ES2634155T3 - Composición inmunomoduladora - Google Patents

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ES2634155T3
ES2634155T3 ES08840894.3T ES08840894T ES2634155T3 ES 2634155 T3 ES2634155 T3 ES 2634155T3 ES 08840894 T ES08840894 T ES 08840894T ES 2634155 T3 ES2634155 T3 ES 2634155T3
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Susan Marie Metcalfe
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Abstract

Una composición para promover una respuesta de tolerancia inmunitaria en un mamífero, la composición comprende: a) una solución portadora farmacéuticamente aceptable; y b) una pluralidad de nanopartículas biodegradables, en donde las nanopartículas comprenden una capa de polímero biodegradable, en donde las nanopartículas comprenden una porción de direccionamiento que es capaz de unirse selectivamente a la superficie de una célula de linfocito T y/o de una célula endotelial vascular, en donde la porción de direccionamiento se selecciona de un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal o un fragmento de anticuerpo de unión al antígeno; y en donde las nanopartículas comprenden además un factor inhibidor de la leucemia (LIF).

Description

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DESCRIPCION
Composicion inmunomoduladora Campo de la invencion
La invencion pertenece al campo de las composiciones para modular y controlar la respuesta inmune en un animal, tal como un ser humano como se define en las reivindicaciones. En particular, la invencion se refiere a una composicion para promover una respuesta de tolerancia inmune en un mamlfero, la composicion comprende: a) una solucion portadora farmaceuticamente aceptable; y b) una pluralidad de nanopartlculas biodegradables, en donde las nanopartlculas comprenden una capa de pollmero biodegradable y donde las nanopartlculas comprenden una porcion de direccionamiento que es capaz de unirse selectivamente a la superficie de una celula de linfocito T y/o a una celula endotelial vascular, en donde la porcion de direccionamiento se selecciona de un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal o un fragmento de anticuerpo de union al antlgeno; y en donde las nanopartlculas comprenden ademas un factor inhibidor de la leucemia (LIF). Ademas se refiere a metodos para controlar la respuesta inmune en un animal o en tejidos y celulas derivadas de un animal y que se usan en el trasplante de celulas y tejidos.
Antecedentes
Las enfermedades inmunomediadas surgen cuando ocurren errores dentro del sistema inmunologico. Normalmente, la respuesta inmune tiene el potencial de destruir antlgenos extranos mientras que al mismo tiempo protege contra el ataque autoinmune. Esta capacidad exquisita para discriminar entre lo "propio" y lo "no propio" es orquestada por los linfocitos T: estas celulas aseguran que la actividad agresiva destructiva solo mate dianas extranjeras mientras que la respuesta inmune al huesped ("propio") es activamente protectora y tolerante.
Los linfocitos T dominantes tolerantes a antlgenos especlficos incluyen celulas T reguladoras (TReg), que desempenan un papel importante en la moderation de la respuesta inmune en un organismo para mantener la autotolerancia. Las celulas que conforman el fenotipo de la TReg son un grupo de linfocitos T especializados que expresan marcadores de superficie celular incluyendo CD4, CD25, CTLA-4 y GITR. Las celulas TReg expresan el factor de transcription Foxp3. Foxp3 funciona como un represor transcripcional necesario para el desarrollo de linfocitos en el linaje de TReg y la perdida de la funcion Foxp3 tlpicamente resulta en la muerte temprana en los seres humanos debido a la abrumadora enfermedad autoinmune conocida como IPEX (slndrome de inmunodesregulacion poliendocrinopatla enteropatla ligada a X). Las celulas TReg se derivan predominantemente del timo, donde se desarrollan bajo un riguroso proceso de selection para asegurar su reactividad autotolerante antes de su liberation en una circulation mas amplia. Las celulas TReg circulantes contribuyen a la regulation negativa de las respuestas inmunes agresivas del cuerpo contra patogenos extranjeros. Las celulas TReg tambien dominan y suprimen cualquier respuesta inmune agresiva que de otra manera podrla conducir al ataque de los propios tejidos del cuerpo (es decir, autotolerancia).
La enfermedad puede ocurrir cuando las celulas TReg autotolerantes se debilitan, permitiendo de este modo a las celulas agresivas avanzar. En algunos individuos se desarrollaran enfermedades autoinmunes paralizantes. Se cree que tal actividad inmune inapropiada subyace a un gran numero de enfermedades que carecen de terapia curativa incluyendo artritis reumatoide, diabetes mellitus tipo I, lupus eritematoso sistemico (SLE), psoriasis y enfermedad de Crohn por nombrar algunos.
La tolerancia inmunologica es tambien de crucial importancia en el campo del trasplante de organos. Existe una escasez crltica de organos donantes y es de primordial preocupacion que se realice la tipificacion tisular apropiada en el tejido donante y en el receptor antes del trasplante. A pesar de una aparentemente buena compatibilidad entre un huesped receptor y un donante, el sistema inmunologico del receptor reconocera naturalmente el tejido aloinjertado como "extranjero" y si no se controla rechazara el trasplante. Consecuentemente, los receptores de organos donados deben permanecer en terapia inmunosupresora durante el resto de sus vidas despues del trasplante. Incluso entonces, los receptores estan sujetos a un rechazo cronico progresivo dentro de los vasos sangulneos del organo trasplantado debido a un proceso insidioso que no es controlado por los farmacos inmunosupresores actuales: tal rechazo vascular cronico finalmente bloquea el flujo sangulneo dentro del organo trasplantado causando fallo organico. Sin un nuevo trasplante de organos - poco probable dada la escasez de organos - o la dialisis en el caso de los receptores de injerto renal, el paciente morirla.
En 2004 alrededor de 15,000 procedimientos de trasplante de rinon se llevaron a cabo solo en los Estados Unidos, con una tasa de supervivencia al injerto de un ano de alrededor del 90 % (datos de OPTN/SRTR a partir del 1 de mayo de 2006). Sin embargo, en la fecha de presentation de esta solicitud mas de 70,000 personas estaban en la lista de espera para un trasplante de rinon en losEstados Unidos, lo que demuestra claramente que la demanda supera la oferta muchas veces. Para otros organos disminuye la tasa de supervivencia del injerto, por ejemplo, la tasa de supervivencia de un ano para los trasplantes de hlgado fue de alrededor del 83 % y la demanda tambien es mayor que el suministro disponible de material donante. Aparentemente las altas tasas de supervivencia del injerto a menudo desmienten el hecho de que frecuentemente el trasplante solo esta disponible para individuos con un caso cllnico muy favorable. Los pacientes que son considerados como los candidatos mas pobres para el trasplante desafortunadamente rara vez se convertiran en receptores de tejidos de donantes tan necesarios.
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Existe una necesidad de mejorar el control de la respuesta inmunitaria para promover la tolerancia del huesped al tejido aloinjertado de manera que se incrementa la aceptacion del huesped al material trasplantado. Ademas, la modulacion de la respuesta inmunitaria en el receptor de manera que promueva el reconocimiento del tejido trasplantado extrano como "propio" puede servir tambien para reducir la dependencia del tratamiento inmunosupresor durante toda la vida. Ademas, los tratamientos inmunomoduladores mejorados tambien pueden afectar la capacidad de compatibilizar el tejido donante con los receptores que necesitan un trasplante, expandiendo los parametros para la adaptacion del tipo de tejido - es decir, expandiendo los parametros de tolerancia para la incompatibilidad entre el tipo de tejido del huesped y el del huesped donante. Esto es de importancia primordial para los pacientes con tipos de tejido raro, como los de las minorlas etnicas particulares.
La presente invencion pretende superar o al menos reducir los problemas que existen proporcionando composiciones y metodos para la modulacion dirigida de la respuesta inmune y promoviendo la proliferacion y la actividad de celulas TReg que suprimiran la respuesta anti donante y/o el proceso de rechazo vascular cronico. No solo el modo de suministro dirigido aporta inmunomoduladores al sitio donde se necesitan, por ejemplo dentro del trasplante de organos, sino que tambien reduce la exposicion general del paciente a componentes bioactivos que pueden llevar a efectos secundarios toxicos a sitios irrelevantes.
Resumen
Las materias en cuestion que no estan comprendidas en el alcance de las reivindicaciones no forman parte de la presente invencion reivindicada. La invencion proporciona una terapia dirigida especlficamente al sitio de actividad inmune que esta asociado con el estado de enfermedad. La invencion tambien explota un nuevo enfoque molecular para reducir la actividad inmune agresiva aprovechando el propio mecanismo de proteccion del cuerpo. El beneficio cllnico es considerable tanto para pacientes con enfermedad autoinmune como para receptores de injertos de organos.
Un primer aspecto de la invencion proporciona una composicion para promover una respuesta de tolerancia inmune en un mamlfero, la composicion comprende: a) una solucion portadora farmaceuticamente aceptable; y b) una pluralidad de nanopartlculas biodegradables, en donde las nanopartlculas comprenden una capa de pollmero biodegradable y en donde las nanopartlculas comprenden una porcion de direccionamiento que es capaz de unirse selectivamente a la superficie de una celula de linfocito T y/o a una celula endotelial vascular, en donde la porcion de direccionamiento se selecciona de un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal o un fragmento de anticuerpo de union al antlgeno; y en donde las nanopartlculas comprenden ademas un factor inhibidor de la leucemia (LIF).
Un segundo aspecto de la invencion proporciona un metodo in vitro o ex vivo para inducir que una celula de linfocitos T adopte un fenotipo de TReg que comprende exponer el linfocito T a una pluralidad de nanopartlculas biodegradables, en donde las nanopartlculas comprenden una porcion de direccionamiento que es capaz de unirse selectivamente a la superficie de una celula de linfocito T y/o a una celula endotelial vascular y en donde las nanopartlculas comprenden ademas un factor inhibidor de la leucemia (LIF).
Un tercer aspecto de la invencion proporciona una nanopartlcula biodegradable que comprende un material de soporte biodegradable que encapsula un compuesto terapeutico, un compuesto terapeutico y una porcion de direccionamiento localizada en la superficie, caracterizado porque el compuesto terapeutico es LIF y la porcion de direccionamiento situada en la superficie es un anticuerpo, o un fragmento de union a antlgeno de un anticuerpo, que se une especlficamente a un antlgeno presente en la superficie celular de un linfocito T y/o de una celula endotelial vascular.
Un cuarto aspecto de la invencion proporciona el uso de una preparacion que comprende una pluralidad de nanopartlculas biodegradables, en donde las nanopartlculas comprenden una porcion de direccionamiento que es capaz de unirse selectivamente a la superficie de una celula de linfocito T y/o de una celula endotelial vascular y en donde las nanopartlculas comprenden ademas un factor inhibidor de leucemia (LIF), en la fabricacion de una composicion para moderar la respuesta inmune en un paciente. Otros aspectos de la invencion proporcionan usos para el tratamiento de enfermedades autoinmunes y enfermedades de injerto contra huesped.
Un aspecto adicional de la invencion proporciona un metodo para promover una respuesta de tolerancia inmune en un paciente que comprende administrar al paciente una cantidad terapeuticamente eficaz de una composicion que comprende una pluralidad de nanopartlculas biodegradables, en donde las nanopartlculas comprenden una porcion de direccionamiento que es capaz de unirse selectivamente a la superficie de una celula de linfocito T y/o de una celula endotelial vascular y en donde las nanopartlculas comprenden ademas un factor inhibidor de leucemia (LIF).
Un aspecto adicional de la invencion proporciona un metodo para almacenar tejido de mamlfero destinado a aloinjertarse en un receptor que comprende perfundir el tejido con una solucion que comprende una pluralidad de nanopartlculas biodegradables, en donde las nanopartlculas comprenden una porcion de direccionamiento que es capaz de unirse selectivamente a la superficie de una celula de linfocito T y/o de una celula endotelial vascular y en donde las nanopartlculas comprenden ademas un factor inhibidor de leucemia (LIF).
Estos y otros aspectos y modalidades de la invencion resultaran evidentes a partir de la descripcion detallada de las realizaciones preferidas de la presente invencion mas abajo.
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Dibujos
La Figura 1 muestra una vista esquematica de seccion transversal de un linfocito T ilustrativo o de una nanopartlcuia dirigida a una celula endotelial vascular de la invencion.
La Figura 2 (a) muestra los resultados de un experimento en formato de histograma en el que los linfocitos T procedentes de ratones mutantes nulos de axotropina se tratan con LIF y despues se ensayan para la liberacion de la citoquina proinflamatoria interferon gamma (LIF se muestra en negro, el control se muestra en sombreado). (b) la liberacion de interferon gamma es muy alta en el rechazo y es parcialmente inhibida por el LIF. La liberacion de interferon gamma en el sobrenadante de cultivos cebados rechazados aumento con el tiempo, alcanzando 16 ng/ml a los 5 dlas despues del reestlmulo con antlgeno donante; la presencia de LIF recombinante suprimio esta liberacion de interferon gamma alrededor de 50 %. En tolerancia, el interferon gamma nunca excedio 200 pmol, con o sin LIF.
La Figura 3 muestra los resultados de un experimento en el que se activaron celulas de bazo de raton geneticamente normales por ligacion de CD3/CD28 en presencia o ausencia de LIF exogeno.
La Figura 4 muestra los resultados de un experimento en formato de histograma en el que las celulas de bazo cebadas de ratones alotolerantes estimulados con antlgeno donante (barras negras) en vivo muestran niveles incrementados de protelna LIF y niveles disminuidos de protelna IL6 cuando se comparan con celulas de bazo cebadas de ratones alorechazados estimulados con antlgeno donante (barras blancas) en vivo, lo que indica que la protelna LIF esta vinculado a la alotolerancia y la protelna IL6 esta vinculado a alorechazo.
Descripcion detallada
La invencion proporciona una liberacion dirigida mediada por nanopartlculas del LIF (factor inhibidor de la leucemia) como un nuevo medio para guiar la tolerogenesis en un paciente. Los inventores demostraron previamente que el LIF es un regulador clave de la respuesta inmune en la que los linfocitos TReg garantizan colectivamente una tolerancia protectora hacia los tejidos propios mientras que simultaneamente permiten un ataque agresivo contra patogenos extranos. Sin estar ligado a la teorla, se cree que el papel del LIF en este equilibrio crltico esta ligado a las celulas TReg y actua de manera concertada con Foxp3. La actividad del LIF sostenida es una caracterlstica intrlnseca de celulas TReg, apoyando la nocion de que LIF proporciona una senal para el desarrollo de TReg y el mantenimiento de TReg. La presente invencion usa nanopartlculas cargadas con LIF que estan dirigidas especlficamente a los linfocitos T para guiar a las celulas T vlrgenes a convertirse en celulas TReg antlgeno especlfico mediante la exposicion a altas concentraciones locales de actividad LIF. Una ventaja de este enfoque es que tiene aplicacion cllnica inmediata para receptores de injertos de organos y tambien para pacientes que sufren de enfermedad autoinmune.
De acuerdo con la presente invencion se considera que la modulacion de la tolerancia inmune abarca una supresion del nivel basal inherente de un organismo de la funcion inmune. Tlpicamente, el organismo es un animal, mas tlpicamente un mamlfero o un ser humano. El nivel basal se toma como el nivel de reactividad inmune en el organismo antes del tratamiento con una composicion de la invencion. En un individuo sano normal, tal como un paciente humano, el nivel inmunologico serla equivalente al de un nivel de estado estacionario no desafiado. Aunque en un paciente que sufre de un trastorno autoinmune la respuesta inmune basal serla elevada en comparacion con un paciente sano normal. Del mismo modo, en un paciente que ha recibido recientemente tejido aloinjertado, se esperarla ver un nivel basal elevado de actividad inmune en ausencia de terapia inmunosupresora tal como ciclosporina. La actividad inmune elevada puede ser identificada por un aumento relativo de los globulos blancos asesinos agresivos tales como neutrofilos, macrofagos y celulas T citotoxicas, as! como niveles elevados de citoquinas tales como IL-2, IL-6, IL-13, IL- 17, IL-23 y mediadores inflamatorios incluyendo interferon gamma, TNFa e IL1 p.
LIF es un miembro de la familia de citoquinas IL-6. Es un factor de senalizacion secretado que se une a y senaliza a traves de un receptor de superficie celular gp190 especlfico de LIF que interactua con el receptor de transduccion de senal gp130. La propagacion de la senal intracelular aguas abajo se produce a traves de la ruta JAK/STAT, especialmente a traves del factor de transcripcion STAT-3. La actividad de senalizacion LIF es terminada por SOCS3, SOCS3 que es inducido en un mecanismo de bucle de realimentacion. Los presentes inventores han identificado previamente que el tratamiento ex vivo de celulas de bazo murino con LIF aumenta la transcripcion de Foxp3. Ademas, en contraste con un mutante FOXP3 que es incapaz de unirse al ADN y funcionar como un represor transcripcional - FOXP3 de tipo silvestre inhibe fuertemente SOCS-3 (supresor 3 de senalizacion de citoquinas) (Muthukumarana y otros 2007). Dado que SOCS-3 es un inhibidor de retroalimentacion de la senalizacion del LIF, su represion por FOXP3 de tipo silvestre en las celulas TReg tendra un efecto positivo en la actividad del LIF. Se conoce, ademas, que en las celulas TReg la actividad de senalizacion del LIF esta ligada a la actividad de la ligasa E3 MARCH VII (axotropina) que a su vez regula la actividad de Foxp3. Se preve un casete regulador jerarquico entre LIF, Foxp3 y axotropina. Dado que Foxp3 es considerado como uno de los marcadores arquetlpicos del fenotipo de la TReg, la regulacion de la actividad LIF en las celulas TReg y en las celulas TReg precursoras pueden tener un efecto profundo sobre la respuesta inmune tolerogenica en un animal.
Las propiedades pleiotroficas del LIF son amplias e incluyen el sistema cardiovascular. La sobreexpresion dirigida del LIF en miocardio infartado previene la perdida miocardica y mejora la funcion cardlaca post infarto en ratas (Berry MF y
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otros. J Thorac Cardiovasc Surg. 2004 dic; 128 (6): 866-75). LIF tambien muestra una capacidad multifacetica para el tratamiento de la enfermedad vascular oclusiva, en particular en las primeras etapas de la formacion de placa aterosclerotica (Moran CS y otros. Arterioscler Thromb. 1994 agosto; 14 (8): 1356 - 63;World CJ y otros. Ann NY Acad Sci. 2001 dic.; 947: 323-8) y la terapia genica con LIF ha demostrado ser beneficiosa para la supervivencia de aloinjertos de piel en ratones (Akita S. y otros. Trasplante. 2000 oct. 15; 70 (7): 1026-31).
En una modalidad, la presente invencion proporciona composiciones que comprenden el LIF que pueden ser dirigidas a una ubicacion en una celula, dentro de un tejido o dentro del cuerpo de un paciente o animal. Por ejemplo, las composiciones de la invencion pueden comprender LIF biodisponible que se dirige a celulas que expresan el receptor de superficie celular CD4 (celulas CD4 +) y, de este modo, incrementan la exposicion localizada a LIF para estas celulas. En otra modalidad de la invencion, el LIF puede dirigirse a celulas que expresan un biomarcador de superficie celular que es caracterlstico o se asocia con pluripotencia, tal como el antlgeno 1 especifico en etapa embrionaria (SSEA-1). Otras moleculas expresadas en la superficie celular que podrlan ser objeto de las composiciones de la invencion incluyen el receptor de VEGF, EPCR, CD34 y/o CD31 expresado en celulas endoteliales vasculares para generar un microambiente tolerogenico dentro de un organo o tejido.
De acuerdo con la invencion, las celulas T que no estan conectadas pueden desviarse por el trayecto hasta convertirse en TReg(autotolerante) mediante la exposicion a la senalizacion del LIF. El LIF no se puede administrar de forma sistemica debido a su citotoxicidad y corta vida media in vivo. La presente invencion proporciona un enfoque dirigido al suministro del LIF, que proporciona las ventajas duales de aumentar la concentracion local del LIF en el punto de necesidad (es decir, en la superficie celular de la celula T sensible al antlgeno) y de reducir la concentracion global del LIF que se necesita para obtener el efecto terapeutico deseado. En una modalidad especlfica de la invencion, las nanopartlculas que contienen LIF se dirigen a linfocitos T, particularmente a marcadores especlficos de linfocitos T situados en la superficie celular. Alternativamente, las nanopartlculas que contienen el LIF se dirigen a celulas endoteliales vasculares. El direccionamiento al marcador de superficie celular especificado se consigue tlpicamente situando una porcion de direccionamiento, tal como anticuerpos, en la superficie de la nanopartlcula. Las nanopartlculas basadas en pollmeros que comprenden porciones de direccionamiento de anticuerpos se describen enWO-A- 2006/080951, nanopartlculas liposomicas que comprenden porciones de direccionamiento de anticuerpos se describen enWO-A-2005/051305.
Como se usa en la presente descripcion, el termino anticuerpo denota una protelna que se produce en respuesta a un antlgeno que es capaz de combinarse y unirse al antlgeno, preferentemente en un sitio especifico del antlgeno, conocido como epitopo. El termino como se usa en la presente descripcion incluye anticuerpos de origen policlonal y monoclonal, a menos que se indique lo contrario. Los anticuerpos policlonales son un grupo de anticuerpos producidos por diferentes linfocitos B en respuesta al mismo antlgeno; diferentes anticuerpos en el grupo tipicamente reconocen diferentes partes (epitopos) sobre el antlgeno. Un anticuerpo monoclonal reconoce solo un tipo de antlgeno y es producido por las celulas hijas de un solo linfocito productor de anticuerpos, tipicamente un hibridoma. Tambien se incluyen dentro del termino anticuerpo fragmentos de union a antigenos de anticuerpos naturales o no naturales, por ejemplo, el "fragmento Fab", el "fragmento Fab' " (un Fab con una region de bisagra de cadena pesada) y el "fragmento F(ab')2" (un dimero de fragmentos Fab' unidos por una region de bisagra de cadena pesada). Se han usado metodos recombinantes para generar pequenos fragmentos de union al antlgeno, tales como "Fv de cadena sencilla" (fragmento variable) o "scFv", que consiste en una cadena ligera de region variable y cadena pesada de region variable unidas por un enlazador peptidico sintetico. A diferencia de los anticuerpos derivados de otros mamiferos, las especies de camelidos expresan anticuerpos altamente funcionales y altamente especificos que carecen de secuencias de cadena ligera. Los anticuerpos de cadena pesada de camelidos son de uso particular, ya que se encuentran como homodimeros de una unica cadena pesada, dimerizados a traves de sus regiones constantes. Los dominios variables de anticuerpos de cadenas pesadas de camelidos se denominan dominios VHH y retienen la capacidad, cuando se aislan como pequenos fragmentos de la cadena VH, de unirse al antlgeno con alta especificidad (Hamers-Casterman y otros, 1993, Nature 363: 446-448; Gahroudi y otros, 1997, FEBS Lett. 414: 521-526). Tambien se incluyen en el termino anticuerpo los denominados mutantes camelizados de los dominios VH humanos que retienen la actividad de union al antigeno pero exhiben algunas de las ventajas de los dominios VHH del camelido (Riechmann, 1994, FEBS Lett. 339: 285-290). Ademas de los fragmentos de union al antigeno, los anticuerpos de la presente invencion pueden incluir derivados de anticuerpos, tales como fusiones quimericas con restos marcadores que incluyen la proteina verde fluorescente (GFP).
Pueden usarse porciones diana alternativas que no son anticuerpos para dirigir las nanopartlculas de la invencion a las celulas de eleccion. Por ejemplo, se pueden usar marcadores de afinidad tales como estreptavidina para dirigirse a un objetivo biotinilado. Otros marcadores de afinidad adecuados seran conocidos en la tecnica y pueden incluir ligandos anclados para un receptor de superficie celular conocido por expresarse especificamente en la celula diana.
En una modalidad de la invencion la composicion comprende una nanopartlcula basada en polimero biodegradable que comprende un polipeptido LIF encapsulado, cuya nanopartlcula comprende ademas un anticuerpo expuesto a la superficie que se une especificamente, por ejemplo, al receptor CD4. Adecuadamente, el polimero es un polimero de polilactida-co-glicolida (PLG). Las nanopartlculas de la invencion se resuspenden en una solucion biocompatible, tal como solucion salina tamponada con fosfato y pueden usarse in vivo (por ejemplo, por administracion parenteral), in vitro o ex vivo con el fin de modular la respuesta inmune. Los usos ex vivo pueden incluir pretratamiento del tejido
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donante destinado al aloinjerto con las composiciones de la invencion poco antes del implante, mejorando de este modo las posibilidades de aceptacion del tejido aloinjertado por el receptor. En esta ultima modalidad de la invencion, las nanopartlculas pueden comprender una porcion de direccionamiento alternativa ademas de o en lugar del anticuerpo de union a CD4, por ejemplo un anticuerpo que se dirige a las celulas endoteliales presentes dentro del tejido de aloinjerto. De esta manera, el LIF puede liberarse de forma controlable desde dentro del tejido aloinjertado en el perlodo inmediatamente despues del trasplante, facilitando de este modo la reaccion de tolerancia inmunitaria en el receptor.
Las composiciones de la invencion son adecuadas para el tratamiento de trastornos autoinmunes. La administracion parenteral o subcutanea local de las composiciones que comprenden nanopartlculas de la invencion en o alrededor de una articulacion inflamada puede ayudar a mejorar los slntomas de la artritis reumatoide. Ademas, la administracion topica de una composition de nanopartlculas apropiada (es decir, como una locion o crema para la piel) puede ser eficaz en el tratamiento de la psoriasis. Finalmente, las nanopartlculas pueden incorporarse en una formulation de deposito de liberation temporal para uso a largo plazo, adecuada para el tratamiento de encefalopatlas autoinmunes y esclerosis multiple.
Las composiciones de la invencion son utiles para el control de la respuesta inmune in vivo, ex vivo o in vitro. En una modalidad especlfica de la invencion, los tejidos y organos destinados al trasplante (por ejemplo, injertos de corazon, rinon, hueso y vasos sangulneos) pueden pretratarse con las composiciones de la invencion antes de su implantation en el receptor. El tejido de aloinjerto celular, tal como medula osea o celulas madre, tambien puede tratarse in vitro o ex vivo, antes de su introduction en el receptor. Como tal, las composiciones de la invencion proporcionan una tecnologla facilitadora para la expansion de una variedad de terapias de medicina regenerativa.
En una modalidad particular, las nanopartlculas de la invencion estan comprendidas dentro de la solution de perfusion que se usa para la conservation de organos y tejidos durante el trasplante de organos donantes. De esta manera, el LIF comprendido dentro de las nanopartlculas tiene un doble proposito de mantener la proliferation de celulas madre endogenas dentro del tejido de trasplante, as! como favorecer la tolerancia inmune en el receptor despues de que el procedimiento de trasplante se ha completado.
Ejemplo 1
Los modelos experimentales en ratones han identificado un sistema regulador crltico en linfocitos T en el queFoxp3 - el gen maestro para la tolerancia reguladora - esta regulado en si mismo por la axotropina/MARCH-7 (una E3-ligasa) y LIF. No solo la axotropina/MARCH-7 regula directamente la liberacion de LIF por los linfocitos T, sino que tambien se requiere axotropina/MARCH-7 y LIF para la actividad normal del gen Foxp3.
En humanos, Foxp3 y axotropina/MARCH-7 se coexpresan en celulas sangulneas perifericas. En pacientes que han recibido un trasplante de medula osea y tambien en pacientes que han recibido un trasplante de rinon, la expresion de Foxp3 y axotropina/MARCH-7 se correlacionan positivamente con una buena funcion de injerto (Muthukumaranay otros2007). Estos hallazgos deducen que la relation entre tolerancia inmunitaria, axotrofina/MARCH-7 y - por extrapolation - LIF es valida en pacientes cllnicos y apoya la presente invencion que adopta un nuevo enfoque terapeutico tolerogenico de suministro de LIF dirigido al sitio de actividad inmune.
Reciprocidad entre Foxp3 y LIF
Tabla 1: SOCS-3: magnitud del cambio de 0h a 24h despues de la induction de Foxp3 en celulas T humanas
transcrito
FOXP3 tipo silvestre DE251 FOXP3
SOCS-3
12.00 345.00
LIF
64.00 0.02
FOXP3*
9.00 10.00
*equivalente de ambos transcrito y protefna
Administracion selectiva de farmacos usando nanopartlculas
Las nanopartlculas polimericas biodegradables que combinan alta carga de farmacos con direccionamiento a tipos especlficos de celulas han sido desarrolladas por la Universidad de Yale (verWO-A-2006/080951; y Fahmy y otros 2005). Las nanopartlculas cargadas con LIF se prepararon de acuerdo con este protocolo: estas se recubrieron con avidina para permitir la adicion de anticuerpo biotinilado. Los presentes inventores ampliaron el uso de este recurso terapeutico para controlar la respuesta inmunitaria para receptores de trasplante y para pacientes con enfermedad autoinmune.
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De acuerdo con la presente invencion, se considera que el LIF es un regulador no reconocido previamente de la tolerancia inmune y funciona de acuerdo con Foxp3. En consecuencia, se propone que el tratamiento con LIF dirigido a linfocitos CD4+ guiara a las celulas T vlrgenes hacia el fenotipo tolerante (TReg).
Diseno experimental:
Basado en datos cllnicos, experimentales y moleculares, este ejemplo prueba un nuevo abordaje terapeutico que combina dos estrategias, a saber: (i) entrega dirigida y (ii) aprovechamiento de rutasreguladoras naturales.
La liberacion de interferon gamma se reduce en las celulas inmunitarias expuestas al tratamiento con LIF
La liberacion de interferon gamma esta fuertemente correlacionada con el rechazo ex vivo, mientras que los autocontroles revelan bajos niveles de interferon gamma. Cuando se estimula por un antlgeno de terceros (C57B16), los cultivos tolerantes y rechazados de celulas de bazo CBA de un modelo de raton BALB/c tolerante o de rechazo, liberan cada uno niveles altos de interferon gamma pero con una cinetica de liberacion mas lenta en comparacion con cultivos cebados, demostrando la especificidad del estado ex vivo alotolerante donde el interferon gamma es bajo. Cuando los cultivos de celulas libres de suero de estas celulas se tratan con el LIF, la liberacion de interferon gamma en el rechazo cebado se reduce notablemente, reduciendose a la mitad a partir de los valores de control de alrededor de 9 ng/ml a alrededor de 4 ng/ml (Figura 2 (b)). En las celulas tolerantes cebadas, los niveles de interferon gamma son muy bajos y en gran medida no responden a la adicion de LIF exogeno. La concentracion de interferon gamma liberado se determina segun ELISA y Western blotting.
El efecto supresor de la serialization del LIF sobre la liberacion de interferon gamma se incremento hasta 90 % de supresion cuando celulas de bazo vlrgenes tomadas de ratones mutantes nulos de axotropina se activaron in vitro mediante reticulation CD3/CD28 (Figura 2 (a)). Esto indica que el tratamiento con el LIF puede conducir a la supresion de la liberacion de la citoquina inflamatoria interferon gamma a partir de celulas inmunes in vitro en determinadas condiciones celulares.
Terapia del LIF usando nanopartfculas
Dado que las celulas TReg se originan a partir de celulas T CD4+, las nanopartlculas cargadas con el LIF se recubren previamente con anticuerpo anti-CD4 biotinilado (como se muestra en la Figura 1) con el objetivo de dirigir el LIF a los sitios de compromiso del antlgeno para la activation de linfocitos CD4+. Las nanopartlculas no cargadas actuan como controles mientras que la dosis del LIF administrada se determina por comparacion entre los sobrenadantes tratados y control de los experimentos in vitro.
La estrategia tiene el beneficio adicional de que las nanopartlculas tambien pueden ser fagocitadas por las celulas presentadoras de antlgeno, aumentando aun mas el suministro del LIF al microambiente del linfocito que responde. En vivo, la absorcion de tejido de las nanopartlculas de sangre se mide en todos los organos principales incluyendo pulmon, hlgado, rinon, bazo, ganglio linfatico, timo, corazon y cerebro. El tamano de las nanopartlculas <500 nm puede reducir el secuestro al hlgado: si esto sigue siendo un problema, las nanopartlculas "furtivas" se pueden preparar incluyendo polietilenglicol (PEG) biotinilado en la capa superficial.
Medicion de Foxp3 por citometrla de flujo
Una lectura crltica para los experimentos es la expresion de la protelna Foxp3 en los linfocitos CD4+ (vease la Figura 2). El protocolo de citometrla de flujo normalizado emplea seis analisis de color de celulas individuales en poblaciones complejas: por consiguiente, cada celula se caracteriza por 36 variables potenciales. La tincion superficial incluye CD4, CD3, CD25, CD8, CTLA-4 y gp190 (la subunidad de receptor especlfica de LIF) mientras que la tincion intracelular mide Foxp3 y CTLA-4 citoplasmatica. Las poblaciones de celulas se fenotipifican a 0h y despues del cultivo mas aloantlgeno estimulante en presencia o ausencia de nanopartlculas de LIF. De acuerdo con los metodos de la presente invencion, la terapia con nanopartlculas de LIF conduce a un aumento significativo en el numero de celulas Foxp3+.
Se toman tres enfoques experimentales para validar los resultados aun mas.
(i) Respuesta de linfocitos mixtos: Un modelo in vitro de aloreactividad es la respuesta unidireccional de linfocitos mixtos (MLR) y los linfocitos de sangre periferica humana se usan en protocolos MLR establecidos para medir tanto la slntesis de ADN por captation de timidina tritiada y expresion de Foxp3 por analisis de citometrla de flujo de una sola celula despues de la activacion en presencia o ausencia de terapia con LIF. Estos experimentos pueden identificar el efecto del LIF durante la preparation del aloantlgeno durante un perlodo de 7 dlas.
(ii) Respuesta MLR cebada: El uso de linfocitos aloreactivos cebados plantea hasta que punto la reactividad inmunitaria cebada especlfica del donador puede ser guiada hacia el estado tolerante por el tratamiento con LIF. Aqul se usan modelos humanos y murinos. Los experimentos en humanos observan los linfocitos de sangre periferica despues de la estimulacion con perlas revestidas con antlgeno "especlficos de donante" comercialmente disponibles, seguidas de
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reestimulacion con perlas usadas en el paso de cebado, o con perlas de terceros. Estudios ex vivo en paralelo usan ratones CBA agrupados en receptores "alotolerantes"versus "alorechazados" de un aloinjerto de corazon BALB/c completamente incompatible: aqul la estimulacion de donante-antlgeno es a traves de celulas de bazo BALB/c irradiadas usando protocolos estandares. De nuevo se determina si las nanopartlculas cargadas con LIF sesgan la respuesta antidonante hacia la tolerancia, buscando aumentos en el numero de celulas Foxp3 positivas durante un perlodo de 7 dlas. El perfil completo del fenotipo ocurre a tiempo cero, 3, 5 y 7 dlas para buscar cambios a medida que avanza la aloactivacion.
(iii) Tolerogenesis in vivo mediante terapia con LIF:Para poder influir en el desarrollo de TReg in vivo, mas que en cultivo, representa un reto significativamente mayor, dado que se sabe que el LIF recombinante administrado por via intravenosa o en el peritoneo se degrada muy rapidamente [Hiltony otros1991]. Los presentes inventores han desarrollado un nuevo enfoque usando nanopartlculas dirigidas que representan un medio potente para lograr la entrega del LIF directamente al microambiente de celulas T vlrgenes, donde la liberacion lenta sera opcionalmente continua durante varias semanas y el modelo de aloinjerto cardlaco murino es adecuado para probar la eficacia de dicho tratamiento del LIFen vivo,tlpicamente como un preliminar a los estudios precllnicos.
Para probar el efecto del LIF encapsulado en nanopartlculas sobre la supervivencia de aloinjertos cardlacos en ratones BALB/c que recibieron un injerto de corazon cBa vascularizado, se ha ideado el siguiente ensayo. Los ratones receptores reciben el LIF encapsulado en nanopartlculas dirigidas a CD4 (suministrado por Tarek Fahmy y Jason Park, Universidad de Yale). Los controles historicos no recibieron terapia y rechazaron su injerto alrededor del dla 7 despues del injerto. La importancia de este experimento es la comprension de los mecanismos reguladores que controlan las celulas T in vivo.
Materiales y metodos:
Injertos de corazon CBA a BALB/c dla 0: N=2 Preparacion microencapsulada de LIF:
Pre descargar todas las superficies inertes para eliminar la carga estatica 6 mg de nanopartlculas en tubo Eppendorf [~ 6 microgramos LIF]
Resuspender en 500 microlitros de PBS esteril
Anadir 100 microlitros de material anti-CD4 biotinilado esteril (eBioscience Cat N 36-0041 (13-0041) 0.5 mg en PBS sin NHN3: IgG2b de rata, k) @ 1 mg/ml (0.1 mg en total)
Incubar 20 minutos a temperatura ambiente.
Centrifugar a 10,000 g durante 5 minutos Conservar sobrenadante
Resuspender vigorosamente las nanopartlculas mediante sonicacion LAVaDo: Anadir lentamente 1 ml de PbS esteril Centrifugar a 10,000 g durante 5 minutos
Conservar sobrenadante [~ 3 microgramos de LIF (asumiendo una perdida del 50%)]
Tratamiento de los receptores de aloinjertos:
Resuspender el granulo de nanopartlculas vigorosamente por sonicacion Anadir lentamente - con sonicacion - 400 microlitros de PBS esteril
Resuspender vigorosamente por sonicacion para administration intravenosa de 200 microlitros POR RATON
El tratamiento se lleva a cabo el Dla 0; Dla 2; Dla 4 introduciendo 200 microlitros de nanopartlculas del LIF resuspendidas en la vena de la cola usando una aguja de calibre 27 1.
En el momento del rechazo (cesacion del latido del corazon trasplantado) el animal se sacrifica y el corazon donado se retira para su analisis. El corazon nativo tambien se conserva para el analisis. Tambien se toman muestras de sangre, pulmon, hlgado, rinon, piel, timo, ganglio linfatico, cerebro, intestino grueso e intestino delgado para determinar la distribution y captation de nanopartlculas.
Ratones
La insertion de la trampa genetica se uso para generar ratones BALB/c nulos a axotropina y los companeros de camada de padres heterocigotos fueron genotipados por PCR analisis de ADN genomico para identificar cachorros axot +/+, axot +/- y axot -/- como se detallo anteriormente. El bazo, el timo y el ganglio linfatico se obtuvieron a partir de companeros de camada de 5m de edad y se mantuvieron en hielo antes de la preparacion celular para los analisis descritos mas abajo. El tejido de los ganglios linfaticos produjo muy pocas celulas y se descarto
Preparacion de celulas
Se extrajeron esplenocitos y timocitos de cada organo y se recogieron en medio de crecimiento esteril [RPMI-1640
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(Gibco™ Invitrogen Co.) suplementado con FCS al 10% (Gibco™ Invitrogen Co.), L-Glutamina 200 mM, Penicilina 100U/mL y 100 pg/mL Estreptomicina (Sigma Chemical Co.)]. Las suspensiones celulares se lavaron, se resuspendieron en medio de crecimiento y se contaron usando un hemocitometro.
ELISA
Los ELISA se realizaron en los sobrenadantes de cultivo de 48 horas, en placas Falcon® de 96 pocillos usando el DuoSet® ELISAS para Interferon gamma (DY485), IL2 (DY402), IL4 (DY404), IL10 (DY417) y Quantikine®M Immunoassay para LIF MLF00), de R&D Systems. Las curvas estandares se establecieron procesando los datos de densidad optica usando el software Microsoft Excel y se determinaron las concentraciones de citoquina usando las curvas estandares.
Citometria de flujo
Las suspensiones de celulas esplenicas y tlmicas se agotaron y se lavaron en solucion de tincion FACS (BSA al 0.2 % y azida sodica al 0.1 % en 1x PBS) antes de mezclarse con los diversos anticuerpos monoclonales detallados mas abajo, conjugados directa o indirectamente con Ficoeritrina (PE) o Isotiocianato de Fluorescelna (FITC). El CD19 (557399) anti raton PE-rata, la cadena TCRa anti raton PE-hamster (553172) y el clon de celula dendrltica de rata anti raton 33D1 (551776) procedlan de Pharmingen. El CD205-FITC anti-raton de rata (MCA949F), la cadena pesada IgG2a-FITC (MCA278F) de raton anti-rata y la cadena IgG2b-FITC anti-rata de raton fueron de Serotec Ltd. mientras que el CD25 de conejo (IL2Ra) y la IgG anti raton (H&L)-PE de cabra (4050-89) eran de Santa Cruz Biotechnology y Southern Biotechnology Associates, respectivamente. El anti CD4 (YTS177.9.6) y el anti CD8 (YTS 105.18.10) fueron un regalo del profesor Stephen Cobbold, de la Universidad de Oxford. Los analisis se realizaron en un instrumento Becton Dickinson FACSCalibur equipado con el software CellQuest.
Ejemplo 2
Este Ejemplo muestra el efecto de LIF exogeno sobre celulas T activadas por ligacion de CD3/CD8.
Las celulas de bazo de raton geneticamente normales cultivadas en medio de crecimiento sin suero fueron activadas por anti-CD3 y anti-CD28 en presencia o ausencia de 10 ng/ml de LIF. Como se muestra en la Figura 3, a las 48 h se descubrio que el LIF exogeno tenia una expresion aumentada de los genes Nanog, p53,yLIF y la disminucion de la expresion del gen SOCS-3.
Por lo tanto, se predice que la terapia in vivo con la administracion selectiva de LIF aumentara de forma similar la expresion de los genes Nanog,P53,yLIF en una celula diana y reducira la expresion de SOCS-3.
Ejemplo 3
Este Ejemplo muestra que la protelna del LIF derivada de celulas esta unida a alotolerancia, mientras que la liberacion de protelna IL6 esta ligada al alorechazo.
Las celulas de bazo cebadas de ratones alotolerantes o alorechazadas estimuladas in vivo por antlgeno donador (es decir, celulas de bazo de tipo donador irradiadas) en medio de crecimiento RPMI que contenla FCS al 10 % revelo que la liberacion de protelna LIF derivada de celulas esta unida a alotolerancia, mientras que la liberacion de la proteina IL6 esta unida al alorechazo (ver Figura 4).
Por lo tanto, se predice que la entrega dirigida de LIF a las celulas T CD4+in vivoresultara en aumentos en el linaje regulador tolerante (Treg), mientras que la administracion dirigida de IL6 se opondra a la induccion de la tolerancia.
Conclusion:
La invencion representa un enfoque altamente innovador para el tratamiento de la enfermedad mediada por inmunidad usando el tratamiento de LIF dirigido. Los experimentos incorporan dos grandes avances de importancia central para el tratamiento de las indicaciones mediadas por el sistema inmune, es decir la focalizacion mas el aprovechamiento de una via natural tolerogenica y de este modo apuntalan el desarrollo de terapias clinicas nuevas y exitosas.
Referencias
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Hilton DJ, Nicola NA, Waring PM, Metcalf D. Clearance and fate of leukemia-inhibitory factor (LIF) after injection into mice J Cell Physiol. 1991 sep;148(3):430-9
5 Hori, S., Nomura, T. y Sakagushi, S. (2003) Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science 299, 1057-1061.
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Muthukumarana, GE Lyons y Miura, L Thompson, T Watson, CJ Verde, S Shurey, AD Hess, BR. Rosengard, Su M. 15 Metcalfe. Evidence for functional inter-relationships between FOXP3, leukaemia inhibitory factor, and axotrophin/MARCH-7 in transplantation tolerance International Immunopharmacology 6 (2006) 1993-2001

Claims (11)

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    Reivindicaciones
    1. Una composition para promover una respuesta de tolerancia inmunitaria en un mamlfero, la composition comprende:
    a) una solution portadora farmaceuticamente aceptable; y
    b) una pluralidad de nanopartlculas biodegradables, en donde las nanopartlculas comprenden una capa de pollmero biodegradable, en donde las nanopartlculas comprenden una portion de direccionamiento que es capaz de unirse selectivamente a la superficie de una celula de linfocito T y/o de una celula endotelial vascular, en donde la porcion de direccionamiento se selecciona de un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal o un fragmento de anticuerpo de union al antlgeno; y en donde las nanopartlculas comprenden ademas un factor inhibidor de la leucemia (LIF).
  2. 2. La composicion de la reivindicacion 1, en donde el pollmero comprende un pollmero de polilactido-co-glicoluro (PLG).
  3. 3. La composicion de cualquier reivindicacion anterior, en donde la porcion de direccionamiento se une
    especlficamente al antlgeno presente en la superficie de una celula de linfocito T, seleccionado entre uno o mas de: un receptor CD4; un receptor CD25; un receptor gp190; y un receptor LIF.
  4. 4. La composicion de cualquier reivindicacion anterior, en donde la porcion de direccionamiento se une
    especlficamente al antlgeno presente en la superficie de una celula endotelial vascular, seleccionado de uno o mas de: un receptor CD31; un receptor CD34; un receptor de VEGF y un receptor de EPC.
  5. 5. La composicion de cualquier reivindicacion anterior, en donde las nanopartlculas tienen un diametro entre aproximadamente 50 nm y aproximadamente 500 nm.
  6. 6. Un metodo in vitrooex vivo para inducir que una celula de linfocitos T adopte un fenotipo TReg que comprende exponer el linfocito T a una pluralidad de nanopartlculas biodegradables, en donde las nanopartlculas comprenden una porcion de direccionamiento que es capaz de unirse selectivamente a la superficie de una celula de linfocito T y/o de una celula endotelial vascular, en donde la porcion de direccionamiento se selecciona de un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal o un fragmento de anticuerpo de union al antlgeno; y en donde las nanopartlculas comprenden ademas un factor inhibidor de la leucemia (LIF).
  7. 7. El metodo de la reivindicacion 6, en donde las nanopartlculas comprenden una capa de pollmero biodegradable que encapsula el LIF.
  8. 8. El metodo de la reivindicacion 7, en el que el pollmero comprende un pollmero de polilactido-co-glicoluro (PLG).
  9. 9. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en donde la porcion de direccionamiento se une especlficamente al antlgeno presente en la superficie de una celula de linfocito T, seleccionada entre: un receptor CD4; un receptor CD25; un receptor gp190; y un receptor LIF.
  10. 10. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en donde la porcion de direccionamiento se une especlficamente al antlgeno presente en la superficie de una celula endotelial vascular, seleccionada entre uno o mas de: un receptor CD31; un receptor CD34; un receptor de VEGF y un receptor de EPC.
  11. 11. Una preparation que comprende una pluralidad de nanopartlculas biodegradables, en donde las nanopartlculas comprenden ademas un factor inhibidor de leucemia (LIF) y una porcion de direccionamiento que es capaz de unirse selectivamente a la superficie de una celula de linfocito T y/o de una celula endotelial vascular, para el tratamiento de una enfermedad autoinmune, tratamiento de la enfermedad del injerto frente al huesped, o tratamiento de aloinjertos celulares destinados al trasplante.
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