ES2635638T3 - Un electrodo y uso del mismo - Google Patents

Abstract

Un método para fabricar un electrodo para su uso en una técnica de espectroscopía de impedancia electroquímica, método que comprende: (a) unir monómeros de betaína fotopolimerizables a la superficie plana de un sustrato, obteniendo de este modo una superficie modificada que tiene una capa de monómeros de betaína fotopolimerizables dispuestos sobre la misma; después (b) poner en contacto dicha superficie modificada con monómeros de betaína fotopolimerizables adicionales, y opcionalmente reticular monómeros, y polimerizar fotoquímicamente los monómeros, generando de ese modo un electrodo que comprende polímeros dispuestos sobre dicha superficie plana; en el que la fijación de la capa de monómeros de betaína fotopolimerizables en la etapa (a) está sustancialmente completa antes de que la superficie modificada entre en contacto con otros monómeros de betaína fotopolimerizables, y opcionalmente reticular monómeros, y la polimerización fotoquímica se lleva a cabo en la etapa (b).

Description

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DESCRIPCION

Un electrodo y uso del mismo

La presente invencion se refiere a un electrodo para su uso en la deteccion electroqufmica de especies diana, en particular, para la deteccion de insulina.

Antecedentes

La insulina es una hormona polipeptfdica de bajo peso molecular (aproximadamente 5800 Da) producida por el pancreas. Es responsable de regular el metabolismo de los hidratos de carbono y los niveles de glucosa en sangre. La forma humana es un peptido compuesto de 51 aminoacidos, una cadena A de 21 residuos y una cadena B de 30 residuos unidas por dos enlaces disulfuro. Una determinacion de la insulina circulante en suero o plasma es de valor intrfnseco en el diagnostico clfnico y clasificacion de diversos tipos de diabetes y enfermedades relacionadas y control de dopaje en atletas.

Durante la ultima decada, se han desarrollado una variedad de metodos de deteccion, incluyendo aquellos basados en radioinmunoensayo, espectrometrfa de masas, espectrometrfa de fluorescencia y resonancia de plasmon superficial para la determinacion de insulina. Estos metodos son, sin embargo, poco practicos o insensibles, y no son traducibles a un formato de punto de atencion.

Con un aumento en la incidencia de la diabetes, el desarrollo de una prueba de diagnostico ultrasensible, barata, sencilla y automatizada serfa de un valor considerable. Al intentar cumplir con estos requisitos, los analisis electroqufmicos han recibido atencion. Aunque se han informado sensores amperometricos basados en la oxidacion de la insulina, estos operan a altos potenciales, y por consiguiente, padecen la interferencia de acido ascorbico y acido urico. Tambien son relativamente insensibles; el contenido en sangre de la insulina es normalmente por debajo de 80 pM entre comidas, muy inferior a los lfmites de deteccion de la mayorfa de los sensores electroqufmicos informados hasta la fecha.

La espectroscopfa de impedancia electroqufmica (EIS) es una tecnica que es capaz de monitorizar de forma sensible los cambios en la capacidad o resistencia a la transferencia de carga asociados con la union especffica de ciertos materiales a una superficie de electrodo modificada adecuadamente. Algunos inmunoensayos basados en EIS se han demostrado para la deteccion de moleculas proteicas relativamente grandes (PM >20 kD). Sin embargo, generalmente no se ha aplicado EIS al analisis de moleculas mas pequenas, tales como polipeptidos de bajo peso molecular, donde se espera que el impacto sobre la impedancia resultante de la union interfacial sea mucho menor que en el caso de protefnas grandes; esta es una consideracion particularmente significativa en el contexto de fluidos biologicos complejos que contienen concentraciones muy bajas de las moleculas de interes.

Sumario de la invencion

Los presentes inventores han encontrado ahora un sistema de ensayo para detectar insulina que es altamente selectivo, se extiende linealmente a traves del intervalo de concentracion clfnicamente relevante en su totalidad y presenta lfmites de deteccion en el intervalo picomolar bajo. Las interfaces pueden reutilizarse facilmente y por lo tanto son ideales para su uso en diagnosticos de punto de atencion.

En particular, los presentes inventores han establecido sorprendentemente que las muestras fisiologicas que contienen insulina son susceptibles al analisis cuantitativo por medio de espectroscopfa de impedancia electroqufmica con selectividad y sensibilidad excepcionales. Los inventores han encontrado tambien que la sensibilidad de estos sistemas de ensayo puede mejorarse aun mas aplicando tecnicas de impedancia electroqufmica no faradica, analizando el cambio de fase en la senal electrica que se produce cuando la insulina se une a las moleculas sonda sobre la superficie del electrodo y haciendo uso de electrodos preparados usando un protocolo de modificacion de superficie multietapa especffico basado en la fotopolimerizacion de monomeros de betafna fotopolimerizables. Este protocolo de modificacion de superficie multietapa tambien puede aplicarse a la preparacion de electrodos para su uso en la deteccion electroqufmica de especies diana distintas de la insulina.

Por lo tanto, un aspecto de la presente invencion se refiere a un electrodo para su uso en espectroscopfa de impedancia electroqufmica, que se ha preparado de esta manera.

En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un metodo para detectar insulina en una tecnica de espectroscopfa de impedancia electroqufmica, en el que el metodo comprende: (a) poner en contacto un electrodo de la presente invencion con un medio portador que comprende insulina; y (b) detectar una senal electrica.

La presente invencion tambien proporciona un espectrometro de impedancia electroqufmica que comprende un electrodo de la presente invencion.

Aun en un aspecto adicional, la presente invencion proporciona el uso de un electrodo de la presente invencion para

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detectar insulina mediante una tecnica de espectroscopfa de impedancia electroqufmica. Por lo tanto, la presente invencion proporciona un metodo para fabricar un electrodo para su uso en una tecnica de espectroscopfa de impedancia electroqufmica, de acuerdo con la reivindicacion 1.

El documento US 2019/061533 A1 describe la preparacion de revestimientos de poli (carboxibetafna) no ensuciantes para sensores usando un proceso de dos etapas en el que un iniciador de la polimerizacion se inmoviliza sobre un sustrato y luego se polimerizan monomeros de carboxibetafna usando fotopolimerizacion o polimerizacion radicalica por transferencia de atomos (ATRP).

Analytical Chemistry, 2008, vol. 80 n.° 20, paginas 7894-7901, ISSN 0003-2700, XP055083280 y Biomacromolecules, 2006, vol. 7, n.° 12, tambien ensenan la preparacion de recubrimientos de poli(carboxibetafna) no ensuciantes inmovilizando mercapto-undecil-bromoisobutirato como iniciador de polimerizacion sobre un sustrato seguido de ATRP de monomeros de carboxibetafna. En un aspecto preferido de la invencion, este metodo comprende ademas (c) unir moleculas sonda aptas para union especffica a una especie diana a dichos polfmeros. La especie diana es preferiblemente insulina.

En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un electrodo que se puede obtener mediante el metodo anterior de fabricacion de un electrodo de la presente invencion. La presente invencion proporciona ademas un metodo para detectar una especie diana en una tecnica de espectroscopfa de impedancia electroqufmica, en el que el metodo comprende: (a) poner en contacto el electrodo que puede obtenerse mediante el metodo anterior de fabricacion de un electrodo de la presente invencion con un medio portador que comprende dicha especie diana; y (b) detectar una senal electrica. La invencion proporciona ademas un espectrometro de impedancia electroqufmica que comprende un electrodo que se puede obtener por el metodo anterior de fabricacion de un electrodo de la presente invencion, asf como el uso de un electrodo que puede obtenerse mediante el metodo anterior de fabricacion de un electrodo de la presente invencion para detectar una especie diana mediante una tecnica de espectroscopfa de impedancia electroqufmica.

Otras caracterfsticas y realizaciones preferidas se describen en la descripcion adjunta y en las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripcion de las figuras

La figura 1 muestra graficos de Nyquist de electrodos diferentes registrados en solucion de PBST (10 mM, pH

7.4) que contiene Fe(CN)63"/4" 1,0 mM y KCl 0,1 M como se describe en el Ejemplo 1: (a) electrodo de oro desnudo; (b) interfaces PEG SAM; (c) interfaces modificadas con anticuerpo preparado posteriormente; Recuadro: (A) Un grafico Nyquist tfpico ideal de EIA faradica y (B) el circuito equivalente de Randles usado para el ajuste de datos.

La figura 2 muestra los espectros de impedancia faradica tfpicos correspondientes al biosensor del ejemplo 1 despues de la incubacion en solucion de PBST con diferentes concentraciones: (A) las curvas de interior a exterior representan 0 pM, 50 pM, 100 pM, 1 nM, 10 nM, y 50 nM de insulina, respectivamente; (B) la resistencia a la transferencia de carga normalizada (Rct) cambia del biosensor despues de la incubacion con diferentes concentraciones de protefna de insulina en PBST (10 mM, pH 7,4) que contiene Fe(CN)63"/4" 1,0 mM y KCl 0,1 M; el recuadro muestra la curva de calibracion correspondiente para los biosensores de insulina.

La figura 3 muestra una curva de calibracion para ensayos "in situ" de insulina en suero sangufneo al 10 % como se describe en el Ejemplo 1. Las superficies del biosensor se incubaron en solucion de PBST (10 mM, pH 7,4) que contenfa Fe(CN)63"14" 1,0 mM, KCl 0,1 M y suero sangufneo al 10%, con diferentes concentraciones de insulina, y mediciones de EIS realizadas posteriormente en la misma solucion.

La figura 4 muestra el efecto de la concentracion de suero sangufneo tal como se describe en el Ejemplo 1 sobre la respuesta del sensor a la insulina antes (columna izquierda) y despues (correccion de la columna derecha). Las superficies de los electrodos se incubaron en solucion de PBST (10 mM, pH 7,4) que contenfa insulina 100 pM y diferentes porcentajes en volumen de suero sangufneo durante 30 minutos, y despues se aclararon con PBST antes de mediciones EIS "ex situ" en PBST que contenfa Fe(CN)63"/4"1,0 mM y KCl 0,1 M. Los datos medidos se corrigieron a continuacion mediante la sustraccion de las contribuciones de EIS de la insulina en el propio suero calculados a partir de la curva de calibracion.

La figura 5 muestra una curva de calibracion para ensayos "in situ" de insulina en suero sangufneo al 50% como se describe en el Ejemplo 1. Las superficies de los electrodos se incubaron en solucion de PBST (10 mM, pH

7.4) que contenfa Fe(CN)63"14" 1,0 mM, KCl 0,1 M y suero sangufneo al 50%, con diferentes concentraciones de insulina, y las mediciones EIS se realizaron en una solucion de PBST (10 mM, pH 7,4) que contenfa Fe(CN)63"/4" 1,0 mM y KCl 0.1 M despues del aclarado con PBST.

La figura 6 muestra la regeneracion de la superficie sensorial del sensor del Ejemplo 1 mediante inmersion en tampon Gly-HCl 0,2 M que contiene DMSO al 1 % durante 5 min antes de aclarado con PBST, y analisis de impedancia en solucion PbST (10 mM, pH 7,4) que contiene Fe(CN)63"/4" 1,0 mM y KCl 0,1 M.

La figura 7 muestra los resultados del analisis de EIS no faradico de cambio de fase de muestras de insulina medidas en una serie de concentraciones en un sensor como se describe en el Ejemplo 2: (A) datos de respuesta; (B) curva de calibracion.

La figura 8 muestra un analisis ESI no faradico de cambio de fase de una muestra de insulina representativa y

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una serie de muestras de control en un sensor como se describe en el Ejemplo 2.

La figura 9 muestra una ilustracion esquematica de un metodo para preparar un electrodo funcionalizando una superficie de sustrato con un anticuerpo de insulina de acuerdo con una realizacion de la presente invencion.

La figura 10 muestra los graficos de fase Bode de EIS no faradica de un electrodo modificado con PCBMA registrado a diferentes intervalos de tiempo (especfficamente, en los dfas 1, 4, 6, 8, 11, 13, 15, 19, 22, 25, 28 y 32) en PBS (10 mM, pH 7,4), como se describe en el Ejemplo 3.

La figura 11 muestra los graficos Bode de EIS no faradica de las interfaces de biosensor como se describe en el Ejemplo 3 despues de la exposicion a concentraciones calibradas de insulina. Las mediciones se hicieron en PBS 10 mM (pH 7,4) a traves de un intervalo de frecuencias de 0,1-100 KHz. El pico curvado estrechamente emparejado a un valor de aproximadamente 6 y que generalmente disminuye a medida que el registro (frecuencia) aumenta son las mediciones de log (impedancia). Las curvas que aumentan primero como log (frecuencia) aumentan, despues alcanzan un maximo y posteriormente disminuyen a medida que el log (frecuencia) continua aumentando, son mediciones de cambio de fase. Las ultimas curvas se pueden distinguir por la concentracion de la muestra de insulina particularmente a valores bajos de log (frecuencia) por debajo de aproximadamente 0; en esta region la curva mas baja corresponde a 0 pM de insulina, con curvas sucesivamente mas altas correspondientes a 1 pM, 10 pM, 100 pM y, finalmente, 2000 pM de insulina.

La figura 12 muestra las curvas de fase (A), que representan el desfase de fase detectado entre las senales de entrada y salida en funcion de la frecuencia aplicada y (B) las curvas de impedancia de los graficos Bode de EIS no faradica de una superficie sensorial tfpica como se describe en el Ejemplo 3. Para ambas graficas (A) y (B), en la medida en que se pueden identificar curvas discretas, la curva mas baja corresponde a 0 pM de insulina, con curvas sucesivamente mas altas correspondientes a 1 pM, 10 pM, 100 pM y, finalmente, 2000 pM de insulina.

La figura 13 muestra los cambios de fase limpios de biosensores en el dominio de baja frecuencia, como se describe en el Ejemplo 3. La curva mas baja corresponde a 1 pM de insulina, con curvas sucesivamente mas altas correspondientes a 10 pM, 100 pM y, finalmente, 2000 pM de insulina.

La figura 14 muestra la respuesta del biosensor a la insulina 50 pM en concentracion serica progresivamente creciente con la respuesta en PBS puro tomada como el 100 %, como se describe en el Ejemplo 3. La respuesta se basa en el cambio de fase de EIS antes y despues del enriquecimiento con insulina, y los errores del ensayo estan dentro del 2 %. Las barras de error representan las desviaciones estandar de tres repeticiones de medicion.

La figura 15 muestra ensayos de muestras de suero de pacientes reales comparativos representativos con el metodo de EIS no faradico como se describe en el Ejemplo 3 (electrodos de macrodisco, cada una de las muestras analizada por triplicado) y un inmunoensayo quimioluminiscente clfnicamente aprobado. Se muestran las diferencias porcentuales. Observese que para los grupos de bloques adyacentes, el bloque de la izquierda corresponde a los resultados de quimioluminiscencia y el bloque de la derecha a los resultados de EIS.

La figura 16 muestra un grafico de Bland Altman del rendimiento del biosensor, en comparacion con un ensayo de quimioluminiscencia estandar clfnico y como se describe adicionalmente en el Ejemplo 3. Los datos mostrados aquf se adquirieron tanto en electrodos de oro de macro disco como en matrices de microelectrodos serigrafiadas.

Descripcion detallada

Los electrodos de la presente invencion comprenden moleculas sonda dispuestas sobre la superficie plana de un sustrato. Las moleculas sonda son capaces de unirse selectivamente a una especie diana. En los electrodos para su uso en la deteccion del EIS de insulina, la especie diana es insulina. En ciertos electrodos de la presente invencion, la especie diana puede ser una especie distinta de la insulina, como se describe adicionalmente en el presente documento.

El sustrato del electrodo puede comprender cualquier material electricamente conductor. El sustrato puede comprender un metal o carbono. El metal puede ser un metal en forma elemental o una aleacion de un metal. Opcionalmente, la totalidad del sustrato comprende un metal o carbono. El sustrato puede comprender un metal de transicion. El sustrato puede comprender un metal de transicion seleccionado entre cualquiera de los grupos 9 a 11 de la Tabla Periodica. El sustrato puede comprender un metal seleccionado entre, pero sin limitacion, renio, iridio, paladio, platino, cobre, indio, rubidio, plata y oro. El sustrato puede comprender un metal seleccionado entre oro plata y platino. El sustrato puede comprender un material que contiene carbono, que puede seleccionarse entre grafito pirolftico en plano de borde, grafito pirolftico en plano basal, carbon vftreo, diamante dopado con boro, grafito pirolftico altamente ordenado, polvo de carbono y los nanotubos de carbono.

En una realizacion preferida, el sustrato comprende oro, por ejemplo, el sustrato es un sustrato de oro.

La superficie del sustrato es plana, que incluye una superficie generalmente plana, tfpicamente sin muescas, protuberancias y poros. Tales superficies de sustrato pueden prepararse facilmente, antes de que las moleculas sonda y cualquier molecula enlazadora asociada se unan a la superficie, mediante tecnicas tales como pulido con partfculas finas, por ejemplo, pulverizacion con partfculas finas, opcionalmente en una secuencia de etapas en las que el tamano de las partfculas finas disminuye en cada paso de pulido. Las partfculas finas pueden comprender, por ejemplo, un material a base de carbono, tal como diamante, y/o pueden tener partfculas con diametros de 10 pm

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o menos, opcionalmente 5 pm o menos, opcionalmente 3 pm o menos, opcionalmente 1 pm o menos, opcionalmente 0,5 pm o menos, opcionalmente 0,1 pm o menos, Despues del pulido, la superficie del sustrato puede lavarse, por ejemplo, por ultrasonidos, opcionalmente en un medio lfquido adecuado, tal como agua, por ejemplo, durante un periodo de al menos 1 minuto, por ejemplo, de aproximadamente 1 minuto a 10 minutos. Opcionalmente, la superficie del sustrato puede lavarse con un abrasivo, por ejemplo, una solucion acida, por ejemplo despues del pulido y, si se usa, etapas de lavado ultrasonico. La solucion abrasiva puede comprender un acido inorganico, por ejemplo H2SO4, y/o un peroxido, por ejemplo, H2O2, en un medio lfquido adecuado, por ejemplo, agua. Opcionalmente, los sustratos pueden ser pulidos electroqmmicamente, que pueden seguir cualesquiera etapas que implican uno o mas de pulir con partmulas finas, lavar, por ejemplo, con ultrasonidos, y/o usar una solucion abrasiva. El pulido electroqmmico puede implicar un ciclo entre un potencial superior e inferior hasta que se alcanza un pico de reduccion estable, por ejemplo, un potencial superior de 0,5 V o mas, opcionalmente 1 V o more, opcionalmente 1,25 V o mas, y un potencial inferior de 0,5 V o menos, opcionalmente 0,25 V o menos, opcionalmente 0,1 V o menos.

La molecula sonda preferiblemente comprende o es una especie de union seleccionada entre un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un aptamero, un oligosacarido, un peptido y una protema. Preferiblemente, las moleculas sonda comprenden o son una especie de union seleccionada entre uno o mas de un anticuerpo, un acido nucleico y un peptido. Mas preferiblemente, las moleculas sonda comprenden o son un anticuerpo.

Si las moleculas sonda comprenden un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo pueden seleccionarse de una o mas de las clases IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. IgD, IgE, IgG e IgM. En una realizacion preferida, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es del tipo IgG. El anticuerpo se une selectivamente a la especie diana. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede derivarse de un mamnfero, incluyendo, pero sin limitacion, un mairnfero seleccionado de un ser humano, un raton, una rata, un conejo, una cabra, una oveja, y un caballo. En una realizacion, las moleculas sonda comprenden un anticuerpo del tipo IgG derivado de un raton.

Si las moleculas sonda comprenden un aptamero, el aptamero se puede seleccionar entre un aptamero de peptido, un aptamero de ADN y un aptamero de ARN.

Tal como se indica anteriormente, preferiblemente, las moleculas sonda comprenden una especie de union seleccionada entre uno o mas de un anticuerpo, un acido nucleico y un peptido.

Preferiblemente, la superficie del sustrato que tiene las moleculas sonda sobre la misma, como un todo, es selectiva para la especie diana (por ejemplo, para insulina). Si la superficie del sustrato que tiene las moleculas sonda sobre la misma es selectiva para la especie diana, esto indica que sustancialmente solo o solo la especie diana se unira a la superficie (por union a las moleculas sonda) y otras especies (por ejemplo, presentes en el medio portador con la especie diana) no se uniran, o no se uniran en ningun grado significativo, a otras partes de la superficie del sustrato u otras especies en la misma. Tales superficies de sustrato selectivo pueden denominarse superficies de sustrato altamente selectivas (o superficies de electrodos altamente selectivas).

En una realizacion, las moleculas sonda pueden comprender un polfmero que esta unido a: (a) la superficie plana del sustrato; y (b) a un resto B capaz de unirse selectivamente a la insulina. Preferiblemente, dicho polfmero comprende una pluralidad de grupos betama colgantes. Un grupo betama es un grupo que comprende tanto un grupo funcional cationico cargado positivamente que no lleva atomo de hidrogeno (por ejemplo, un grupo funcional amonio cuaternario o fosfonio) y un grupo funcional cargado negativamente (por ejemplo un grupo carboxilato o un grupo sulfonato). Colgante significa que dichos grupos betama son grupos laterales que se extienden alejandose de la cadena principal del polfmero (es decir, la cadena derivada de unidades monomericas repetitivas).

Los grupos betama colgantes, por ejemplo, pueden comprender un cation de amonio cuaternario y un grupo carboxilato. Por ejemplo, los grupos betama colgantes pueden tener la formula (I)

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en la que:

R1 y R3 son iguales o diferentes y cada uno es un grupo alquileno C1 a C5;

R2 y R2' son iguales o diferentes y cada uno es un grupo alquilo C1 a C5; y X es O o NH.

En un aspecto ejemplar, los grupos betama colgantes pueden tener la formula (I), en la que R1 y R3 son etileno, R2 y R2. son metilo y X es O. Un polfmero que contiene tales grupos colgantes se puede obtener por fotopolimerizacion

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de (alquil)acrilatos de carboxibetafna tales como metilacrilato de carboxibetafna (CBMA) y etilacrilato de carboxibetafna (CBEA). En otro aspecto ejemplar, los grupos betafna colgantes pueden tener la formula (I) en la que Ri es propileno, R3 es etileno, R2 y R2. son metilo y X es NH. Un polfmero que contiene tales grupos colgantes se puede obtener mediante fotopolimerizacion de carboxibetafna (alquil)acrilamidas tales como carboxibetalacrilamida.

El polfmero puede tener, por ejemplo, una cadena principal de hidrocarburo, por ejemplo, una cadena principal que es un resto alquileno de cadena lineal o ramificada (por ejemplo, que tiene al menos 10 atomos de carbono, opcionalmente al menos 50 atomos de carbono, opcionalmente al menos 100 atomos de carbono). Tfpicamente, cuando el polfmero comprende una pluralidad de grupos de betafna colgantes, el polfmero comprende al menos 5, o al menos 10, por ejemplo, al menos 25 grupos de betafna colgantes. Dichos polfmeros se pueden obtener, por ejemplo, mediante fotopolimerizacion de monomeros fotopolimerizables que contienen un doble enlace carbono- carbono fotopolimerizable (asf como un grupo betafna, si el polfmero comprende una pluralidad de grupos betafna colgantes). Por ejemplo, Por ejemplo, se pueden usar monomeros que comprenden grupos (alquil)acrilato tales como acrilato, metacrilato y etilacrilato. Segun la presente invencion, los electrodos se pueden obtener llevando a cabo el metodo de fabricacion de un electrodo de la presente invencion, como se describe con mas detalle en el presente documento.

La presente solicitud tambien se refiere a un metodo para detectar insulina en una tecnica de espectroscopfa de impedancia electroqufmica, en el que el metodo comprende: (a) poner en contacto un electrodo de la presente invencion con un medio portador que comprende insulina; y (b) detectar una senal electrica en el electrodo de trabajo.

La espectroscopfa de impedancia electroqufmica (EIS) es conocida por el experto en la tecnica. En general, Generalmente, se aplica un potencial de ca variable en un potencial de polarizacion (o CC) entre un electrodo de trabajo y un contraelectrodo. En general, el EIS implica escanear a traves de una gama de frecuencias de CA. La relacion entre la senal de entrada (tfpicamente el potencial variable) y la senal de salida (tfpicamente la corriente variable) permite calcular la impedancia. Generalmente existe una diferencia de fase entre la senal de entrada y la senal de salida, de modo que la impedancia puede considerarse como una funcion compleja, que tiene una parte real (a veces denominada Z') y una parte imaginaria (a veces denominada Z").

Las partes real e imaginaria de la impedancia se pueden trazar una contra otra, por ejemplo, en la forma de un grafico de Nyquist, como se ilustra en la figura 1. Al ajustar los datos de impedancia a un supuesto circuito equivalente, se puede determinar la resistencia a la transferencia de electrones, que es un medio a traves del cual se puede evaluar el evento de union. Como alternativa, el metodo puede comprender medir la propia diferencia de fase.

El intervalo de frecuencia del potencial alternativo variable aplicado puede ser de 0,05 Hz a 10 kHz. La amplitud del potencial alternativo aplicado, que esta tfpicamente en forma de onda sinusoidal, puede ser de 1 mV a 100 mV, opcionalmente de 5 mV a 50 mV, opcionalmente de 5 mV a 20 mV, opcionalmente de 5 mV a 15 mV, opcionalmente de 8 mV a 12 mV, opcionalmente aproximadamente 10 mV. El potencial de polarizacion (o potencial de corriente continua) puede ajustarse a cualquier potencial deseado. Si esta presente una sonda redox en el medio portador, el potencial de polarizacion puede ajustarse al potencial de electrodo de la sonda redox en las condiciones en las que se lleva a cabo el metodo.

En un aspecto, puede estar presente una sonda redox en el medio portador, y el metodo puede implicar EIA faradico. Si esta presente una sonda redox, puede ser una especie de metal de transicion, en la que el metal de transicion puede adoptar dos estados de valencia (por ejemplo, un ion metalico (M) capaz de adoptar estados M (II) y M (III)). En una realizacion, la sonda redox contiene un ion metalico, en el que el metal del ion metalico se selecciona de hierro, rutenio, iridio, osmio, cobalto, tungsteno y molibdeno. En una realizacion, la sonda redox se selecciona de Fe(CN)63-/4-, Fe(NH3)63+/2+, Fe(phen)33+/2+, Fe(bipy)23+/2+, Fe(bipy)33+/2+, Ru3+/2+, RuO43-/2-, Ru(CN)63-/4-, Ru(NH3)63+/2+, Ru(en)33+/2+, Ru(NH3)5(Py)3+/2+, Ir4+/3+, Ir(CI)62-/3-, Ir(Br)62-/3-, Os(bipy)23+/2+, Os(bipy)33+/2+, OxCl62-/3-, Co(NH3)63+/2+, ,W(CN)63-/4-, Mo(CN)63-/4-, ferroceno opcionalmente sustituido, poliferroceno, quinionas, tales como p- benzoquinona e hidroquinona y fenol. En una realizacion, la sonda redox es una especie que contiene hierro en la que el hierro esta en los estados Fe(II) y/o Fe(III). En una realizacion, la sonda redox es Fe(CN)63"/4". La sonda redox puede estar presente en el medio portador en una cantidad de 0,1 mM a 100 mM, opcionalmente de 0,5 mM a 10 mM, opcionalmente de 0,5 mM a 2 mM, opcionalmente de 0,5 mM a 1,5 mM, opcionalmente aproximadamente 1 mM.

En un aspecto particularmente preferido de la invencion, sin embargo, la tecnica de EIS es una tecnica de EIS no faradica. En este aspecto, no se anade una sonda redox al medio portador. Por ejemplo, el medio portador puede no contener una sonda redox exogena anadida externamente, es decir, por ejemplo, puede no comprender una sonda redox. Los presentes inventores han encontrado que la EIS no faradica proporciona resultados mas sensibles para la deteccion de insulina que la EIS faradica. Este fue un resultado inesperado debido a que los ensayos EIS estan convencionalmente dominados por metodos faradicos en los que se anade una sonda redox al medio portador (debido a que los efectos resistivos de un evento de union en una superficie se amplifican ampliamente muestreando el impacto de esto sobre la corriente generada por una sonda redox en gran exceso).

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El medio portador esta preferiblemente en forma liquida. El liquido portador puede ser cualquier liquido en el que las especies diana (por ejemplo, insulina) puedan ser suspendidas o disueltas. En una realizacion, el liquido portador comprende agua. En una realizacion, el liquido portador comprende un fluido biologico. Un fluido biologico puede ser un fluido que se ha obtenido de un sujeto, que puede ser un ser humano o un animal. En una realizacion, el liquido portador comprende un fluido biologico no diluido. Un fluido biologico no diluido en el presente contexto es un fluido biologico obtenido de un sujeto, por ejemplo, un ser humano o animal, que no ha sido diluido con otro liquido, aunque pueden estar presentes aditivos tales como una sonda redox en el fluido biologico no diluido. El fluido biologico puede seleccionarse de sangre, orina, lagrimas, saliva, sudoracion, y liquido cefalorraqufdeo.

Opcionalmente, el medio portador comprende un fluido biologico obtenido de un sujeto, por ejemplo, un ser humano o animal, y un diluyente. El diluyente puede anadirse al fluido biologico despues de haber sido obtenido del sujeto. El diluyente puede incluir un medio liquido, por ejemplo, un medio liquido seleccionado de agua y un alcohol, por ejemplo, un alcohol, por ejemplo, etanol. El medio portador puede comprender ademas un tampon. El tampon puede comprender un fosfato.

El metodo puede comprender calcular la concentracion de la especie diana (por ejemplo, insulina) a partir de la senal electrica. La senal electrica puede convertirse en datos de impedancia y luego convertirse en la concentracion de la especie diana (por ejemplo, insulina) a partir de la senal electrica. La senal electrica puede convertirse en datos de resistencia de transferencia de carga, o datos de cambio de fase, y luego convertirse en la concentracion de la especie diana (por ejemplo, insulina) a partir de la senal electrica. El metodo puede implicar comparar los datos obtenidos en la tecnica de espectroscopfa de impedancia electroqufmica, por ejemplo, a partir de la senal electrica, los datos de impedancia, los datos de resistencia de transferencia de carga, o los datos de cambio de fase, y comparando los datos con los datos obtenidos en una etapa de calibracion, para obtener la concentracion de la especie diana (por ejemplo, insulina). El metodo puede implicar una etapa de calibracion inicial que determina una relacion entre la concentracion de la especie diana (por ejemplo insulina) y datos electroqufmicos obtenidos de la senal electroqufmica en la tecnica de espectroscopfa de impedancia electroqufmica; los datos electroqufmicos pueden seleccionarse a partir de datos de impedancia, datos de resistencia de transferencia de carga y datos de cambio de fase; la relacion se puede usar para convertir los datos electroqufmicos obtenidos de una muestra de interes en la tecnica de espectroscopfa de impedancia electroqufmica a la concentracion de la especie diana (por ejemplo, insulina) en la muestra.

Los inventores han encontrado que el calculo de la concentracion de insulina a partir de un cambio de fase en una senal electrica que se produce tras la union de la insulina a las moleculas sonda da lugar a un ensayo de insulina particularmente sensible comparado con otros metodos conocidos en la tecnica para cuantificar datos de espectroscopfa de impedancia electroqufmica. Por consiguiente, es un aspecto particularmente preferido del metodo de la invencion que la concentracion de insulina se calcula a partir de un cambio de fase en una senal electrica que se produce al unirse la insulina a las moleculas sonda. Los datos de fase adecuados pueden proporcionarse, por ejemplo, directamente mediante un software de potenciostato (por ejemplo, utilizando potenciostatos Autolab comercialmente disponibles). Los datos de fase se pueden muestrear a cualquier frecuencia y en presencia de cualquier concentracion de especies diana.

La concentracion de la especie diana (por ejemplo, insulina) en el medio portador puede ser 0,1 pM o mas, opcionalmente 0,2 pM o mas, opcionalmente 0,5 pM o mas, opcionalmente 1,0 pM o mas, La concentracion de la especie diana (por ejemplo, insulina) en el medio portador puede ser 100 nM o menos opcionalmente 80 nM o menos, opcionalmente 50 nM o menos, opcionalmente 10 nM o menos, La concentracion de la especie diana (por ejemplo, insulina) en el medio portador puede ser de 0,1 pM a 100 nM, opcionalmente de 0,2 pM a 100 nM, opcionalmente de 0,5 pM a 50 nM.

Los presentes inventores han encontrado que es posible regenerar el electrodo que se ha unido a especies diana (por ejemplo, insulina), disociando especies diana unidas (por ejemplo, insulina) del electrodo. Por lo tanto, el metodo puede implicar, despues de poner en contacto el electrodo con el medio portador de manera que las especies diana (por ejemplo, insulina) se unan a las moleculas sonda, disociar especies diana (por ejemplo, insulina) de las moleculas sonda. La disociacion puede comprender el contacto de la superficie de electrodo que tiene especies diana (por ejemplo, insulina) sobre la misma con un medio liquido acido, que opcionalmente tiene un pH de 6 o inferior, opcionalmente un pH de 5 o inferior, por ejemplo un pH de 4 o inferior. El medio liquido acido puede contener una sustancia acida, por ejemplo un tampon acido (por ejemplo, clorhidrato de glicina). El medio liquido acido puede ser acuoso o no acuoso. Por ejemplo, puede ser un medio no acuoso que comprende un disolvente no acuoso tal como DMSO.

El metodo puede comprender ademas, despues de disociar la insulina de las moleculas sonda, reutilizar el electrodo en uno o mas metodos adicionales para detectar insulina en una tecnica de espectroscopfa de impedancia electroqufmica. Cada uno de tales metodos adicionales puede comprender llevar a cabo un metodo para detectar insulina de la presente invencion.

La presente invencion tambien se refiere a un espectrometro de impedancia electroqufmica, en el que el espectrometro comprende un electrodo como se define en el presente documento. El espectrometro de impedancia

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electroqufmica puede ser de un diseno estandar. El espectrometro de impedancia electroqufmica puede comprender un electrodo de la presente invencion como electrodo de trabajo, un contraelectrodo y, si se desea, un electrodo de referencia. El espectrometro de impedancia electroqufmica comprende preferiblemente un medio para aplicar, controlar y variar un potencial entre los electrodos de trabajo y contraelectrodos, y un medio para medir la corriente resultante. El espectrometro de impedancia electroqufmica comprende preferiblemente un potenciostato para controlar el potencial y medir la corriente resultante. El espectrometro de impedancia electroqufmica comprende preferiblemente un medio para calcular los datos de impedancia del potencial aplicado y la corriente resultante. El espectrometro de impedancia electroqufmica puede comprender un medio para calcular la resistencia a la transferencia de electrones del electrodo de trabajo.

El espectrometro de impedancia electroqufmica es preferiblemente para detectar insulina presente en un medio portador a una concentracion de 0,1 pM o mas, opcionalmente 0,2 pM o mas, opcionalmente 0,5 pM o mas, opcionalmente 1,0 pM o mas,

La presente invencion se refiere tambien al uso de un electrodo como se describe en el presente documento, o un espectrometro de impedancia electroqufmica como se describe en el presente documento, para la deteccion de una especie diana, por ejemplo, insulina. El uso puede incluir la deteccion de la presencia de y/o la deteccion de la concentracion de la especie diana, por ejemplo, insulina. El uso puede ser para detectar la insulina presente en un medio portador a una concentracion de 0,1 pM o mas, opcionalmente 0,2 pM o mas, opcionalmente 0,5 pM o mas, opcionalmente 1,0 pM o mas,

Los presentes inventores han encontrado que se puede obtener una superficie de electrodo particularmente no ensuciante y estable, idealmente para su uso en las circunstancias tecnicamente exigentes asociadas con la deteccion de insulina por EIS, realizando la funcionalizacion de la superficie del substrato mediante un procedimiento multietapa aprovechando las tecnicas de fotopolimerizacion. En particular, los presentes inventores han ideado un metodo para fabricar un electrodo para su uso en una tecnica de espectroscopfa de impedancia electroqufmica, de acuerdo con la reivindicacion 1.

Ventajosamente, este metodo conduce a una superficie de sustrato modificada con polfmero que es sustancialmente no ensuciante. Ademas, las etapas del metodo pueden llevarse a cabo en solucion acuosa y por fotoiniciacion en condiciones de laboratorio moderadas y seguras. Esto puede contrastarse con un metodo alternativo en el que se genera un polfmero en solucion y posteriormente se deposita por colada o por centrifugacion sobre una superficie, lo que conduce a reacciones relativamente incontroladas y superficies potencialmente inestables (debido a la ausencia de union covalente del polfmero a la superficie del substrato). El presente metodo es tambien ventajoso con respecto a un metodo alternativo en el que se genera una monocapa autoensamblable iniciadora y luego se inicia una reaccion de radical libre en una atmosfera y disolvente inertes y con el monomero anadido (que es inconveniente, relativamente incontrolado y potencialmente peligroso).

Para facilitar la comprension, la figura 9 muestra una ilustracion esquematica de esta metodologfa para preparar un electrodo. Se hace hincapie en que esta figura solo muestra una realizacion especffica de la presente invencion y no es representativa del alcance completo del presente metodo.

Los monomeros fotopolimerizables pueden estar unidos a la superficie plana de un sustrato en la etapa (a) por metodos conocidos en la tecnica, por ejemplo, utilizando los metodos descritos en el presente documento para unir un resto de enlace "L" a una superficie de sustrato. Se apreciara que dependiendo de la naturaleza qufmica tanto del sustrato como de los monomeros, puede ser posible unir los monomeros directamente a la superficie. Como alternativa, la superficie puede ser activada qufmicamente primero para introducir grupos funcionales qufmicamente reactivos (tales como, pero sin limitacion, grupo tiol o amina), que permiten la union de los monomeros. Por ejemplo, la cisteamina se utiliza comunmente para introducir grupos funcionales amina reactivos sobre sustratos de oro; el grupo tiol del reactivo de cisteamina se une al sustrato y los grupos de amina libre resultantes se pueden hacer reaccionar facilmente con un grupo funcional adecuado, tal como un grupo acido carboxflico, sobre los monomeros (en el caso de un grupo de acido carboxflico sobre los monomeros, dando como resultado la formacion de un enlace amida). Tfpicamente, la etapa de fijacion de los monomeros fotopolimerizables comprende la union covalente o semi-covalente de monomeros fotopolimerizables a la superficie plana del sustrato (es decir, la formacion de un enlace covalente o semi-covalente entre los monomeros fotopolimerizables y la superficie del sustrato). Para disipar cualquier duda, la inclusion de monomeros fotopolimerizables en la superficie plana de un sustrato de oro a traves de un enlace oro-azufre se incluye dentro del alcance de la expresion "unir covalentemente o semi-covalentemente" (considerandose el enlace oro-azufre como un enlace covalente o semi-covalente, por ejemplo, un enlace semi- covalente).

La superficie modificada que tiene una capa de monomeros fotopolimerizables dispuesta sobre la misma puede ser una monocapa autoensamblada.

En el metodo de la invencion, la etapa (a) se realiza antes de la etapa (b). Por lo tanto, se realiza la etapa (a), y a continuacion se realiza la etapa (b). Esto significa que la union (tfpicamente covalente) de una capa de monomeros fotopolimerizables esta sustancialmente completa antes de que la superficie modificada se ponga en contacto con

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otros monomeros fotopolimerizables, opcionalmente monomeros de reticulacion, y se realiza la polimerizacion fotoqufmica. Esta naturaleza multietapas del metodo conduce a la generacion de una superficie de sustrato estable y homogeneamente modificada.

Tfpicamente, pero no esencialmente, los monomeros fotopolimerizables usados en las etapas (a) y (b) son los mismos. Los monomeros fotopolimerizables (y otros monomeros fotopolimerizables) son monomeros de betafna fotopolimerizables.

Los monomeros de betafna fotopolimerizables comprenden un grupo funcional fotopolimerizable y un grupo betafna. Como se ha explicado en la divulgacion anterior, un grupo betafna es un grupo que comprende tanto un grupo funcional cationico cargado positivamente que no lleva atomo de hidrogeno (por ejemplo, un grupo funcional amonio cuaternario o fosfonio) y un grupo funcional cargado negativamente (por ejemplo un grupo carboxilato o un grupo sulfonato).

El grupo fotopolimerizable puede ser cualquier grupo susceptible a la fotopolimerizacion bajo condiciones adecuadas para la modificacion de la superficie del electrodo. En una realizacion, los monomeros fotopolimerizables pueden comprender cada uno un doble enlace carbono-carbono fotopolimerizable. Por ejemplo, los monomeros fotopolimerizables pueden comprender grupos (alquil)acrilato, tales como grupos acrilato, metacrilato y/o etilacrilato. En el caso de un monomero de betafna fotopolimerizable, el grupo fotopolimerizable es un grupo distinto del grupo funcional cationico cargado positivamente del grupo betafna y el grupo funcional negativamente cargado del grupo betafna.

En una realizacion, los monomeros de betafna polimerizables comprenden cada uno un cation de amonio cuaternario y un grupo carboxilato. Los monomeros de betafna fotopolimerizables pueden, por ejemplo, ser de la formula (II)

imagen2

en la que:

Ri y R3 son iguales o diferentes y cada uno es un grupo alquileno Ci a C5;

R2 y R2' son iguales o diferentes y cada uno es un grupo alquilo Ci a C5;

R4 es un atomo de hidrogeno o un grupo alquilo Ci a C5; y X es O o NH

En los aspectos ejemplares del metodo, los monomeros de betafna fotopolimerizables se seleccionan de metacrilato de carboxibetafna (CBMA), carboxibetafna acrilamina (CBAA) y etilacrilato de carboxibetafna (CBEA).

Opcionalmente se pueden usar monomeros de reticulacion en la etapa (b). Un reticulante adecuado es dimetacrilato de etilenglicol (EGDMA), aunque tambien pueden usarse otros reticulantes conocidos en la tecnica.

Un fotoiniciador se usa tfpicamente para iniciar la polimerizacion fotoqufmica de los monomeros en la etapa (b). Puede usarse cualquier fotoiniciador adecuado de los muchos fotoiniciadores conocidos en la tecnica. Ejemplos no limitantes de fotoiniciadores adecuados incluyen formiato de metilbenzoflo y 1-hidroxiciclohexifenil cetona.

La fotopolimerizacion puede dar como resultado polfmeros que comprenden una pluralidad de grupos betafna colgantes, tal como se describe en otras partes del presente documento. Los polfmeros pueden comprender, por ejemplo, al menos 5, o al menos 10, por ejemplo, al menos 25 grupos de betafna colgantes.

La fotopolimerizacion puede dar como resultado un polfmero que puede tener, por ejemplo, una cadena principal de hidrocarburo, por ejemplo, una cadena principal que es un resto alquileno de cadena lineal o ramificada (por ejemplo, que tiene al menos 10 atomos de carbono, opcionalmente al menos 50 atomos de carbono, opcionalmente al menos 100 atomos de carbono).

En un aspecto preferido, este metodo comprende ademas (c) unir moleculas sonda aptas para union especffica a una especie diana a dichos polfmeros. Las moleculas sonda pueden unirse directamente a los polfmeros siempre que tanto las moleculas sonda como los polfmeros tengan grupos funcionales reactivos accesibles adecuados. Como alternativa, los polfmeros, o las moleculas sonda, pueden activarse qufmicamente haciendo reaccionar con

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compuestos activantes adecuados conocidos en la tecnica. Por ejemplo, los grupos funcionales cargados negativamente accesibles, tales como grupos carboxilato en grupos de betafna colgantes del polfmero pueden activarse facilmente usando compuestos tales como NHS, haciendolos asf reactivos qufmicamente a moleculas sonda tales como anticuerpos.

En un aspecto ejemplar, la especie diana es insulina y, por lo tanto, la etapa (c) implica unir moleculas sonda capaces de union especffica a insulina (por ejemplo, anticuerpos de insulina) a dichos polfmeros.

Sin embargo, como se ha indicado en la divulgacion anterior, este metodo de fabricacion de un electrodo tambien puede aplicarse a la produccion de electrodos para su uso en la deteccion por espectroscopfa de impedancia electroqufmica de moleculas sonda que son capaces de realizar una union especffica a especies diana distintas de insulina (denominadas en el presente documento como "otras especies diana").

Dichas otras especies diana incluyen protefnas, polipeptidos, anticuerpos, nanopartfculas, farmacos, toxinas, gases nocivos, sustancias qufmicas peligrosas, explosivos, partfculas virales, celulas, organismos multicelulares, citocinas y quimiocinas, ganietocitos, organulos, lfpidos, secuencias de acido nucleico, oligosacaridos, intermedios qufmicos de las rutas metabolicas y macromoleculas. En realizaciones preferidas, la otra especie diana comprende, consiste esencialmente en, o consiste en, una molecula biologica, mas adecuadamente una macromolecula biologica, mucho mas adecuadamente un polipeptido.

Si la otra especie diana es o comprende una protefna, la protefna puede seleccionarse de, pero sin limitacion, protefnas nativas, protefnas desnaturalizadas, fragmentos de protefnas y protefnas expresadas procariota o eucarioticamente. La protefna puede tener su significado normal en la tecnica y mucho mas preferiblemente, "protefna" se refiere a una molecula polipeptfdica. Dicho polipeptido puede comprender modificaciones tales como glicosilacion; fosforilacion u otras modificaciones de este tipo.

Si la otra especie diana es un anticuerpo, el anticuerpo puede seleccionarse de una o mas de las clases IgA, IgD, IgE, IgG e IgM.

Si la otra especie diana es una nanopartfcula, la nanopartfcula puede seleccionarse de, pero sin limitacion, una o mas de nanopartfculas aislantes, metalicas o semiconductoras.

Si la otra especie diana es un farmaco, el farmaco puede seleccionarse de, pero sin limitacion, alcohol (por ejemplo, etanol), anfetaminas, nitrato de amilo, herofna, ketamina, esteroides anabolicos, LSD, disolventes, cannabis, cocafna (tal como clorhidrato de cocafna o "coca"), tabaco, tranquilizantes, crack (es decir, base libre de cocafna), extasis y/o gammhidroxibutirato (GHB). Como alternativa, en algunas realizaciones, el farmaco puede ser una sustancia medicinal.

La otra especie diana puede ser un farmaco candidato, por ejemplo, una entidad qufmica o biologica que puede ser ensayada o cribada para una actividad o propiedad particular usando la presente invencion.

Si la otra especie diana es una toxina, la toxina puede seleccionarse de, pero sin limitacion, una o mas toxinas procedentes de animales, plantas, o bacterias.

Si la otra especie diana es una partfcula viral, la partfcula viral puede seleccionarse de, pero sin limitacion, una o mas partfculas virales con y sin un genoma.

Si la otra especie diana es una celula, la celula puede seleccionarse de, pero sin limitacion, una o mas celulas progenitoras pluripotentes, celulas humanas (por ejemplo, linfocitos B, linfocitos T, mastocitos, fagocitos, neutrofilos, eosinofilos, macrofagos, celulas endoteliales), celulas cancerosas (por ejemplo, las que provienen de canceres de hfgado, hueso cervical, pancreatico, colorrectal, prostata, epidermico, cerebro, mama, pulmon, testicular, renal, vejiga, organismos unicelulares de origen no humano, algas, hongos, bacterias, celulas vegetales, huevos de parasitos, plasmodios y micoplasmas.

Si la otra especie diana es un organulo, el organulo puede seleccionarse de, pero sin limitacion, uno o mas de nucleo, mitocondrias, aparato de Golgi, retfculo endoplasmatico, lisosoma, fagosoma, membranas intracelulares, membranas extracelulares, citoesqueleto, membrana nuclear, cromatina, matriz nuclear y cloroplastos.

Si la otra especie diana es un lfpido, el lfpido puede seleccionarse de, pero sin limitacion, uno o mas de lfpidos de senalizacion, lfpidos estructurales, fosfolfpidos, glicolfpidos y acidos grasos.

Si la otra especie diana es una secuencia de acido nucleico, la secuencia de acido nucleico puede seleccionarse de, pero sin limitacion, uno o mas de ADN, ADNc, ARN, ARNr, ARNm, ARNmi y ARNt.

Si la otra especie diana es un oligosacarido, el oligosacarido se puede seleccionar, pero sin limitacion, uno o mas de oligosacaridos de origen humano, animal, vegetal, fungico o bacteriano.

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La otra especie diana puede ser cualquier antfgeno o analito que sea indicativo de una enfermedad particular. La diana puede seleccionarse de, por ejemplo, protefna C reactiva, enzima convertidora de angiotensina I (peptidil- dipeptidasa A) 1; adiponectina; receptor especffico del producto final de glucosilacion avanzada; alfa-2-HS- glicoprotefna; angiogenina, ribonucleasa, familia A de RNasa, 5; apolipoprotefna A-l; apolipoprotefna B (incluyendo antfgeno Ag(x)); apolipoprotefna E; protefna X asociada a BCL2; CLL linfocitos B/linfoma 2; complemento C3; ligando 2 de quimiocina (motivo C-C); CD 14, soluble; CD 40, soluble; cdk5;, relacionado con pentraxina; catepsina B, dipeptidil peptidasa IV; factor de crecimiento epidermico; endoglina; Fas; fibrinogeno; ferritina; hormona del crecimiento 1; alanina aminotransferasa; factor de crecimiento de hepatocitos; haptoglobina; protefna 70kDa de choque termico 1 B; molecula de adhesion intracelular 1; factor de crecimiento insulfnico 1 (somatomedina C), receptor de factor de crecimiento insulfnico de tipo 1, protefna 1 de union a factor de crecimiento insulfnico; protefna 2 de union a factor de crecimiento insulfnico; protefna 3 de union a factor de crecimiento insulfnico; interleucina 18; receptor de interleucina 2, alfa; receptor de interleucina 2, beta; interleucina 6 (interferon, beta 2); receptor de interleucina 6, transductor de senal de interleucina 6 (gp130, receptor de oncostatina M); interleucina 8; activina A; leptina (homologo de obesidad, raton); activador de plasminogeno, tejido; proopiomelanocortina (adrenocorticotropina/beta-lipotropina/hormona estimuladora de alfa-melanocitos/hormona estimuladora de beta- melanocitos/beta-endorfina); proinsulina; resistina; selectina e (molecula de adhesion endotelial 1 ); selectina P (protefna de membrana granular 140 kDa, antfgeno CD62); inhibidor de serpina peptidasa, clado E (nexina, inhibidor activador del plasminogeno tipo 1), miembro 1; cinasa regulada por suero/glucocorticoide; globulina de union a hormonas sexuales; factor de crecimiento transformante, beta 1 (enfermedad de Camurati-Engelmann); inhibidor de metalopeptidasa TIMP 2; superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral, miembro 1 B; molecula de adhesion a celulas vasculares 1 (VCAM-1); factor de crecimiento endotelial vascular; Factor II, Factor V, Factor VIII, Factor IX, Factor XI, Factor XII, productos de degradacion de F/fibrina, complejo de trombina-antitrombina III, fibrinogeno; plasminogeno, protrombina, y factor von Willebrand, y similares. Los marcadores utiles para la diabetes incluyen, por ejemplo, protefna C reactiva; glucosa; insulina; TRIG; GPT; HSPA1 B; IGFBP2; LEP; AdIPOQ; CCL2; ENG; HP; IL2RA; SCp; SHBG; y TIMP2.

La otra especie diana puede ser una diana asociada con el control de la diabetes. En una realizacion, la diana puede seleccionarse entre glucosa, insulina, receptor alfa de Interleucina 2 (IL2-RA), protefna C reactiva (CRP) y hemoglobina glicada (HbAlc). Si la otra diana es glucosa, los restos de sonda pueden seleccionarse de, por ejemplo, el elemento de reconocimiento molecular del ensayo GDH-FAD o una protefna de union a glucosa/galactosa (GGBP) (Scholle et al., Mol. Gen. Genet 208:247-253 (1987)). Si la otra diana es IL-2RA, los restos de sonda pueden comprender o consistir en un anticuerpo monoclonal especffico para IL-2RA. Si la otra especie diana es o comprende una protefna C reactiva, preferiblemente esta es protefna C reactiva humana.

Se cree que la reaccion de multiples etapas de la presente invencion da lugar a superficies que tienen caracterfsticas de estabilidad y anti-ensuciamiento mejoradas con respecto a superficies de electrodo modificadas con polfmero anteriores. Por consiguiente, la presente invencion se refiere tambien a un electrodo que se puede obtener mediante este metodo de fabricacion de un electrodo. Se apreciara que tales caracterfsticas anti-ensuciantes y de estabilidad son particularmente ventajosas en el contexto de la deteccion de insulina a partir de muestras fisiologicas, donde la selectividad y la sensibilidad son cuestiones importantes.

Los electrodos modificados con polfmero de la presente invencion son susceptibles de analisis utilizando tecnicas de analisis superficial conocidas en la tecnica. Por ejemplo, se pueden usar metodos electroanalfticos (tales como "reduccion reductiva") y metodos espectroscopicos de superficie (tales como espectroscopfa de fotoelectrones de rayos X y elipsometrfa) para confirmar que una pelfcula de polfmero se une qufmicamente a un electrodo a traves de una qufmica basada en azufre. La elipsometrfa y la microscopfa de fuerza atomica se pueden utilizar para definir el espesor de la pelfcula y la homogeneidad. La espectroscopfa de masas se puede usar para definir la composicion de la pelfcula. Se puede utilizar adicionalmente electroanalisis adicional, tal como impedancia, para definir la estabilidad y el espesor de la pelfcula.

El electrodo que puede obtenerse mediante el metodo de fabricacion de un electrodo de la presente invencion puede utilizarse en un metodo para detectar una especie diana en una tecnica EIS. Este metodo para detectar una especie diana comprende: (a) poner en contacto el electrodo con un medio portador que comprende la especie diana; y (b) detectar la senal electrica. En una realizacion ejemplar, el metodo es para detectar insulina y por lo tanto el medio portador comprende insulina. Sin embargo, el metodo tambien puede aplicarse para la deteccion de la "otra especie diana" descrita en el presente documento.

De forma analoga, la invencion proporciona un espectrometro de impedancia electroqufmica que comprende un electrodo que puede obtenerse mediante el metodo de fabricacion de un electrodo de la presente invencion. Preferiblemente, este espectrometro de impedancia electroqufmica comprende un electrodo que se puede obtener por el metodo de fabricacion de un electrodo de la presente invencion, en el que el metodo comprende cada uno de las etapas (a), (b) y (c) descritas en el presente documento (es decir, que da como resultado un electrodo que comprende moleculas sonda unidas a los polfmeros que estan dispuestos en la superficie plana del sustrato de electrodo). De nuevo, el espectrometro de impedancia electroqufmica es preferiblemente adecuado para detectar insulina (es decir, comprende un electrodo que comprende moleculas sonda capaces de unirse selectivamente a la insulina). Sin embargo, tambien se proporcionan espectrometros de impedancia electroqufmica adecuados para

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detectar "otra especie diana" descrita en el presente documento y que comprenden de este modo un electrodo que comprende moleculas sonda capaces de unirse selectivamente a una especie diana de interes.

Tambien de manera similar, la invencion proporciona el uso de un electrodo que puede obtenerse mediante el metodo de fabricar un electrodo de la presente invencion para detectar una especie diana mediante una tecnica EIS. De nuevo, este uso comprende preferiblemente el uso para detectar la insulina. Sin embargo, el uso tambien puede usarse para detectar "otras especies diana" definidas en el presente documento.

Un aspecto particularmente preferido de la invencion se refiere a un metodo para detectar insulina en una tecnica de espectroscopfa de impedancia electroqufmica en la que:

- la tecnica es una tecnica de espectroscopfa de impedancia electroqufmica no faradica;

- el metodo comprende calcular la concentracion de insulina a partir de la senal electrica, en el que la concentracion de insulina se calcula a partir de un cambio de fase en una senal electrica que se produce tras la union de la insulina a las moleculas sonda. y

- el electrodo se puede obtener por el metodo de fabricacion de un electrodo de la presente invencion,

Los inventores han descubierto que tal metodo da lugar a un metodo excepcionalmente selectivo para detectar la insulina hasta lfmites de deteccion muy bajos (de los ordenes de 1 pM o menores) en muestras biologicas complejas y que es facilmente aplicable a diagnosticos de punto de atencion.

Los metodos y electrodos proporcionados en el presente documento se describen a continuacion con referencia a Ejemplos particulares. La invencion no pretende limitarse a estos Ejemplos particulares.

Ejemplo 1 - Deteccion de insulina por EIS faradica. a traves de analisis de resistencia de transferencia de caraa. en un electrodo modificado con PEG

(Ejemplo Comparativo) Productos qufmicos y reactivos

Se adquirieron insulina humana, suero sangufneo humano, estreptavidina y albumina de suero bovino (BSA) en Sigma Aldrich. Se adquirio el anticuerpo monoclonal anti-insulina (isotipo IgG1 de raton) de Santa Cruz Biotechnology, Inc. Se adquirieron 1 -etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC), N-hidroxisuccinimida (NHS) y dimetilsulfoxido (DMSO) en Sigma Aldrich. Se adquirio tiol que contenIa polietilenglicol (PEG) Hs-Ch-(EG)3- OCH2-COOH en Prochimia Surfaces, Polonia. Se preparo solucion salina tamponada con fosfato (PBS) con Tween- 20 (PBST, 10 mM, pH 7,4) disolviendo tabletas de PBS (Sigma Aldrich) en agua ultrapura con Tween-20 al 0,2% v/v anadido y se filtro usando un filtro de membrana de 0,22 pm. Todos los demas productos qmmicos eran de calidad analftica. Se obtuvo agua ultrapura (18,2 MQ/cm) a partir de un sistema Milli-Q y se utilizo en todas partes.

Aparato

Los experimentos electroqufmicos se realizaron en un potenciostato Autolab 12 equipado con un modulo FRA2 (Metrohm Autolab B.V.). Se utilizo un sistema convencional de tres electrodos con electrodos de trabajo de disco de oro (1,6 mm de diametro, BASi), un contador de alambre de platino y un electrodo de referencia de plata/cloruro de plata (Ag/AgCl, relleno con KCl 1,0 M) (CH Instruments). Todos los potenciales informados son relativos al electrodo de referencia Ag/AgCl.

Preparacion de la superficie del sensor.

Los electrodos de oro se pulieron primero secuencialmente con pulverizador de diamante de 3,0, 1,0 y 0,1 pm (Kemet International Ltd) y luego se lavaron por ultrasonidos en agua (aproximadamente 5 minutos) antes de sumergirse en solucion pirana caliente (H2SO4concentrado: H2O2 al 30%, v/v 3:1. Precaucion: jtratar con cuidado!) durante 15 min. Finalmente, los electrodos se pretrataron electroqufmicamente de acuerdo con un reporte anterior (Xiao Y, Lai RY, Plaxco KW; 2007 Nature protocols 2: 2875-2880), con algo de alteracion. En resumen: se realizaron exploraciones de voltamperometrfa cfclica (CV) en KOH 0,5 M en el intervalo de potencial de -0,35 V a -1,35 V a una velocidad de exploracion de 2 V/s, hasta que las curvas fueron estables. Despues de este tratamiento, se realizaron escaneos en H2SO4 0,5 M en el intervalo de potencial de -0,35 a 1,5 V (4 V/s) hasta que se obtuvo un pico estable marcado de reduccion. La superficie eficaz del electrodo de oro se puede calcular durante este procedimiento (Hoogvliet JC, Dijksma M, Kamp B, van Bennekom WP; 2000 Anal chem 72: 2016-2021). Los electrodos de oro pretratados se secaron en un flujo de gas nitrogeno e inmediatamente se sumergieron en una solucion de HS-C11- (EG)3-OCH2-COOH 50 pM en etanol durante 12 horas a temperatura ambiente. Despues de la formacion de la monocapa, los electrodos se aclararon con etanol, luego con agua y se secaron en un flujo de gas nitrogeno, antes de la incubacion en una solucion que contenfa EDC 0,4 M y NHS 0,1 M para activar los grupos carboxilo terminales (-40 minutos). Los anticuerpos de insulina se inmovilizaron posteriormente sumergiendo el electrodo de oro en una solucion de anticuerpo 1,0 pM (PBST, pH 7,4) durante 10 horas a 4 °C. Con el fin de bloquear los sitios activos en la superficie del electrodo, el electrodo modificado se empapo finalmente en BSA 100 pM durante 6 horas a 4° C, despues se aclaro con PBST antes de analisis.

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Espectroscopia de impedancia electroquimica

Las mediciones de EIS se realizaron con un potenciostato Autolab 12 equipado con un modulo FRA2 usando un sistema de tres electrodos y un intervalo de frecuencias de 0,01 Hz a 10 kHz. La amplitud de la onda sinusoidal aplicada fue de 10 mV con el potencial de corriente continua ajustado en 0,22 V (que es el E0 de la sonda redox utilizada). Todos los analisis se llevaron a cabo en solucion de PBST 10 mM que contenfa Fe(CN)63"/4" 1,0 mM y KCl 0,1 M y se representaron en forma de diagramas planos complejos (graficos de Nyquist) montados posteriormente utilizando un circuito equivalente estandar de Randles.

Funcionamiento del sensor

Para la deteccion de insulina, se incubaron las interfases receptivas preparadas en PBST 10 mM pH 7,4 con Fe(CN)63"/4" 1,0 mM y KCl 0,1 M que contenfa concentraciones especfficas de insulina a temperatura ambiente durante 30 min, y las respuestas de EIS se registraron en la misma solucion. Para evaluar la selectividad de los sensores, se utilizo inicialmente la estreptavidina. Para los ensayos "in situ" en suero (10% v/v con PBST 10 mM, Fe(CN)63"14" 1,0 mM, KCl 0,1 M), los electrodos se incubaron en diferentes concentraciones de PBST con insulina anadida durante 30 min antes del analisis por EIS en la misma solucion. Los ensayos "ex situ" tambien se realizaron en suero adicionado (1-80% v/v con PBST 10 mM, Fe(CN)63'14' 1,0 mM, KCl 0,1 M) por incubacion del electrodo durante 30 min antes de aclarar PBST y analisis por ElS en PBST 10 mM pH 7,4 con Fe(CN)63-/4- 1,0 mM y KCl 0,1 M. Las interfaces de electrodo usadas se regeneraron por inmersion en tampon Gly-HCl 0,2 M a pH 2,0 que contenfa DMSO al 1 % durante 5 min para disociar la insulina unida, antes del aclarado con PBST y la reutilizacion.

Resultados - Fabricacion de biosensores

Las graficas de impedancia de Nyquist incluyen una porcion semicircular a altas frecuencias y una porcion lineal a frecuencias mas bajas correspondientes a los procesos de transferencia de carga limitada y de difusion, respectivamente. El primero puede cuantificarse, a traves del diametro del semicfrculo, como la resistencia de transferencia de carga (Rct) del electrodo modificado, cuando esta montado usando el circuito equivalente estandar de Randles (recuadro en la figura 1) (como se explica, por ejemplo, en (a) Guo XF, Kulkarni A, Doepke A, Halsall HB, Iyer S, Heineman WR; 2012. Anal Chem 84: 241-246 y (b) Vyas RN, Li KY, Wang B; 2010 J Phys Chem B 114: 15818-15824; el contenido de estos documentos se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad).

Se usaron inicialmente analisis EIS faradicos para caracterizar la construccion de las superficies receptivas, observando, predeciblemente, fuertes aumentos en Rct en la formacion de SAM de PEG (<50 Q a -120 kQ) e inmovilizacion de anticuerpos (-200 kQ, figura 1).

Resultados - Deteccion de insulina en tampon

A pesar del peso molecular comparativamente bajo de la protefna diana, se observo que las interfaces preparadas eran sensiblemente sensibles a la insulina en PBSt incluso en el intervalo picomolar bajo (figura 2). Puede ser que esta sensibilidad, al menos parcialmente, sea ayudada por la carga negativa de insulina (el punto isoelectrico de la insulina humana es aproximadamente 5,4) a este pH y la repulsion electrostatica resultante de la sonda redox. Analisis mas detallados revelan una buena correlacion lineal (R2 = 0,994) entre Rct y el valor logarftmico de la concentracion de insulina, un intervalo lineal de 5 pM a 50 nM y un lfmite de deteccion de 1,24 ± 0,01 pM (figura 2). La constante de disociacion interfacial Kd, se calculo que era de 0,11 ± 0,01 nM, un valor en muy buen acuerdo con la determinacion previa de fluorescencia inducida por laser. Las interfaces preparadas presentan una respuesta insignificante (<5% de cambio en la senal de referencia) a estreptavidina o concentraciones de BSA de hasta 100 nM.

Resultados - Deteccion de insulina en suero de sangre

Los ensayos de suero de insulina se evaluaron de dos maneras. En primer lugar, los ensayos "in situ" se llevaron a cabo con un suero enriquecido al 10% en PBST (figura 3). Bajo tales condiciones, las evaluaciones lineales fiables eran posibles en el rango clfnicamente relevante con un lfmite de deteccion de 4,70 ± 0,64 pM. Por extrapolacion de los datos adquiridos a traves de tales analisis, los niveles de insulina presentes en suero nativo (no enriquecidos) podrfan determinarse a 60,1 ± 3,9 pM, dentro del rango normal informado.

Los analisis "ex situ" posteriores se llevaron a cabo con suero sangufneo enriquecido con insulina a una dilucion controlable en PBST (figura 4). Los biosensores se incubaron en estas soluciones y luego se midieron despues de enjuagar con PBST. Los ensayos fueron eficaces y se mantuvieron fuertes en suero sangufneo al 50 %, con una respuesta de interferencia de menos del 3 % de la respuesta de ensayo en solucion tampon pura. La figura 5 muestra la curva de calibracion de ensayo "ex situ" de la deteccion de insulina en suero sangufneo al 50 %. Se obtuvo un intervalo lineal similar al de los ensayos en solucion tampon pura, con un lfmite de deteccion de 4.77 ± 0.99 pM.

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Resultados - Regeneration de biosensores

La regeneracion de biosensores se consiguio mediante inmersion superficial en tampon Gly-HCl 0,2 M que contenfa DMSO al 1 % durante 5 min para disociar el complejo anticuerpo de insulina-antfgeno. Posteriormente, los electrodos pueden reutilizarse en ensayos con un mfnimo perjuicio a la sensibilidad (<4% de desviacion en la sensibilidad a lo largo de 4 evaluaciones y regeneraciones de generaciones repetidas - vease la figura 6).

Ejemplo 2 - Deteccion de insulina por EIS no faradica. a traves de analisis de fases, en un electrodo modificado con polimero de betafna

Productos qufmicos y reactivos

Se adquirieron insulina humana, suero sangufneo humano, estreptavidina y albumina de suero bovino (BSA) en Sigma Aldrich. Se adquirio el anticuerpo monoclonal anti-insulina (isotipo IgG1 de raton) de Santa Cruz Biotechnology, Inc. Se adquirieron 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) en Sigma Aldrich. Se adquirio p-propiolactona en Alfa Aesar. Se adquirieron metacrilato de 2-(dimetilamino) etilo (DMAEM), acetona anhidra, dimetacrilato de etilenglicol (EGDMA) y el fotoiniciador 2-hidroxi-2-metilpropiofenona en Sigma Aldrich.

Se preparo una solucion salina tamponada con fosfato (PBS, 10 mM, pH 7,4) disolviendo tabletas de PBS (Sigma Aldrich) en agua ultrapura y se filtro usando un filtro de membrana de 0,22 pm. Todos los demas productos qmmicos eran de calidad analftica. Se obtuvo agua ultrapura (18,2 MQ/cm) a partir de un sistema Milli-Q y se utilizo en todas partes.

Aparato

Los experimentos electroqufmicos se realizaron en un potenciostato Autolab 12 equipado con un modulo FRA2 (Metrohm Autolab B.V.). Se utilizo un sistema convencional de tres electrodos con electrodos de trabajo de disco de oro (1,6 mm de diametro, BASi), un contador de alambre de platino y un electrodo de referencia de plata/cloruro de plata (Ag/AgCl, relleno con KCl 1,0 M) (CH Instruments). Todos los potenciales informados son relativos al electrodo de referencia Ag/AgCl. La polimerizacion ultravioleta (UV) se realizo con una lampara UV (CAMAG).

Preparation de la superficie del sensor.

El monomero metacrilato de carboxibetafna (CBMA) se sintetizo segun metodos conocidos. En resumen: se anadieron gota a gota 10 ml de p-propiolactona 12 mM en acetona a 50 ml de DMAEM 10 mM en acetona anhidra y la mezcla de reaccion se agito bajo proteccion de nitrogeno a 15 °C durante 5 h. El precipitado blanco se lavo con 50 ml de acetona anhidra y 100 ml de eter anhidro. El producto se seco a presion reducida para obtener el producto monomero CBMA final y el monomero se mantuvo a 2-8 °C antes de la polimerizacion.

Los electrodos de oro se pulieron primero secuencialmente con pulverizador de diamante de 3,0, 1,0 y 0,1 pm y luego se lavaron por ultrasonidos en agua (aproximadamente 5 minutos) antes de sumergirse en solucion pirana recien preparada (H2SO4concentrado: H2O2 al 30%, v/v 3:1. Precaucion: jtratar con cuidado!) durante 15 min. Finalmente, los electrodos se pretrataron electroqufmicamente, exploraciones de voltamperometrfa cfclica (CV) en KOH 0,5 M en el intervalo de potencial de 0,35 V a -1,35 V a una velocidad de exploracion de 2 V/s, hasta que las curvas fueron estables. Despues de este tratamiento, se realizaron escaneos en H2SO4 0,5 M en el intervalo de potencial de -0,35 a 1,5 V (4 V/s) hasta que se obtuvo un pico estable marcado de reduccion.

Los electrodos de oro pretratados se secaron en un flujo de gas nitrogeno e inmediatamente se sumergieron en una solucion de cisteamina 5 mM en etanol durante 12 horas a temperatura ambiente. Despues de la formacion de la monocapa, los electrodos se aclararon con etanol, luego con agua y se secaron en un flujo de gas nitrogeno, antes de la incubacion en una solucion que contenfa EDC 0,4 M, NHS 0,1 M y CBMA 0,5 mM para unir el CBMA a los grupos amina terminales (3 horas). Despues de la union de CBMA, se aplicaron gota a gota 1,0 pl de solucion de fotopolimerizacion (preparada disolviendo 17,2 mg de CBMA, 0,2 mg de EGDMA y 1,17 mg de fotoiniciador en 0,1 ml de agua) sobre la superficie del electrodo de Au y la reaccion de fotopolimerizacion se llevo a cabo a 25 °C durante 30 minutos bajo una luz UV de 254 nm para formar metacrilato de poli(carboxibetafna) (PCBMA). El electrodo modificado con PCBMA se empapo entonces en PBS 10 mM (cambiar el PBS despues de 30 min) durante 12 h para liberar los productos qufmicos sin reaccionar y equilibrar el polimero tipo hidrogel.

Con el fin de unir el anticuerpo de insulina al electrodo modificado con PCBMA, el electrodo se sumergio en primer lugar en una solucion que contenfa EDC 0,4 M y NHS 0,1 M durante 30 minutos para activar los grupos carboxilo terminales y despues lavando con PBS, se inmovilizaron los anticuerpos de insulina sumergiendo el electrodo en una solucion de anticuerpo 1,0 pM (PBS 10 mM, pH 7,4) durante 3 horas a temperatura ambiente. Con el fin de desactivar los grupos terminales no reaccionados, el electrodo modificado se empapo finalmente en BSA 100 pM durante 1 horas a temperatura ambiente, luego se aclaro con PBS y se almaceno en PBS antes de analisis.

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Espectroscopia de impedancia electroquimica

Las mediciones de espectroscopia de impedancia electroquimica (EIS) no faradica se realizaron con un potenciostato Autolab 12 equipado con un modulo FRA2 usando un sistema de tres electrodos y un intervalo de frecuencias de 0,1 Hz a 100 kHz, o 100 Hz si se indica, con el potencial ajustado a 0 V. Todos los analisis se llevaron a cabo en PBS 10 mM pH 7,4, y se representaron en forma de graficos Bode, y la fase registrada a 0,2 Hz se utilizo para el analisis.

Funcionamiento del sensor

Para la deteccion de insulina, se incubaron las interfases receptivas preparadas en PBS 10 mM pH 7,4 que contenfa concentraciones especfficas de insulina a temperatura ambiente durante 30 min, y se registraron respuestas de EIS en PBS puro despues de aclarado a traves de PBS. La figura 7 muestra que los datos de cambio de fase extrafdos de las mediciones de EIS no faradica son capaces de determinar la concentracion de insulina hasta niveles de sub- pM.

Para evaluar la selectividad de los sensores, se ensayaron de forma similar BSA y PBS que contenfan diferentes volumenes de suero humano (1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 50 %, 80 % y 100 %). La figura 8 muestra que no existe sustancialmente ningun efecto de interferencia/ensuciamiento sobre la senal EIS de cambio de fase que se origina en las muestras que no contienen insulina.

Las barras de error en los datos informados representan la desviacion estandar de tres mediciones.

Resumen

El sistema de ensayo del Ejemplo 2, que se basa en un EIS no faradico, analizado a traves de datos de cambio de fase y que utiliza la superficie de electrodo modificada con polfmero descrita en el presente documento, muestra un rendimiento mejorado (por ejemplo, mejor ajuste lineal, mejor lfmite de deteccion y demostracion con medios de soporte de suero al 100 %) en comparacion con el sistema de ensayo del Ejemplo 1.

Ejemplo 3 - Datos adicionales relacionados con la deteccion de insulina por EIS no faradico, a traves de analisis de fases, en un electrodo modificado con polfmero de betafna

Se investigaron algunas propiedades adicionales de los electrodos y metodos de la invencion. Los electrodos se fabricaron, y se realizo EIS, sustancialmente como se describe en el Ejemplo 2.

La estabilidad de la interfase de polfmero de PCBMA zwitterionico quimisorbido (antes del acoplamiento de los anticuerpos anti-insulina) se evaluo mediante EIS. La interfaz mostro una excelente estabilidad durante un mes. En particular, tal como se muestra en la figura 10, se registraron graficos de fase Bode no faradicos del electrodo a diferentes intervalos de tiempo a lo largo de 32 dfas en PBS (10 nM, pH 7,4). Se encontro que la desviacion estandar de la fase registrada a 0,2 Hz era inferior al 0,5 %, indicando una excelente estabilidad interfacial. Observese que el hidrogel y la naturaleza hidrofila extrema de estas pelfculas excluyen cualquier caracterizacion SEM, TEM, espectroscopica, de angulo de contacto o elipsometrica.

La figura 11 muestra tanto el cambio de impedancia como la fase obtenida mediante la realizacion de la presente tecnica de EIS no faradica en PBS 10 mM (pH 7,4), en un intervalo de frecuencias de 0,1-100 KHz, en muestras que contienen diferentes cantidades de insulina (0 PM, 1 pM, 10 pM, 100 pM y 2000 pM). Esto ultimo, que es independiente del area de superficie del electrodo, se controlo por metodos de impedancia estandar. Ya se puede ver en esta figura que la sensibilidad a los cambios en la concentracion de insulina es mucho mayor cuando se evalua el cambio de fase en lugar de la impedancia, particularmente en la region de baja frecuencia. La figura 12 compara ademas (A) las curvas de cambio de fase con las curvas de impedancia (B) en frecuencias seleccionadas. La figura 13 muestra con mas detalle todavfa los cambios de fase limpios registrados en el dominio de baja frecuencia y demuestra como la frecuencia de muestreo se puede optimizar facilmente a la respuesta mas sensible a la insulina (aquf 0,2 Hz, que corresponde a un valor log {frecuencia} 0,7 en el eje x de la figura). Observese que la fluctuacion en el centro de las curvas es meramente un artefacto potenciostatico y no tiene impacto sobre la validez de las mediciones.

Para confirmar la aplicabilidad del metodo a la deteccion cuantitativa en suero sangufneo puro, se realizaron ensayos de insulina enriquecida en diferentes soluciones de suero y se revelo que la cuantificacion estaba consistentemente dentro del 2 % de la de PBS puro (vease la figura 14).

La aplicacion de las interfaces para la cuantificacion de la insulina en una cohorte de muestras de pacientes (abarcando un amplio intervalo de concentraciones) se resume en la figura 15, donde es evidente que los ensayos se comportan bien y se comparan bien (estando la mayor parte de los resultados dentro del 5 % uno de otro) con cuantificacion comparativa de las mismas muestras mediante un ensayo de quimioluminiscencia estandar. En la figura 16 se muestra un analisis mas detallado de Bland Altman a traves de muestras de pacientes evaluadas tanto

en macro electrodos de oro como en matrices de microelectrodos, donde las diferencias de cuantificacion entre EIS y quimioluminiscencia estan en gran medida dentro del 10 % a lo largo de todo el intervalo de concentracion. Esto es muy alentador ya que los niveles actuales del acuerdo entre los metodos comunmente utilizados en el uso clfnico pueden mostrar una variacion del 200 % en los resultados a traves de diferencias en la sensibilidad y especificidad 5 del ensayo.

El trabajo que conduce a esta invencion ha recibido financiacion del Septimo Acuerdo Marco de la Union Europea (FP7/2007-2013) con el acuerdo de subvencion n.° 271775.

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   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo para fabricar un electrodo para su uso en una tecnica de espectroscopfa de impedancia electroqufmica, metodo que comprende:

   (a) unir monomeros de betafna fotopolimerizables a la superficie plana de un sustrato, obteniendo de este modo una superficie modificada que tiene una capa de monomeros de betafna fotopolimerizables dispuestos sobre la misma; despues

   (b) poner en contacto dicha superficie modificada con monomeros de betafna fotopolimerizables adicionales, y opcionalmente reticular monomeros, y polimerizar fotoqufmicamente los monomeros, generando de ese modo un electrodo que comprende polfmeros dispuestos sobre dicha superficie plana;

   en el que la fijacion de la capa de monomeros de betafna fotopolimerizables en la etapa (a) esta sustancialmente completa antes de que la superficie modificada entre en contacto con otros monomeros de betafna fotopolimerizables, y opcionalmente reticular monomeros, y la polimerizacion fotoqufmica se lleva a cabo en la etapa (b).
2. 2. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que los monomeros de betafna fotopolimerizables comprenden cada uno un doble enlace carbono-carbono fotopolimerizable.
3. 3. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en el que los monomeros de betafna fotopolimerizables comprenden cada uno un cation de amonio cuaternario y un grupo carboxilato.
4. 4. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 3, en el que los monomeros de betafna fotopolimerizables tienen la formula (II)

   imagen1

   en la que:

   R1 y R3 son iguales o diferentes y cada uno es un grupo alquileno C1 a C5;

   R2 y R2' son iguales o diferentes y cada uno es un grupo alquilo C1 a C5;

   R4 es un atomo de hidrogeno o un grupo alquilo C1 a C5; y X es O o NH.
5. 5. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 4, en el que los monomeros de betafna fotopolimerizables se seleccionan entre metacrilato de carboxibetafna (CBMA), carboxibetafna acrilamina (CBAA) y etilacrilato de carboxibetafna (CBEA).
6. 6. Un metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende ademas (c) unir moleculas sonda aptas para union especffica a una especie diana a dichos polfmeros.
7. 7. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 6, en el que la especie diana es insulina.
8. 8. Un electrodo que se puede obtener mediante el metodo definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. 9. Un metodo para detectar una especie diana en una tecnica de espectroscopfa de impedancia electroqufmica, comprendiendo el metodo: (a) poner en contacto un electrodo como se define en la reivindicacion 8 con un medio portador que comprende dicha especie diana; y (b) detectar una senal electrica.
10. 10. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 9, que es un metodo para detectar insulina en una tecnica de espectroscopfa de impedancia electroqufmica no faradica, comprendiendo el metodo:

    (a) poner en contacto un electrodo que puede obtenerse mediante un metodo segun la reivindicacion 7, con un medio portador que comprende insulina;

    (b) detectar una senal electrica; y y

    (c) calcular la concentracion de insulina de la senal electrica,

    en el que la concentracion de insulina se calcula a partir de un cambio de fase en una senal electrica que se produce tras la union de la insulina a las moleculas sonda.
11. 11. Un espectrometro de impedancia electroqufmica que comprende un electrodo como se define en la reivindicacion 8.
12. 12. Uso de un electrodo segun la reivindicacion 8 para detectar una especie diana mediante una tecnica de 5 espectroscopfa de impedancia electroqufmica.