ES2632772T3 - Procedimientos y dispositivos de manipulación de la bioincrustación - Google Patents
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Abstract
Un biosensor que comprende (a) un armazón que comprende una matriz formada a partir de un material formador de armazón, comprendiendo dicho material formador de armazón uno o más polisacáridos que tienen una temperatura de transición de fase sólida a líquida a una temperatura superior a 35 ºC y no superior a 95 ºC y que se convierte en una estructura sólida o semisólida tras el enfriamiento; (b) un complejo de colorantes que comprende minerales de arcilla asociados con un material colorante, en el que el material colorante proporciona una señal detectable en presencia de microorganismos; en el que el complejo de colorante está embebido, al menos parcialmente, en el armazón y el armazón está caracterizado por poros y/o huecos.
Description
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DESCRIPCION
Procedimientos y dispositivos de manipulacion de la bioincrustacion Campo de la invencion
La presente invencion se refiere, en general, a la bioincrustacion y, espedficamente, a procedimientos y dispositivos para predecir y reducir la bioincrustacion en sistemas fluidos, tales como sistemas de desalinizacion.
Antecedentes de la invencion
El problema de la bioincrustacion de membranas, tubenas, torres de refrigeracion y otras superficies en contacto con el agua, es un problema constante en los procedimientos y sistemas relacionados con el agua, y, particularmente, en los procesos de desalinizacion de agua.
El desarrollo de la bioincrustacion en las superficies de membranas presenta uno de los problemas mas graves en el funcionamiento de las plantas de desalinizacion basadas en la tecnologfa de osmosis inversa (RO, reverse osmosis), especialmente para la desalinizacion de aguas residuales tratadas despues del tratamiento secundario.
La capa de bioincrustacion en las membranas provoca un aumento en la presion de entrada, una disminucion en el flujo de producto y un aumento en la disminucion de la presion en la superficie de las membranas entre el lado de alimentacion y el lado de concentracion. Estos cambios provocan una disminucion de la produccion de las instalaciones de desalinizacion, un aumento en el consumo de energfa y una necesidad frecuente de limpieza qmmica de las membranas con el fin de eliminar las capas de bioincrustacion.
El desarrollo de la contaminacion biologica es el resultado de la adsorcion y el crecimiento de microorganismos, que se encuentran en el agua de alimentacion, en las superficies de la membrana.
Existen varios procedimientos para la prediccion de la bioincrustacion, algunos son pruebas de laboratorio que incluyen AOC (carbono organico asimilable), BDOM (materia organica disuelta biodegradable), DBO (demanda bioqmmica de oxfgeno), DOC (carbono organico disuelto), TBC (recuento de microorganismos totales), TOC (carbono organico total). Para las pruebas de campo, la mayona de las mediciones se basan en el crecimiento de biopelfcula en las superficies de medicion. Existen varios kits comerciales de identificacion de biopelfculas, que detectan la presencia de biopelfcula; el mas habitual de estos es el kit de la prueba de la reaccion de la actividad biologica (BART) o el kit de la prueba HydroBio.
Tambien se describieron colorantes para detectar microorganismos. [Turner Nikki, W. E. Sandine, P. R. Elliker y E. A. Day, "Use of Tetrazolium Dyes in an Agar Medium for Differentiation of Streptococcus Lactis and Streptococcus Cremoris", Journal of Dairy Science, 46:380-385 (1963); Hayashi Shuhei, Takeshi Kobayashi y Hiroyuki Honda, "Simple and rapid cell growth assay using tetrazolium violet coloring method for screening of organic solvent tolerant bacteria", Journal of Bioscience and Bioengineering, 96(4):360-363 (2003)].
Armon y col., (Journal of Biotechnology 51, (1996), 279-285) describen aplicaciones de sol-gel en biotecnologfa ambiental.
Sumario de la divulgacion
La presente divulgacion proporciona, de acuerdo con un aspecto, un biosensor como se define en las reivindicaciones, que comprende un armazon que comprende una matriz formada a partir de un material de formacion de armazon que comprende uno o mas polisacaridos que tienen una temperatura de transicion de fase solida a lfquida a una temperatura por encima de 35 °C y no mas de 95 °C y que se convierte en una estructura solida o semisolida tras el enfriamiento y un complejo de colorante, el complejo de colorante comprende un material de arcilla asociado con un material de colorante en el que el material de colorante proporciona una serial detectable en presencia de microorganismos; en el que el complejo de colorante esta incrustado, al menos parcialmente, en el armazon y el armazon esta caracterizado por poros y / o huecos.
En otro aspecto adicional, la presente divulgacion proporciona un procedimiento para la preparacion de un biosensor como se define en las reivindicaciones, el procedimiento comprende: (i) mezclar un complejo de colorante que comprende un material de arcilla y un material de tinte que proporciona una serial detectable en presencia de microorganismos con un material formador de armazon que comprende uno o mas polisacaridos que tienen una temperatura de transicion de fase de solido a lfquido a una temperatura por encima de 35 °C y no mas de 95 °C y que se convierte en una estructura solida o semisolida al enfriarse A una temperatura a la cual el complejo de colorante y el material que forma un armazon estan en una mezcla acuosa fluida tal como una temperatura entre 35 °C y 95 °C; ii) anadir a la mezcla de fluidos un reactivo no electrolftico; y (iii) enfriar la mezcla fluida con el reactivo no electrolttico a una temperatura a la que se solidifica la mezcla; por lo que se forma un biosensor que comprende el armazon caracterizado por poros y / o huecos y el complejo de colorante que esta al menos parcialmente incrustado en el armazon.
En otro aspecto adicional, la presente divulgacion proporciona un aparato como se define en las reivindicaciones,
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que comprende al menos una entrada de fluido y al menos una salida de fluido, estando dicha entrada de fluido y salida de fluido en comunicacion fluida; estando situada una camara biosensora entre la entrada de fluido y la salida de fluido y que comprende un biosensor como se define en el presente documento.
Tambien se describe un procedimiento como se define en las reivindicaciones para detectar microorganismos viables en una muestra de ensayo de fluido acuoso, que comprende
(a) poner en contacto la muestra de ensayo de fluido acuoso con un biosensor como se describe en el presente documento:
(b) detectar una intensidad de senal del biosensor, siendo la intensidad de senal indicativa de la presencia de microorganismos en la muestra de ensayo de fluido acuoso.
En todavfa otro aspecto, la presente divulgacion proporciona un procedimiento para predecir la bioincrustacion en un sistema de flujo fluido, comprendiendo el procedimiento:
(a) poner en contacto una muestra de fluido acuoso del sistema de flujo de fluido acuoso, con un biosensor como se define en el presente documento; (b) detectar una intensidad de senal en el biosensor, siendo la intensidad de senal correlativa con el potencial del sistema de flujo fluido para formar bioincrustacion.
Tambien se describe un procedimiento para determinar una concentracion de desinfectante requerida para desinfectar un fluido acuoso, comprendiendo el procedimiento:
(a) poner en contacto una o mas muestras del fluido acuoso con una o mas concentraciones diferentes de un desinfectante;
(b) poner en contacto cada una de una o mas muestras que contienen el desinfectante con un biosensor que comprende (i) un armazon y (ii) un complejo de colorante que comprende un material de arcilla y un material colorante en el que el complejo de colorante esta, al menos parcialmente, incrustado en el armazon;
(c) para cada una de las una o mas muestras, detectar una intensidad de senal del biosensor;
(d) seleccionar una muestra para la cual la intensidad de senal esta entre un intervalo determinado como un tratamiento eficaz para dicho fluido acuoso o para dicho desinfectante; en el que la concentracion del desinfectante anadido a la muestra seleccionada es la concentracion eficaz para desinfectar el fluido acuoso.
Breve descripcion de los dibujos
Con el fin de entender la invencion y de ver como se puede llevar a cabo en la practica, a continuacion se describiran realizaciones solo a modo de ejemplo no limitante, con referencia a las figuras adjuntas en las que:
La Figura 1 proporciona una ilustracion esquematica en seccion transversal de un aparato biosensor (10) de acuerdo con una realizacion de la invencion.
La Figura 2 proporciona un grafico que muestra un mdice de biopelmula para las tres alimentaciones de agua diferentes (a la etapa I, a la etapa II y a la etapa III en sistema de desalinizacion por osmosis inversa), determinado usando un biosensor de acuerdo con una realizacion de la invencion.
La Figura 3 proporciona un grafico que muestra el biovolumen (en pm3) de biopelmula que ha crecido en una membrana de osmosis inversa (RO) despues de 15 dfas, para tres etapas de agua de alimentacion diferentes, a la etapa I, a la etapa II y a la etapa III, siendo el biovolumen medido con una microscopia confocal de barrido laser (CLSM).
La Figura 4 proporciona un grafico que muestra un mdice de bioincrustacion en funcion de la concentracion total de cloro en agua.
La Figura 5 Proporciona un grafico que muestra el biovolumen de la biopelmula que ha crecido en la membrana de RO para el agua de alimentacion a la etapa I (alimentacion I) sin cloraminas y para el agua de alimentacion a la etapa I con cloraminas (alimentacion I + CA) despues de 15 dfas, medida con CLSM.
La Figura 6 proporciona un grafico que muestra el espesor de la biopelmula que ha crecido en la membrana de RO con agua de alimentacion a la etapa I (alimentacion I) y agua de alimentacion a la etapa I con cloraminas (alimentacion I + CA) despues de 15 dfas, medida con CLSM.
La Figura 7 proporciona una grafica que muestra el flujo de permeado normalizado en funcion del tiempo de operacion para una planta piloto con dosis bajas de cloraminas, segun se determina con la prueba de biosensor.
Descripcion detallada de las realizaciones
La presente divulgacion se basa en el desarrollo de un material biosensible inmovilizado que permite la deteccion incluso de pequenas cantidades de microorganismos en el lfquido que fluye. El material biosensible se incorporo de
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este modo en un sistema de comunicacion fluida para permitir la prediccion de la bioincrustacion y, de este modo, evitar el taponamiento de las membranas como resultado de la formacion de bioincrustacion.
La presente divulgacion proporciona un campo fiable, cuantitativo y reproducible, biosensor y aparato en tiempo real, que los contiene para determinar el potencial de formacion de bioincrustacion.
Ademas, como se tratara mas adelante en el presente documento, el biosensor permite la correlacion entre sus mediciones y el potencial de bioincrustacion en el fluido de entrada (fluido que fluye, por ejemplo, agua que fluye), y determinar un posible protocolo de tratamiento de fluido, basado en los resultados de la correlacion.
Por lo tanto, de acuerdo con un primer aspecto, la presente divulgacion proporciona un biosensor como se define en el presente documento.
De acuerdo con un segundo aspecto, la presente divulgacion proporciona un procedimiento para la preparacion de un biosensor como se define en el presente documento.
El "armazon" es una matriz formada a partir de un material formador del armazon. El material formador de armazon puede ser un material formador de armazon natural, semisintetico o sintetico que tiene una temperatura de transicion de fase de solido a lfquido por encima de 35 °C, a veces por encima de 50 °C e incluso por encima de 65 °C. La temperatura de transicion de fase no es superior a 95 °C. El armazon es de un tipo al que los microorganismos son capaces de adherirse y los microorganismos adheridos son capaces de crecer encima. Ademas, el armazon se caracteriza por poros / huecos cuyas dimensiones se manipulanen presencia de un agente qmmico o de condiciones ffsicas. Por ejemplo, la deshidratacion de un material formador de armazon puede dar como resultado la retraccion de los huecos del armazon. La deshidratacion puede conseguirse exponiendo material formador de armazon a alcohol.
Al enfriar, el material formador de armazon se solidifica. En el contexto de la presente divulgacion, la solidificacion incluye la transicion a una forma solida asf como semi(casi) solida.
El material formador de armazon comprende uno o mas polisacaridos.
En una realizacion, el armazon es agar, que se sabe que se produce a partir de algas y esta compuesto por una mezcla de dos polisacaridos: agarosa y agaropectina. Aunque el agar es bien conocido en la materia, las Tablas 1A y 1B proporcionan algunas propiedades del agar que pueden usarse de acuerdo con la presente divulgacion.
En las Tablas 1A y 1B se proporcionan algunas propiedades de agar e ingredientes inorganicos de agar, respectivamente (obtenidos de
http://www.bd.com/ds/technicalCenter/inserts/Agars.pdf).
http://www.bd.com/ds/technicalCenter/inserts/Agars.pdf).
Tabla 1A: Propiedades del agar (1,5 % en agua)
- % de cenizas
- 3,6
- Claridad (NTU)
- 4,3
- Perdida por desecacion (%)
- 17,3
- pH
- 6,5
- Resistencia del gel (g/cm2)
- 600
- Punto de gelificacion (°C)
- 35 °C
- Punto de fusion (°C)
- 88 °C
Tabla 1B: Ingredientes inorganicos del agar (1,5 % en agua)
- Elemento
- %
- Calcio
- 0,179
- Cloruro
- 0,021
- Cobalto
- <0,001
- Cobre
- <0,001
- Hierro
- 0,002
- Plomo
- <0,001
- Magnesio
- 0,068
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(continuacion)
- Elemento
- %
- Manganeso
- <0,001
- Nitrato
- <0,005
- Fosfato
- <0,005
- Potasio
- 0,121
- Sodio
- 0,837
- Sulfato
- 1,778
- Azufre
- 0,841
- Estano
- <0,001
- Cinc
- <0,001
Debe entenderse que el “complejo de colorante" abarca cualquier asociacion ffsica (union) entre un material colorante y un material de arcilla, en el que el material colorante forma interaccion no covalente con el material de arcilla. Las interacciones no covalentes (enlace qmmico no covalente) pueden incluir, sin limitaciones, enlaces ionicos, enlaces de hidrogeno, fuerzas de van der Waals e interaccion hidrofoba. La interaccion entre el material colorante y el material de arcilla se trata mas adelante.
Debe entenderse que "material colorante" abarca cualquier compuesto qmmico que proporcione una senal detectable en presencia de microorganismos y en respuesta a los mismos, por ejemplo, como resultado del metabolismo de los microorganismos. Con este fin, la sustancia qmmica debe ser, al menos, no toxica para microorganismos y de un tipo que experimente un cambio en presencia de productos metabolicos de microorganismos (que responden a la presencia de los mismos).
En general, los materiales colorantes se pueden dividir en sentido amplio en dos grupos:
(i) materiales colorantes que proporcionan una senal en respuesta al medio ambiente, por ejemplo, en respuesta a un cambio de pH (indicadores de pH) o en respuesta a una reaccion de reduccion-oxidacion (indicadores redox).
(ii) materiales colorantes que proporcionan una senal debido a un cambio en su estructura qmmica. Por ejemplo, un cambio qmmico en la formula o configuracion qmmica (estereoqmmica) en el compuesto debido a una actividad enzimatica (por ejemplo, metabolica) de los microorganismos.
De acuerdo con lo anterior, el material colorante puede seleccionarse de un cromoforo o fluoroforo.
Los materiales colorantes se utilizaron previamente para determinar la presencia de microorganismos en medios analizados introducidos en placas de 96 pocillos. La presente divulgacion ahora hace uso de material colorante para detectar microorganismos en fluidos que fluyen o en circulacion, por ejemplo, agua que fluye, y no en fluidos en reposo, como se ha descrito anteriormente. [Turner Nikki, y col., Journal of Dairy Science, 46:380-385 (1963); Hayashi Shuhei, y col., Journal of Bioscience and Bioengineering, 96(4):360-363 (2003)]
Por ejemplo, se puede identificar la presencia de coliformes en el agua usando p-d-galactopiranosido rojo de clorofenol, que cambia su color de amarillo a rojo en presencia de S-d-galactosidasa
Los microorganismos de descomposicion de tolueno en condiciones anaerobias en aguas subterraneas pueden identificarse mediante el uso de trifluoro-m-cresol, que cambia su color a amarillo cuando se descompone.
De acuerdo con algunas realizaciones, el material colorante empleado de acuerdo con la invencion pertenece a la familia de los compuestos de tetrazolio.
Los compuestos de tetrazolio son, principalmente, incoloros o estan debilmente coloreados y se reducen mediante deshidrogenasas o reductasas en la cadena de transporte de electrones de un microorganismo para formar cromoforos, es decir, formazanos, como se ilustra mas adelante:
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Los formazanos tienen una variedad de colores que van desde el azul oscuro al rojo oscuro a naranja, dependiendo de las propiedades qmmicas originales del compuesto de tetrazolio que estan determinadas por los diversos grupos organicos unidos al anillo tetrazol (representado por los restos R). El cambio de color puede detectarse en pocas horas en luz visible o bajo radiacion ultravioleta.
En general, los compuestos de tetrazolio pueden dividirse en subgrupos, de acuerdo con el sitio en el que la actividad de reduccion del compuesto de tetrazolio con respecto a la celula de microorganismos:
(i) compuestos de tetrazolio que producen un derivado de formazan que es soluble en agua. La reduccion de tales compuestos de tetrazolio tiene lugar fuera de las celulas del microorganismo.
(ii) Compuestos de tetrazolio que producen un derivado de formazan que no es soluble en agua. Tales compuestos de tetrazolio, especialmente el grupo de monotetrazolio, penetran en la envoltura celular y, por tanto, la reaccion de reduccion tiene lugar dentro de la celula.
Los compuestos de tetrazolio se pueden seleccionar del grupo no limitante que consiste en cloruro de 2-(4- yodofenil)-3-(4- nitrofenil)-5-fenil tetrazolio (INT), bromuro de 2-(4,5-dimetiltiazolil)-3,5-difenil-2H-tetrazolio (MTT), sal interna de 2,3-bis-(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-[(fenilamino)-carbonil]-2H-tetrazolio de sodio (XTT), sal interna de 5-[3-(carboximetoxi)fenil]-3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio (MTS), cloruro de 2,3,5-trifenil-2H- tetrazolio (TTC), sal interna de 5-(2,4-disulfofenil)-2-(4-yodofenil)-3-(4-nitrofenil)-2H-tetrazolio de sodio (WST-1), cloruro de 2,3,5-trifenil-2H-tetrazolio (rojo tetrazolio), cloruro de 2,5-difenil-3-[alfa-naftil]-1-tetrazolio (violeta de tetrazolio), cloruro de 3,3'-(4,4'-bifenilen)bis(2,5-difenil-2H-tetrazolio (cloruro de neotetrazolio), cloruro de 3,3'-(3,3'- dimetoxi-4-4'-bifenilen)bis(2,5-difenil-2H-tetrazolio (cloruro de azul tetrazolio), cloruro de 3,3'-(3,3'-dimetoxi-4,4'- bifenilen)bis[2-(4-nitrofenil)-5-fenil-2H-tetrazolio] (tetrazolio de nitroazul) o cloruro de 3,3'-(3,3'-dimetoxi-4-4' bifenilen)bis[2,5-bis(4-nitrofenil)-2H-tetrazolio] (tetrazolio de tetranitroazul).
En una realizacion preferente, el material colorante es del tipo que se metaboliza dentro del microorganismo. Esto asegura que una vez que el biosensor se pone en contacto con el fluido que fluye y se crea la senal, la senal no se elimina del biosensor.
De acuerdo con esta realizacion, pueden usarse varios compuestos de tetrazolio, preferentemente compuestos de monotetrazolio.
En la Tabla 2 se proporcionan ejemplos de compuestos de monotetrazolio espedficos que entran en las celulas para someterse a una reaccion de reduccion por la cual se crea un color.
Tabla 2: compuestos de monotetrazolio
- Nombre del compuesto
- Peso molecular (g/mol)
- Cloruro de trifeniltetrazolio
- 334,8
- Rojo tetrazolio
- 348,5
- Violeta de tetrazolio (C23H17CIN4)
- 384,84
- (Fuente: Graham D. Horace, 1967)
De acuerdo con una realizacion, el compuesto de tetrazolio es el violeta de tetrazolio (tambien conocido como cloruro de 2,5-difenil-3- [alfa-naftil] -1-tetrazolio).
Con el fin de asegurar el atrapamiento del material colorante, se forma un complejo con un material de arcilla, que actua como anclaje del colorante. La interaccion (asociacion) entre el material colorante y el material de arcilla es no covalente, como se ha tratado anteriormente. En una realizacion, la interaccion se basa en la interaccion ionica entre el material colorante cargado positivamente y el material de arcilla cargada negativamente, lo que da como resultado un complejo de colorante de alto peso molecular.
Debe entenderse que el "material de arcilla" se refiere a cualquier silicato de aluminio compuesto principalmente por minerales granulados.
En una realizacion, el material de arcilla comprende minerales de arcilla. Los minerales de arcilla son filosilicatos de aluminio hidratado que comprenden cantidades variables de hierro, magnesio, metales alcalinos, alcalinoterreos y otros cationes.
Sin limitarse a ello, el mineral de arcilla puede seleccionarse del grupo que consiste en caolm, esmectita, clorito de illitem, sepiolita y atapulgita.
En una realizacion preferida, el mineral de arcilla es caolm. El caolm es una sustancia pulverulenta blanca que comprende, principalmente, el mineral caolinita, asf como otros minerales, tales como dickita, haloisita y nacrita. El caolm es bien conocido en la materia y esta comercialmente disponible en diversas formas.
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El caolm, as^ como otros minerales de arcilla, pueden denominarse "intercambio cationico", ya que los materiales de arcilla usualmente comprenden una carga negativa sobre su superficie y, por lo tanto, son capaces de adsorber y mantener especies cargadas positivamente.
Sin estar limitado por la teona, la asociacion entre los materiales colorantes y el material de arcilla implica la interaccion entre el material colorante cargado positivamente que es adsorbido sobre la superficie del material de arcilla ionica formando asf el complejo de colorante.
Una ventaja del uso de caolm como material de arcilla reside en su color blanco natural, que sirve como un color de fondo para permitir una deteccion clara del cambio de color sobre la superficie del biosensor.
En el ejemplo no limitativo de la presente invencion, la cantidad de material colorante que quedo expuesta sobre una superficie del armazon que tiene un area superficial de 70 cm2 fue suficiente para permitir la deteccion de al menos 40 UFC / ml de microorganismo (a un TOC de al menos 1,2 mg /l).
De acuerdo con algunas realizaciones, el complejo de colorante tiene un peso molecular en el intervalo de 300 g / mol a 1500 g / mol, preferentemente en el intervalo de 500 g / mol a 1300 g / mol, mas preferentemente en el intervalo de 700 g / mol a 1300 g / mol.
El atrapamiento o incrustacion, que es un atrapamiento ffsico (mecanico) del complejo de colorante en el armazon, puede conseguirse exponiendo el material formador de armazon a un agente qmmico tal como un reactivo no electrolftico, que da como resultado la retraccion del material formador de armazon. El reactivo no electrolftico puede entenderse que indica cualquier sustancia qmmica que no existe en forma ionica en una solucion acuosa.
La retraccion puede conseguirse por deshidratacion (total o parcialmente) del material formador de armazon en presencia del complejo de colorante, como se tratara mas adelante. Como resultado, el complejo de colorante esta al menos parcialmente incrustado o atrapado en el armazon. En este contexto, debe entenderse que "al menos parcialmente incrustado en el armazon" significa que una porcion del material colorante que responde a la presencia de microorganismos en el fluido se expone fuera del armazon, pero aun asf, el complejo de colorante esta atrapado de forma estable en el armazon.
De acuerdo con una realizacion, la incrustacion del complejo de colorante en el armazon es proporcionada por la exposicion del material formador de armazon a un alcanol. Por lo tanto, de acuerdo con algunas realizaciones de la invencion, el biosensor comprende un alcanol.
El "alcanol' en el contexto de la invencion indica un carbohidrato que contiene hidroxilo alifatico o aromatico saturado o no saturado, lineal o ramificado. En algunas realizaciones, el alcanol es un alcohol, por ejemplo, alcohol C1-C20. Esto puede incluir, sin limitaciones a los mismos, alcohol metflico (metanol), alcohol etflico (etanol), alcohol terc-butflico, alcohol n-propflico, alcohol iso-propflico (alcohol sec-propflico), alcohol n-butflico, alcohol iso-butflico (alcohol sec-butflico).
En una realizacion preferida, el alcohol es etanol.
De acuerdo con la presente invencion, y sin quedar limitado a teona alguna, parece que el reactivo no electrolftico, tal como un alcanol anadido al armazon y al complejo de colorante, retrae los poros del armazon y, por tanto, mantiene ffsicamente el complejo de colorantes e impide la difusion del complejo de colorante del armazon polimerico, por ejemplo, en presencia de fluido que fluye.
El reactivo no electrolftico se anade a la mezcla del material formador de armazon y del material complejo de colorante cuando esta en forma fluida. Para ello, se calienta la mezcla de los componentes, a saber, el material formador de armazon y el material de complejo de colorante. En algunas realizaciones, el calentamiento es a una temperatura entre 35 °C y 95 °C, a veces entre 55 °C y 85 °C adicionalmente a veces, a una temperatura en el intervalo de 45 °C-85 °C o incluso a 65 °C a 85 °C. A continuacion, se anade una cantidad predeterminada del reactivo no electrolftico, estando la cantidad en correlacion con el nivel de retraccion deseado.
En algunas realizaciones, el material colorante y el material de arcilla se mezclan a un pH en el intervalo de pH 4 a pH 6. En una realizacion particular; la mezcla esta a un pH de 4,5±0,5.
La mezcla homogenea formada de este modo se enfna despues a una temperatura a la cual la mezcla forma una estructura solida o semisolida. En algunas realizaciones, la temperatura puede estar entre 10 °C y 35 °C, preferentemente entre 20 °C y 30 °C y, a veces, entre 20 °C y 25 °C. En algunas realizaciones, el material formador de armazon se anade en exceso al material colorante. En una realizacion, la mezcla esta en una proporcion estequiometrica de 2:1, a veces de 3:1 e incluso de 4:1 entre el material formador de armazon y el complejo de colorante.
El biosensor en un solido o semisolido puede proporcionarse en diversas formas. En una realizacion, el complejo de colorante incrustado en el armazon se proporciona como un laminado o capa sobre una placa. Con este fin, la mezcla fluida puede verterse en un molde, tal como una placa, que cubre la superficie de la placa. El biosensor en
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forma de un laminado puede definirse de modo que tenga una superficie superior y una superficie inferior, exponiendose el material al menos en la superficie superior del laminado.
La placa puede ser, por ejemplo, una placa de microtitulacion (tambien conocida como microplaca o placa de micropocillos) preparada a partir de un material seleccionado de poliestireno, polipropileno, policarbonato o ciclo- olefinas. La microplaca puede tener cualquier numero de pocillos. Las placas comercialmente disponibles comprenden 6, 12, 24, 48, 96, 384 o incluso 1536 pocillos de muestra.
De acuerdo con algunas otras realizaciones, el biosensor esta en forma de materia en partmulas con el material de colorante expuesto en la superficie exterior de la materia en partmulas. Las partmulas se pueden obtener usando tecnicas de pulverizacion bien conocidas o cualquier otra tecnica conocida que forme perlas.
A continuacion, el material biosensible en partmulas puede suspenderse en un tampon adecuado, en un recipiente o esta alojado en una columna. Cuando esta en forma de partmulas, el diametro puede variar y, en algunas realizaciones, la distribucion de tamano de la materia en partmulas puede estar en el intervalo de 0,01 micrometros a 10 micrometros. Las partmulas pueden ser de tamano uniforme o de tamano variable.
El biosensor puede ser desechable, para un solo uso, puede reutilizarse, para varias pruebas. Cuando se usa mas de una vez, se purga entre usos. La purga puede conseguirse reemplazando el complejo de colorante con el nuevo complejo de colorante.
En el procedimiento para la preparacion del biosensor, se encontro que la capacidad del armazon para atrapar un material dentro de sus poros depende del tamano de poro del polfmero y que el tamano de los poros se puede ajustar usando una concentracion mas alta que la convencional (mayor que la recomendada por el fabricante) del material formador de armazon. El tamano de poro reducido reduce el coeficiente de difusion (salida) del complejo de colorante atrapado dentro del armazon.
Por tanto, por ejemplo, aunque en medios de cultivo convencionales se utiliza agar en una concentracion de 1,8 % en agua destilada (que es la concentracion recomendada por los fabricantes de agar), los inventores han descubierto que, con el fin de obtener un atrapamiento optimo del complejo de colorante en agar (optimo en el sentido de que el complejo de colorante no se libera del biosensor una vez que el fluido fluye sobre el biosensor), la concentracion de agar en la mezcla de fluidos debe incrementarse al menos por dos veces, a veces 3 veces e incluso 4 veces y, en los ejemplos espedficos, se aumento a 7,2 %.
En una realizacion particular, el biosensor comprende un complejo de colorante de caolm y violeta de tetrazolio incrustado en agar (el armazon).
Se observa que el agar es un gel a temperatura ambiente y permanece solido a una temperatura tan alta como de 65 °C. El agar se funde a aproximadamente 85 °C y luego se solidifica a una temperatura por debajo de aproximadamente 45 °C, espedficamente a un intervalo de temperaturas de 32 °C a 40 °C.
De acuerdo con esta realizacion, el biosensor se prepara mediante un procedimiento que comprende:
(a) mezclar un complejo de colorante que comprende caolm y violeta de tetrazolio con agar a una temperatura en el intervalo de 65 °C a 85 °C para formar una mezcla fluida que retiene el complejo de colorante y el agar en forma fluida acuosa;
(b) anadir a la mezcla fluida etanol; y
(c) enfriar la mezcla fluida con etanol hasta una temperatura en el intervalo de 20 °C-25 °C;
con lo que se forma un biosensor que comprende el complejo de colorante que esta incrustado, al menos parcialmente, en agar.
Asimismo, la presente divulgacion proporciona un aparato que comprende:
- al menos una entrada de fluido y al menos una salida de fluido en comunicacion fluida;
- estando situada una camara biosensora entre la entrada de fluido y la salida de fluido y que comprende un biosensor que comprende:
(i) un armazon;
(ii) un complejo de colorante que comprende un material de arcilla asociado con un material colorante; en el que el complejo de colorante esta incrustado al menos parcialmente en el armazon.
Una ilustracion en seccion transversal de un aparato biosensorial de acuerdo con una realizacion de la invencion se proporciona en Figura 1.
Por consiguiente, un aparato biosensor (10) comprende una base (12) y paredes laterales (14) y (14'), una camara biosensora (16), una entrada de fluido (18) en la base proximal a una pared lateral (14) para liberar fluido a la cuba de amortiguacion (20) dentro de la camara biosensora (16) y una salida (22) proximal a la otra pared lateral (14')
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para expulsar el fluido de la camara biosensora (16).
La camara biosensora (16) comprende un biosensor (24) que comprende un armazon; y un complejo de colorante que comprende un material de arcilla asociado con un material colorante; en el que el complejo de colorante esta al menos parcialmente incrustado en el armazon.
La camara biosensora (16) se puede construir para llevar uno (como se muestra en la Figura 1) o una serie de biosensores (no mostrados). El uno o mas biosensores pueden estar alineados uno junto al otro y / o apilados uno encima del otro de una manera que permita que el fluido fluya entre ellos.
La cuba de amortiguacion (20) que a veces se puede denominar cuba silenciadora, se utiliza para silenciar el fluido que entra en la camara biosensora (16), es decir reducir, si no eliminar, las oscilaciones de fluido que entra en la camara biosensora (16) y para formar un flujo laminar fino y silencioso (26) de lfquido sobre el biosensor (24). La oscilacion puede producirse como resultado de los golpes de una bomba (no mostrada) para retirar fluido al aparato biosensor.
Las dimensiones de una cuenca de amortiguacion (20) se calcula de modo que las oscilaciones del fluido que entra por la entrada (18) sean mmimas y se forme un flujo laminar constante sobre el biosensor.
Para mantener un flujo laminar sobre el biosensor (24), fue necesario calcular las condiciones para obtener un numero de Reynolds (Re) por debajo de 2.000, incluso por debajo de 1.000 y, a veces, incluso preferentemente, entre 300 y 800 (un numero de Reynolds por encima de 2.000 se correlaciona con el flujo turbulento). El numero de Reynolds se calcula de acuerdo con la ecuacion:
Ra
IT X A
en la que Qc es el caudal volumetrico (3/s); L es el radio hidraulico del conducto a traves del cual fluye el fluido (cm); A es el area transversal del flujo (cm2); v es la viscosidad cinematica (cm2/s).
A este respecto, se observa que un flujo a traves de un conducto recto, un numero de Reynolds de menos de 2000 se considera generalmente de tipo laminar, en el que los numeros de Reynolds de mas de 2000 indican flujo turbulento.
Un flujo laminar, en el contexto de la presente divulgacion, significa la formacion de una capa de fluido que fluye sobre el biosensor, con una profundidad esencialmente uniforme sobre el biosensor, siendo la profundidad entre 0,5 mm y 10 mm, incluso entre 1 mm y 5 mm e incluso 1 mm-3 mm.
Por consiguiente, para una camara de amortiguacion que tiene un volumen de 92,16 cm3 (altura 1,8 cm, longitud 4,0 cm y anchura 12,8 cm); y un flujo laminar caracterizado por una profundidad de fluido sobre el biosensor de aproximadamente 0,3 cm, se obtuvo un numero de Reynolds de 718.
La entrada del aparato (18) y la salida del aparato (22) estan en comunicacion fluida. Espedficamente, la entrada (18) puede transferir el fluido analizado a la camara biosensora (16) para reaccionar con el biosensor (24) y la salida (22) puede transferir el fluido analizado de la camara biosensora (16) a un colector de residuos (no mostrado) o recircular el fluido en la entrada (18).
En algunas realizaciones, el aparato puede comprender una bomba (28) que puede facilitar el flujo de fluido dentro del aparato o puede utilizarse para recircular el fluido desde la salida (22) a la entrada (18) ("bomba de circuladdn”).
El aparato puede comprender tambien un deposito de fluido (30) para contener fluido antes de su introduccion y analizar en la camara biosensora (16). El deposito (30) recibe fluido de una fuente de fluido a traves de la lmea de entrada de fluido (32) y descarga fluido a traves de la lmea de descarga de fluido (34). El control del fluido entrante y saliente a traves de la lmea de entrada de fluido (32) y la lmea de descarga de fluido (34) puede ser controlado por valvulas (36) y (38), respectivamente.
En algunas realizaciones, el aparato puede ser parte de un sistema biosensor, que comprende una o mas de las siguientes unidades:
- una unidad de control de temperatura para controlar la temperatura dentro de al menos la camara biosensora, por ejemplo para apoyar el crecimiento de microorganismos
- una unidad de deteccion de senal. La unidad de deteccion de senales puede comprender un microscopio equipado con detector de color o detector UV o similar, que se utiliza de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- escaner para escanear imagenes de uno o mas biosensores, por ejemplo, escaneado optico del color.
- Una unidad de procesamiento para recibir los datos de entrada desde el detector o el escaner y emitir
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parametros indicativos de la intensidad de la senal del biosensor. La unidad de procesamiento puede ser parte de un modulo de usuario final, tal como un ordenador que lleva una base de datos de diversos biosensores, e indices de bioincrustacion de diversos fluidos.
- La unidad de control para controlar el funcionamiento del aparato biosensor, incluyendo el caudal, la temperatura etc. La unidad de control puede estar equipada con un sistema de alarma para notificar un nivel de bioincrustacion por encima de un umbral predeterminado, para notificar un fallo de funcionamiento, etc.
El aparato de acuerdo con la presente invencion puede accionarse automaticamente. Cuando se utiliza un sistema de alarma, la intervencion directa de un operador humano puede minimizarse.
La unidad de control puede accionarse mediante un microprocesador y puede controlarse mediante software.
La presente divulgacion tambien proporciona un procedimiento para detectar microorganismos viables en una muestra de ensayo de fluido, que comprende
(a) poner en contacto la muestra de ensayo de fluido acuoso con un biosensor como se describe en el presente documento;
(b) detectar una intensidad de senal del biosensor, siendo la intensidad de senal indicativa de la presencia de microorganismos viables en la muestra de ensayo de fluido acuoso.
En algunas realizaciones, el fluido es un fluido acuoso, tal como agua. El agua puede ser agua de transpiracion natural (por ejemplo, de manantiales, lagos, estanques, nos, etc.) o agua salada natural, por ejemplo, agua de mar, o agua tratada, por ejemplo. agua purificada, agua desalinizada, agua en proceso de desalacion, etc., o aguas residuales.
El "contacto" es en la medida en que se proporciona un flujo laminar del fluido acuoso sobre el biosensor, para asegurar un contacto mtimo del fluido acuoso y el complejo de colorante.
Como se ha descrito anteriormente, la senal en el biosensor es el resultado de una formacion de productos metabolicos de microorganismo que depende de la presencia de microorganismos viables en el fluido que circula en un flujo laminar sobre el biosensor.
Como se ilustra a continuacion, un cambio en la senal (color) aparece sobre la superficie del biosensor solo cuando el fluido que fluye sobre el biosensor contema una combinacion de microorganismos y nutrientes adecuados. Si uno de estos elementos faltaba o se eliminaba del fluido circulante, no aparecio ninguna senal en comparacion con el control (por ejemplo, con solucion salina circulante). En otras palabras, el crecimiento de microorganismos en el biosensor, es decir, la bioincrustacion, se atribuina unicamente a la actividad metabolica en presencia de los materiales alimenticios que existen originalmente en el fluido analizado.
En algunas realizaciones, el fluido analizado se trata con agua en una planta de destino, por ejemplo, agua en cualquier etapa de la filtracion de RO. Con este fin, se desea hacer uso del biosensor desvelado en el presente documento para predecir la bioincrustacion en un sistema de flujo de fluido, tal como sistemas de RO en plantas de desalinizacion.
En consecuencia, se proporciona un procedimiento que comprende:
(a) poner en contacto una muestra de fluido acuoso del sistema de flujo de fluido acuoso, con un biosensor como se define en el presente documento,
(b) detectar la intensidad de la senal en el biosensor (estando la senal producida en respuesta a los productos metabolicos del microorganismo si esta presente en la muestra), siendo la intensidad de la senal correlativa al potencial del sistema de flujo de fluido para formar bioincrustacion.
En el contexto de este procedimiento, se debe entender que un potencial de un fluido significa la probabilidad debida a la presencia de microorganismos en el fluido que son capaces de adherirse al biosensor, incluso si ya no se ha producido bioincrustacion.
De acuerdo con el procedimiento anterior, se ha descubierto que hay una correlacion positiva lineal entre la intensidad de la senal en el biosensor y el fluido, por ejemplo, la calidad del agua medida por el volumen de la biopelfcula (biovolumen) que ha crecido en, por ejemplo, membranas de RO en instalaciones de desalinizacion.
De acuerdo con otro aspecto, la presente divulgacion proporciona un procedimiento para determinar una concentracion de desinfectante requerida para desinfectar un fluido acuoso, comprendiendo el procedimiento:
(a) poner en contacto una o mas muestras del fluido acuoso con una o mas concentraciones diferentes de un desinfectante;
(b) poner en contacto cada una de una o mas muestras que contienen el desinfectante con un biosensor como se define en el presente documento;
(c) para cada una de las una o mas muestras, detectar una intensidad de senal del biosensor;
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(d) seleccionar una muestra para la cual la intensidad de la senal esta entre un intervalo determinado que es un tratamiento eficaz para dicho fluido acuoso o para dicho desinfectante;
en el que la concentracion del desinfectante anadido a la muestra seleccionada es la concentracion requerida para desinfectar el fluido acuoso.
En general, las aguas residuales urbanas tratadas en la planta de purificacion contienen una concentracion de amomaco (NH3) a valores que vanan entre aproximadamente 2-10 mg / l. Cuando se anade a este agua un desinfectante, tal como, por ejemplo, hipoclorito de sodio (NaOCl), se crean los enlaces de cloro al amomaco y las cloraminas (NCh, NHCh, NH2Cl).
De acuerdo con este aspecto, el desinfectante puede ser cualquier agente convencional para el tratamiento del agua.
El cloro es el desinfectante qmmico mas utilizado para su uso en el tratamiento del agua y se comercializa en muchas formas. El cloro que se anade al agua reacciona con el material organico e inorganico, asf como con microorganismos. La cantidad de cloro que consume el agua tratada se llama "demanda de cloro". La cantidad de cloro que queda en el agua despues de que se ha satisfecho la demanda de cloro se denomina "cloro residual’.
Los compuestos de tratamiento de agua a base de cloro convencionales incluyen cloro elemental (empleado como gas cloro), hipoclorito de sodio, hipoclorito de calcio, dicloruro de sodio, dicloro-isocianurato sodico (NaDCC), dicloroisocianurato sodico dihidrato (NaDCC.2H2O), dicloroisocianurato de potasio (KDCC) acido tricloroisocianurico (TCCA), cloraminas, dioxido de cloro, clorito de sodio, clorato de sodio, clorato de potasio, peroxido de hidrogeno, ozono y mezclas de los mismos,
El desinfectante tambien puede incluir plata, cobre, compuestos de bromo, acido periodico, un fotocatalizador y combinaciones de los mismos.
En una realizacion, el desinfectante es hipoclorito de sodio.
Para preparar soluciones de tratamiento de agua, los desinfectantes qmmicos solidos se disuelven preliminarmente en un recipiente separado y la mezcla resultante que constituye la solucion de tratamiento de agua se extrae luego con bombas dosificadoras adecuadas y se introduce en agua a tratar.
Es importante senalar a este respecto que las membranas de osmosis inversa son resistentes a las cloraminas pero no son resistentes al cloro, que oxida la superficie de las membranas y provoca una disminucion del flujo de producto y un aumento de la presion de entrada. Por lo tanto, es muy importante reducir la dosis de inyeccion del hipoclorito sodico, con el fin de evitar que el cloro libre permanezca en el agua de entrada y, de este modo, danar las membranas.
Descripcion detallada sobre algunos ejemplos no limitantes Materiales
En los siguientes ejemplos se usaron los materiales siguientes
- Material
- Fuente
- Agar Bacto
- Difco, EE.UU.
- Violeta de tetrazolio
- Sigma-Aldrich, Austria
- Caolm (polvo de arcilla de china)
- Spectrum, EE.UU.
- Solucion de HCl (0,1 M)
- Frutarom, Israel
- Etanol (EtOH, 96 %),
- Biolab, Israel
- Caldo de nutrientes
- Difco, Francia
- Hipoclorito
- Amgal, Israel
- Instrumento de ensayo de cloro total
- Hach Lange, Alemania
Sistema
En la Figura 1 se proporciona una ilustracion esquematica de un aparato biosensor.
Aspectos generales
Antes de cada experimento, el aparato se desinfecto con solucion de cloro y se aclaro varias veces con agua destilada para eliminar los restos que quedan sobre el cloro.
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Ejemplo 1: Desarrollo del biosensor y analisis Sitio de obtencion de muestras y calidad del agua:
Se obtuvieron muestras de agua para los siguientes ejemplos no limitantes de la planta de purificacion de Shafdan (Shafdan, Israel), a menos que se indique lo contrario. La planta de purificacion de Shafdan es responsable de la purificacion de las aguas residuales de las ciudades de la region de Dan, en Israel, y hace funcionar una instalacion de desalinizacion de agua que comprende:
- Un pre-filtro de 130 micrometros.
- Un sistema de pretratamiento de ultrafiltracion (UF) que comprende membranas de poros de 0,02 micrometros.
- Un sistema de osmosis inversa (RO) que comprende tres etapas de desalinizacion (cada etapa desaliniza la salmuera de la etapa anterior), con una tasa de recuperacion del 90%.
Los parametros del agua a diferentes tiempos y ubicaciones de obtencion de muestras ("Punto de obtencion de muestras") se determinaron mediante protocolos estandar llevados a cabo por AminoLab, Israel y se resumen en la Tabla 3.
El Carbono Organico Total (TOC) fue determinado por el procedimiento estandar 5310B Procedimiento de combustion a alta temperatura.
El recuento de bacterias totales (TBC) se determino mediante el procedimiento de unidades formadoras de colonias (UFC/ml)
La Demanda Bioqu^mica de Ox^geno (DBO) se determino mediante el procedimiento estandar 5210B - Prueba de DBO de 5 dfas
La conductividad se determino mediante el analizador multiparametrico Consort C532, Belgica.
Tabla 3: Calidad del agua en los puntos de obtencion de muestras de Shafdan*
- Punto de obtencion de muestras
- Descripcion TOC (mg/l) TBC (CFU/ml) BOD (mg/l) Conductividad (pmho)
- 1
- Agua buruta tras cribado 130 micro 9,0-12,1 105-106 35 1.600-1.850
- 2
- Agua tratada despues de pretratamiento con UF 8,0-11,5 3x102 -103 >5 1.600-1.850
- 3
- Agua de alimentacion a la etapa I de la RO 8,0-14,2 3x102 -103 >6 1.600-1.850
- 4
- Agua de alimentacion a la etapa II de la RO 23-39 6x102 -104 14,5-25 3.900-4.700
- 5
- Agua de alimentacion a la etapa III de la RO 38,1-68,5 103-105 24-103 5.800-6.740
- 6
- Salida del concentrado de RO 80-115 6x103 -105 50 12.000-14.000
- *Intervalo en los parametros se debe a los cambios en la calidad del agua durante el periodo de medicion
Preparacion de material biosensor:
Se disolvio violeta de tetrazolio (0,15 mg) en 30 ml de DDW (para obtener una concentracion de la solucion madre de 0,5 %) mientras se agitaba vorticialmente (es decir, mezclando en un vortex). A continuacion, la solucion se esterilizo despues por filtracion a traves de papel de filtro de 0,45 p. La solucion filtrada se mantuvo a una temperatura de 4 °C en un tubo de ensayo cerrado envuelto en papel de aluminio.
Se disolvio caolm (1,5 gramos) en 60 ml de agua destilada para obtener una solucion de caolm, a una concentracion de 2,5 % y el pH se ajusto a aproximadamente pH de 4,5 utilizando HCl 0,1 M. La solucion de caolm se esterilizo en un autoclave a 120 °C durante 17 minutos y se dejo enfriar a temperatura ambiente. A continuacion, se anadieron 3 ml de solucion madre de violeta de tetrazolio para obtener una concentracion de 0,025 %. La solucion se agito durante 24 horas en un matraz Erlenmeyer, que se envolvio en papel de aluminio para mantener la luz fuera.
El (21,6 gramos) se disolvio en 240 ml de agua destilada y la solucion se mezclo en un agitador magnetico durante 5
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Despues de mezclar las dos soluciones durante 10 minutos a una temperatura constante de 65 °C (la temperatura constante obtenida utilizando un bano de agua caliente) se obtuvo una solucion homogenea y despues se anadieron 3 ml de etanol (EtOH) a la solucion homogenea, mientras se mezcla, hasta alcanzar una concentracion de etanol de 1 % en la solucion. A Esta solucion final se hace referencia en los siguientes ejemplos como medio biosensor.
El medio biosensor, a una temperatura de 65 °C, se vertio en una placa de 96 pocillos. Las placas se cubrieron inmediatamente con papel de aluminio mientras se produda solidificacion, para evitar la exposicion a la luz.
Evaluacion preliminar de deteccion del color:
Se coloco una placa de 96 pocillos en un recipiente grande, con pesos en los lados de la placa para evitar que fluyera. La placa se cubrio con una solucion de agua obtenida del punto de obtencion de muestras 1 hasta una altura de 1 cm por encima de la superficie superior de la placa (para cubrir completamente la placa).
Para el control se utilizaron dos placas de Petri: una con agua destilada esteril y la otra con el agua analizada.
La placa y los dos platos se envolvieron en papel de aluminio y se colocaron en una incubadora a una temperatura de 35 °C.
La placa de 96 pocillos se fotografio despues de 48 horas y despues de 72 horas. El color purpura se detecto en la placa ya despues de 24 horas y fue mas intenso despues de 72 horas, lo que indica que la intensidad del color se ve afectada por el aumento de la presencia de los microorganismos. Las placas de control (con solucion salina solamente) se fotografiaron despues de 72 horas.
En todos los experimentos, se mantuvieron las siguientes condiciones:
a. A lo largo de todos los experimentos no se anadieron nutrientes y el crecimiento de cualquier microorganismo resulto de los nutrientes en los diversos lfquidos utilizados.
b. Antes de la operacion, la desinfeccion se realizo utilizando una solucion de cloro que se hizo circular en el biosensor durante dos horas, despues de lo cual el biosensor se enjuago varias veces con agua destilada para eliminar los restos del desinfectante.
c. Las muestras de control incluyeron el mismo numero de pocillos con: (i) solucion esteril, o (ii) agua obtenida del punto de obtencion de muestras 1; (lii) agua obtenida del punto de obtencion de muestras 1, desde el cual se filtraron los microorganismos; y (iv) solucion salina con microorganismos que se filtraron del agua desde el punto de obtencion de muestras 1.
d. El biosensor se realizo en la oscuridad, tanto como sea posible, con el fin de prevenir el dano a los materiales fluorescentes atrapados en las capas de agar.
Experimentos de validacion:
Experimentos para determinar la actividad y sensibilidad del biosensor:
A. En primer lugar, se verifico el crecimiento de microorganismos en las placas, en condiciones de incubacion. Con este fin, se coloco una solucion salina esteril o agua del punto de obtencion de muestras 1 en una placa Petri y se mantuvo en la incubadora.
B. A continuacion, se llevaron a cabo experimentos de ensayo de la muestra para confirmar la aparicion o falta de apariencia de un color violeta en diferentes muestras, como se especifica en la Tabla 4, a diferentes temperaturas en el material biosensor dentro de la placa de 96 pocillos. Cada muestra se hizo circular en el aparato biosensor como se describe en el presente documento (vease tambien la Figura 1). Los Experimentos se llevaron a cabo en lotes, cada lote numerado como numero de muestra / numero de lote. El tiempo de circulacion fue 48, 72 o 96 horas y, durante la circulacion, se tomaron imagenes de las placas. Ademas, para todas las muestras, el flujo de fluido en el aparato fue de 90 ml / min y el volumen de una muestra analizada fue de 2 l. Las muestras analizadas se hicieron circular dentro del aparato, en el que la camara biosensora llevaba una placa de 96 pocillos, conteniendo cada pocillo el material biosensible.
Tabla 4: Muestras y condiciones analizadas para cada experimento
- N.° de lote
- Muestra analizada Horas(1) Temp. (°C)
- 1/1
- Solucion salina que contiene microorganismos extrafdos 72 35
- 2/1
- Muestra del punto de obtencion de muestras 1, aunque diluida 1:1 con solucion salina 72 35
- 3/1
- Muestra del punto de obtencion de muestras 1 72 35
- 1/2
- Muestra del punto de obtencion de muestras 1 mezclada con 50 ml de 1,8 % de caldo nutriente; 96 35
- 2/2
- Muestra del punto de obtencion de muestras 1 96 35
- 3/2
- Muestra del punto de obtencion de muestras 1 96 24
- 1/3
- Solucion salina que contiene microorganismos extrafdos 48 35
- 2/3
- Muestra del punto de obtencion de muestras n.° 1, de la que cualquier microorganismo existente se elimino por filtracion 48 35
- 3/3
- Muestra del punto de obtencion de muestras 1 48 35
- 1/4
- oMuestra del punto de obtencion de muestras 1 mezclada con 15 ml de 1,8 % de caldo nutriente 72 35
- 2/4
- Muestra del punto de obtencion de muestras 1, de la que se elimino por filtracion todos los microorganismos existentes y, despues, se anadio la muestra n.° 2 a una relacion de 1,5:0,5 72 35
- 3/4
- Muestra del punto de obtencion de muestras 1 72 35
- 1/5
- Agua de mar desde el punto de entrada de agua a la instalacion de desalinizacion de agua marina en Palmahim, Israel 72 35
- 2/5
- Agua de mar desde el punto de entrada de agua a la instalacion de desalinizacion de agua marina en Palmahim, Israel 72 35
- 3/5
- Muestra del punto de obtencion de muestras 2 72 35
Resultados
Crecimiento de microorganismos en condiciones de incubadora:
El cambio de color del medio se detecto visualmente. Las imagenes obtenidas con una camara (PowerShot A95, 5 Canon) se escanearon con un escaner Perfection 10 (Espon, Japon), con una resolucion de escaneo de 300 dpi.
Los resultados de la primera placa Petri de control (con agua destilada esteril) mostraron que no se habfa producido cambio de color del medio, mientras que en la segunda placa Petri (con agua del punto de obtencion de muestras 1) se produjo la actividad metabolica de los microorganismos, que produjo un cambio significativo (visible) de color del medio, es decir, la aparicion de un fuerte color violeta.
10 Examen de los cambios de color con varias muestras y condiciones:
En los experimentos de validacion siguientes, se permitio que varias soluciones (como se indica en la Tabla 4) circularan sobre la superficie del biosensor para examinar la reaccion del indicador de color en diversas situaciones, incluyendo situaciones extremas de las soluciones circulantes: soluciones esteriles sin nutrientes sin microorganismos, soluciones sin nutrientes que contienen microorganismos, soluciones que contienen nutrientes 15 pero no contienen microorganismos y soluciones de agua Shafdan. Ademas, se analizaron diferentes temperaturas.
Los resultados obtenidos para los diferentes experimentos se muestran en la Tabla 5.
Tabla 5 - Aparicion de la senal del biosensor en diferentes experimentos.
- N.° de lote
- Muestra analizada Horas(1) T (°C) Color(2)
- Control
- Solucion salina esteril 96 35 -
- 1/1
- Solucion salina que contiene microorganismos extrafdos 72 35 -
- 2/1
- Muestra del punto de obtencion de muestras 1, aunque diluida 1:1 con solucion salina 48 35 +
- 3/1
- Muestra del punto de obtencion de muestras 1 24, 72 35 + , +
- 1/2
- oMuestra del punto de obtencion de muestras 1 mezclada con 50 ml de 1,8 % de caldo nutriente 24,96 35 + , +
- 2/2
- Muestra del punto de obtencion de muestras 1 96 35 +
- 3/2
- Muestra del punto de obtencion de muestras 1 24,96 24 -, +
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(continuacion)
- N.° de lote
- Muestra analizada Horas(1) T (°C) Color(2)
- 1/3
- Solucion salina que contiene microorganismos extrafdos 48 35 -
- 2/3
- Muestra del punto de obtencion de muestras n.° 1, de la que cualquier microorganismo existente se elimino por filtracion 48 35 -
- 3/3
- Muestra del punto de obtencion de muestras 1 48 35 +
- 1/4
- oMuestra del punto de obtencion de muestras 1 mezclada con 15 ml de 1,8 % de caldo nutriente 48 35 +
- 2/4
- Muestra del punto de obtencion de muestras 1, de la que se eliminaron por filtracion todos los microorganismos existentes y a la que se anadio solucion salina con microorganismos extrafdos en una relacion de 1,5:0,5 48 35 +
- 3/4
- Muestra del punto de obtencion de muestras 1 72 35 +
- 1/5
- Agua de mar desde el punto de entrada de agua a la instalacion de desalinizacion de agua marina en Palmahim, Israel 72 35 +
- 2/5
- Agua de mar desde el punto de entrada de agua a la instalacion de desalinizacion de agua marina en Palmahim, Israel 72 35 +
- (1) Tiempo de la adquisicion de imagenes del sistema circulante (2) (+) indicativo de la aparicion de color violeta, (-) indicativo de ausencia de cambio de color
Los resultados del experimento anterior muestran que el color violeta aparecio en la superficie del biosensor solo cuando habfa una combinacion de microorganismos y nutrientes. Si faltaba uno de estos elementos en la solucion de circulacion, el color permaneda como el original. . Ademas, cuanto mas larga es la duracion de la circulacion, mayor es la intensidad y la cobertura de la superficie del color violeta en la superficie del biosensor.
De este modo, los resultados del experimento muestran que existe una dependencia lineal entre la cantidad de microorganismos que crecen en la superficie del biosensor y la cantidad e intensidad del color violeta que aparecio en el medio biosensor. En todos los experimentos, el color violeta, si apareda en la superficie del biosensor, era uniforme. Ademas, despues de cuatro dfas de circulacion, el color no se elimino del medio biosensor al fluido circulante.
El ultimo experimento por lotes (Lote 5), que involucro la circulacion de agua de mar, que se utiliza para la entrada a la instalacion de desalinizacion de agua de mar, mostro que el color tambien apareda con este tipo de agua, aunque solo despues de un tiempo de circulacion de mas de 72 horas. El largo tiempo requerido para la aparicion del color violeta puede explicarse por los bajos valores de TOC del agua de mar. Estos resultados muestran que sera posible utilizar el biosensor para diversos tipos de fluidos.
Ejemplo 2: Indexacion y estudios de bioincrustacion
El fin de estos experimentos era definir un fndice de bioincrustacion y el uso del mismo para determinar la correlacion entre el color / intensidad del biosensor en lmea con el mdice de bioincrustacion y la cantidad de biopelfcula que ha crecido en la superficie de las membranas de RO, utilizando diferentes fuentes de agua.
Para ello, se distribuyeron tres soluciones de entrada, puntos de obtencion de muestras n.° 3, 4 y 5, tal como se definen en la Tabla 3, se hicieron circular en la camara biosensora durante 24 horas o a traves de membranas miniatura de RO en la instalacion de Shafdan durante 15 dfas y se midio el crecimiento real de la biopelfcula a partir de estas soluciones sobre la superficie de las membranas de RO en comparacion con el crecimiento en el biosensor.
Crecimiento de bioincrustacion en el biosensor:
El cambio de color en el biosensor se determino para cada muestra de agua en seis repeticiones, como se ha descrito anteriormente.
Condiciones de circulacion: flujo de circulacion: 90 ml / min; volumen del recipiente de circulacion: 2 l; duracion de la circulacion: 24 horas, temperatura de 35 °C.
Crecimiento de bioincrustacion en membranas de RO:
Se dejo crecer la biopelfcula sobre la superficie de membranas miniatura de RO (ESNA1-LF, Hydranautics, EE.UU.), equipadas dentro de un dispositivo que tema la membrana retenida dentro de una camara cerrada, comprendiendo la camara una entrada de alimentacion, una salida para la salmuera y una salida para el permeado para fluidos, donde fluye la presion obtenida por el piloto de desalinizacion presurizado.
La superficie de la membrana era de 33,44 cm2 (38 x 88 mm). Para cada muestra de agua, se realizaron tres repeticiones.
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Durante el experimento, se registraron parametros tales como presiones, caudales de agua, conductividad, temperature y pH, con el fin de monitorizar y registrar posibles cambios en la produccion de membrana como resultado del crecimiento de la biopelfcula.
Despues de completar los experimentos de circulacion (circulacion de 15 d^as), se retiraron las membranas de la camara y se almacenaron en una solucion salina esterilizada a una temperatura de 4 °C.
Para el analisis de la biopelfcula se tomo un segmento de membrana de 5 x 5 mm de cada una de las membranas analizadas. Cada segmento se inserto en un tubo de ensayo Eppendorf que comprendfa 2 ml de solucion de TRIS al 0,24 % esterilizada (pH 7,2) y se dio la vuelta a los tubos de ensayo varias veces.
A continuacion, se llevo a cabo el aclarado de la membrana reemplazando tres veces una porcion de la solucion (1 ml) con un volumen nuevo de solucion TRIS (1 ml). Entre cada sustitucion de la porcion, se dio la vuelta al tubo de ensayo suavemente varias veces.
Las membranas aclaradas se tineron a continuacion con colorante basado en SYTO (Molecular Probes, EE.UU., preparacion descrita mas adelante) que se uso para tenir el microorganismo y con tetrametilrhodamina (Molecular Probes, EE.UU., descrita mas adelante) que se uso para tenir la superficie polimerica extracelular (EPS) de los organismos y, por lo tanto, utilizada como marcador para la formacion de biovolumen.
En la Tabla 6 se muestran los tonos de color y las longitudes de onda de estas tinciones en excitacion y emision.
Tabla 6: Tipo de colorante para celulas y colorante EPS
- Tipo de colorante
- Color Excitacion Emision
- SYTO9
- Verde ADN: 485 ARN: 486 ADN: 498 ARN: 501
- Tetrametilrodamina (C-860)
- Rojo 555 580
Para la tincion, el colorante SYTO comercial se diluyo con TRIS-HCl a una concentracion de 0,3 % (v / v) y se mantuvo en alfcuotas de 70 pl en el tubo de ensayo Eppendorf, a -20 °C hasta su uso posterior.
El colorante comercial de tetrametilrhodamina se disolvio en 5 ml de bicarbonato sodico 0,1 M (NaHCOa) para obtener una concentracion de 2 mg / ml. Esta solucion madre se mantuvo a -20 °C hasta su uso posterior.
Para la tincion, la solucion madre de tetrametilrhodamina se diluyo con TRIS-HCl 0,24 % para obtener una concentracion de 0,2 mg/ml. Las soluciones diluidas se mantuvieron en alfcuotas pequenas de 70 pl a -20 °C.
Los segmentos enjuagados de la membrana se colocaron en una placa de Petri grande y se anadieron 35 pl de SYT09 a los segmentos de membrana, para permitir una distribucion uniforme. La placa de Petri se cerro y se cubrio con papel de aluminio para mantener un ambiente oscuro durante 25 minutos.
Tras 25 minutos, cada segmento de membrana tenido se inserto en un tubo de ensayo Eppendorf que comprendfa 2 ml de solucion de TRIS al 0,24 % esterilizada (pH 7,2) y se dio la vuelta a los tubos de ensayo varias veces.
A continuacion, se llevo a cabo el aclarado de la membrana reemplazando tres veces una porcion de la solucion (1 ml) con un volumen nuevo de solucion TRIS (1 ml). Entre cada sustitucion de la porcion, se dio la vuelta al tubo de ensayo suavemente varias veces.
Despues del aclarado, los segmentos se colocaron en una placa de Petri grande y se anadieron a la membrana 35 pl de SYT09, para permitir una distribucion uniforme. La placa de Petri se cerro y se cubrio con papel de aluminio para mantener un ambiente oscuro durante 25 minutos.
Despues de 25 minutos, los segmentos de membrana tenidos se aclararon como se ha descrito anteriormente.
Los segmentos de membrana aclarados, tenidos con los dos materiales colorantes, se colocaron en una placa de Petri grande y se anadieron 50 pl de solucion TRIS a las membranas.
Antes del analisis con microscopio, se anadio una gota de aceite de inmersion sobre el cubreobjetos de vidrio.
El examen de las membranas se realizo utilizando una microscopia confocal de barrido laser (CLSM) (Leica, Microsystems, Alemania), mientras que STOY9 y tetrametilrhodamina se excitaron a una longitud de onda de 488 nm y 532 nm, respectivamente.
RESULTADOS:
Indice de bioincrustacion:
5
10
15
20
25
30
35
Los resultados de las tres soluciones medidas, desde los puntos de obtencion de muestras 3, 4 y 5, se utilizaron para obtener un mdice de bioincrustacion.
Caracterizacion del agua de alimentacion antes de los experiments de circulacion:
Punto de obtencion de muestras 3 / alimentacion 1: cantidad de microorganismos: unidad formadora de colonias (UFC) / ml - 588; Carbono organico total (TOC) - 14,2 mg / l; conductividad: 1,620 pmho; pH=6.7; Demanda biologica de oxfgeno (BOD) =6 mg/l
Punto de obtencion de muestras 4 / alimentacion II: cantidad de microorganismos: unidad formadora de colonias (UFC) / ml - -18.000; Carbono organico total (TOC) - 39 mg / l; conductividad: 4,005 pmho; pH=7.19; Demanda biologica de oxfgeno (BOD) =25 mg/l
Punto de obtencion de muestras 5 / alimentacion III: cantidad de microorganismos: unidad formadora de colonias (UFC) / ml - -48.000; carbono organico total (TOC) -68,5 mgl ; conductividad: 6,740 pmho; pH=7,42; Demanda biologica de oxfgeno (BOD) =103 mg/l.
El analisis de la intensidad de color de cada muestra analizadas de los tres puntos de obtencion de muestras (denominadas Alimentacion I, II y III) se cuantifico e indexo como Indice de bioincrustacion.
El ndice de bioincrustacion se determino del siguiente modo:
Indice de bioincrustacion = 100 x PPP x (1 - PPP) + (100 LL) x PPP
en la que:
fadice de bioincrustacion - un valor numerico que define el nivel de bioincrustacion
PPP (Porcentaje de pfxeles purpura) - el porcentaje de los pfxeles que son purpura (fraccion decimal)
LL (nivel de claridad) - la intensidad
La Figura 2 muestra la intensidad del color (promedio de cada 6 repeticiones) con el agua diferente.
Para simplificar, el Indice de bioincrustacion se tradujo en una puntuacion de bioincrustacion, A, B, C, ... F, de acuerdo con los intervalos de bioincrustacion, el menor intervalo de bioincrustacion representa una baja bioincrustacion identificada como puntuacion A. La puntuacion correlacionada se identifica en la Tabla 7.
- Descripcion
- indice de bioincrustacion Nivel de bioincrustacion
- Agua limpia
- indice de bioincrustacion < 0,0002 A
- Bioincrustacion leve
- Indice de bioincrustacion < 6 B
- Bioincrustacion moderada
- indice de bioincrustacion < 40 C
- Bioincrustacion moderada- intensa
- indice de bioincrustacion < 48 D
- Bioincrustacion intensa
- indice de bioincrustacion < 70 E
- Bioincrustacion extremadamente intensa
- indice de bioincrustacion >= 70 F
Bioincrustacion en membranas de RO
Tambien se usaron muestras de fluidos de los puntos de obtencion de muestras para determinar la bioincrustacion en las membranas de RO.
La tincion de las membranas RO con SYTO9 y Tetrametilrhodamina proporciono informacion sobre la presencia y cantidad de microorganismos y la sustancia polimerica extracelular (EPS), respectivamente. Las imagenes de CLSM se escanearon y analizaron con el software PHLIP (
http://sourceforge.net/proiects/phlip/). que permitio la cuantificacion de los datos de CLSM con respecto al biovolumen de la biopeltula. La Figura 3 proporciona el biovolumen obtenido para cada fluido, Alimentacion I, Alimentacion II y Alimentacion III.
http://sourceforge.net/proiects/phlip/). que permitio la cuantificacion de los datos de CLSM con respecto al biovolumen de la biopeltula. La Figura 3 proporciona el biovolumen obtenido para cada fluido, Alimentacion I, Alimentacion II y Alimentacion III.
Fiabilidad de los resultados del biosensor
Aplicando una prueba t estadfstica sobre los resultados del indice de biopelfcula obtenido despues de 24 horas de circulacion de agua (Figura 2), que condujo a la determinacion del Indice de bioincrustacion (Tabla 7) y del biovolumen (Figura 3) de la biopeltula que se desarrollo sobre la membrana de RP tras 15 dfas de circulacion de agua indico una correlacion positiva significativa de mas de 0,9.
Ejemplo 3: Determinacion de las condiciones minimas para la reaccion del biosensor
5
10
15
20
25
30
35
Las muestras del punto de obtencion de muestras N.° 2 (SP2) se diluyeron con solucion salina (para obtener tres soluciones diluidas, Tabla 8) con el fin de determinar la sensibilidad del biosensor, a saber, el valor mmimo detectable de TOC y la concentracion de microorganismos. En todas las muestras analizadas, el pH fue de 7,3 y la BOD <5 mg / l.
Tabla 8: Muestras analizadas
- N.°
- Muestra analizada UFC (UFC/ml) TOC (mg/l) C* (pmho)
- 1
- 1 l de SP2 +1 l de solucion salina 195 6,2 1.470
- 2
- 0.667 l de SP2 + 1,333 l de solucion salina 130 4,4 1.467
- 3
- 0,400 l de SP2 + 1,6 l de solucion salina 78 3,1 1.464
- *Conductividad
Se aplicaron las condiciones siguientes: flujo de circulacion: 90 ml/min, volumen de circulacion de 2 l; Duracion de la circulacion 24 h a una temperatura de 35 °C.
Resultados:
Despues de 24 horas de circulacion en el aparato biosensor, se determino la intensidad de color (purpura) que aparecio en el biosensor y se clasifico usando el mdice de bioincrustacion a un nivel B. Por tanto, los resultados llevaron a la conclusion de que el biosensor de la invencion es capaz de detectar bioincrustacion a un nivel bajo de microorganismos, es decir, a un TOC bajo de aproximadamente 3 mg / l y a un recuento bajo de los microorganismos, de 78 UFC / ml.
Ejemplo 4: Aplicacion del biosensor
El objeto de este ejemplo fue determinar la cantidad minima de hipoclorito (desinfectante) requerida para prevenir la bioincrustacion.
La fuente del agua analizada (el Shafdan) contiene amomaco (NH3) a valores que vanan entre aproximadamente 210 mg / l. Cuando se anade hipoclorito sodico (NaOCl), se forman cloraminas, por ejemplo, NCh, NHCh, NH2Cl, que se usan para prevenir la bioincrustacion. El cloro residual dana la membrana del RO. Por lo tanto, es muy importante utilizar una cantidad minima de hipoclorito sodico para prevenir, por un lado la bioincrustacion, y, por otro, prevenir el dano a la membrana de RO.
Procedimientos:
Se disolvio hipoclorito para obtener una solucion madre de 140 mg / l. Las diluciones de esta solucion madre se detallaron en la Tabla 9. Las diluciones se inyectaron en el agua que circulaba en el aparato biosensor y se midio la concentracion de cloro total para cada dilucion. Como control, no se anadio hipoclorito.
Condiciones de circulacion: flujo: 90 ml / min; volumen del recipiente de circulacion: 2 l; duracion de la circulacion: 24 horas, a una temperatura de 35 °C.
Ademas, el agua del punto de obtencion de muestras N.° 3 (SP3) se dejo fluir a traves de instalaciones de membranas en miniatura (como se describio anteriormente) en paralelo, durante 15 dfas, con el fin de permitir el crecimiento de biopelmula en la superficie de las membranas. Despues de 15 dfas, las membranas se trataron y analizadas como se ha descrito anteriormente para determinar el biovolumen resultante.
RESULTADOS
En la Tabla 9 se presentan las cloraminas totales y el mdice de bioincrustacion en la muestra analizada despues de 24 horas de circulacion. En la Figura 4 se proporciona el mdice de bioincrustacion en funcion del cloro total.
Tabla 9 - Concentracion de cloro e mdice de bioincrustacion
- Hipoclorito de sodio Img/ll
- Cloraminas totales Img/ll indice de bioincrustacion
- Control
- C
- 0,7
- 0,17 B
- 1,4
- 0,29 B
- 2,1
- 0,45 B
- 2,8
- 0,94 B
- 2,8
- 1,0 B
5
10
15
20
25
(continuacion)
- Hipoclorito de sodio [mg/l]
- Cloraminas totales [mg/l] indice de bioincrustacion
- 4,2
- 1,42 B
- 4,2
- 1,48 B
- 4,6
- 1,63 B
- 5,6
- 1,86 B
La adicion de hipoclorito mostro una disminucion del mdice de bioincrustacion (de C a B). Se obtuvo un mdice de incrustacion biologica mas bajo para una concentracion de cloro total de 1,4 y mas [mg / l], en la cual el mdice de bioincrustacion fue cercano a cero (Figura 4). Por lo tanto, para una bioincrustacion cercana a cero, una cantidad de 4,2 mg / l de hipoclorito sena suficiente para evitar la bioincrustacion sin crear entidades perjudiciales de cloro.
Crecimiento de biopelicula en membranas de RO con agua de entrada que contiene cloraminas
Sobre la base de los resultados anteriores, se decidio utilizar una concentracion total de cloraminas de 1,5 mg / l obtenida mediante inyeccion de hipoclorito 4,2 mg / l. La duracion de la inyeccion de hipoclorito en el agua de entrada de la Etapa I (SP1) fue de 4 horas al dfa, todos los dfas.
Despues de 15 dfas, se desmontaron las membranas fueron y se examinaron con microscopia CLSM. Se examino un total de cuatro membranas, dos utilizadas como control (no se anadio hipoclorito). El procesamiento de datos se realizo de una manera similar a la descrita anteriormente.
La figura 5 muestra el biovolumen de la biopelicula desarrollada en cada membrana cuando se inyecto hipoclorito en el agua de entrada para producir cloraminas a la concentracion recomendada por el instrumento de prediccion: 1,5 mg / l, en comparacion con la biopelicula desarrollada en las membranas en la misma agua de entrada sin hipoclorito. Los resultados se calcularon como un promedio de 18 puntos escaneados y calculados.
Los resultados presentados en la Figura 5 muestran que la creacion de una dosis baja de 1,5 mg / l de cloraminas, obtenidas mediante la adicion de 4,2 mg / l de hipoclorito, impidio el desarrollo de biopelicula en la membrana; el biovolumen fue de aproximadamente 1/5 del volumen de la biopelicula desarrollada sobre la membrana en las mismas condiciones de circulacion sin la adicion de hipoclorito.
La Figura 6 proporciona el espesor de la biopelicula, lo que muestra que el espesor de la biopelicula despues de 15 dfas en presencia de cloraminas (es decir, cuando se anadio hipoclorito) era aproximadamente 1/5 del espesor de la biopelicula desarrollada en ausencia de cloraminas.
Tambien se examino el efecto de la prevencion del desarrollo de la biopelicula en la superficie de la membrana cuando se anadieron 4,2 mg / l de hipoclorito. Se ha descubierto que el flujo normalizado durante 320 horas no mostro ningun efecto y, en particular, no disminuyo en el flujo de permeado, ni en la Etapa I ni en la Etapa II ni la Etapa III (Figura 7). Tambien se descubrio que el tratamiento con hipoclorito reducfa la bioincrustacion en las membranas (datos no mostrados).
Claims (13)
- 5101520253035404550REIVINDICACIONES1. Un biosensor que comprende(a) un armazon que comprende una matriz formada a partir de un material formador de armazon, comprendiendo dicho material formador de armazon uno o mas polisacaridos que tienen una temperatura de transicion de fase solida a ftquida a una temperatura superior a 35 °C y no superior a 95 °C y que se convierte en una estructura solida o semisolida tras el enfriamiento;(b) un complejo de colorantes que comprende minerales de arcilla asociados con un material colorante, en el que el material colorante proporciona una senal detectable en presencia de microorganismos;en el que el complejo de colorante esta embebido, al menos parcialmente, en el armazon y el armazon esta caracterizado por poros y/o huecos.
- 2. El biosensor de la reivindicacion 1, en el que el complejo de colorante esta embebido, al menos parcialmente, en poros de dicho armazon, preferentemente mediante atrapamiento ffsico del complejo en los poros del armazon, de manera que al menos parte del material de colorante permanece expuesto fuera del armazon.
- 3. El biosensor de la reivindicacion 1, en el que el material colorante se selecciona de un cromoforo o fluoroforo.
- 4. El biosensor de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende, ademas, un alcanol, tal como etanol.
- 5. El biosensor de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el material colorante pertenece a la familia de los compuestos de tetrazolio, tales como cloruro de 2-(4-yodofenil)-3-(4- nitrofenil)-5-fenil tetrazolio (INT), bromuro de -5-(4,5-dimetiltiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazolio (mTt), 2,3-bis-(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-2H-tetrazolio-5- carboxanilida (XTT), 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio (MTS), cloruro de 2,3,5-trifenil-2H-tetrazolium (TTC), cloruro de 2,3,5-trifenil-2H-tetrazolio (rojo tetrazolio), cloruro de 2,5-difenil-3-[alfa- naftil]-1 -tetrazolio (violeta tetrazolio), cloruro de 3,3'-(4,4-bifenilen)bis(2,5-difenil-2H-tetrazolio (cloruro de neotetrazolio), cloruro de 3,3'-(3,3'-dimetoxi-4-4'-bifenilen)bis(2,5-difenil-2H-tetrazolio (cloruro de azul tetrazolio), cloruro de3,3'-(3,3'-dimetoxi-4,4'-bifenilen)bis[2-(4-nitrofenil)-5-fenil-2H-tetrazolio] (nitroazul tetrazolio) o cloruro de 3,3'-(3,3'-dimetoxi-4-4' bifenilen)bis[2,5-bis(4-nitrofenil)-2H-tetrazolio ] (tetranitroazul tetrazolio), preferentemente cloruro de 2,5-difenil-3-[alfa-naftil]-1-tetrazolio (violeta de tetrazolio).
- 6. El biosensor de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que los minerales de arcilla se seleccionan del grupo que consiste en caolm, esmectita, clorito de illitem, sepiolita y atapulgita, y, preferentemente es caolm.
- 7. El biosensor de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el complejo de colorante tiene un peso molecular en el intervalo de 300 g / mol a 1500 g / mol.
- 8. El biosensor de la reivindicacion 2, en el que el biosensor esta en forma de un laminado que tiene una superficie superior y una superficie inferior, y el material colorante esta expuesto, al menos en dicha superficie superior, o "2 - r en el que el biosensor esta en forma de materia en partmulas suspendida en un recipiente, y el material colorante esta expuesto en la superficie exterior de la materia en partmulas.
- 9. Un procedimiento de preparacion de un biosensor, comprendiendo el procedimiento(a) mezclar un complejo de colorante que comprende minerales de arcilla y un material colorante que proporciona una senal detectable en presencia de microorganismos con un material formador de armazon, que comprende uno o mas polisacaridos que tienen una temperatura de transicion de fase solida a ftquida a una temperatura por encima de 35 °C y no superior a 95 °C y que se convierte en una estructura solida o semisolida al enfriarse, dicha mezcla se realiza a una temperatura a la cual el complejo de colorante y el material formador de armazon estan en una mezcla acuosa fluida, tal como a una temperatura entre 35 °C y 95 °C;(b) anadir a la mezcla fluida un reactivo no electrolftico; y(c) enfriar la mezcla fluida con el reactivo no electrolftico a una temperatura a la cual la mezcla se convierte en un solido o semisolido;por medio de lo cual se forma un biosensor que comprende un armazon caracterizado por poros y / o huecos y estando el complejo de colorante incrustado, al menos parcialmente, en el armazon, siendo el biosensor segun se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
- 10. El procedimiento de la reivindicacion 9, en el que la mezcla entre el material colorante y el mineral de arcilla esta a un pH en el intervalo de 4 a 6, preferentemente a un pH de 4,5 ± 0,5.
- 11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10, en el que la mezcla del material formador de armazon y el complejo de colorante se encuentra en una relacion estequiometrica de 4:1.
- 12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que el reactivo no electrolftico es un alcanol, tal como etanol.
- 13. Un aparato, que comprende:al menos una entrada de fluido y al menos una salida de fluido en comunicacion de fluido; estando situada una camara biosensora entre la al menos una entrada de fluido y la al menos una salida de fluido, configurada de tal modo que el fluido se libera a dicha camara biosensora desde dicha entrada de fluido 5 en un flujo laminar y es expulsado de dicha camara a traves de dicha salida de fluido, la camara biosensoracomprende un biosensor como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y opcionalmente, una cubeta de amortiguacion de fluido despues de dicha entrada y que precede a la camara biosensora, estando la cubeta de amortiguacion de fluido construida para permitir el flujo laminar de fluido sobre el biosensor.10 14. Un procedimiento para predecir la bioincrustacion en un sistema de flujo de fluido, comprendiendo elprocedimiento:(a) poner en contacto una muestra de fluido acuoso del sistema de flujo de fluido acuoso, con un biosensor como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, siendo dicho contacto preferentemente con un flujo laminar de la muestra de fluido acuoso sobre el biosensor 15 (b) detectar la intensidad de la senal en el biosensor asociado con la presencia de dichosmicroorganismos, siendo la intensidad de la senal correlativa con el potencial del sistema de flujo de fluido para formar bioincrustacion.
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