no se realizo el analisis PK en el raton 1. En las Tablas 5 y 6 presentadas a 5 continuacion se muestra un resumen de los resultados.

Tabla 5: farmacocinetica en suero subcutanea de 1A2.

Raton ID

Raton 2 Raton 3 Raton 4 Media SE

Cmax (Mg/ml)

341 256 317 305 25

Tmax (h)

48 24 24 32 8

AUC(last) (h • mg/ml)

44542 33562 39977 40027 2593

AUC(inf) (h • mg/ml)

122893 96428 128894 116072 9973

% Extrapolacion

63,8 63,1 69 65,3 1,9

CL/Fsc (ml/h/kg)

0,24 0,31 0,23 0,26 0,02

MRTinf(h)

350 366 425 380 23

T1/2 (h)

231,9 253,4 285,9 257 15,7

Cmax: concentracion maxima; Tmax: tiempo transcurrido para alcanzar la concentracion maxima; AUC(last): area bajo la curva de concentracion hasta la ultima medicion validada; AUC(inf): area bajo la curva de concentracion hasta el infinito; CL/Fsc: aclaramiento sistemico; MRTinf: tiempo medio de residencia al infinito; T1/2: semivida; h: hora; h • mg/ml: hora • miligramo por mililitro; ml/h/kg: mililitro por hora por kilogramo.______________________

10

Tabla 6: datos en suero

Concentracion (pg/ml)

Tiempo (h)

Raton 1 Raton 2 Raton 3 Raton 4 Media SD

1

26,4 33,3 38,1 33,1 32,7 4,8

4

154,3 209,7 217,4 178,3 189,9 29,1

7

218,9 224,1 238,6 232,9 228,6 8,8

24

273,8 299,5 255,6 317,4 286,6 27,3

48

N/S 341,1 242,6 295,8 293,2 49,3

72

231,5 292,1 233,7 247,3 251,1 28,2

103

N/S 242,4 198,9 200,7 214,0 24,6

168

N/S 234,2 166,5 215,6 205,4 35,0

N/S: sin muestra

LISTADO DE SECUENCIAS 15 <110> University of Rochester

<120> Anticuerpos anti-DC-STAMP <130> 20724-0037WO1

20

<150> US 61/174.219 <151>

<160>8 25

<170> FastSEQ para Windows Version 4

<210> 1 <211> 14

30 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

<220>

<223> Construccion sintetica <400> 1

Glu Val His Leu Lys Leu His Gly Glu Lys Gin Gly Thr Gin 15 10

<210>2 <211>8 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Construccion sintetica <400> 2

His Gly Glu Lys Gin Gly Thr Gin 1 5

<210>3 <211>5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Construccion sintetica <400>3

Lys Gin Gly Thr Gin 1 5

<210>4 <211>6 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Construccion sintetica <400>4

Ser-Phe-Tyr-P ro-Ser-Val 1 5

<210> 5 <211> 134 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Construccion sintetica <400>5

Met

Arg Phe Ser Ala Gin Leu Leu

1

5

Gly

Ser Thr Ala Asp lie Val Met

20

Val

Thr Leu Gly Thr Ser Ala Ser

35 40

Leu

Leu

H±S Ser Asn Gly lie Thr

50 55

Pro

Gly Gin Ser Pro Gin Val Leu

65

70

Ser

Gly Val Pro Asp Arg 85 Phe

Ser

Thr

Leu Arg lie Ser Arg Val Glu

100

Cys

Ala Gin Asn Leu Glu Leu Pro

115 120

Leu

Glu He Lys Arg Thr

130

Gly

Leu 10 Leu Val Leu Trp lie 15 Pro

Thr 25

Gin Ala Ala Phe Ser 30 Asn Pro

lie

Ser Cys Arg Ser 45 Ser Lys Ser

Tyr

Leu Tyr Trp 60 Tyr Leu Gin Lys

H H ft

Tyr Gin 75 Met Ser Asn Leu Ala 80

Ser

Ser 90 Gly Ser Gly Thr Asp 95 Phe

Ala 105

Glu Asp Val Gly Val 110 Tyr Tyr

Trp

Thr Phe Gly Gly 125 Gly Thr Lys

<210>6 <211> 138 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construccion sintetica

10

<400>6

Met 1

Gly Arg Leu Thr 5 Phe Ser

Val

Leu Ser Gin 20 Val Thr Leu

Pro

Ser Gin 35 Thr Leu Ser Leu

Ser

Thr 50 Phe Gly Met Gly Val 55

Gly 65

Leu Glu Trp Leu Ala 70 His

Ser

Pro Ala Leu Lys 85 Ser Arg

Asn

Gin Val Phe 100 Leu Lys lie

Thr

Tyr Tyr 115 Cys Val Arg lie

Gly

Pro 130 Gly Thr Leu Val Thr 135

15 <210> 7

<211> 402 <212> ADN

<213> Secuencia artificial 20 <220>

<223> Construccion sintetica

Phe

Leu Leu 10 Leu Thr Val Pro Ala 15 Tyr

Lys

Glu 25 Ser Gly Pro Gly lie 30 Leu Gin

Thr 40

Cys Ser Phe Ser Gly 45 Phe Ser Leu

Gly

Trp lie Arg Gin 60 Pro Ser Gly Lys

lie

Trp Trp Asp 75 Asp Asp Lys Tyr Tyr 80

Leu

Thr lie 90 Ser Lys Asp Thr Ser 95 Lys

Ala

Asn 105 Val Asp Thr Ala Asp 110 Thr

Ala

Gly 120 Val

Ser Ser Arg Ser Ser Pro Phe 125 Ala Tyr Trp

<400> 7

atgaggttct

gatattgtga

atctcctgca

tatctgcaga

tcaggagtcc

agcagagtgg

tggacgttcg

ctgctcagct

tgacgcaggc

ggtctagtaa

agccaggcca

cagacaggtt

aggctgagga

gtggaggcac

tctggggctg

tgcattctcc

gagtctccta

gtctcctcag

cagtagcagt

tgtgggtgtt

caagctggaa

cttgtgctct

aatccagtca

catagtaatg

gtcctgattt

gggtcaggaa

tattactgtg

ataaaacgta

ggatccctgg

atccactgca 60

ctcttggaac

atcagcttcc 120

gcatcactta

tttgtattgg 180

atcagatgtc

caaccttgcc 240

ctgatttcac

actgagaatc 300

ctcaaaatct

agaacttccg 360

eg

402

5

<210>8 <211> 414 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Construccion sintetica

10

<400> 8

attcctgtta ctgactgtcc ctgcatatgt cctgtcccag 60 ccctgggata ttgcagccct cccagaccct cagtctgact 120 actgagcact tttggtatgg gtgtaggctg gattcgtcag 180 gtggctggca cacatttggt gggatgatga taagtactat 240 gctcacaatc tccaaggata cctccaaaaa ccaggtattc 300 cactgcagat actgccacat actattgtgt tcgaatagga 360 ctggggccca ggaactctgg tcacagtctc gagt 414

atgggcagac ttacattctc gttactctga aagagtctgg tgttctttct ctgggttttc ccttcaggga agggtctgga agtccagccc tgaagagtcg ctcaagatcg ccaatgtgga tcacggtccc cttttgctta

Claims (7)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un anticuerpo monoclonal que se une espedficamente a un epttopo de DC-STAMP, en donde el epttopo es Glu- Val-His-Leu-Lys-Leu-His-Gly-Glu-Lys-Gln-Gly-Thr-Gln (SEQ ID NO: 1), en donde una cadena ligera del anticuerpo

   5 monoclonal comprende la SEQ ID NO: 5, y en donde una cadena pesada del anticuerpo monoclonal comprende la SEQ ID NO: 6.
2. 2. Un anticuerpo monoclonal que se une espedficamente a un epttopo de DC-STAMP, en donde el epttopo es His- Gly-Glu-Lys-Gln-Gly-Thr-Gln (SEQ ID NO:2), en donde una cadena ligera del anticuerpo monoclonal comprende la

   10 SEQ ID NO: 5, y en donde una cadena pesada del anticuerpo monoclonal comprende la SEQ ID NO: 6.
3. 3. Una composicion que comprende un anticuerpo, en donde la composicion comprende un anticuerpo que se une espedficamente a un epftopo de DC-STAMP de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 o 2.

   15 4. La composicion de la reivindicacion 3, en donde la composicion comprende ademas un vedculo farmaceuticamente aceptable.
4. 5. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 3 o 4, para uso en la inhibicion de la osteoclastogenesis en una celula.

   20
5. 6. Un metodo para inhibir la osteoclastogenesis en una celula, comprendiendo el metodo administrar in vitro a la celula la composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 3 o 4.
6. 7. La composicion para uso de la reivindicacion 5 o el metodo de la reivindicacion 6, en donde la celula es una celula 25 de mairnfero.
7. 8. La composicion para uso o el metodo de la reivindicacion 7, en donde la celula de marnffero es una celula humana.

   30 9. La composicion para uso de la reivindicacion 5 o el metodo de la reivindicacion 6, en donde la composicion comprende ademas un vedculo farmaceuticamente aceptable.